KR20230038139A - 인간화 cd38 및 icam1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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버투오소 빈코, 인크.
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Abstract

인간화 항-CD38 항체, 인간화 항-ICAM1 항체, 및 인간화 항-CD38 및 항-ICAM1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체, 및 종양 세포를 사멸시키고 종양 성장을 억제하기 위해 인간화 항-CD38 항체, 인간화 항-ICAM1 항체, 및 인간화 항-CD38 및 항-ICAM1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 사용하는 방법이 본원에 개시된다.

Description

인간화 CD38 및 ICAM1 항체 및 이의 용도
1. 상호 참조
본 출원은 2020년 5월 14일에 출원된 미국 가출원 제63/024,931호의 이익을 특허청구한 것이며, 이는 모든 목적상 전체적으로 본원에 참조로 포함된다.
2. 참조에 의한 인용
본원의 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 본원의 용어와 인용된 참조문헌의 용어 사이에 불일치가 있는 경우, 본원의 용어가 우위에 있다.
2.1 서열목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었고 그 전체가 본원에 참조로 포함된 서열목록을 포함한다. 2021년 5월 14일에 작성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 55429-707_601_SL.txt이고 크기가 143,044바이트이다.
3. 본 개시내용의 개요
본 개시내용은 CD38 및 ICAM1의 세포외 도메인에 결합하는 인간화 이중특이적 항체를 기재한다. 본원에 개시된 다양한 실시양태에서, CD38 및 ICAM1의 세포외 도메인에 결합하는 인간화 이중특이적 항체는 CD38 및 ICAM1 발현 수준이 다양한 광범위한 형질전환된 세포에 대해 세포독성 및 항종양 활성을 갖는다.
일 실시양태에서, 이중특이적 항체는 하나 이상의 인간화 CD38 결합 도메인, 하나 이상의 인간화 ICAM1 결합 도메인 및 인간 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간화 CD38 결합 도메인은 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간화 CD38 결합 도메인은 IgG 중쇄의 가변 도메인 및 IgG 경쇄의 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간화 CD38 결합 도메인은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간화 ICAM1 결합 도메인은 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간화 ICAM1 결합 도메인은 IgG 중쇄의 가변 도메인 및 IgG 경쇄의 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간화 ICAM1 결합 도메인은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이적 항체의 이소형은 IgG1이다. 일부 실시양태에서, 상기 인간 Fc 도메인은 이종이량체 Fc 도메인이고, 여기서 이종이량체 Fc 영역은 놉(knob) 사슬 및 홀(hole) 사슬을 포함하여 놉-인-홀(knob-in-hole: KiH) 구조를 형성한다. 구체적 실시양태에서, 상기 놉 사슬은 돌연변이 T366W를 포함하고 상기 홀 사슬은 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하며, 여기서 아미노산 위치 번호매김은 카밧(Kabat) 등의 EU 지수에 따른다. 또 다른 실시양태에서, 상기 놉 사슬은 돌연변이 S354C, T366W를 포함하고 홀 사슬은 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함하며, 여기서 아미노산 위치 번호매김은 카밧 등의 EU 지수에 따른다. 일부 실시양태에서, 상기 Fc 도메인은 비푸코실화된다(afucosylated). 일부 실시양태에서, 상기 Fc 도메인은 항체 의존성 세포 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC) 활성을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 상기 Fc 도메인은 S239D, I332E 및 A330L 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 번호는 카밧 등의 EU 지수에 따른다. 일부 실시양태에서, 인간화 CD38 결합 도메인은 항-CD38 IgG의 가변 도메인을 포함하고, ICAM1 결합 도메인은 항-ICAM1 단일 사슬 가변 단편(항-ICAM1 scFv)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간화 ICAM1 결합 도메인은 항-ICAM1 IgG의 가변 도메인을 포함하고, CD38 결합 도메인은 항-CD38 단일 사슬 가변 단편(항-CD38 scFv)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 CH1 IgG 도메인 및 CL IgG 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 T 세포 수용체(TCR) 불변 영역을 추가로 포함하며, 여기서 TCR 불변 영역은 TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 상기 인간화 CD38 결합 도메인은 VH-CD38 도메인 및 VL-CD38 도메인을 포함하고, 여기서 VH-CD38 도메인은 TCR 베타 불변 도메인에 융합되고, VL-CD38 도메인은 TCR 알파 불변 도메인에 융합된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 인간화 CD38 결합 도메인은 VH-CD38 도메인 및 VL-CD38 도메인을 포함하고, 여기서 VH-CD38 도메인은 CH1 IgG 도메인에 융합되고, VL-CD38 도메인은 CL IgG 도메인에 융합된다. 일부 실시양태에서, 상기 인간화 ICAM1 결합 도메인은 VH-ICAM1 도메인 및 VL-ICAM1 도메인을 포함하고, 여기서 VH-ICAM1 도메인은 TCR 베타 불변 도메인에 융합되고, VL-ICAM1 도메인은 TCR 알파 불변 도메인에 융합된다. 일부 실시양태에서, 상기 인간화 ICAM1 결합 도메인은 VH-ICAM1 도메인 및 VL-ICAM1 도메인을 포함하고, 여기서 VH-ICAM1 도메인은 CH1 IgG 도메인에 융합되고, VL-ICAM1 도메인은 CL IgG 도메인에 융합된다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이적 항체는 적어도 55℃, 적어도 60℃ 또는 적어도 65℃의 용융 전이 온도를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 인간화 CD38 결합 도메인은 서열 번호 40과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 CD38 결합 도메인은 서열 번호 41과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간화 CD38 결합 도메인은 서열 번호 35와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 CD38 결합 도메인은 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 및 서열 번호 55와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HC CDR3 도메인은 글루탐산 95, 글루탐산 100b, 글리신 100c 및 티로신 100d를 포함하고, LC CDR3 도메인은 글리신 90, 티로신 91, 세린 93, 글리신 94 및 티로신 96을 포함하고, 여기서 아미노산 위치 번호매김은 카밧 등의 EU 지수에 따른다. 일부 실시양태에서, 인간화 ICAM1 결합 도메인은 서열 번호 44와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 ICAM1 결합 도메인은 서열 번호 45와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 ICAM1 결합 도메인은 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60 및 서열 번호 61과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 CD38 결합 도메인은 10 nM 미만 또는 5 nM 미만의 평형 해리 상수(KD 또는 KD)로 인간 CD38의 세포외 도메인에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 CD38 결합 도메인은 0.1 nM 내지 20 nM, 0.5 nM 내지 15 nM, 1 nM 내지 10 nM, 또는 1 nM 내지 5 nM의 평형 해리 상수(KD 또는 KD)로 인간 CD38의 세포외 도메인에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 CD38 결합 도메인은 2 nM 내지 5 nM의 평형 해리 상수(KD 또는 KD)로 인간 CD38의 세포외 도메인에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 ICAM1 결합 도메인은 1 nM 미만, 0.5 nM 미만 또는 0.2 nM 미만의 평형 해리 상수(KD 또는 KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 ICAM1 결합 도메인은 0.02 nM 내지 10 nM, 0.05 nM 내지 5 nM, 0.05 nM 내지 1 nM, 또는 0.1 nM 내지 0.5 nM의 평형 해리 상수(KD 또는 KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 ICAM1 결합 도메인은 0.1 nM 내지 0.15 nM의 평형 해리 상수(KD 또는 KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 비푸코실화된 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 비푸코실화된 Fc 도메인을 포함하지 않는 그외에는 동일한 이중특이적 항체에 의해 표적 세포에서 유도된 항원 의존성 세포 세포독성(ADCC) 효과와 비교하여 표적 세포에서 향상된 ADCC 효과를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간화 CD38 결합 도메인 또는 인간화 ICAM1 결합 도메인을 포함하는 단일특이적 단백질에 의해 표적 세포에서 유도된 ADCC 효과와 비교하여 표적 세포에서 향상된 ADCC 효과를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 10 nM 미만 또는 0.5 nM 내지 1.0 nM의 EC50(최대 유효 농도(들)의 절반)으로 다우디(Daudi) 세포 상에서 보체 의존성 세포독성을 유도할 수 있다.
일 실시양태에서, 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편은 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 및 서열 번호 61과 90%와 적어도 90% 동일한 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 44 및 서열 번호 45와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 청구항 42의 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편. 일부 실시양태에서, 상기 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편은 1 nM 미만 또는 0.5 nM 미만의 평형 해리 상수(KD 또는 KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 하나 이상의 ICAM1 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편은 0.02 nM 내지 10 nM, 0.05 nM 내지 5 nM, 또는 0.05 nM 내지 1 nM의 평형 해리 상수(KD 또는 KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 하나 이상의 ICAM1 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편은 0.1 nM 내지 0.5 nM의 평형 해리 상수(KD 또는 KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 하나 이상의 ICAM1 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 KD는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된다.
일 실시양태에서, 약학적 조성물은 이전 실시양태 중 어느 하나의 이중특이적 항체, 이전 실시양태 중 어느 하나의 인간화 항-ICAM1 항체, 이의 ICAM1 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, 대상체에서 세포를 사멸시키는 방법은 이전 실시양태 중 어느 하나의 이중특이적 항체, 또는 이전 실시양태 중 어느 하나의 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편, 또는 상기 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포는 CD38 및 ICAM1을 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포는 용해된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 종양 세포이다. 다른 실시양태에서, 대상체에서 종양의 성장을 감소시키는 방법은 이전 실시양태 중 어느 하나의 이중특이적 항체, 또는 이전 실시양태 중 어느 하나의 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편, 또는 상기 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 종양은 CD38 및 ICAM1을 발현하는 세포를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 대상체에서 암을 치료하는 방법은 이전 실시양태 중 어느 하나의 이중특이적 항체, 또는 이전 실시양태 중 어느 하나의 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편, 또는 상기 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 암은 CD38 및 ICAM1을 발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 암은 고형 종양 또는 혈액 악성종양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 암은 혈액 악성종양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 혈액 악성종양은 다발성 골수종, 림프종 또는 버킷 림프종이다. 일부 실시양태에서, 상기 암은 폐암 또는 전립선암이다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 이의 표면 상에서 적어도 NCI-H2291 세포만큼의 ICAM1을 발현한다.
일부 실시양태에서, 상기 세포는 이의 표면 상에서 적어도 NCI-H2342 세포만큼의 CD38을 발현한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 이의 표면 상에서 다우디 세포보다 더 적은 CD38을 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포의 표면 상의 CD38의 양은 라지(Raji) 세포의 표면 상의 CD38의 양 이하이다. 일부 실시양태에서, 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율은 다우디 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율보다 크다. 일부 실시양태에서, 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율은 라지 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율 이상이다. 일부 실시양태에서, 세포는 이의 표면 상에서 적어도 5000, 10000, 150000, 20000, 30000, 50000, 100000, 150000, 200000, 250000, 300000, 400000, 또는 500000개의 ICAM1 단백질을 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포는 이의 표면 상에서 적어도 50,000개의 ICAM1 단백질을 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포는 이의 표면 상에서 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개의 CD38 단백질을 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포는 이의 표면 상에서 적어도 300개의 CD38 단백질을 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포는 이의 표면 상에서 약 350000, 300000, 250000, 200000, 150000, 100000, 50000, 30000, 20000, 15000, 10000, 또는 5000개 미만의 CD38 단백질을 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포는 이의 표면 상에서 약 350,000개 미만의 CD38 단백질을 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율은 적어도 약 1, 1.5, 2.0, 2.5, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 또는 200이다. 일부 실시양태에서, 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율은 적어도 약 1이다. 일부 실시양태에서, 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율은 적어도 약 10이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
다른 실시양태에서, 키트는 이전 실시양태 중 어느 하나의 이중특이적 항체, 또는 이전 실시양태 중 어느 하나의 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편, 또는 이전 실시양태의 약학적 조성물을 포함한다.
4. 도면의 간단한 설명
본 발명의 신규 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시양태를 기재하는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조함으로써 본 발명의 특징 및 이점에 대한 더 나은 이해가 얻어질 것이다:
도 1a 내지 1b는 18E4의 키메라 및 인간화 변이체의 VL(도 1a) 및 VH(도 1b) 도메인의 아미노산 서열 정렬을 도시한다. CDR은 볼드체로 강조 표시되어 있다. 수직선은 보존된 잔기를 나타낸다. 도면은 출현 순서에 따라 각각 서열 번호 6, 63-68, 41 및 69-77을 개시한다.
도 2a 내지 2b는 h18E4-19 경쇄(도 2a) 및 중쇄(도 2b)의 알라닌 스캔 변이체의 아미노산 서열 정렬을 도시한다. 도면은 출현 순서에 따라 각각 서열 번호 41, 78-86, 77 및 87-99를 개시한다.
도 3a 내지 3b는 8B12의 키메라 및 인간화 변이체의 VL(도 3a) 및 VH(도 3b) 도메인의 아미노산 서열 정렬을 도시한다. CDR은 볼드체로 표시되어 있다. 수직선은 보존된 잔기를 나타낸다. 도면은 출현 순서대로 각각 서열 번호 26 및 100-111을 개시한다.
도 4a 내지 4b는 항-ICAM1 클론 8B12 및 11F2로부터의 VH CDR(도 4a) 및 LC CDR(도 4b)의 아미노산 서열 정렬을 도시한다. 수직선은 보존된 잔기를 나타낸다.
도 5a 내지 5b는 11F2의 키메라 및 인간화 변이체의 VL(도 5a) 및 VH(도 5b) 도메인의 아미노산 서열 정렬을 도시한다. CDR은 볼드체로 표시되어 있다. 수직선은 보존된 잔기를 나타낸다. 도면은 출현 순서대로 각각 서열 번호 16, 112-113, 45, 114-117, 44 및 118-120을 개시한다.
도 6a 내지 6c는 예시적인 이중특이적 TCR-키메라 항체 포맷을 도시한다. (도 6a) 비대칭 2가 1+1 (도 6b) 비대칭 3가 2+1 (도 6c) 대칭 4가 2+2. 검은색 사각형은 IgG 불변 도메인을 나타낸다. 삼각형 연장부 및 만입부는 Fc 도메인 내의 놉-인투-홀(knob-into-hole) 돌연변이를 나타낸다. 체크무늬 타원형은 TCR 불변 도메인을 나타낸다. 회색 및 흰색 사각형은 상이한 항원 결합 도메인을 나타낸다.
도 7a 내지 7b는 TCR-키메라 항체 포맷(도 7a) 및 3쇄 항체 포맷(도 7b)의 이중특이적 CD38xICAM1을 도시한다. 검은색 사각형은 IgG 불변 도메인을 나타낸다. 삼각형 연장부 및 만입부는 Fc 도메인 내의 놉-인투-홀(knob-into-hole) 돌연변이를 나타낸다. 체크무늬 타원은 TCR 불변 도메인을 나타낸다. 회색 및 흰색 사각형은 상이한 항원 결합 도메인을 나타낸다. 직조무늬(weaved) 타원형은 항-CD38 scFv를 나타낸다.
도 8a 내지 8e는 이중특이적 또는 2가 항체에 의한 다우디(도 8a), 라지(도 8b), HuNS1(도 8c), NCI-H2342(도 8d) 및 NCI-2291(도 8e) 세포의 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC) 매개 용해를 도시한다.
도 9a 내지 9c는 이중특이적 또는 2가 항체에 의한 라지 림프종(도 9a), KMS-26 다발성 골수종(도 9b) 또는 HCC44 폐 암종(도 9c) 세포 유래 이종이식편의 성장 억제를 도시한다.
도 10은 이중특이적 또는 2가 항체에 의한 LY3071 림프종 환자 유래 이종이식편의 성장 억제를 도시한다.
5. 본 개시의 상세한 설명
CD38에 결합하는 항체는 CD38을 발현하는 암의 치료에 유용하다. 항-CD38 항체는 항체 의존성 세포 매개 세포독성 및 보체 의존성 세포독성을 포함하는 다양한 메커니즘에 의해 암 세포를 사멸시키는 것으로 사료된다. 이러한 항체 중 하나인 다라투무맙은 성인 다발성 골수종 치료용으로 승인되어 있다. 감소된 CD38 발현은 항-CD38 항체의 효능을 제한할 수 있다. 이러한 한계를 극복하기 위한 제안은 CD38에 더 높은 친화도를 갖는 항체를 사용한 치료, CD38 상의 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 사용한 치료, CD38 효소 활성을 보다 효과적으로 억제하는 항체를 사용한 치료, 4가 항-CD38 항체를 사용한 치료 및 CD38 발현을 증가시키는 올-트랜스 레티노산(all-trans retinoic acid)을 사용한 동시 치료를 포함한다.
항체 기반 치료제는 표적 결합에 대한 항체의 특이성 및 친화도와 화학적 및 분자적 변형의 용이성으로 인해 효과적인 암 치료 옵션으로서 부상하였다. 예를 들어, 승인된 항체 기반 요법은 리툭시맙, 토시투모맙 및 트라스투주맙과 같은 단클론 항체; 및 블리나투모맙과 같은 이중특이적 T-세포 인게이저(engager)를 포함한다.
일부 예에서, 표적 세포 상의 낮은 수용체 카피 수 또는 항원에 대한 낮은 친화도가 항체 기반 요법의 치료 효과를 방해하였다. 일부 경우에, 표적 항원에 대한 항체의 비특이성(non-specificity) 또는 암세포와 및 비암세포 둘 다에서 표적의 존재는 항체 기반 요법의 사용이 더욱 제한하였다.
사이클릭 ADP 리보스 하이드롤라제로도 알려진 CD38은 긴 C-말단 세포외 도메인 및 짧은 N-말단 세포질 도메인을 갖는 II형 막관통 당단백질이다. CD38은 사이토카인 분비와 림프구의 활성화 및 증식을 매개하고(Funaro et al, J Immunology 145:2390-6, 1990; Guse et al, Nature 398:70-3, 1999), 이의 NAD 글리코하이드롤라제 활성을 통해, 조절성 T-세포 구획의 조절에 연루된 세포외 NAD+ 수준을 조절한다(Adriouch et al., 14: 1284-92, 2012; Chiarugi et al., Nature Reviews 12:741-52, 2012). 일부 예에서, CD38은 상이한 유형의 암, 특히 다발성 골수종과 같은 혈액 악성종양에서 상향조절된다.
