JP2023511482A - Ｃｄ２７６抗原の抗体ターゲティング、および他のモジュレーター、ならびにその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、Ｂ７－Ｈ３としても知られるＣＤ２７６抗原を標的とする、抗体または他の抗原結合タンパク質に関するものである。本発明は、該ＣＤ２７６抗原内の新たな位置で結合し、かつＣＤ２７６陽性がんの処置における治療法として特に有用である、改善された抗体セットを提供する。さらに本発明は、本発明の新規抗ＣＤ２７６抗体を基に開発した抗体コンジュゲートおよび二重特異性抗体を提供する。さらに、本発明は、ＣＤ２７６陽性がんの処置における該抗体および他のモジュレーターの治療的使用を開示する。最後に、本発明の分子をコードする核酸構築物、該核酸構築物を発現する組換え細胞、ならびに特定の使用および方法が提供される。【選択図】図１Ｂ

Description

本発明は、Ｂ７－Ｈ３としても知られるＣＤ２７６抗原を標的とする抗体または他の抗原結合タンパク質に関するものである。本発明により、該ＣＤ２７６抗原内の新たな位置で結合し、かつＣＤ２７６陽性がんの処置における治療法として特に有用である、改善された抗体セットが提供される。さらに本発明により、本発明の新規抗ＣＤ２７６抗体を基に開発された抗体コンジュゲートおよび二重特異性抗体が提供される。さらに、本発明により、ＣＤ２７６陽性がんの処置における該抗体および他のモジュレーターの治療的使用が開示される。最後に、本発明の分子をコードする核酸構築物、該核酸構築物を発現する組換え細胞、ならびに特定の使用および方法が提供される。
説明
リツキシマブおよびハーセプチン（それぞれ、Ｂ細胞リンパ腫およびＨｅｒ２／ｎｅｕ－陽性乳がんの処置に用いられる）のようなヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、これらの疾病のためのかなり改善された治療的選択肢を有する。これらのｍＡｂの治療活性の中心は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を有するエフェクター細胞を刺激するそれらの能力であり、それが標的細胞の溶解を引き起こす（「抗体依存性細胞傷害」、ＡＤＣＣ）。有効性を高めるために、有望な戦略としては、ＦｃＲ媒介性ＡＤＣＣを刺激する所与の抗腫瘍ｍＡｂの能力を、例えばＣＨ２ドメインのＳＤＩＥ修飾１、またはグリコシル化パターンを利用してアミノ酸配列をモジュレートすることにより強化する取組みが挙げられる［１］。ＮＫ細胞（および恐らくは他のエフェクター細胞）の動員を改善するための別のアプローチは、ＩＬ２またはＩＬ－１５などのサイトカインへの抗体の融合である。かかる免疫サイトカインは小児における神経芽細胞腫に対して有望な活性を示しており［２］、また現在は悪性黒色腫に罹患した患者に関する臨床試験で評価中である。本発明者らは近年、標的細胞限定的な活性を付与する改変ＩＬ－１５部分を含有する、新規クラスの免疫サイトカイン（ＭＩＣタンパク質）について記載した［３］。
抗腫瘍抗体の最適化のための最も有望なアプローチは、その（ＮＫ細胞と比較して）かなり高いエフェクター能力を示すＴ細胞の抗体媒介性刺激のようである［４］。事実、がん細胞に対するＴ細胞の動員を可能にする抗体ベースの戦略は、目覚ましい成功を収めている：（ｉ）Ｔ細胞上の抑制性「チェックポイント」分子、例えばＣＴＬＡ４またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を抑制するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、高腫瘍量の患者においてさえ長期寛解を誘発する。しかし、永続的応答はごく一部の患者のみで得られ、またＴ細胞のオフターゲット活性化に起因する副作用は相当なものである［５］。（ｉｉ）Ｂ細胞関連ＣＤ１９分子およびＣＤ３会合シグナル伝達ドメインを指向する抗体部分を含有するキメラ受容体をトランスフェクトしたＴ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）は、Ｂ細胞由来の悪性腫瘍を患う患者において多数の悪性細胞を根絶し［６、７］、また（ｉｉｉ）ブリナツモマブは、いわゆる二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ）の形でＣＤ１９×ＣＤ３特異性を有する二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）であり、２０１４年にＢ細胞起源の急性リンパ性白血病において画期的治療薬（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ）指定を受けている［８～１０］。
しかし、初期の臨床試験では、固形腫瘍に対するＣＡＲ Ｔ細胞ならびに二重特異性抗体の活性は、恐らくは固形腫瘍部位へのＴ細胞の接近手段が限られているために、顕著ではないようである［１１～１２］。エフェクター細胞の十分な流入が、固形腫瘍に対する大抵の免疫療法的戦略にとって重要な前提条件であることは、その腫瘍部位で炎症誘発性環境が整っていない限りは多数の腫瘍特異的Ｔ細胞でも十分な抗腫瘍活性を発揮できないことを示す報告により示唆されている［１３、１４］。従って、最適な標的抗原が腫瘍細胞上だけでなく腫瘍血管上でも発現されることで、損傷した血管内皮を介した免疫細胞の十分な流入とそれに続く腫瘍細胞の破壊が可能となるであろう。
ＣＤ２７６は免疫グロブリンのクラスに属している。Ｂ７－Ｈ３またはＢ７ＲＰ－２とも称されるＣＤ２７６は、免疫学的刺激のシグナルカスケードに関与する、７７ｋＤａのグリコシル化クラス１膜貫通タンパク質である。ＣＤ２７６はＢ７分子のファミリーの一部であり、Ｎ末端シグナルペプチド、細胞外Ｖ－およびＣ－Iｇ様ドメイン、膜貫通セクションならびに４５アミノ酸長のＣ末端で構成されている。該Ｂ７ファミリーおよびその受容体であるＣＤ２８ファミリーは、Ｔ細胞への抗原の結合に関与している。これは正の共刺激および負の共阻害を介して生じる。Ｂ７－Ｈ３は２００１年にＣｈａｐｏｖａｌ，Ａ．Ｉ．，ら、（Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１．２（３）：ｐ．２６９－７４）によりＴ細胞応答およびＩＦＮ－γ産生の共刺激に関与する分子として初めて記載された。Ｂ７－Ｈ３はこの状況ではＴ細胞刺激のインヒビターとして働き、それと同時にＩＬ－４およびＩＦＮ－γなどのエフェクターサイトカインの産生を刺激する（Ｐｒａｓａｄ，Ｄ．Ｖ．，ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４．１７３（４）：ｐ．２５００－６）。さらに、Ｂ７－Ｈ３は初代ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の刺激に関与しており、これは腫瘍成長速度を低下させることが証明されている。２つのアイソフォーム、すなわちＶ－およびＣ－Ｉｇ様ドメインの数が異なるヒトおよびマウス型、が知られている。そのヒトタンパク質（４ＩｇＢ７Ｈ３）は４つのタンデムＩｇ様ドメインからなり、一方でマウスタンパク質はたった２つのドメインからなる（２ＩｇＢ７Ｈ３）。他のＢ７ファミリーメンバーとは対照的に、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）ＲＮＡはほぼ全てのヒト組織に存在する。しかし、該タンパク質の翻訳はマイクロＲＮＡを介して厳密に調節されており、多くのヒトのがん、例えば前立腺がん、非小細胞肺がん、胃がん、神経芽細胞腫および卵巣がんでは過剰発現が生じる［２５］。前立腺がんの研究により、ＣＤ２７６発現の、腫瘍播種、腫瘍再発および全生存期間との相関関係が示された。ＣＤ２７６は腫瘍および血管細胞上でのかかる二重発現をもたらすごく小数の標識抗原の１つであり、本発明者らの免疫組織化学的研究により、発現は正常組織と比較すると悪性組織に対してかなり特異的であることを確認した。その二重発現に加えて、ＣＤ２７６は、Ｔ細胞機能に対する抑制作用を有する免疫チェックポイント分子と特徴付けられている。ＣＤ２７６に関するより多くの情報は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（２０１９年１１月版）からアクセッション番号：Ｑ５ＺＰＲ３で得ることができる。４つのヒトアイソフォームのアミノ酸配列を、本明細書中では配列番号４１～４４として記載する。
ＷＯ２００８／１１６２１９には、抗原に４Ｇドメインで結合しかつ抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するモノクローナル抗ＣＤ２７６抗体８Ｈ９が開示されている。
まとめると、腫瘍血管系上に提示されるかかる腫瘍関連抗原を標的化することで達成されうる、腫瘍塊の効率的な標的化を可能にするさらなる治療選択肢が必要とされている。従って、本発明は、がん性疾患の処置に使用できる抗体を同定しようと努めるものである。
本発明の簡単な説明
全般的に、かつ簡単な説明として、本発明の主な態様は以下のように記載することができる。
第１態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ３タンパク質、またはそのバリアントに特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）であって、ここで該単離されたＡＢＰが該Ｂ７－Ｈ３を発現する細胞に対して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を誘導できる、該単離されたＡＢＰに関するものである。
第２態様では、本発明は、前記Ｂ７－Ｈ３抗原、またはそのバリアントに結合する能力がある第１抗原結合ドメインと、ヒト分化抗原群３（ＣＤ３）抗原に結合する能力がある第２抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）に関するものである。
第３態様では、本発明は、前記第１態様のいずれか１つのＡＢＰ、またはＡＢＰの抗原結合フラグメントもしくはモノマー、例えば重もしくは軽鎖、をコードするか、あるいは前記第２態様による二重特異性ＡＢＰをコードする配列を含む、単離された核酸に関するものである。
第４態様では、本発明は、前記第３態様の核酸と、細胞における前記のコード化ＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰ、または該ＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰの成分（例えば、抗体の重鎖もしくは軽鎖）の発現を可能にする１以上の追加の配列特徴とを含む、核酸構築物（ＮＡＣ）に関するものである。
第５態様では、本発明は、前記第３または第４態様による核酸またはＮＡＣを含む組換え宿主細胞に関するものである。
第６態様では、本発明は、（ｉ）前記第１もしくは第２態様のＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰ、または（ｉｉ）前記第３もしくは第４態様の核酸もしくはＮＡＣ、または（ｉｉｉ）前記第５態様による組換え宿主細胞、ならびに製薬上許容可能な担体、安定剤および／または賦形剤を含む医薬組成物に関するものである。
第７態様では、本発明は、医薬への使用のための成分であって、ここで該成分が、（ｉ）前記第１もしくは第２態様のＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰ、または（ｉｉ）前記第３もしくは第４態様の核酸もしくはＮＡＣ、または（ｉｉｉ）前記第５態様による組換え宿主細胞および（ｉｖ）前記第６態様による医薬組成物、からなるリストより選択される、該使用のための成分に関するものである。
第８態様では、本発明は、ヒトＢ７－Ｈ３を発現するヒト細胞への細胞媒介性免疫応答を増強する方法であって、該細胞を、（ｉ）前記第１もしくは第２態様のＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰ、または（ｉｉ）前記第３もしくは第４態様の核酸もしくはＮＡＣ、または（ｉｉｉ）前記第５態様による組換え宿主細胞および（ｉｖ）前記第６態様による医薬組成物と、免疫細胞、例えばＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の存在下で接触させて、それによって該ヒト細胞に対する細胞媒介性免疫応答、好ましくは細胞傷害を増強することを含む、該方法に関するものである。
第９態様では、本発明は、対象における増殖性疾患の予防および／または処置のための方法であって、該対象への、前記第７態様に列挙した成分の治療上有効な量の投与を含み、かつここで該増殖性疾患が該増殖性疾患に関連する細胞におけるＢ７－Ｈ３の発現を特徴とする、該方法に関するものである。
図面は以下を示す。
図１は、本発明の抗体および抗体構築物を示す図である。（Ａ）は新たに作製したＢ７－Ｈ３抗体を用いたエピトープマッピング結果の概要である。この概要図はＢ７－Ｈ３抗原の結晶構造（Ｖｉｇｄｏｒｏｖｉｃｈ Ｖら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２０１３）を示しており、矢印はＢ７－Ｈ３ ｍＡｂの有する様々な結合部位を明示している。ＣＣ－３に含有される７Ｃ４抗体は細胞膜に近接したエピトープに結合する点に注目されたい。図示した抗体は、図示したアミノ酸交換を保有するＣＤ２７６変異体にはもはや結合しなかった。これらの変化は、非ヒト霊長類動物とヒトのＣＤ２７６配列間の差異に基づいて選択された。（Ｂ）は単一特異性抗体（左）、免疫サイトカイン（ＭＩＣタンパク質、中央）および二重特異性ＩｇＧｓｃ抗体（右）の図である。単一特異性抗体を（図に示す通り）野生型ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分またはそのＳＤＩＥ改変型と共に使用したという点に注目されたい。 図１は、本発明の抗体および抗体構築物を示す図である。（Ａ）は新たに作製したＢ７－Ｈ３抗体を用いたエピトープマッピング結果の概要である。この概要図はＢ７－Ｈ３抗原の結晶構造（Ｖｉｇｄｏｒｏｖｉｃｈ Ｖら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２０１３）を示しており、矢印はＢ７－Ｈ３ ｍＡｂの有する様々な結合部位を明示している。ＣＣ－３に含有される７Ｃ４抗体は細胞膜に近接したエピトープに結合する点に注目されたい。図示した抗体は、図示したアミノ酸交換を保有するＣＤ２７６変異体にはもはや結合しなかった。これらの変化は、非ヒト霊長類動物とヒトのＣＤ２７６配列間の差異に基づいて選択された。（Ｂ）は単一特異性抗体（左）、免疫サイトカイン（ＭＩＣタンパク質、中央）および二重特異性ＩｇＧｓｃ抗体（右）の図である。単一特異性抗体を（図に示す通り）野生型ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分またはそのＳＤＩＥ改変型と共に使用したという点に注目されたい。 図２は、図示したＢ７－Ｈ３×ＣＤ３ ｂｓＡｂへのＢ７－Ｈ３抗原の結合を測定するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）センサーグラムを示す図である。７Ｃ４または８Ｈ８を含有する構築物は特に長いオフレート（off-rate）を示す点に注目されたい。 図３は、フローサイトメトリーにより測定した、ＮＡＬＭ－１６細胞（Ａ）およびＪｕｒｋａｔ細胞（Ｂ）上にそれぞれ発現されたＢ７－Ｈ３およびＣＤ３への種々のＢ７－Ｈ３×ＣＤ３ ｂｓＡｂの結合を示す図である。全構築物において、抗ＣＤ３抗体親和性を減弱化することによりオフターゲットＴ細胞活性化を低減したが、標的抗原Ｂ７－Ｈ３への結合は全構築物で非常に高い点に注目されたい。 図４は、ＳＤＩＥ改変Ｆｃ部分を含有する、様々な単一特異性ＣＤ２７６抗体（Ａ、Ｂ）またはＭＩＣタンパク質（Ｃ、Ｄ）によるＮＫ細胞の活性化および腫瘍細胞の枯渇を示す図である。方法：腫瘍細胞（ＬＮＣａｐ）を、ヒトＰＢＭＣおよび図示した抗体と共にインキュベートした。３日後にＮＫ細胞の活性化および腫瘍細胞の枯渇をフローサイトメトリーにより測定した。 図５は、野生型ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含有する、様々なＣＤ２７６抗体（Ａ～Ｃ）またはＭＩＣタンパク質（Ｄ～Ｆ）によるＮＫ細胞の活性化、ＮＫ細胞の増殖および腫瘍細胞の枯渇を示す図である。方法：腫瘍細胞（ＬＮＣａＰ）を、ヒトＰＢＭＣおよび図示した抗体と共にインキュベートした。３日後にＮＫ細胞の活性化および腫瘍細胞の枯渇をフローサイトメトリーにより測定した。 図６は、ＩｇＧｓｃフォーマット（図１Ｂを参照のこと）の二重特異性抗体に組み込んだ様々なＣＤ２７６抗体によるＴ細胞の活性化および腫瘍細胞の殺傷を示す図である。方法：Ｂ７－Ｈ３を発現するＮＡＬＭ－１６腫瘍細胞を、漸増濃度の図示Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３構築物または非関連特異性を示す対照ｂｓＡｂの存在下で健常ドナーのＰＢＭＣと共にインキュベートし、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の活性化ならびに腫瘍細胞の殺傷を３日後にフローサイトメトリーにより測定した（Ｂ）。Ｔ細胞の増殖の誘導（Ｃ）は、３Ｈ－チミジン取込みアッセイを利用して評価した。ＣＣ－３（７Ｃ４×ＣＤ３）が、全てのアッセイにおいて、他のＢ７－Ｈ３×ＣＤ３ ｂｓＡｂと比較して顕著に優れたＴ細胞刺激を媒介する点に注目されたい。長期ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ腫瘍溶解アッセイ（Ｄ）を、図示したＢ７－Ｈ３×ＣＤ３ ｂｓＡｂの存在下でＢ７－Ｈ３発現ＬＮＣａＰ腫瘍細胞および健常ドナーのＰＢＭＣを用いて実施した。ＣＣ－３（７Ｃ４×ＣＤ３）が、他のＢ７－Ｈ３×ＣＤ３ ｂｓＡｂと比較して優れたＴ細胞活性化および腫瘍細胞殺傷を媒介する点に注目されたい。 図７は、二重特異性ＩｇＧｓｃ抗体（図１Ｂ）に組み込んだ種々のＣＤ２７６抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す図である。方法：ＬＮＣａＰ細胞を雌ＮＳＧマウスの右側腹部にｓ．ｃ．注射することにより、直径５ｍｍの腫瘍を定着させた。その後（１日目）ＰＢＭＣを、Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３抗体（２μｇ／投与）もしくは無関係な対照ｂｓＡｂと共に、または該抗体もしくは該ｂｓＡｂなしで、１、８および１５日目にｉ．ｖ．適用した（矢印で示す）。腫瘍成長を週に２回測定し、腫瘍が直径１５ｍｍに達した時点でマウスを安楽死させた。このｉｎ ｖｉｖｏ環境で、ＣＣ－３（７Ｃ４×ＣＤ３）はやはり８Ｄ９×ＣＤ３よりも顕著により有効であり、提示したｉｎ ｖｉｔｒｏデータを裏付けていることに注目されたい。
本発明の詳細な説明
以下に、本発明の要素を記載する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらはさらなる実施形態を創出するために任意の様式および任意の数で組み合わせうることを理解されたい。様々に記載された例および好適な実施形態は、本発明を明確に記載された実施形態のみに限定するものと解釈してはならない。本記載は、明確に記載された実施形態のうちの２つ以上を組み合わせるか、または明確に記載された実施形態のうちの１以上を任意の数の開示された要素および／もしくは好適な要素と組み合わせる実施形態を支持かつ包含するものと理解されたい。さらに、本出願におけるあらゆる記載された要素の任意の並べ替えおよび組み合わせは、文脈上他を意味しない限り、本願の記載により開示されているとみなすべきである。
本発明は、幾つかの態様および実施形態において、本明細書中に開示されるような抗ＣＤ２７６抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドおよびタンパク質を提供する。該ポリペプチドおよびタンパク質は、有利なことに、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３としても知られる）を特異的に認識しかつこれに高親和性で結合する。該ポリペプチドおよびタンパク質は、有利なことに、可溶性ＣＤ２７６を特異的に認識してこれに結合し、また同様に、細胞表面上に発現されたＣＤ２７６も特異的に認識してこれに結合する。ＣＤ２７６は、小児固形腫瘍および成人がん腫を含む様々なヒト腫瘍上で発現または過剰発現される。ＣＤ２７６を発現または過剰発現するがんの例としては、限定するものではないが、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、ならびに前立腺、卵巣、大腸、および肺がんが挙げられる。ＣＤ２７６は腫瘍血管系でも発現され、腫瘍内皮マーカーである。特定の理論または機序に束縛されるものではないが、ＣＤ２７６を特異的に認識してこれに結合することにより、本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、有利なことに、ＣＤ２７６発現がん細胞および／または腫瘍血管系を標的化しうると考えられる。本発明の一実施形態では、本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、ＣＤ２７６に対する抗原特異的応答を誘発しうる。従って、特定の理論または機序に束縛されるものではないが、ＣＤ２７６を特異的に認識してこれに結合することにより、本発明のタンパク質およびポリペプチドは、ＣＤ２７６発現がん細胞および／または腫瘍血管系を検出すること、ＣＤ２７６発現がん細胞および／または腫瘍血管系を標的化しこれを破壊すること、がん細胞および／または腫瘍血管系を減少させるかまたは除去すること、腫瘍部位および／または腫瘍血管系への免疫細胞および／またはエフェクター分子の浸潤を促進すること、ならびに抗がんおよび／または抗腫瘍血管系応答を増強／延長すること、のうちの１以上を提供しうると考えられる。
第１態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ３タンパク質、またはそのバリアントに特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）であって、かつここで、該単離されたＡＢＰが該Ｂ７－Ｈ３を発現する細胞に対して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導できる、該単離されたＡＢＰに関する。
ＣＤ２７６を標的とする抗原結合タンパク質
本明細書中で使用する「抗原結合タンパク質」（「ＡＢＰ」）は、標的抗原により提示されるかまたは標的抗原上に存在する１以上のエピトープなどの標的抗原に特異的に結合するタンパク質を意味する。本発明のＡＢＰの抗原は、ＣＤ２７６またはそのオルソログ（もしくはパラログ）もしくは他のバリアントであり、また該ＡＢＰは、場合によっては該ＣＤ２７６またはバリアントの１以上のドメインに結合できる（例えば、エピトープは、該ＣＤ２７６またはバリアントの１以上の細胞外ドメインにより提示されうるか、または該細胞外ドメイン上に存在しうる）。典型的には、抗原結合タンパク質は抗体（またはそのフラグメント）であるが、抗原結合タンパク質の他の形態もまた本発明により想定される。例えば、該ＡＢＰは、例えばコンビナトリアルタンパク質設計の方法（ＧｅｂａｕｅｒおよびＳｋｅｒｒａ，２００９；Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，１３：２４５）を利用することで、結合機能を備えたものなどの、小さく強固な非免疫グロブリン「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）」に由来する別の（非抗体）受容体タンパク質としてもよい。かかる非抗体ＡＢＰの特定の例としては、プロテインＡのＺドメインに基づくアフィボディ分子（Ｎｙｇｒｅｎ，２００８；ＦＥＢＳ Ｊ ２７５：２６６８）、γ－Ｂクリスタリンおよび／またはユビキチンに基づくアフィリン（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈら、２００７；Ｊ Ｍｏ Ｂｉｏｌ，３７２：１７２）、シスタチンに基づくアフィマー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２０１２；Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８４：６５５３）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｃａｌｄａｒｉｕｓ）由来のＳａｃ７ｄに基づくアフィチン（Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋら、２００８；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８３：１０５８）、三重らせんコイルドコイルに基づくアルファボディ（Ｄｅｓｍｅｔら、２０１４；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｓ ５：５２３７）、リポカリンに基づくアンチカリン（Ｓｋｅｒｒａ，２００８；ＦＥＢＳ Ｊ ２７５：２６７７）、様々な膜受容体のＡドメインに基づくアビマー（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００５；Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３：１５５６）、アンキリンリピートモチーフに基づくＤＡＲＰｉｎ（Ｓｔｒｕｍｐｐら、２００８；Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，１３：６９５）、ＦｙｎのＳＨ３ドメインに基づくフィノマー（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら、２００７；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：３１９６）、様々なプロテアーゼインヒビターのクニッツドメインに基づくクニッツドメインペプチド（Ｎｉｘｏｎら、Ｃｕｒｒ ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ，９：２６１）ならびにフィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメインに基づくセンチリンおよびモノボディ（Ｄｉｅｍら、２０１４；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２７：４１９ ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｕ０１６；ＫｏｉｄｅおよびＫｏｉｄｅ，２００７；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３５２：９５）、が挙げられる。ヒトＣＤ２７６に特異的に結合する本発明のＡＢＰとの関連において、好ましいのはアイソフォーム１である。
用語「エピトープ」には、抗体などの抗原結合タンパク質により結合される能力がある任意の決定基が含まれる。エピトープとは、抗原を標的とする抗原結合タンパク質により結合されるその抗原の領域であり、また該抗原がタンパク質である場合には、該抗原結合タンパク質に（例えば、該タンパク質の抗原結合ドメインを介して）結合する特定のアミノ酸を含む。エピトープ決定基はアミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基（ｓｕｒｆａｃｅ ｇｒｏｕｐｉｎｇｓ）を含む可能性があり、また固有の三次元構造特性、および／または固有の電荷特性を有する可能性がある。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗原結合タンパク質は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中の該標的抗原上のエピトープを選択的に認識する。
