ES2903408T3 - Miembros de unión para PD-L1 - Google Patents

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Miriam Droste
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Abstract

Un anticuerpo que tiene una especificidad de unión para PD-L1, que comprende (i) la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1; y (ii) la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN
Miembros de unión para PD-L1
Campo de la invención
Se proporciona un miembro de unión contra PD-L1, que es un fragmento de anticuerpo humanizado, en particular un scFv anti-PD-L1 monovalente, muy potente y estable, aplicable para usos terapéuticos y de diagnóstico. También se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica dicho miembro de unión, un vector que contiene la secuencia de una molécula de ácido nucleico respectiva, una célula hospedadora que contiene el vector o la secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico respectiva, una composición farmacéutica y de diagnóstico que contiene el miembro de unión o la molécula de ácido nucleico, así como un uso de los mismos.
Antecedentes
La proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) es un receptor de superficie celular expresado en linfocitos T activados, linfocitos B y células mieloides. PD-1 se une a dos ligandos, PD-L1 (Dong H, et al. Nat Med. 1999; 5: 1365­ 1369) y PD-L2 (Latchman Y. et al. Nat Immunol. 2001; 2: 261-8).
Tras la unión del ligando PD-L1 o PD-L2 a PD-1, se desencadena una cascada de señalización inhibidora dentro del linfocito T que inhibe la activación mediada por TCR de la producción de IL-2 y la proliferación de linfocitos T. PD-L1 (ligando 1 de muerte programada) es una proteína transmembrana de tipo 1 que se expresa o induce de forma constitutiva por IFNy en la superficie de la mayoría de las células cancerosas humanas y las células presentadoras de antígenos (Antigen Presenting Cells, APC).
Además de PD-1, PD-L1 se une a CD80 (Butte M.J. et al. (2007) 27:111-122), un receptor de membrana que es capaz de unirse a CD28 y CTLA-4. Sin embargo, PD-L1 interactúa más fuertemente con PD-1 que con CD80. Como PD-1, CD80 es un receptor de membrana expresado en linfocitos T y linfocitos B. La unión de PD-L1 a PD-1 o CD80 transmite señales inhibidoras a los linfocitos T, suprimiendo la migración de linfocitos T, proliferación y secreción de mediadores citotóxicos y reduciendo la destrucción de células tumorales. Sin embargo, mientras que la interacción PD-1/PD-L1 impulsa el agotamiento de linfocitos T, la interacción PD-L1/CD80 impulsa la anergia de linfocitos T. Estos son procesos distintos, ya que el agotamiento es progresivo durante un periodo de semanas o meses y depende del estímulo antigénico crónico, mientras que la anergia se induce rápidamente después de la estimulación por antígenos en ausencia de una coestimulación adecuada.
En consecuencia, la expresión de PD-L1 protege las células tumorales de la destrucción mediada por linfocitos T (Haile S. T. et al. (2011), J Immunol.; 186 (12): 6822-9; Haile S.T. et al. (2013), J Immunol.; 191 (5): 2829-2836). Los niveles regulados positivamente de PD-L1 se correlacionan con una mayor agresividad tumoral y un mayor riesgo de muerte. Los estudios en animales demostraron que el bloqueo de la interacción PD-L1:PD-1 a través de anticuerpos monoclonales mejora la activación de linfocitos T y reduce la progresión tumoral. Por otra parte, el bloqueo de anticuerpos de la señalización de PD-L1 a través de CD80 expresado por linfocitos T previene la anergia de linfocitos T.
Los anticuerpos monoclonales que bloquean PD-1 o PD-L1 han demostrado una actividad impresionante en un amplio conjunto de subtipos de cáncer, incluso en etapas avanzadas y metastásicas de la enfermedad (Maute et al. (2015), PNAs , 112 (47): E6506-E6514). Aunque estudios anteriores sugirieron que el bloqueo de las interacciones de PD-L1 con PD-1 o CD80 solos puede ser más beneficioso, en términos de aumentar la inmunidad mientras se minimiza el riesgo de inmunopatología (Butte MJ (2008), Mol Immunol; 45 (13): 3567-72), ensayos clínicos recientes con anticuerpos monoclonales que bloquean la interacción de PD-L1 con PD-1 y CD80 mostraron un éxito clínico notable en varios cánceres y son menos tóxicos que la quimioterapia tradicional. Aunque solo un subconjunto de pacientes responde al bloqueo de puntos de control, la duración de dicha respuesta debido a la memoria inmunológica es notable y es más larga de lo que cabría esperar con cualquier otro agente en la enfermedad refractaria (Janakiram M et al. (2016), Immunotherapy; 8 (7): 809-19).
Atezolizumab (MPDL3280A, p. ej., descrito en el documento US 8217 149) es un anticuerpo IgG1 humanizado que se dirige a PD-L1 de manera que se bloquea la unión del receptor a PD-1 y CD80. El anticuerpo se diseñó por ingeniería genética para tener una función efectora de Fc reducida y, con esta, un agotamiento reducido de las células que expresan PD-L1. En octubre de 2016, la FDA aprobó el atezolizumab para el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) metastásico que tienen progresión de la enfermedad durante o después de la quimioterapia que contiene platino. Si el tumor tiene aberraciones genómicas de EGFR o ALK, los pacientes deberían tener progresión de la enfermedad con la terapia aprobada por la FDA para estas aberraciones antes de recibir el anticuerpo. Los estudios clínicos subyacentes inscribieron pacientes independientemente de su estado de PD-L1 e incluyeron tipos de enfermedades tanto escamosas como no escamosas. En mayo de 2016, la FDA aprobó el atezolizumab para el tratamiento de pacientes con carcinoma urotelial localmente avanzado o metastásico, que tienen progresión de la enfermedad durante o después de la quimioterapia que contiene platino.
Durvalumab (MEDI4736; véanse, p. ej., los documentos US 8779 108, WO2010077634) es un anticuerpo monoclonal IgG1 humano anti-PD-L1 que bloquea la interacción tanto de PD-1 como de CD80 tras la unión de PD-L1. El anticuerpo se generó inmunizando animales XenoMouse IgG2 e IgG4 e intercambiando un dominio mutante triple IgG1 humano por el dominio constante. Este dominio constante contiene tres mutaciones puntuales que reducen la unión a los receptores Clq y Fc gamma, lo que da lugar a una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos reducida y una citotoxicidad dependiente del complemento.
El anticuerpo se encuentra en ensayos clínicos como monoterapia para varias indicaciones, incluyendo CPNM localmente avanzado o metastásico, cáncer urotelial, cáncer de cabeza y cuello, de cuello de útero, colorrectal, esofágico, de ovario, de mama, CPM y cánceres gástricos y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CECC) positivo para PD-L1 recurrente o metastásico. Están en curso ensayos clínicos de terapia combinada.
Un anticuerpo adicional que se dirige a PD-1 y bloquea la interacción de PD-1 y CD80 con PD-L1 es avelumab (MSB0010718C, descrito en el documento WO2013079174). El anticuerpo monoclonal IgG1 completamente humano conserva una región Fc nativa y, por lo tanto, puede inducir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA). El anticuerpo se encuentra en ensayos clínicos para tumores sólidos, cánceres gástricos, carcinoma de células de Merkel y CPNM.
Todavía existe la necesidad de compuestos mejorados que se dirijan a los inhibidores de puntos de control inmunitarios y de proporcionar métodos terapéuticos seguros y eficaces para tratar los trastornos relacionados con el sistema inmunitario, tales como cáncer, inmunodeficiencia, enfermedades autoinmunitarias, alergias, trastornos inflamatorios, rechazo de trasplantes y otros trastornos.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona miembros de unión que se unen a PD-L1, incluyendo ácidos nucleicos y vectores que codifican, células hospedadoras que expresan y composiciones que contienen dichos miembros de unión, así como para su uso en terapia.
Dicho miembro de unión puede tener una o más de las siguientes propiedades:
(a) tiene una alta afinidad por PD-L1, tanto como inmunoglobulina como en un formato de fragmento de anticuerpo monovalente tal como un scFv.
(b) se une a PD-L1 humano con una constante de equilibrio de disociación de unión (KD) inferior a 10 pM medida mediante ensayo de exclusión cinética en las condiciones indicadas en el ejemplo 4 para el formato monovalente o las condiciones indicadas en el ejemplo 9 para el formato bivalente;
(c) se une a un epítopo en PD-L1 que impide la interacción de PD-L1 humano con PD-1 humana y CD80 humana; (d) reacciona de forma cruzada con PD-L1 de mono;
(e) se une a PD-L1 de mono, con una afinidad de unión al menos tan fuerte, más preferentemente al menos dos veces más fuerte para PD-L1 de mono que para PD-L1 humano;
(f) no se une a PD-L2 humano o B7-H3 humano;
(g) inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de cáncer de pulmón humano HCC827; y
(h) forma menos del 3 % de dímeros después de 1 o 2 semanas de almacenamiento a 37 °C a una concentración de 10 mg/ml en PBS a pH 7,2 en el formato scFv.
Por tanto, en un aspecto, se proporciona un miembro de unión que es un anticuerpo que tiene una especificidad de unión por PD-L1, que comprende
(i) una secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1; y
(ii) una secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 2.
Dichos miembros de unión pueden usarse en el tratamiento del cáncer y enfermedades inflamatorias, así como en el diagnóstico. También se proporcionan ácidos nucleicos relacionados, vectores, células, composiciones, métodos y equipos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra que scFv1 bloquea la señal inhibidora del punto de control inmunitario mediada por PD-L1 y rhPD-1 humana recombinante (rh) en un sistema basado en células.
La figura 2 muestra que scFv1 bloquea la interacción entre rhPD-L1 y rhPD-1 en ELISA. El nivel de fondo se determinó en ausencia de scFv y PD-1.
La figura 3 muestra que scFv1 bloquea la interacción entre rhPD-L1 y rhCD80 en ELISA. El nivel de fondo se determinó en ausencia de PD-L1.
La figura 4 muestra que la capacidad de scFvl para unirse a rhPD-L1, medida mediante ELISA, no se ve afectada después del almacenamiento a 37 °C en suero humano.
La figura 5 muestra que scFv1 se une a rhPD-L1 en un ensayo de exclusión cinética.
La figura 6 muestra que scFv1 se une a PD-L1 recombinante humano y de mono, pero no a PD-L1 de rata, mediante ELISA de unión. El nivel de fondo se muestra en ausencia de scFv y la funcionalidad de las proteínas se confirma mediante el uso de un anticuerpo de control positivo como se define en el ejemplo 5.
La figura 7 muestra que scFv1 se une a PD-L1 de mono recombinante en un ensayo de exclusión cinética. La figura 8 muestra que scFv1 se une a la forma humana natural de PD-L1 en la superficie de las células en un ensayo de exclusión cinética.
La figura 9 muestra que scFv1 producido a partir de cuerpos de inclusión de E. coli o secretado por células CHO muestra una inhibición similar de la interacción entre PD-L1 y PD-1 en un sistema basado en células.
La figura 10 muestra que scFv1 promueve la contracción del tumor en un modelo de cáncer de pulmón humano HCC827 en ratones desnudos a los que se les han administrado células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas. A: Tratamiento (scFv1 o IgG de control positivo) sobre la relación de control (scFv2 sin unión) como se define en el ejemplo 8. B: Inhibición del crecimiento tumoral (scFv1 o IgG de control positivo en comparación con scFv2 sin unión) como se define en el ejemplo 8.
La figura 11 muestra que IgG_1 e IgG_2 son más eficaces que IgG_3 e IgG_4 en la inhibición de la interacción entre rhPD-L1 y rhPD-1. El nivel de fondo se determinó en ausencia de IgG y PD-1.
La figura 12 muestra que IgG_1 (A) tiene una afinidad más estrecha que IgG_2 (B) en la interacción entre IgG y PD-L1.
Descripción detallada
Para que las explicaciones sobre los miembros de unión, ácidos nucleicos, vectores, células hospedadoras, composiciones, métodos y usos desvelados en el presente documento puedan entenderse más fácilmente, primero se definen ciertos términos.
Definiciones
A menos que se definan de otra manera, todos los demás términos científicos y técnicos utilizados en la descripción, las figuras y las reivindicaciones tienen su significado ordinario, como las entiende habitualmente un experto en la materia. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de los miembros de unión, ácidos nucleicos, vectores, células hospedadoras, composiciones, métodos y usos desvelados en el presente documento, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
El término "administrar", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier modo de transferencia, suministro, introducción o transporte de materia tal como un compuesto, p. ej., un compuesto farmacéutico u otro agente tal como un antígeno, a un sujeto. Los modos de administración incluyen, sin limitación, administración parenteral, oral, rectal, sistémica, intravenosa, subcutánea, urogenital, tópica, intravítrea, intraocular, ótica, intranasal, transdérmica, intradérmica, dérmica, intraperitoneal, intramuscular, sublingual o administración bucal. La administración "en combinación con" materia adicional tal como uno o más agentes terapéuticos incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "modificación conservadora" y "sustitución conservadora" se refieren a una modificación y una sustitución, respectivamente, que mantiene física, biológica, química y/o funcionalmente las propiedades con respecto a la referencia correspondiente. Una molécula que incluye una secuencia con sustitución conservadora, por ejemplo, tiene un tamaño, forma, carga eléctrica, propiedades químicas similares, incluyendo una capacidad comparable para formar enlaces covalentes o de hidrógeno y/o polaridad comparable. Dichas modificaciones conservadoras incluyen, pero sin limitación, una o más sustituciones, adiciones y supresiones de nucleobases y aminoácidos.
Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen aquellas en las que el resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Por ejemplo, se pueden reemplazar restos de aminoácidos que no son esenciales con respecto a la unión a un antígeno con otro resto de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales, p. ej., la treonina puede ser sustituida por serina. Los restos de aminoácidos se dividen habitualmente en familias basadas en propiedades comunes, similares, de la cadena lateral, tales como: 1. cadenas laterales no polares (p. ej., glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina),
2. cadenas laterales polares sin carga (p. ej., asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, prolina, cisteína, triptófano),
3. cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina, prolina),
4. cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico),
5. cadenas laterales beta-ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y
6. cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).
Se puede interpretar que una sustitución conservadora es una sustitución de un primer aminoácido dentro de uno de los seis grupos anteriores por un aminoácido adicional dentro del mismo grupo de los seis grupos. Las sustituciones conservadoras preferidas incluyen:
1. Sustitución de alanina (A) por valina (V);
2. Sustitución de arginina (R) por lisina (K);
3. Sustitución de asparagina (N) por glutamina (Q);
4. Sustitución del ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E);
5. Sustitución de cisteína (C) por serina (S);
6. Sustitución de ácido glutámico (E) por ácido aspártico (D);
7. Sustitución de glicina (G) por alanina (A);
8. Sustitución de histidina (H) por arginina (R) o lisina (K);
9. Sustitución de isoleucina (I) por leucina (L);
10. Sustitución de metionina (M) por leucina (L);
11. Sustitución de fenilalanina (F) por tirosina (Y);
12. Sustitución de serina (S) por treonina (T);
13. Sustitución de triptófano (W) por tirosina (Y);
14. Sustitución de fenilalanina (F) por triptófano (W); y/o
15. Sustitución de valina (V) por leucina (L)
y viceversa. También son permisibles otras sustituciones tales como la sustitución de prolina (P) por alanina (A) y pueden determinarse de forma empírica o de acuerdo con otras sustituciones conservadoras o no conservadoras conocidas. Una sustitución conservadora también puede implicar el uso de un aminoácido no natural.
Las sustituciones no conservadoras, es decir, el intercambio de miembros de una familia por miembros de otra familia, pueden conducir a cambios sustanciales, p. ej., con respecto a la carga, momento dipolar, tamaño, hidrofilia, hidrofobicidad o conformación del miembro de unión, lo que puede alterar la actividad de unión, en particular si se ven afectados los aminoácidos que son esenciales para la unión a la molécula diana. Una sustitución no conservadora también puede implicar el uso de un aminoácido no natural.
Pueden introducirse modificaciones conservadoras y no conservadoras en los miembros de unión parentales mediante diversas técnicas convencionales conocidas en este campo, tales como la química combinatoria, mutagénesis de ADN dirigida, mutagénesis de casete y/o mediada por p Cr , síntesis química de péptidos/proteínas, introduciendo modificaciones apropiadas en o construyendo una nueva secuencia de ácido nucleico que codifique el miembro de unión y/o una reacción química que modifique específicamente los grupos reactivos en el miembro de unión parental. Las variantes pueden ensayarse mediante métodos rutinarios para determinar sus propiedades químicas, biológicas, biofísicas y/o bioquímicas. Preferentemente, la sustitución de aminoácidos conservadora no cambia sustancialmente las características funcionales y, en general, también estructurales de la secuencia parental. Por consiguiente, las características de unión de un miembro de unión que incluye una sustitución conservadora están al menos esencialmente inalteradas. Asimismo, una sustitución conservadora de aminoácidos, en general, no modifica ni altera sustancialmente una estructura secundaria de la secuencia parental.
El término "marcador" se usa en el presente documento para hacer referencia a cualquier sustancia cuya detección o medición, ya sea directa o indirectamente, por medios físicos o químicos, es indicativo de la presencia de una bioentidad diana seleccionada en una muestra. Los ejemplos representativos de marcadores detectables útiles incluyen, pero sin limitación, moléculas o iones detectables directa o indirectamente en función de las propiedades de absorbancia de la luz, fluorescencia, reflectividad, dispersión de la luz, fosforescencia o luminiscencia, moléculas o iones detectables por sus propiedades radiactivas o moléculas o iones detectables por sus propiedades de resonancia magnética nuclear o paramagnéticas. En algunas realizaciones, un marcador puede ser una molécula que puede detectarse indirectamente en función de la absorbancia de la luz o la fluorescencia, por ejemplo, diversas enzimas que causan que los sustratos apropiados se conviertan, p. ej., de moléculas no absorbentes de la luz a absorbentes de la luz, o de moléculas no fluorescentes a fluorescentes.
Una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un artículo tal como un compuesto, incluyendo un miembro de unión desvelado en el presente documento, es una cantidad, ya sea como dosis única o como parte de una serie de dosis, que en la pauta posológica aplicada produce el efecto terapéutico deseado, es decir, alcanzar un determinado objetivo de tratamiento. Una cantidad terapéuticamente eficaz es, en general, una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento o control de la afección patológica relevante o para retardar o minimizar uno o más síntomas asociados con la presencia de la afección. La dosis dependerá de diversos factores, incluyendo factores clínicos y del paciente (p. ej., la edad, el peso, el sexo, el historial clínico del paciente, la gravedad del trastorno y/o la respuesta al tratamiento), la naturaleza del trastorno que se trata, la composición particular que se va a administrar, la vía de administración y otros factores.