CD54로도 알려진 ICAM1은 Ig-유사 세포 부착 분자이다. ICAM1은 내피 및 백혈구 관련 막관통 단백질이며 세포 간 상호작용을 안정화하고 백혈구 내피 이동을 촉진하는 데 관여한다. ICAM1은 내피세포 및 백혈구를 포함하는 다양한 세포 유형에서 발현되며 골수종, 췌장암, 신경아교종, 폐암, 흑색종, 결장직장암 및 림프종과 같은 상이한 암 세포에서 발현되거나 과발현될 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간화 항-CD38 항체, 인간화 항-ICAM1 항체, 및 인간화 CD38 및 ICAM1 결합 도메인을 갖는 이중특이적 항체가 본원에 개시된다. 추가적인 실시양태에서, 항-CD38 항체, 항-ICAM1 항체 또는 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 CD38/ICAM1 항체)를 사용하여 암을 치료하는 방법이 본원에 추가로 기재된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "이중특이적 항체"는 일반적으로 적어도 2개의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭하며, 2개의 상이한 항원에만 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하고, 또한 2개의 상이한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하고, 추가로 제3, 제4 또는 그 이상의 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 추가적인 결합 도메인을 포함하거나 이에 접합된다.
5.1 인간화 항-CD38 항체
특정 실시양태에서, 인간화 항-CD38 항체가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-CD38 항체는 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)를 포함하는 전장 항체이다. 일부 경우에, HC는 도 1b 또는 도 2b로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 경우에, LC는 도 1a 또는 도 2a로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 예에서, 항-CD38 항체는 가변 중쇄(VH) 영역 및 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하고, 여기서 VH 영역은 서열 번호 50의 CDR1 서열; 서열 번호 51의 CDR2 서열; 및 서열 번호 52의 CDR3 서열을 포함하고; VL 영역은 서열 번호 53의 CDR1 서열; 서열 번호 54의 CDR2 서열; 및 서열 번호 55의 CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항-CD38 항체는 VH 영역 및 VL 영역을 포함하며, 여기서 상기 VH 영역의 서열은 서열 번호 5 또는 40에 대해 약 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84 %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 포함하고 상기 VL 영역의 서열은 서열 번호 6 또는 41에 대해 약 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항-CD38 항체는 전장 항체이다. 다른 실시양태에서, 인간화 항-CD38 항체는 결합 단편이다. 일부 예에서, 인간화 항-CD38 항체는 항체 또는 이의 결합 단편, 단클론 항체 또는 이의 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 인간화 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 일부 경우에, 인간화 항-CD38 항체는 1가 Fab, 2가 Fab'2, 단일 사슬 가변 단편(scFv) 또는 이의 결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-CD38 항체는 참조 항체로서의 다라투무맙과 비교하여 향상된 ADCC 및/또는 CDC를 갖는다. 일부 경우에, 향상된 ADCC 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)은 다라투무맙과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 그 이상의 증가이다. 일부 경우에, 향상된 ADCC 및/또는 CDC는 다라투무맙과 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 그 이상의 증가이다.
일부 경우에, 향상된 ADCC 및/또는 CDC는 참조 항체 다라투무맙과 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 그 이상의 증가이다. 일부 경우에, 향상된 ADCC 및/또는 CDC는 참조 항체 다라투무맙과 비교하여 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 그 이상의 증가이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-CD38 항체는 예를 들어, PBMC 효과기 세포를 사용하고 림프종으로부터 B-림프아세포, 예를 들어 다우디 세포와 같은 암 세포를 표적화하여 ADCC 활성을 결정하기 위한 시험관내 세포독성 분석에서 약 1 x 10-6 nM 내지 약 2 nM, 예컨대 약 4 x 10-6 nM, 약 0.000014 nM, 0.00007 nM, 0.00006 nM, 약 0.00010 nM, 약 0.0002 nM, 약 0.0003 nM, 약 0.1 nM, 약 0.2 nM, 약 0.3 nM, 약 0.4 nM, 약 0.5 nM, 약 0.6 nM, 약 0.7 nM, 약 0.8 nM, 약 0.9 nM, 약 1.0 nM, 또는 약 0.00001 내지 약 0.00003 nM의 최대 유효 농도의 절반(EC50 또는 EC50)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-CD38 항체는 참조 항체 다라투무맙과 비교하여 개선된 세포 사멸 효과를 갖는다. 일부 경우에, 개선된 세포 사멸 효과는 참조 항체 다라투무맙과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 또는 그 이상의 증가이다. 일부 경우에, 개선된 세포 사멸 효과는 참조 항체 다라투무맙과 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 또는 그 이상의 증가이다.
일부 예에서, 개선된 세포 사멸 효과는 참조 항체 다라투무맙과 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 또는 그 이상의 증가이다. 일부 경우에, 개선된 세포 사멸 효과는 참조 항체 다라투무맙과 비교하여 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 또는 그 이상의 증가이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-CD38 항체는 참조 항체 다라투무맙과 비교하여 개선된 혈청 반감기를 갖는다. 일부 예에서, 개선된 혈청 반감기는 참조 항체 다라투무맙보다 적어도 30분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 14일, 30일 또는 그 이상 길다.
일부 경우에, 본원에 기재된 항-CD38 항체의 혈청 반감기는 참조 항체 다라투무맙보다 적어도 30분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 14일, 30일 또는 그 이상 길다. 일부 경우에, 본원에 기재된 항-CD38 항체의 혈청 반감기는 약 30분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 14일, 30일, 또는 그 이상이다.
5.2 항-ICAM1 항체
특정 실시양태에서, 인간화 항-ICAM1 항체가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-ICAM1 항체는 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)를 포함하는 전장 항체이다. 일부 경우에, HC는 도 3b 또는 도 5b로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 경우에, LC는 도 3b 또는 도 5b로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-ICAM1 항체는 VH 영역 및 VL 영역을 포함하고, 여기서 VH 영역은 서열 번호 17, 27 및 56으로부터 선택된 CDR1 서열을 포함하고; 서열 번호 18, 28 및 57로부터 선택된 CDR2 서열; 및 서열 번호 19, 29 및 58로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하고; VL 영역은 서열 번호 20, 30 및 59로부터 선택된 CDR1 서열; 서열 번호 21, 31, 및 60으로부터 선택된 CDR2 서열; 및 서열 번호 22, 30 및 61로부터 선택된 CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항-ICAM1 항체는 VH 영역 및 VL 영역을 포함하고, 여기서 상기 VH 영역의 서열은 서열 번호 44에 대해 약 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 100% 서열 동일성을 포함하고 VL 영역의 서열은 서열 번호 45에 대해 약 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 100% 서열 동일성을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항-ICAM1 항체는 전장 항체이다. 다른 실시양태에서, 항-ICAM1 항체는 결합 단편이다. 일부 예에서, 항-ICAM1 항체는 항체 또는 이의 결합 단편, 단클론 항체 또는 이의 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 인간화 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 일부 경우에, 인간화 항-ICAM1 항체는 1가 Fab, 2가 Fab'2, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 또는 이의 결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 항-ICAM1 항체는 예를 들어, 인간 전립선암 세포와 같은 암 세포를 사용하여 ADCC 활성을 결정하기 위한 시험관내 세포독성 분석에서 약 0.001 nM 내지 약 2.5 nM, 예컨대 약 0.02 nM, 0.03 nM, 약 0.04 nM, 약 0.05 nM, 약 0.06 nM, 약 0.09 nM, 약 0.1 nM, 약 1.2 nM, 약 1.7 nM, 약 2.0 nM, 약 2.5 nM의 최대 유효 농도의 절반(EC50 또는 EC50)을 갖는다.
일부 경우에, 본원에 기재된 인간화 항-ICAM1 항체의 혈청 반감기는 적어도 30분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 14일, 30일, 또는 그 이상이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 인간화 항-ICAM1 항체의 혈청 반감기는 약 30분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 14일, 30일, 또는 그 이상이다.
5.3 이중특이적 항체
특정 실시양태에서, 인간화 이중특이적 항-CD38 및 항-ICAM1 항체, 또는 이의 결합 단편이 본원에 기재된다. 일부 예에서, 인간화 이중특이적 항-CD38 및 항-ICAM1 항체는 CD38에 특이적으로 결합하는 제1 인간화 표적화 모이어티 및 ICAM1에 특이적으로 결합하는 제2 인간화 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 2가, 3가, 4가 또는 4가 초과이다. 일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 CD38에 결합하는 하나 초과의 결합 부위를 갖는다. 일부 예에서, 이중특이적 항체는 ICAM1에 결합하는 하나 초과의 결합 부위를 갖는다. 일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체 또는 이의 결합 단편은 이중특이적 항체 접합체, 하이브리드 이중특이적 IgG, 가변 도메인 단독 이중특이적 항체, CH1/CL 융합 단백질, Fab 융합 단백질, 비면역글로불린 융합 단백질, Fc 변형된 IgG, 첨부된(appended) 및 Fc 변형된 IgG, 변형 Fc 및 CH3 융합 단백질, 첨부된 IgG-HC 융합, Fc 융합, CH3 융합, IgE/IgM CH2 융합 또는 F(ab')2 융합이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화 이중특이적 항체는 IgG 프레임워크, IgA 프레임워크, IgE 프레임워크 또는 IgM 프레임워크를 포함한다. 일부 경우에, 항-CD38 항체는 IgG 프레임워크(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)를 포함한다. 이러한 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 프레임워크를 포함한다.
일부 경우에, 이중특이적 항체는 프레임워크 영역, 예를 들어 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 힌지 영역 또는 이들의 조합에서 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 돌연변이는 항체를 안정화시키고/시키거나 반감기를 증가시키기 위한 것이다. 일부 예에서, 하나 이상의 돌연변이는 Fc 수용체 상호작용을 조절하거나 ADCC 또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 증가시키기 위한 것이다. 다른 예에서, 하나 이상의 돌연변이는 FcγR-결합, ADCC 또는 CDC와 같은 Fc 효과기 기능을 감소시키거나 제거하기 위한 것이다. 추가적인 예에서, 하나 이상의 돌연변이는 글리코실화, 예를 들어 푸코실화를 조절하기 위한 것이다. 일부 경우에, 하나 이상의 돌연변이는 예를 들어 ADCC 및/또는 CDC를 증가 또는 감소시키기 위해, 안정성을 향상시키고/시키거나 반감기를 증가시키고/시키거나 글리코실화를 감소시키고/시키거나 Fc 수용체 상호작용을 조절한다.
일부 경우에, 이중특이적 항체는 IgG1 프레임워크를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항-CD38 항체의 불변 영역은 Fc 수용체 상호작용을 변경하기 위해 하나 이상의 아미노산 위치에서 변형된다. Fc 수용체 상호작용을 조절하거나 변경하는 예시적인 잔기는 G236, S239, T250, M252, S254, T256, K326, A330, I332, E333A, M428, H433, 또는 N434(카밧 번호매김; 문헌[Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest]의 EU 지수)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 돌연변이는 G236A, S239D, T250Q, M252Y, S254T, T256E, K326W, A330L, I332E, E333A, E333S, M428L, H433K, 또는 N434F를 포함한다.
일부 실시양태에서, Fc 수용체 상호작용을 변경하기 위한 IgG1 불변 영역 내의 하나 이상의 아미노산 위치에서의 변형은 증가된 반감기를 유도한다. 일부 예에서, 하나 이상의 아미노산 위치에서의 변형은 T250, M252, S254, T256, M428, H433, N434, 또는 예를 들어 T250Q/M428L 또는 M252Y/S254T/T256E 및 H433K/N434F를 포함하는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상술한 인간화 이중특이적 항체는 놉-인투-홀(KIH) 포맷을 포함한다. 일부 경우에, KIH는 Fc 영역에 위치하며, 여기서 CH3 도메인 내의 잔기는 WO96/027011; 문헌[Ridgway, et. al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; Merchant, et. al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681]; PCT/US19/61884; 또는 문헌[Carter, J. Immunol. Protein Engineering 9(7) 617-621, 1996]의 개시내용에 기초하여 임의로 변형된다. 일부 경우에, CH3 도메인 쌍의 한 구성원은 "놉" 사슬인 한편, 다른 구성원은 "홀" 사슬이며, 추가적인 디설파이드 브릿지가 임의로 도입되어 항체를 추가로 안정화시키고/시키거나 수율을 증가시킨다.
일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 IgG1이고, "놉" 사슬의 CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 포함하고 "홀" 사슬의 CH3 도메인은 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 일부 경우에, "놉" 사슬의 CH3 도메인은 "홀" 사슬의 CH3 도메인에서 E356C 또는 S354C와 사슬간 디설파이드 브릿지를 형성하는 Y349C 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 예에서, "놉" 사슬의 CH3 도메인은 R409D 및 K370E 돌연변이를 포함하고, "홀" 사슬의 CH3 도메인은 D399K 및 E357K를 포함한다. 일부 경우에, "놉" 사슬의 CH3 도메인은 T366W 돌연변이를 추가로 포함하고, "홀" 사슬의 CH3 도메인은 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체 및 이의 항원 결합 단편은 제1 T-세포 수용체(TCR) 불변 영역에 융합된 제1 항체의 중쇄 가변 단편(VH) 및 제2 TCR 불변 영역에 융합된 제1 항체의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 TCR 불변 영역은 이량체를 형성할 수 있고, 제1 항체는 제1 항원 특이성을 갖는다. 일부 예에서, TCR 불변 영역은 TCR 알파 불변 영역 및 TCR 베타 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, VH-TCR 융합 폴리펩티드는 인간 IgG1 Fc 도메인에 융합된다. WO 2019/057122를 참조할 수 있다.
일부 실시양태에서, Fc 수용체 상호작용을 변경하기 위한 IgG1 불변 영역 내의 하나 이상의 아미노산 위치에서의 변형은 증가된 ADCC 및/또는 CDC를 유도한다. 일부 예에서, 하나 이상의 아미노산 위치에서의 변형은 S239, K326, A330, I332, E333 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 예에서, 증가된 ADCC 및/또는 CDC를 위한 하나 이상의 아미노산 위치에서의 변형은 예를 들어 E333A, S239D/A330L/I332E, 또는 K326W/E333S를 포함한다. 일부 경우에, 증가된 ADCC를 위한 하나 이상의 아미노산 위치에서의 변형은 S239D/A330L/I332E를 포함한다. 일부 경우에, 증가된 CDC를 위한 하나 이상의 아미노산 위치에서의 변형은 K326W/E333S를 포함한다.
일부 실시양태에서, Fc 수용체 상호작용을 변경하기 위한 IgG1 불변 영역 내의 하나 이상의 아미노산 위치에서의 변형은 증가된 대식세포 식세포작용을 유도한다. 일부 예에서, 하나 이상의 아미노산 위치에서의 변형은 G236, S239, I332 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 증가된 대식세포 식세포작용을 위한 하나 이상의 아미노산 위치에서의 변형은 S239D/I332I/G236A의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, IgG1 불변 영역은 아미노산 N297(카밧 번호매김)에서 변형되며, 여기서 잔기 N297은 비푸코실화되고, 올리고당류는 푸코스 당 단위를 함유하지 않는다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 IgG2 프레임워크를 포함한다. 일부 예에서, IgG2 프레임워크 내의 하나 이상의 아미노산 위치는 Fc 수용체 상호작용을 변경하기 위해, 예를 들어 ADCC 및/또는 CDC를 증가시키기 위해 변형된다. 일부 경우에, IgG2 프레임워크 내의 하나 이상의 아미노산 위치는 항체를 안정화하고/하거나 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 일부 예에서, IgG2 프레임워크 내의 하나 이상의 아미노산 위치는 글리코실화를 조절하기 위해 변형된다. 일부 경우에, IgG2 불변 영역은 비푸코실화된다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 IgG3 프레임워크를 포함한다. 일부 경우에, IgG3 프레임워크 내의 하나 이상의 아미노산 위치는 Fc 수용체 상호작용을 변경하기 위해, 예를 들어 ADCC 및/또는 CDC를 증가시키기 위해 변형된다. 일부 경우에, IgG3 프레임워크 내의 하나 이상의 아미노산 위치는 항체를 안정화하고/하거나 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 일부 예에서, IgG3 프레임워크 내의 하나 이상의 아미노산 위치는 글리코실화를 조절하기 위해 변형된다. 일부 경우에, 항체의 불변 영역은 반감기를 연장하기 위해 아미노산 R435에서, 예를 들어 R435H(카밧 번호매김)로 변형된다. 일부 예에서, 불변 영역은 잔기 N297에서 비푸코실화된다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 IgG4 프레임워크를 포함한다. 일부 예에서, IgG4 프레임워크 내의 하나 이상의 아미노산 위치는 Fc 수용체 상호작용을 변경하기 위해, 예를 들어 ADCC 및/또는 CDC를 증가시키기 위해 변형된다. 예를 들어, ADCC를 증가시키기 위한 돌연변이는, 일부 실시양태에서, 미국 특허 제8,093,359호에 기재된 바와 같은 S239D, I332E 및 A330L(아미노산 번호는 카밧 등의 EU 지수에 따름)을 포함한다. 일부 경우에, IgG4 프레임워크 내의 하나 이상의 아미노산 위치는 항체를 안정화 및/또는 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 일부 예에서, IgG4 프레임워크 내의 하나 이상의 아미노산 위치는 글리코실화를 조절하기 위해 변형된다. 일부 경우에, 불변 영역은 가닥 교환을 방지하거나 감소시키기 위해 힌지 영역에서 변형된다. 일부 예에서, 변형되는 아미노산은 S228(예를 들어, S228P)이다.
일부 실시양태에서, ADCC 및/또는 CD를 위해 인간 IgG 불변 영역은 예를 들어 문헌[Natsume et al., 2008 Cancer Res, 68(10): 3863-72; Idusogie et al., 2001 J Immunol, 166(4): 2571-5; Moore et al., 2010 mAbs, 2(2): 181- 189; Lazar et al., 2006 PNAS, 103(11): 4005-4010, Shields et al., 2001 JBC, 276( 9): 6591- 6604; Stavenhagen et al., 2007 Cancer Res, 67(18): 8882-8890; Stavenhagen et al., 2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164; Alegre et al, 1992 J Immunol, 148: 3461-3468; Kaneko and Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1): 1-11에서 검토됨]에 기재된 아미노산 변형으로 변형된다.