本発明において、前記抗体、またはそのバリアントにより標的化されうる好適なエピトープは、ヒトＣＤ２７６中の以下のアミノ酸位置のうちのいずれか１つを含む該エピトープである。以下の位置は、本発明のＡＢＰおよびヒトＣＤ２７６タンパク質間のタンパク質－タンパク質相互作用に関与するアミノ酸である。該エピトープは、従って、本明細書中に記載するヒトＣＤ２７６アミノ酸配列の少なくとも８個、および好ましくは２０個以下の連続するアミノ酸を有する領域であり、以下の位置を含む。
本発明において、ヒトＣＤ２７６のＩｇＣドメイン中のエピトープは、Ｑ１７９を含むエピトープである。ヒトＣＤ２７６のＩｇＶドメイン中のエピトープは、Ａ１１５、Ｇ４３および／またはＦ１２０のうちのいずれか１つ、いずれか２つまたは全てを含むエピトープである。さらなるエピトープはＲ１２７またはＧ１３０を含む。
抗原結合タンパク質は、該抗原結合タンパク質がある抗原（例えばＣＤ２７６、例えばヒトＣＤ２７６、そのオルソログおよび他のバリアント）に、該抗原結合タンパク質が２つ目の抗原に結合するよりも選択的に（例えば、より強くまたはより広範囲に）結合する場合、「特異的」である。ＡＢＰとの関連において本明細書中で使用する用語「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」（または「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」など）は、該ＡＢＰが所望の抗原（例えばＣＤ２７６、特にＣＤ２７６のＩｇＣドメイン）に、他のタンパク質（または他の分子）に結合するよりも選択的に結合すること、例えばかかるＣＤ２７６に、他の免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー遺伝子の１以上と比較して選択的に結合することを意味する。従って、好ましくは、ある抗原（例えばＣＤ２７６）への該ＡＢＰの結合親和性は、他の標的（例えば、マウスもしくはヒトＦｃドメイン、またはストレプトアビジンなどの非関連タンパク質）へのその親和性と比較して、少なくとも２倍、５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも２０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも１００００倍、少なくとも１０５倍またはさらに少なくとも１０６倍、最も好ましくは少なくとも２倍である。
本明細書中で使用する「ＩｇＶドメイン」（または「Ｉｇ様Ｖドメイン」）および「ＩｇＣドメイン」（または「Ｉｇ様Ｃドメイン」）は、概して、Ｉｇスーパーファミリーメンバーのドメインを指す。これらのドメインは、Ｉｇ様フォールド（Ｉｇ－ｌｉｋｅ ｆｏｌｄｓ）と呼ばれる別個の折りたたみパターンを有する構造単位に相当する。Ｉｇ様フォールドは、逆平行β鎖の２つのシートのサンドイッチからなり、大部分の、ただし全てではないドメインにおいて該２シート間に保存されたジスルフィド結合を有する。Ｉｇ、ＴＣＲ、およびＭＨＣ分子のＩｇＣドメインは同じタイプの配列パターンを共有しており、Ｉｇスーパーファミリー中のＣ１セットドメインと称される。他のＩｇＣドメインはＩｇＣ２セットドメインに含まれる。ＩｇＶドメインもまた配列パターンを共有しており、Ｖセットドメインと称される。
本明細書中で使用する用語「オルソログ」は、同じ祖先遺伝子に由来するが、種分化イベントの結果別の生物中に存在するバリアントを意味する。ＣＤ２７６のオルソログは典型的には、ヒトＣＤ２７６と同一の機能を保持する（または類似した機能を有する）ことが予想される。
本明細書中で使用する用語「パラログ」は、複製イベントにより同じ祖先遺伝子に由来する同一生物中のバリアントを意味する。ＣＤ２７６のパラログは典型的には、免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質、特に（かかるパラログがヒトに存在するならば）該ＣＤ２７６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、８０％、８５％または９０％の配列同一性を有するものであることが予想される。
タンパク質との関連において本明細書中で使用する用語「バリアント」は、参照タンパク質と比較すると１以上のアミノ酸変異を含むが、該参照タンパク質と有意なアミノ酸配列同一性、例えば少なくとも７０％または７５％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性および最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を共有する、任意の天然または非天然型のかかるタンパク質を意味する。好ましくは、該タンパク質の該バリアントは、該参照タンパク質と同一であるか、本質的に同一であるかまたは類似した少なくとも１つの機能／活性を保有および／または維持している。ＣＤ２７６のバリアントは、ヒトＣＤ２７６に対するオルソログおよびヒトＣＤ２７６の天然バリアントを含んでいてもよい。ＣＤ２７６のバリアントは同様に、１以上のアミノ酸残基がそのアミノ酸配列に挿入されているかまたは該アミノ酸配列から欠失しているヒトＣＤ２７６、例えばある集団内で天然に見出されるＣＤ２７６のそれらバリアント、または例えば、該バリアントの１以上のドメイン（例えば細胞外ドメイン）内にアミノ酸変化を具体的に作り出すために遺伝子操作により作製されたものも該当する場合がある。ＣＤ２７６のバリアントには、ＣＤ２７６の融合タンパク質（例えば、Ｆｃ免疫グロブリンドメインもしくはタグなどの異種ポリペプチド鎖に融合させたヒトＣＤ２７６）、および／またはエフェクター基もしくは標識基などの別の化学的部分に結合させたＣＤ２７６が含まれる。ＣＤ２７６のバリアントは、ある特定の実施形態では、ＣＤ２７６のフラグメント、例えばＣＤ２７６の１以上のＩｇＣもしくはＩｇＶドメイン（またはその領域もしくは（サブ）ドメイン）から、いずれか一方（またはその他）なしに構成されるポリペプチドを含みうる。
用語「同一性」は、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の、該配列をアラインメントして比較することにより決定した関係を指す。「同一性パーセント」は、比較する分子中のアミノ酸間またはヌクレオチド間の同一残基の割合を意味しており、また比較している分子の最小限のサイズに基づいて算出される。これらの計算のために、アラインメント中のギャップ（存在するならば）を特定の数理モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）で処理することが好ましい。アラインメントした核酸またはポリペプチドの同一性を算出するために使用できる方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，編），１９８８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，編），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，編），１９９４，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されたものが挙げられる。
同一性パーセントを算出する際は、比較する配列は典型的には、該配列間に最大の一致が得られる形でアラインメントする。同一性パーセントを決定するために使用できるコンピュータープログラムの１例はＧＣＧプログラムパッケージであり、これにはＧＡＰが含まれる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。該コンピューターアルゴリズムＧＡＰを使用することにより、配列同一性パーセントを決定する２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドをアラインメントする。該配列を、それらの各アミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致のためにアラインメントする（該アルゴリズムによって決定される「一致スパン（ｍａｔｃｈｅｄ ｓｐａｎ）」）。ギャップ開始ペナルティ（平均対角線の３倍として算出され、該「平均対角線」は使用する比較行列の対角線の平均値であり、該「対角線」は特定の比較行列により各々の完全なアミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常は該ギャップ開始ペナルティの１／１０倍である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などの比較行列を、該アルゴリズムと併せて使用する。
標準的な比較行列（ＰＡＭ２５０比較行列についてはＤａｙｈｏｆｆら、１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５－３５２、ＢＬＯＳＵＭ６２比較行列についてはＨｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５－１０９１９を参照のこと）が前記アルゴリズムに使用されていてもよい。
前記ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチドまたはヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定する際に用いることができるパラメータの例は、（ｉ）アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３、（ｉｉ）比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，上掲のＢＬＯＳＵＭ６２、（ｉｉｉ）ギャップペナルティ：１２（ただし終了ギャップに対するペナルティはない）、（ｉｖ）ギャップ長ペナルティ：４、（ｖ）類似性の閾値：０である。
タンパク質または核酸と、ヒトＣＤ２７６、そのパラログ、オルソログもしくは他のバリアントとの間（またはヒトＣＤ２７６、そのパラログ、オルソログもしくは他のバリアント間）の類似性を決定する好適な方法は、上掲のＵｎｉｐｒｏｔで支援されるＢｌａｓｔサーチ（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ５ＺＰＲ３）により提供されている方法、特にアミノ酸同一性に関しては、次のパラメータ、すなわちプログラム：ｂｌａｓｔｐ、行列：ｂｌｏｓｕｍ６２、閾値：１０、フィルタ処理：ｆａｌｓｅ、ギャップあり：ｔｒｕｅ、報告される最大ヒット数：２５０を使用する方法である。
２つのアミノ酸配列をアラインメントするための、ある特定のアラインメントスキームは、それら２つの配列の短い領域のみの一致を生じる場合があり、またこの小さなアラインメントされた領域は、その２つの全長配列間には有意な関係がないにもかかわらず、非常に高い配列同一性を有する場合がある。従って、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）は、必要があれば、標的ポリペプチドまたはその領域の少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または他の数の連続したアミノ酸に及ぶアラインメントが生じるように調整することができる。
本発明の特定の実施形態では、前記ＣＤ２７６は、ヒトＣＤ２７６、好ましくは、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４（特に、配列番号４１）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質、またはこれらの配列と比較して２、４、６、８、もしくは１０以下、例えば１、２もしくは３以下、例えば１以下のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を有するタンパク質である。
ＣＤ２７６のバリアントとの関連において、本発明は、ＣＤ２７６のバリアントが配列番号４１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％または９７％の配列同一性（特に、少なくとも９２％または９５％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であるような実施形態を含む。
１以上の相補性決定領域を含む本発明のＡＢＰ
特定の実施形態では、本発明のＡＢＰは少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば抗体由来（特にヒト抗体由来）のものを好ましく含みうるし、また特定の実施形態では、該ＡＢＰは、本明細書中の表１に記載したＣＤＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性（好ましくは、少なくとも９０％の配列同一性）を示すアミノ酸配列を有するＣＤＲか、または本明細書中の表１に記載したＣＤＲ配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲを含みうる。
用語「相補性決定領域」（または「ＣＤＲ」または「超可変領域」）は、本明細書中で使用する場合、概して抗体の軽または重鎖の可変領域中に見出される超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１以上を指す。例えば、「ＩＭＧＴ」，Ｌｅｆｒａｎｃら、２００３，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５、ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００１，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０９：６５７、ＡｂｈｉｎａｎｄａｎおよびＭａｒｔｉｎ，２００８，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５：３８３２、Ｋａｂａｔ，ら（１９８７）：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄを参照のこと。これらの表現には、Ｋａｂａｔら（１９８３）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓにより定義された超可変領域、または抗体の３次元構造中の超可変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，１９８７；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１）が含まれる。各鎖中の該ＣＤＲはフレームワーク領域によって近接して保持されており、また他方の鎖由来のＣＤＲと共に、抗原結合部位の形成に寄与している。該ＣＤＲ内には、抗体－抗原相互作用において該ＣＤＲにより使用される重要な接触残基である、選択性決定領域（ＳＤＲ）と記載されている選択アミノ酸が存在する（Ｋａｓｈｍｉｒｉ，２００５；Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５）。
上記の通り、本発明の特定の実施形態では、ＡＢＰは少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含みうる。かかる実施形態の幾つかにおいては、本発明のＡＢＰは、少なくとも１つの相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、例えば表１に示すそれらの重および軽鎖ＣＤＲ３配列から選択される配列（例えば、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、および３９からなるリストから選択される配列）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するもの、または表１に示すそれらの重および軽鎖ＣＤＲ３配列から選択される配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するものを含む。
本発明のＡＢＰは、代替的に、またはＣＤＲ３配列だけでなく、少なくとも１つのＣＤＲ１、および／または少なくとも１つのＣＤＲ２（例えば、抗体由来、特にヒト抗体由来のもの）を含んでいてもよい。好ましくは、本発明のＡＢＰは少なくとも１つのかかるＣＤＲ３、ならびに少なくとも１つのかかるＣＤＲ１および少なくとも１つのかかるＣＤＲ２を含み、より好ましくはかかるＣＤＲの各々が、表１に示す対応する（重および軽鎖）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列から選択される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するか、または表１に示す対応する（重および軽鎖）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列から選択される配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有する。
特定の実施形態では、本発明のＡＢＰは、抗体またはその抗原結合フラグメントでありうる。
本明細書中で使用する場合、用語「抗体」は、そのエピトープへの結合を可能にする任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）として最も広義に理解されうる。従って抗体はＡＢＰの一種である。全長「抗体」または「免疫グロブリン」は一般に、２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から構成される、約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有結合性ジスルフィド結合により重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は重鎖の様々な免疫グロブリンアイソタイプ間で異なる。各重および軽鎖は、規則的に間隔の空いた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、アミノ末端可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続く３つのカルボキシ末端定常ドメイン（ＣＨ）を有する。各軽鎖は、可変Ｎ末端ドメイン（ＶＬ）および単一のＣ末端定常ドメイン（ＣＬ）を有する。該ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に並ぶ、３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有している。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）を含む細胞または因子および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への免疫グロブリンの結合を媒介しうる。他の形態の抗体としては重鎖抗体が挙げられ、これは２つの重鎖のみからなり、かつ抗体に通常見出される２つの軽鎖を欠損したものである。重鎖抗体としては、ラクダ科の動物、例えばヒトコブラクダ、ラクダ、ラマおよびアルパカのｈｃＩｇＧ（ＩｇＧ様）抗体、ならびに軟骨魚類（例えばサメ）のＩｇＮＡＲ抗体が挙げられる。またさらに他の形態の抗体としては、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、開発企業であるＡｂｌｙｎｘにはナノボディと呼ばれている）が挙げられる。単一ドメイン抗体は、典型的には重鎖抗体から作製されるが、従来の抗体から得てもよい。
抗体（またはそのフラグメントを単離できるもの）としては、例えば、キメラ、ヒト化、（完全）ヒト、または二重もしくは多重抗原もしくはエピトープ特異性を示すハイブリッド抗体、抗体フラグメントおよび抗体サブフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）および同類のもの（後述）、例えば任意の免疫グロブリンのハイブリッドフラグメントまたは複合体を形成するために特定の抗原に結合することにより抗体のように作用する任意の天然、合成もしくは遺伝子操作されたタンパク質を挙げることができる。
従って、ある特定の実施形態では、本発明のＡＢＰは抗体重鎖、もしくはその抗原結合フラグメント、および／または抗体軽鎖、もしくはその抗原結合フラグメントを含みうる。
さらなる実施形態では、本発明のＡＢＰは、抗体重鎖可変領域、もしくはその抗原結合フラグメント、および／または抗体軽鎖可変領域、もしくはその抗原結合フラグメントを含む可能性があり、またさらに別の実施形態では、本発明のＡＢＰは、抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに／または抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む可能性がある。
本発明の特定の実施形態では、前記ＡＢＰが抗体重鎖配列および／もしくは抗体軽鎖配列、またはその抗原結合フラグメントを含む場合、該抗体重鎖配列、またはそのフラグメントは、表１に示すそれらの重鎖ＣＤＲ３配列から選択されるＣＤＲ３配列（例えば、配列番号３、１１、１９、２７、および３５からなるリストから選択される配列）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有するＣＤＲ３、または表１に示すそれらの重鎖ＣＤＲ３配列から選択されるＣＤＲ３配列（例えば、配列番号３、１１、１９、２７、および３５からなるリストから選択される配列）と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲ３を含む可能性があり、かつ／あるいはここで抗体軽鎖配列、もしくはそのフラグメントは、表１に示すそれらの軽鎖ＣＤＲ３配列から選択されるＣＤＲ３配列（例えば、配列番号７、１５、２３、３１、および３９からなるリストから選択される配列）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有するＣＤＲ３、または表１に示すそれらの軽鎖ＣＤＲ３配列から選択されるＣＤＲ３配列（例えば、配列番号７、１５、２３、３１、および３９からなるリストから選択される配列）と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲ３を含む可能性がある。
本発明のさらなる実施形態では、前記ＡＢＰが抗体重鎖、またはその抗原結合フラグメントを含む場合、該抗体重鎖の配列、またはそのフラグメントは、配列番号１、９、１７、２５、および３３から選択される配列（例えば表１に開示した重鎖ＣＤＲ１配列）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有するＣＤＲ１、または配列番号１、９、１７、２５、および３３から選択される配列（例えば表１に開示した重鎖ＣＤＲ１配列）と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲ１、ならびに／あるいは配列番号２、１０、１８、２６、および３４から選択される配列（例えば表１に開示したＣＤＲ２配列）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有するＣＤＲ２、または配列番号２、１０、１８、２６、および３４から選択される配列（例えば表１に開示したＣＤＲ２配列）と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲ２をさらに含みうる。
本発明のさらに別の実施形態では、本発明のＡＢＰは抗体軽鎖、またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで該抗体軽鎖の配列、またはそのフラグメントは、配列番号５、１３、２１、２９、および３７から選択される配列（例えば表１に開示した軽鎖ＣＤＲ１配列）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有するＣＤＲ１、または配列番号５、１３、２１、２９、および３７から選択される配列（例えば表１に開示した軽鎖ＣＤＲ１配列）と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲ１、ならびに／あるいは配列番号６、１４、２２、３０、および３８から選択される配列（例えば表１に開示した軽鎖ＣＤＲ２配列）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有するＣＤＲ２、または配列番号６、１４、２２、３０、および３８から選択される配列（例えば表１に開示した軽鎖ＣＤＲ２配列）と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲ２をさらに含む。
本発明の他の実施形態では、本発明のＡＢＰは、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、および４０から選択される配列（例えば、表１に開示したＶＨもしくはＶＬ配列）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有する抗体可変鎖配列、または配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、および４０から選択される配列（例えば、表１に開示したＶＨもしくはＶＬ配列）と比較して１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１つ以下、好ましくは３、２もしくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有する抗体可変鎖配列を含みうる。
本発明の特定の実施形態では、本発明のＡＢＰは抗体の抗原結合フラグメントを含み、ここで該抗原結合フラグメントはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。かかる実施形態の幾つかにおいては、該ＣＤＲ１は表１に開示したものから選択され、該ＣＤＲ２は表１に開示したものから選択されかつ該ＣＤＲ３は表１に開示したものから選択され（例えば、該ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、配列番号１、２、３、または５、６、７、または９、１０、１１、または１３、１４、１５、または１７、１８、１９、または２１、２２、２３、または２５、２６、２７、または２９、３０、３１、または３３、３４、３５、または３７、３８、３９の各アミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列から選択される）、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３または２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、挿入または欠失を伴う。
本発明のさらなる特定の実施形態では、本発明のＡＢＰは、抗体重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに／または抗体軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む可能性があり、ここで該ＣＤＲ１は表１に示す重もしくは軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を有し（例えば配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、および３７からなるリストから選択されるアミノ酸配列を有し）、かつここで該ＣＤＲ２は表１に示す重もしくは軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を有し（例えば配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、および３８からなるリストから選択されるアミノ酸配列を有し）、かつここで該ＣＤＲ３は表１に示す重もしくは軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有し（例えば配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、および３９からなるリストから選択されるアミノ酸配列を有し）、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３または２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、挿入または欠失を伴う。