Se entiende que la expresión "consiste esencialmente en" permite la presencia de componentes adicionales en una muestra o una composición que no afectan a las propiedades de la muestra o una composición.
Como ejemplo ilustrativo, una composición farmacéutica puede incluir excipientes si consiste esencialmente en un principio activo.
Dentro del alcance de la presente divulgación, el término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina de longitud completa así como a fragmentos de la misma. Dicha inmunoglobulina de longitud completa puede ser un anticuerpo monoclonal, policlonal, quimérico, humanizado, rechapado y/o humano. Un anticuerpo quimérico puede incluir, p. ej., una región constante de una especie diferente y/o un isotipo diferente o ser una construcción artificial biespecífica o multiespecífica, tal como, p. ej., un cuadroma, un botón en ojal (KIH) o CrossMab o un DuoBody. El término también abarca construcciones donde se fusionan inmunoglobulinas de longitud completa a un fragmento de anticuerpo o un armazón que no es de anticuerpo. Los ejemplos ilustrativos de los mismos, sin limitación, incluyen Bs1Ab, Bs2Ab, Bs3Ab, Bs4Ab, Ts1Ab y Ts2Ab según lo descrito por Dimasi N. et al. (2009), JMB 393, 672-692. Otros anticuerpos quiméricos incluyen DVD-Ig, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, scFv-KIH, FynomAB o BiTE-KIH. Un anticuerpo como se desvela en el presente documento puede, en algunas realizaciones, estar glucosilado en otras realizaciones, el anticuerpo no está glucosilado.
Por "fragmento", en referencia a un polipéptido tal como un anticuerpo o una molécula de unión proteica se entiende cualquier secuencia de aminoácidos presente en un polipéptido correspondiente, siempre que sea más corta que la secuencia de inmunoglobulina de longitud completa y siempre que sea capaz de realizar la función de interés de la proteína, en el caso de un anticuerpo que se une específicamente a la diana deseada, p. ej., antígeno (tal como PD-L1). La expresión "fragmento de anticuerpo" se refiere a una parte de un anticuerpo, con frecuencia la región hipervariable y partes de las cadenas ligeras y pesadas circundantes, que presenta afinidad de unión específica para una diana en particular, normalmente una molécula.
Una región hipervariable es una parte de un anticuerpo que se une físicamente a la diana polipeptídica. Por tanto, un fragmento de anticuerpo incluye o consiste en una o más partes de un anticuerpo de longitud completa que conserva la especificidad de direccionamiento del anticuerpo. Dicho fragmento de anticuerpo puede, por ejemplo, carecer de al menos parcialmente la región constante (región Fc) del anticuerpo de longitud completa. En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo se produce por digestión del anticuerpo de longitud completa. Un fragmento de anticuerpo también puede ser una construcción sintética o recombinante que contiene una o más partes del anticuerpo (ver, p. ej., Holliger P y Hudson J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnol. 2005, vol. 23, 9, pág. 1126). Los ejemplos de un fragmento de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, un scFv, un Fab, un Fv, un Fab', un fragmento F(ab')2, un scFab, un dAb, un VHH, un nanocuerpo, un V(NAR) o una denominada unidad mínima de reconocimiento, un diacuerpo, un diacuerpo monocatenario (scDb), un scDb en tándem (Tandab), un scDb dimérico lineal (LD-scDb), un scDb dimérico circular (CD-scDb), un BiTE (también denominado anticuerpo de interacción con linfocitos T biespecíficas, scFv en tándem o di-scFv en tándem), un DART, un tri-scFv en tándem, un tri(a)cuerpo, Fab2 biespecífico, diminianticuerpo, tetracuerpo, di-diacuerpo o scFab-dsscFv.
Un "fragmento variable monocatenario" o un "anticuerpo monocatenario" o un "scFv" son ejemplos de un tipo de fragmento de anticuerpo. Un scFv es una proteína de fusión que incluye los dominios VH y v L de un anticuerpo conectado por un conector. Por tanto, carece de la región Fc constante que está presente en un anticuerpo de longitud completa.
Un "miembro de unión" como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de unión proteica que comprende una o más CDR y opcionalmente las cadenas ligeras y/o pesadas variables como se desvela en el presente documento. Como tal, la expresión "miembro de unión" comprende anticuerpos (es decir, inmunoglobulinas de longitud completa y fragmentos de anticuerpos como se ha definido anteriormente), armazones proteicos que no son de anticuerpos y/u otros compuestos de unión. En algunas realizaciones, los armazones que no son de anticuerpos comprenden una o más secuencias de CDR desveladas en el presente documento. Dicho miembro de unión puede ser monovalente o multivalente, es decir, que tiene uno o más sitios de unión a antígeno. Los ejemplos no limitantes de miembros de unión monovalentes incluyen scFv, Fab, scFab, dAb, VHH, V(NAR) (o una denominada unidad mínima de reconocimiento), DARPinas, afilinas y nanocuerpos. Un miembro de unión multivalente puede tener dos, tres, cuatro o más sitios de unión a antígeno. Las inmunoglobulinas de longitud completa, fragmentos F(ab')2, bis-scFv (o scFvor BiTE en tándem), DART, diacuerpos, scDb, DVD-Ig, IgG-scFab, scFab-Fc-scFab, IgG-scFv, scFv-Fc, scFv-fc-scFv, Fv2-Fc, FynomAB, cuadroma, CrossMab, DuoBody, triacuerpos y tetracuerpos son ejemplos no limitantes de miembros de unión multivalentes; en los miembros de unión multivalentes ilustrativos, están presentes dos sitios de unión, es decir, el miembro de unión es bivalente. En algunas realizaciones, el miembro de unión multivalente es biespecífico, es decir, el miembro de unión se dirige contra dos dianas diferentes o dos sitios diana diferentes en una molécula diana. Se revisan anticuerpos biespecíficos, p. ej., en Muller D. y Kontermann R.E. Bispecific antibodies.
Editado por Dubel S. Weinheim: Wiley-VCH, 2007. ISBN 3527314539. pág. 345. En algunas realizaciones, el miembro de unión multivalente incluye más de dos, p. ej., tres o cuatro sitios de unión diferentes para tres o cuatro, respectivamente, antígenos diferentes. Dicho miembro de unión es multivalente y multiespecífico, en particular, triespecífico o tetraespecífico, respectivamente.
Los "armazones sin anticuerpos" son polipéptidos de unión a antígeno que se describen, p. ej., en Fielder M. y Skerra A. Non-antibody scaffolds. Editado por Dubel S. Weinheim: Wiley-VCH, 2007. ISBN 3527314539. pág. 467; o Gilbreth R.N. y Koide S. Structural insights for engineering binding proteins based on non-antibody scaffolds. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, vol. 22, pág. 413. Los ejemplos no limitantes incluyen affibodies, moléculas de afilina, AdNectinas, muteínas basadas en polipéptidos de la familia de las lipocalinas (Anticalins®), DARPinas, knotinas, dominios de tipo Kunitz, avímeros, fynomers, tetranectinas y trans-cuerpos. Los avímeros contienen los llamados dominios A que se producen como cadenas de múltiples dominios en varios receptores de superficie celular (Silverman J., et al., Nature Biotechnol.
2005, vol. 23, p.1556). Las tetranectinas, procedentes de la proteína homotrimérica humana respectiva, contienen, de manera análoga, regiones de bucle en un dominio de lectina de tipo C que se puede diseñar para la unión deseada (misma referencia).
Un miembro de unión como se desvela en el presente documento puede estar PEGilado o hiperglucosilado, si se desea, véase también a continuación. En algunas realizaciones, un miembro de unión es una proteína de fusión de una de las moléculas de unión proteicas ilustrativas anteriores y un dominio de unión a albúmina, por ejemplo, un dominio de unión a albúmina de la proteína G estreptocócica. En algunas realizaciones, un miembro de unión es una proteína de fusión de un fragmento de anticuerpo, tal como un diacuerpo monocatenario, y un dominio de unión a anticuerpo, por ejemplo, un dominio de unión a un anticuerpo bacteriano. Como ejemplo ilustrativo, un diacuerpo monocatenario puede fusionarse con el dominio B de la proteína A estafilocócica como se describe en Unverdorben et al. (Protein Eng., Design & Selection, 2012, vol. 25, pág. 81).
La "CI 50" o "concentración inhibidora semimáxima" es una medida de la potencia antagonista y describe de forma cuantitativa la eficacia de un compuesto para inhibir una función biológica o bioquímica. Por consiguiente, este valor indica qué cantidad de un artículo determinado, tal como un miembro de unión, es necesaria para inhibir en un 50 % un determinado proceso o función biológico o bioquímico. Aunque no es un indicador directo de la afinidad, los valores de CI 50 y Ki están correlacionados y se pueden determinar mediante la ecuación de Cheng-Prusoff (Cheng Y. y Prusoff W.H. Relationship between the inhibition constant (Ki) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (IC50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 1973, vol. 22, pág. 3099; Rammes G., et al., PLOSONE 2009, vol. 4, pág. 1-14; Zhen I, et al., Concentration of receptor and ligand revisited in a modified receptor binding protocol for high-affinity radioligands: [3H] spiperone binding to D2 and D3 dopamine receptors. J. Neurosci. Meth.
2010, vol. 188, p.32).
La expresión "región marco" (framework, FR) se refiere al armazón del dominio de anticuerpo variable, ya sea la cadena ligera variable (VL) o la cadena pesada variable (VH), que incluye las CDR respectivas. Una región marco VL y/o VH incluye normalmente cuatro secciones de marco, FR1, FR2, FR3 y FR4, que flanquean las regiones CDR. Por tanto, como se conoce en la técnica, una VL tiene la estructura general: (FR-L1) -(CDR-L1) -(FR-L2) -(CDR-L2) -(FR-L3) -(CDR-L3) -(FR-L4), mientras que una VH tiene la estructura general: (FR-H1) -(CDR-H1) -(FR-H2) -(CDR-H2) -(FR-H3) -(CDR-H3) -(FR-H4).
El término "CDR" se refiere a las regiones hipervariables del anticuerpo que contribuyen principalmente a la unión a antígeno. Normalmente, un sitio de unión a antígeno incluye seis CDR, incluidas en un armazón de región marco. En el presente documento, las CDR de la VL se denominan CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, mientras que las CDR de la VH se denominan CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3.
Estas pueden identificarse como se describe en KABAT, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest.
5a edición. Editado por el Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos. NIH Publications, 1991. pág. 91-3242. CDR-H1, como se usa en este documento, sin embargo, difiere de la definición de Kabat en que comienza con la posición 27 y termina antes de la posición 36 (posiciones 28 a 42 de AHo, inclusive).
Como se usa en el presente documento, el sistema de numeración para identificar las posiciones de los restos de aminoácidos en el VH y VL del anticuerpo corresponde al sistema "AHo" descrito por Honegger A. y Pliickthun A. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: An automatic modelling and analysis tool. J. Mol. Biol. 2001, vol. 309, pág. 657. La publicación proporciona además tablas de conversión entre el sistema de AHo y el de Kabat (Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5a edición. Editado por el Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos. NIH Publications, 1991. n.° 91-3242).
Los anticuerpos "humanizados" se refieren a anticuerpos que incluyen una o más, normalmente las seis regiones CDR de un anticuerpo precursor no humano o variantes del mismo o CDR sintéticas, y cuya región marco es, p. ej., (i) una región marco humana, que incluye potencialmente uno o más restos de la región marco del anticuerpo precursor no humano o (ii) una región marco de un anticuerpo no humano modificado para aumentar la similitud con las regiones marco humanas producidas de forma natural. Se conocen en la técnica métodos de humanización de anticuerpos, p. ej., Leger O. y Saldanha J. Antibody Drug Discovery. Editado por Wood C. Londres: Imperial College Press, 2011.
ISBN 1848166281. pág. 1-23.
El término "aislado" indica que una materia tal como un péptido, una molécula de ácido nucleico o una célula se ha eliminado de su entorno fisiológico normal, p. ej., una fuente natural, o que se sintetiza un péptido o ácido nucleico. El uso del término "aislado" indica que se ha eliminado una secuencia de origen natural de su entorno celular normal (p. ej., cromosómico). Por tanto, la secuencia puede estar en una solución sin células o colocada en un entorno celular diferente. "Aislado" en referencia a un polipéptido o molécula de ácido nucleico significa un polímero de dos o más aminoácidos o nucleótidos acoplados entre sí, que incluyen un molécula polipeptídica o de ácido nucleico que está aislada de una fuente natural o que se ha sintetizado. El término "aislado" no implica que la secuencia sea la única cadena de aminoácidos o de nucleótidos presente, sino que está esencialmente exenta de, p. ej., material distinto de aminoácidos y/o material distinto de ácido nucleico, respectivamente, asociado de forma natural con ella. Una "célula aislada" se refiere a una célula que está separada de los componentes moleculares y/o celulares que acompañan de forma natural a la célula.
El término "identidad", como se usa en el presente documento, se refiere a la coincidencia de secuencias entre dos proteínas o ácidos nucleicos. Las secuencias proteicas o de ácidos nucleicos que se van a comparar se alinean para obtener la máxima correspondencia en una ventana de comparación, por ejemplo, usando herramientas bioinformáticas tales como EMBOSS Needle (alineación por pares; disponible en www.ebi.ac.uk o por alineación manual e inspección visual. Cuando la misma posición en las secuencias que se van a comparar está ocupada por la misma nucleobase o resto de aminoácido, entonces las moléculas respectivas son idénticas en esa misma posición. Por consiguiente, el "porcentaje de identidad" está en función del número de posiciones coincidentes dividido por el número de posiciones comparadas y multiplicado por el 100 %. Por ejemplo, si 6 de cada 10 posiciones de secuencia son idénticas, entonces la identidad es del 60 %. La alineación de secuencias para lograr la máxima correspondencia puede requerir la introducción de huecos. El porcentaje de identidad entre dos secuencias proteicas puede, p. ej., determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needlemann S.B. y Wunsch C.D. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J. Mol. Biol. 1970, vol. 48, pág. 443) que se ha incorporado a EMBOSS Needle, usando una matriz BLOSUM62, una "penalización por apertura de hueco" de 10, una "penalización por extensión de hueco" de 0,5, una falsa "penalización por hueco final", una "penalización por apertura de hueco final" de 10 y una "penalización por extensión de hueco final" de 0,5, o se puede usar un método para alinear secuencias introduciendo espacios manualmente de una manera que maximice la identidad. Por tanto, en una realización, las secuencias desveladas en el presente documento se alinean mediante la introducción manual de huecos de una manera que maximice la identidad de secuencia. Dos moléculas que tienen la misma secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos primarios son idénticas independientemente de cualquier modificación química y/o biológica. Por ejemplo, dos anticuerpos que tienen la misma secuencia de aminoácidos primaria pero diferentes patrones de glucosilación son idénticos según esta definición. En el caso de los ácidos nucleicos, por ejemplo, dos moléculas que tienen la misma secuencia pero diferentes componentes de unión, tales como tiofosfato en lugar de fosfato, son idénticas según esta definición. Una secuencia que sea más larga que cualquiera de las secuencias proporcionadas en el presente documento, por ejemplo, porque comprende varios dominios variables o uno o más dominios constantes, no obstante, será idéntica a la secuencia de referencia desvelada en el presente documento si se proporciona la identidad de secuencia en una ventana de comparación. Una ventana de comparación como se usa en el presente documento incluye la secuencia completa como se reivindica. De manera similar, las nucleobases que difieren solo debido a modificaciones exocíclicas, por ejemplo, citosina y 5-metil-citosina, son idénticas según esta definición.
La expresión "molécula de ácido nucleico" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier ácido nucleico en cualquier configuración posible, tal como monocatenario, bicatenario o una combinación de los mismos. Los ejemplos de ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN, moléculas de ARN, análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos o usando química de ácidos nucleicos, moléculas de ácido nucleico bloqueadas (LNA), moléculas de ácidos nucleicos proteicos (PNA), moléculas de ácido nucleico de alquilfosfonato y alquilfosfotriéster y moléculas de tecto-ARN (p. ej., Liu B. et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, vol. 126, 4076). El LNA tiene una cadena principal de ARN modificada con un enlace de metileno entre C4' y 02', lo que proporciona a la molécula respectiva una mayor estabilidad bicatenaria y resistencia a las nucleasas. Las moléculas de ácido nucleico de alquilfosfonato y alquilfosfotriéster pueden verse como una molécula de ADN o ARN, en la que los grupos fosfato de la cadena principal del ácido nucleico se neutralizan intercambiando los grupos P-OH de los grupos fosfato en la cadena principal del ácido nucleico por un grupo alquilo y por uno alcoxi, respectivamente. El ADN o ARN puede ser de origen genómico o sintético y puede ser mono o bicatenario. Dicho ácido nucleico puede ser, p. ej., ARNm, ARNc, ARN sintético, ADN genómico, ADN sintético de ADNc, un copolímero de ADN y ARN, oligonucleótidos, etc. Un ácido nucleico respectivo puede contener además análogos de nucleótidos no naturales y/o estar ligado a una etiqueta de afinidad o a un marcador.
Se conocen muchos análogos de nucleótidos y pueden usarse en ácidos nucleicos usados en los métodos divulgados en la presente memoria descriptiva. Un análogo de nucleótido es un nucleótido que contiene una modificación en, por ejemplo, los restos de base, azúcar o fosfato. Como ejemplo ilustrativo, se sabe que una sustitución de restos 2'-OH de ARNip por restos de 2'F, 2'O-Me o 2'H mejora la estabilidad in vivo del ARN respectivo. Las modificaciones en el resto de base pueden ser una modificación natural o sintética de A, C, G y T/U, una base de purina o pirimidina diferente, tal como uracil-5-ilo, hipoxantina-9-ilo y 2-aminoadenin-9-ilo, así como una base nucleotídica distinta de purina o distinta de pirimidina. Otros análogos de nucleótidos actúan como bases universales. Los ejemplos de bases universales incluyen 3-nitropirrol y 5-nitroindol. Las bases universales pueden formar un par de bases con cualquier otra base. Las modificaciones de bases se pueden combinar con frecuencia, por ejemplo, con una modificación de azúcar, tal como, por ejemplo, 2'-O-metoxietilo, p. ej., para lograr propiedades únicas tales como una mayor estabilidad bicatenaria.