일부 실시양태에서, 인간 IgG 불변 영역은 이종이량체화를 유도하도록 변형된다. 예를 들어, Thr366에서 CH3 도메인 내의 아미노산 변형을 갖는 것은 보다 부피가 큰 아미노산, 예를 들어 Trp(T366W)로 대체될 때, 위치 Thr366, Leu368 및 Tyr407에서 보다 부피가 덜 큰 아미노, 예를 들어 각각 Ser, Ala 및 Val로의 아미노산 변형(T366S/L368A/Y407V)을 갖는 제2 CH3 도메인과 우선적으로 쌍을 형성할 수 있다. 일부 경우에, CH3 변형을 통한 이종이량체화는 예를 들어 반대편 CH3 도메인에서 Ser354를 Cys(S354C)로 변경하고 Y349를 Cys(Y349C)로 변경하여 디설파이드 결합을 도입함으로써 추가로 안정화된다(문헌[Carter, 2001 Journal of Immunological Methods, 248: 7-15]에서 검토됨).
일부 예에서, 본원에 기재된 인간화 이중특이적 항체는 감소된 글리코실화를 갖거나 글리코실화가 결여되어 있지만, 아미노산 Asn297(카밧 번호매김)에서 변형되지 않는다. 이러한 예들에서, 글리코실화는 예를 들어 번역 후 글리코실화 능력이 결여된 숙주 세포, 예를 들어 세균 또는 효모 유래 시스템 또는 변형된 포유동물 세포 발현 시스템에서 항체의 생성에 의해 제거된다. 특정 측면에서, 이러한 시스템은 무세포(cell-free) 발현 시스템이다.
일부 실시양태에서, CD38 결합 제1 성분 및 ICAM1 결합 제2 성분을 포함하는 다중특이적 단백질은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정 시 각각의 표적 항원에 대해 상이한 친화도(KD)를 갖는다.
일부 경우에, 제1 성분은 약 0.1 nM 내지 약 100 nM, 약 0.15 nM 내지 약 95 nM, 약 0.2 nM 내지 약 90 nM, 0.25 nM 내지 약 85 nM, 약 0.3 nM 내지 약 80 nM, 약 0.35 nM 내지 약 75 nM, 약 0.4 nM 내지 약 70 nM, 약 0.5 nM 내지 약 70 nM, 약 0.6 nM 내지 약 60 nM, 약 0.7 nM 내지 약 50 nM, 약 0.8 nM 내지 약 40 nM, 약 0.9 nM 내지 약 30 nM, 약 1 nM 내지 약 20 nM, 약 1.5 nM 내지 약 10 nM, 약 2 nM 내지 약 5 nM, 약 0.01 nM 내지 약 25 nM, 약 0.01 nM 내지 약 20 nM, 약 0.01 nM 내지 약 10 nM, 약 0.01 nM 내지 약 5 nM, 약 0.02 nM 내지 약 20 nM, 약 0.04 nM 내지 약 20 nM, 약 0.06 nM 내지 약 20 nM, 약 0.08 nM 내지 약 20 nM, 또는 약 0.1 nM 내지 약 20 nM의 KD로 인간 CD38에 결합한다.
일부 경우에, 제2 성분은 약 0.1 nM 내지 약 100 nM, 약 0.15 nM 내지 약 95 nM, 약 0.2 nM 내지 약 90 nM, 0.25 nM 내지 약 85 nM, 약 0.3 nM 내지 약 80 nM, 약 0.35 nM 내지 약 75 nM, 약 0.4 nM 내지 약 70 nM, 약 0.5 nM 내지 약 70 nM, 약 0.6 nM 내지 약 60 nM, 약 0.7 nM 내지 약 50 nM, 약 0.8 nM 내지 약 40 nM, 약 0.9 nM 내지 약 30 nM, 약 1 nM 내지 약 20 nM, 약 1.5 nM 내지 약 10 nM, 약 0.15 nM 내지 약 30 nM, 약 0.16 nM 내지 약 25 nM, 약 0.1 nM 내지 약 0.15 nM, 약 0.05 nM 내지 약 0.15 nM, 약 0.1 nM 내지 약 0.25 nM, 약 0.05 nM 내지 약 0.25 nM, 약 0.17 nM 내지 약 20 nM, 0.18 nM 내지 약 15 nM, 약 0.19 nM 내지 약 10 nM, 약 0.1 nM 내지 약 6 nM, 약 0.2 nM 내지 약 6 nM, 약 0.2 nM 내지 약 4 nM, 약 0.2 nM 내지 약 2 nM, 약 0.2 nM 내지 약 1.5 nM, 약 0.2 nM 내지 약 1 nM, 약 0.2 nM 내지 약 0.8 nM, 약 0.2 nM 내지 약 0.6 nM, 또는 약 0.2 nM 내지 약 0.4 nM의 KD로 인간 ICAM1에 결합한다.
5.4 이중특이적 항체 및 이의 결합 성분의 인간화
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체 및 이의 결합 단편은 비인간(예를 들어, 토끼) 항체로부터 유래된다. 일부 예에서, 비인간 항체의 인간화 형태는 원래의 항원 특이성을 유지하기 위해 최소의 비인간 서열을 포함한다. 일부 경우에, 인간화 항체는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이고, 여기서 수용자 항체의 CDR은 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는, 래트, 토끼, 마우스와 같은 비인간 면역글로불린(공여자 항체)의 CDR 잔기로 대체된다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 공여자 항체의 상응하는 비인간 잔기로 대체된다.
5.5 표적 세포에 대한 이중특이적 항체 결합
일부 실시양태에서, CD38에 결합하는 제1 성분 및 ICAM1에 결합하는 제2 성분을 포함하는 본 개시내용의 인간화 이중특이적 항체는 CD38 또는 ICAM1 중 하나에만 단일특이적인 항체의 세포에 대한 결합 친화도와 비교하여 적어도 2-50배, 10-100배, 2배, 5배, 10배, 25배, 50배 또는 100배, 또는 20-50%, 50-100%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 그 이상의 친화도로 표면에서 이중특이적 단백질의 표적 항원을 발현하는 세포에 결합한다(예를 들어, 우선적으로 결합한다).
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 인간화 이중특이적 항체는 표면 상에서 CD38보다 더 높은 수준의 ICAM1을 발현하는 표적 세포에 결합한다. 예를 들어, 표적 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38 단백질 발현의 비율은 유세포계측에 의해 측정 시 약 1, 1.5, 2.0, 2.5, 5, 10, 15, 20, 50, 100 또는 200이다. 예를 들어, 표적 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38 단백질 발현의 비율은 단백질의 표면 발현의 정량화에 기반하여 약 1.1 내지 700, 예컨대 약 2.5, 14.2, 29.1, 64.5, 34.0, 50.3, 357.1, 666.7이다.
일부 예에서, 표적 세포는 유세포계측에 의해 측정 시 이의 표면 상에서 적어도 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 10000, 150000, 20000, 30000, 50000, 100000, 150000, 200000, 250000, 300000, 400000, 또는 500000개의 ICAM1을 발현한다.
일부 경우에, 표적 세포는 유세포계측에 의해 측정 시 이의 표면 상에서 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개의 CD38 단백질을 발현한다. 일부 예에서, 표적 세포는 유세포계측에 의해 측정될 때 이의 표면 상에서 350,000, 300,000, 250,000, 200,000, 150,000, 100,000, 50,000, 25,000개 미만의 CD38 단백질을 발현한다. 일부 예에서 표적 세포의 표면 상의 CD38 단백질의 수는 100 내지 350,000, 100 내지 300,000, 100 내지 250,000, 100 내지 200,000, 100 내지 150,000, 100 내지 100,000, 100 내지 80,000, 100 내지 60,000, 100 내지 50,000, 100 내지 40,000, 100 내지 30,000, 100 내지 20,000, 100 내지 10,000, 300 내지 350,000, 300 내지 300,000, 300 내지 250,000, 300 내지 200,000, 300 내지 150,000, 300 내지 100,000, 300 내지 80,000, 300 내지 60,000, 300 내지 50,000, 300 내지 40,000, 300 내지 30,000, 300 내지 20,000, 또는 300 내지 10,000개이다. 일부 예에서, 표적 세포는 이의 표면 상에 다우디 세포, 라지 세포, KMS-26 세포, HuNS1 세포, HCC44 세포 또는 DU145 세포보다 더 적은 CD38 단백질을 갖는다. 일부 예에서, 표적 세포는 이의 표면 상에 적어도 200개의 CD38 단백질을 갖지만, 다우디 세포, 라지 세포, KMS-26 세포, HuNS1 세포, HCC44 세포 또는 DU145 세포보다 더 적은 CD38 단백질을 이의 표면 상에 갖는다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 형질전환된 세포이고, 여기서 ICAM1 대 CD38 단백질의 비율은 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 35, 40, 50 또는 200이다. 일부 경우에, 형질전환된 세포는 이의 표면 상에서 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 2000, 3000개의 CD38 단백질을 발현한다. 일부 경우에, 표적 세포는 골수종 세포, 림프종 세포, 췌장암 세포, 폐 선암종 세포 또는 전립선 암종 세포이고, 여기서 ICAM1 대 CD38 단백질의 비율은 적어도 0.15, 0.20, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 2.5 또는 5.0이다. 다른 경우에, 표적 세포는 폐 선암종으로부터 유래하며, 여기서 ICAM1 대 CD38 단백질의 비율은 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 35, 40, 50 또는 200이다. 일부 경우에, 골수종 세포, 림프종 세포, 췌장암 세포, 폐 선암종 세포 또는 전립선 암종 세포는 이의 표면 상에서 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 2000, 3000개의 CD38 세포를 발현한다.
일부 실시양태에서, CD38 결합 도메인 및 ICAM1 결합 도메인을 갖는 인간화 이중특이적 항체는 CD38 결합 도메인을 갖는 단일특이적 단백질 및/또는 ICAM1 결합 도메인을 갖는 단일특이적 단백질과 비교하여 CD38 및 ICAM1을 발현하는 세포에 대해 향상된 친화도를 갖는다. 일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 CD38에 결합하는 단일특이적 단백질 또는 ICAM1에 결합하는 단일특이적 단백질보다 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 10배 더 높은 CD38-발현 세포에 대한 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, CD38 결합 도메인 및 ICAM1 결합 도메인을 갖는 인간화 이중특이적 항체는 CD38 결합 도메인을 갖는 단일특이적 단백질과 비교하여 ICAM1보다 더 높은 수준의 CD38을 발현하는 세포에 대한 향상된 친화도를 갖는다. 일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 CD38에 결합하는 단일특이적 단백질과 비교하여 CD38 발현보다 ICAM1 발현이 더 높은 세포에 대해 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 10배 더 높은 친화도를 갖는다.
일부 실시양태에서, CD38 결합 도메인을 갖는 인간화 이중특이적 항체 및/또는 ICAM1 결합 도메인을 갖는 인간화 이중특이적 항체와 비교하여 CD38 결합 도메인 및 ICAM1 결합 도메인을 갖는 더 많은 양의 인간화 이중특이적 항체가 CD38 및 ICAM1을 발현하는 세포의 표면에 결합한다. 일부 예에서, CD38에 결합하는 단일특이적 단백질 또는 ICAM1에 결합하는 인간화 이중특이적 항체보다 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 10배 더 많은 인간화 이중특이적 항체가 CD38 발현 세포에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD38 결합 도메인을 갖는 단일특이적 단백질과 비교하여 CD38 결합 도메인 및 ICAM1 결합 도메인을 갖는 더 많은 양의 인간화 이중특이적 항체가 CD38 발현보다 ICAM1 발현이 더 높은 세포의 표면에 결합한다. 일부 예에서, CD38에 결합하는 단일특이적 단백질과 비교하여 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 10배 더 많은 인간화 이중특이적 항체가 CD38보다 더 많은 ICAM1을 발현하는 세포에 결합한다.
5.6 표적 세포 상에서 인간화 이중특이적 항체의 면역학적 활성
일부 실시양태에서, CD38 결합 도메인 및 ICAM1 결합 도메인을 갖는 인간화 이중특이적 항체는 CD38 결합 도메인을 갖는 단일특이적 항체 및/또는 ICAM1 결합 도메인을 갖는 단일특이적 항체와 비교하여 CD38-발현 세포에 대한 더 높은 면역학적 활성을 갖는다. 일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 CD38 결합 도메인을 갖는 단일특이적 항체 및/또는 ICAM1 결합 도메인을 갖는 단일특이적 항체보다 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 10배 더 높은 면역학적 활성을 갖는다. 인간화 이중특이적 항체의 다양한 면역학적 활성은 ADCC 분석 및 CDC 분석과 같은 시험관내 분석에서 측정될 수 있다. 일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 CD38 결합 도메인을 갖는 단일특이적 항체 및/또는 ICAM1 결합 도메인을 갖는 단일특이적 항체보다 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 10배 더 높은 ADCC 활성을 갖는다. 일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 CD38 결합 도메인을 갖는 인간화 단일특이적 항체 및/또는 ICAM1 결합 도메인을 갖는 단일특이적 항체보다 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 10배 더 높은 CDC 활성을 갖는다.
일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 참조 항체 다라투무맙에 의한 CDC 효과와 비교하여 향상된 CDC 효과를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 참조 항체 다라투무맙에 의한 ADCC 효과와 비교하여 향상된 ADCC 효과를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 참조 항체 다라투무맙의 면역 세포 사멸 효과와 비교하여 감소된 면역 세포 사멸 효과를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 향상된 CDC는 참조 항체 다라투무맙의 CDC 효과보다 적어도 2배, 3배, 4배 또는 그 이상 더 높다. 일부 경우에, 향상된 CDC는 참조 항체 다라투무맙의 CDC 효과보다 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 더 높다. 일부 경우에, 향상된 ADCC는 참조 항체 다라투무맙의 ADCC 효과보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상 더 높다. 일부 경우에, 향상된 ADCC는 참조 항체 다라투무맙의 ADCC 효과보다 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 더 높다. 일부 경우에, 면역 세포는 자연 살해 세포이다. 일부 경우에, 면역 세포 생존율은 참조 항체 다라투무맙의 존재 하의 면역 세포 생존율과 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 개선된다.
일부 실시양태에서, CD38에 특이적으로 결합하는 제1 표적화 모이어티 및 ICAM1에 특이적으로 결합하는 제2 표적화 모이어티를 포함하는 인간화 이중특이적 항체가 본원에 기재된다. 일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 참조 항체 다라투무맙에 의한 CDC 효과와 비교하여 향상된 CDC 효과를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 참조 항체 다라투무맙에 의한 ADCC 효과와 비교하여 향상된 ADCC 효과를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 향상된 CDC는 참조 항체 다라투무맙의 CDC 효과보다 적어도 2배, 3배, 4배 또는 그 이상 높다. 일부 경우에, 향상된 CDC는 참조 항체 다라투무맙의 CDC 효과보다 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 높다. 일부 경우에, 향상된 ADCC는 참조 항체 다라투무맙의 ADCC 효과보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상 더 높다. 일부 경우에, 향상된 ADCC는 참조 항체 다라투무맙의 ADCC 효과보다 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 높다.
일부 실시양태에서, CD38에 특이적으로 결합하는 제1 성분 및 ICAM1에 특이적으로 결합하는 제2 성분을 포함하는 인간화 이중특이적 항체가 본원에 기재되며, 여기서 상기 인간화 이중특이적 항체는 제1 성분 또는 제2 성분 중 하나를 포함하는 단일특이적 항체보다 효율적으로 ADCC를 매개하고, ADCC 활성은 시험관내 세포독성 분석을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 인간화 이중특이적 항체는 시험관내 ADCC 분석에서 제1 성분 또는 제2 성분 중 하나를 포함하는 단일특이적 항체보다 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 100% 더 높은 최대 세포독성을 매개한다. 일부 실시양태에서, 인간화 이중특이적 항체는 시험관내 ADCC 분석에서 제1 성분 또는 제2 성분 중 하나를 포함하는 단일특이적 항체보다 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 더 높은 최대 세포독성을 매개한다.
일부 실시양태에서, CD38에 특이적으로 결합하는 제1 성분 및 ICAM1에 특이적으로 결합하는 제2 성분을 포함하는 인간화 이중특이적 항체가 본원에 기재되며, 여기서 상기 인간화 이중특이적 항체는 제1 성분 또는 제2 성분 중 하나를 포함하는 단일특이적 항체보다 효율적으로 CDC를 매개하고, ADCC 활성은 시험관내 세포독성 분석을 사용하여 결정되고, CDC 활성은 시험관내 세포독성 분석을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 인간화 이중특이적 항체는 시험관내 CDC 분석에서 제1 성분 또는 제2 성분 중 하나를 포함하는 단일특이적 항체보다 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 100% 더 높은 최대 세포독성을 매개한다.
일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 참조 항체 다라투무맙의 면역 세포 사멸 효과와 비교하여 감소된 면역 세포 사멸 효과를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 면역 세포 생존율은 참조 항체 다라투무맙의 존재 하의 면역 세포 생존율과 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 개선된다. 일부 경우에, 면역 세포는 자연 살해 세포이다.
면역학적 활성은 또한 형질전환된 세포를 마우스에 주사하여 종양을 형성하는 세포주 유래 이종이식편 분석으로 측정될 수 있다. 일부 예에서, CD38 결합 도메인 및 ICAM1 결합 도메인을 갖는 인간화 이중특이적 항체는 CD38 결합 도메인을 갖는 인간화 이중특이적 항체 및/또는 ICAM1 결합 도메인을 갖는 단일특이적 단백질보다 더 큰 정도로 CD38 발현 세포를 포함하는 종양의 성장을 억제한다. 일부 예에서, 인간화 이중특이적 항체는 CD38 결합 도메인을 갖는 단일특이적 단백질 및/또는 ICAM1 결합 도메인을 갖는 단일특이적 단백질과 비교하여 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 10배 더 높은 이종이식편 종양 성장 억제를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항체 의존성 세포 매개 세포독성" 및 "ADCC"는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 그 후 표적 세포의 용해를 유발하는 세포 매개 반응을 지칭한다. 일 실시양태에서, 표적 세포는 종양 세포(예를 들어, 골수종 세포)와 같은 인간 세포이다. 임의의 특정 작용 메카니즘에 얽매이기를 바라지는 않지만, ADCC를 매개하는 세포독성 세포는 일반적으로 Fc 수용체(FcR)를 발현한다. ADCC를 매개하는 세포인 NK 세포는 FcγRIII를 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIV를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)]에 요약되어 있다.