好適なかかる実施形態では、前記ＡＢＰは、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体重鎖配列と、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体軽鎖配列とからなる抗体、またはその抗原結合フラグメントであってもよく、ここで該抗体重鎖配列の少なくとも１つ、好ましくは両方および該抗体軽鎖配列の少なくとも１つ、好ましくは両方が、表Ａに示す重鎖ＣＤＲの組み合わせのいずれかから選択される組み合わせおよび／または表Ａに示す軽鎖ＣＤＲの組み合わせのいずれかから選択される組み合わせのＣＤＲ１～ＣＤＲ３配列を含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３または２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、挿入または欠失を伴う。特に好適なのは、下記表Ａ中１列目の重および軽鎖配列の組み合わせで示される、かかる抗体である。
表Ａ：重鎖ＣＤＲの好適な組み合わせおよび軽鎖ＣＤＲの好適な組み合わせ
Figure 2023511482000002
好適な実施形態では、本発明は、ＣＤ２７６タンパク質、またはそのバリアントに特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）に関するものであり、かつここで該単離されたＡＢＰが該ＣＤ２７６タンパク質を発現する細胞において抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導可能であり、かつ該ＡＢＰは、
（Ａ）配列番号１に示す抗体重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号２に示す抗体重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３に示す抗体重鎖ＣＤＲ３配列、ならびに配列番号５に示す抗体軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号６に示す抗体軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号７に示す抗体軽鎖ＣＤＲ３配列を含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を伴う［かかるＡＢＰは、内部指定７Ｃ４の本明細書中に開示した抗体であるかもしくは該抗体に由来する］、または
（Ｂ）配列番号９に示す抗体重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１０に示す抗体重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１１に示す抗体重鎖ＣＤＲ３配列、ならびに配列番号１３に示す抗体軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１４に示す抗体軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１５に示す抗体軽鎖ＣＤＲ３配列を含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を伴う［かかるＡＢＰは、内部指定１１Ａ７の本明細書中に開示した抗体であるかもしくは該抗体に由来する］、または
（Ｃ）配列番号１７に示す抗体重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１８に示す抗体重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１９に示す抗体重鎖ＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２１に示す抗体軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号２２に示す抗体軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号２３に示す抗体軽鎖ＣＤＲ３配列を含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を伴う［かかるＡＢＰは、内部指定８Ｄ９の本明細書中に開示した抗体であるかもしくは該抗体に由来する］、または
（Ｄ）配列番号２５に示す抗体重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号２６に示す抗体重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号２７に示す抗体重鎖ＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２９に示す抗体軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号３０に示す抗体軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３１に示す抗体軽鎖ＣＤＲ３配列を含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を伴う［かかるＡＢＰは、内部指定１０Ａ７の本明細書中に開示した抗体であるかもしくは該抗体に由来する］、または
（Ｅ）配列番号３３に示す抗体重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号３４に示す抗体重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３５に示す抗体重鎖ＣＤＲ３配列、ならびに配列番号３６に示す抗体軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号３７に示す抗体軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３８に示す抗体軽鎖ＣＤＲ３配列を含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を伴う［かかるＡＢＰは、内部指定８Ｈ８の本明細書中に開示した抗体であるかもしくは該抗体に由来する］
抗原結合ドメインを少なくとも１つ有する。
本発明の他の好適な実施形態では、前記ＡＢＰは、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体重鎖配列と、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体軽鎖配列とからなる抗体、またはその抗原結合フラグメントであってもよく、ここで該抗体重鎖配列および該抗体軽鎖配列は各々、表Ｂに示す重および軽鎖可変ドメインの組み合わせの可変領域配列を含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは３、２または１つ以下のアミノ酸の置換、挿入または欠失を伴う。特に好適なのは、下記Ｂ中１列目の重および軽鎖配列の組み合わせで示される、かかる抗体である。
表Ｂ：重および軽鎖可変ドメインの好適な組み合わせ
Figure 2023511482000003
本発明の全ＡＢＰの好適な実施形態では、該ＡＢＰは単離されている、および／または実質的に純粋である。
タンパク質、例えばＡＢＰ（その１例は抗体でありうる）との関連において本明細書中で使用する用語「単離された」は、その治療的、診断的、予防的、研究的または他の用途の妨げになるであろうタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の混在物から精製されているタンパク質を指す。本発明による単離されたＡＢＰは、組換え、合成または改変（非天然）ＡＢＰであってもよい。核酸または細胞との関連において本明細書中で使用する用語「単離された」は、その治療的、診断的、予防的、研究的または他の用途の妨げになるであろうＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質もしくはポリペプチドまたは他の混在物（例えば他の細胞）から精製されている核酸または細胞を指すか、あるいは該用語は組換え、合成または改変（非天然）核酸を指す。好ましくは、単離されたＡＢＰまたは核酸または細胞は実質的に純粋である。この関連で、「組換え」タンパク質または核酸は、組換え技術を利用して作製されたものである。組換え核酸およびタンパク質の製造のための方法および技術は当分野で周知である。
タンパク質、例えばＡＢＰ（その１例は抗体でありうる）との関連において本明細書中で使用する用語「単離された」は、その治療的、診断的、予防的、研究的または他の用途の妨げになるであろうタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の混在物から精製されているタンパク質を指す。本発明による単離されたＡＢＰは、組換え、合成または改変（非天然）ＡＢＰであってもよい。核酸または細胞との関連において本明細書中で使用する用語「単離された」は、その治療的、診断的、予防的、研究的または他の用途の妨げになるであろうＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質もしくはポリペプチドまたは他の混在物（例えば他の細胞）から精製されている核酸または細胞を指すか、あるいは該用語は組換え、合成または改変（非天然）核酸を指す。好ましくは、単離されたＡＢＰまたは核酸または細胞は実質的に純粋である。この関連で、「組換え」タンパク質または核酸は、組換え技術を利用して作製されたものである。組換え核酸およびタンパク質の製造のための方法および技術は当分野で周知である。
幾つかの実施形態では、本発明のＡＢＰは、ＣＤ２７６またはそのパラログ、オルソログもしくは他のバリアント（例えば本明細書中に記載の任意のＣＤ２７６またはバリアント）に（例えば、その１以上のドメインにより提示される１以上のエピトープを介して）、２０ｎＭ未満、例えば約１０ｎＭ、５ｎＭまたは２ｎＭ未満（特に、約１ｎＭ未満）のＫＤで結合しうる。好適な実施形態では、本発明のＡＢＰは、該ＣＤ２７６またはバリアント（例えば、その該エピトープ）を１００ｐＭ未満のＫＤで結合するだろう。より好適な実施形態では、本発明のＡＢＰは、該ＣＤ２７６またはバリアントを約（＋／－５）１０ｐＭのＫＤで結合するだろう。該ＣＤ２７６またはバリアントを発現するヒト細胞系への、本発明の抗体などの本発明のＡＢＰの結合は、幾つかの実施形態では、約１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬまたは０．２μｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０、好ましくは２μｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０で生じうる。該ＣＤ２７６またはバリアントのオルソログを発現するカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）の細胞系への、本発明の抗体などの本発明のＡＢＰの結合は、幾つかの実施形態では、約１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ未満、５０ｎｇ／ｍＬ未満、または２５ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ未満、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ未満、最も好ましくは約４ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０で生じうる。
他の実施形態では、本発明のＡＢＰは、（ｉ）前記ＣＤ２７６、または前記ＣＤ２７６のバリアントに、２０ｎＭ未満、例えば約１０ｎＭ、５ｎＭもしくは２ｎＭ未満（特に、約１ｎＭ未満）であるか、１００ｐＭ未満であるか、または約１０ｐＭであるＫＤで結合しうるし、かつ／あるいは（ｉｉ）該ＣＤ２７６または該ＣＤ２７６のバリアントを発現するヒト細胞系に１０ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０で結合しうる。
用語「ＫＤ」は、本明細書中で使用する場合、Ｋａに対するＫｄの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）で得られる解離定数を指すものとし、モル濃度（Ｍ）で表される。抗体のＫＤ値は当分野で十分に確立された方法、例えばプラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））、ＥＬＩＳＡおよびＫＩＮＥＸＡを利用して決定することができる。抗体に関する該ＫＤを決定するための好適な方法は、表面プラズモン共鳴を利用することによるもの、好ましくはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）装置などのバイオセンサー装置を利用することによるもの、またはＥＬＩＳＡによるものである。「Ｋａ」（または「Ｋ－ａｓｓｏｃ」）は、本明細書中で使用する場合、概して特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すが、用語「Ｋｄ」（または「Ｋ－ｄｉｓｓ」）は、本明細書中で使用する場合、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指す。
ある実施形態では、本発明のＡＢＰがポリクローナル抗体（混合物）であるか、または前記抗原結合フラグメントがポリクローナル抗体（混合物）のフラグメントである。
本発明の全ＡＢＰの代替的かつ好適な実施形態では、該ＡＢＰが抗体またはその抗原結合フラグメントであり、かつ該抗体がモノクローナル抗体であるか、またはここで該抗原結合フラグメントがモノクローナル抗体のフラグメントである。
本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、そのアミノ酸配列に基づいて実質的に同一の抗体の集団から取得される抗体を指す。モノクローナル抗体は典型的には高度に特異的である。さらに、典型的には抗原の種々の決定基（例えばエピトープ）に対する種々の抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、各ｍＡｂは典型的には抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、ｍＡｂは、それらが他の免疫グロブリンによる汚染のない細胞培養（ハイブリドーマ、組換え細胞など）により合成可能であるという点で有利である。ｍＡｂは、本明細書中では、例えばキメラの、ヒト化した、またはヒトの抗体または抗体フラグメントを含む。
本発明によるモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により調製してもよい。例えば、マウス、ラットまたはウサギを、アジュバントと共に目的の抗原で免疫してもよい。ある特定の間隔で数回の免疫を行った動物から脾細胞をプールとして採取し、併せて試験用血液採取（ｔｅｓｔ ｂｌｅｅｄｓ）を血清抗体価について評価するために実施する。調製した脾細胞は、融合実験で直ちに使用するか、または今後の融合の際に使用するために液体窒素中で保存する。次に融合実験をＳｔｅｗａｒｔおよびＦｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８９，１２３：４５－５３の手順に従って実施する。ハイブリッドを増殖させているウェルから得た上清を、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりｍＡｂ分泌型に関してスクリーニングする。ＥＬＩＳＡ陽性培養物を限界希釈または蛍光活性化セルソーティングのいずれかによりクローン化することで、典型的には単一コロニーから樹立したハイブリドーマが得られる。抗体フラグメントまたはサブフラグメントを含む抗体の、特定抗原に結合する能力は、当分野で公知の結合アッセイにより、例えば、目的の抗原を結合パートナーとして使用して、判定することができる。
さらなる好適な実施形態では、本発明のＡＢＰは抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ここで該抗体はヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト抗体であるか、またはここで該抗原結合フラグメントはヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト抗体のフラグメントである。
ヒト抗体もまたｉｎ ｖｉｔｒｏ法により誘導することができる。適切な例としてはファージディスプレイ法（ＣＡＴ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏｍａ、Ｙｕｍａｂ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ、Ａｆｆｉｍｅｄ）などが挙げられるが、これらに限定されない。ファージディスプレイ法では、単一ＦａｂまたはＦｖ抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを、ファージ粒子の表面上に発現させる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：５８１（１９９１）、米国特許第５，８８５，７９３号を参照のこと）。ファージは、標的に対する親和性を有するそれらの抗体フラグメントを同定するために「スクリーニング」される。従って、かかる過程の一部は、繊維状バクテリオファージの表面における抗体フラグメントレパートリーの提示と、その後の標的へのその結合によるファージの選択を通じて免疫選択を模倣している。一部のかかる手順では、高親和性の機能性中和抗体フラグメントが単離される。従って、ヒト抗体遺伝子の完全なレパートリーを、末梢血リンパ球から自然に再配列したヒトＶ遺伝子をクローン化することにより（例えば、Ｍｕｌｌｉｎａｘら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８７：８０９５－８０９９（１９９０）を参照のこと）、またはヒト抗体配列を用いて完全合成もしくは半合成ファージディスプレイライブラリを作製することにより（Ｋｎａｐｐｉｋら２０００；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７、ｄｅ Ｋｒｕｉｆら、１９９５；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８）：９７を参照のこと）、創出してもよい。
本明細書中に記載した抗体は、選択的に、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術の利用を通じて調製してもよい。かかるマウスはヒトの免疫グロブリン分子および抗体を産生する能力があり、かつマウスの免疫グロブリン分子および抗体の産生が欠損している。特に、マウスおよび抗体のトランスジェニック作製の好適な実施形態は、米国特許出願第０８／７５９，６２０号（１９９６年１２月３日出願）ならびに国際特許出願ＷＯ９８／２４８９３（１９９８年６月１１日公開）およびＷＯ００／７６３１０（２０００年１２月２１日公開）に開示されている。Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６－１５６（１９９７）も参照のこと。かかる技術の利用を通じて、様々な抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が作製されている。本質的には、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系のマウスを目的の抗原、例えばＣＤ２７６で免疫し、リンパ細胞（例えば、Ｂ細胞）を過免疫マウスから回収してから、その回収したリンパ球を骨髄性の細胞系と融合することにより、不死ハイブリドーマ細胞系を調製する。これらのハイブリドーマ細胞系をスクリーニングし選別することにより、目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を同定する。他の「ヒト化」マウス、例えば、Ｍｅｄａｒｅｘ－ＨｕＭａｂマウス、Ｋｙｍａｂ－Ｋｙｍｏｕｓｅ、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ－Ｖｅｌｏｃｉｍｍｕｎｅマウス、Ｋｉｒｉｎ－ＴＣマウス、Ｔｒｉａｎｎｉ－Ｔｒｉａｎｎｉマウス、ＯｍｎｉＡｂ－ＯｍｎｉＭｏｕｓｅ、Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｈ２Ｌ２マウス、Ｍｅｒｕｓ－ＭｅＭｏマウスも市販されている。「ヒト化」した他の種、すなわちラット：ＯｍｎｉＡｂ－ＯｍｎｉＲａｔ、ＯＭＴ－ＵｎｉＲａｔ．Ｃｈｉｃｋｅｎ：ＯｍｎｉＡｂ－ＯｍｎｉＣｈｉｃｋｅｎも利用可能である。
本発明による用語「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列（ただし典型的には、まだ少なくとも一部）を含有する、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、もしくは抗体の他の抗原結合性部分配列）を指す。大抵の場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、該レシピエント抗体のＣＤＲ残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種免疫グロブリン（ドナー抗体）からのＣＤＲ残基で置き換えられている。そのため、該抗体またはそのフラグメントのフレームワーク配列の少なくとも一部は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列でありうる。一部の例では、特異性または親和性を増大させるために、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を対応する非ヒト残基で置き換える必要がある。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入したＣＤＲまたはフレームワーク配列中にも見出されない残基を含みうる。これらの改変は、抗体性能をさらに改善して最大化するために行われる。一般に、該ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的には少なくとも２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、該可変ドメイン中の全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、かつ全てまたは実質的に全てのフレームワーク領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である。該ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれも含み、該（例えばヒト）免疫グロブリン定常領域を（例えば突然変異または糖鎖工学により）改変することで、かかる領域の１以上の性質を最適化する、および／または（例えば治療用）抗体の機能を改善する、例えばＦｃエフェクター機能を向上もしくは低下させる、または血清中半減期を延長することができる。例示的なかかるＦｃ改変（例えば、Ｆｃ操作またはＦｃ増強）は本明細書中の他の箇所に記載する。
本発明による用語「キメラ抗体」は、その軽および／または重鎖遺伝子が、マウスおよびヒトなどの異なる種の対応配列と同一であるかまたは相同である免疫グロブリン可変および定常領域から、典型的には遺伝子操作により構築された抗体を指す。あるいは、可変領域遺伝子は特定の抗体クラスまたはサブクラスに由来するが、その鎖の残部は同じであるかまたは異なる種の別の抗体クラスまたはサブクラスに由来する。これはかかる抗体のフラグメントにも当てはまる。例えば、典型的な治療用キメラ抗体は、マウス抗体からの可変または抗原結合ドメインと、ヒト抗体からの定常またはエフェクタードメインとからなるハイブリッドタンパク質であるが、他の哺乳動物種を使用してもよい。
かかる実施形態の詳細においては、本発明のＡＢＰは抗体の抗原結合ドメインを含み、ここで該抗原結合ドメインはヒト抗体の抗原結合ドメインである。好ましくは、ＡＢＰは抗体またはその抗原結合フラグメントの抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインはヒト抗原結合ドメインであり、（ｉｉ）該抗体はモノクローナル抗体であり、すなわちここで該抗原結合フラグメントはモノクローナル抗体のフラグメントであり、また（ｉｉｉ）該抗体はヒト抗体またはヒト化抗体であり、すなわちここで該抗原結合フラグメントはヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト抗体のフラグメントである。
ヒト抗体の軽鎖は一般にカッパおよびラムダ軽鎖として分類され、またこれらの各々が１つの可変領域と１つの定常ドメインを含有する。重鎖は典型的にはミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロン鎖として分類され、またこれらが抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ。ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義付けている。ヒトＩｇＧには、限定するものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む幾つかのサブタイプがある。ヒトＩｇＭのサブタイプとしては、ＩｇＭ、およびＩｇＭ２が挙げられる。ヒトＩｇＡのサブタイプとしてはＩｇＡ１およびＩｇＡ２が挙げられる。ヒトの場合、該ＩｇＡおよび該ＩｇＤのアイソタイプは４つの重鎖と４つの軽鎖を含有しており、該ＩｇＧおよび該ＩｇＥのアイソタイプは２つの重鎖と２つの軽鎖を含有しており、また該ＩｇＭのアイソタイプは１０または１２の重鎖と１０または１２の軽鎖を含有している。本発明による抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ免疫グロブリンでありうる。
幾つかの実施形態では、本発明のＡＢＰはＩｇＧ抗体またはそのフラグメントである。幾つかの実施形態では、本発明のＡＢＰはＩｇＥ抗体またはそのフラグメントである。幾つかの実施形態では、本発明のＡＢＰはＩｇＤ抗体またはそのフラグメントである。幾つかの実施形態では、本発明のＡＢＰはＩｇＡ抗体またはそのフラグメントである。幾つかの実施形態では、本発明のＡＢＰはＩｇＭ抗体またはそのフラグメントである。好ましくは、本発明のＡＢＰは、ＩｇＧ免疫グロブリンまたはそのフラグメント、例えば、ヒト、ヒト由来のＩｇＧ免疫グロブリン、またはウサギもしくはラット由来のＩｇＧ、および／またはＩｇＧ２免疫グロブリン、あるいはそのフラグメントであるか、それらを含むかまたはそれらに由来する。本発明のＡＢＰがラット由来のＩｇＧであるか、それを含むかまたはそれに由来するならば、その際は好ましくは、該ＡＢＰはラットＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ免疫グロブリンであるか、それを含むかまたはそれに由来する。本発明のＡＢＰがヒト由来のＩｇＧであるか、それを含むかまたはそれに由来するならば、その際はより好ましくは、本発明のＡＢＰはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であるか、それを含むかまたはそれに由来するものであり、最も好ましくは、本発明のＡＢＰはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２であるか、それらを含むかまたはそれらに由来する。