Como se usa en este documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a los compuestos activos, materiales, composiciones, vehículos y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance del buen criterio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de los seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
El término "prevenir" en el contexto médico/fisiológico, es decir, en el contexto de un estado fisiológico, se refiere a disminuir la probabilidad de que un organismo se contraiga o desarrolle una condición anómala.
Las secuencias proteicas "similares" son las que, cuando se alinean, comparten restos de aminoácidos similares y, con mucha frecuencia, pero no obligatoriamente, restos de aminoácidos idénticos en las mismas posiciones de las secuencias que se van a comparar. Los restos de aminoácidos similares se agrupan en familias según las características químicas de las cadenas laterales. Estas familias se han descrito anteriormente para "sustituciones conservadoras de aminoácidos". El "porcentaje de similitud" entre secuencias es el número de posiciones que contienen restos idénticos o similares en las mismas posiciones de secuencia de las secuencias que se van a comparar dividido por el número total de posiciones comparadas y multiplicado por el 100 %. Por ejemplo, si 6 de 10 posiciones de secuencia tienen restos de aminoácidos idénticos y 2 de 10 posiciones contienen restos similares, entonces las secuencias tienen un 80 % de similitud. La similitud entre dos secuencias se puede determinar, p. ej., usando EMBOSS Needle. Una secuencia que sea más larga que cualquiera de las secuencias proporcionadas en el presente documento, por ejemplo, porque comprende varios dominios variables o uno o más dominios constantes, no obstante, será similar a la secuencia de referencia desvelada en el presente documento si se proporciona la similitud de secuencia en una ventana de comparación. Una ventana de comparación como se usa en el presente documento incluye la secuencia completa como se reivindica.
Se entiende que el término "específico", como se usa en este documento, indica que un miembro de unión o un compuesto de unión se une a una diana definida tal como PD-L1 con una constante de unión en equilibrio Kd de <10­ 6 molar. Esta constante se puede determinar, p. ej., usando una microbalanza de cristal de cuarzo (Quartz Crystal Microbalance, QCM) en un instrumento Attana, tecnología de resonancia de plasmón superficial (RPS) en un instrumento BIACORE o ensayo de exclusión cinética (KinExA®).
Los términos "estratificar" y "estratificación" como se usan en el presente documento indican que un individuo está asignado a un cierto grupo según características que coinciden con el grupo respectivo, tales como una probabilidad correspondiente de responder a un miembro de unión desvelado en el presente documento. Los grupos pueden usarse, por ejemplo, para ensayar, prescribir, ajustar la dosificación, suspender o abandonar un miembro de unión. Por consiguiente, en algunas realizaciones de un método o uso según la invención, un sujeto puede estratificarse en un subgrupo de un ensayo clínico de una terapia.
El término "sujeto", como se usa en el presente documento, también denominado individuo, se refiere a un ser humano o animal no humano, en general, un mamífero. Un sujeto puede ser una especie de mamífero tal como un conejo, un ratón, una rata, una cobaya, un hámster, un perro, un gato, un cerdo, una vaca, una cabra, una oveja, un caballo, un mono, un simio o un ser humano. Por tanto, los métodos, usos y composiciones descritos en el presente documento son aplicables tanto a enfermedades humanas como veterinarias. Como se explica en más detalle a continuación, la muestra puede obtenerse del sujeto. Por tanto, se entiende que las conclusiones extraídas de los niveles de expresión en la muestra y las decisiones basadas en ellos se refieren al sujeto de quien/del que se ha tomado la muestra. Además, aunque un sujeto es normalmente un organismo vivo, también puede usarse un método o uso descrito en el presente documento en análisis postmortem. Cuando el sujeto es un ser humano vivo recibe atención médica por una enfermedad o afección, también se denomina "paciente".
Los términos "tratamiento" y "tratar", como se usan en el presente documento, incluyen una medida profiláctica o preventiva que tiene un efecto terapéutico y/o prevención, ralentización (disminución) o al menos alivio parcial o anulación de una afección anómala, incluyendo patológica, en el organismo de un sujeto. El tratamiento según la presente divulgación implica la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de una molécula como se ha descrito en el presente documento, es decir, entre otras cosas, el miembro de unión (tal como un anticuerpo), ácido nucleico, vector o célula desvelados en el presente documento, a un sujeto que lo necesite para prevenir, curar, retardar la aparición y/o progresión, reducir la gravedad de, estabilizar, modular, curar o aliviar uno o más síntomas de un trastorno relacionado con PD-L1. Normalmente, el miembro de unión, ácido nucleico, vector o célula hospedadora se proporciona en una composición farmacéutica que incluye las descritas anteriormente en el presente documento. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya padecen el trastorno, así como los propensos a tener el trastorno o en los que se debe prevenir el trastorno (profilaxis). En general, un tratamiento reduce, estabiliza o inhibe la progresión de un síntoma que está asociado con la presencia y/o progresión de una enfermedad o proceso patológico.
Como se usa en el presente documento, "PD-L1" se refiere a la proteína también conocida como "ligando 1 de muerte celular programada", "grupo de diferenciación 274 (es decir, CD274)" u "homólogo 1 de B7 (es decir, B7-H1)". La proteína nativa comprende dos dominios extracelulares, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático. El término abarca PD-L1 de longitud completa y/o sin procesar, así como cualquier producto intermedio resultante del procesamiento en la célula. PD-L1 puede existir como proteína transmembrana o como proteína soluble; por tanto, el término como se usa en el presente documento puede referirse a la longitud completa o al dominio extracelular de la proteína. El término también abarca variantes de origen natural de PD-L1, p. ej., variantes de corte y empalme o variantes alélicas. La proteína puede contener adicionalmente un marcador, tal como un marcador his o un marcador Fc. La secuencia de aminoácidos de la proteína PD-L1 de longitud completa humana ilustrativa se puede encontrar, por ejemplo, con el número de referencia de la base de datos de proteínas del NCBI NP 054862. El término "hPD-L1" se refiere a PD-L1 humano y comprende hPD-L1 natural y rhPD-L1 humano recombinante. "rPD-L1" se refiere a PD-L1 recombinante. El PD-L1 recombinante puede tener o no un resto de metionina amino terminal, dependiendo del método por el que se prepare. "rhPD-L1" se refiere a PD-L1 humano recombinante. De manera análoga, el PD-L1 también se puede obtener mediante aislamiento de muestras biológicas de origen humano o no humano. rhPD-L1 puede obtenerse, p. ej., de RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 156-B7, o de Peprotech, Estados Unidos, n.° de cat. 310-35. "PD-L1 de mono" se refiere a PD-L1 de macaco de la India (Macaca mulatta). La secuencia de aminoácidos de la proteína PD-L1 de mono ilustrativa se puede encontrar, p. ej., con el número de referencia de la base de datos de proteínas del NCBI NP 001077358. El PD-L1 de mono puede obtenerse, p. ej., de Sino Biological, China, n.° de cat. 90251-C02H. "PD-L1 de rata" se refiere a PD-L1 de Rattus norvegicus (rata noruega). La secuencia de aminoácidos de la proteína PD-L1 de rata ilustrativa se puede encontrar, p. ej., con el número de referencia de la base de datos de proteínas del NCBI NP_OOl 178883. El PD-L1 de rata se puede obtener, p. ej., de Sino Biological, China, n.° de cat. 80450-R02H. "PD-L1 de ratón" se refiere a PD-L1 de Mus musculus. La secuencia de aminoácidos de la proteína PD-L1 de ratón ilustrativa se puede encontrar, p. ej., con el número de referencia de la base de datos de proteínas del NCBI NP_068693. El PD-L1 de ratón se puede obtener, p. ej., de Sino Biological, China, n.° de cat.
50010-M03H o de RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 1019-B7-100.
"PD-1" es la proteína 1 de muerte celular programada, también conocida como CD279 es un receptor de superficie celular para PD-L1. PD-1 se une a dos ligandos, PD-L1 y PD-L2. PD-1 es una proteína transmembrana que incluye un dominio extracelular seguido de una región transmembrana y un dominio intracelular. El término abarca PD-1 de longitud completa y/o sin procesar, así como cualquier producto intermedio resultante del procesamiento en la célula. PD-1 puede existir como proteína transmembrana o como proteína soluble; por tanto, el término como se usa en el presente documento puede referirse a la longitud completa o al dominio extracelular de la proteína. El término también abarca variantes de origen natural de PD-1, p. ej., variantes de corte y empalme o variantes alélicas. La proteína puede contener adicionalmente un marcador, tal como un marcador his o un marcador Fc. La secuencia de aminoácidos de la proteína PD-1 humana ilustrativa se puede encontrar, por ejemplo, con el número de referencia de la base de datos de proteínas del NCBI NP 005009. El término "hPD-1" se refiere a la PD-1 humana y comprende su forma natural (hPD-1) así como la forma humana recombinante (rhPD-1). "rPD-1" se refiere a PD-1 recombinante.
"CD80" se refiere al grupo de diferenciación 80, también conocido como B7-1, B7.1, BB1, CD28LG, CD28LG1, LAB7. Es un receptor de membrana para CD28 y CTLA-4 así como para PD-L1 y comprende un dominio extracelular seguido de una región transmembrana y un dominio intracelular. El término abarca CD80 de longitud completa y/o sin procesar, así como cualquier producto intermedio resultante del procesamiento en la célula. CD80 puede existir como proteína transmembrana o como proteína soluble; por tanto, el término como se usa en el presente documento puede referirse a la longitud completa o al dominio extracelular de la proteína. El término también abarca variantes de origen natural de CD80, p. ej., variantes de corte y empalme o variantes alélicas. La proteína puede contener adicionalmente un marcador, tal como un marcador his o un marcador Fc. La secuencia de aminoácidos de la proteína CD80 humana ilustrativa se puede encontrar, p. ej., con el número de referencia de la base de datos de proteínas del NCBI NP 005182. CD80 se puede obtener, p. ej., de RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 9050-BM00. El término "hCD80" se refiere a CD80 humano y comprende su forma natural (hCD80) así como la forma humana recombinante (rhCD80). "rCD80" se refiere a CD80 recombinante.
"PD-L2" se refiere a la proteína también conocida como "ligando 2 de muerte celular programada 1", "B7-DC" o "CD273" (grupo de diferenciación 273). El término, como se usa en el presente documento, abarca PD-L2 de longitud completa y/o sin procesar, así como cualquier intermedio resultante del procesamiento en la célula. PD-L2 puede existir como proteína transmembrana o como proteína soluble; por tanto, el término como se usa en el presente documento puede referirse a la longitud completa o al dominio extracelular de la proteína. El término también abarca variantes de origen natural de PD-L2, p. ej., variantes de corte y empalme o variantes alélicas. La proteína puede contener adicionalmente un marcador, tal como un marcador his o un marcador Fc. La secuencia de aminoácidos de la proteína PD-L2 humana ilustrativa de longitud completa se puede encontrar, p. ej., con el número de referencia de la base de datos de proteínas del NCBI NP 079515. PD-L2 se puede obtener, p. ej., de RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 1224-PL. El término "rhPD-L2" se refiere a PD-L2 humano recombinante.
"B7-H3" se refiere a la proteína también conocida como CD276 (grupo de diferenciación 276). El término, como se usa en el presente documento, abarca B7-H3 de longitud completa y/o sin procesar, así como cualquier intermedio resultante del procesamiento en la célula. B7-H3 puede existir como proteína transmembrana o como proteína soluble; por tanto, el término como se usa en el presente documento puede referirse a la longitud completa o al dominio extracelular de la proteína. El término también abarca variantes de origen natural de B7-H3, p. ej., variantes de corte y empalme o variantes alélicas. La proteína puede contener adicionalmente un marcador, tal como un marcador his o un marcador Fc. La secuencia de aminoácidos de la proteína B7-H3 humana ilustrativa de longitud completa se puede encontrar, p. ej., con el número de referencia de la base de datos de proteínas del NCBI NP 079516. B7-H3 se puede obtener, p. ej., de RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 1027-B3. El término "rhB7-H3" se refiere a B7-H3 humano recombinante.
Una "variante" se refiere a una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico que difiere de la secuencia original en virtud de la adición (incluyendo las inserciones), supresión, modificación y/o sustitución de uno o más restos de aminoácidos o nucleobases conservando al mismo tiempo al menos una actividad deseada de la secuencia original desvelada en el presente documento. En el caso de anticuerpos, dicha actividad deseada puede incluir la unión a antígenos específicos. De manera similar, una secuencia de ácido nucleico variante puede modificarse en comparación con la secuencia original en virtud de la adición, supresión y/o sustitución de una o más nucleobases, pero el anticuerpo codificado conserva la actividad deseada como se ha descrito anteriormente. Las variantes pueden ser de origen natural, tales como variantes alélicas o de corte y empalme, o pueden construirse artificialmente.
Las reacciones de hibridación de ácidos nucleicos se pueden realizar en condiciones de diferente rigurosidad. Las "condiciones rigurosas" son ampliamente conocidas y están publicadas en la técnica. Normalmente, durante la reacción de hibridación se puede usar un tampón basado en SSC en el que SSC es NaCl 0,15 M y tampón de citrato 15 mM que tiene un pH de 7,0. El aumento de las concentraciones de tampón y la presencia de un agente desnaturalizante aumentan la rigurosidad de la etapa de hibridación. Por ejemplo, las condiciones de hibridación de alta rigurosidad pueden implicar el uso de (i) formamida al 50 % (vol/vol), SSC 5 x (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1 %, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), s Ds al 0,1 % y sulfato de dextrano al 10 % a 42 °C con lavados a 42 °C en s Sc 0,2 x y SDS al 0,1 %; (ii) formamida al 50 % (vol/vol) con seroalbúmina bovina al 0,1 %/Ficoll al 0,1 %/polivinilpirrolidona al 0,1 %/tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C o (iii) sulfato de dextrano al 10 %, SSC 2 x y formamida al 50 % a 55 °C, seguido de un lavado muy riguroso que consiste en SSC 0,1 x que contiene EDTA a 55 °C. Adicionalmente, o como alternativa, se pueden incluir una, dos o más etapas de lavado usando soluciones de lavado de baja fuerza iónica y alta temperatura en el protocolo de hibridación usando, por ejemplo, cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecilsulfato de sodio al 0,1 % a 50 °C.
El alcance y el significado de cualquier uso de un término resultarán evidentes a partir del contexto específico en el que se usa el término. Ciertas definiciones adicionales para términos seleccionados usados a lo largo del presente documento se dan en el contexto apropiado de la descripción detallada, según corresponda.
Las expresiones "que comprende", "que incluye", "que contiene", "que tiene", etc. se leerán de forma amplia o abierta y sin limitación. Las formas singulares tales como "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a un "vector" incluye un solo vector, así como una pluralidad de vectores, ya sea el mismo, por ejemplo, el mismo operón, o diferente. Asimismo, la referencia a una "célula" incluye una única célula así como una pluralidad de células. Salvo que se indique otra cosa, debe entenderse que la expresión "al menos" que precede a una serie de elementos se refiere a todos los elementos de la serie. Las expresiones "al menos uno" y "al menos uno de" incluyen, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco o más elementos. Asimismo, se entiende que se pueden usar ligeras variaciones por encima y por debajo de un intervalo establecido para lograr sustancialmente los mismos resultados que un valor dentro del intervalo. Además, salvo que se indique otra cosa, se entiende la divulgación de intervalos como un intervalo continuo que incluye todos los valores entre los valores mínimo y máximo.
Cualquier realización enumerada de forma específica y explícita en el presente documento puede constituir la base de una exención de responsabilidad, ya sea sola o en combinación con una o más realizaciones adicionales.
Salvo que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto habitual en la materia a la que pertenecen las invenciones descritas en el presente documento.
Se describen diversos aspectos de la divulgación con más detalle en las siguientes subsecciones. Se entiende que las diversas realizaciones, preferencias e intervalos pueden combinarse a voluntad.
Además, dependiendo de la realización específica, pueden no corresponder las definiciones, realizaciones o rangos seleccionados.
Caracterización de miembros de unión
Los miembros de unión proporcionados en el presente documento se unen específicamente a PD-L1. La especificidad de unión del miembro de unión se puede verificar usando técnicas bien conocidas en este campo. En algunas realizaciones, el PD-L1 es el PD-L1 humano.
La unión del miembro de unión a PD-L1 bloquea la interacción de PD-L1 con PD-1 y/o CD80, preferentemente con PD-1 y CD80.
En algunas realizaciones, el miembro de unión proporcionado en el presente documento es bivalente y se une a hPD-L1 con una Kd de menos de 10 pM medido por KinExA®, preferentemente inferior a 5 pM, más preferentemente aproximadamente 3 pM, p. ej., 2,9 pM, 2,8 pM o 2,7 pM. En algunas realizaciones, dicho miembro de unión bivalente es una inmunoglobulina de longitud completa. En una realización, dichas mediciones de KinExA® para miembros de unión bivalentes se realizan a temperatura ambiente. En una realización, el miembro de unión es bivalente y las condiciones especificadas en el ejemplo 9 se usan para las mediciones de KinExA®.
En algunas realizaciones, el miembro de unión proporcionado en el presente documento es monovalente y se une a hPD-L1 con una Kd de menos de 50 pM medido por KinExA®. Dicho Kd es preferentemente inferior a 10 pM, tal como aproximadamente 9 pM, p. ej., 9,0 pM, 8,9 pM, 8,8 pM u 8,7 pM. En una realización, dichas mediciones de KinExA® para miembros de unión monovalentes se realizan a temperatura ambiente. En una realización, el miembro de unión es monovalente y las condiciones especificadas en el ejemplo 4 se usan para las mediciones de KinExA®.
En algunas realizaciones, dicho miembro de unión monovalente es un scFv. En algunas realizaciones, dicho miembro de unión monovalente es un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 60 kDa o menos, tal como aproximadamente 55 kDa, 50 kDa, 45 kDa, 40 kDa, 35 kDa, 30 kDa o 27 kDa o menos. En una realización, el peso molecular del miembro de unión es de aproximadamente 26 kDa, tal como 23, 24, 25, 26 o 27 kDa. En particular para el tratamiento del cáncer, los fragmentos de anticuerpos pueden tener ventajas sobre los anticuerpos de longitud completa cuando se dirigen a la ruta de señalización PD-1:PD-L1 (Maute et al. (2015), PNAS, 24 de noviembre; 112 (47): E6506-E6514). Debido a su menor tamaño, se cree que los fragmentos de anticuerpos penetran más profundamente en los tumores que en el caso de los anticuerpos de longitud completa, que normalmente tienen un peso molecular de aproximadamente 150 kDa, o cualquier otro formato de anticuerpo que tenga un peso molecular similar o mayor. Otro inconveniente asociado con los anticuerpos de longitud completa, en particular IgG, es su capacidad para mediar en respuestas inmunitarias citotóxicas a través de su región Fc (p. ej., CCDA/FCDA o CDC). Esta inhibición puede ser indeseable cuando se dirige al eje PD-1:PD-L1 ya que ambas proteínas se expresan en la superficie de linfocitos T citotóxicos antitumorales. Por lo tanto, la administración de anticuerpos monoclonales de longitud completa con partes funcionales de Fc puede dar lugar al agotamiento de los mismos linfocitos que están destinados a activar.