본원에 기재된 바와 같은 인간화 이중특이적 항체의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 일부 실시양태에서 암 세포주를 사용하는 세포독성 분석과 같은 시험관내 ADCC 분석이 수행된다. 이러한 분석에 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로 또는 추가로, 관심대상의 인간화 이중특이적 항체의 ADCC 활성은 일부 실시양태에서 생체내에서, 예를 들어 동물에서 평가된다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 활성화를 개시하여 보체의 존재 하의 표적 세포의 용해를 유도하는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체화된 분자(예를 들어, 항체)에 대한 보체계의 제1 성분(C1q)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 일부 실시양태에서 예를 들어 문헌[Gazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석이 수행된다.
일부 실시양태에서, CD38 및 ICAM1에 결합하는 본원에 기재된 바와 같은 인간화 이중특이적 항체는 약 2 nM의 농도에서, 지수적으로 성장하는 라지 세포 집단 중 세포의 적어도 50%의 보체 의존성 용해를 매개한다. 일부 실시양태에서, CD38 및 ICAM1에 결합하는 본원에 기재된 바와 같은 다중특이적 단백질은 약 1 nM의 농도에서, 지수적으로 성장하는 다우디 세포 집단 중 세포의 40%의 PBMC 세포에 의한 ADCC를 매개한다. 특정 실시양태에서, CD38 및 ICAM1에 결합하는 본원에 기재된 바와 같은 인간화 이중특이적 항체는 가교결합 없이 세포자멸사(apoptosis)를 유도하지 않는다.
5.7 항체 또는 이의 결합 단편의 생성
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드(예를 들어, 항체 및 이의 결합 단편)는, 특히 화학적 합성 또는 재조합 발현에 의한 폴리펩티드(예를 들어, 항체)의 합성에 유용한 것으로 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생성되며, 바람직하게는 재조합 발현 기술에 의해 생성된다.
일부 예에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 재조합으로 발현되고, 항체 또는 이의 결합 단편을 코딩하는 핵산은 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립되며(예를 들어, 문헌[Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242]에 기재된 바와 같음), 이는 항체를 코딩하는 서열의 일부를 함유하는 중첩 올리고뉴클레오티드 함유 부분의 합성, 이들 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 이어서 라이게이션된 올리고뉴클레오티드의 PCR에 의한 증폭을 포함한다.
대안적으로, 항체를 코딩하는 핵산 분자는 임의로 서열의 3' 말단 및 5' 말단에 하이브리드화 가능한 합성 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 또는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 클로닝에 의해 적합한 공급원(예를 들어, 면역글로불린을 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터 생성된 cDNA 라이브러리 또는 항체 cDNA 라이브러리)으로부터 생성된다.
일부 예에서, 항체 또는 이의 결합 단편은, 예를 들어, Kohler 및 Milstein(1975, Nature 256:495-497)에 의해 설명된 바와 같이 또는 Kozbor 등(1983, Immunology Today 4:72) 또는 Cole 등(1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)에 의해 설명된 바와 같이, 토끼와 같은 동물을 면역화하여 다클론 항체를 생성하거나, 보다 바람직하게는 단클론 항체를 생성함으로써 임의로 생성된다. 대안적으로, 항체의 적어도 Fab 부분을 코딩하는 클론은 특정 항원에 결합하는 Fab 단편의 클론을 위한 Fab 발현 라이브러리를 스크리닝하거나(예를 들어, 문헌[Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281]에 설명된 바와 같이) 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써(예를 들어, 문헌[Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937] 참조) 임의로 얻어진다.
일부 실시양태에서, 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 스플라이싱함으로써 "키메라 항체"를 생성하기 위해 개발된 기술(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)이 이용된다. 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래한 분자, 예컨대 뮤린 단클론 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 것들이다.
일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체의 생산에 대해 기재된 기술(미국 특허 제4,694,778호; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334:544-54)은 단일 사슬 항체를 생성하는 데 적합하다. 단일 사슬 항체는 아미노산 가교를 통해 Fv 영역의 중쇄 단편과 경쇄 단편을 연결시켜 단일 사슬 폴리펩티드를 생성함으로써 형성된다. 이. 콜라이(E. coli)에서의 기능성 Fv 단편의 조립을 위한 기술도 임의로 사용된다(Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
일부 실시양태에서, 항체의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 항체의 뉴클레오티드 서열은 통상적인 기술(예를 들어, 전기천공, 리포좀 형질감염 및 칼슘 포스페이트 침전)에 의해 숙주 세포로 이전되고, 이어서 형질감염된 세포는 항체를 생성하는 통상적인 기술에 의해 배양된다. 특정 실시양태에서, 항체의 발현은 구성적, 유도성 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
일부 실시양태에서, 다양한 숙주 발현 벡터 시스템이 본원에 기재된 항체 또는 이의 결합 단편을 발현시키기 위해 이용된다. 이러한 숙주 발현 시스템은 항체의 코딩 서열이 생성되고 후속적으로 정제되도록 하는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염되는 경우에 항체 또는 이의 결합 단편을 인 시츄(in situ)에서 발현하는 세포를 나타낸다. 이들은 항체 또는 이의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균(예를 들어, 이. 콜라이 및 비. 섭틸리스(B. subtilis))와 같은 미생물; 항체 또는 이의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스 피치아(Saccharomyces Pichia)); 항체 또는 이의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 또는 이의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환되거나 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 및 담배 모자이크 바이러스(TMV)로 감염된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 75K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 작제물을 보유하는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BH, 293, 293T, 3T3 세포)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
재조합 단백질의 장기간 및 고수율 생성을 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 일부 예에서, 항체를 안정하게 발현하는 세포주는 임의로 조작된다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 터미네이터, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택가능한 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환된다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포를 강화 배지에서 1 내지 2일 동안 성장하도록 한 다음, 선택적 배지로 교체한다. 재조합 플라스미드에서 선택가능한 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 이의 염색체 내로 안정적으로 혼입시키고 성장하여 병소를 형성할 수 있게 하고, 이어서 이것이 클로닝되고 세포주로 증대(expand)되도록 한다. 이러한 방법은 항체 또는 이의 결합 단편을 발현하는 세포주를 조작하는 데 유리하게는 사용될 수 있다.
일부 예에서, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(Wigler et al., 1977, Cell 11:223), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, 192, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy et al., 1980, Cell 22:817) 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 선택 시스템이 사용되며, 이들은 각각 tk-, hgprt-, 또는 aprt- 세포에서 사용된다. 또한, 다음 유전자들에 대한 선택의 기준으로서 대사길항제 내성이 사용된다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); 아미노글리코사이드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May 1993, TIB TECH 11(5):155-215) 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al., 1984, Gene 30:147). 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에 흔히 공지된 방법은 문헌[Ausubel et al. (eds., 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; 및 in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1)]에 기재되어 있다.
일부 예에서, 항체의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가된다(검토를 위해, 문헌[Bebbington and Hentschel, the use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)] 참조]. 항체를 발현하는 벡터 시스템에서 마커가 증폭가능할 때, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체의 뉴클레오티드 서열과 관련되기 때문에, 항체의 생성이 또한 증가할 것이다(Crouse et al., 1983, Mol Cell Biol 3:257).
일부 예에서, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화도에 의한 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등적 용해성에 의한 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의한 항체의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용된다.
5.8 발현 벡터
일부 실시양태에서, 벡터는 진핵생물 또는 원핵생물 공급원으로부터 유래된 임의의 적합한 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 벡터는 세균(예를 들어, 이. 콜라이), 곤충, 효모(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)), 조류 또는 포유류 공급원으로부터 얻어진다. 예시적인 세균 벡터는 pACYC177, pASK75, pBAD 벡터 시리즈, pBADM 벡터 시리즈, pET 벡터 시리즈, pETM 벡터 시리즈, pGEX 벡터 시리즈, pHAT, pHAT2, pMal-c2, pMal-p2, pQE 벡터 시리즈, pRSET A, pRSET B, pRSET C, pTrcHis2 series, pZA31-Luc, pZE21-MCS-1, pFLAG ATS, pFLAG CTS, pFLAG MAC, pFLAG Shift-12c, pTAC-MAT-1, pFLAG CTC, 또는 pTAC-MAT-2를 포함한다.
예시적인 곤충 벡터는 pFastBac1, pFastBac DUAL, pFastBac ET, pFastBac HTa, pFastBac HTb, pFastBac HTc, pFastBac M30a, pFastBact M30b, pFastBac, M30c, pVL1392, pVL1393, pVL1393 M10, pVL1393 M11, pVL1393 M12, FLAG 벡터, 예컨대 pPolh-FLAG1 또는 pPolh-MAT 2, 또는 MAT 벡터, 예컨대 pPolh-MAT1, 또는 pPolh-MAT2를 포함한다.
일부 경우에서, 효모 벡터는 Gateway® pDESTTM 14 벡터, Gateway® pDESTTM 15 벡터, Gateway® pDESTTM 17 벡터, Gateway® pDESTTM 24 벡터, Gateway® pYES-DEST52 벡터, pBAD-DEST49 Gateway® 목표 벡터, pAO815 피키아 벡터, pFLD1 피키 파스토리스(Pichi pastoris) 벡터, pGAPZA,B, & C 피키아 파스토리스 벡터, pPIC3.5K 피키아 벡터, pPIC6 A, B, & C 피키아 벡터, pPIC9K 피키아 벡터, pTEF1/Zeo, pYES2 효모 벡터, pYES2/CT 효모 벡터, pYES2/NT A, B, & C 효모 벡터, 또는 pYES3/CT 효모 벡터를 포함한다.
예시적인 조류 벡터는 pChlamy-4 벡터 또는 MCS 벡터를 포함한다.
포유동물 벡터의 예는 일시적 발현 벡터 또는 안정한 발현 벡터를 포함한다. 포유동물 일시적 발현 벡터는 pRK5, p3xFLAG-CMV 8, pFLAG-Myc-CMV 19, pFLAG-Myc-CMV 23, pFLAG-CMV 2, pFLAG-CMV 6a,b,c, pFLAG-CMV 5.1, pFLAG-CMV 5a,b,c, p3xFLAG-CMV 7.1, pFLAG-CMV 20, p3xFLAG-Myc-CMV 24, pCMV-FLAG-MAT1, pCMV-FLAG-MAT2, pBICEP-CMV 3, 또는 pBICEP-CMV 4를 포함할 수 있다. 포유동물 안정한 발현 벡터는 pFLAG-CMV 3, p3xFLAG-CMV 9, p3xFLAG-CMV 13, pFLAG-Myc-CMV 21, p3xFLAG-Myc-CMV 25, pFLAG-CMV 4, p3xFLAG-CMV 10, p3xFLAG-CMV 14, pFLAG-Myc-CMV 22, p3xFLAG-Myc-CMV 26, pBICEP-CMV 1, 또는 pBICEP-CMV 2를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 무세포 시스템은 세포로부터의 세포질 및/또는 핵 성분의 혼합물이며 시험관내 핵산 합성을 위해 사용된다. 일부 경우에, 무세포 시스템은 원핵 세포 성분 또는 진핵 세포 성분을 사용한다. 때때로, 핵산 합성은 예를 들어 드로소필라(Drosophila) 세포, 제노푸스(Xenopus) 난자, 또는 HeLa 세포에 기반한 무세포 시스템에서 얻어진다. 예시적인 무세포 시스템은 이. 콜라이 S30 추출물 시스템, 이. 콜라이 T7 S30 시스템, 또는 PURExpress®를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
5.9 숙주 세포
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 천연 유래 세포 또는 유전자 변형된 세포와 같은 임의의 적합한 세포를 포함한다. 일부 예에서, 숙주 세포는 생산 숙주 세포이다. 일부 예에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 다른 예에서 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 경우에서, 진핵 세포는 진균(예를 들어, 효모 세포), 동물 세포, 또는 식물 세포를 포함한다. 일부 경우에, 원핵 세포는 세균 세포이다. 세균 세포의 예는 그람 양성 세균 또는 그람 음성 세균을 포함한다. 때때로 그람 음성 세균은 혐기성, 막대형, 또는 둘 다이다.
일부 예에서, 그람 양성 세균은 악티노박테리아(Actinobacteria), 피르미쿠테스(Firmicutes), 또는 테네리쿠테스(Tenericutes)를 포함한다. 일부 경우에, 그람 음성 세균은 아퀴피카에(Aquificae), 데이노코쿠스-테르무스(Deinococcus-Thermus), 피브로박테레스-클로로비/박테로이데테스(Fibrobacteres-Chlorobi/Bacteroidetes)(FCB군), 푸소박테리아(Fusobacteria), 겜마티모나데테스(Gemmatimonadetes), 니트로스피라에(Nitrospirae), 플란크토미세테스-베루코미크로비아/클라미디아에(Planctomycetes-Verrucomicrobia/Chlamydiae)(PVC군), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 스피로카에테스(Spirochaetes) 또는 시네르기스테테스(Synergistetes)를 포함한다. 다른 세균은 아시도박테리아(Acidobacteria), 클로로플렉시(Chloroflexi), 크리시오게네테스(Chrysiogenetes), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 데페리박테레스(Deferribacteres), 딕티오글로미(Dictyoglomi), 테르모데술포박테리아(Thermodesulfobacteria) 또는 테르모토가에(Thermotogae)일 수 있다. 세균 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 또는 콜라이 바실리(Coli bacilli)일 수 있다.
예시적인 원핵 숙주 세포는 BL21, Mach1TM, DH10BTM, TOP10, DH5α, DH10BacTM, OmniMaxTM, MegaXTM, DH12STM, INV110, TOP10F', INVαF, TOP10/P3, ccdB 서바이벌(Survival), PIR1, PIR2, Stbl2TM, Stbl3TM, 또는 Stbl4TM을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 동물 세포는 척추동물 또는 무척추동물로부터의 세포를 포함한다. 일부 경우에, 동물 세포는 해양 무척추동물, 어류, 곤충, 양서류, 파충류, 포유동물로부터의 세포를 포함한다. 일부 경우에, 진균 세포는 맥주 효모, 빵 효모 또는 와인 효모와 같은 효모 세포를 포함한다.
진균은 효모, 몰드(mold), 사상균, 담자균 또는 접합균과 같은 자낭균을 포함한다. 일부 예에서, 효모는 아스코미코타(Ascomycota) 또는 바시디오미코타(Basidiomycota)를 포함한다. 일부 경우에, 아스코미코타는 사카로미코티나(Saccharomycotina)(진정 효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비시아에(빵 효모)) 또는 타프리노미코티나(Taphrinomycotina)(예를 들어, 쉬조사카로미세테스(Schizosaccharomycetes)(분열 효모))를 포함한다. 일부 경우에, 바시디오미코타(Basidiomycota)는 아가리코미코티나(Agaricomycotina)(예를 들어, 트레멜로미세테스(Tremellomycetes)) 또는 푸시니오미코티나(Pucciniomycotina)(예를 들어, 미크로보트리요미세테스(Microbotryomycetes))를 포함한다.
예시적인 효모 또는 사상균은 예를 들어 사카로마이세스, 쉬조사카로마이세스, 칸디다, 피키아, 한세눌라(Hansenula), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 야로위아(Yarrowia), 트리코스포론(Trichosporon), 로도스포리디(Rhodosporidi), 아스페르길루스(Aspergillus), 푸사리움(Fusarium), 또는 트리코데르마(Trichoderma) 속을 포함한다. 예시적인 효모 또는 사상균은, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아에, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 칸디다 우틸리스(Candida utilis), 칸디다 보이디니(Candida boidini), 칸디다 알비카스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 스텔라토이데아(Candida stellatoidea), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 구일리에르몬디이(Candida guilliermondii), 칸디다 비스와나티이(Candida viswanathii), 칸디다 루시타니아에(Candida lusitaniae), 로도토룰라 무실라기노사(Rhodotorula mucilaginosa), 피키아 메타놀리카(Pichia metanolica), 피키아 안구스타(Pnichia angusta), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 아노말라(Pichia anomala), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 지고사카로마이세스 로욱시이(Zygosaccharomyces rouxii), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 로도스로리디움 토루-아스페르길루스 니거(Rhodosporidium toru-Aspergillus niger), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 브레타노미세스 브룩셀렌시스(Brettanomyces bruxellensis), 칸디다 스텔라타(Candida stellata), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 토룰라스포라 델브루엑키이(Torulaspora delbrueckii), 지고사카로마이세스 바일리이(Zygosaccharomyces bailii), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토코쿠스 가티이(Cryptococcus gattii), 또는 사카로마이세스 보울라르디이(Saccharomyces boulardii) 종을 포함한다.
예시적인 효모 숙주 세포는 GS115, KM71H, SMD1168, SMD1168H 및 X-33과 같은 피키아 파스토리스 효모 균주; 및 INVSc1과 같은 사카로마이세스 세레비시아에 효모 균주를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 추가적인 동물 세포는 연체동물, 절지동물, 환형동물 또는 해면동물로부터 수득되는 세포를 포함한다. 일부 경우에, 추가적인 동물 세포는 예를 들어 영장류, 유인원, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 또는 설치류로부터의 포유동물 세포이다. 일부 경우에, 설치류는 마우스, 래트, 햄스터, 저빌쥐, 햄스터, 친칠라, 팬시 래트 또는 기니피그를 포함한다.
예시적인 포유동물 숙주 세포는 293A 세포주, 293FT 세포주, 293F 세포, 293 H 세포, CHO DG44 세포, CHO-S 세포, CHO-K1 세포, FUT8 KO CHO-K1, Expi293F™ 세포, Flp-In™ T-REx™ 293 세포주, Flp-In™-293 세포주, Flp-In™-3T3 세포주, Flp-In™-BHK 세포주, Flp-In™-CHO 세포주, Flp-In™-CV-1 세포주, Flp-In™ -Jurkat 세포주, FreeStyle™ 293-F 세포, FreeStyle™ CHO-S 세포, GripTite™ 293 MSR 세포주, GS-CHO 세포주, HepaRG™ 세포, T-REx™ Jurkat 세포주, Per.C6 세포, T-REx™-293 세포주, T-REx™-CHO 세포주, 및 T-REx™-HeLa 세포주를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 포유동물 숙주 세포는 안정한 세포주, 또는 관심대상의 유전 물질을 자체 게놈에 혼입시키고 여러 세대의 세포 분열 후에 유전 물질의 산물을 발현할 수 있는 능력을 가진 세포주이다. 일부 경우에, 포유동물 숙주 세포는 일시적 세포주", 또는 관심대상의 유전 물질을 자체 게놈에 혼입시키지 않고 여러 세대의 세포 분열 후에 유전 물질의 산물을 발현할 능력이 없는 세포주이다.