従って、本発明の特定の実施形態では、ＡＢＰは抗体であり、ここで該抗体はＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ免疫グロブリンである。
本発明のＡＢＰは、免疫グロブリン定常領域（典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部を含む場合、かかる領域の１以上の性質を最適化するため、および／または（例えば治療用）抗体の機能を改善するため、例えばＦｃエフェクター機能を向上もしくは低下させるかまたは血清中半減期を延長するために（例えば、例として糖鎖工学または突然変異により）改変された、かかる（例えばヒト）免疫グロブリン定常領域を有していてもよい。
本発明のＡＢＰ、特に本発明の方法において有用な該ＡＢＰには、ＣＤ２７６発現細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する抗体が含まれる。抗ＣＤ２７６抗体のＡＤＣＣは、低レベルのフコースを有するかまたはフコースが欠損した抗体を使用することにより改善できる。フコースが欠損した抗体は、特に低用量の抗体で、増強されたＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性と関連付けられている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｈ，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｈ，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６）。
フコースを欠いた抗体またはフコースレベルが低下した抗体を調製する方法として、ラットのミエローマＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２）の増殖が挙げられる。ＹＢ２／０細胞は、ポリペプチドのフコシル化に必要な酵素（α１，６－フコシルトランフェラーゼ）をコードする、低レベルのＦＵＴ８ ｍＲＮＡを発現する。
あるいは、かかる抗体の発現の最中に、ツニカマイシン（Ｎ－グリコシド結合型糖鎖の前駆体であるコアオリゴ糖の形成の第１段階であるＧｌｃＮＡｃ－Ｐ－Ｐ－Ｄｏｌの形成を選択的に阻害する）、カスタノスペルミンおよびＷ－メチル－１－デオキシノジリマイシン（グリコシダーゼＩの阻害物質である）、キフネンシン（マンノシダーゼＩの阻害物質である）、ブロモコンズリトール（グリコシダーゼＩＩの阻害物質である）、１－デオキシノジリマイシンおよび１，４－ジオキシ－１，４－イミノ－Ｄ－マンニトール（マンノシダーゼＩの阻害物質である）、スワインソニン（マンノシダーゼＩＩの阻害物質である）、スワインソニン（マンノシダーゼＩＩの阻害物質である）などを含む、糖鎖の修飾に関する酵素に対する阻害物質を使用してもよい。グリコシルトランスフェラーゼに特異的な阻害物質の例としては、Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼＶ（ＧｎＴＶ）に対する基質のデオキシ誘導体などが挙げられる。同様に、１－デオキシノジリマイシンは複合型糖鎖の合成を阻害しかつ高マンノース型および混成型糖鎖の割当て量を増大させることが知られている（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ｓｅｒｉｅｓ ２－Ｄｅｓｔｉｎｙ ｏｆ Ｓｕｇａｒ Ｃｈａｉｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ，Ｋａｔｓｕｔａｋａ Ｎａｇａｉ，Ｓｅｎｉｃｈｉｒｏ ＨａｋｏｍｏｒｉおよびＡｋｉｒａ Ｋｏｂａｔａにより編集，１９９３）。
これらのデータを基に、様々な病状において利用しうるＦｃγＲに関連する具体的な特性を示す治療用モノクローナル抗体を選別する目的で、ＩｇＧのグリコシル化パターンを操作するため、幾つかの細胞系が遺伝子操作され、フコースを含有しないかまたは低レベルのフコースを含有する抗体が作製されている（Ｍｏｒｉら、２００４；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉら、２００４）。
ＵｍａｎａらおよびＤａｖｉｓらにより、増加した量の二分岐（bisected）複合オリゴ糖（二分岐（bisecting）Ａ／－アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮＡＣ）を含有するよう操作されたＩｇＧ１抗体が、その親対応物と比較して強力なＡＤＣＣの誘発を可能にすることが示された（Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｄａｖｉｅｓら、２００１）。第２に、ヒトＩｇＧ１ Ｎ－結合型オリゴ糖上のフコースの欠損がＦＣＧＲＩＩＩ結合およびＡＤＣＣを改善することが示された。
ＧＬＹＣＡＲＴ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＧ（Ｚｕｒｉｃｈ，ＣＨ）により、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系において前記Ｎ－結合型オリゴ糖への前記二分岐ＧｌｃＮａｃ残基の付加を触媒するＮ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）が明示されており、また作製したＩｇＧ１抗体のより強いＡＤＣＣが示されている（ＷＯ９９／５４３４２、ＷＯ０３／０１ １８７８、ＷＯ２００５／０４４８５９）。
ＷＯ２００７０１６６３０６は、（ｉ）抗ＣＤ１９抗体に対するｃＤＮＡおよび（ｉｉ）前記ＧｎＴＩＩＩ酵素に対するｃＤＮＡをトランスフェクトした哺乳動物ヒト２９３Ｔ胎児腎臓細胞において産生された６０％のＮ－アセチルグルコサミン二分岐オリゴ糖および１０％の非フコシル化Ｎ－アセチルグルコサミン二分岐オリゴ糖を含有する抗体抗ＣＤ１９の改変に関連している。
ＹＢ２／０細胞（Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３、Ｓｉｂｅｒｉｌら、２００６）またはＣＨＯ－Ｌｅｃ１３（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２）で産生させた、野生型ＣＨＯ細胞で産生された同じＩｇＧ１と比較して低フコース含有量を示すかまたはフコースが欠損した組換えヒトＩｇＧ１は、細胞性細胞傷害を誘発する能力の増強を示した。対照的に、ガラクトースとＡＤＣＣとの間に相関関係は認められず、また二分岐ＧｌｃＮＡＣの含有量のみがＡＤＣＣにわずかに影響を及ぼした（Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３）。
前記抗体の前記Ｆｃ部分からフコースを除去するかまたは置き換えることにより、協和発酵工業（東京、日本）はＦｃ結合を増強してＡＤＣＣを改善し、結果としてＭＡｂの有効性を改善した（ＵＳ６，９４６，２９２）。この低フコシル化ＩｇＧの改善されたＦｃγＲＩＩＩＡ依存性エフェクター機能は、ＦｃγＲＩＩＩ対立遺伝子型とは無関係であることが示されている（Ｎｉｗａら、２００５）。さらに、ＩｇＧが高フコシル化ＩｇＧと比較して少ない含有量のフコースを有する場合、効率的なＡＤＣＣを誘導するために必要とされる抗原密度は低いことが最近になって示された（Ｎｉｗａら、２００５）。
Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｆｒａｎｇａｉｓ ｄｕ Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＬＦＢ）（フランス）により、高ＡＤＣＣを示す抗体を得るためにはＭＡｂオリゴ糖中のＦｕｃ／Ｇａｌ比は等しいかまたは０．６未満であるべきということが示された（ＦＲ２ ８６１ ０８０）。
Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉら（２０１９）は、α１，６－フコシルトランフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が欠損したＭｓ－７０４ＰＦ ＣＨＯ細胞において抗ＣＤ１９抗体を作製しており、この論文中では該抗体の非フコシル化は酵素欠損細胞系の操作を必要とする。この論文ではアミノ酸変異は考慮されていない。
Ｈｅｒｂｓｔらは、フコシルトランフェラーゼ－欠損プロデューサーＣＨＯ細胞系で発現させたヒト化ＩｇＧ１ ＭＡｂ ＭＥＤＩ－５５１を作製した。この論文ではアミノ酸変異は考慮されていない（Ｈｅｒｂｓｔら、２０１０）。Ｓ．Ｓｉｂｅｒｉｌらは、ラットのミエローマＹＢ２／０細胞系を使用することにより、フコース含有量が少ないＭＡｂ抗ＲｈＤを作製した。野生型ＣＨＯで産生されたＭＡｂが高いフコース含有量（８１％）を示す一方で、ＹＢ２／０細胞で産生された同じＭＡｂはより低いフコース含有量（３２％）を示した。この論文ではアミノ酸変異は考慮されていない（Ｓｉｂｅｒｉｌら、２００６）。
従って、本発明のＡＢＰは、上記のかかる糖鎖工学（例えば脱フコシル化）アプローチ／抗体の特徴の１以上を有するように調製してもよく、かつ／または有していてもよい。
本発明のＡＢＰに関するＡＤＤＣ活性を増大させるための代替法には、かかるＡＢＰのＦｃ部分の突然変異、特にＦｃγＲ受容体に対する抗体親和性を増大させる突然変異が含まれる。
従って、上記の本発明のＡＢＰのいずれかを、種々のアイソタイプまたは変異アイソタイプを用いて作製することにより、種々のＦｃγ受容体への結合の程度を制御することができる。Ｆｃ領域を欠く抗体（例えば、Ｆａｂフラグメント）は、種々のＦｃγ受容体への結合を欠く。アイソタイプの選択もまた、種々のＦｃγ受容体への結合に影響を及ぼす。３つの異なるＦｃγ受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩに対する様々なヒトＩｇＧアイソタイプの各親和性が決定されている（ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，４５７（１９９１）を参照のこと）。ＦｃγＲＩは、単量体型のＩｇＧに結合する高親和性受容体であり、後者２つは多量体型のＩｇＧにのみ結合する低親和性受容体である。一般に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は共に３つの受容体全てに対して有意な結合活性を有し、ＩｇＧ４はＦｃγＲＩに対して、またＩｇＧ２はＩＩａＬＲと呼ばれる１種類のＦｃγＲＩＩのみに対して有意な結合活性を有する（Ｐａｒｒｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，６９５（１９９２）を参照のこと）。従って、ヒトアイソタイプＩｇＧ１は、通常はＦｃγ受容体へのより強い結合が望ましい場合に選択され、またＩｇＧ２は通常はより弱い結合のために選択される。
増大したＦｃγＲ結合と変異型Ｆｃとの相関関係は、標的化細胞傷害細胞ベースアッセイ（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｈ，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１－６６０４、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｈ，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：４８７－４９０）を利用して実証されている。特定のＦｃ領域変異を通じてＡＤＣＣ活性を増大させるための方法には、２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０および３３２からなる群より選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＦｃバリアントが含まれ、ここで該Ｆｃ領域中の残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｈ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９８７））に記載されたＥＵインデックスのものである。
ある特定の具体的な実施形態では、前記Ｆｃバリアントは、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｒ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｙ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３Ｑ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｖ２６２Ｉ、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２６２Ｔ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６４Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｙ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｔ、Ｖ２６６Ｉ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｌ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ｙ２９６Ｈ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｅ、Ａ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｅ、Ｗ３１３Ｆ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｉ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ａ３２７Ｎ、Ａ３２７Ｌ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｎ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ｌ３２８Ｈ、Ｌ３２８Ａ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２ＹおよびＩ３３２Ａからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含み、ここで該Ｆｃ領域中の残基のナンバリングはＫａｂａｔに記載されたＥＵインデックスのものである。
またＦｃバリアントは、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４１Ｌ／Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ／Ｖ２６２Ａ／Ｖ２６４Ａ、Ｆ２４１Ｌ／Ｖ２６２Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｗ、Ｆ２４１Ｙ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２３８Ｍ／Ｉ３３２Ｅ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｗ３１３Ｆ、Ｐ２４４Ｈ／Ｐ２４５Ａ／Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／２６４Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｇ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｑ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｔ２９９Ｉ、Ａ３２７Ｎ、Ｓ２６７Ｑ／Ａ３２７Ｓ、Ｓ２６７Ｌ／Ａ３２７Ｓ、Ａ３２７Ｌ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｄ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｓ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｆ／Ｎ２９７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６６Ｉ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｆ２４１Ｙ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ａ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ｌ３２８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｈ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ａ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２Ｙ、Ｉ３３２Ａ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｖ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｉ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｌ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｆ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｈ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｎ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｑ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｈ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｆ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｈ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、およびＳ２３９Ｄ／２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅからなる群より選択することも可能であり、ここで該Ｆｃ領域中の残基のナンバリングはＫａｂａｔに記載されたＥＵインデックスのものである。本明細書中に参照により組み込まれるＷＯ２００４０２９２０７も参照のこと。
特定の実施形態では、ヒンジリンク領域中の部位上の、該部位に隣接する、または該部位に近接する変異（例えば、残基２３４、２３５、２３６および／または２３７を別の残基に置き換える変異）は、Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩ受容体に対する親和性を低減するために、前記アイソタイプの全てにおいて作製することができる（例えば、ＵＳ６６２４８２１を参照のこと）。場合によっては、２３４位、２３６位および／または２３７位をアラニンと置換し、かつ２３５位をグルタミン酸と置換する（例えばＵＳ５６２４８２１を参照のこと）。２３６位はヒトＩｇＧ２アイソタイプでは欠損している。ヒトＩｇＧ２の２３４位、２３５位および２３７位に対するアミノ酸の例示的セグメントは、Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ、Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ、Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ、Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ、およびＡｌａ Ｇｌｕ Ａｌａである。変異の好適な組み合わせは、ヒトアイソタイプＩｇＧ１の場合はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａであるか、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａである。本発明の特に好適なＡＢＰは、ヒトアイソタイプＩｇＧと、Ｆｃ領域のこれら３つの変異のうちの１つとを有する抗体である。Ｆｃγ受容体への結合を減少させる他の置換は、（特にマウスＩｇＧ１における）Ｅ２３３Ｐ変異および（特にマウスＩｇＧ２ａにおける）Ｄ２６５Ａである。Ｆｃおよび／またはＣ１ｑ結合を低減する変異および変異の組み合わせの他の例は、（特にマウスＩｇＧ１における）Ｅ３１８Ａ／Ｋ３２０Ａ／Ｒ３２２Ａ、（特にマウスＩｇＧ２ａにおける）Ｌ２３５Ａ／Ｅ３１８Ａ／Ｋ３２０Ａ／Ｋ３２２Ａである。同様に、ヒトＩｇＧ４中の残基２４１（Ｓｅｒ）を、例えばプロリンと置き換えることにより、Ｆｃ結合を破壊することができる。
エフェクター活性をモジュレートするために、定常領域にさらなる変異を作製することができる。例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａの定常領域にＡ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、または両方の変異を生じさせることができる。ＩｇＧ４の場合は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４ＶおよびＬ２３５Ａの変異、ならびにＧ２３６欠失、またはこれらの任意の組み合わせを作製することができる。ＩｇＧ４には、Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅの一方または両方の変異を保有させることもできる。エフェクター機能をモジュレートするための破壊された定常領域配列の使用については、例えばＷＯ２００６１１８，９５９およびＷＯ２００６０３６２９１にさらに記載されている。
エフェクター活性をモジュレートするために、ヒトＩｇＧの定常領域にさらなる変異を作製することができる（例えば、ＷＯ２００６０３２９１を参照のこと）。これらの変異には、ヒトＩｇＧ１に対する次の置換、すなわち（ｉ）Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、（ｉｉ）Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６欠失、（ｉｉｉ）Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、（ｉｖ）Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６欠失、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、ならびに（ｖ）Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、または特に、（ｖｉ）（例えば、ヒトＩｇＧ１に対する）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓが含まれ、ここでＦｃ領域中の残基のナンバリングはＫａｂａｔに記載されたＥＵインデックスのものである。本明細書中に参照により組み込まれるＷＯ２００４０２９２０７も参照のこと。
前記ＦｃＲに対する抗体の親和性は、重鎖定常領域のある特定の残基を変異させることにより変更できる。例えば、ヒトＩｇＧ１のグリコシル化部位の破壊により、該抗体のＦｃＲ結合、ひいてはそのエフェクター機能を低減することができる（例えばＷＯ２００６０３６２９１を参照のこと）。トリペプチド配列ＮＸＳおよびＮＸＴ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）は、該Ｎ残基のグリコシル化の際の酵素認識部位である。該トリペプチドアミノ酸のいずれかの破壊、特にＩｇＧのＣＨ２領域での破壊は、その部位でのグリコシル化を阻止する。例えば、ヒトＩｇＧ１のＮ２９７の変異は、グリコシル化を阻止し、かつこの抗体へのＦｃＲ結合を低減する。
Ｆｃ受容体結合の好適な増強は、本明細書中では通常「ＳＤＩＥ」（変異Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅを意味する）と称される、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン変異体を導入することにより達成できる。
ＡＤＣＣおよびＣＤＣの活性化は治療用抗体にとって望ましいことが多いが、エフェクター機能を活性化できない本発明のＡＢＰ（例えば、寛容なモジュレーター（ａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）である本発明のＡＢＰ）が好適な場合がある。これらの目的のためにＩｇＧ４が一般に使用されてきたが、これはＦａｂアーム交換を経るこのサブクラスの特有の性能（ｉｎ ｖｉｖｏではＩｇＧ４間で重鎖が入れ替わる可能性がある）のために近年は支持されていない。従って、Ｆｃ操作アプローチを同様に使用することにより、ＦｃドメインとＦｃγ受容体およびＣ１ｑとの重要な相互作用部位を決定し、その後例えば本発明のＡＢＰのＦｃにおいてこれらの位置を変異させて、結合を低減または消失させることができる。アラニンスキャニングを通じて、ＤｕｎｃａｎおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９８；Ｎａｔｕｒｅ ３３２：７３８）は、Ｆｃドメインのヒンジ部と上部ＣＨ２にわたる領域へのＣ１ｑの結合部位を初めて特定した。Ｇｅｎｍａｂ社の研究者らは、変異体Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを同定しており、これらは組み合わせると、ＦｃγＲおよびＣ１ｑ結合をほぼ完全に消失させるのに十分なものである（Ｈｅｚａｒｅｈら、２００１；Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５：１２１６１）。同様の方法で、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ社は後に、非常に類似した効果を有する一連の３つの変異、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（ＴＭと称される）を同定した（Ｏｇａｎｅｓｙａｎら、２００８；Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ ６４：７００）。代替アプローチは、最適なＦｃＲ相互作用に必要であることが知られている、Ｆｃドメインのアスパラギン２９７に対するグリコシル化の修飾である。ＦｃＲへの結合の喪失は、Ｎ２９７点突然変異（Ｔａｏら、１９８９；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４３：２５９５）、酵素的に脱グリコシル化したＦｃドメイン（Ｍｉｍｕｒａら、２００１；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：４５５３９）、グリコシル化阻害物質の存在下で組換えにより発現させた抗体（Ｗａｌｋｅｒら、１９８９；Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２５９：３４７）および細菌でのＦｃドメインの発現（Ｍａｚｏｒら２００７；Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５：５６３）において観察されている。従って、本発明は、かかる技術または変異を利用してエフェクター機能を低減させたＡＢＰの実施形態も含む。