Se encontró que el tratamiento con anticuerpos anti-PD-1 se correlaciona con un menor número de linfocitos T en circulación en los pacientes. Por lo tanto, fragmentos de anticuerpos que tienen un peso molecular pequeño (p. ej., 60 kDa o menos, tal como aproximadamente 55 kDa, 50 kDa, 45 kDa, 40 kDa, 35 kDa, 30 kDa o 27 kDa o menos) pueden ofrecer una alternativa más eficaz a las terapias de anticuerpos de longitud completa en el tratamiento del cáncer. Por tanto, en realizaciones preferidas, el miembro de unión es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', scFab, scFv, fragmento Fv, nanocuerpo, VHH, dAb, unidad mínima de reconocimiento, diacuerpo, diacuerpo monocatenario (scDb), BiTE o DART. Dichos formatos tienen un peso molecular inferior a 60 kDa y no comprenden un dominio Fc.
El tamaño y/o arquitectura del miembro de unión tiene implicaciones en su semivida. Para disminuir los efectos secundarios en un entorno terapéutico, puede resultar ventajoso usar miembros de unión con una semivida corta. Esto se puede lograr, p. ej., usando un miembro de unión que carece de una parte Fc o que tiene una parte Fc modificada.
En determinadas aplicaciones puede resultar ventajoso inducir respuestas inmunitarias citotóxicas y/o activar el complemento y, por lo tanto, puede desearse la presencia de un dominio Fc. Por tanto, en una realización, el miembro de unión comprende un dominio Fc que es capaz de mediar en respuestas inmunitarias citotóxicas. Son ejemplos no limitantes de miembros de unión que incluyen un dominio Fc inmunoglobulinas de longitud completa, DVD-Ig, fusiones scFv-Fc y scFv-Fc.scFv, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, fusiones IgG-scFv (tales como, p. ej., bsAb, Bs1Ab, Bs2Ab, Bs3Ab, Ts1Ab, Ts2Ab, botones en ojales (Knob-into-Holes, KiHs)), DuoBody, CrossMab.
En una realización, el miembro de unión comprende un dominio Fc y/o bisagra que está modificado de manera que no induzca respuestas inmunitarias citotóxicas y/o no active el complemento. Dicho dominio Fc inactivado y/o bisagra se puede crear introduciendo una o más sustituciones como se piensa en la técnica. Dicho miembro de unión tiene la ventaja de una semivida aumentada en comparación con los fragmentos de anticuerpos que tienen un peso molecular inferior a 60 kDa, sin mediar en las respuestas inmunitarias citotóxicas.
En una realización, el derivado del miembro de unión carece de un dominio Fc. Son miembros de unión ilustrativos que carecen de un dominio Fc Fab, Fab', scFab, scFv, fragmento Fv, nanocuerpo, VHH, unidad mínima de reconocimiento, diacuerpo, diacuerpo monocatenario (scDb), scDb en tándem (Tandab), un scDb dimérico lineal (LD-scDb), scDb dimérico circular (CD-scDb), BiTE (también denominado di-scFv en tándem o scFv en tándem), tri-scFv en tándem, tri(a)cuerpo, Fab2 biespecífico, di-minianticuerpo, di-diacuerpo, scFab-dsscFv o DART.
En una realización, el miembro de unión comprende una región constante seleccionada del grupo que consiste en el isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humano.
En una realización, el miembro de unión comprende una región constante seleccionada del grupo que consiste en el isotipo IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3 murino.
La divulgación proporciona un miembro de unión contra PD-L1, que comprende
(a) al menos una de las secuencias de CDR VH CDR-H1, CDR-H2 o CDR-H3 como se expone en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, o variantes de las mismas; y/o
(b) al menos una de las secuencias de CDR VL CDR-L1, CDR-L2 o CDR-L3 como se expone en las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, o variantes de las mismas. En algunas realizaciones, el miembro de unión incluye al menos CDR-L3 de SEQ ID NO: 5 y/o CDR-H3 de SEQ ID NO: 8, o variantes de las mismas. En algunas realizaciones, el miembro de unión incluye dos secuencias de CDR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, o variantes de las mismas. En algunas realizaciones, el miembro de unión incluye dos secuencias de CDR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, o variantes de las mismas. En algunas realizaciones, el miembro de unión comprende las tres CDR de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8 o variantes de las mismas. En algunas realizaciones, el miembro de unión comprende las tres CDR de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5 o variantes de las mismas. Preferentemente, un miembro de unión incluye todas las CDR expuestas en las SEQ ID NO: 3-8, o variantes de las mismas.
Los miembros de unión proporcionados en el presente documento poseen una fuerte afinidad de unión por PD-L1 humano. Por ejemplo, dicho miembro de unión es capaz de unirse a PD-L1 humano con una constante de unión en equilibrio Kd de menos de 100 pM, preferentemente inferior a 75 pM, 50 pM, 25 pM, 15 pM, más preferentemente la Kd es de aproximadamente 10 pM o menos, tal como aproximadamente 9 pM (p. ej., 9,0 pM, 8,9 pM, 8,8 pM u 8,7 pM), 8 pM, 7 pM, 6 pM, 4 pM, 3 pM (2,9 pM, 2,8 pM o 2,7 pM) o menos. Las afinidades se pueden determinar como se describe en la sección de ejemplos a continuación u otros métodos disponibles en la técnica. En una realización preferida, la afinidad se determina mediante el ensayo de exclusión cinética (KinExA®) a temperatura ambiente, más preferentemente en las condiciones indicadas en el ejemplo 4 para miembros de unión monovalentes o en el ejemplo 9 para miembros de unión bivalentes.
El miembro de unión descrito en el presente documento puede ser, esencialmente consistir en o incluir un anticuerpo (tal como una inmunoglobulina de longitud completa) o un fragmento de anticuerpo (tal como un Fab, Fab', F(ab')2, scFab, scFv, fragmento Fv, nanocuerpo, VHH o unidad de reconocimiento mínima) o un armazón distinto de anticuerpo. Algunos miembros de unión incluyen una o más copias de cadenas ligeras y/o pesadas variables como se desvela en el presente documento, p. ej., un formato seleccionado del grupo que consiste en scFv en tándem, diacuerpos o diacuerpos monocatenarios (scDb), scDb en tándem, scDb dimérico lineal, scDb dimérico circular, un BiTE; un tri-scFv en tándem, un tri(a)cuerpo, Fab2 biespecífico, di-minianticuerpo, IgG, triacuerpo, tetracuerpo, fusión scFv-Fc-scFv, di-diacuerpo, DVD-lg, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc o una fusión IgG-scFv (incluyendo, sin limitación, Bs1Ab, Bs2Ab, Bs3Ab, Bs4Ab, Ts1Ab y Ts2Ab), cuadroma, botón en ojal (KIH), anticuerpos biespecíficos, CrossMabs y DuoBodies.
En algunas realizaciones, el miembro de unión y en particular el fragmento de anticuerpo monovalente anterior es un scFv. Los dominios VH y VL se pueden conectar en cualquier orientación, VL-conector-VH o VH-conector-VL, mediante un conector flexible. En una realización preferida, la orientación es VL-conector-VH, es decir, la región variable de cadena ligera está en el extremo N-terminal y la región variable de cadena pesada está en el extremo C-terminal del polipéptido.
El miembro de unión es preferentemente un miembro de unión humanizado, tal como un anticuerpo humanizado, en particular un fragmento de anticuerpo humanizado, tal como un scFv. El miembro de unión puede ser monoclonal y/o quimérico.
Por tanto, en algunas realizaciones, el miembro de unión incluye una región de cadena pesada variable del subtipo VH3 y/o una región de cadena ligera variable del subtipo Vkappa1.
El miembro de unión comprende la secuencia VH de la SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma. Dicha variante tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más preferentemente 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. Dicho de otra manera, en una realización, el miembro de unión comprende una secuencia VH que tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más preferentemente 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2.
Adicionalmente, el miembro de unión desvelado en el presente documento comprende la secuencia VL de la SEQ ID NO: 1, o una variante de la misma. Dicha variante tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más preferentemente 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. Dicho de otra manera, en una realización, el miembro de unión comprende una secuencia VL que tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más preferentemente 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1.
En una realización, dicho miembro de unión comprende una secuencia VH que tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más preferiblemente 100 % de similitud de secuencia con la SEQ ID NO: 2. Adicionalmente, o como alternativa, el miembro de unión comprende una secuencia VL que tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más preferiblemente 100 % de similitud de secuencia con la SEQ ID NO: 1.
En una realización muy preferida, el miembro de unión comprende el VL como se expone en la SEQ ID NO: 1 y el VH como se expone en la SEQ ID NO: 2. Las secuencias marco tanto de la SEQ ID NO: 1 como de la SEQ ID NO: 2 proceden de una inmunoglobulina humana descrita en el documento WO 03/097697 A (ESBATech AG). Sus secuencias marco VH y VL se han modificado para la humanización y estabilización de anticuerpos de conejo, véase, p. ej., el documento WO 2009/155726 A (ESBATech, AN ALCON BIOMEDICAL RESEARCH UNIT LLC); Borras, L., et al., JBC 2010, vol. 285 (12), pág. 9054.
En algunas realizaciones, el miembro de unión comprende una o más, preferentemente todas las secuencias marco de VL seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12 a 15.
En algunas realizaciones, el miembro de unión comprende una o más, preferentemente todas las secuencias marco de VH seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16 a 19.
El miembro de unión, por ejemplo, en el caso de un scFv o una molécula biespecífica tal como un scFv en tándem, un diacuerpo o un diacuerpo monocatenario, puede comprender una secuencia conectora. En el caso de un scFv, dicha secuencia conectora tiene de diez a aproximadamente 25 aminoácidos. Normalmente, un péptido conector es rico en glicinas, que confieren flexibilidad, así como serinas y/o treoninas para mejorar la solubilidad. En una realización preferida, se usa un conector (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 10) o una variante del mismo. También se pueden usar variaciones de dicho motivo que tienen de dos a cinco repeticiones. Se describen otros conectores adecuados, p. ej., en Alfthan, K., Protein Eng 1995, vol. 8 (7), pág. 725.
Por tanto, en una realización, dicho miembro de unión comprende, tiene, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que incluye la SEQ ID NO. 9. En algunas realizaciones, el miembro de unión comprende, tiene, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que incluye la SEQ ID NO. 11.
En determinadas realizaciones, se contemplan variantes del miembro de unión proporcionado en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la unión a antígenos, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA), la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), reducir la susceptibilidad a la proteólisis y/o la susceptibilidad a la oxidación, aumentar la estabilidad o la solubilidad, disminuir la inmunogenicidad y/o alterar otras propiedades biológicas, bioquímicas o biofísicas del miembro de unión. En algunas realizaciones, la variante no muestra ninguna mejora con respecto al miembro de unión original. En algunas realizaciones, una variante puede ser una molécula proteica que difiere de un miembro de unión dado, en uno, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones de su secuencia de aminoácidos. Dicha diferencia puede ser, por ejemplo, una sustitución, adición, modificación o supresión.
Las variantes de los miembros de unión proporcionados en el presente documento pueden prepararse mediante ingeniería de proteínas y/o química, introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de ácido nucleico que codifica el miembro de unión o mediante síntesis de proteínas/péptidos. Se puede realizar cualquier combinación o combinaciones de supresiones, sustituciones, adiciones, modificaciones e inserciones en el marco o en las CDR, siempre que el miembro de unión generado posea las características deseadas para las que se pueda cribar usando métodos apropiados. Son de particular interés las sustituciones, preferentemente las sustituciones conservadoras como se han descrito anteriormente.
El miembro de unión descrito en el presente documento puede comprender una o más, tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más de dichas sustituciones conservadoras. Las sustituciones no conservadoras pueden conducir a cambios más sustanciales, p. ej., con respecto a la carga, momento dipolar, tamaño, hidrofilia, hidrofobicidad o conformación del polipéptido. En una realización, el miembro de unión comprende una o más, tales como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más de dichas sustituciones no conservadoras.
Pueden estar presentes modificaciones en las CDR y/o en las secuencias marco. Por ejemplo, las CDR proporcionadas en el presente documento pueden comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o incluso más modificaciones. Por ejemplo, las secuencias de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 tomadas en su conjunto son al menos un 75 %, preferentemente al menos un 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o más preferentemente un 99 % idénticas a las CDR proporcionadas en el presente documento, en particular a las SEQ ID NO: 3, 4 y 5. Adicionalmente, o como alternativa, las secuencias de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 tomadas en su conjunto son al menos un 80 %, preferentemente al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 95 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o más preferentemente un 99 % idénticas a las CDR proporcionadas en el presente documento, en particular a las SEQ ID NO: 6, 7 y 8.
En una realización, la CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 tomadas en su conjunto son al menos un 85 %, preferentemente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o más preferentemente un 99 % similares a las CDR proporcionadas en el presente documento, en particular a las SEQ ID NO: 3, 4 y 5. Adicionalmente, o como alternativa, la CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 tomadas en su conjunto son al menos un 85 %, preferentemente al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o más preferentemente un 99 % similares a las CDR proporcionadas en el presente documento, en particular a las SEQ ID NO: 6, 7 y 8.
En una realización, una variante comprende una, dos, tres o cuatro sustituciones en una cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1 a 19. En una realización, una variante comprende cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce sustituciones en una cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1, 2, 9 u 11.
Un tipo de variante particularmente preferido es uno en el que se reemplazan una o más CDR completas. Normalmente, las CDR-H3 y CDR-L3 contribuyen de manera más significativa a la unión a antígenos. Por ejemplo, toda la CDR-L1, CDR-L2, CDR-H1 y/o CDR-H2 puede reemplazarse por una CDR diferente de origen natural o artificial. En algunas realizaciones, una o más CDR se reemplazan por un casete de alanina.
Adicionalmente, o como alternativa, la VH del anticuerpo comprende mutaciones puntuales potenciadoras de la solubilidad. El documento WO2009/155725 (ESBATech, a Novartis Company) describe un motivo, que ha demostrado aumentar la solubilidad general del anticuerpo. Los restos se colocan en posiciones ubicadas en la interfaz del dominio variable y el dominio constante de un anticuerpo y estabilizan en particular fragmentos de anticuerpos tales como scFv, que carecen del dominio constante. En algunas realizaciones, en una variante del miembro de unión como se desvela en el presente documento, dos o los tres de los siguientes restos están presentes:
(i) serina (S) en la posición 12 de aminoácido de cadena pesada (según la numeración AHo);
(ii) serina (S) o treonina (T) en la posición 103 de aminoácido de cadena pesada (según la numeración AHo); y/o (iii) serina (S) o treonina (T) en la posición 144 de aminoácido de cadena pesada (según la numeración AHo). En una realización preferida, dicha variante tiene una serina en la posición 12 de VH; una serina en la posición 103 de VH; y una treonina en la posición 144 de VH (todas las numeraciones AHo).
Adicionalmente, o como alternativa, las variantes pueden incluir una o más mutaciones puntuales como se reivindica en el documento EP2158315B1.
Las variantes pueden incluir, p. ej., modificaciones como se describe en el documento WO2014/206561, incluyendo, en particular, las secuencias de marco de VL SEQ ID NO. 15 a 22 del documento WO2014/206561.
Preferentemente, un miembro de unión variante como se describe en el presente documento
(i) conserva la unión específica a PD-L1, en particular a hPD-L1; y/o
(ii) tiene una Kd para PD-L1 humano de menos de 100 pM, preferentemente inferior a 75 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, más preferentemente de menos de 10 pM medido por KinExA® (la medición se realiza preferentemente usando las condiciones descritas en el ejemplo 4 para miembros de unión monovalentes o el ejemplo 9 para miembros de unión bivalentes); y/o
(iii) no presenta reactividad cruzada con PD-L1 de ratón y/o;
(iv) tiene reactividad cruzada con PD-L1 de mono; y/o
(v) compite con el miembro de unión desvelado en el presente documento por la unión a PD-L1; y/o
(vi) tiene al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, 90 %, 95 % o 97 % de identidad de secuencia con las secuencias desveladas en el presente documento.
También se pueden preparar variantes mediante el intercambio de cadenas ligeras y pesadas. Se puede combinar una única cadena ligera con una biblioteca de cadenas pesadas para producir una biblioteca de variantes. En una realización, dicha cadena ligera individual se selecciona del grupo de secuencias VL enumeradas anteriormente y/o dicha biblioteca de cadenas pesadas comprende una o más de las secuencias VH enumeradas anteriormente. De manera análoga, se puede combinar una única cadena pesada con una biblioteca de cadenas ligeras. Preferentemente, dicha cadena pesada individual se selecciona del grupo de secuencias VH enumeradas anteriormente y/o dicha biblioteca de cadenas ligeras comprende una o más de las secuencias VL enumeradas anteriormente.
Un miembro de unión puede comprender cualquiera de las secuencias VL y/o VH mencionadas anteriormente. Los miembros de unión que tienen un formato de dominio único, tales como un nanocuerpo o un VHH, comprenden solo una de las secuencias VL o VH mencionadas anteriormente, preferentemente la secuencia VH. Los miembros de unión multivalentes, en particular fragmentos F(ab')2, bis-scFv (también conocido como scFv en tándem), diacuerpos, scDb, triacuerpos o tetracuerpos y similares, preferentemente miembros de unión biespecíficos, pueden comprender una o más de las secuencias Vl mencionadas anteriormente y/o una o más de las secuencias VH mencionadas anteriormente.
Los miembros de unión de la presente invención, preferentemente los fragmentos de anticuerpos monovalentes, más preferentemente los scFv, son particularmente estables. Como se usa en el presente documento, el término "estabilidad" se refiere a la propiedad biofísica del polipéptido de permanecer monomérico en solución después de una incubación prolongada y/o incubación a temperatura elevada. Los polipéptidos inestables tienden a dimerizarse u oligomerizarse e incluso precipitar, disminuyendo de este modo la vida útil y volviéndose menos adecuados para aplicaciones farmacéuticas.