예시적인 곤충 숙주 세포는 드로소필라 S2 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, High Five™ 세포 및 expresSF+® 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 식물 세포는 조류로부터의 세포를 포함한다. 예시적인 조류 세포주는 클라미도모나스 레이하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii) 137c, 또는 시네코코쿠스 엘론가투스(Synechococcus elongatus) PPC 7942로부터의 스트레인(strain)을 포함한다.
5.10 특정 용어
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 청구된 보호대상이 속하는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상술한 일반적인 설명 및 하기의 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적이며, 청구된 임의의 보호대상을 제한하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 출원에서, 단수의 사용은 달리 명시적으로 언급하지 않는 한 복수를 포함한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a," "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는(including)"뿐만 아니라 "포함하다(include, includes)" 및 "포함된(included)"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로서 표현될 수 있다. 약은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서, "약 5 μL"는 "약 5 μL" 및 또한 "5 μL"를 의미한다. 일반적으로, 용어 "약"은 실험 오차 내에 있는 것으로 예측되는 양을 포함한다.
본원에서 사용되는 섹션 표제는 단지 구성적 목적을 위한 것일 뿐이며 설명되는 보호대상을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
"항체" 및 "면역글로불린"(Ig)은 동일한 구조적 특성을 보유하는 당단백질이다. 용어들은 동의어로 사용된다. 일부 예에서, 면역글로불린의 항원 특이성은 공지되어 있다.
용어 "항체"는 가장 광의의 의미로 사용되고, 완전히 조립된 항체, 항원에 결합할 수 있는 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, 단일 사슬 항체(scFv), 디아바디, 항체 키메라, 하이브리드 항체, 이중특이적 항체, 인간화 항체 등), 및 상술한 것들을 포함하는 재조합 펩티드를 포괄한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "단클론 항체" 및 "mAb"는 본원에서 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하기 위해 사용되며, 즉 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다.
"고유한(native) 항체" 및 "고유한 면역글로불린"은 일반적으로 2개의 동일한 경(L)쇄와 2개의 동일한 중(H)쇄로 구성된 약 150,000 Da의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되어 있는 반면, 디설파이드 연결의 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄 중에서 상이하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬간 디설파이드 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VH)에 이어서 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VL) 및 이의 다른 말단에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성한다고 믿어진다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 중에서 서열이 광범위하게 상이함을 의미한다. 가변 영역은 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 균일하게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 상보성-결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역이라 불리는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크(FR) 영역이라 지칭된다. 고유한 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 루프 연결을 형성하고 일부 경우에 β-주름 쉬트(β-pleated-sheet) 구조의 일부를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된, β-주름 쉬트 입체배치를 주로 채택하는 4개의 FR 영역을 포함한다. 각각의 사슬 내의 CDR은 FR 영역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되며, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(예를 들면, 문헌[Kabat et al. (1991) NIH PubL. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669] 참조). 불변 도메인은 항체와 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 다양한 효과기 기능, 예컨대 Fc 수용체(FcR) 결합, 항체 의존성 세포 독성에의 항체의 참여, CDC의 개시 및 비만 세포 탈과립화를 나타낸다.
용어 "초가변 영역"은 본원에서 사용될 때 항원 결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md.) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 이들 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3), 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 (H1), 53-55(H2) 및 96-101(L3); Clothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917)를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 간주된 바와 같이 초가변 영역 잔기 이외의 이들 가변 도메인 잔기이다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(Zapata et al. (1995) Protein Eng. 10:1057-1062); 단일 사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 분해는 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는, "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 그 명칭이 용이하게 결정화되는 능력을 반영하는 잔류 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원 조합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소의 항체 단편이다. 이 영역은 단단한 비공유 회합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이러한 입체배치에서 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 한정한다. 총체적으로, 6개의 CDR이 항원 결합 특이성을 항체에 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)조차도 비록 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이지만 항원을 인식하여 이에 결합하는 능력을 갖는다.
"scFv"는 단일 폴리펩티드 내에 중쇄 가변 도메인으로부터의 3개의 CDR과 경쇄로부터의 3개의 CDR을 함유하는 단일 사슬 항체 단편이다. 각각의 가변 도메인으로부터 유래된 3개의 CDR은 상호작용하여 scFv 폴리펩티드의 표면 상의 항원 결합 부위를 한정한다.
Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 또한 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 몇몇 잔기가 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 첨가됨으로써 Fab' 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 본원의 표기이다. Fab' 단편은 F(ab')2 단편의 중쇄 디설파이드 가교의 환원에 의해 생성된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 2가지의 구별되는 상이한 유형들 중 하나로 배정될 수 있다.
면역글로불린은 이의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 부류(class)로 배정될 수 있다. 인간 면역글로불린의 5가지의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭된다. 면역글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 입체배치는 잘 공지되어 있다. 상이한 이소형은 상이한 효과기 기능을 갖는다. 예를 들어, 인간 IgG1 및 IgG3 이소형은 ADCC(항체 의존성 세포 매개 세포독성) 활성을 갖는다.
일부 예에서, 항체의 CDR은 (i) 카밧(Kabat) 번호매김 시스템(Kabat et al. (197) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 and, Kabat et al.(1991) Sequence of Protein of Immunological Interest Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242); 또는 (ii) 본원에서 "코티아(Chothia) CDR"로 지칭될 코티아 번호매김 체계(예를 들어, 문헌[Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917; Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273 :927-948; Chothia et al., 1992, J. Mol. Biol., 227:799-817; Tramontano A et al. , 1990, J. Mol. Biol. 215(1): 175-82]; 및 미국 특허 제7,709,226호 참조); 또는 예를 들어 문헌[Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7: 132-136 and Lefranc, M.-P. et al, 1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212 ("IMGT CDRs")]에 기재된 바와 같은 ImMunoGeneTics(IMGT) 번호매김 시스템; 또는 (iv) 문헌[MacCallum et al, 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745]에 따라 결정된다. 또한 예를 들어 문헌[Martin, A., "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Diibel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer- Verlag, Berlin (2001)]을 참조한다.
카밧 번호매김 시스템과 관련하여, 항체 중쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 31 내지 35에 존재하는데, 이는 임의로 아미노산 위치 35(카밧 번호매김 체계에서 35A 및 35B로 지칭됨)(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 65(CDR2), 및 아미노산 위치 95 내지 102(CDR3) 뒤에 1개 또는 2개의 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 카밧 번호매김 시스템을 이용하면, 항체 경쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 24 내지 34(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 56(CDR2), 및 아미노산 위치 89 내지 97(CDR3)에 존재한다. 당업자에게 잘 공지된 바와 같이, 카밧 번호매김 시스템을 이용하면, 항체 가변 도메인의 실제 선형 아미노산 서열은 FR 및/또는 CDR의 단축 또는 연장으로 인해 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있고, 이에 따라 아미노산의 카밧 번호는 이의 선형 아미노산 번호와 반드시 동일하지 않을 수 있다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 한편, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 다른 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "인간 항체" 또는 "인간화 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간 항체는 당업계에 잘 공지되어 있다(van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 일부 예에서, 인간 항체는 또한, 면역화 시, 내인성 면역글로불린 생성 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리 또는 모음을 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스)에서 생성된다. 이러한 생식계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 챌린지(challenge) 시 인간 항체의 생성을 초래할 것이다(예를 들어, 문헌[Jakobovits, A., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al, Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al, Year Immunol. 7 (1993) 33-40] 참조). 추가적인 예에서, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리에서도 생성된다(Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al, J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Cole 등 및 Boerner 등의 기술도 인간 단클론 항체의 생성을 위해 이용가능하다(Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); and Boerner, P., et al, J. Immunol. 147 (1991) 86-95).
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "재조합 인간 항체"는 NS0 또는 CHO 세포 같은 숙주 세포로부터 또는 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체, 또는 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체와 같은, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 모든 인간 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 가변 영역 및 불변 영역을 재배열된 형태로 갖는다. 일부 경우에, 재조합 인간 항체는 생체내에서 체세포 초돌연변이되었다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 바와 같이, 용어 "개체(들)", "대상체(들)" 및 "환자(들)"는 임의의 포유동물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비인간이다. 상기 용어들 중 어느 것도 의료 종사자(예를 들어, 의사, 공인 간호사, 임상 간호사, 의료 조무사, 잡역부 또는 호스피스 직원)의 감독(예를 들어, 지속적 또는 간헐적)을 특징으로 하는 상황을 요구하거나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항-CD38 BMK" 항체는 참조 항체 다라투무맙을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 서열에 대한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 고려하지 않은 후에 특정 서열 내의 아미노산과 동일한 후보 서열 내의 아미노산의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은, 예를 들어, EMBOSS MATCHER, EMBOSS WATER, EMBOSS STRETCHER, EMBOSS NEEDLE, EMBOSS LALIGN, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR)과 같은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전정에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기에 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비푸코실화된"은 야생형 세포주 또는 건강한 개체에서 발현되는 글리코실화된 폴리펩티드와 비교하여 푸코스 잔기가 감소된 글리코실화된 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, CHO FUT8 -/- 돌연변이체 세포주에서 발현된 글리코실화된 폴리펩티드는 비푸코실화된다. 비푸코실화된 글리코실화된 폴리펩티드는 0개의 푸코스 잔기를 갖는 것을 필요로 하지 않는다.
6. 실시양태의 목록
본 발명의 실시양태의 다음 목록은 본 발명의 다양한 특징을 개시하는 것으로 간주되어야 하며, 이러한 특징은 논의되는 특정 실시형태에 고유한 것으로 간주될 수 있거나 다양한 실시형태에 열거된 다양한 다른 특징과 조합될 수 있다. 따라서, 단순히 하나의 특정 실시양태 하에 논의된 특징은 그 특징의 사용을 그 실시양태로 반드시 제한하지 않는다.
실시양태 1. 하나 이상의 인간화 CD38 결합 도메인, 하나 이상의 인간화 ICAM1 결합 도메인 및 인간 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 scFv를 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 IgG 중쇄의 가변 도메인 및 IgG 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 scFv를 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 IgG 중쇄의 가변 도메인 및 IgG 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 항체의 이소형이 IgG1인, 이중특이적 항체.
실시양태 9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 인간 Fc 도메인이 이종이량체 Fc 도메인이고, 이종이량체 Fc 영역이 놉 사슬 및 홀 사슬을 포함하여 놉-인-홀(KiH) 구조를 형성하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 10. 실시양태 9에 있어서, 놉 사슬이 돌연변이 T366W를 포함하고, 홀 사슬이 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하고, 여기서 아미노산 위치 번호매김이 카밧 등의 EU 지수에 따른 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 11. 실시양태 9에 있어서, 놉 사슬이 돌연변이 S354C, T366W를 포함하고, 홀 사슬이 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함하고, 여기서 아미노산 위치 번호매김이 카밧 등의 EU 지수에 따른 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 12. 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, Fc 도메인이 비푸코실화된 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 13. 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, Fc 도메인이 항원 의존성 세포 세포독성(ADCC) 활성을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 14. 실시양태 13에 있어서, Fc 도메인이 S239D, I332E, 및 A330L 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 위치 번호매김이 카밧 등의 EU 지수에 따른 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 15. 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 항-CD38 IgG의 가변 도메인을 포함하고, ICAM1 결합 도메인이 항-ICAM1 단일 사슬 가변 단편(항-ICAM1 scFv)을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 16. 실시양태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 항-ICAM1 IgG의 가변 도메인을 포함하고, CD38 결합 도메인이 항-CD38 단일 사슬 가변 단편(항-CD38 scFv)을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 17. 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, CH1 IgG 도메인 및 CL IgG 도메인을 추가로 포함하는 이중특이적 항체.
실시양태 18. 실시양태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, T 세포 수용체(TCR) 불변 영역을 추가로 포함하고, 상기 TCR 불변 영역이 TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 19. 실시양태 18에 있어서,
인간화 CD38 결합 도메인이 VH-CD38 도메인 및 VL-CD38 도메인을 포함하고;
VH-CD38 도메인이 TCR 베타 불변 도메인에 융합되고;
VL-CD38 도메인이 TCR 알파 불변 도메인에 융합되는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 20. 실시양태 18에 있어서,
인간화 CD38 결합 도메인이 VH-CD38 도메인 및 VL-CD38 도메인을 포함하고;
VH-CD38 도메인이 CH1 IgG 도메인에 융합되고;
VL-CD38 도메인이 CL IgG 도메인에 융합되는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 21. 실시양태 18 또는 20에 있어서,
인간화 ICAM1 결합 도메인이 VH-ICAM1 도메인 및 VL-ICAM1 도메인을 포함하고;
VH-ICAM1 도메인이 TCR 베타 불변 도메인에 융합되고;
VL-ICAM1 도메인이 TCR 알파 불변 도메인에 융합되는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 22. 실시양태 18 또는 19에 있어서,
인간화 ICAM1 결합 도메인이 VH-ICAM1 도메인 및 VL-ICAM1 도메인을 포함하고;
VH-ICAM1 도메인이 CH1 IgG 도메인에 융합되고;
VL-ICAM1 도메인이 CL IgG 도메인에 융합되는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 23. 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 항체의 최저 용융 전이가 적어도 55℃, 적어도 60℃ 또는 적어도 65℃인, 이중특이적 항체.
실시양태 24. 실시양태 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 서열 번호 40과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 25. 실시양태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 서열 번호 41과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 26. 실시양태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 서열 번호 35와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 27. 실시양태 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 및 서열 번호 55와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 28. 실시양태 27에 있어서, HC CDR3 도메인이 글루탐산 95, 글루탐산 100b, 글리신 100c 및 티로신 100d를 포함하고, LC CDR3 도메인이 글리신 90, 티로신 91, 세린 93, 글리신 94, 및 티로신 96을 포함하고, 여기서 아미노산 위치 번호매김이 카밧 등의 EU 지수에 따른 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 29. 실시양태 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 서열 번호 44와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 30. 실시양태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 서열 번호 45와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 31. 실시양태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 및 서열 번호 61과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 32. 실시양태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 10 nM 이하 또는 5 nM 이하의 평형 해리 상수(KD)로 인간 CD38의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 33. 실시양태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 0.1 nM 내지 20 nM, 0.5 nM 내지 15 nM, 1 nM 내지 10 nM, 또는 1 nM 내지 5 nM의 평형 해리 상수(KD)로 인간 CD38의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 34. 실시양태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 2 nM 내지 5 nM의 평형 해리 상수(KD)로 인간 CD38의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 것인, 이중특이적 항체. .
실시양태 35. 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 1 nM 미만, 0.5 nM 미만 또는 0.2 nM 미만의 평형 해리 상수(KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 36. 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 0.02 nM 내지 10 nM, 0.05 nM 내지 5 nM, 0.05 nM 내지 1 nM, 또는 0.1 nM 내지 0.5 nM의 평형 해리 상수(KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 37. 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 0.1 nM 내지 0.15 nM의 평형 해리 상수(KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 38. 실시양태 32 내지 37 중 어느 하나에 있어서, KD가 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 39. 실시양태 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 항체가 비푸코실화된 Fc 도메인을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 40. 실시양태 39에 있어서, 이중특이적 항체가 비푸코실화된 Fc 도메인을 포함하지 않는 그외에는 동일한 이중특이적 항체에 의해 표적 세포 상에서 유도된 ADCC 효과와 비교하여 표적 세포 상에서 향상된 ADCC 효과를 유도할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 41. 실시양태 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 항체는 인간화 CD38 결합 도메인 또는 인간화 ICAM1 결합 도메인을 포함하는 단일특이적 단백질에 의해 표적 세포 상에서 유도된 ADCC 효과와 비교하여 표적 세포 상에서 향상된 ADCC 효과를 유도할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 42. 실시양태 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 항체가 10 nM 미만 또는 0.5 nM 내지 1.0 nM의 최대 유효 농도의 절반(EC50)으로 다우디 세포 상에서 보체 의존성 세포독성을 유도할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
실시양태 43. 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 및 서열 번호 61과 적어도 90% 동일한 CDR 서열을 포함하는 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편.
실시양태 44. 실시양태 43에 있어서, 서열 번호 44 및 서열 번호 45와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편.
실시양태 45. 실시양태 43 또는 44에 있어서, 1 nM 미만 또는 0.5nM 미만의 평형 해리 상수(KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 하나 이상의 ICAM1 결합 도메인을 포함하는 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편.
실시양태 46. 실시양태 43 또는 44에 있어서, 0.02 nM 내지 10 nM, 0.05 nM 내지 5 nM, 또는 0.05 nM 내지 1 nM의 평형 해리 상수(KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 하나 이상의 ICAM1 결합 도메인을 포함하는 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편.
실시양태 47. 실시양태 43 또는 44에 있어서, 0.1 nM 내지 0.5 nM의 평형 해리 상수(KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 하나 이상의 ICAM1 결합 도메인을 포함하는 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편.
실시양태 48. 실시양태 43 내지 47 중 어느 하나에 있어서, KD가 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되는 것인, 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편.
실시양태 49. 실시양태 1 내지 42 중 어느 하나의 이중특이적 항체 또는 실시양태 43 내지 48 중 어느 하나의 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물.
실시양태 50. 실시양태 49에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
실시양태 51. 대상체에서 세포를 사멸시키는 방법으로서, 실시양태 1 내지 42 중 어느 하나의 이중특이적 항체, 또는 실시양태 43 내지 48 중 어느 하나의 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편, 또는 실시양태 49 또는 50의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 세포가 CD38 및 ICAM1을 발현하는 것인, 방법.
실시양태 52. 실시양태 51에 있어서, 세포가 용해되는 것인, 방법.
실시양태 53. 실시양태 51 또는 52 중 어느 하나에 있어서, 세포가 종양 세포인, 방법.
실시양태 54. 대상체에서 종양의 성장을 감소시키는 방법으로서, 실시양태 1 내지 42 중 어느 하나의 이중특이적 항체, 또는 실시양태 43 내지 48 중 어느 하나의 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편, 또는 실시양태 49 또는 50의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 종양이 CD38 및 ICAM1을 발현하는 세포를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 55. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 실시양태 1 내지 42 중 어느 하나의 이중특이적 항체, 또는 실시양태 43 내지 48 중 어느 하나의 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편, 또는 실시양태 49 또는 50의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 암이 CD38 및 ICAM1을 발현하는 세포를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 56. 실시양태 55에 있어서, 암이 고형 종양 또는 혈액 악성종양을 포함하는 것인, 방법.
실시양태 57. 실시양태 56에 있어서, 암이 혈액 악성종양을 포함하는 것인, 방법.
실시양태 58. 실시양태 57에 있어서, 혈액 악성종양이 다발성 골수종, 림프종 또는 버킷 림프종인, 방법.