ＩｇＧは本来、およそ２１日という典型的な半減期を与えるＦｃＲｎ媒介性リサイクリングにより（例えばヒト）血清中に長期間にわたり存続する。こうした事情にもかかわらず、該ＦｃＲｎとのＦｃドメインのｐＨ依存性相互作用を操作することにより、ｐＨ７．４では最小限の結合を保持しつつｐＨ６．０での親和性を増大させるための数多くの試みが為されている。ＰＤＬ ＢｉｏＰｈａｒｍａ社の研究者らは、アカゲザルにおいてＩｇＧの半減期のおよそ２倍の増大をもたらす変異Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌを同定し（Ｈｉｎｔｏら、２００４；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：６２１３）、またＭｅｄＩｍｍｕｎｅ社の研究者らは、カニクイザルにおいてＩｇＧの半減期のおよそ４倍の増大をもたらす変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥと称される）を同定した（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，ら２００６；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２３５１４）。本発明のＡＢＰはＰＥＧ化されていてもよい。ＰＥＧ化、すなわち合成ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との化学結合は、持続性作用を発揮する生物製剤の開発のための、一般に認められた技術として登場し、今日までに約１０種の臨床的に承認されたタンパク質薬およびペプチド薬が存在する（Ｊｅｖｓｅｖａｒら、２０１０；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ５：１１３）。本発明のＡＢＰは、薬剤的に活性なタンパク質の血漿中半減期を延長するためのＰＥＧ化の生物学的代替法である、ＰＡＳ化を施してもよい（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙら、２０１３；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２６：４８９；ＸＬ－ｐｒｏｔｅｉｎ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。従って、本発明は、かかる技術または変異を利用して（特にヒト血清における）血清中半減期を延長したＡＢＰの実施形態も含む。
抗体フラグメントは、軽鎖の隣接する定常領域と重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）により結び付けられた、重鎖および軽鎖の各々の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインからなる「Ｆａｂフラグメント」を含む。これらは従来の抗体から、例えばパパインによるプロテアーゼ消化により形成してもよいが、同様のＦａｂフラグメントを遺伝子操作により作製してもよい。Ｆａｂフラグメントには、Ｆａｂ’、Ｆａｂおよび「Ｆａｂ－ＳＨ」（少なくとも１つの遊離スルフヒドリル基を含有するＦａｂフラグメント）が含まれる。
Ｆａｂ’フラグメントは、それらが抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含む重鎖の第１定常ドメインのカルボキシ末端に追加の残基を含有する点でＦａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’フラグメントには、「Ｆａｂ’－ＳＨ」（少なくとも１つの遊離スルフヒドリル基を含有するＦａｂ’フラグメント）が含まれる。
さらに、抗体フラグメントには、２つの軽鎖と、ＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の定常領域の一部（「ヒンジ領域」）を含有する２つの重鎖とを含有し、鎖間ジスルフィド結合がこれら２つの重鎖間で形成されるような、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが含まれる。従って、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、それら２つの重鎖間のジスルフィド結合により結び付けられた２つのＦａｂ’フラグメントからなる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域より下で切断する酵素による（例えばペプシンによる）タンパク質切断により、または遺伝子操作により、従来の抗体から調製してもよい。
「Ｆｖ領域」は、重および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域が欠如している。「一本鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」は、重および軽鎖可変領域がフレキシブルリンカーにより連結されて単一ポリペプチド鎖を形成し、該鎖が抗原結合領域を形成する、Ｆｖ分子である。
「Ｆｃ領域」は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含む。かかる２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合、および該ＣＨ３ドメインの疎水性相互作用により結び付けられている。
従って、幾つかの実施形態では、本発明のＡＢＰは、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆａｂ－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびＦ（ａｂ’）２からなるリストから選択される抗体フラグメントである。
抗体フラグメントなどの免疫グロブリンのフラグメントであるＡＢＰのそうした実施形態では、好適なのは、本明細書中に記載した任意のエピトープまたは他の結合特徴などの、ＣＤ２７６、またはそのパラログ、オルソログもしくは他のバリアントの細胞外ドメイン（例えば、該ドメインにより提示されるエピトープ）に結合する能力があるそれらのフラグメントであり、またより好ましくは、該フラグメントはＣＤ２７６またはＣＤ２７６のパラログ、オルソログもしくは他のバリアントの発現、機能、活性および／または安定性のモジュレーター（例えば、阻害物質またはアンタゴニスト）である。
好適な実施形態では、本発明のＡＢＰは、抗体またはそのフラグメントのフレームワーク配列の少なくとも一部がヒトコンセンサスフレームワーク配列である、例えば、ヒト生殖細胞系コード化フレームワーク配列を含む、該抗体である。
幾つかの実施形態では、本発明のＡＢＰは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増大させるために改変または操作されている。ここで当業者には理解されるように、本発明のかかるＡＢＰは、ＣＴＬのような免疫細胞に対する細胞抵抗性に関連する疾患または障害（例えば、ＣＤ２７６陽性がん）の治療において特に有用である。これは、該ＡＤＣＣの機序（免疫系のエフェクター細胞が、その膜表面抗原に特異的抗体が結合した標的細胞を積極的に溶解することによる細胞媒介性免疫防御）がＣＴＬのような免疫細胞に対する抵抗性を有する細胞に関して増強され、該免疫系のエフェクター細胞による接着の増大、および／または該免疫系のエフェクター細胞によるかかる細胞の溶解の増大をもたらすことによる。
本明細書中で使用する場合、「治療」は疾患、障害、または状態を処置することと同義であり、これには該疾患、障害、もしくは状態の症状を低減すること、該疾患、障害、もしくは状態の進行を阻止すること、該疾患、障害、もしくは状態の軽減をもたらすこと、および／または該疾患、障害、もしくは状態を治癒させることが含まれる。
本発明のＡＢＰを改変または操作することによりＡＤＣＣを増大させるための様々な技術が公知であり（Ｓａｔｏｈら、２００６；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ６：１１６１；ＷＯ２００９／１３５１８１）、従ってかかる実施形態は、本発明のＡＢＰが脱フコシル化（ＧｌｙｃＡｒｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）されうる、例えば、抗体を内在性ＦＵＴ８遺伝子がノックアウトされているＣＨＯ細胞において産生させる実施形態、または該ＡＢＰが「糖操作抗体」（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）でありうる、例えばフコース類似体を抗体発現ＣＨＯ細胞に添加してフコシル化の有意な低下を生じさせる実施形態を含む。本発明のＡＢＰに適用しうる他の脱フコシル化アプローチは、本明細書中の他の箇所に記載されている。
本発明のＡＢＰを改変または操作することによりＡＤＣＣを増大させるための他の技術としては、（例えば、本明細書中の他の箇所により詳細に記載した）該ＡＢＰのＦｃ部分の突然変異、特にヒトＦｃの残基２３４、２３５、２３６および／もしくは２３７、ならびに／または残基３３０、３３１のうちの１以上をそのように変異させる突然変異が挙げられ、ここで該Ｆｃ領域中の該残基のかかるナンバリングはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｈ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９８７）に記載されたＥＵインデックスのものである。
従って、ある特定の実施形態では、本発明のＡＢＰは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増大させるために改変または操作されており、好ましくはここで、該ＡＢＰを脱フコシル化する、ならびに／または該ＡＢＰのＦｃを変異させる（例えばその際、Ｆｃを次の残基変化、すなわちＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓおよび／もしくはＰ３３１Ｓのうちの１以上を利用して変異させる）。代替的実施形態では、本発明のＡＢＰは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低減するために改変または操作されている。
他のある特定の実施形態では、本発明のＡＢＰは、特にヒト血清における、血清中半減期を延長するために改変されている。例えば、本発明のＡＢＰはＰＥＧ化および／もしくはＰＡＳ化されていてもよく、またはＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８ＬもしくはＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ改変を持つＦｃ領域を有する。
ある特定の実施形態では、本発明のＡＢＰは（ａ）ＣＤ２７６、もしくはＣＤ２７６のバリアントの細胞外ドメインにより提示される１以上のエピトープに結合するか、または本発明のＡＢＰは（ｂ）ＣＤ２７６、もしくはＣＤ２７６のバリアントの細胞外ドメインにより提示される２つ以上のエピトープに結合する。好ましくは、該エピトープの１以上は、配列番号３７１のアミノ酸残基２３と２４１の間（ヒトＣＤ２７６タンパク質のＥＣＤ）、例えば、配列番号３７１のアミノ酸残基２３と１３６の間（ヒトＣＤ２７６タンパク質Ｉｇ様Ｖ型ドメイン）に提示される。
本発明のＡＢＰは、単一特異性（すなわち、ただ１つの抗原に結合する抗原結合ドメインを持つ）であっても、または多重特異性（すなわち、異なる抗原に結合する２つ以上の異なる抗原結合ドメインを持つ）であってもよい。例えば、「二重特異性（ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二特異性（ｄｕａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「二機能性（ｂｉ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」ＡＢＰまたは抗体は、それぞれ、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッドのＡＢＰまたは抗体である。二重特異性抗原結合タンパク質および抗体は、多重特異性抗原結合タンパク質抗体の１種であり、限定するものではないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結（例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ，１９９０、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２を参照のこと）を含む様々な方法により作製することができる。二重特異性抗原結合タンパク質または抗体の前記２つの結合部位は、同一または異なるタンパク質標的上に存在しうる、２つの異なるエピトープに結合する。
かかる実施形態においては、前記ＡＢＰは二重特異性、三重特異性、または四重特異性の抗体であってもよく、特に二重特異性抗体は、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）抗体、二親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ抗体、ＤｕｔａＭａｂ（登録商標）抗体、ＤｕｏＢｏｄｙ抗体、Ｔｒｉｏｍａｂ、ＴａｎｄＡｂ、二重特異性ＮａｎｏＢｏｄｙ、Ｔａｎｄｅｍ ｓｃＦｖ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、ＨＳＡ抗体、（ｓｃＦｖ）２ ＨＳＡ抗体、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ抗体、Ｄｏｃｋ ａｎｄ Ｌｏｃｋ二重特異性抗体、ＤＶＤ－ＩｇＧ抗体、ＴＢＴＩ ＤＶＤ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－フィノマー、四価二重特異性タンデムＩｇＧ抗体、二標的化ドメイン抗体、化学結合型二重特異性（Ｆａｂ’）２分子、架橋ｍＡｂ、Ｄｕａｌ－ａｃｔｉｏｎ Ｆａｂ ＩｇＧ（ＤＡＦ－ＩｇＧ）、ｏｒｔｈｏＦａｂ－ＩｇＧ、二重特異性ＣｏｖＸ－Ｂｏｄｙ、二重特異性六価トリマーボディ、およびＡＲＴ－Ｉｇから選択される。
従って、ある特定の実施形態では、本発明のＡＢＰは少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体であり、ここで各抗原結合ドメインは異なる抗原エピトープに特異的に結合する。
従って、幾つかの実施形態では、本発明のＡＢＰは、哺乳動物細胞の表面上に発現されると前記ＣＤ２７６、パラログ、オルソログまたは他のバリアントの細胞外ドメインに（例えば１以上の第１抗原結合ドメインを介して）結合し、さらに該ＣＤ２７６またはバリアント以外の抗原に結合する１以上の追加の抗原結合ドメインを含む。かかる他の抗原は、本発明のＡＢＰのある特定の実施形態では、別の免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子であってもよく、また／またはかかる他の抗原は哺乳動物Ｔ細胞上に存在する抗原であってもよい。かかる追加の抗原結合ドメインにより結合されうる、哺乳動物Ｔ細胞上に存在する抗原としては、ＣＤ３、ＣＤ４０、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳおよび４－１ＢＢが挙げられる。かかる他の抗原はまた、本発明のＡＢＰのある特定の実施形態では、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンであってもよい。かかる他の抗原はまた、該ＡＢＰによるその結合が該ＡＢＰに延長された血清中半減期、例えば、アルブミンに結合した場合の半減期と同様の半減期を付与する、血液または血清の別の成分であってもよい。
本発明のＡＢＰの好適なバリアントは、本発明の抗体の抗原結合領域と、ＣＤ３を対象とする第２抗原結合領域、例えばＵＣＨＴ１として知られるｓｃＦｖ構築物とを含む、二重特異性のものに関する。本発明のある好適な構築物は、本明細書中では７Ｃ４と指定する抗体の２つの抗原結合ドメインと、２つの抗ＣＤ３結合ドメイン、例えば前述のＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ構築物とを含む。
他の実施形態では、本発明のＡＢＰは２つ以上の抗原結合領域を含むことが可能であり、好ましくは２、３または４つの抗原結合領域を含む。
さらに他の実施形態では、本発明のＡＢＰはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むことが可能であり、また好ましくは細胞外抗原結合領域、膜貫通ドメインなどの膜アンカー、および細胞内領域、例えば、細胞内シグナル伝達領域を含む。
好適な実施形態では、本発明のＡＢＰは少なくとも１つの抗体定常ドメインを含むことが可能であり、特にここで、少なくとも１つの抗体定常ドメインはＣＨ１、ＣＨ２、もしくはＣＨ３ドメイン、またはその組み合わせである。
さらなるかかる実施形態では、抗体定常ドメインを有する本発明のＡＢＰは、例えばＦｃ領域とＦｃ受容体（免疫エフェクター細胞上のＦｃ受容体（例えばＳａｘｅｎａおよびＷｕ，２０１６；Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：５８０）との相互作用を増大させるために、変異させた該Ｆｃ領域を含む。その例および実施形態は本明細書中の他の箇所に記載されている。
他の実施形態では、本発明のＡＢＰは、エフェクター基および／または標識基を含んでいてもよい。
用語「エフェクター基」は、任意の基、特に細胞傷害性物質として働く、抗原結合タンパク質などの別の分子に結合した基を意味する。適切なエフェクター基としての例は、放射性同位体または放射性核種である。他の適切なエフェクター基としては、毒素、治療基、または化学療法基が挙げられる。適切なエフェクター基の例としては、カリケアマイシン、アウリスタチン、ゲルダナマイシン、α－アマニチン、ピロロベンゾジアゼピンおよびマイタンシンが挙げられる。
用語「標識」または「標識基」は、任意の検出可能な標識を指す。一般に、標識はそれらを検出するアッセイに応じて、様々なクラス、すなわちａ）放射性同位体もしくは重同位体でありうる同位体標識、ｂ）磁気標識（例えば、磁性粒子）、ｃ）酸化還元活性部分、ｄ）光学色素；酵素基（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、ｅ）ビオチン化基、およびｆ）二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）に分類される。
幾つかの実施形態では、エフェクター基または標識基を別の分子（例えば、前記ＡＢＰ）に様々な長さのスペーサーアームを介して結合させることにより、潜在的な立体障害を低減する。
次に、本発明の好適な実施形態は、免疫サイトカイン機能基を含むよう改変されたＡＢＰに関する。好適なのは、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）または改変ＩＬ－１５の使用である。しかし、抗体融合構築物のための他の免疫サイトカインの使用は文書で十分に立証されており、例としてＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＴＮＦα、ならびにインターフェロンα、βおよびγを含有する抗体－サイトカイン融合タンパク質が挙げられる。
本発明のＡＢＰとの融合タンパク質として使用される好適なＩＬ１５分子は、ＩＬ－１５Ｒαに対する親和性が野生型ＩＬ－１５の親和性と比較して低下している分子である。本発明において使用される改変ＩＬ－１５ポリペプチドは、好ましくは、ヒト野生型ＩＬ－１５のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔからアクセッション番号：Ｐ４０９３３－１で得られる）の９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位および／または１１６位に対応する１以上の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。従って、好ましくは、本発明のＡＢＰは、本明細書中に開示した１つまたは２つの抗原結合ドメイン、および例えば抗体定常領域に融合された、上記改変ＩＬ－１５ポリペプチドのうちの１以上を含んでいてもよい。かかる構築物は、その全内容が参照により本明細書中に包含されるＥＰ３ ２６５ ４７８に開示されている。
第２態様では、本発明は、前記ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）抗原、またはそのバリアントに結合する能力がある第１抗原結合ドメインと、前記ヒト分化抗原群３（ＣＤ３）抗原に結合する能力がある第２抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）に関する。
「二重特異性」または「二機能性」ＡＢＰは、２つの異なるエピトープ／抗原結合ドメイン（または「部位」）を有するＡＢＰであり、従って２つの異なる標的エピトープに対する結合特異性を有する。これら２つのエピトープは、同一抗原のエピトープであっても、または本発明では好適であるような、異なる抗原、例えば異なる抗原ＣＤ２７６およびＣＤ３のエピトープであってもよい。
「二重特異性ＡＢＰ」は、重鎖と軽鎖、または主鎖とより短い／より小さい鎖との第１ペアにより定義される、２つ以上の結合アームのうちの１つで１つの抗原またはエピトープを結合し、かつ重鎖と軽鎖、または主鎖とより小さい鎖との第２ペアにより定義される第２アーム上に異なる抗原またはエピトープを結合するＡＢＰであってもよい。二重特異性ＡＢＰのかかる実施形態は、特異性とＣＤＲ配列の両方の点で２つの別個の抗原結合アームを有する。典型的には、二重特異性ＡＢＰはそれが結合する各抗原に対して１価である、すなわち、該各抗原またはエピトープに１つのアームだけで結合する。しかし、二重特異性抗体は二量体化または多量体化することも可能であり、このことは、本発明との関連においては好適である。例えば、本明細書中に記載した二量体ＩｇＧｓｃフォーマットでは、抗体は各抗原に対して２つの結合部位を有していてもよい（図１Ｂ、３つ目の構築物）。二重特異性抗体はハイブリッドＡＢＰであってもよく、これは第１軽鎖可変領域および第１重鎖可変領域により定義される第１結合領域と、第２軽鎖可変領域および第２重鎖可変領域により定義される第２結合領域とを有していてもよい。これらの結合領域のうちの一方が重鎖／軽鎖ペアにより定義されうることは、本発明により想定される。本発明との関連において、前記二重特異性ＡＢＰは、主鎖およびより小さな鎖の可変領域により定義される第１結合部位と、該ＡＢＰの主鎖に含まれるｓｃＦｖフラグメントの可変領域により定義される第２の異なる結合部位とを有していてもよい。
二重特異性ＡＢＰを作製する方法、例えば２つの異なるモノクローナル抗体の化学的コンジュゲーションまたは例えば、同様に２つの抗体フラグメントの（例えば、２つのＦａｂフラグメントの）化学的コンジュゲーションは、当分野で公知である。あるいは、二重特異性ＡＢＰを、親抗体を産生するハイブリドーマの融合によるものである、クアドローマ技術により作製する。ＨおよびＬ鎖のランダムな組み合わせにより、１０種の異なる抗体構造物の潜在的混合物が産生され、そのうちの１種のみが所望の結合特異性を有する。
本発明の二重特異性ＡＢＰは、各標的に関してモノクローナル抗体（ｍＡｂ）として機能しうる。幾つかの実施形態では、該抗体はキメラ、ヒト化または完全ヒト抗体である。二重特異性ＡＢＰは、例えば二重特異性タンデム一本鎖Ｆｖ、二重特異性Ｆａｂ２、または二重特異性ダイアボディであってもよい。
本発明のＡＢＰに含まれるドメインを基に、本発明の二重特異性ＡＢＰは、一般にヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよび一本鎖Ｆｖフラグメントを含みうる、Ｆａｂフラグメントを含んでいてもよい。かかる二重特異性ＡＢＰは「Ｆａｂｓｃ」ＡＢＰと称されており、国際特許出願ＷＯ２０１３／０９２００１に初めて記載された。より具体的には、本明細書中で使用する「Ｆａｂｓｃ」フォーマットのＡＢＰは、典型的には、Ｆａｂフラグメントを有する本発明の二重特異性ＡＢＰを指し、該Ｆａｂフラグメントは一般にヒンジ領域を含み、該ヒンジ領域はＣＨ２ドメインのＮ末端に結合している該ＦａｂフラグメントのＣ末端にあり、該ＣＨ２ドメインのＣ末端が今度はｓｃＦｖフラグメントのＮ末端に結合している。かかる「Ｆａｂｓｃ」はＣＨ３ドメインを含まないか、または本質的には含まない。これに関連して、「含まない」または「本質的には含まない」は、該ＡＢＰが完全長ＣＨ３ドメインを含まないことを意味する。それは好ましくは、該ＡＢＰが該ＣＨ３ドメインの１０以下、好ましくは５以下、好ましくは３またはさらに少ないアミノ酸を含むことを意味する。
ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎの刊行物（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５：１５９－６３，１９９７）によれば、本発明の二重特異性ＡＢＰは同様に、一般にＣＨ２ドメインのＣ末端側に配置される、ＣＨ３ドメインを有していてもよい。かかる分子は、本明細書中では「ＩｇＧｓｃ」フォーマットＡＢＰとも称され、これはＦａｂフラグメントを有する本発明の二重特異性ＡＢＰを意味しており、該Ｆａｂフラグメントは一般にヒンジ領域を含み、該ヒンジ領域は典型的にはＣＨ２ドメインのＮ末端に結合している該ＦａｂフラグメントのＣ末端にあり、該ＣＨ２ドメインのＣ末端は今度は典型的にはＣＨ３ドメインのＮ末端に結合しており、該ＣＨ３ドメインのＣ末端は今度は典型的にはｓｃＦｖフラグメントのＮ末端に結合している。ＩｇＧｓｃフォーマットＡＢＰの例示的例を図１Ｂに示す。かかる二重特異性ＡＢＰフォーマットは、本発明との関連において好適である。
さらに、または代替的に、本発明の「Ｆａｂｓｃ」または「ＩｇＧｓｃ」ＡＢＰは、「Ｆｃ減弱化」ＣＨ２ドメイン（ヒンジ領域を含む）を同様に有していてもよい。この「Ｆｃ減弱化」は、Ｆｃ受容体への結合を媒介できる、該ＣＨ２ドメイン中の選択したアミノ酸残基のうちの少なくとも１つを欠失および／または置換（変異）させることにより達成される。例示的実施形態では、Ｆｃ受容体への結合を媒介可能でありかつ欠損しているかまたは変異している該ヒンジ領域または該ＣＨ２ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基は、配列位置２２８、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２９７、３２７、および３３０（ＥＵ－インデックスによる配列位置のナンバリング）からなる群より選択される。例示的具体例では、かかるＦｃ減弱化ＡＢＰは、アミノ酸２２８の欠失、アミノ酸２２９の欠失、アミノ酸２３０の欠失、アミノ酸２３１の欠失、アミノ酸２３２の欠失、アミノ酸２３３の欠失、置換Ｇｌｕ２３３→Ｐｒｏ、置換Ｌｅｕ２３４→Ｖａｌ、アミノ酸２３４の欠失、置換Ｌｅｕ２３５→Ａｌａ、アミノ酸２３５の欠失、アミノ酸２３６の欠失、アミノ酸２３７の欠失、アミノ酸２３８の欠失、置換Ａｓｐ２６５→Ｇｌｙ、置換Ａｓｎ２９７→Ｇｌｎ、置換Ａｌａ３２７→Ｇｌｎ、および置換Ａｌａ３３０→Ｓｅｒ（ＥＵ－インデックスによる配列位置のナンバリング、これに関しては、例えば、国際特許出願ＷＯ２０１３／０９２００１の図１Ｏおよび図１Ｐも参照のこと）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を含有していてもよい。Ｔ細胞を、例えば腫瘍細胞に対して活性化する二重特異性抗体の場合、Ｔ細胞の望ましくないオフターゲット活性化をもたらしうるＦｃ受容体担持細胞への該抗体の結合を阻止するには、Ｆｃ減弱化が望ましい場合がある。
ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎの刊行物（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５：１５９－６３，１９９７）によれば、本発明の最も好ましいＩｇＧｓｃフォーマットである二重特異性ＡＢＰは同様に、一般にＣＨ２ドメインのＣ末端側に配置される、ＣＨ３ドメインを有していてもよい。かかる分子は本明細書中では「ＩｇＧｓｃ」フォーマットＡＢＰとも称され、これはＦａｂフラグメントを有する本発明の二重特異性ＡＢＰを意味しており、該Ｆａｂフラグメントは一般にヒンジ領域を含み、該ヒンジ領域は典型的にはＣＨ２ドメインのＮ末端に結合している該ＦａｂフラグメントのＣ末端にあり、該ＣＨ２ドメインのＣ末端は今度は典型的にはＣＨ３ドメインのＮ末端に結合しており、該ＣＨ３ドメインのＣ末端は今度は典型的にはｓｃＦｖフラグメントのＮ末端に結合している。ＩｇＧｓｃフォーマットＡＢＰの例示的具体例を図１Ｂに示す。かかる二重特異性ＡＢＰフォーマットは、本発明との関連においては好適である。
前記抗体フォーマットＦａｂｓｃおよびＩｇＧｓｃは共に、Ｎ末端標的化部分がそれぞれ「生理的」Ｆａｂ領域またはＦａｂ２領域から構成されており、それによって分子のこの部分の一本鎖成分の使用を回避するという共通点を有する。これらのフォーマットを標的細胞に限定されたＴ細胞活性化のために使用する場合、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）媒介性活性化を阻止するために（希望する場合、または必要に応じて）Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合の減弱化を利用してもよい。これは例えば、上記、さらには国際特許出願ＷＯ２０１３／０９２００１およびＡｒｍｏｕｒら Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；２９：２６１３に記載の、分子のＣＨ２ドメインへの定義済みかつ周知の変異の導入により達成できる。従って、本発明のＩｇＧｓｃ ＡＢＰもまた、ＣＨ２ドメイン（ヒンジ領域を含む）を有していてもよく、ここでＦｃ受容体への結合を媒介できる該ヒンジ領域または該ＣＨ２ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基が欠損しているかまたは変異している。先に説明した通り、該ＣＨ２およびヒンジ領域中のこの残基は、それぞれ、配列位置２２８、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２９７、３２７、および３３０（ＥＵ－インデックスによる配列位置のナンバリング）からなる群より選択してもよい。しかし、該ＩｇＧｓｃ分子中のＣＨ３ドメインの存在により、２つの個々の分子が該ＣＨ３ドメインを介して（自然発生的に）ホモ二量体化し、４価分子を形成する（これに関しては、図１Ｂを再度参照のこと）。従って、前記ヒンジ領域の配列位置２２６および／または配列位置２２９のシステイン残基を欠失または変異させる必要がない。従って、本発明のかかる四量体ＩｇＧｓｃ ＡＢＰは、Ｋａｂａｔのナンバリング［ＥＵ－インデックス］による、各ヒンジドメインの１つの配列位置２２６および／または配列位置２２９にシステイン残基を有していてもよい。
ＣＤ２７６結合および／または白血病がん細胞への結合を媒介するＣＤＲ領域のセットを含有する二重特異性ＡＢＰの上記開示内容を踏まえると、本発明のＡＢＰは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞上の受容体に特異的に結合する第２結合部位を含んでいてもよい。該免疫細胞上に存在するこの受容体は、該免疫細胞を活性化する能力があるか、または該免疫細胞の免疫応答を刺激する能力がある受容体であってもよい。惹起された免疫応答は、好ましくは細胞傷害性免疫応答でありうる。かかる適切な受容体は、例えば、ＣＤ３、抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）およびＣＤ９５であってもよい。特に好適なのは、前記第２結合部位がＣＤ３、ＴＣＲまたはＣＤ１６に結合するＡＢＰである。最も好適なのは、前記第２結合部位がＣＤ３に特異的に結合するＡＢＰである。ある好適なＡＢＰは、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３の抗原結合部位に相当する第２結合部位を含む。該抗体ＯＫＴ３の重鎖の可変ドメインと軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、例えば、Ａｒａｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０，６５７－６６２（１９９６）および国際特許出願ＷＯ２０１５／１５８８６８（ＷＯ２０１５／１５８８６８の配列表中の配列番号１７および１８を参照のこと）にも記載されている。別の好適なＡＢＰは、抗ＣＤ３抗体ＵＣＨＴ１の抗原結合部位に相当する第２結合部位を含む。ヒト化ＵＣＨＴ１抗体のＶＨおよびＶＬ配列は、国際特許出願ＷＯ２０１３／０９２００１に記載されている。本発明に使用できるＣＤ３結合ＡＢＰの他の例としては、ヒトおよびコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ）またはリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＣＤ３ε鎖のエピトープに結合する能力がある、欧州特許第２ １５５ ７８３ Ｂ１号または欧州特許ＥＰ２ １５５ ７８８ Ｂ１に記載のＡＢＰが挙げられる。
従って、本発明の二重特異性ＡＢＰは、本明細書中に記載したようにＦａｂフラグメントおよびｓｃＦｖフラグメントを含むＩｇＧｓｃ分子などの二重特異性ＡＢＰであってもよい。この分子中で、第１結合部位はＣＤ２７６に結合してもよいし、また本明細書中に記載したようにＦａｂ（またはＩｇＧｓｃフォーマットに関しては２価ＣＤ２７６ Ｆ（ａｂ）２）フラグメントに含まれていてもよく、かつ第２結合部位（免疫受容体に結合しうる）はｓｃＦｖフラグメント、例えばＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖに含まれていてもよい。あるいは、ＣＤ２７６に結合する該第１結合部位は一本鎖Ｆｖフラグメントに含まれており、かつ該第２結合部位（ＣＤ３に結合しうる）はＦａｂフラグメントに含まれている。
幾つかの実施形態では、本発明の二重特異性ＡＢＰは、それ自体では結合時、例えばＣＤ３への結合時に免疫細胞、例えばＴ細胞を活性化しない。その代わりに、両方の結合部位、例えばＣＤ２７６特異的結合部位およびＣＤ３特異的結合部位がＴ細胞上の受容体および標的がん細胞上のＣＤ２７６に結合した場合のみ、前者が活性化受容体を架橋し、エフェクター細胞に特定の標的細胞を殺傷させる。本発明の二重特異性ＡＢＰの存在下または非存在下でのリンパ球による標的細胞殺傷能力を評価するための標準的な機能アッセイを設定することにより、該ＡＢＰが結合する受容体を活性化する該ＡＢＰの能力について評価および／またはスクリーニングすることができる。
本発明の幾つかの実施形態では、前記二重特異性ＡＢＰは、第２抗原結合ドメインとしてＵＣＨＴ１またはそのバリアントなどの抗ＣＤ３抗体のｓｃＦｖを含む。
第３態様では、本発明は、前記第１態様のいずれか１つのＡＢＰ、またはＡＢＰの抗原結合フラグメントもしくはモノマー、例えば重もしくは軽鎖をコードする配列、あるいは前記第２態様による二重特異性ＡＢＰをコードする配列を含む、単離された核酸に関する。
例えば、本発明の核酸によりコードされる成分は、本発明の抗体の１つの鎖の全部または一部であってもよいし、または該成分は前記ＡＢＰのｓｃＦｖであってもよい。かかる核酸によりコードされる成分は、本発明の抗体の鎖の一方または他方の全部または一部であってもよく、例えば、かかる核酸によりコードされる該成分は本発明のＡＢＤであってもよい。本発明の核酸は同様に、本発明のＡＢＰのフラグメント、誘導体、変異体、またはバリアントをコードしていてもよく、かつ／または、ポリヌクレオチド、および前述のものの相補的配列の発現を阻害するための、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、アンチセンスもしくは抑制性核酸（例えば、ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡもしくはｇＲＮＡ分子）を同定するか、解析するか、変異させるかもしくは増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーもしくはシークエンシングプライマーとしての使用に適切および／もしくは十分なポリヌクレオチドである成分であってもよい。
本発明の特定の実施形態では、本発明の核酸は、各場合に表１に示すような、重もしくは軽鎖ＣＤＲ、重および／もしくは軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組み合わせまたは重もしくは軽鎖可変ドメインをコードする配列を有する核酸、またはその機能的断片を含む。他の実施形態では、本発明の核酸は、本明細書中に開示したＣＤＲのいずれか、好ましくは表１中のＣＤＲ３をコードする配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％（好ましくは少なくとも７５％）の配列同一性を有する（または５０、４０、３０、２０、１５、１０もしくは５以下、好ましくは３、２もしくは１つ以下の塩基の置換、挿入もしくは欠失を有する）核酸配列を含む。
本発明による核酸は、場合によっては自然状態では結合していないポリヌクレオチドに結合している、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成起源、もしくはゲノム由来のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはその幾つかの組み合わせであってもよい。幾つかの実施形態では、かかる核酸は、１以上の（例えば、配列中の特定のヌクレオチドの２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくは２０個より多い、特に１～約５個、もしくは好ましくは全例の）非天然（例えば合成）ヌクレオチドを含んでいてもよく、かつ／またはかかる核酸は、標識基もしくはエフェクター基、例えば、本明細書中の他の箇所に記載した標識基もしくはエフェクター基などの別の化学的部分を含んでいてもよい（例えば該化学的部分に結合している）。
ある実施形態では、本発明の核酸は単離されていてもよいし、または実質的に純粋であってもよい。別の実施形態では、本発明の核酸は、組換え、合成および／または改変型であるか、または任意の他の形で非天然であってもよい。例えば、本発明の核酸は、ヒト核酸などの自然の産物と比較して少なくとも１つの核酸置換（または欠失）改変（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０より多くのかかる改変、特に１～約５のかかる改変、好ましくは２または３のかかる改変）を含有していてもよい。
前記核酸は、任意の適切な長さ、例えば約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００またはそれ以上のヌクレオチド長でありうる。例えば、ｓｉＲＮＡ核酸は、好ましくは、約１５～約２５塩基対の長さ（好ましくは約１９～約２１塩基対の長さ）であってもよく、ｓｈＲＮＡ核酸は、好ましくは、２０～３０塩基対のステム、少なくとも４ヌクレオチドのループ、および３’末端にジヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよく、マイクロＲＮＡは、好ましくは、約２２塩基対の長さであってもよく、本発明のＡＢＰまたはその成分（例えば、重もしくは軽鎖またはＩｇＧ抗体）をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡ配列は、好ましくは、約５００～１，５００ヌクレオチドであってもよい。より好ましくは、哺乳動物の抗体の軽鎖をコードする核酸は約６３０～約６５０ヌクレオチドであってもよく、また哺乳動物の抗体の重鎖をコードする核酸は約１，３００～約１，６５０ヌクレオチドであってもよい。核酸は１以上の追加の配列、例えば、調節配列を含みうるか、および／またはより大きな核酸の一部でありうる。該核酸は一本鎖または二本鎖でありうるし、またＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、ならびにその人工バリアント（例えば、ペプチド核酸）を含みうる。
抗体ポリペプチド（例えば、重もしくは軽鎖、可変ドメインのみ、または全長）をコードする核酸は、ＣＤ２７６抗原またはその断片、例えば１以上のドメイン（またはＣＤ２７６抗原もしくはその断片をコードしかつ発現する能力があるポリヌクレオチド）で免疫したマウス、ラット、ラマ、アルパカ、ニワトリまたはウサギのＢ細胞から単離してもよい。該核酸は、ＰＣＲなどの従来の手順により単離してもよい。
本発明の核酸の配列中に、突然変異により変化を導入することができる。かかる変化は、それらの性質およびコドン内の位置に応じて、それがコードするポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質）のアミノ酸配列に変化をもたらすことができる。突然変異は当分野で公知の任意の技術を利用して導入することができる。
ある実施形態では、１以上の特定のアミノ酸残基を、例えば、部位特異的突然変異誘発プロトコルを利用して変化させてもよい。別の実施形態では、１以上のランダムに選択した残基を、例えば、ランダム突然変異誘発プロトコルを利用して変化させてもよい。どんな方法で作製するにせよ、変異ポリペプチドを発現させて、所望の特性についてスクリーニングすることができる。変異は、核酸がコードするポリペプチドの生物学的活性を有意に変更することなく該核酸中に導入することができる。例えば、非必須アミノ酸残基でのアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を生じさせることができる。
本発明の核酸の配列に（例えば突然変異により）加えてもよい他の変化は、そのコード化ポリペプチドのアミノ酸配列を変更しなくてもよいが、該コード化ポリペプチドの発現のその安定性および／または有効性に変化をもたらしてもよい。例えば、コドン最適化により、所与のポリペプチド配列の発現を、そのヌクレオチドが発現される種に見出される、所与のアミノ酸に対してより多くみられるコドンを利用して改善してもよい。コドン最適化の方法、および代替法（例えば、ＣｐＧおよびＧ／Ｃ含量の最適化）は、例えば、Ｈａｓｓら、１９９６（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：３１５）、ＷＯ１９９６／０９３７８、ＷＯ２００６／０１５７８９およびＷＯ２００２／９８４４３）に記載されている。
第４態様では、本発明は、前記第３態様の核酸と、細胞における前記のコード化ＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰ、または該ＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰの成分（例えば抗体の重鎖もしくは軽鎖）の発現を可能にする１以上の追加の配列特徴とを含む核酸構築物（ＮＡＣ）に関する。
かかるＮＡＣは、細胞における（例えば宿主細胞における）前記コード化ＡＢＰまたは該ＡＢＰの成分（例えばＡＢＤ）の発現を可能にする１以上の追加の特徴を含みうる。本発明のＮＡＣの例としては、限定するものではないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ｍＲＮＡ、非エピソーマル哺乳動物ベクターおよび発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターが挙げられる。本発明の核酸構築物は、本発明の核酸を、宿主細胞などの細胞における該核酸の発現に適した形態で含みうる（下記参照）。本発明の核酸構築物は、典型的には、組換え核酸であり、かつ／または単離されていてもよく、かつ／または実質的に純粋であってもよい。組換え核酸は、特にそれらが異なる種および／または合成法、ｉｎ－ｖｉｔｒｏ法もしくは突然変異誘発法から得られる部分を含む場合、典型的には非天然である。
幾つかの実施形態では、本発明のＮＡＣは１以上の構築物を含み、該構築物のいずれかは、重または軽抗体鎖のいずれかをコードする核酸を含む。幾つかの実施形態では、本発明のＮＡＣは２つの構築物を含み、両構築物からの発現により完全な抗体分子が生成されうるように、その一方は重抗体鎖をコードする核酸を含み、他方は軽抗体鎖をコードする核酸を含む。幾つかの実施形態では、本発明のＮＡＣは、完全な抗体分子が１つの構築物から発現されうるように、重および軽抗体鎖の両方をコードする核酸を含む構築物を含む。他の実施形態では、本発明のＮＡＣは、（例えば、そのコード化ＡＢＰがｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ抗体）である場合）本発明のＡＢＰを形成するには十分である一本鎖をコードする単一構築物を含みうる。
幾つかの実施形態では、本発明のＮＡＣは定常領域の全てまたは一部をコードする配列を含み、重鎖および／または軽鎖の全体または一部を発現させることができる。
本発明によるＮＡＣは、本発明のＡＢＰをコードするオープンリーディングフレームを、例えば該ＡＢＰの発現、ならびに好ましくはｍＲＮＡの安定性および／または該ＡＢＰの発現の増強を可能にする上流ならびに下流要素（例えば、５’および／もしくは３’ＵＴＲならびに／またはポリＡストレッチ）と共に含むｍＲＮＡ分子を含んでいてもよい（または該ｍＲＮＡ分子から構成されていてもよい）。細胞内に導入してポリヌクレオチドを発現させるためのＮＡＣとしてのｍＲＮＡの使用については、例えば、Ｚａｎｇｉら Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｖｏｌ．３１，８９８－９０７（２０１３）、Ｓａｈｉｎら（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １３：７５９およびＴｈｅｓｓらによるＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．ｖｏｌ．２３ ｎｏ．９，１４５６－１４６４（２０１５）に記載されている。本発明のｍＲＮＡ ＮＡＣに含まれていてもよい特定のＵＴＲとしては、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ（ＷＯ２０１３／１４３６９９）、および／またはヒストンステムループ（ＷＯ２０１３／１２０６２９）が挙げられる。本発明のｍＲＮＡ ＮＡＣは、５’キャップ、例えばｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ、（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡもしくはＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇおよび／または天然に存在するヌクレオチドの類似体である少なくとも１つのヌクレオチド、例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７－デアザ－グアノシン、５－メチルシトシンもしくはイノシンを含む１以上の化学修飾（ＥＰ１ ６８５ ８４４）をさらに含んでいてもよい。
本発明のＮＡＣ、例えばＤＮＡベース、レトロウイルスベースおよびｍＲＮＡベースのＮＡＣを、免疫系の疾患を処置または予防するための遺伝子治療的方法（後述の処置の方法を参照のこと）に使用してもよく、それによって本発明のＡＢＰをコードする発現可能な配列を含むＮＡＣを細胞または生物に（例えばトランスフェクションにより）投与する。特に、抗体の発現のためのｍＲＮＡ治療の利用は、ＷＯ２００８／０８３９４９より公知である。
第５態様では、本発明は、前記第３または第４態様による核酸またはＮＡＣを含む組換え宿主細胞に関する。好ましくは、かかる細胞は、該ＮＡＣによりコードされる前記ＡＢＰ（またはその成分）を発現する能力がある。例えば、本発明のＡＢＰが２つの別々のポリペプチド鎖（例えばＩｇＧの重および軽鎖）を含むのであれば、その際本発明の細胞は、かかるＡＢＰの重鎖をコードする（かつ発現できる）第１のＮＡＣならびにかかるＡＢＰの軽鎖をコードする（かつ発現できる）第２のＮＡＣを含んでいてもよいし、あるいは、該細胞はかかるＡＢＰの両鎖をコードする単一のＮＡＣを含んでいてもよい。これらの方法で、かかる本発明の細胞は、本発明の機能性（例えば結合性および／または抑制性）ＡＢＰを発現することができるであろう。本発明の（宿主）細胞は、本明細書中の他の箇所に記載した哺乳動物、原核生物または真核生物の宿主細胞のうちの１つであってもよく、特にその場合、該細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
かかる態様のある特定の実施形態では、前記（宿主）細胞はヒト細胞であり、特に該細胞は特定の個人から採取したヒト細胞（例えば自家ヒト細胞）であってもよい。かかる実施形態では、かかるヒト細胞を、本発明のＮＡＣを導入するためにｉｎ－ｖｉｔｒｏで増殖させる、および／または操作することができる。特定の個人から得た操作済みヒト細胞の有用性は、例えば治療に使用するために、かかる操作済みヒト細胞の集団をヒト対象に再導入することを含む、本発明のＡＢＰを産生することでありうる。かかる使用の一部においては、該操作済みヒト細胞を、該細胞を最初に採取した同一ヒト個体に（例えば、自家ヒト細胞として）導入してもよい。
かかる操作の対象となるヒト細胞は、体内の任意の生殖細胞または体細胞型でありうる。例えば、ドナー細胞は、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、上皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、心臓細胞、食道細胞、筋細胞、メラニン細胞、造血細胞、マクロファージ、単球、および単核細胞からなる群より選択される生殖細胞または体細胞でありうる。該ドナー細胞は、体内の任意の臓器または組織から取得することが可能であり、例えば、該ドナー細胞は、肝臓、胃、腸、肺、膵臓、角膜、皮膚、胆のう、卵巣、精巣、腎臓、心臓、膀胱、および尿道からなる群より選択される臓器からの細胞でありうる。
第６態様では、本発明は、（ｉ）前記第１もしくは第２態様のＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰ、または（ｉｉ）前記第３もしくは第４態様の核酸もしくはＮＡＣ、または（ｉｉｉ）前記第５態様による組換え宿主細胞、ならびに製薬上許容可能な担体、安定剤および／または賦形剤、を含む医薬組成物に関する。
治療に使用するために、本発明のＡＢＰ、核酸またはＮＡＣ（または細胞、例えば宿主細胞）を、動物またはヒトへの投与を容易にするのに適した医薬組成物に製剤化してもよい。用語「医薬組成物」は、製薬用途のための治療活性物質（例えば本発明のＡＢＰ）を含む物質の混合物を意味する。
例として、本発明の医薬組成物は、０．１％～１００％（ｗ／ｗ）の活性成分、例えば約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、好ましくは約１％～約２０％、約１０％～５０％または約４０％～９０％の活性成分を含みうる。
本明細書中で使用する場合、「製薬上許容可能な」賦形剤、安定化剤または担体という言葉は、薬剤投与に適合する、任意かつ全ての溶媒、可溶化剤、充填剤、安定化剤、結合剤、吸収剤、基剤、緩衝剤、滑沢剤、徐放性ビヒクル、希釈剤、乳化剤、湿潤剤、分散媒、コーティング、抗菌剤または抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むものとする。薬剤的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当分野では周知である。いかなる従来の媒体または薬剤も該活性化合物と適合しない場合を除いては、組成物におけるその使用が想定される。補助的な薬剤もまた該組成物中に組み込むことができる。
本発明の（または本発明と共に使用するための）医薬組成物は、典型的には、その意図する投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、経口、非経口例えば、髄腔内、動脈内、静脈内、皮内、皮下、経口、経皮（局所）および経粘膜投与が挙げられる。
幾つかの実施形態では、ＡＢＰまたはＮＡＣを含む前記医薬組成物は、１０～１０００ｍｇの単位用量形態である。幾つかの実施形態では、ＡＢＰまたはＮＡＣを含む該医薬組成物は、１０～２００ｍｇの単位用量形態である。幾つかの実施形態では、ＡＢＰを含む該医薬組成物は２００～４００ｍｇの単位用量形態である。幾つかの実施形態では、ＡＢＰまたはＮＡＣを含む該医薬組成物は４００～６００ｍｇの単位用量形態である。幾つかの実施形態では、ＡＢＰまたはＮＡＣを含む該医薬組成物は６００～８００ｍｇの単位用量形態である。幾つかの実施形態では、ＡＢＰまたはＮＡＣを含む該医薬組成物は８００～１００ｍｇの単位用量形態である。
ＡＢＰまたはＮＡＣを含む医薬組成物のための例示的な単位用量形態は、錠剤、カプセル剤（例えば粉剤、顆粒剤、マイクロタブレットもしくはマイクロペレットとして）、懸濁剤または使い捨ての充填済みシリンジである。ある特定の実施形態では、単一用量投与単位を作製するためのキットが提供される。該キットは、乾燥させた活性成分を有する第１容器と、水性製剤を有する第２容器の両方を含みうる。あるいは、該キットは、シングルチャンバー型およびマルチチャンバー型の充填済みシリンジを含有しうる。
かかる活性成分の毒性および治療効力（例えば有効性）は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きい治療指数を示す活性物質が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用してもよいが、非罹患（uninfected）細胞への潜在的損傷を最小限に抑え、またそれによって副作用を低減するために、罹患組織の部位にかかる化合物を標的化させる送達系を設計するよう注意を払うべきである。
本明細書中に提供する処置の医学的利用および方法の全ての態様および実施形態によれば、ＡＢＰまたはＮＡＣによる処置を必要とする対象に少なくとも１回投与する有効量は、典型的には、１回投与当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば１回投与当たり約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇである。幾つかの実施形態では、ＡＢＰまたはＮＡＣの該対象に少なくとも１回投与する該有効量は、１回投与当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ、１回投与当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、１回投与当たり約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、１回投与当たり約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、１回投与当たり約１０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、または１回投与当たり約５０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇである。