Los miembros de unión proporcionados en el presente documento y, en particular, el fragmento de anticuerpo monovalente anterior permanecen monoméricos al menos hasta el 85 %, preferentemente al menos hasta el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % y más preferentemente hasta el 95 % después de incubarse a una concentración de 10 mg/ml en PBS a pH 7,2 durante 2 semanas a una temperatura de 4 °C, adicionalmente o como alternativa también cuando se incuban en las mismas condiciones a 22 °C o 37 °C. En algunas realizaciones, el miembro de unión y, en particular, el fragmento de anticuerpo monovalente anterior permanece monomérico al menos hasta el 85 %, preferentemente al menos hasta el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % y más preferentemente hasta el 97 % después de incubarse a una concentración de 10 mg/ml en PBS a pH 7,2 durante 3 semanas a una temperatura de 4 °C, adicionalmente o como alternativa también cuando se incuban en las mismas condiciones a 22 °C o 37 °C.
En algunas realizaciones, el miembro de unión es un scFv y forma menos del 3 % de dímeros después de 1 semana o después de 2 semanas de almacenamiento a 37 °C a una concentración de 10 mg/ml en PBS a pH 7,2.
El grado de monómeros se puede determinar, p. ej., mediante SE-HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento con exclusión por tamaño). Una fase móvil adecuada para tales pruebas es, p. ej., PBS a pH 7,2. El contenido monomérico se puede cuantificar mediante la integración máxima de la señal de UV280 medida durante la cromatografía de proteínas. Un sistema adecuado es, p. ej., una HPLC Dionex Summit controlada por el programa informático Chromeleon® 6.8 que también permite el análisis posterior del cromatograma y la cuantificación de picos.
El miembro de unión, preferentemente el fragmento de anticuerpo monovalente anterior, más preferentemente el scFv, puede tener un punto isoeléctrico (pI) teórico en el intervalo de 4 a 10, preferentemente de 4 a 9, lo más preferentemente alrededor de 7,6. El pI teórico puede calcularse, por ejemplo, usando la herramienta ProtParam en el servidor de ExPASy (disponible en http://web.expasy.org/protparam/; véase también GASTEIGER E. et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. (In) The Proteomics Protocols Handbook. Editado por Walker J.M. Totowa: Humana Press Inc., 2005. ISBN 9781588295934. págs. 571-607).
El miembro de unión puede tener reactividad cruzada con PD-L1 de especies no humanas, lo que tiene ventajas para probar el miembro de unión en modelos animales. Preferentemente, el miembro de unión tiene reacción cruzada con PD-L1 de mono. En algunas realizaciones, la KD de un miembro de unión monovalente a temperatura ambiente en formato scFv con respecto a PD-L1 de mono es de aproximadamente 3,3 pM según lo medido por KinExA®, p. ej., medido en las condiciones indicadas en el ejemplo 5. En algunas realizaciones, la afinidad del miembro de unión es al menos tan fuerte, más preferentemente al menos dos veces más fuerte para PD-L1 de mono que para PD-L1 humano. En algunas realizaciones, el miembro de unión no tiene reactividad cruzada con PD-L1 de ratón. Con frecuencia, los anticuerpos contra una diana humana dada tienen afinidades menores con los ortólogos de roedores, lo que hace que los datos de animales roedores in vivo sean menos valiosos. Como los miembros de unión desvelados en el presente documento tienen valores de KD comparables para PD-L1 humano y de mono, se espera que los datos de animales in vivo reflejen más la enfermedad en seres humanos. Adicionalmente, la reactividad cruzada con el mono permite el uso del mono como especie toxicológica.
En realizaciones preferidas, el miembro de unión no tiene reactividad cruzada con otros miembros de la familia B7, tales como PD-L2 y/o B7-H3. Ambas proteínas tienen una alta similitud de secuencia con PD-L1 y, por lo tanto, la unión con estos miembros de la familia B7 plantearía problemas de seguridad.
Por tanto, en algunas realizaciones, se proporciona un miembro de unión que se une específicamente a PD-L1, que comprende al menos una cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1 y al menos una cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 2, en donde dicho miembro de unión tiene una constante de unión en equilibrio Kd para PD-L1 humano de menos de 10 pM. Preferentemente, dicho miembro de unión permanece monomérico hasta al menos el 95 % en un formato scFv después de la incubación durante 1 semana o 2 semanas a 37 °C en PBS a una concentración de 10 mg/ml. Más preferentemente, dicho miembro de unión no tiene reactividad cruzada con PD-L1 de ratón.
La invención también proporciona un miembro de unión que compite con los miembros de unión desvelados en el presente documento por la unión a PD-L1 humano. Por ejemplo, dicho miembro de unión competitivo (o de bloqueo cruzado) puede ser neutralizante. Preferentemente, dicho miembro de unión competitivo tiene una constante de unión en equilibrio (Kd) para unirse a PD-L1 humano de 250 pM o menos, tal como inferior a aproximadamente 100 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM o menos de aproximadamente 5 pM. Por tanto, en una realización, el miembro de unión tiene una Kd de menos de aproximadamente 5 pM.
Como se usa en el presente documento, el término "competir" se refiere a la competencia entre miembros de unión por unirse a la misma diana. La competencia se puede determinar mediante ensayos de unión competitiva en los que el miembro de unión de interés previene o inhibe o reduce la unión específica de los miembros de unión desvelados en el presente documento a un antígeno común (en este caso, PD-L1 o un fragmento del mismo, respectivamente). Dichos ensayos de unión competitiva son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, radioinmunoensayo directo o indirecto en fase sólida (RIA) e inmunoensayo enzimático directo o indirecto en fase sólida (ELISA). Normalmente, dicho ensayo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida, un miembro de unión que se va a ensayar y el miembro de unión de referencia como se describe en el presente documento. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de (i) el miembro de unión de referencia unido a la superficie sólida en presencia del miembro de unión que se va a ensayar o (ii) el miembro de unión que se va a ensayar unido a la superficie sólida en presencia del miembro de unión de referencia. Un miembro de unión competitivo puede unirse (i) al mismo epítopo que el miembro de unión de referencia, (ii) a un epítopo solapante o (iii) a un epítopo diferente en la misma molécula diana pero provocando impedimento estérico de la unión del miembro de unión de referencia a su diana.
Normalmente, cuando un miembro de unión competitivo está presente en exceso, este reducirá la unión específica del miembro de unión como se describe en el presente documento a PD-L1, es decir, bloquea de forma cruzada la unión, en al menos un 40-45 %, 45-50 %, 50-55 %, 55-60 %, 60-65 %, 65-70 %, 70-75 % o 75 % o más. Preferentemente, la unión de los miembros de unión descritos en el presente documento en presencia del miembro de unión competitivo se reduce en al menos un 80-85 %, 85-90 %, 90-95 %, 95-97 % o 97 % o más.
En una realización, el miembro de unión es monovalente, tal como un scFv o un fragmento Fab. En otra realización, el miembro de unión es multivalente. Dicha molécula multivalente puede ser bivalente (tal como un anticuerpo de longitud completa o un fragmento F(ab')2) o comprende al menos tres sitios de unión a la diana. El miembro de unión multivalente puede ser un anticuerpo biespecífico tal como, p. ej., un diacuerpo, un diacuerpo monocatenario, un bisscFv o un dAr T (véase, p. ej., Kontermann R.E. Methods in Mol. Biol. Editado por LO, B. Totowa, N.J.: Humana Press, 2004. ISBN 1588290921. pág. 227).
Dichos anticuerpos biespecíficos pueden usar conectores más cortos que los descritos anteriormente para scFv, es decir, que tiene solo de una a tres repeticiones del motivo básico de la SEQ ID NO: 10 (véase, p. ej., Holliger, P., et al., PNAS, 1993, vol. 90 (14), pág. 6444). En otra realización, el miembro de unión multivalente es un triacuerpo, un minicuerpo o tetracuerpo. Otros ejemplos de miembros de unión multivalentes incluyen, sin limitación, diacuerpos monocatenarios, scDb en tándem, scDb dimérico lineal, scDb dimérico circular, BiTE, tri-scFv en tándem, tri(a)cuerpos, Fab2 biespecífico, di-minianticuerpos, fusiones scFv-Fc-scFv, di-diacuerpos, DVD-Ig, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc o fusiones IgG-scFv (incluyendo, sin limitación, Bs1Ab, Bs2Ab, Bs3Ab, Bs4Ab, Ts1Ab y Ts2Ab, cuadroma, botón en ojal (KIH), anticuerpos biespecíficos, CrossMabs y DuoBodies).
Un miembro de unión según la presente divulgación puede incluir en algunas realizaciones un resto de captura tal como un marcador de unión de estreptavidina, p. ej., el STREP-TAGS® descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos US 2003/0083474, patentes de los Estados Unidos 5506 121 o 6 103493. Los ejemplos adicionales de un resto de captura incluyen, pero sin limitación, proteína de unión a maltosa, glutatión-S-transferasa (GST), péptido de unión a calmodulina (CBP), péptido FLAG (p. ej., de la secuencia Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly), el epítopo T7 (Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly), proteína de unión a maltosa (Mb P), el epítopo del VHS de la secuencia Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp de la glucoproteína D del virus del herpes simple, el epítopo de la glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) de la secuencia Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys, el epítopo de hemaglutinina (HA) de la secuencia Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala y el epítopo de "myc" del factor de transcripción c-myc de la secuencia Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu.
Un ejemplo adicional de un resto de captura es un quelante metálico, que es capaz de unirse a un ion metálico. Un resto de captura respectivo puede ser etilendiamina, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), N,N-bis(carboximetil)glicina (también denominada ácido nitrilotriacético, NTA), ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético (BAPTA), 2,3-dimercapto-1-propanol (-dimercaprol), porfina o hemo. De acuerdo con el método convencional de cromatografía de afinidad de metales inmovilizados usado en la técnica, por ejemplo, un marcador de oligohistidina es capaz de formar un complejo con iones de cobre (Cu2+), níquel (Ni2+), cobalto (Co2+), o cinc (Zn2+), que puede presentarse, por ejemplo, con fines cromatográficos por medio del ácido nitrilotriacético quelante (NTA).
En algunas realizaciones, el miembro de unión desvelado en el presente documento es menos inmunogénico que un miembro de unión conocido contra PD-L1. En algunas realizaciones, el miembro de unión desvelado en el presente documento se une a un epítopo diferente que un miembro de unión conocido contra PD-L1. En algunas realizaciones, el miembro de unión desvelado en el presente documento tiene una tasa de eliminación diferente a la de un miembro de unión conocido contra PD-L1. En algunas realizaciones, el miembro de unión desvelado en el presente documento tiene una mayor resistencia a agregaciones y/o degradación por proteasa que un miembro de unión conocido contra PD-L1. En algunas realizaciones, el miembro de unión desvelado en el presente documento tiene una mejor CI50 y/o CE50 que un miembro de unión conocido contra PD-L1. En algunas realizaciones, el miembro de unión desvelado en el presente documento tiene mejores parámetros de unión tales como kon, koff o Kd que un miembro de unión conocido para PD-L1. En algunas realizaciones, el miembro de unión desvelado en el presente documento tiene un patrón de reactividad cruzada con una especie diferente a la de un miembro de unión conocido contra PD-L1. En algunas realizaciones, el miembro de unión tiene una estabilidad de pH diferente a la de un miembro de unión conocido contra PD-L1. En algunas realizaciones, el miembro de unión tiene una estabilidad a largo plazo diferente a las temperaturas indicadas que un miembro de unión conocido contra PD-L1. En algunas realizaciones, el miembro de unión muestra una capacidad de penetración tisular diferente a la de un miembro de unión conocido contra PD-L1. En algunas realizaciones, el miembro de unión tiene una eficacia de bloqueo diferente de las interacciones de PD-L1 con sus receptores PD-1 y/o CD80 que un miembro de unión conocido contra PD-L1.
También se contemplan miembros de unión que compiten con los miembros de unión desvelados en el presente documento por la unión a PD-L1.
Ácidos nucleicos, vectores, células hospedadoras y método de producción
Un miembro de unión como se describe en el presente documento puede estar codificado por una única secuencia de ácido nucleico o por una pluralidad de secuencias de ácido nucleico. En el caso de una pluralidad de secuencias de ácido nucleico, cada secuencia puede codificar una región variable. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico puede codificar dos o más regiones variables. En general, una pluralidad de secuencias de ácido nucleico codifica las regiones variables de un miembro de unión. Normalmente, cada región variable está codificada por una secuencia de ácido nucleico distinta. Las secuencias de ácido nucleico respectivas que codifican las regiones variables pueden incluirse en una única molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, se incluyen dos o más secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones variables en una única molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, cada secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable se incluye en una única molécula de ácido nucleico distinta. Por consiguiente, se puede usar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico en la producción de un miembro de unión, por ejemplo, que codifican cada una al menos una región variable. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico respectiva puede definir un casete de expresión. Como se ha indicado anteriormente, un casete de expresión es una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular en una célula hospedadora apropiada.
Un casete de expresión incluye un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés, que está unida operativamente a una o más señales de terminación. También puede incluir secuencias necesarias para la traducción apropiada de la secuencia de nucleótidos. La región codificante puede codificar un polipéptido de interés y también puede codificar un ARN funcional de interés, incluyendo, pero sin limitación, ARN antisentido o un ARN no traducido, en la dirección con sentido o antisentido. El casete de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérico, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. El casete de expresión también puede ser de origen natural, pero se ha obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. En algunas realizaciones, sin embargo, el casete de expresión es heterólogo con respecto al hospedador; es decir, la secuencia de ácido nucleico particular del casete de expresión no se produce de forma natural en la célula hospedadora y se introdujo en la célula hospedadora o un predecesor de la célula hospedadora mediante un acontecimiento de transformación. La expresión de la secuencia de nucleótidos en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicia la transcripción solo cuando la célula hospedadora está expuesta a algún estímulo externo en particular. En el caso de un organismo multicelular, tal como una planta o un animal, el promotor también puede ser específico de un tejido, órgano o etapa de desarrollo en particular.
Al conocer la secuencia del miembro de unión o de sus partes, los ADNc que codifican la secuencia polipeptídica pueden generarse mediante métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., mediante síntesis génica. Estos ADNc se pueden clonar mediante técnicas convencionales de clonación y mutagénesis en un vector adecuado, tal como un vector de expresión o un vector de clonación. Opcionalmente, la cadena ligera variable está codificada por un vector separado de la cadena pesada variable del anticuerpo. Además, se pueden incluir en la construcción genética secuencias adicionales tales como un marcador (p. ej., un marcador His), un dominio constante para la producción de un Fab o un anticuerpo de longitud completa, un conector, la secuencia codificante de una segunda especificidad de unión u otro polipéptido funcional tal como una enzima para generar una construcción de fusión o una molécula biespecífica.
En función de la estrategia de clonación elegida, las construcciones genéticas pueden generar un miembro de unión que tiene uno o más restos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal. Por ejemplo, una metionina N-terminal procedente del codón de inicio o una alanina adicional pueden estar presentes en un polipéptido expresado, a menos que se haya recortado después de la traducción. Por lo tanto, debe entenderse que los anticuerpos desvelados en el presente documento comprenden las secuencias desveladas en lugar de consistir en ellas. Por tanto, en una realización, el miembro de unión comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 9. En otra realización, el miembro de unión comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 11. Si el miembro de unión es un scFv que tiene la orientación VH-conector-VL o cualquier otro fragmento de anticuerpo donde el VH se coloca en sentido N-terminal, la parte de la secuencia VH de la molécula puede estar metilada en sentido N-terminal. Por tanto, en una realización, la SEQ ID NO: 2 tiene una metionina N-terminal.
Los protocolos básicos de clonación convencional, mutagénesis y técnicas de biología molecular se describen en, p. ej., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Green M. y Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 4a edición. Cold Spring Harbor Laboratory, 2012. ISBN 1936113422.).
Además, se contemplan ácidos nucleicos aislados que hibridan con los ácidos nucleicos descritos en el presente documento en condiciones rigurosas.
También se contemplan células que expresan de forma recombinante los miembros de unión desvelados en el presente documento. Las células hospedadoras apropiadas para la expresión de las construcciones genéticas pueden ser procariotas o eucariotas. Las células hospedadoras procariotas adecuadas son gramnegativas o grampositivas e incluyen especies de las familias Escherichia, Ervinia, Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonas o Bacillus. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es Escherichia coli, tal como una o más de las cepas de E. coli BL21 (DE3) (por ejemplo, Invitrogen, Estados Unidos, n.° de cat C600003) y Origami™ 2(DE3) (por ejemplo, Novagen, Estados Unidos, n.° de cat. 71345-3).
Si se desean modificaciones postraduccionales tales como glucosilación o fosforilación, puede resultar ventajoso usar una célula hospedadora eucariota. Por ejemplo, microbios eucariotas tales como las cepas usadas habitualmente de Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris pueden actuar como células hospedadoras. Los ejemplos adecuados de células hospedadoras también incluyen una célula vegetal o animal, en particular células de insecto o mamífero. Las células de mamífero adecuadas incluyen, sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionarias humanas (HEK), células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) o células de mieloma NSO. También se ha informado de la glucosilación en células hospedadoras procariotas, véase, por ejemplo, Jaffé S.R.P. et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2014, vol. 30, pág. 205.
El miembro de unión se puede producir mediante expresión en una célula hospedadora adecuada. Por ejemplo, los vectores de expresión descritos anteriormente se introducen en una célula hospedadora mediante técnicas convencionales tales como electroporación o transformación química. A continuación, las células transformadas se cultivan en condiciones adecuadas para la expresión de proteínas recombinantes, normalmente en medios nutricionales apropiados, opcionalmente modificados para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar secuencias codificantes de interés. El miembro de unión se recupera del cultivo y opcionalmente se purifica usando técnicas convencionales en este campo. La producción de proteína recombinante se puede mejorar optimizando los medios y las condiciones de cultivo, tales como la temperatura o el suministro de oxígeno. En procariotas, el miembro de unión se puede producir en el periplasma, intracelularmente como cuerpos de inclusión o secretarse al medio. Las células animales normalmente secretarán el miembro de unión al medio. Tras la recogida, la proteína se puede purificar usando métodos bien conocidos en este campo, tales como la filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, interacción hidrófoba, cromatografía de modo mixto y/o cromatografía de afinidad.