실시양태 59. 실시양태 55에 있어서, 암이 폐암 또는 전립선암인, 방법.
실시양태 60. 실시양태 51 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 적어도 NCI-H2291 세포만큼의 ICAM1을 발현하는 것인, 방법.
실시양태 61. 실시양태 60에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 적어도 NCI-H2342 세포만큼의 CD38을 발현하는 것인, 방법.
실시양태 62. 실시양태 60 또는 61 중 어느 하나에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 다우디 세포보다 더 적은 CD38을 발현하는 것인, 방법.
실시양태 63. 실시양태 62에 있어서, 세포의 표면 상의 CD38의 양이 라지 세포의 표면 상의 CD38의 양 이하인, 방법.
실시양태 64. 실시양태 51 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율이 다우디 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율보다 큰 것인, 방법.
실시양태 65. 실시양태 64에 있어서, 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율이 라지 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율 이상인, 방법.
실시양태 66. 실시양태 51 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 적어도 5000, 10000, 150000, 20000, 30000, 50000, 100000, 150000, 200000, 250000, 300000, 400000, 또는 500000개의 ICAM1 단백질을 발현하는 것인, 방법.
실시양태 67. 실시양태 66에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 적어도 50,000개의 ICAM1 단백질을 발현하는 것인, 방법.
실시양태 68. 실시양태 51 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개의 CD38 단백질을 발현하는 것인, 방법.
실시양태 69. 실시양태 68에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 적어도 300개의 CD38 단백질을 발현하는 것인, 방법.
실시양태 70. 실시양태 68 또는 69에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 약 350000, 300000, 250000, 200000, 150000, 100000, 50000, 30000, 20000, 15000, 10000, 또는 5000개 미만의 CD38 단백질을 발현하는 것인, 방법.
실시양태 71. 실시양태 70에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 약 350,000개 미만의 CD38 단백질을 발현하는 것인, 방법.
실시양태 72. 실시양태 51 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율이 적어도 약 1, 1.5, 2.0, 2.5, 5, 10, 15, 20, 50, 100 또는 200인, 방법.
실시양태 73. 실시양태 72에 있어서, 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율이 적어도 약 1인, 방법.
실시양태 74. 실시양태 72에 있어서, 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율이 적어도 약 10인, 방법.
실시양태 75. 실시양태 51 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 인간인, 방법.
실시양태 76. 실시양태 1 내지 41 중 어느 하나의 이중특이적 항체, 또는 실시양태 42 내지 48 중 어느 하나의 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편, 또는 실시양태 49 또는 50의 약학적 조성물을 포함하는 키트.
7. 실시예
이들 실시예는 예시 목적으로만 제공되며 본원에 제공된 청구범위를 제한하지 않는다.
7.1 실시예 1: CD38 및 ICAM1을 발현하는 종양 세포주
본 개시내용에 기재된 항체의 결합 및 기능적 활성을 표 1의 종양 유래 세포주를 사용하여 분석하였다.
[표 1]
Figure pct00001
7.1.1 유세포계측 결합 분석
형질전환된 세포주에서 CD38 및 ICAM1의 표면 발현을 유세포계측으로 정량화하였다. 수거된 세포를 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 10 내지 15 ml 빙냉 배양 배지에 재현탁한 다음, 계수하였다. 그 다음, 차단 완충액(PBS + 2% FBS) ml당 3×106개 세포를 재현탁하였다. 100 ㎕의 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰에 분주하고 실온에서 10 내지 20분 동안 인큐베이션하였다. Fc 수용체 발현 세포의 경우, 5 ㎕ 인간 Fc 블록(BD Biosciences, Cat#: 564220)을 첨가하고 15분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션하는 동안, 정제된 항체를 차단 완충액을 이용하여 원하는 희석율로 희석하였다. 10 내지 20분 인큐베이션 후, 세포를 냉장 원심분리기에서 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 차단 완충액을 흡인하고, 세포를 100 ㎕/웰 희석된 항체에 재현탁하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 PBS + 2% FBS로 3회 세척하였다. 3차 세척 후, 세포를 100 ㎕ 1:500 희석 Alexa Fluor 488 표지된 마우스 항-인간 IgG1 Fc 2차 항체(Invitrogen, Cat#: A10631)에 재현탁하고 암실에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 200 ㎕ PBS로 3회 세척하였다. 마지막 세척 후, 세포를 300 ㎕ 차가운 PBS에 재현탁하고 FACSVerse™(BD Biosciences) 유세포계측기에서 분석하였다. 9종의 세포주에서의 CD38 및 ICAM1의 상대적 발현 수준은 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00002
7.2 실시예 2: CD38 및 ICAM1 항원의 생성
인간 CD38 및 ICAM1의 전장 세포외 도메인(ECD)을 6XHis 친화도 태그(서열 번호 62), TEV 절단 부위 및 직접적인 비오틴화를 위한 AviTag를 포함하는 pCDNA3.1 벡터에 클로닝하였다. 이러한 AviTag 부착된 항원(절단 후)의 아미노산 서열은 표 3에 나타낸다. CD38 및 ICAM1 단백질을 발현하는 형질감염된 Expi293 배양물을 2000 rpm 및 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하였다. Ni-NTA 수지를 E 완충액(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4)와 사전 평형화하고 4℃에서 상청액과 함께 로터에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 컬럼에 부었다. 컬럼을 G-250에 의해 신호가 관찰되지 않을 때까지 I-20 완충액(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, 20 mM 이미다졸)로 세척하였다. 표적 단백질을 5 CV의 I-250 완충액(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, 250 mM 이미다졸)으로 용출시켰다. 용출액을 E 완충액에 대해 투석한 다음, 프로테아제 대 단백질의 1:10 비율로 4℃에서 TEV 프로테아제로 밤새 절단하였다.
겔 여과를 이용하여 응집을 분석하였다. 각각의 단리된 ECD의 작은 분취량을 E 완충액과 사전 평형화된 24 ml Superdex™ 200 컬럼(10/300GL, GE)에 로딩하였다. 항원은 단량체로서 용출되었다. 나머지 단백질은 저장 완충액(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4, 6% 수크로스, pH 7.4)으로 투석하고, 30 KDa 분자량 컷오프를 갖는 한외여과 튜브에서 농축시키고, 액체 N2로 급속 냉동하고 -80℃에서 저장하였다.
[표 3]
Figure pct00003
7.3 실시예 3: CD38 및 ICAM 1 단클론 항체
CD38 또는 ICAM1에 특이적인 토끼 단클론 항체는 전체 내용이 참조로 포함된 PCT/US2019/061884에 설명된 바와 같이 생성하였다.
토끼를 108 다우디 세포(CD38 항체용) 또는 CHO-G10 세포(ICAM1을 발현하는 안정한 클론)로 4회 면역화하였다. 혈청 역가를 재조합 ICAM1 및 CD38 단백질을 사용하여 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 분석하였다. 표적 인식을 유세포계측에 의해 추가로 분석하였다. 각 표적에 대해, 높은 ELISA 역가 및 강력한 유세포계측 신호를 가진 토끼를 비장 절제술 4일 전에 400 ㎍의 재조합 ICAM1 또는 CD38의 IV 주사를 통해 부스트(boost)하였다. 각 표적에 대해, 1.2E8 새로 단리된 비장세포를 분류 전에 맞춤 제작된 B 세포 배지에서 밤새 배양하였다. 비장세포를 SMab™ 플랫폼을 사용하여 가공처리하여 항원 인식 B 세포를 풍부화하였다. FACS 분류된 B 세포를 10 내지 14일 동안 96웰 플레이트에서 1개 세포/웰로 배양하였다.
항원 인식에 대해 양성인 클론을 직접 항원 ELISA를 사용하여 식별하였다. FACS 분석에 적합한 단클론 항체를 식별하기 위해, 초기 양성 클론을 CD38(CHO-F10) 및 ICAM1(CHO-G10)을 발현하는 CHO 세포주에 대해 스크리닝하였다. 형질감염되지 않은 CHO 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. FACS 양성 mAb 클론을 초기 양성 클론으로부터 회수된 재조합 IgG 유전자를 일시적으로 발현하는 HEK293F 세포로부터의 선형 발현 모듈(LEM) 상청액을 사용하여 추가로 확인되었다.
CD38 및 ICAM1 항원을 발현하는 안정한 세포주를 이식유전자 발현을 유지하기 위해 항생제와 함께 선택 배지에서 유지시켰다. CHO-G10 세포를 10% FBS 및 5 ug/ml 퓨로마이신이 보충된 F12 배지에서 성장시켰다. CHO-F10 세포를 10% FBS 및 5 ug/ml 퓨로마이신 및 2 mg/ml 네오마이신이 보충된 F12 배지에서 성장시켰다.
항-CD38 및 항-ICAM1 단클론 항체의 VH 도메인을 인간 IgG1 불변 영역에 융합시키고 항-CD38 및 항-ICAM1 단클론 항체의 VL 도메인을 인간 카파 불변 영역에 융합시켜 토끼 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 갖는 키메라 항체를 생성하였다. 인간 카파 불변 영역은 토끼 VL(Cys80 내지 Cys171)과 도메인간 디설파이트 결합을 형성하는 토끼 카파 불변 영역 내의 시스테인에 상응하는 시스테인을 갖지 않기 때문에, VL 영역 내의 Cys80을 Ser로 대체시켜 유리 시스테인을 제거하였다.
표 4 내지 6은 중쇄 및 경쇄, 가변 도메인 및 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 이들 방법에 의해 발견된 예시적인 키메라 항-CD38 및 항-ICAM1 단클론 항체의 서열을 제시한다.
[표 4]
Figure pct00004
[표 5]
Figure pct00005
[표 6]
Figure pct00006
7.4 실시예 4: 키메라 항-CD38 및 항-ICAM1 항체의 결합 및 기능 평가
ELISA 결합 분석
96웰 플레이트를 4℃에서 1㎍/ml 재조합 CD38 또는 ICAM1로 밤새 코팅하였다. 3회 세척한 후, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 PBST 중의 300 ㎕ 1% BSA로 차단하였다. 연속 희석된 항체를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 플레이트를 PBST로 4회 세척하고 1:5000 희석된 2차 항체(Sigma, Cat# A0293)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 PBST로 4회 세척하고, 실온에서 15분 동안 TMB 기질과 함께 인큐베이션하고, 1N HCl로 종결시킨 다음, 450 nM에서 판독하였다. 키메라 항체 18E4는 약 50 pM의 최대 유효 농도의 절반(EC50 또는 EC50)로 CD38에 결합하였다. 키메라 항체 11F2 및 8B12는 약 50 pM의 EC50으로 ICAM1에 결합하였다.
유세포계측 결합 분석
종양 세포의 표면 상의 단백질에 대한 키메라 항-CD38 및 항-ICAM1 항체의 결합을 상술한 바와 같이 유세포계측에 의해 측정하였다. 키메라 항체 18E4 및 항-CD38 BMK는 0.3 내지 1.0 nM의 EC50으로 다우디 세포 상의 CD38에 결합하였다. 키메라 항체 11F2 및 8B12는 1.0 내지 1.5 nM의 EC50으로 DU145 세포 상의 ICAM1에 결합하였다.
표면 플라즈몬 공명 결합 분석
표면 플라즈몬 공명(SPR)은 결합 동역학 및 친화도에 있어 ELISA보다 더 정확하고 민감한 분석이다. 또한, 항체가 고정화되고 단량체 항원으로 챌리지되었기 때문에, 항-CD38 및 항-ICAM1 항체의 결합 동역학 측정은 SPR 분석에서 항체 결합가에 의해 영향을 받지 않았다. SPR은 Biacore 8K 기기(GE Healthcare)에서 수행하였다. 항체를 단클론 마우스 항-인간 IgG(Fc) 항체(GE Healthcare 인간 항체 포획 키트)로 코팅된 Biacore 시리즈 S CM5 센서 칩에서 포획하였다. 항체의 연속 3배 희석액(CD38 ECD 또는 ICAM1 ECD)을 30 ㎕/분의 유속으로 주사하였다. 각 샘플을 실온(25℃)에서 1분 회합 및 10분 해리로 분석하였다. 각 주사 후, 칩을 3M MgCl2를 사용하여 재생하였다. kon과 koff를 동시에 핏팅하는 1:1 랑뮈어(Langmuir) 모델을 동역학 분석을 위해 사용하였다. 키메라 항체 18E4는 0.1 내지 0.5 nM의 KD로 인간 CD38에 결합하였다. 키메라 항체 11F2 및 8B12는 0.1 내지 0.5nM의 KD로 인간 ICAM1에 결합하였다.
기능적 활성
보체 의존성 세포독성
보체 의존성 세포독성 또는 CDC를 분석하기 위해, 보체, 항체 또는 표적 세포를 FBS 부재 하의 세포 배양 배지에 희석하였다. 표적 세포를 대수 성장기에서 수거하고 FBS 부재 하의 세포 배양 배지로 2회 세척하였다. 세포 밀도를 4x105/ml로 조정하고 50 μL의 세포 현탁액을 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 항체를 최종 농도의 4X에서 제조하였다. 그 다음, 25 μL의 연속 희석된 항체를 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 25 μL의 희석된 인간 혈청을 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 보체의 작업 농도는 10%였다. 보체, 항체 및 표적 세포의 희석에 사용된 모든 배지는 무혈청 배지였다. 분석 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 50 μL CellTiter-Glo Luminescent 완충액을 각 웰에 첨가하고 오비탈 진탕기에서 2분 동안 광범위하게 혼합하여 세포 용해를 유도하였다. 그 다음, 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 발광 신호를 안정화시켰다. 발광은 SpectraMax M5에 의해 측정하였다. 데이터를 비선형 회귀 핏팅을 사용하여 GraphPad prism 5에 의해 분석하였다. 키메라 항-CD38 항체 18E4는 1 내지 2 nM의 EC50으로 다우디 세포 상에서 강력한 CDC 활성을 가졌다.
항체 의존성 세포 세포독성
항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 분석하기 위해, 표적 세포를 균형 염 용액 또는 배양 배지로 1회 세척하고, 세포 수를 1x106개 세포/ml로 조정하였다. 2 μL의 BATDA 형광 강화 리간드(Perkin Elmer, Cat# C136-100)를 세포의 각 mL마다 첨가하고 세포 인큐베이터에서 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하고, 배양 배지를 흡인하였다. 표지된 세포를 PBS로 4회 세척하였다. 최종 세척 후, 세포를 배양 배지에 재현탁하고 5 x 104개 세포/ml로 조정하였다. 200 μL(1x 104개 세포)의 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 표지된 표적 세포의 분취량을 회수하여 배경 방출을 결정하고, 원심분리기 및 상청액을 빈 웰로 이전하였다. 항체를 10% FBS를 함유하는 RPMI-1640으로 연속 희석하였다. 50 μL의 연속 희석된 항체를 표적 세포를 함유하는 분석 플레이트에 첨가하고 37℃, 5% CO2에서 5 내지 10분 동안 인큐베이션하였다. 효과기 세포 NK92/CD16a176V 또는 새로 분리된 PBMC를 수거하고 10% FBS를 함유하는 RPMI-1640에 현탁시켰다. 50 ul/웰 효과기 세포를 상이한 ET 비율에서 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 대조군 설정: 자발적인 표적(표적 세포 + 100 μL 배지); 최대 표적(표적 세포 + 100 μL 배지 + 10 μL 용해 완충액); 배경(표지된 표적 세포 상청액 100 μL 및 희석 배지 100 μL). 플레이트를 가습된 5% CO2 대기에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료 시, 10 μL의 용해 완충액(Perkin Elmer, Cat# 4005-0010)을 최대 방출 웰에 첨가하였다. 플레이트를 500g에서 5분 동안 원심분리하였다. 각 웰로부터의 상청액 20 μL를 평저 검출 플레이트로 이전하였다. 그 다음, 200 μL의 유로퓸 용액(Perkin Elmer, Cat# C135-100)을 검출 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 250 rpm에서 15분 동안 진탕한 다음, 5시간 이내에 시분해 형광측정기에서 형광을 측정하였다.
키메라 항-CD38 항체 18E4는 다우디 및 HuNS1 세포 상에서 강력한 ADCC 활성을 가졌고, 이때 다우디 세포에 대한 EC50은 0.1 내지 0.5 pM이었다. 11F2 및 8B12 키메라 항-ICAM1 항체는 0.01 내지 0.1 nM의 EC50으로 ICAM1 발현이 높은 DU145 세포에서 강력한 ADCC 활성을 가졌다.
7.5 실시예 5: 인간화
18E4, 11F2 및 8B12 항체를, 이들의 CDR 서열을 인간 프레임워크에 그래프팅함으로써 인간화하였다. CDR 그래프트 변이체는 키메라 항체에 비해 이들의 항원에 대한 친화도가 감소하였으며, 이들의 안정성을 감소시킬 수 있는 서열을 함유하였다. 따라서, 이들을, 결합에 기여하는 위치에서 인간 프레임워크 잔기를 상응하는 토끼 프레임워크 잔기로 대체하고 잠재적인 화학적 핫 스팟(hot spot)을 화학적 책임이 없는 잔기로 대체함으로써 추가로 조작하였다.
7.5.1 항-CD38 항체, 18E4의 인간화
18E4 가변 도메인의 서열을 국제 ImMunoGeneTics information system®(IMGT®)로부터의 서열에 정렬시켜 18E4의 HV 및 VL 사슬에 대한 상동성을 갖는 인간 생식계열 VH 및 VL-카파 서열을 식별하였다. IGKV1-05는 VL 인간 생식계열 수용자 서열로서 선택하였다. IGHV3-23은 VH 인간 생식계열 수용자 서열로서 선택하였다.
단순 그래프트 변이체 h18E4-1은 18E4 키메라 항체와 비교하여 CD38에 대해 상당히 감소된 친화도를 가졌다. 이의 친화도를 회복하기 위해, 프레임워크 영역에서 선택된 아미노산을 다시 토끼 서열로 변경하였다. 3개의 경쇄 버니어(Vernier) 위치 M4, I48 및 L78 (도 1a)와 8개의 중쇄 버니어 위치 V37, S49, S62, V63, I69, R71, L78 및 K94(도 1b)를 평가하였다.
최종 클론의 잠재적인 화학적 불안정성을 감소시키기 위해 추가적인 변이체를 작제하였다. LC CDR3 내의 잠재적인 탈아미드화 부위(NG)는 AG, SG 또는 NA로 돌연변이되었으며(도 1a), LC CDR1, HC CDR1 및 HC CDR2 내의 시스테인 잔기는 세린 또는 알라닌으로 돌연변이되었다(도 1a 내지 1b).