疾患の予防または処置のための、ＡＢＰもしくはＮＡＣ（またはそれらからなる医薬組成物）の適当な投与量は、処置する疾患の種類、疾患の重症度および経過、ＡＢＰもしくはＮＡＣおよび／または医薬組成物を予防目的で投与するのかまたは治療目的で投与するのか、以前の治療、患者の病歴、年齢、体格／体重ならびにＡＢＰもしくはＮＡＣおよび／または医薬組成物への応答、さらには主治医の判断によって決まる。該ＡＢＰもしくはＮＡＣおよび／または医薬組成物は、１度に、または一連の処置にわたり適宜患者に投与される。かかるＡＢＰもしくはＮＡＣおよび／または医薬組成物を一連の処置にわたり投与する場合、所与の処置過程のための投与の総回数は、合計で約２、３、４、５、６、７、８、９、１０回または約１０回より多くの処置で構成されていてもよい。例えば、処置を１日１回（または１日に２、３もしくは４回）１週間、１ヶ月間、またはさらには数ヶ月間施してもよい。ある特定の実施形態では、該処置過程を無期限に続けてもよい。
第７態様では、本発明は医薬に使用するための成分に関するものであり、ここで該成分は、（ｉ）前記第１もしくは第２態様のＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰ、または（ｉｉ）前記第３もしくは第４態様の核酸もしくはＮＡＣ、または（ｉｉｉ）前記第５態様による組換え宿主細胞および（ｉｖ）前記第６態様による医薬組成物、からなるリストより選択される。
関連のある態様では、本発明は、その必要がある哺乳動物対象において疾患、障害、または状態を処置または予防する方法であって、上記のモジュレーティング化合物の有効量を少なくとも１回該対象に投与すること、または、および特に先に記載した前記ＡＢＰ、前記ＮＡＣ、前記（宿主）細胞、または前記医薬組成物の有効量を少なくとも１回該対象に投与することを含む該方法にも関する。
別の関連のある態様では、本発明は、医薬品の製造のため、特に哺乳動物対象における疾患、障害、または状態の処置のための、特に該疾患、障害、または状態が本明細書中に記載したものである場合の、上記の本発明の生成物、または上記モジュレーティング化合物（特に本発明のＡＢＰ）の使用にも関する。
本発明における用語「処置（treatment）」は、疾患（または障害または状態）に対する治療、例えば治療的処置、ならびに予防的または抑制的手段を含むことを意味する。従って、例えば、疾患の発症前の本発明による化合物の投与の成功は、該疾患の処置につながる。「処置」は、疾患（またはその症状）を改善または根絶するための、該疾患の出現後の本発明の化合物の投与もまた包含する。発症後および臨床症状後の本発明のＣＤ２７６結合化合物の投与は、臨床症状の軽減の可能性および恐らくは疾患の改善と併せて、該疾患の処置も含む。「処置の必要がある」ものには、疾患、障害、または状態を既に有する対象（例えば、ヒト対象）、ならびに疾患、障害、または状態を有する傾向があるかまたは有する疑いがあるもの、例えば疾患、障害、または状態を予防すべきものが含まれる。
これらの態様の特定の実施形態では、前記モジュレーティング化合物は上記のもの、および／または本発明のＡＢＰ、ＮＡＣ、（宿主）細胞、もしくは医薬組成物、特に本発明のＡＢＰである。
かかる化合物は、例えば、ナチュラルキラー細胞によるＣＤ２７６、またはＣＤ２７６のバリアントを発現する細胞の殺傷および／または溶解（ＡＤＣＣ）および／またはＣＤＣを増強する化合物（例えば、ＡＢＰまたは抑制核酸）でありうる。
本明細書中の他の箇所に記載した他の態様では、哺乳動物対象において疾患、障害、もしくは状態を検出および／または診断するための方法が提供される。
ある特定の実施形態では、前記疾患、障害、または状態は病的免疫応答を特徴とする。
さらなる特定の実施形態では、前記の疾患、障害、または状態は、ＣＤ２７６、またはＣＤ２７６のバリアントの発現、特に該疾患、障害、または状態に関連する細胞、例えばがん細胞によるＣＤ２７６、またはＣＤ２７６のバリアントの発現を特徴とする。例えば、該疾患、障害、または状態は、ＣＤ２７６陽性細胞またはＣＤ２７６のバリアントに対して陽性の細胞の望ましくない存在と関連している可能性がある。好ましくは、該疾患、障害、または状態は、ＣＤ２７６またはそのバリアントを発現している細胞を含む血管系を特徴とする。
本発明の主題により処置可能な障害、障害または状態は、ある特定の代替的実施形態では、ＣＤ２７６の発現を特徴とするもの、特に、異常であるかかる発現、例えば、健常対象または正常細胞におけるそれと比較して所与の細胞または組織（例えば、対象の増殖性疾患に関与するそれらの細胞または組織）におけるＣＤ２７６の過剰（もしくは過小）発現または提示または活性を特徴とするものである。
さらに別の特定の実施形態では、前記疾患、障害、または状態は、ＣＤ２７６の発現および／または活性を特徴とし、特にかかる細胞は、ＣＤ２７６のｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質を発現するか、ならびに／またはかかるＣＤ２７６発現および／もしくは活性に関して陽性である。
別の特定の実施形態では、前記の疾患、障害、または状態は、特に前記の生成物がモジュレーティング化合物（例えば、本発明のＡＢＰ、核酸、ＮＡＣまたは組換え宿主細胞、特に本発明のＡＢＰ）の場合、増殖性疾患（またはかかる障害もしくは疾患に関連する状態）である。
「増殖性疾患」は、細胞の異常増殖を特徴とする障害を指す。増殖性疾患は、細胞成長の速度に関する制限を意味するのではなく、単に成長および細胞分裂に影響を及ぼす正常な制御の喪失を示している。従って、幾つかの実施形態では、増殖性疾患の細胞は、正常細胞と同じ細胞分裂速度を有しうるが、かかる成長を制限するシグナルには応答しない。組織または細胞の異常な成長である新生物または腫瘍は、「増殖性疾患」の範囲内にある。がんは当分野で理解されており、周辺組織に浸潤する、および／または新たな定着部位に転移する能力を有する細胞の増殖を特徴とする様々な悪性新生物のいずれかを含む。増殖性疾患としては、がん、粥状硬化症、関節リウマチ、特発性肺線維症および肝臓の硬変症が挙げられる。非がん性増殖性疾患としては、皮膚における細胞の過剰増殖、例えば、乾癬およびその様々な臨床型、ライター症候群、毛孔性紅色粃糠疹、ならびに角化の障害の過剰増殖性変異型（例えば、光線性角化症、老人性角化症）、強皮症なども挙げられる。
より特定の実施形態では、前記増殖性疾患は、がんまたは腫瘍、特に固形腫瘍（またはかかるがんもしくは腫瘍に関連する状態）である。かかる増殖性疾患としては、限定するものではないが、頭頸部がん、扁平上皮がん、多発性骨髄腫、孤立性形質細胞腫、腎細胞がん、網膜芽細胞腫、胚細胞腫瘍、肝芽腫、肝細胞がん、黒色腫、腎横紋筋肉腫様腫瘍、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、任意の血液悪性腫瘍（例えば、慢性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄芽球性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病、肥満細胞性白血病、肥満細胞性新生物、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、菌状息肉症、セザリー症候群（ｓｅａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、慢性骨髄増殖性疾患、骨髄線維症、骨髄化生、全身性肥満細胞症）、ならびに中枢神経系腫瘍（例えば、脳がん、膠芽腫、非膠芽腫脳がん、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星細胞腫、退形成性星細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫および脈絡叢乳頭腫）、骨髄増殖性疾患（例えば、真性赤血球増加症、血小板血症、特発性骨髄線維症）、軟部組織肉腫、甲状腺がん、子宮内膜がん、カルチノイドがん、または肝がんが挙げられる。
ある好適な実施形態では、本発明の様々な態様は、例えば、がん腫（例えば、乳がん、前立腺がん、胃がん、肺がん、大腸および／もしくは結腸がん、肝細胞がん、黒色腫）、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫および菌状息肉症）、白血病、肉腫、中皮腫、脳がん（例えば神経膠腫）、胚細胞腫（例えば、精巣がんおよび卵巣がん）、絨毛がん、腎がん、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、または胃がんを含むがこれらに限定されないかかる増殖性疾患を検出／診断、予防および／または処置するために使用する本発明のＡＢＰに関する。
従って、好適な実施形態では、本発明によるＡＢＰ、二重特異性ＡＢＰ、またはＮＡＣは、がん、例えば、副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連がん、胞巣状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、膀胱がん、骨がん、脳および脊髄のがん、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈球腫瘍、子宮頸がん、軟骨肉腫、脊索腫、色素嫌性腎細胞がん、明細胞がん、結腸がん、大腸がん、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、ユーイング腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨性線維形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ ｏｓｓｉｕｍ）、骨の線維性異形成症、胆のうまたは胆管がん、胃がん、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、頭頸部がん、肝細胞がん、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎がん、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫性腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫性腫瘍、肝がん、リンパ腫、肺がん、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腺腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、副甲状腺腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、後部ブドウ膜黒色腫、稀な血液障害、転移性腎がん、横紋筋肉腫様腫瘍、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｓａｒｃｏｍａ）、肉腫、皮膚がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺がん、胸腺腫、転移性甲状腺がん、ならびに子宮がんの細胞からなる群より選択されるがん細胞の存在を特徴とするがんの予防および／または処置に使用するためのものである。
特に好適な実施形態では、前記疾患、障害または状態は、ＣＤ２７６陽性がんまたはＣＤ２７６のバリアントに対して陽性のがんであるか、および／または腫瘍環境のＣＤ２７６陽性血管細胞の存在を特徴とするがんである。より好ましくは、該がんは固形腫瘍であって、かつＣＤ２７６、またはそのバリアントの、いずれも腫瘍組織のがん細胞における二重発現、および腫瘍血管系の血管の細胞におけるＣＤ２７６の発現－二重ターゲティングを特徴とする。
他の方法では、前記モジュレーティング（例えば抑制）化合物（例えば、本発明のものなどのＡＢＰ）を、異なる抗増殖治療、特に異なる抗がん治療と組み合わせて使用してもよく、特にここで、その異なる抗増殖治療は免疫療法、特に免疫チェックポイント分子に対するリガンドを用いる免疫療法である。従って、前記組成物は、その必要がある対象における増殖性疾患の処置に使用するためのものでありうるし、ここで該対象には免疫療法による共処置、特に免疫チェックポイント分子に対するリガンドとの共治療（例えば併用処置）を行う。
かかる実施形態では、前記リガンドは、免疫（抑制性）チェックポイント分子に結合するものである。例えば、かかるチェックポイント分子は、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１（もしくはそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２のうちの１つ）、ＴＩＭ－３（もしくはそのリガンドであるガレクチン－９）、ＴＩＧＩＴ、または例えばＦＬＴ３、ＰＳＭＡもしくは他の腫瘍関連標的をターゲティングする抗原結合分子からなる群より選択されるものであってもよい。特定のかかる実施形態では、該リガンドは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１から選択されるチェックポイント分子に結合する。他のより具体的な実施形態では、該リガンドは、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ＢＧＢ－Ａ３１７、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブからなる群より選択される抗体、特に、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）およびアテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ）からなる群より選択される抗体である。
本発明の治療における方法また使用（例えば、本発明のＡＢＰに関与するもの）を、かかる他の手法のいずれか（例えば、免疫（抑制性）チェックポイント分子に結合するリガンドなどの、別の作用物質またはがん免疫療法）と共に併用処置に利用する場合、併用処置レジメンであるかかる方法または使用は、かかる曝露／投与が同時である実施形態を含んでいてもよい。代替的実施形態、特に本発明のＡＢＰをかかる他の手法の前に投与するそれらの実施形態では、かかる投与は連続的であってもよい。例えば、本発明のかかる化合物を、他の手法の約１４日以内（例えば他の手法の前）、例えば他の手法の約１０日、７日、５日、２日または１日以内（例えば他の手法の前）に連続的に投与してもよく、さらに例えばここで、本発明の化合物を、他の手法の約４８時間、２４時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、２時間、１時間、３０分、１５分または５分以内（例えば他の手法の前）に連続的に投与してもよい。
第８態様では、本発明は、ヒトＣＤ２７６を発現するヒト細胞への細胞媒介性免疫応答を増強する方法であって、該細胞を、（ｉ）前記第１もしくは第２態様のＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰ、または（ｉｉ）前記第３もしくは第４態様の核酸もしくはＮＡＣ、または（ｉｉｉ）前記第５態様による組換え宿主細胞および（ｉｖ）前記第６態様による医薬組成物と、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞の存在下で接触させて、それにより該ヒト細胞に対する細胞媒介性免疫応答、好ましくは細胞傷害を増強する該方法に関する。
第９態様では、本発明は、対象における増殖性疾患の予防および／または処置のための方法であって、該対象への、前記第７態様に列挙した成分の治療上有効な量の投与を含み、かつここで該増殖性疾患が該増殖性疾患に関連する細胞におけるＣＤ２７６の発現を特徴とする、該方法に関する。
上記の通り、ある態様では、上記ＡＢＰを発現する能力がある細胞、例えば（組換え）宿主細胞またはハイブリドーマが本明細書中に提供される。代替的な態様では、上記のＡＢＰまたはＡＢＰの成分をコードする少なくとも１つのＮＡＣを含む細胞が本明細書中に提供される。本発明の細胞は、本発明のＡＢＰおよび／またはＮＡＣを作製するために、本明細書中に提供する方法において使用することができる。
従って、別の態様では、本発明は、ＣＤ２７６またはＣＤ２７６バリアントに特異的なＡＢＰを発現する能力がある組換え細胞系を作製する方法であって、
・適切な宿主細胞を用意するステップ、
・本発明のＡＢＰをコードするコード配列を含む少なくとも１つの遺伝子構築物を提供するステップ、
・かかる適切な宿主細胞に、該遺伝子構築物を導入するステップ、および
・場合によっては、該ＡＢＰの発現を可能にする条件下でかかる適切な宿主細胞により該遺伝子構築物を発現させるステップ
を含む該方法に関する。
さらに別の態様では、例えば前記ＡＢＰの発現を可能にする条件下で本発明の１以上の細胞を培養することを含む、上記のように該ＡＢＰを作製する方法が本明細書中に提供される。
従って、別の態様では、本発明はＣＤ２７６、またはＣＤ２７６バリアントに特異的なＡＢＰを作製する方法であって、
・本発明によるＡＢＰを発現する能力があるハイブリドーマまたは（宿主細胞）、例えば、前記化合物またはＡＢＰをコードするコード配列を含む少なくとも１つの遺伝子構築物を含む組換え細胞系を提供するステップ、および
・該ハイブリドーマまたは宿主細胞を、該ＡＢＰの発現を可能にする条件下で培養するステップ
を含む該方法に関する。
本明細書中で使用する「［本］発明の」、「本発明による（ｉｎ ａｃｃｏｒｄａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、「本発明による（ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」などの用語は、本明細書中に記載した、および／または項目別に示した本発明の全ての態様および実施形態を指すものとする。
本明細書中で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」の両方を包含するものと解釈され、それらの意味は共に、具体的に意図され、従って個別に開示された本発明による実施形態である。本明細書中で使用する場合、「および／または」は、２つの特定の特徴または成分の各々の、他方と併せた、または他方なしの具体的な開示とみなされる。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、まるで各々が本明細書中に個別に記載されているかのような、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の具体的な開示とみなされる。本発明との関連において、用語「約」および「およそ」は、当該特徴の技術的効果をさらに確実なものにすると当業者には理解される、精度の間隔（ｉｎｔｅｒｖａｌ ｏｆ ａｃｃｕｒａｃｙ）を意味する。該用語は典型的には、示された数値からの±２０％、±１５％、±１０％、および例えば±５％の偏差を示す。通常の技術を有する者には理解されるように、所与の技術的効果に関する数値の具体的なかかる偏差は、該技術的効果の性質によって決まる。例えば、天然の、または生物学的な技術的効果は、一般に、人工的または工学的な技術的効果に関するものより大きなかかる偏差を有する場合がある。通常の技術を有する者には理解されるように、所与の技術的効果に関する数値の具体的なかかる偏差は、該技術的効果の性質によって決まる。例えば、天然の、または生物学的な技術的効果は、一般に、人工的または工学的な技術的効果に関するものより大きなかかる偏差を有する場合がある。単数名詞に言及する際に不定冠詞または定冠詞、例えば「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」が使用されている場合、他のものが具体的に記載されていない限り、これはその名詞の複数形を含む。
特定の問題または環境への本発明の教示内容の適用、ならびに本発明のバリエーションまたはそれに対する追加の特徴（例えば、さらなる態様および実施形態）の包含は、本明細書中に含まれる教示内容を考慮すれば、当分野の通常の技術を有する者の能力の範囲内であることは理解されよう。
文脈上他を指示しない限り、上記の特徴の説明および定義は、本発明のいかなる特定の態様または実施形態にも限定されず、記載した全ての態様および実施形態に等しく適用される。
本明細書中で引用した全ての参考文献、特許、および刊行物は、その全内容が参照により本明細書中に組み込まれるものとする。
上記を踏まえると、本発明が以下の項目別の実施形態にも関連することが理解されよう：
項目１：ＣＤ２７６タンパク質、またはそのバリアントに特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）であって、ここで該単離されたＡＢＰが、該ＣＤ２７６を発現する細胞において抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を誘導できる、該単離されたＡＢＰ。
項目２：前記の単離されたＡＢＰが、前記ＣＤ２７６タンパク質、もしくはそのバリアントの免疫グロブリン様Ｖ（ＩｇＶ）もしくはＣ（ＩｇＣ）ドメインまたはＦＧループ領域に特異的に結合する、項目１の項目の単離されたＡＢＰ。
項目３：前記ＣＤ２７６タンパク質がヒトＣＤ２７６タンパク質である、項目１または項目２の項目の単離されたＡＢＰ。
項目４：前記の単離されたＡＢＰが（ｉ）Ｑ１７９、（ｉｉ）Ｇ１３０、（ｉｉｉ）Ｒ１２７、ならびに（ｉｖ）Ｇ４３、Ａ１１５、および／またはＦ１２０から選択されるヒトＣＤ２７６のアミノ酸位置を含むＣＤ２７６エピトープに特異的に結合し、好ましくはここで、該ＡＢＰがヒトＣＤ２７６のＱ１７９を含む（抗体）エピトープに特異的に結合する、項目１～項目３の項目のいずれか１つの単離されたＡＢＰ。
項目５：配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、および３９から選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するか、または配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、および３９から選択される配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、項目１～項目４の項目のいずれか１つの単離されたＡＢＰ。
項目６：前記ＡＢＰが少なくとも１つのＣＤＲ１、および少なくとも１つのＣＤＲ２をさらに含む、項目５の単離されたＡＢＰ。
項目７：前記ＡＢＰが抗体またはその抗原結合フラグメントである、項目１～６のいずれか１つの単離されたＡＢＰ。
項目８：抗体重鎖、もしくはその抗原結合フラグメント、および／または抗体軽鎖、もしくはその抗原結合フラグメントを含む、項目１～７のいずれか１つの単離されたＡＢＰ。
項目９：抗体重鎖可変領域、もしくはその抗原結合フラグメント、および／または抗体軽鎖可変領域、もしくはその抗原結合フラグメントを含む、項目１～８のいずれかの単離されたＡＢＰ。
項目１０：抗体重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに／または抗体軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、項目１～９のいずれかの単離されたＡＢＰ。
項目１１：抗体重鎖配列および／もしくは抗体軽鎖配列、またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで該抗体重鎖配列、またはそのフラグメントが、配列番号３、１１、１９、２７、および３５から選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、または配列番号３、１１、１９、２７、および３５から選択される配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲ３を含み、かつ／あるいは、ここで抗体軽鎖配列、またはそのフラグメントが、配列番号７、１５、２３、３１、および３９から選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、または配列番号７、１５、２３、３１、および３９から選択される配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲ３を含む、項目１～１０のいずれかの単離されたＡＢＰ。
項目１２：前記抗体重鎖配列、またはそのフラグメントが、配列番号１、９、１７、２５、および３３から選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、または配列番号１、９、１７、２５、および３３から選択される配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲ１、ならびに／あるいは配列番号２、１０、１８、２６、および３４から選択される配列に対して８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、または配列番号２、１０、１８、２６、および３４から選択される配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲ２をさらに含む、項目８～１１のいずれか１つの単離されたＡＢＰ。
項目１３：前記抗体軽鎖配列、またはそのフラグメントが、配列番号５、１３、２１、２９、および３７から選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１、または配列番号５、１３、２１、２９、および３７から選択される配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲ１、ならびに／あるいは配列番号６、１４、２２、３０、および３８から選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２、または３もしくは２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲ２をさらに含む、項目８～１２のいずれか１つの単離されたＡＢＰ。
項目１４：配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、および４０から選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する抗体可変鎖配列、または配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、および４０から選択される配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有する抗体可変鎖配列を含む、項目１～１３のいずれか１つの単離されたＡＢＰ。
項目１５：抗体の抗原結合フラグメントを含み、ここで該抗原結合フラグメントが、場合によっては配列番号１、２、３、または５、６、７、または９、１０、１１、または１３、１４、１５、または１７、１８、１９、または２１、２２、２３、または２５、２６、２７、または２９、３０、３１、または３３、３４、３５、または３７、３８、３９の各アミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３または２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失を伴う、項目１～１４のいずれかの単離されたＡＢＰ。