En una realización, el miembro de unión se produce en un sistema sin células. Normalmente, esto implica la transcripción in vitro seguida de la traducción in vitro de moldes de productos de ácido nucleico que codifican una proteína descrita en el presente documento, p. ej., moldes de productos de ADN plasmídico o PCR. Por ejemplo, se usan lisados brutos de células en crecimiento, que proporcionan las enzimas necesarias, así como la maquinaria de síntesis de proteínas celulares. Los componentes básicos necesarios, tales como los aminoácidos o las nucleobases, así como las moléculas que suministran energía y otros, pueden suministrarse de forma exógena. Los sistemas de expresión acelulares pueden basarse, por ejemplo, en reticulocitos de conejo lisados (p. ej., sistema de lisado de reticulocitos de conejo, Promega, n.° de cat. L4540), células HeLa (p. ej., equipo de traducción in vitro humana de 1 etapa, 88881, Thermo Scientific), células de insectos (p. ej., equipo de insectos EasyXpress II, 32561, Qiagen), gérmenes de trigo (p. ej., extracto de germen de trigo, L4380, Promega) o células de E. coli (p. ej., equipo de síntesis de proteínas in vitro PURExpress®, E6800S, NEB). Además, se pueden usar para la producción sistemas optimizados de expresión de anticuerpos acelulares para la generación mejorada de enlaces disulfuro. Los equipos disponibles en el mercado incluyen lisados de células de insectos (p. ej., equipo de disulfuro de insectos EasyXpress, 32582, Qiagen) o lisados celulares de E. coli (p. ej., equipo de disulfuro de E. coli EasyXpress, 32572, Qiagen). La síntesis de proteínas acelular tiene, p. ej., la ventaja de ser rápida, lograr altos rendimientos de producto, permitir una fácil modificación de las condiciones de reacción, formar un grado bajo de subproductos o incluso ninguno. La síntesis de proteínas acelular puede implicar etapas biológicas y/o químicas que no pueden realizarse en sistemas de producción puramente biológicos o químicos. Por ejemplo, se pueden incorporar aminoácidos no naturales o modificados químicamente a la proteína en las posiciones deseadas. Las proteínas de fusión scFv-toxina se han producido con éxito en sistemas sin células (Nicholls, P. J., et al., JBC 1993, vol. 268, págs. 5302-5308). Por tanto, en una realización, se proporciona un método para producir el miembro de unión descrito en el presente documento, que incluye las etapas de (a) proporcionar un sistema sin células, (b) proporcionar un molde de producto de ácido nucleico que codifica el miembro de unión anterior, (c) permitir la transcripción y traducción del molde de producto de ácido nucleico; (d) recuperar; y opcionalmente (e) purificar el miembro de unión, respectivamente.
Adicionalmente, o como alternativa, un método para producir el miembro de unión descrito en el presente documento incluye al menos una etapa de síntesis química. Por ejemplo, el método puede ser completamente químico. En otra realización, los sistemas de producción basados en células o sin células descritos anteriormente incluyen al menos una etapa de este tipo de síntesis química.
En algunas realizaciones, un miembro de unión como se describe en el presente documento se produce en un sistema basado en células usando un vector de expresión para la expresión intracelular en E. coli. Tras la expresión, el polipéptido se genera como un cuerpo de inclusión dentro de la célula hospedadora que se separa de partículas celulares adicionales seguido de solubilización en un agente desnaturalizante tal como clorhidrato de guanidina (GndHCl) y se repliega mediante procedimientos de renaturalización bien conocidos por el experto.
El miembro de unión deseado también se puede producir en un animal transgénico. Puede obtenerse un animal transgénico adecuado según métodos convencionales, por ejemplo, incluyendo las etapas de (i) hacer el embrión transgénico, p. ej., mediante microinyección de construcciones de ADN que incluyen la secuencia codificante de los miembros de unión así como secuencias de control adecuadas en los huevos; (ii) transferir los huevos a hembras receptoras pseudoembarazadas; (iii) supervisar la gestación o el embarazo; y (iv) seleccionar un descendiente que exprese el anticuerpo deseado.
Debe entenderse que los ácidos nucleicos, vectores, células hospedadoras y el método de producción descritos anteriormente también se aplican a los miembros de unión (en la medida en que sean una proteína) descritos en el presente documento.
Se contemplan además en el presente documento células que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR). Las células que expresan CAR han encontrado un amplio uso en el tratamiento del cáncer. Dichas células, ya sea de origen autólogo o alogénico, están modificadas genéticamente para expresar CAR, p. ej., traduciendo las células con vectores lentivíricos. Las células son habitualmente linfocitos T, mientras que los linfocitos NK también han encontrado uso. Un CAR normalmente tiene varias secciones, que comprenden un dominio de unión a antígeno, un espaciador, un dominio transmembrana, un dominio de señalización coestimulador y un dominio de señalización.
El dominio de unión a antígeno extracelular reconoce específicamente una proteína diana dada, habitualmente en una célula cancerosa. Al unirse a la diana, la célula CAR se activa y también se mantiene cerca de la célula cancerosa. El dominio de unión a antígeno está conectado a través de un espaciador a un dominio transmembrana que a su vez está conectado al dominio de señalización coestimuladora intracelular. Es posible que se deba optimizar la longitud del espaciador, dependiendo de las características del dominio de unión a antígeno y su proteína diana. La unión de la diana a la célula cancerosa desencadena un cambio conformacional que conduce a una señal de activación por parte del dominio de señalización, p. ej., un dominio de señalización zeta de CD3. El dominio de la señalización coestimulante, normalmente ubicado entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización, actúa para amplificar la señal de activación. Son realizaciones ilustrativas de dominios de señalización coestimulantes CD28 o 4-1BB.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno comprende las secuencias VL y/o VH como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno comprende un scFv como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, la célula que expresa CAR es una célula "CAR blindada", es decir, una célula que expresa CAR que secreta proteínas solubles para modificar la respuesta inmunitaria dentro del microambiente tumoral del sujeto al que se administraron las células CAR. En algunas realizaciones, dicha célula secreta un miembro de unión como se describe en el presente documento, en particular un scFv.
Modificaciones químicas y/o biológicas
En un aspecto, el miembro de unión desvelado en el presente documento está modificado química y/o biológicamente. Dicha modificación puede incluir, pero sin limitación, glucosilación, PEGilación, HESilación, tecnología de fusión de albúmina, PASilación, marcaje con colorantes y/o radioisótopos, conjugación con enzimas y/o toxinas, fosforilación, hidroxilación y/o sulfatación. De manera análoga, cualquier miembro de unión, la secuencia de ácido nucleico, el vector y/o la célula hospedadora descritos anteriormente se pueden modificar en consecuencia.
Pueden realizarse modificaciones químicas y/o biológicas para optimizar la farmacodinámica o la solubilidad en agua de la proteína o para reducir sus efectos secundarios. Por ejemplo, se pueden aplicar PEGilación, PASilación y/o HESilación para ralentizar el aclaramiento renal y aumentar de este modo la semivida plasmática del miembro de unión. Adicionalmente, o como alternativa, una modificación puede añadir una funcionalidad diferente a la proteína, p. ej., una toxina para combatir más eficientemente las células cancerosas o una molécula de detección con fines de diagnóstico.
La glucosilación se refiere a un proceso que une los hidratos de carbono a las proteínas. En los sistemas biológicos, este proceso se realiza enzimáticamente dentro de la célula como una forma de modificación cotraduccional y/o postraduccional. Una proteína, aquí el miembro de unión, tal como un anticuerpo, también se puede glucosilar químicamente. Normalmente, pero sin limitación, la glucosilación está (i) ligada en N a un nitrógeno de cadenas laterales de asparagina o arginina; (ii) ligada en O al oxígeno de hidroxilo de las cadenas laterales de serina, treonina, tirosina, hidroxilisina o hidroxiprolina; (iii) implica la unión de xilosa, fucosa, manosa y N-acetilglucosamina a una fosfoserina; o (iv) está en forma de C-manosilación, en donde se añade un azúcar manosa a un resto de triptófano que se encuentra en una secuencia de reconocimiento específica. Los patrones de glucosilación pueden controlarse, p. ej., eligiendo líneas celulares, medios de cultivo, modos de fabricación de ingeniería de proteínas y estrategias de proceso adecuados (HOSSLER, P. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology 2009, vol. 19, n.° 9, págs. 936-949.). En algunas realizaciones, los patrones de glucosilación de los miembros de unión descritos en el presente documento se modifican para mejorar la función efectora de CCDA y CDC.
La ingeniería de proteínas para controlar o alterar el patrón de glucosilación puede implicar la supresión y/o la adición de uno o más sitios de glucosilación. La creación de sitios de glucosilación puede realizarse convenientemente introduciendo la secuencia de reconocimiento enzimático correspondiente en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o añadiendo o sustituyendo uno o más de los restos de aminoácidos enumerados anteriormente.
Puede ser deseable PEGilar el miembro de unión. La PEGilación puede alterar las propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas de una proteína. El polietilenglicol (PEG) de un peso molecular adecuado se une covalentemente a la cadena principal de la proteína (véase, p. ej., Pasut G. y Veronese F. State of the art in PEGylation: the great versatility achieved after forty years of research. J. Control Release, 2012, vol. 161, n.° 2, p.461). La PEGilación puede reducir adicionalmente la inmunogenicidad protegiendo la proteína PEGilada del sistema inmunitario y/o alterar su farmacocinética, p. ej., aumentando la estabilidad in vivo del miembro de unión, protegiéndolo de la degradación proteolítica, prolongando su semivida y alterando su biodistribución.
Se pueden lograr efectos similares mediante miméticos de PEG, p. ej., HESilando o PASilando el anticuerpo. La HESilación utiliza derivados de almidón de hidroxietilo ("HES"), mientras que durante la PASilación el anticuerpo se une a secuencias polipeptídicas con alteraciones conformacionales compuestas por los aminoácidos prolina, alanina y serina. Estos miméticos de PEG y compuestos relacionados se describen, p. ej., en Binder U. y Skerra, A. Half-Life Extension of Therapeutic Proteins via Genetic Fusion to Recombinant p Eg Mimetics, en Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives. Editado por Kontermann R., Weinheim, Alemania: Wiley-VCH, 2012. ISBN: 9783527328499. pág. 63.
El miembro de unión puede incluir un epítopo tal como un epítopo de unión al receptor de rescate. Dicho epítopo de unión al receptor de rescate se refiere normalmente a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) y tiene el efecto de aumentar la semivida in vivo de la molécula.
Adicionalmente, o como alternativa, el miembro de unión se marca o se conjuga con un segundo resto que atribuye funciones auxiliares después de la unión a la diana. El segundo resto puede tener, p. ej., una función efectora inmunológica adicional, ser eficaz en el direccionamiento de fármacos o ser útil para la detección, sin limitarse a lo anterior. El segundo resto puede, p. ej., unirse químicamente o fusionarse genéticamente al miembro de unión usando métodos conocidos en la técnica.
Las moléculas que pueden actuar como segundo resto incluyen, sin limitación, un radionúclido, también denominado radioisótopo, una apoenzima, una enzima, un cofactor, un resto peptídico tal como un marcador HIS, una proteína, un hidrato de carbono tal como un marcador de manosa-6-fosfato, un fluoróforo tal como el isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina, una proteína verde/azul/roja u otra fluorescente, aloficocianina (APC), un cromóforo, una vitamina tal como biotina, un quelante, un antimetabolito tal como metotrexato, un liposoma, una toxina tal como un fármaco citotóxico o una radiotoxina. Son ejemplos ilustrativos de un radionúclido 35S, 32P, 14C, 18F y 125I. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen, pero sin limitación, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa y angiogenina. Un ejemplo ilustrativo de una proteína adecuada es una lectina. Los ejemplos de fármacos citotóxicos adecuados incluyen, pero sin limitación, taxol, gramicidina D y colchicina.
Un miembro de unión marcado es particularmente útil para fines de diagnóstico o detección in vitro e in vivo. Por ejemplo, un miembro de unión marcado con un radioisótopo, enzima, fluoróforo y/o cromóforo adecuados puede detectarse mediante radioinmunoensayo (RIA), ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) o análisis de células individuales basado en citometría de flujo (p. ej., análisis FACS), respectivamente. De manera similar, los ácidos nucleicos y/o vectores desvelados en el presente documento pueden usarse con fines de detección o diagnóstico, p. ej., usando fragmentos marcados de los mismos como sondas en ensayos de hibridación. Pueden encontrarse protocolos de marcaje, p. ej., en Johnson I. y Spence, M. T.Z. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. Life Technologies, 2010. ISBN: 0982927916.
Composiciones
Un miembro de unión, una secuencia de ácido nucleico y/o un vector como se desvelan en el presente documento se pueden proporcionar en una composición que incluye además un vehículo, excipiente o diluyente adecuado. En realizaciones habituales, una composición respectiva incluye un anticuerpo descrito en el presente documento.
Dicha composición puede ser, p. ej., una composición de diagnóstico, cosmética o farmacéutica. Con fines terapéuticos o cosméticos, la composición es una composición farmacéutica que incluye un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, es decir, que no es tóxico a las dosis y concentración empleadas.
El "vehículo", "excipientes" o "diluyentes" adecuados incluyen, sin limitación: (i) tampones tales como fosfato, citrato u otro, ácidos orgánicos; (ii) antioxidantes tales como ácido ascórbico y tocoferol; (iii) conservantes tales como 3pentanol, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, alcohol bencílico, alquil parabeno, catecol o ciclohexanol; (iv) aminoácidos, tales como, p. ej., histidina, arginina; (v) péptidos, preferentemente hasta 10 restos tales como polilisina; (vi) proteínas, tales como seroalbúmina bovina o humana; (vii) polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; (viii) monosacáridos, disacáridos, polisacáridos y/u otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa, sacarosa, manitol, trehalosa, sorbitol, aminodextrano o poliamidoaminas; (ix) agentes quelantes, p. ej., EDTA; (x) iones formadores de sales tales como sodio, potasio y/o cloruro; (xi) complejos metálicos (p. ej., complejos de Znproteína); (xii) tensioactivos iónicos y no iónicos tales como TWEEN™, PLEIRONICS™ o polietilenglicol (PEG) y/o (xiii) crioconservantes tales como dimetilsulfóxido (DMSO).
Muchos de los compuestos ilustrativos tienen diferentes funciones y pueden, p. ej., actuar como vehículo y diluyente. También debe entenderse que la composición puede incluir más de uno de cada vehículo, diluyente o excipiente.
El miembro de unión, las secuencias de ácido nucleico o el vector se pueden proporcionar sobre materiales de soporte sólidos tales como perlas, micropartículas o nanopartículas. Normalmente, una molécula miembro de unión está unida a dicho vehículo a través de un enlace covalente (que implica opcionalmente un conector), un enlace no covalente o ambos. Las perlas y micropartículas pueden incluir, por ejemplo, almidón, celulosa, poliacrilato, poliglicolato de poliacetato, poli(lactida-co-glicólido), látex o dextrano.
En una realización, se proporciona una composición farmacéutica, que incluye el miembro de unión, las secuencias de ácido nucleico o el vector como se han descrito anteriormente. La composición puede incluir asimismo uno o más compuestos terapéuticamente activos adicionales en una cantidad terapéuticamente eficaz. El compuesto terapéuticamente activo adicional es en algunas realizaciones un compuesto activo contra una enfermedad mediada por PD-L1.
Aplicaciones terapéuticas
Una molécula como se describe en el presente documento, en particular el miembro de unión (tal como un anticuerpo), la molécula de ácido nucleico, la célula hospedadora o el vector, es útil como medicamento. Normalmente, dicho medicamento incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula o célula como se proporciona en el presente documento. Por consiguiente, se puede usar una molécula o célula hospedadora respectiva para la producción de un medicamento útil en el tratamiento de uno o más trastornos relacionados con PD-L1.
En un aspecto, se proporciona un método para tratar un trastorno relacionado con PD-L1/mediado por PD-L1. El método incluye las etapas de administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de una molécula o célula hospedadora como se describe en el presente documento, en particular el anticuerpo o la célula hospedadora, a un sujeto que lo necesite.
En una realización, la composición farmacéutica descrita anteriormente, que incluye dicha cantidad farmacéuticamente eficaz del miembro de unión, p. ej., un anticuerpo, o la célula hospedadora se administra al sujeto. El medicamento mencionado anteriormente se puede administrar a un sujeto.
El sujeto que necesita un tratamiento puede ser un ser humano o un animal no humano. Normalmente, el sujeto es un mamífero, p. ej., un ratón, una rata, conejo, un hámster, un perro, un gato, un mono, un simio, una cabra, una oveja, un caballo, un pollo, una cobaya o un cerdo. En realizaciones habituales, al sujeto se le diagnostica un trastorno relacionado con PD-L1 o puede contraer dicho trastorno. En el caso de un modelo animal, el animal podría estar modificado genéticamente para desarrollar un trastorno relacionado con PD-L1. En un modelo animal, un animal también puede estar modificado genéticamente de modo que muestre las características de una enfermedad mediada por PD-L1.
Se conocen diversos trastornos relacionados con PD-L1, en los que un antagonista de PD-L1 ha mostrado un efecto terapéutico en, incluyendo, sin limitación, CPNM (carcinoma de pulmón no microcítico), cáncer urotelial, melanoma, carcinoma de células renales, linfoma de Hodgkin, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer gastrointestinal, cáncer hepatocelular, glioma, cáncer de mama, linfoma, carcinoma de pulmón microcítico, síndromes mielodisplásicos, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer de riñón de células no claras, cáncer colorrectal, sarcomas, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas o cáncer gástrico, cáncer de piel, cáncer de útero, glioblastoma, leucemia, carcinoma, carcinoma de células de Merkel o carcinoma de células renales (CCR), neoplasia hemática, mieloma múltiple, leucemia linfoblástica (LLA), leucemia de linfocitos B, leucemia linfocítica crónica, linfoma no hodgkiniano y cáncer de ovario; o en donde dicha enfermedad es lupus eritematoso sistémico.
También se ha mostrado que la ruta de la PD-1 está implicada en la septicemia y trastornos relacionados (véase, p. ej., el documento WO2015038538). Por tanto, en una realización, la enfermedad relacionada con PD-L1 es septicemia, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica o síndrome de respuesta antiinflamatoria compensatoria.
Bodhankar et al. ((2015) Stroke 46 (10): 2926-34) demostraron los efectos terapéuticos beneficiosos del tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-PD-LI en el modelo de ratón con oclusión de la arteria cerebral media de ictus experimental.
PD-1 y PDL-1 son inmunohistoquímicamente detectables en linfomas primarios del sistema nervioso central y pueden participar en la creación de un microambiente inmunosupresor (Berghoff et al., (2014) Clinical Neuropathology 33 (1): 42-9). Se pueden considerar inhibidores de puntos de control inmunitarios específicos para enfoques de terapia experimental en esta enfermedad.