도 1a 내지 1b의 돌연변이된 18E4 중쇄 및 경쇄 변이체를 조합하여, 표 7에 나타낸 바와 같은 인간화 18E4 항체 변이체를 생성하였다.
[표 7]
Figure pct00007
프레임워크 영역 내에 역 돌연변이를 갖는 인간화 18E4 및 h18E4 변이체의 결합 동역학을 SPR에 의해 평가하였다. CDR 그래프트 변이체 h18E4-1은 키메라 18E4보다 10배 초과로 더 높은 KD로 인간 CD38에 결합하였다. 프레임워크 잔기를 다시 첨가하는 것은 변이체 h18E4-2 내지 h18E4-8의 친화도를 키메라 18E4와 거의 동일한 친화도(약 50% 내지 200%)로 개선하였다. 3개의 LC 역 돌연변이 및 8개의 HC 역 돌연변이를 갖는 h18E4-9는 키메라 18E4보다 낮은 KD를 가졌다. 프레임워크 영역에 다시 아미노산 잔기를 첨가하는 것은 세포 표면 CD38에 대한 인간화 18E4 변이체의 친화도를 개선하고 이들의 ADCC 활성을 증가시켰다. 특히, h18E4-9 및 키메라 18E4는 다우디 세포의 표면 상의 CD38에 대해 유사한 친화도를 가졌고, 0.01 내지 0.05 nM의 EC50으로 HuNS1 표적 세포 상에서 유사한 ADCC 활성을 가졌다.
h18E4-9의 우수한 결합 및 기능적 특성을 확립한 이 변이체를 잠재적인 화학적 불안정성 부위를 제거하기 위해 추가로 돌연변이시켰다. 경쇄 내의 잠재적인 NG 탈아미드화 부위를 제거하도록 설계된 돌연변이 세트 중에서, h18E4_L7의 아스파라긴에서 세린으로의 돌연변이(h18E4-13 내로 혼입됨)는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 바와 같이 결합 친화도에 가장 해로운 영향을 미쳤다. h18E4-13의 h18E4_H3 중쇄를 CDR1 및 CDR2 도메인 내의 시스테인 잔기를 제거하도록 추가로 돌연변이시켜 h18E4_H6을 생성하고, 이를 h18E4-19 내로 혼입시켰다. 다우디 세포에서의 ADCC 분석에서, h18E4-19는 강력한 활성을 가졌으며, 이때 EC50 농도(0.05 내지 0.1 pM)는 키메라 18E4와 유사하고 벤치마크 항-CD38 항체 다라투무맙(0.1 내지 0.5 pM)보다 약간 더 강력하였다.
알라닌 스캐닝
인간 CD38에 대한 결합에 중요한 CDR3 잔기를 식별하기 위해 인간화 h18E4-19 항체의 알라닌 스캐닝 변이체를 생성하였다. 도 2a 내지 2b에 도시된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역의 각 잔기를 알라닌으로 돌연변이시킴으로써 알라닌 돌연변이를 체계적으로 생성하였다. 각 돌연변이 변이체는 표 8에 나타낸 바와 같이 ELISA에 의해 CD38에 대한 결합에 대해 시험하였다. 0.02 nM 내지 0.1 nM(부류 A)의 EC50 값을 갖는 변이체는 CD38에 대한 결합을 실질적으로 억제하지 않으면서 돌연변이될 수 있는 CDR3 위치를 식별한다.
[표 8]
Figure pct00008
*NB: 결합 없음, 정량화하기에는 결합이 너무 낮음
7.5.2 항-ICAM1 항체 8B12 및 11F2의 인간화
항-ICAM1 항체, 8B12의 인간화
8B12 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 서열을 국제 ImMunoGeneTics information system®(IMGT®) 라이브러리로부터의 서열에 정렬하여 상동 인간 생식계열 VH 및 VL-카파 서열을 식별하였다. 8B12 VL의 경우, 인간 생식계열 IGKV1-05를 수용자 서열로서 선택하였다. 8B12 VH의 경우, 인간 생식계열 IGHV3-23을 수용자 서열로서 선택하였다.
CDR 그래프트 변이체 h8B12-1은 다우디 세포의 표면 상에서 및 SPR 분석에서 ICAM1에 대한 결합이 상당히 감소되었다. 친화도를 회복하기 위해, 프레임워크 영역 내의 다음 버니어 위치에서 선택된 아미노산을 평가하였다: 경쇄 I2, L46, L78, F83및 I106(도 3a) 및 중쇄 L4, A24, W47, V48, S49, S62, V63, R71, L78, M82, L82c, A93 및 K94(도 3b). 도 3a 내지 3b의 돌연변이된 8B12 중쇄 및 경쇄 변이체를 표 9에 나타낸 바와 같이 조합하여 인간화 8B12 항체 변이체를 생성하였다.
[표 9]
Figure pct00009
유세포계측 분석은 h8B12-2 내지 h8B12-7의 역 돌연변이가 CDR 그래프트 변이체 h8B12-1(EC50: 0.2nM 내지 0.5 nM)와 비교하여 다우디 세포의 표면 상의 ICAM1에 대한 결합을 개선하였음(EC50: 0.08 nM 내지 0.2 nM)을 밝혔다. 그러나, h8B12-2 내지 h8B12-7은 여전히 키메라 8B12(EC50: 0.04 nM 내지 0.08 nM)보다 낮은 친화도를 가졌다. 이러한 결과는 표면 플라즈몬 공명에 의해 확인되었다. h8B12-2 내지 h8B12-7은 0.3 nM 내지 1 nM 범위의 친화도 상수(KD)를 가졌다. 이것은 h8B12-1에 비해 10배 초과의 개선을 나타냈지만, 키메라 8B12(KD: 1 nM 내지 2 nM)에 비해서는 여전히 약한 결합이었다. 추가적인 프레임워크 영역 변이체의 평가는 더욱 개선된 결합 특성을 갖는 h8B12-21로 이어졌다. h8B12-21은 또한 h8B12-4, h8B12-6, h8B12-7 및 h8B12-19에 비해 개선된 ADCC 활성을 가졌다.
항-ICAM1 항체, 11F2의 인간화
11F2 클론은 도 14에 도시된 바와 같이 8B12와 높은 서열 유사성을 공유한다. 11F2 CDR을 h8B12-21의 프레임워크 영역 내로 이식하여 11F2 인간화를 시작하였다. 이어서, 경쇄 잔기 I2, F83 및 I106(도 5a) 및 중쇄 잔기 W47(도 5b)을 인간 잔기로 다시 돌연변이시켜 항원 결합에 대한 이들의 기여도를 평가하였다. 11F2 CDR H3 영역 내의 화학적 책임 부위(D100bG100c)를 연마하기 위해 추가적인 돌연변이를 생성하였다. 생성된 중쇄 및 경쇄를 표 10에 나타낸 바와 같이 추가 평가를 위해 항-ICAM1 항체 내로 조합하였다.
[표 10]
Figure pct00010
h11F2-1 내지 h11F2-4는 0.05 nM 내지 0.2 nM의 EC50 값으로 다우디 세포에서 강력한 ADCC 활성을 가졌다. h11F2-5 내지 h11F2-9는 모두 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정 시 h8B12-21(0.1 nM 내지 0.5 nM)과 유사한 결합 친화도(KD)를 가졌다.
7.6 실시예 6: 상이한 포맷의 인간화 이중특이적 항체
인간화 항-CD38(h18E4-19) 및 항-ICAM1(h11F2-6) 결합 도메인을 연결하여 이중특이적 항체를 형성하였다. 2가지 포맷의 이중특이적 항체를 작제하였다. 하나는 CD38 scFv 도메인을 갖는 3개의 폴리펩티드 사슬을 가졌다. 다른 하나는 4개의 폴리펩티드 사슬을 가졌고 CD38 결합 아암(arm)을 ICAM1 결합 아암과 구별하기 위해 T-세포 수용체(TCR) 불변 도메인을 사용하였다. 두 이중특이적 포맷 모두의 Fc 도메인을 동종이량체 조립을 억제하도록 놉-인투-홀 돌연변이로 조작하였다. 이중특이적 항체를 작제하기 위한 다양한 놉-투-홀 포맷 및 기타 방법은 PCT/US19/61884 및 문헌[Carter, J. Immunol. Protein Engineering 9(7) 617-621, 1996]에 기재되어 있다.
7.6.1 αCD38(scFv) x αICAM1의 작제
αCD38(scFv) x αICAM1은 h18E4-19로부터 유래된 단일 사슬 CD38 결합 도메인(scFv), h11F2-6로부터 유래된 ICAM1 결합 도메인 및 이중특이적 항체의 조립을 촉진하는 놉-인투-홀 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc 도메인을 갖는 이중특이적 항체이다. scFv 도메인을 이중특이적 항체의 하나의 아암에 혼입하는 것은 비특이적 항체의 조립을 억제한다(도 7b). αCD38(scFv) x αICAM1의 폴리펩티드 성분의 서열은 표 11에 나타낸다. 놉 및 홀 돌연변이를 포함하는 αCD38(scFv) x αICAM1의 Fc 도메인의 서열은 표 12에 나타낸다.
[표 11]
Figure pct00011
[표 12]
Figure pct00012
7.6.2 TCR 불변 도메인을 갖는 이중특이적 항체의 작제
미스매치된 중쇄 및 경쇄를 갖는 비특이적 항체의 조립을 방지하는 대안적 방법은 도 6a 내지 6c에 도시된 바와 같이 하나의 중쇄 CR1 불변 도메인을 T-세포 수용체 알파(TCRα) 불변 도메인으로 대체하고 상응하는 LC 불변 도메인을 TCRβ 불변 도메인로 대체하는 것으로, WO 2019/057122에 Xu에 의해 설명되어 있다. αCD38(TCR) x αICAM1은 TCR 서열에 연결된 h18E4-19로부터 유래된 CD38 결합 도메인, h11F2-6으로부터 유래된 ICAM1 결합 도메인 및 관련 HC CR1 및 LC 불변 도메인, 및 단일특이적 항-CD38 또는 단일특이성 항-ICAM1 항체의 조립을 억제하면서 이중특이적 항체의 조립을 촉진하는 놉-인투-홀 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. αCD38(TCR) x αICAM1 및 이의 성분 부분의 중쇄 및 경쇄의 서열은 표 13에 제시되어 있다. αCD38(scFv) x αICAM1 및 αCD38(TCR) x αICAM1의 구조는 도 7a 내지 7b에 비교되어 있다. αCD38(scFv) x αICAM1 및 αCD38(TCR) x αICAM1에 의해 공유된 CDR 도메인 서열은 표 14에 제시되어 있다.
[표 13]
Figure pct00013
[표 14]
Figure pct00014
1서열 번호 52는 서열 번호 9와 동일한 아미노산 서열이고; 서열 번호 54는 서열 번호 11과 동일한 아미노산 서열이고; 서열 번호 56은 서열 번호 17과 동일한 아미노산 서열이고; 서열 번호 57은 서열 번호 18 및 28과 동일한 아미노산 서열이고; 서열 번호 59는 서열 번호 20과 동일한 아미노산 서열이고; 서열 번호 60은 서열 번호 21과 동일한 아미노산 서열이고; 서열 번호 61은 서열 번호 22와 동일한 아미노산 서열이다.
7.6.3 인간화 이중특이적 항체의 열안정성
열안정성을 96웰 플레이트 오토샘플러가 장착된 자동화 MicroCal VP-Capillary DSC에서 시차주사열량계(DSC)에 의해 측정하였다. 이중특이적 항체를 20 mM 히스티딘, 150mM NaCl, pH 5.5 완충액에 1 mg/mL로 희석하였다. 희석된 항체 400 μL를 96웰 플레이트의 웰당 분석하였다. 이중특이적 항체 샘플을 60℃/h의 속도에서 25℃ 내지 100℃로 가열하였다. 용융 온도(Tm)는 Origin 7.0 소프트웨어를 사용하여, 단백질 무함유 참조 샘플에서 배경을 공제하고 단백질 농도로 정규화하여 비-2-상태 모델에 따라 계산하였다.
αCD38(scFv) x αICAM1 및 αCD38(TCR) x αICAM1 이중특이적 항체는 각각 3가지의 용융 온도를 가졌다. CD38 결합 도메인의 풀림을 나타낼 수 있는 최저 열 전이는 αCD38(TCR) x αICAM1(65℃)의 경우에 αCD38(scFv) x αICAM1(60℃)보다 더 높았다.
7.6.4 인간화 이중특이적 항체의 결합 활성
αCD38(scFv) x αICAM1 및 αCD38(TCR) x αICAM1의 결합 친화도를 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정하였다. 예상대로, hCD38(KD: 2 내지 5nM) 및 hICAM1(KD: 0.1 내지 0.15nM)에 대한 이들 이중특이적 항체의 친화도는 서로 유사하였다.
7.6.5 이중특이적 및 비푸코실화된 항체의 ADCC 활성
αCD38(scFv) x αICAM1 및 αCD38(TCR) x αICAM1은, 표 15에 나타낸 바와 같이, 매우 다양한 종양으로부터 유래되고 광범위하게 다양한 CD38 및 ICAM1 발현 수준을 갖는 세포주에 대해 강력한 ADCC 활성을 가졌다. 이중특이적 항체는 CD38 발현이 비교적 낮은 세포주에서 동일한 항-CD38 CDR을 갖는 2가 CD38 항체보다 더 높은 ADCC 활성을 가졌다. 마찬가지로, 이중특이적 항체는 ICAM1 발현이 낮거나 중간인 세포에서 동일한 항-ICAM1 CDR을 갖는 2가 ICAM1 항체보다 더 높은 ADCC 활성을 가졌다.
항체가 FUT8(푸코실트랜스퍼라제 8) 발현이 결여된 CHO 세포주에서 생성되었을 때, 비푸코실화는, 표 15에 나타낸 바와 같이, 시험된 모든 이중특이적 항체 및 단일특이적 항체의 ADCC 활성을 향상시켰고 시험된 모든 CD38+ ICAM1+ 종양 세포주에서 효과적이었다.
도 8a 내지 8e는 비푸코실화된 αCD38(TCR) x αICAM1의 ADCC 활성을 동일한 결합 도메인을 갖는 비푸코실화된 2가 항-CD38 또는 항-ICAM 항체 및 항-CD38 BMK 벤치마크 항체와 비교한다. 비푸코(afuco)-αCD38(TCR) x αICAM1은 CD38 또는 ICAM1 표면 발현이 낮은 종양 세포주를 포함하는 시험된 모든 종양 세포주에서 우수한 ADCC 활성을 나타냈다. 종합하면, 이들 ADCC 분석은 인간화 이중특이적 CD38 x ICAM1 항체가 단일특이적 αCD38 또는 단일특이적 αICAM1 항체보다 더 넓은 범위의 형질전환된 세포에 대해 더 다방면의 ADCC 활성을 갖고 이 활성이 비푸코실화에 의해 추가로 향상시킨다는 것을 입증한다.
[표 15]
Figure pct00015
*n.d. 검출되지 않음
7.7 실시예 5: 생체내 이종이식 종양 모델
세포 유래 이종이식편(CDX) 또는 환자 유래 이종이식편(PDX)을 갖는 마우스를 사용하여, 인간화 CD38 x ICAM1 이중특이적 항체가 종양 성장을 억제하는 능력을 보유하는지 여부를 시험하였다. 인간화 αCD38(scFv) x αICAM1 및 αCD38(TCR) x αICAM1 이중특이적 항체의 종래의 또는 비푸코실화된 버전을 라지(림프종), KMS-26(다발성 골수종) 및 HCC44(폐암) CDX 모델 및 LY3071(림프종) PDX 모델에서 단일특이적 ICAM1 및 CD38 항체와 비교하였다.
7.7.1 피하 림프종(라지) CDX 모델에서의 생체내 활성
CD38/ICAM1 이중특이적 항체의 생체내 항종양 활성을 라지 림프종 CDX 모델에서 조사하였다. 라지 종양 세포를 37℃에서 공기 중 5% CO2 대기에서 10% 열 불활성화 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 단층 배양물로서 시험관내에서 유지시켰다. 종양 세포를 트립신-EDTA 처리에 의해 주 2회 일상적으로 계대배양하였다. 지수 성장기에서 성장하는 세포를 수거하고 종양 접종을 위해 계수하였다. 종양 발생을 위해 암컷 CB.17 SCID 마우스(Beijing Charles River Laboratories)에 BD 마트리겔(Matrigel)(1:1)이 보충된 0.2 mL의 PBS 중 107개 세포를 피하 접종하였다. 처리는 종양 접종 후 9일차에 평균 종양 크기가 약 181 mm3에 도달했을 때 시작하였다. 동물을 이들의 종양 체적에 기반하여 계층화 무작위화를 수행하는 Excel 기반 무작위화 소프트웨어를 사용하여 군으로 배정하였다. 각 군은 5마리의 종양 보유 마우스로 구성되었다. 시험 항체를 3주 연속해서 주당 2회, 10mg/kg의 용량으로 마우스에 정맥내 주사하였다. 종양 체적을 모니터링하고, 종양 크기가 3000 mm3에 도달하거나 괴사되면 동물을 희생시켰다.
미처리 라지 세포 종양은 25일 후에 4000 mm3에 도달하였다(도 9a). αCD38(scFv) x αICAM1 및 αCD38(TCR) x αICAM1 인간화 이중특이적 항체 둘 다는 유의한 성장 억제를 제공하였다. TCR 포맷 이중특이적 항체는 scFv 포맷 이중특이적 항체보다 더 큰 활성을 가졌다. 두 이중특이적 항체 모두는 동일한 결합 도메인을 갖는 2가 항-CD38 항체 및 벤치마크 2가 항-CD38 항체보다 더 큰 정도로 성장을 억제하였다. 2가 항-ICAM1 항체뿐만 아니라 αCD38(scFv) x αICAM1 이중특이적 항체는 라지 세포 종양 성장을 억제하였다. 항-ICAM1 항체의 비교적 높은 활성은 라지 세포에서의 높은 ICAM1 발현과 일치한다. 비푸코-αCD38(TCR) x αICAM1은 시험된 모든 항체 중에서 가장 높은 라지 세포 종양 성장 억제를 나타냈다.