項目１６：前記ＣＤＲ１が配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、または３７のアミノ酸配列を有し、かつ前記ＣＤＲ２が配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、または３８のアミノ酸配列を有し、かつ前記ＣＤＲ３が配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、または３９のアミノ酸配列を有し、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３または２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失を伴う、項目１０～１５のいずれかの単離されたＡＢＰ。
項目１７：前記ＡＢＰが、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体重鎖配列と、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体軽鎖配列とからなる抗体、またはその抗原結合フラグメントであり、ここで該抗体重鎖配列および該抗体軽鎖配列のうちの少なくとも一方、好ましくは両方が、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３配列を下表に記載の組み合わせで含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３または２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失を伴う、項目１～１６のいずれかの単離されたＡＢＰ。
Figure 2023511482000004
項目１８：前記ＡＢＰが、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体重鎖配列と、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体軽鎖配列とからなる抗体、またはその抗原結合フラグメントであり、ここで該抗体重鎖配列および該抗体軽鎖配列が、下表に記載の組み合わせの可変領域配列を含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３または２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失を伴う、項目１～１７のいずれかの単離されたＡＢＰ。
Figure 2023511482000005
項目１９：エフェクター基を含む、および／または標識されている、項目１～１８のいずれか１つに記載の単離されたＡＢＰ。
項目２０：単離されている、および／または実質的に純粋である、項目１～１９のいずれか１つに記載の単離されたＡＢＰ。
項目２１：抗体、例えばモノクローナル抗体であるか、または抗体のフラグメント、例えばモノクローナル抗体のフラグメントである、項目１～２０のいずれか１つに記載の単離されたＡＢＰ。
項目２２：前記抗体がキメラ抗体、例えばヒトキメラ抗体である、項目２１に記載の単離されたＡＢＰ。
項目２３：前記抗体がＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ免疫グロブリンである、項目２１または２２に記載の単離されたＡＢＰ。
項目２４：Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびＦ（ａｂ’）２からなるリストから選択される抗体フラグメントである、項目２１～２３のいずれか１つに記載の単離されたＡＢＰ。
項目２５：前記ＡＢＰが抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増大させるために改変または操作されており、好ましくはここで該ＡＢＰが脱フコシル化されている、項目１～２４のいずれか１つに記載の単離されたＡＢＰ。
項目２６：前記ＣＤ２７６、またはそのバリアント以外の抗原、例えば哺乳動物Ｔ細胞上に存在する抗原、および最も好ましくはヒトＣＤ３に結合する１以上の追加の抗原結合ドメインを含む、項目１～２５のいずれか１つに記載の単離されたＡＢＰ。
項目２７：二重特異性である、および好ましくはＣＤ２７６に結合する２つの結合部位と、該ＣＤ２７６以外の抗原、例えば哺乳動物Ｔ細胞上に存在する抗原、および最も好ましくはヒトＣＤ３に結合する２つの結合部位とを含む、項目２６に記載の単離されたＡＢＰ。
項目２８：前記ＣＤ２７６以外の抗原に結合する前記の２つの結合部位が、ヒトＣＤ３に結合し、かつ好ましくはＵＣＨＴ１抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ構築物を含む、項目２７に記載の単離されたＡＢＰ。
項目２９：抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強する部分をさらに含み、好ましくはここで該部分がインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）または改変ＩＬ－１５などの免疫サイトカイン（ＭＩＣ）である、項目１～２８のいずれか１つの単離されたＡＢＰ。
項目３０：ＣＤ２７６抗原またはそのバリアントに結合する能力がある第１抗原結合ドメインと、ヒト分化抗原群３（ＣＤ３）抗原に結合する能力がある第２抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）。
項目３１：２つ以下かつ２つ以上の第１抗原結合ドメインと２つの第２抗原結合ドメインとを含み、場合によってはここで前記二重特異性ＡＢＰがＩｇＳｃフォーマットである、項目３０に記載の二重特異性ＡＢＰ。
項目３２：抗体におけるＦｃ受容体への結合を媒介できるＣＨ２ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失しているかまたは変異している。項目３０または３１のいずれか１つに記載の二重特異性ＡＢＰ。
項目３３：前記第１抗原結合ドメインが項目１～２９のいずれか１つに記載の前記ＡＢＰ、またはその抗原結合ドメインを含む、項目３０～３２のいずれか１つに記載の二重特異性ＡＢＰ。
項目３４：Ｔ細胞およびＣＤ２７６発現腫瘍細胞、またはＣＤ２７６を発現する腫瘍細胞隣接細胞、例えば腫瘍血管細胞に結合するための活性を有し、好ましくはここで前記抗体がＣＤ２７６およびＣＤ３への結合によりＣＤ２７６発現腫瘍細胞への細胞傷害性細胞の動員を増大させる、項目３０～３３のいずれか１つの二重特異性ＡＢＰ。
項目３５：前記第２抗原結合ドメインがＵＣＨＴ１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、項目３０～３４のいずれか１つに記載の二重特異性ＡＢＰ。
項目３６：項目１～２９のいずれか１つのＡＢＰ、またはＡＢＰの抗原結合フラグメントもしくはモノマー、例えば重もしくは軽鎖をコードする配列、あるいは項目３０～３５のいずれか１つに記載の二重特異性ＡＢＰをコードする配列を含む、単離された核酸。
項目３７：項目３６の核酸と、細胞におけるそのコード化ＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰ、または該ＡＢＰもしくは該二重特異性ＡＢＰの成分（例えば抗体の重鎖もしくは軽鎖）の発現を可能にする１以上の追加の配列特徴とを含む、核酸構築物（ＮＡＣ）。
項目３８：項目３６の核酸または項目３７に記載のＮＡＣを含む組換え宿主細胞。
項目３９：（ｉ）項目１～３５のいずれか１つのＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰ、または（ｉｉ）項目３６の核酸もしくは項目３７に記載のＮＡＣ、または（ｉｉｉ）項目３８に記載の組換え宿主細胞、ならびに製薬上許容可能な担体、安定剤および／または賦形剤を含む、医薬組成物。
項目４０：医薬への使用のための成分であって、ここで該成分が、項目１～３５のいずれか１つのＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰ、項目３６の単離された核酸または項目３７に記載のＮＡＣ、項目３８に記載の組換え宿主細胞および項目３９に記載の医薬組成物からなるリストより選択される、該使用のための成分。
項目４１：前記成分が、ＣＤ２７６陽性腫瘍もしくは腫瘍関連細胞、またはＣＤ２７６のバリアントに対して陽性の腫瘍細胞もしくは腫瘍関連細胞の、Ｔ細胞媒介性の殺傷を増強する、および／またはその増殖を抑制する際に使用するためのものである、項目４０の使用のための成分。
項目４２：前記成分が増殖性疾患の診断、予防および／または処置に使用するためのものであり、ここで該増殖性疾患がＣＤ２７６の発現と関連しており、かつ好ましくはがん、例えば（好適なＣＤ２７６陽性がん）から選択されるがんである、項目４０～４１に記載の使用のための成分。
項目４３：ヒトＣＤ２７６を発現するヒト細胞への細胞媒介性免疫応答を増強する方法であって、該細胞を、項目１～２９のいずれか１つのＡＢＰ、または項目３０～３５のいずれか１つに記載の二重特異性ＡＢＰ、または項目３６に記載の該ＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰをコードする核酸と、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞の存在下で接触させて、それにより該ヒト細胞に対する細胞媒介性免疫応答、好ましくは細胞傷害を増強することを含む、該方法。
項目４４：対象における増殖性疾患の予防および／または処置のための方法であって、該対象への項目４０に列挙した成分の治療上有効な量の投与を含み、かつここで該増殖性疾患が該増殖性疾患に関連する細胞におけるＣＤ２７６の発現を特徴とする、該方法。
図面および配列の簡単な説明
配列は、以下を示している：
Figure 2023511482000006
Figure 2023511482000007
Figure 2023511482000008
配列番号４１は、ヒトＣＤ２７６アイソフォーム１のアミノ酸配列を示す。
Figure 2023511482000009
配列番号４２は、ヒトＣＤ２７６アイソフォーム２のアミノ酸配列を示す。
Figure 2023511482000010
Figure 2023511482000011
配列番号４３は、ヒトＣＤ２７６アイソフォーム３のアミノ酸配列を示す。
Figure 2023511482000012
配列番号４４は、ヒトＣＤ２７６アイソフォーム４のアミノ酸配列を示す。
Figure 2023511482000013
Figure 2023511482000014
本発明のある特定の態様および実施形態を、次に、例を挙げ本明細書中に記載した説明、図面および表を参照して例示する。本発明の方法、使用および他の態様のかかる例は単に代表的なものであって、本発明の範囲をかかる代表例のみに限定するとみなすべきではない。
本発明の過程で、ハイブリダイゼーションおよびスクリーニング手法を利用した組換えＣＤ２７６タンパク質によるマウスの免疫後に、一連の７種の抗体が生成された。次に該抗体の結合エピトープを特徴付けし（図１Ａを参照のこと）、各エピトープに対する代表的な抗体を、下記誘導体の組換え抗体技術を利用した構築のために選択した（図１Ｂを参照のこと）：
・野生型またはＳＤＩＥ改変１ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分を含有する単一特異性抗体
・改変ＩＬ－１５部分と野生型またはＳＤＩＥ改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分とを含有する免疫サイトカイン（ＭＩＣタンパク質）
・以前に開発されたＩｇＧｓｃフォーマットのＣＤ２７６×ＣＤ３特異性を示す二重特異性抗体
次に、前記の種々の構築物の抗腫瘍活性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで試験し、様々なフォーマットで最適な活性を示すＣＤ２７６結合物質を下記実施例に従って同定した。
実施例を以下に示す：
実施例１：抗体の作製
Ｂａｌｂ／ｃマウスを組換えＣＤ２７６タンパク質で免疫した後、脾臓細胞を標準プロトコルに従って融合させた。雌の６ヶ月齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、可溶性ＣＤ２７６－Ｆｃ融合タンパク質を使用して免疫した。使用したタンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＮ末端に融合させた、ヒトＣＤ２７６アイソフォーム２（ＮＭ＿００１０２４７３６．１）（Ｍｅｔ１－Ｔｈｒ４６１）の細胞外ドメインからなるものである。５０μｇの該Ｆｃ融合タンパク質を、各免疫につき１００μＬの量のＰＢＳ中で腹腔内に反復投与した。該マウスを、１０日毎に計３～４回免疫し、最後の静脈内適用は融合の４日前とした。融合細胞の上清を、フローサイトメトリーによりＣＤ２７６をトランスフェクトしたマウス細胞への結合を評価することで、特異的抗体の産生についてスクリーニングした。次に、合計７種のハイブリドーマを再クローン化し、１．２５％ＦＣＳを補充したアドバンスドＤＭＥＭ培地中で増殖させた。抗体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００でのタンパク質アフィニティークロマトグラフィおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により培養上清から精製した。純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび分析的ＳＥＣにより評価した。作製した抗体の配列を表１に示す。
実施例２：新規ＣＤ２７６抗体のエピトープマッピング
ヒトＣＤ２７６分子は２つのアイソフォーム、すなわち２ＩｇＢ７－Ｈ３および４ＩｇＢ７－Ｈ３として存在し、後者はエクソン重複の結果であって、ヒトでは優勢型に相当する。このタンパク質の細胞外構造は、ＩｇＶ－ＩｇＣ様（２ＩｇＢ７－Ｈ３）またはＩｇＶ１－ＩｇＣ１－ＩｇＶ２－ＩｇＣ２様（４ＩｇＢ７－Ｈ３）ドメインを特徴とする。マウスは該２ＩｇＢ７－Ｈ３アイソフォームだけを発現する。エピトープマッピングのために、本発明者らは先ず、該４ＩｇＢ７－Ｈ３分子の切断型であるＩｇＶ１－ＩｇＣ１およびＩｇＶ２－ＩｇＣ２をＦｃ融合タンパク質として作製した。本発明者らは、全ての抗体が両切断型を認識したことに注目した。さらに、該抗体はいずれもマウスタンパク質との交差反応を示さなかった。そこで、高度に保存されたヒトおよびマウスタンパク質間の配列アラインメントを実施した。最終的に、本発明者らは、ヒトＩｇＶ１－ＩｇＣ１－Ｆｃタンパク質中の可変アミノ酸をマウスの分子の各アミノ酸に置き換えた。これにより、図１Ａに示すような該抗体のエピトープマップおよびグループ分けが得られた。さらに、ＦＡＣＳベースの競合アッセイを実施し、同一グループ内の抗体は互いに交差遮断するが、異なるグループの抗体は交差遮断しないことを確認した。
実施例３：組換え抗体誘導体の作製および特徴付け
各グループの代表的な抗体の可変領域を配列決定し、種々の抗体フォーマットに組み込み、さらに該抗体の抗腫瘍活性を適切な機能アッセイで試験した：
（１）ＳＤＩＥ最適化単一特異性抗体：３種のＳＤＩＥ抗体によるＡＤＣＣグラフ。Ｆｃ増強型の抗体７Ｃ４および８Ｄ９に関する結果を図４に提供する。該抗体７Ｃ４は他より優れており、有意に高いＮＫ細胞の活性化、および腫瘍細胞の枯渇を示した。
（２）改変ＩＬ－１５部分を含有する免疫サイトカイン：抗体ＭＩＣ ７Ｃ４、８Ｈ８および８Ｄ９の、ＮＫ細胞の活性化および腫瘍細胞の殺傷を図４および５に示す。図より明らかな通り、全ての抗体が良好に機能し、７Ｃ４が最も活性のある抗体であった。
（３）ＣＤ２６５×ＣＤ３特異性を示す二重特異性抗体のＢｉａｃｏｒｅ、ＦＡＣＳ結合および腫瘍細胞の殺傷：結果を図２、３、および６～７に示す。
参考文献
参考文献は以下の通りである。
Figure 2023511482000015
Figure 2023511482000016

Claims (17)

  1. ＣＤ２７６タンパク質、またはそのバリアントに特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）であって、かつここで該単離されたＡＢＰが該ＣＤ２７６タンパク質を発現する細胞に対して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導可能であり、ここで該ＡＢＰが、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、および３９から選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するか、または配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、および３９から選択される配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有する、少なくとも１つ、好ましくは２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含む、単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）。
  2. 前記ＡＢＰが少なくとも１つ、好ましくは２つのＣＤＲ１、および少なくとも１つ、好ましくは２つのＣＤＲ２をさらに含む、請求項１記載の単離されたＡＢＰ。
  3. 抗体重鎖配列および／もしくは抗体軽鎖配列、またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで該抗体重鎖配列、またはそのフラグメントが、配列番号３、１１、１９、２７、および３５から選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、または配列番号３、１１、１９、２７、および３５から選択される配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲ３を含み、かつ／あるいはここで該抗体軽鎖配列、またはそのフラグメントが、配列番号７、１５、２３、３１、および３９から選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３、または配列番号７、１５、２３、３１、および３９から選択される配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するＣＤＲ３を含む、請求項１または２記載の単離されたＡＢＰ。
  4. 抗体の抗原結合フラグメントを含み、ここで該抗原結合フラグメントが、場合によっては配列番号１、２、３、または５、６、７、または９、１０、１１、または１３、１４、１５、または１７、１８、１９、または２１、２２、２３、または２５、２６、２７、または２９、３０、３１、または３３、３４、３５、または３７、３８、３９の各アミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３または２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失を伴う、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離されたＡＢＰ。
  5. 前記ＡＢＰが、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体重鎖配列と、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体軽鎖配列とからなる抗体、またはその抗原結合フラグメントであり、かつ該ＡＢＰが、
    （Ａ）配列番号１に示す抗体重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号２に示す抗体重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３に示す抗体重鎖ＣＤＲ３配列、ならびに配列番号５に示す抗体軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号６に示す抗体軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号７に示す抗体軽鎖ＣＤＲ３配列を含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を伴う、または
    （Ｂ）配列番号９に示す抗体重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１０に示す抗体重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１１に示す抗体重鎖ＣＤＲ３配列、ならびに配列番号１３に示す抗体軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１４に示す抗体軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１５に示す抗体軽鎖ＣＤＲ３配列を含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を伴う、または
    （Ｃ）配列番号１７に示す抗体重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１８に示す抗体重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１９に示す抗体重鎖ＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２１に示す抗体軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号２２に示す抗体軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号２３に示す抗体軽鎖ＣＤＲ３配列を含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を伴う、または
    （Ｄ）配列番号２５に示す抗体重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号２６に示す抗体重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号２７に示す抗体重鎖ＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２９に示す抗体軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号３０に示す抗体軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３１に示す抗体軽鎖ＣＤＲ３配列を含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を伴う、または
    （Ｅ）配列番号３３に示す抗体重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号３４に示す抗体重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３５に示す抗体重鎖ＣＤＲ３配列、ならびに配列番号３６に示す抗体軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号３７に示す抗体軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３８に示す抗体軽鎖ＣＤＲ３配列を含み、各場合に独立して、場合によってはこれらの配列と比較して３もしくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を伴う
    少なくとも１つの抗原結合ドメインを有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離されたＡＢＰ。
  6. 前記ＡＢＰが抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増大させるために改変または操作されており、好ましくはここで該ＡＢＰがＳＤＩＥ変異を含む、および／または脱フコシル化されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離されたＡＢＰ。
  7. 前記ＣＤ２７６、またはそのバリアント以外の抗原、例えば哺乳動物Ｔ細胞上に存在する抗原、および最も好ましくはヒトＣＤ３に結合する、１以上の追加の抗原結合ドメインを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離されたＡＢＰ。
  8. 抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強する部分をさらに含み、好ましくはここで該部分がインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）または改変ＩＬ－１５などの免疫サイトカイン（ＭＩＣ）である、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離されたＡＢＰ。
  9. ＣＤ２７６抗原、またはそのバリアントに結合する能力がある第１抗原結合ドメインと、免疫細胞上に発現された抗原、好ましくはＣＤ３に結合する能力がある第２抗原結合ドメインとを含み、ここで該第１抗原結合ドメインが請求項１～８のいずれか１項に記載のＡＢＰの抗原結合ドメインである、二重特異性抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）。
  10. ＣＤ３を発現するＴ細胞、およびＣＤ２７６発現腫瘍細胞、またはＣＤ２７６を発現する腫瘍細胞隣接細胞、例えば腫瘍血管細胞、に結合するための活性を有し、好ましくはここで前記二重特異性ＡＢＰがＣＤ２７６およびＣＤ３への結合によりＣＤ２７６発現細胞への細胞傷害性細胞の動員を増大させる、請求項９記載の二重特異性ＡＢＰ。
  11. 請求項１～８のいずれか１項に記載のＡＢＰ、またはＡＢＰの抗原結合フラグメントもしくはモノマー、例えば重もしくは軽鎖、をコードするか、あるいは請求項９または１０記載の二重特異性ＡＢＰをコードする配列を含む、単離された核酸。
  12. 請求項１１記載の核酸と、細胞におけるそのコード化ＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰ、または該ＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰの成分（例えば、抗体の重鎖もしくは軽鎖）の発現を可能にする１以上の追加の配列特徴とを含む、核酸構築物（ＮＡＣ）。
  13. 請求項１１記載の核酸または請求項１２記載のＮＡＣを含む、組換え宿主細胞。
  14. （ｉ）請求項１～１０のいずれか１項に記載のＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰ、または（ｉｉ）請求項１１記載の核酸もしくは請求項１２記載のＮＡＣ、または（ｉｉｉ）請求項１３記載の組換え宿主細胞、ならびに製薬上許容可能な担体、安定化剤および／または賦形剤を含む、医薬組成物。
  15. 医薬への使用のための成分であって、該成分が、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＡＢＰもしくは二重特異性ＡＢＰ、請求項１１記載の単離された核酸もしくは請求項１２記載のＮＡＣ、請求項１３記載の組換え宿主細胞および請求項１４記載の医薬組成物、からなるリストより選択される、該使用のための成分。
  16. 前記成分が、ＣＤ２７６陽性腫瘍もしくは腫瘍関連細胞、またはＣＤ２７６のバリアントに対して陽性の腫瘍細胞もしくは腫瘍関連細胞の、Ｔ細胞媒介性の殺傷の増強および／または増殖の抑制に使用するためのものである、請求項１５記載の使用のための成分。
  17. 前記使用が、ＣＤ２７６の発現を特徴とする増殖性疾患、好ましくはがんの処置または予防である、請求項１５または１６記載の使用のための成分。
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