La influencia de la interacción PD-1/PD-L1 sobre la leucemia aguda en el contexto posterior al trasplante se ha evaluado tanto en ratones como en seres humanos. Koestner et al. ((2011), Blood 117 (3): 1030-1041) observaron la restauración de un efecto del injerto contra el linfoma sin desencadenar la enfermedad del injerto contra el hospedador mediante el bloqueo de PD-L1 en modelos de ratón: la transferencia adoptiva de linfocitos T alogénicos modificados genéticamente poco después del trasplante de células madre hematopoyéticas proporcionó un potente efecto del injerto contra el linfoma sin enfermedad del injerto contra el hospedador, mientras que la transferencia adoptiva posterior fue eficaz solo con el bloqueo simultáneo de PD-L1. Los linfocitos T se modificaron por ingeniería genética para expresar receptores de linfocitos T (TCR) contra un antígeno específico de leucemia del receptor.
La composición farmacéutica se puede aplicar mediante una o más de diversas vías de administración adecuadas. La administración se puede realizar, por ejemplo, por vía parenteral. En algunas realizaciones, la administración se lleva a cabo por vía intramuscular. En algunas realizaciones, la administración se lleva a cabo por vía intravenosa como una embolada o mediante infusión continua. En algunas realizaciones, la administración se realiza por vía intraarticular, intrasinovial, subcutánea, tópica (p. ej., en la piel o el ojo), parenteral, rectal, intradérmica, subcutánea, transdérmica, percutánea o local. Otros modos de administración adecuados incluyen, pero sin limitación, por vía intracerebral, intracerebroespinal, intratecal, epidural o intraperitoneal, por vía oral, urogenital, intravítrea, sistémica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraocular, ótica, intranasal, por inhalación, por vía sublingual, intracraneal, intramuscular, intraperitoneal u oral, por ejemplo. Un miembro de unión desvelado en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico, un vector o una célula hospedadora desvelados en el presente documento pueden combinarse con uno o más compuestos terapéuticamente eficaces adicionales. En algunas realizaciones, dicho compuesto puede ser capaz de alterar la señalización a través de un receptor de PD-L1. En algunas realizaciones, un compuesto respectivo puede ser capaz de inhibir una o más dianas adicionales tales como, p. ej., otros mediadores de respuestas inflamatorias. Dicho compuesto o compuestos se pueden administrar de manera simultánea o secuencial.
Para aplicaciones terapéuticas, el miembro de unión también puede radiomarcarse o unirse a una toxina o unirse a otra función efectora como se ha descrito anteriormente.
En general, el uso terapéutico de los miembros de unión descritos en el presente documento puede estar en combinación con una o más terapias seleccionadas del grupo de terapia con anticuerpos, quimioterapia, terapia con citocinas, terapia con células dendríticas, terapia génica, terapia hormonal, terapia con luz láser, radioterapia o terapia con vacunas.
En algunas realizaciones, el miembro de unión se administra en combinación con uno o más compuestos farmacéuticos diferentes. Los ejemplos ilustrativos incluyen inhibidores de CTLA-4 (tales como tremelimumab y/o ipilimumab), inhibidores de VEGF (tales como bevacizumab), inhibidores del receptor de EGF (p. ej., erlotinib), citostáticos (p. ej., cisplatino, pemetrexed, carboplatino y/o paclitaxel), IFN-g, vacuna contra el cáncer, CD80 soluble o combinaciones de los mismos. Se proporciona una visión de conjunto de los ensayos clínicos que implican anticuerpos anti-PD-L1 en combinación con uno o más compuestos farmacéuticos en He J et al. (2015), Nature Scientific Reports; 5: 13110; DOE 10.1038/srepl3110. Los agentes quimioterapéuticos que pueden administrarse en combinación incluyen, sin limitación, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, alcaloides, agentes de nitrosourea, inhibidores de la topoisomerasa, hormona o antagonista de la misma, inhibidores de la aromatasa, inhibidores de la glucoproteína P y/o un derivado de complejo de platino. Son realizaciones ilustrativas de agentes quimioterapéuticos gemcitabina, ciclofosfamina, 5-fluoroucilo, oxaliplatino, Black et al. (2016) Oncotarget 7 (9): 10557-67 mostraron en un panel de líneas celulares de cáncer de mama y próstata humano y de ratón que expresan PD-L1 que la activación del punto de control inmunitario de PD-1/PD-L1 confiere quimiorresistencia de células tumorales asociada con aumento de la metástasis. También mostraron que la inhibición del eje PD-1/PD-L1 mediante el uso de anticuerpo anti-PD-1 mejoró la quimioterapia con doxorrubicina para inhibir la metástasis en un modelo de ratón ortotópico mamario singénico de cáncer de mama metastásico. Concluyen que las combinaciones de quimioterapia y bloqueo de puntos de control inmunitarios pueden limitar la quimiorresistencia y la progresión a enfermedad metastásica.
En una realización, el anticuerpo descrito en el presente documento se administra en combinación con una vacuna a un sujeto con infección vírica persistente. En modelos murinos, se mostró que el bloqueo de las señales inhibidoras de PD-1/PD-L1 en linfocitos T CD8+ agotados, en combinación con vacunación terapéutica, mejora de forma sinérgica las respuestas funcionales de linfocitos T CD8+ y mejora el control vírico incluso en ausencia de la ayuda de linfocitos T CD4(+) (véase, p. ej., Ha SJ et al., J Exp Med. 17 de marzo de 2008; 205 (3): 543-55 y documento EP2079760B1). El sujeto puede tener, p. ej., una infección vírica persistente con adenovirus, citomegalovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de Epstein-Barr, virus de la hepatitis, virus del herpes, papovavirus, virus del papiloma, parvovirus, virus de la leucemia de linfocitos T, virus linfotrófico T (HTLV) y/o virus de varicela zóster.
También se contemplan métodos para inhibir el crecimiento de un tumor o una célula tumoral, que comprenden la etapa de poner en contacto el tumor o la célula tumoral con una cantidad terapéuticamente eficaz del miembro de unión desvelado en el presente documento. En una realización, la administración reduce el crecimiento tumoral, en otra realización, la administración disminuye el tamaño del tumor.
Aplicaciones de diagnóstico y/o fines de detección
Un miembro de unión como se desvela en el presente documento se puede usar con fines de detección o diagnóstico in vivo y/o in vitro. Por ejemplo, el experto en la materia conoce una amplia gama de inmunoensayos que implican anticuerpos para detectar la expresión en células o tejidos específicos. De manera análoga, cualquier miembro de unión, la secuencia de ácido nucleico, el vector y/o la célula hospedadora descritos en el texto precedente se pueden usar en consecuencia como se detalla en esta sección.
Se ha mostrado que el estado de expresión de PD-L1 tumoral es pronóstico en múltiples tipos de tumores, incluyendo, sin limitación, el melanoma, carcinoma de células renales y cáncer de pulmón no microcítico. La expresión de PD-L1 se puede medir mediante inmunohistoquímica (IHC), para lo que los anticuerpos anti-PD-L1 son esenciales.
Para dichas aplicaciones, el miembro de unión (p. ej., el anticuerpo), la secuencia de ácido nucleico, el vector o la célula hospedadora desvelados en el presente documento pueden incluir un marcador detectable. En algunas realizaciones, el miembro de unión, la secuencia de ácido nucleico, el vector o la célula hospedadora desvelados en el presente documento no incluyen un marcador detectable. Como ejemplo ilustrativo, un anticuerpo sin marcar puede usarse y detectarse mediante un anticuerpo secundario que se une específicamente a un epítopo en el miembro de unión, p. ej., anticuerpo, descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, el miembro de unión, la secuencia de ácido nucleico, el vector y/o la célula hospedadora se acoplan a una o más sustancias que pueden ser reconocidas por una sustancia detectora. Como ejemplo, el miembro de unión puede estar unido de forma covalente a biotina, que puede detectarse por medio de su capacidad para unirse a la estreptavidina. De manera análoga, los ácidos nucleicos y/o vectores desvelados en el presente documento pueden usarse con fines de detección o diagnóstico, p. ej., usando fragmentos marcados de los mismos como sondas en ensayos de hibridación.
En determinadas realizaciones, cualquiera de las moléculas proporcionadas en el presente documento, en particular el anticuerpo, es útil para detectar la presencia de PD-L1 en una muestra, preferentemente una muestra de origen biológico. El término "PD-L1" como se usa en este contexto incluye PD-L1 de longitud completa, fragmentos del mismo y/o precursores del mismo. El término "detectar" abarca la detección cuantitativa y/o cualitativa. En determinadas realizaciones, una muestra biológica incluye una célula o tejido de pacientes humanos. Los ejemplos no limitativos de muestras biológicas incluyen sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, biopsia, linfa y/o tejidos no sanguíneos.
En determinadas realizaciones, el método incluye poner en contacto la muestra biológica con un miembro de unión para PD-L1 (tal como un anticuerpo anti-PD-L1) como se describe en el presente documento en condiciones permisivas para la unión del inhibidor a su PD-L1 diana, si está presente, y detectar el complejo de inhibidor-diana. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo. En una realización, dicho miembro de unión se usa para seleccionar sujetos elegibles para terapia con los miembros de unión descritos en el presente documento, p. ej., donde PD-L1 es un biomarcador para la selección de pacientes.
En otro aspecto, el miembro de unión, p. ej., un anticuerpo, se usa en aplicaciones cosméticas, p. ej., para mejorar el aspecto estético de la piel.
De manera análoga, una secuencia de ácido nucleico, un vector y/o una célula hospedadora descritos anteriormente se pueden usar en consecuencia como se ha detallado anteriormente.
Artículo de fabricación
En un aspecto adicional, se proporciona un artículo de fabricación (es decir, un equipo). El artículo de fabricación incluye materia, p. ej., material, útil para (i) el tratamiento, prevención del retardo en la progresión de los trastornos relacionados con PD-L1; para (ii) diagnóstico o (iii) con fines cosméticos. El artículo de fabricación puede incluir instrucciones de uso y uno o más recipientes. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, cartuchos, placas y tubos de ensayo y pueden estar hechos de diversos materiales tales como vidrio o plástico. Al menos un recipiente contiene una composición que incluye un miembro de unión como se desvela en el presente documento. El recipiente puede tener un orificio de acceso estéril. Normalmente, un recipiente respectivo está etiquetado.
Los reactivos se proporcionan normalmente en cantidades predeterminadas de polvos secos, habitualmente liofilizados, que incluyen excipientes que después de la disolución proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración adecuada. También pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores y/o tampones. Si el miembro de unión está marcado con una enzima, el equipo incluirá normalmente los sustratos y cofactores correspondientes.
Las instrucciones de uso pueden proporcionar indicaciones de que la composición se usa para el tratamiento, la prevención y/o el retardo de la progresión de un trastorno elegido; o instrucciones para realizar un ensayo de detección o diagnóstico. Las instrucciones se pueden proporcionar en una etiqueta y/o en un prospecto.
SECUENCIAS A LAS QUE SE HACE REFERENCIA
Las secuencias desveladas en el presente documento son:
SEQ ID NO: 1 - VL de scFv1
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEDIYSLLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLA
SGVPSRF SGSGSGAEFTLTIS SLQPDDF ATYYCQGNYGS S S SS S YGAVFGQGTKL
TVLG
SEQ ID NO: 2 - VH de scFv1
EV QL VESGGGL V QPGGSLRL SCT V SGIDL S S YTMGWVRQ APGKGLEW V GIIS S
GGRTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYTGYPY
YF ALWGQGTL VT VS S
SEQ ID NO: 3 - CDR-L1 de scFv1
QASEDIYSLLA
SEQ ID NO: 4 - CDR-L2 de scFv1
SEQ ID NO: 5 - CDR-L3 de scFv1
QGNYGSSSSSSYGAY
SEQ ID NO: 6 - CDR-H1 de scFv1
SEQ ID NO: 7 - CDR-H2 de scFv1
US SGGRT YYASWAKG
SEQ ID NO: 8 - CDR-H3 de scFv1
GR YT GYP Y YF AL
SEQ ID NO: 9 - scFv1
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEDIYSLLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLA
SGVPSRF SGSGSGAEFTLTIS SLQPDDF ATYYCQGNYGS S S SS S YGAVFGQGTKL
TVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGIDL
SSYTMGWVRQAPGKGLEWVGIISSGGRTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQ
MN SLR AEDT A V Y Y C ARGR YT GYP Y YF AL W GQGTL VT V S S
SEQ ID NO: 10 - conector
SEQ ID NO: 11 - scFvl metilado
MEIVMTQSPSTLSASYGDRVIITCQASEDIYSLLAWYQQKPGKAPKLLIYDASD
LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNYGSSSSSSYGAVFGQGT
KLT VLGGGGGS GGGGS GGGGS GGGGSE V QL VES GGGL V QPGGSLRL S CT VS GI
DLS S YTMGWVRQ APGKGLEWVGIIS SGGRTYYASWAKGRFTISRDTSKNT VY
LQMN SLRAEDT AVYY C ARGRYT GYP YYF ALW GQGTL VTV S S
SEQ ID NO: 12 - FR - L1
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC
SEQ ID NO: 13 - FR - L2
W YQQKPGK APKLLIY
SEQ ID NO: 14 - FR - L3
GVP SRF S GSGS GAEF TLTIS SLQPDDF AT Y Y C
SEQ ID NO: 15 - FR - L4
SEQ ID NO: 16 - FR - H1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSG
SEQ ID NO: 17 - FR - H2
WVRQAPGKGLEWVG
SEQ ID NO: 18 - FR - H3
RF TISRDT SKNT VYLQMN SLRAEDT AVYY CAR
SEQ ID NO: 19 - FR - H4
WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 20 - Cadena pesada de IgG_1
E V QL VE S GGGL Y QPGGSLRL S CT YS GIDL S S YTMGW VRQ APGKGLEW V Gil S S
GGRT YYAS WAKGRF TISRDTSKNT VYLQMN SLRAEDT AVYY C ARGRYT GYP Y
YFALWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK
VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV
D V SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV S VLTVLHQDWLN
GKEYKCK V SNK ALP APIEKTISK AKGQPREPQ V YTLPP SREEMTKN Q VSLTCL V
KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
F SC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 21 - Cadena pesada de IgG_2
E V QL VE S GGGL V QPGGSLRL S C A AS GF TF SD S WIHW VRQ APGKGLEW V AWIS
PYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGG
FD YW GQGTL VT V S A A S TKGP S VFPL AP S SK S T S GGT A ALGCL VKD YFPEP VT V
SWNSGALTSGYHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK
VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV
D V SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNST YRVV S VLTVLHQDWLN
GKEYKCK V SNK ALP APIEKTI SK AKGQPREPQ V YTLPP SREEMTKN Q VSLTCL V
KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
F SC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 22 - Cadena pesada de IgG_3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIK
QDGSEK Y YVD S VKGRFTISRDNAKN SL YLQMN SLRAEDT AVYY C AREGGWF
GEL AFD YW GQGTL VTV S S ASTKGP S VFPLAP S SKST SGGT AALGCL VKD YFPEP
VT V S WN S GAL T S GVHTFP A VLQ S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTQ T YICNVNHKP S
NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC
VVVD V SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV S VLTVLHQD
WLN GKE YKCK V SNK ALP APIEKTI SK AKGQPREPQ V YTLPP SREEMTKN Q VSL
T CL VKGF YP SDIA VEWE SN GQPENN YKTTPP VLD SDGSFFL Y SKLT VDK SRW Q
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 23 - Cadena pesada de IgG_4
E V QL VE S GGGVVRPGGSLRL S C A AS GF TFDD Y GMT W VRQ APGRGLEW V S GIH
WHGKRTGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLKGEDTALYHCVRGGMST
GDWFDPWGQGTLVIVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEP
VTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASST
K VDKKIEPRGPTIKPCPPCKCP APNLLGGP S VFIFPPKIKD VLMISL SPIVT C VVV
DVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSG
KEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMV
TDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVER
NSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO: 24 - Cadena ligera de IgG_1
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEDIYSLLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLA
SGYPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNYGSSSSSSYGAVFGQGTKL
EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG
N S QES YTEQD SKD STYSLSSTLTL SK AD YEKHK Y Y ACE YTHQGL S SP YTK SFNR
GEC
SEQ ID NO: 25 - Cadena ligera de IgG_2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFL
YSGVPSRF SGSGSGTDFTLTIS SLQPEDF ATYYCQQ YLYHPATF GQGTKVEIKRT
VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES
VTEQD SKD S T Y SL S S TL TL SK AD YEKHK V Y ACE VTHQ GL S SP VTK SFNRGEC
SEQ ID NO: 26 - Cadena ligera de IgG_3
EIYLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSR
AT GIPDRF S GS GS GTDFTLTISRLEPEDF A V Y Y C QQ Y GSLP WTF GQGTKVEIKRT
VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES
VTEQD SKD S T Y SL S S TL TL SK AD YEKHK V Y ACE VTHQ GL S SP VTK SFNRGEC
SEQ ID NO: 27 - Cadena ligera de IgG_4
DIQMTQ SP S SLS ASLGDRVTIT CRASQ SIN S YLNW Y QQKPGKAPKLLIYVAS SL
QSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIKRA
DAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSW
TDQD SKD ST YSMS STLTLTKDEYERHNS YTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
Los siguientes son ejemplos, que ilustran los métodos y composiciones desvelados en el presente documento. Se entiende que se pueden poner en práctica diversas otras realizaciones, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Identificación de scFv de unión a PD-L1
Inmunización de conejos: Se inmunizaron conejos con fusión PD-L1 Fc humana recombinante (rh) (RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 156-B7). Se extrajeron los ganglios linfáticos después del refuerzo final y las células se crioconservaron.
Confirmación de la especificidad de PD-L1: Se llevó a cabo confirmación de la reactividad de los sueros de conejo a PD-L1 mediante ELISA de unión. En resumen, la fusión PD-L1-Fc (RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 156-B7) o PD-L1-His (BioVision, Estados Unidos, n.° de cat. 7429) se aplicaron a una concentración de 2 pg/ml en PBS durante una hora a 37 °C sobre microplacas Maxisorp de 96 pocillos. Después de bloquear con leche desnatada en polvo al 5 % y BSA al 1 %, se añadieron concentraciones crecientes de suero de conejo y se detectaron IgG unidas mediante IgG HRP de cabra anti-conejo (Southern Biotech, Estados Unidos, n.° de cat. 4050-05). El ELISA se desarrolló con solución de sustrato de ELISA TMB (eBioscience, Estados Unidos, n.° de cat. 00-4201-56). Todos los sueros de conejo se unieron a PD-L1 fusionado con Fc y marcado con His, lo que muestra que la inmunización indujo con éxito la respuesta de linfocitos B contra PD-L1.