7.7.2 피하 다발성 골수종 KMS-26 CDX 모델에서의 생체내 활성
CD38xICAM1 이중특이적 항체의 생체내 항종양 활성을 KMS-26 다발성 골수종 CDX 모델에서 추가로 조사하였다. KMS-26 종양 세포를 37℃에서 공기 중 5% CO2 대기에서 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지에서 단층 배양물로서 시험관내에서 유지시켰다. 종양 세포를 트립신-EDTA 처리에 의해 주 2회 일상적으로 계대배양하였다. 지수 성장기에서 성장하는 세포를 수거하고 종양 접종을 위해 계수하였다.
종양 발생을 위해 암컷 CB.17 SCID 마우스(Beijing Charles River Laboratories)에 BD 마트리겔(1:1)이 보충된 0.2 mL의 PBS 중 5 x 106개 세포를 피하 접종하였다. 처리는 종양 접종 후 10일차에 평균 종양 크기가 약 130 mm3에 도달했을 때 시작하였다. 동물을 이들의 종양 체적에 기반하여 계층화 무작위화를 수행하는 Excel 기반 무작위화 소프트웨어를 사용하여 군으로 배정하였다. 각 군은 5마리의 종양 보유 마우스로 구성되었다. 시험 항체를 3주 연속해서 주당 2회, 10 mg/kg의 용량으로 마우스에 정맥내 주사하였다. 종양 체적을 모니터링하고, 종양 크기가 3000 mm3에 도달하거나 괴사되면 동물을 희생시켰다.
미처리된 KMS-26 세포 종양은 30일 후에 2500 mm3에 도달하였다(도 9b). αCD38(scFv) x αICAM1 및 αCD38(TCR) x αICAM1 인간화 이중특이적 항체 둘 다는 유의한 성장 억제를 제공하였다. TCR 포맷 이중특이적 항체는 scFv 포맷 이중특이성 항체보다 더 큰 활성을 가졌다. 두 이중특이적 항체 모두는 동일한 결합 도메인을 갖는 2가 항-ICAM1 항체보다 더 큰 정도로 성장을 억제하였다. 2가 항-CD38 항체는 KMS-26 세포 종양에 대해 비교적 높은 성장 억제 활성을 가졌다. 비푸코-αCD38(TCR) x αICAM1은 시험된 모든 항체 중에서 가장 높은 KMS-26 세포 종양 성장 억제를 나타냈다.
7.7.3 피하 폐암(HCC44) CDX 모델에서의 생체내 활성
CD38/ICAM1 이중특이성의 생체내 항종양 활성을 폐암 CDX 모델(HCC44)에서 추가로 조사하였다. HCC44 종양 세포를 37℃에서 공기 중 5% CO2 대기에서 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 단층 배양물로서 시험관내에서 유지시켰다. 종양 세포를 트립신-EDTA 처리에 의해 주 2회 일상적으로 계대배양하였다. 지수 성장기에서 성장하는 세포를 수거하고 종양 접종을 위해 계수하였다.
종양 발생을 위해 암컷 Balb/c 누드 마우스(Shanghai Lingchang Laboratory Animal Technology Co., LTD.)에 BD 마트리겔(1:1)이 보충된 PBS 0.2 mL 중 5x106개 세포를 우측 옆구리에서 피하 접종하였다. 처리는 종양 접종 후 20일차에 평균 종양 크기가 약 120 mm3에 도달했을 때 시작하였다. 동물을 이들의 종양 체적에 기반하여 계층화 무작위화를 수행하는 Excel 기반 무작위화 소프트웨어를 사용하여 군으로 배정하였다. 각 군은 5마리의 종양 보유 마우스로 구성되었다. 시험 항체를 주당 2회 10mg/kg의 용량으로 마우스에 정맥내 주사하였다. 종양 체적을 모니터링하고, 종양 크기가 3000 mm3에 도달하거나 괴사되면 동물을 희생시켰다.
미처리된 HCC44 세포 종양은 60일 후에 2300 mm3에 도달하였다(도 9c). 2가 항-CD38 및 항-ICAM1은 HCC44 세포 종양의 성장을 억제하지 않은 반면, αCD38(TCR) x αICAM1 인간화 이중특이적 항체는 유의한 성장 억제를 나타냈다. 비푸코-αCD38(TCR) x αICAM1은 일반적으로 푸코실화된 αCD38(TCR) x αICAM1에 비해 유의하게 더 높은 HCC44 세포 종양 성장 억제 활성을 가졌다.
7.7.4 피하 인간 림프종(LY3071) PDX 모델에서의 생체내 활성
확립된 원발성 인간 암 조직을 보유한 마우스로부터의 신선한 종양 조직을 수거하고 작은 조각(직경 약 2 내지 3 mm)으로 절단하였다. 종양 발생을 위해 각각의 마우스에 이들 종양 조직을 우측 앞 옆구리에서 피하 접종하였다. 평균 종양 크기가 약 80 내지 120 mm3에 도달할 때 마우스를 무작위화하였다. 32마리의 마우스를 4개의 연구 군(군당 8마리)에 무작위로 할당하였다. 무작위화는 "일치 분포" 방법 또는 "계층화" 방법(StudyDirector™ 소프트웨어, 버전 3.1.399.19)을 사용하여 수행하였다. 시험 항체를 3주 연속해서 주당 2회, 10 mg/kg의 용량으로 마우스에 정맥내 주사하였다. 종양 체적을 모니터링하고, 종양 크기가 3000 mm3에 도달하거나 괴사되면 동물을 희생시켰다.
미처리된 환자 유래 종양은 22일 내에 >1600 mm3로 성장하였다. 성장은 비푸코실화된 2가 항-CD38 항체에 의해 부분적으로 억제되었다. 종양은 비푸코실화된 2가 항-ICAM1, 비푸코실화된 αCD38(scFv) x αICAM1 및 비푸코실화된 αCD38(TCR) x αICAM1 인간화 이중특이적 항체로 처리되었을 때 수축하였다.
본 개시내용의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태가가 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자는 본 개시내용을 벗어나지 않으면서 다수의 변형, 변경 및 치환을 생각해 낼 것이다. 본원에 설명된 본 개시내용의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 개시내용을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음의 청구범위는 본 개시내용의 범위를 정의하고 이들 청구범위 내의 방법과 구조 및 이들의 등가물은 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> VIRTUOSO BINCO, INC. <120> HUMANIZED CD38 AND ICAM1 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 55429-707.601 <140> <141> <150> 63/024,931 <151> 2020-05-14 <160> 120 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 274 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 Val Pro Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg 20 25 30 Phe Pro Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His 35 40 45 Pro Glu Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys 50 55 60 Gly Ala Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr 65 70 75 80 Gln Pro Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile 85 90 95 Leu Leu Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val 100 105 110 Gln Arg Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala 115 120 125 Asp Asp Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr 130 135 140 Gln Ser Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser 145 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Synthetic polypeptide <400> 3 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr Trp 20 25 30 Ile Cys Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 35 40 45 Cys Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Gly Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 44 Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His 20 25 30 Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Asp Glu Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 45 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Arg Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Gln Gly Tyr Tyr Ser Gly Gly Ser Tyr Ala 1 5 10 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Ser His Ala Met Gly 1 5 <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Asp Glu Gly Tyr Arg Leu 1 5 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 61 <211> 12 <212> 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 88 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Ala Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 89 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 89 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp 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Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 116 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 116 Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His 20 25 30 Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 117 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 117 Glu Val Gln Val Leu Glu Ser 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Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Asp Gln Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 119 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 119 Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His 20 25 30 Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Asp Ser Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 120 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 120 Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His 20 25 30 Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Ser Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Asp Asn Ala Tyr Arg Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (76)

  1. 하나 이상의 인간화 CD38 결합 도메인, 하나 이상의 인간화 ICAM1 결합 도메인 및 인간 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체.
  2. 제1항에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 scFv를 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  3. 제1항에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 IgG 중쇄의 가변 도메인 및 IgG 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  4. 제1항에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  5. 제1항에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 scFv를 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  6. 제1항에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 IgG 중쇄의 가변 도메인 및 IgG 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  7. 제1항에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  8. 제1항에 있어서, 이중특이적 항체의 이소형이 인간 IgG1인, 이중특이적 항체.
  9. 제1항에 있어서, 인간 Fc 도메인이 이종이량체 Fc 도메인이고, 이종이량체 Fc 영역이 놉(knob) 사슬 및 (hole) 사슬을 포함하여 놉-인-홀(knob-in-hole: KiH) 구조를 형성하는 것인, 이중특이적 항체.
  10. 제9항에 있어서, 놉 사슬이 T366W에 상응하는 돌연변이를 포함하고 홀 사슬이 T366S, L368A 및 Y407V에 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 위치 번호매김이 카밧(Kabat) 등의 EU 지수에 따른 것인, 이중특이적 항체.
  11. 제9항에 있어서, 놉 사슬이 S354C, T366W에 상응하는 돌연변이를 포함하고 홀 사슬이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V에 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 위치 번호매김이 카밧 등의 EU 지수에 따른 것인, 이중특이적 항체.
  12. 제1항에 있어서, Fc 도메인이 비푸코실화된(afucosylated) 것인, 이중특이적 항체.
  13. 제1항에 있어서, Fc 도메인이 항원 의존성 세포 세포독성(ADCC) 활성을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  14. 제13항에 있어서, Fc 도메인이 S239D, I332E 및 A330L 아미노산 치환에 상응하는 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 위치 번호매김이 카밧 등의 EU 지수에 따른 것인, 이중특이적 항체.
  15. 제1항에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 항-CD38 IgG의 가변 도메인을 포함하고, ICAM1 결합 도메인이 항-ICAM1 단일 사슬 가변 단편(항-ICAM1 scFv)을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  16. 제1항에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 항-ICAM1 IgG의 가변 도메인을 포함하고, CD38 결합 도메인이 항-CD38 단일 사슬 가변 단편(항-CD38 scFv)을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  17. 제1항에 있어서, CH1 IgG 도메인 및 CL IgG 도메인을 추가로 포함하는 이중특이적 항체.
  18. 제1항에 있어서, T 세포 수용체(TCR) 불변 영역을 추가로 포함하고, 상기 TCR 불변 영역이 TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  19. 제18항에 있어서,
    인간화 CD38 결합 도메인이 VH-CD38 도메인 및 VL-CD38 도메인을 포함하고; 여기서,
    상기 VH-CD38 도메인이 TCR 베타 불변 도메인에 융합되고;
    상기 VL-CD38 도메인이 TCR 알파 불변 도메인에 융합되는 것인, 이중특이적 항체.
  20. 제18항에 있어서,
    인간화 CD38 결합 도메인이 VH-CD38 도메인 및 VL-CD38 도메인을 포함하고; 여기서,
    상기 VH-CD38 도메인이 CH1 IgG 도메인에 융합되고;
    상기 VL-CD38 도메인이 CL IgG 도메인에 융합되는 것인, 이중특이적 항체.
  21. 제18항에 있어서,
    인간화 ICAM1 결합 도메인이 VH-ICAM1 도메인 및 VL-ICAM1 도메인을 포함하고; 여기서,
    상기 VH-ICAM1 도메인이 TCR 베타 불변 도메인에 융합되고;
    상기 VL-ICAM1 도메인이 TCR 알파 불변 도메인에 융합되는 것인, 이중특이적 항체.
  22. 제18항에 있어서,
    인간화 ICAM1 결합 도메인이 VH-ICAM1 도메인 및 VL-ICAM1 도메인을 포함하고; 여기서,
    상기 VH-ICAM1 도메인이 CH1 IgG 도메인에 융합되고;
    상기 VL-ICAM1 도메인이 CL IgG 도메인에 융합되는 것인, 이중특이적 항체.
  23. 제1항에 있어서, 이중특이적 항체의 최저 용융 전이가 적어도 55℃, 적어도 60℃ 또는 적어도 65℃인, 이중특이적 항체.
  24. 제1항에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 서열 번호 40과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  25. 제1항에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 서열 번호 41과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  26. 제1항에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 서열 번호 35와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  27. 제1항에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 및 서열 번호 55와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  28. 제27항에 있어서, HC CDR3 도메인이 글루탐산 95, 글루탐산 100b, 글리신 100c 및 티로신 100d를 포함하고, LC CDR3 도메인이 글리신 90, 티로신 91, 세린 93, 글리신 94 및 티로신 96을 포함하고, 여기서 아미노산 위치 번호매김이 카밧 등의 EU 지수에 따른 것인, 이중특이적 항체.
  29. 제1항에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 서열 번호 44와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  30. 제1항에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 서열 번호 45와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  31. 제1항에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 및 서열 번호 61과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  32. 제1항에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 10 nM 이하 또는 5 nM 이하의 평형 해리 상수(KD)로 인간 CD38의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
  33. 제1항에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 0.1 nM 내지 20 nM, 0.5 nM 내지 15 nM, 1 nM 내지 10 nM, 또는 1 nM 내지 5 nM의 평형 해리 상수(KD)로 인간 CD38의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
  34. 제1항에 있어서, 인간화 CD38 결합 도메인이 2 nM 내지 5 nM의 평형 해리 상수(KD)로 인간 CD38의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
  35. 제1항에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 1 nM 미만, 0.5 nM 미만 또는 0.2 nM 미만의 평형 해리 상수(KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
  36. 제1항에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 0.02 nM 내지 10 nM, 0.05 nM 내지 5 nM, 0.05 nM 내지 1 nM, 또는 0.1 nM 내지 0.5 nM의 평형 해리 상수(KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
  37. 제1항에 있어서, 인간화 ICAM1 결합 도메인이 0.1 nM 내지 0.15 nM의 평형 해리 상수(KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
  38. 제32항에 있어서, KD가 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되는 것인, 이중특이적 항체.
  39. 제1항에 있어서, 이중특이적 항체가 비푸코실화된 Fc 도메인을 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  40. 제39항에 있어서, 이중특이적 항체가 비푸코실화된 Fc 도메인을 포함하지 않는 그외에는 동일한 이중특이적 항체에 의해 표적 세포 상에서 유도된 ADCC 효과와 비교하여 표적 세포 상에서 향상된 ADCC 효과를 유도할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
  41. 제1항에 있어서, 이중특이적 항체가 인간화 CD38 결합 도메인 또는 인간화 ICAM1 결합 도메인을 포함하는 단일특이적 단백질에 의해 표적 세포 상에서 유도된 ADCC 효과와 비교하여 표적 세포 상에서 향상된 ADCC 효과를 유도할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
  42. 제1항에 있어서, 이중특이적 항체가 10 nM 미만 또는 0.5 nM 내지 1.0 nM의 최대 유효 농도의 절반(EC50)으로 다우디(Daudi) 세포에서 보체 의존성 세포독성을 유도할 수 있는 것인, 이중특이적 항체.
  43. 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 및 서열 번호 61과 적어도 90% 동일한 CDR 서열을 포함하는 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편.
  44. 제43항에 있어서, 서열 번호 44 및 서열 번호 45와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편.
  45. 제43항에 있어서, 1 nM 미만 또는 0.5nM 미만의 평형 해리 상수(KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 하나 이상의 ICAM1 결합 도메인을 포함하는 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편.
  46. 제43항에 있어서, 0.02 nM 내지 10 nM, 0.05 nM 내지 5 nM, 또는 0.05 nM 내지 1 nM의 평형 해리 상수(KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 하나 이상의 ICAM1 결합 도메인을 포함하는 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편.
  47. 제43항에 있어서, 0.1 nM 내지 0.5 nM의 평형 해리 상수(KD)로 인간 ICAM1의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 하나 이상의 ICAM1 결합 도메인을 포함하는 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편.
  48. 제43항에 있어서, KD가 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되는 것인, 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편.
  49. 제1항의 이중특이적 항체, 또는 제43항의 인간화 항-ICAM1 항체 또는 이의 ICAM1 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 이들의 임의 조합을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  51. 대상체에서 세포를 사멸시키는 방법으로서, 제1항의 이중특이적 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 세포가 CD38 및 ICAM1을 발현하는 것인, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 세포가 용해되는 것인, 방법.
  53. 제51항에 있어서, 세포가 종양 세포인, 방법.
  54. 대상체에서 종양의 성장을 감소시키는 방법으로서, 제1항의 이중특이적 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 종양이 CD38 및 ICAM1을 발현하는 세포를 포함하는 것인, 방법.
  55. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 제1항의 이중특이적 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 암이 CD38 및 ICAM1을 발현하는 세포를 포함하는 것인, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 암이 고형 종양 또는 혈액 악성종양을 포함하는 것인, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 암이 혈액 악성종양을 포함하는 것인, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 혈액 악성종양이 다발성 골수종, 림프종 또는 버킷 림프종인, 방법.
  59. 제55항에 있어서, 암이 폐암 또는 전립선암인, 방법.
  60. 제51항에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 적어도 NCI-H2291 세포만큼의 ICAM1을 발현하는 것인, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 적어도 NCI-H2342 세포만큼의 CD38을 발현하는 것인, 방법.
  62. 제60항에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 다우디 세포보다 더 적은 CD38을 발현하는 것인, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 세포의 표면 상의 CD38의 양이 라지(Raji) 세포의 표면 상의 CD38의 양 이하인, 방법.
  64. 제51항에 있어서, 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율이 다우디 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율보다 큰 것인, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율이 라지 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율 이상인, 방법.
  66. 제51항에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 적어도 5000, 10000, 150000, 20000, 30000, 50000, 100000, 150000, 200000, 250000, 300000, 400000, 또는 500000개의 ICAM1 단백질을 발현하는 것인, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 적어도 50,000개의 ICAM1 단백질을 발현하는 것인, 방법.
  68. 제51항에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개의 CD38 단백질을 발현하는 것인, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 적어도 300개의 CD38 단백질을 발현하는 것인, 방법.
  70. 제68항에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 약 350000, 300000, 250000, 200000, 150000, 100000, 50000, 30000, 20000, 15000, 10000, 또는 5000개 미만의 CD38 단백질을 발현하는 것인, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 세포가 이의 표면 상에서 약 350,000개 미만의 CD38 단백질을 발현하는 것인, 방법.
  72. 제51항에 있어서, 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율이 적어도 약 1, 1.5, 2.0, 2.5, 5, 10, 15, 20, 50, 100 또는 200인, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율이 적어도 약 1인, 방법.
  74. 제72항에 있어서, 세포의 표면 상의 ICAM1 대 CD38의 비율이 적어도 약 10인, 방법.
  75. 제51항에 있어서, 대상체가 인간인, 방법.
  76. 제1항의 이중특이적 항체를 포함하는 키트.
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