Clasificación por citometría de flujo de linfocitos B de conejo y cultivo: Los linfocitos B de memoria específicos de PD-L1 se clasificaron como células individuales en microplacas de 96 pocillos usando FACSAria III (BD Biosciences). Se cultivaron clones de linfocitos B individuales en presencia de células alimentadoras y medio acondicionado que contenía suero de ternero fetal (FCS) al 10 %.
Se clasificaron más de 900 clones de linfocitos B individuales, se cultivaron y los sobrenadantes de cultivos celulares se analizaron mediante ELISA para determinar la presencia de IgG específicas anti-PD-L1. En resumen, la fusión rhPD-L1 Fc (RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 156-B7) se aplicó a una concentración de 2 pg/ml en PBS durante una noche a 4 °C sobre microplacas Maxisorp de 96 pocillos. Después del bloqueo con leche desnatada en polvo al 5 %, BSA al 1 % y Tween-20 al 0,05 %, se añadieron sobrenadantes de cultivo celular. Se detectaron IgG específicas de PD-L1 mediante IgG-HRP anti-conejo (Southern Biotech, n.° de cat. 4050-05). El ELISA se desarrolló con solución de sustrato de ELISA TMB (eBioscience, Estados Unidos, n.° de cat. 00-4201-56). Se identificaron clones de linfocitos B productores de IgG específicos de PD-L1 y se analizaron adicionalmente los anticuerpos IgG para determinar su capacidad para bloquear la interacción de PD-L1 con PD-1. En resumen, se sembraron células CHO que expresaban PD-L1 (Promega, Estados Unidos, n.° de cat. CS187103) en microplacas de 96 pocillos. Se añadieron IgG específicas de PD-L1 y las placas se incubaron durante 20 minutos a 37 °C, CO2 al 5 %. Se añadieron células efectoras Jurkat que expresan PD-1 (Promega, Estados Unidos, n.° de cat. CS187105) y las placas se incubaron durante 6 horas más a 37 °C, CO2 al 5 %. La activación de TCR/CD3 se midió mediante detección luminiscente con el sistema de ensayo de luciferasa Bio-Glo (Promega, G7941). Se descubrió que 69 clones de linfocitos B productores de IgG inhibían la interacción de PD-1 y PD-L1.
Secuenciación de IgG neutralizantes de PD-L1: Todos los clones de linfocitos B de conejo que producían anticuerpos IgG anti-PD-L1 neutralizantes se sometieron a aislamiento de ARNm usando el miniequipo RNeasy (Qiagen, Alemania, n.° de cat. 74106). El ARNm se usó como molde para la transcripción inversa según el protocolo del fabricante (equipo de RT-PCR OneStep, Qiagen, Alemania, n.° de cat. 210212). Posteriormente, Se llevaron a cabo reacciones de p Cr usando oligonucleótidos para amplificar específicamente las secuencias codificantes de cadena pesada y ligera de IgG de conejo (termociclador Biometra T3). Los fragmentos de PCR de cadena pesada y ligera se secuenciaron de forma independiente (ABI, Sanger 3730x1; Microsynth AG, Balgach, Suiza) y las secuencias de nucleótidos obtenidas se tradujeron a secuencias de aminoácidos usando EMBOSS Transeq (http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) y se alinearon usando CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).
Construcción de genes de scFv anti-PD-L1 y expresión de la proteína scFv: se identificaron las regiones CDR de IgG de conejo de las cadenas ligeras variables y pesadas variables como se ha definido anteriormente y se injertaron en regiones marco aceptoras de cadenas ligeras y pesadas humanas. En algunos, se introdujeron mutaciones puntuales.
Se generaron vectores de expresión bacterianos que codificaban proteínas scFv con la cadena ligera variable N-terminal unida por la secuencia SEQ ID NO: 10 a la cadena pesada variable C-terminal. Las proteínas scFv se expresaron en E. coli BL21 (DE3); Novagen, Estados Unidos, n.° de cat. 69450-3) como cuerpos de inclusión, que se aislaron, se solubilizaron y las proteínas se replegaron. Los scFv replegados se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño y se recogieron las fracciones de los picos monoméricos correspondientes a aproximadamente 26 kDa.
Los scFv humanizados se analizaron para determinar la unión por fusión de PD-L1 Fc humana mediante ELISA, como se ha descrito anteriormente. Por este procedimiento, de 47 scFv probados, se identificaron 28 scFv como aglutinantes de PD-L1 humano. Los scFv humanizados se analizaron adicionalmente para determinar la unión a PD-L1 de ratón mediante ELISA.
En resumen, la fusión de PD-L1 Fc de ratón (Sino Biological, China, n.° de cat. 50010-M03H o RnD Systems, Estados Unidos, cat. n.° 1019-B7-100) se aplicó a una concentración de 5 pg/ml o 1 pg/ml durante una noche a 4 °C sobre microplacas Maxisorp de 96 pocillos en PBS pH 7,2. Después de bloquear con BSA al 1 % en PBS, pH 7,2 o leche en polvo desnatada al 5 % con BSA al 1 % en PBS, pH 7,2, se añadieron a los pocillos concentraciones crecientes de scFv (0,0016, 0,008, 0,04, 0,2, 1,0 y 5,0 pg/ml o 0,02, 0,06, 0,19, 0,56, 1,67 y 5,0 pg/ml). El recubrimiento exitoso de la fusión de PD-L1 Fc de ratón se confirmó con un anticuerpo específico de PD-L1 de ratón (Sino Biological, China, n.° de cat. 50010-M08H). Mientras que los scFv se detectaron mediante la proteína L-HRP (Sigma-Aldrich, Estados Unidos, n.° de cat. P3226), el anticuerpo de control IgG de longitud completa se detectó mediante IgG de cabra anti­ conejo conjugado con HRP (Southern Biotech, Estados Unidos, n.° de cat. 4050-05). El desarrollo se realizó con la solución de sustrato de ELISA TMB (eBioscience, Estados Unidos, n.° de cat. 00-4201-56) y la absorbancia se midió a 450 nm. ScFv1 no reaccionó de forma cruzada con PD-L1 de ratón hasta una concentración de 5 pg/ml. Un scFv probado mostró una reactividad cruzada débil con el PD-L1 de ratón. Los scFv de unión a PD-L1 humanos se caracterizaron además por su capacidad para neutralizar la actividad de PD-L1 humano, como se muestra en el ejemplo 2, su estabilidad, como se muestra en el ejemplo 3, su afinidad por el PD-L1 humano, como se muestra en el ejemplo 4 y su especificidad, como se muestra en el ejemplo 5. ScFv1 se caracterizó además mediante el análisis de la unión a la forma natural de PD-L1 humano, como se muestra en el ejemplo 6, por análisis de scFv1 secretado a partir de células, como se muestra en el ejemplo 7 y mediante la determinación de la eficacia in vivo, como se muestra en el ejemplo 8. Después de la conversión al formato IgG, el anticuerpo correspondiente a scFv1 se analizó adicionalmente por su capacidad para inhibir la interacción entre PD-L1 humano y PD-1 humana y por análisis de afinidad por PD-L1 humano, como se muestra en el ejemplo 9.
Ejemplo 2 - Neutralización de PD-L1 humano
Se analizaron adicionalmente 26 scFv y un scFv que no se une (scFv2) para determinar su capacidad de neutralización de PD-L1 en un ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1. En este ensayo, la actividad luciferasa es promovida por la actividad de los linfocitos T. La interacción de PD-L1 con PD-L1 crea una señal inhibidora y una reducción de la actividad luciferasa, que se supera mediante el tratamiento de las células con un inhibidor de PD-L1. Se sembraron células CHO que expresaban PD-L1 (Promega, CS187103) en microplacas de 96 pocillos. Se añadieron concentraciones crecientes de scFv y las placas se incubaron durante 20 minutos a 37 °C, CO2 al 5 %. Se añadieron células efectoras Jurkat que expresan PD-1 (Promega, CS187105) y las placas se incubaron durante 6 horas más a 37 °C, CO2 al 5 %. La activación de TCR/CD3 se midió mediante detección luminiscente con el sistema de ensayo de luciferasa Bio-Glo (Promega, G7941). Se representaron curvas de inhibición y los valores de CI50 se calcularon usando el programa informático GraphPad Prism®, versión 6.05. Los resultados de scFv1 y scFv2 se muestran en la figura 1. ScFv1 bloqueó eficientemente la señal inhibidora del punto de control inmunitario con una CI50 de 750 pM. El scFv2 que no se une no mostró ningún efecto sobre la señal inhibidora del punto de control inmunitario. ScFv1 mostró la potencia más alta de los 27 scFv probados. La CI50 de los scFv de menor potencia no se pudo determinar usando el intervalo de concentración de hasta 10 pg/ml.
La capacidad de scFv1, el scFv2 que no se une y otros tres scFv para inhibir la unión de PD-L1 a PD-1 se ensayaron mediante ELISA competitivo. La fusión rhPD-L1 Fc (RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 156-B7) se aplicó a una concentración de 2 pg/ml en PBS durante una noche a 4 °C sobre microplacas Maxisorp de 96 pocillos. Las placas se bloquearon con BSA al 1 % y Tween-20 al 0,05 % en PBS, pH 7,2. Se preparó una dilución en serie de scFv, con once diluciones 1:3 a partir de 1 pg/ml, y se añadió a las placas. Después de una hora a temperatura ambiente, la mitad de las diluciones de scFv se retiraron y se reemplazaron con fusión PD-1 Fc biotinilada (BPS Bioscience, Estados Unidos, n.° de cat. 71109) a una concentración final de 15ng/ml. La fusión PD-1 Fc unida se detectó con estreptavidina-HRP (BD Pharmingen, Estados Unidos, n.° de cat. 554060). El nivel de fondo se determinó en ausencia de PD-1. El ELISA se desarrolló con solución de sustrato de ELISA TMB (eBioscience, Estados Unidos, n.° de cat. 00­ 4201-56). En este ensayo, la capacidad de PD-L1 para interactuar con PD-1 genera una señal de absorbancia, que es neutralizada eficazmente por scFv1 pero no por el scFv2 que no se une, como se muestra en la figura 2. Los otros tres scFv también neutralizaron la interacción en una medida comparable a scFv1.
La capacidad de scFv1 y scFv2 que no se une para inhibir la unión de PD-L1 a CD80 se ensayó mediante ELISA competitivo. rhCD80-His (RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 9050-B1-100) se aplicó a una concentración de 2 pg/ml en PBS durante una noche a 4 °C sobre microplacas Maxisorp de 96 pocillos. Las placas se bloquearon con BSA al 1 % y Tween-20 al 0,05 % en PBS, pH 7,4. Se preparó una dilución en serie de scFv con una concentración constante de fusión rhPD-L1 Fc 50 nM (RnD Systems, Estados Unidos, cat. n.° 156-B7), con once diluciones de scFv 1:3 a partir de 1 mM. Esta mezcla se incubó con las placas recubiertas con CD80 durante 2 horas a temperatura ambiente. El nivel de fondo correspondiente a la ausencia de unión de PD-L1 a CD80 se determinó incluyendo una serie de diluciones de scFv1 en ausencia de cualquier PD-L1-Fc. La fusión PD-L1 Fc unida se detectó con Fc-HRP de cabra anti-IgG humana (Southern Biotech, Estados Unidos, n.° de cat. 2048-05). El ELISA se desarrolló con solución de sustrato de ELISA TMB (eBioscience, Estados Unidos, n.° de cat. 00-4201-56). En este ensayo, la capacidad de PD-L1 para interactuar con CD80 genera una señal de absorbancia, que es neutralizada eficazmente al nivel de fondo por scFv1 pero no por el scFv2 que no se une, como se muestra en la figura 3.
En conjunto, estos resultados indican que scFv1 bloquea la interacción de PD-L1 con PD-1 y CD80.
Ejemplo 3 - Estabilidad de scFv
Se pueden observar dos procesos diferentes que pueden afectar a la estabilidad de scFv. En primer lugar, el scFv podría ser propenso a la dimerización, seguido con frecuencia de oligomerización y agregación y precipitación adicionales. En segundo lugar, la degradación de scFv, que conduce a fragmentos más pequeños, puede producirse a lo largo del tiempo.
Se investigó la estabilidad de scFv1 y otros 4 scFv formulados en PBS pH 7,2 tras el almacenamiento a diferentes condiciones de temperatura. Los scFv se almacenaron a una concentración de 10 mg/ml a 4 °C, 22 °C, 37 °C y -20 °C en tubos de polipropileno de 1,5 ml. Las muestras se analizaron mediante SE-HPLC para determinar los niveles (%) de monómeros, dímeros y oligómeros de alto peso molecular en relación con el área total del pico: se usó una columna TOSOH TSKgel G2000 SWXL, fase diol, L x DI. 30 cm x 7,8 mm, tamaño de partícula de 5 pm (Sigma Aldrich, Estados Unidos, n.° de cat. 08540). Se cargaron 5 pl de scFv a 10 mg/ml. Como fase móvil se eligió PBS de pH 7,2.
ScFv1 fue el más estable de los 5 scFv probados. El análisis SE-HPLC de scFv1 no mostró productos de degradación de bajo peso molecular detectables en las condiciones experimentales descritas anteriormente. Solo se observó una pequeña cantidad de dimerización de scFv1 o formación de moléculas de alto peso molecular tras el almacenamiento durante 2 semanas a 4 °C, 22 °C y 37 °C. ScFv1 formó hasta el 1,8 % y 2,7 % de dímeros después de 1 o 2 semanas de almacenamiento a 37 °C, respectivamente (tabla 1).
Tabla 1
Figure imgf000031_0002
La estabilidad térmica de scFv1 también se evaluó mediante fluorimetría diferencial de barrido (DSF). Se calentó scFv1 a 0,4 mg/ml formulado en PBS pH 7,2 de 30 °C a 95 °C a una velocidad de barrido de 1 °C/5 segundos en un dispositivo de PCR en tiempo real (Corbett, Rotor-Gene) en presencia de naranja 20x SYPRO® (Sigma-Aldrich, Estados Unidos, n.° de cat. S5692, 5000x) en PBS pH 7,2. Se midieron los valores de fluorescencia (longitud de onda de excitación de 470 nm; longitud de onda de emisión de 555 nm) durante el recorrido del gradiente. El punto medio de la temperatura de fusión (Tm) de scFv1 calculada usando el programa informático Rotor-Gene 6000 Series 1.7. fue de 81,5 °C.
Las biologías proteicas pueden quedar expuestas a tensión por congelación/descongelación durante la fabricación, el almacenamiento y el envío que pueden causar agregación y degradación. Para evaluar la estabilidad de scFv1 durante los ciclos de congelación/descongelación, se formuló en p Bs a pH 7,2 a 10 mg/ml en tubos de polipropileno de 1,5 ml. Los viales se sumergieron en nitrógeno líquido durante 1 min, a continuación, se incubó en un baño de agua a temperatura ambiente durante 5 min. Se realizaron 3, 5, 7 o 10 ciclos de congelación/descongelación. Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 16100 x g y el sedimento se descartó. Los sobrenadantes se analizaron mediante SE-HPLC como se ha mencionado anteriormente y el contenido de proteína se determinó mediante espectroscopia UV. Prácticamente el 100% de scFv1 permaneció monomérico después de 10 ciclos de congelación/descongelación (tabla 2) y no se observó pérdida de proteína ni precipitación.
Tabla 2
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
La estabilidad de scFvl en suero humano (Sigma-Aldrich, Estados Unidos, n.° de cat. H4522) se evaluó mediante ELISA después de la incubación a 10 |jg/ml a 37 °C durante 0, 4 y 20 horas. La señal de unión se comparó con scFvl en PBS, pH 7,4, sin incubación. En resumen, la fusión rhPD-L1 Fc (RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 156-B7) se aplicó a una concentración de 1 jg/m l en PBS durante una noche a 4 °C sobre microplacas Maxisorp de 96 pocillos. Después de bloquear con PBS, pH 7,4 con, BSA al 1 % y Tween-20 al 0,05 %, se añadió una serie de diluciones 1:3 de 2,5 jg/m l a 42 ng/ml de muestras de suero/scFv a las placas de ELISA por duplicado. Se detectó scFv1 unido con proteína L-HRP (Sigma-Aldrich, Estados Unidos, n.° de cat. P3226). El ELISA se desarrolló con solución de sustrato de ELISA TMB (eBioscience, Estados Unidos, n.° de cat. 00-4201-56). Como se muestra en la figura 4, no hubo pérdida de la actividad de unión de scFv1 después de hasta 20 horas de incubación con suero humano a 37 °C.
Ejemplo 4 - Unión a PD-L1 soluble
La afinidad de scFv1 y otros tres scFv por la fusión PD-L1-Fc se determinó mediante el ensayo de exclusión cinética (KinExA®) con un KinExA 3200 (Sapidyne Instruments, Estados Unidos, n.° de cat. 5001) que incluía un inyector automático (Sapidyne Instruments, Estados Unidos, 5004). El KinExA® mide la afinidad de unión en equilibrio y la cinética entre moléculas sin modificar en solución. La medición requiere la inmovilización de un compañero de interacción en una fase sólida únicamente para actuar como una sonda para determinar la concentración del correspondiente compañero de unión en solución. En este caso, la fusión PD-L1 Fc (RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 156-B7) se inmovilizó sobre perlas de poli(metacrilato de metilo) (PMMA) (440176, Sapidyne Instruments Inc.) a una concentración de 30 jg/ml. Se usó PBS con NaNaal 0,02 %, pH 7,4, como tampón de ejecución. La afinidad de scFv por la fusión PD-L1 Fc se determinó normalmente usando un conjunto de dos curvas, en el que se valoró una serie de diluciones dobles de fusión PD-L1 Fc frente a una cantidad constante de scFv. Se prepararon medidas duplicadas para cada punto de datos. Para scFv1, en la primera curva, se incubó scFv1 20 pM con 11 concentraciones de fusión PD-L1 Fc diferentes, a partir de una fusión PD-L1 Fc 5 nM. Estas mezclas se incubaron durante 5 horas. En una segunda curva, se incubó scFv1 10 pM con 12 concentraciones de fusión PD-L1 Fc diferentes, a partir de una fusión PD-L1 Fc 2,5 nM. Estas mezclas se incubaron durante 9 horas. Para detectar la cantidad de scFv sin unir presente en estas mezclas, las muestras se expusieron a un caudal de 0,25 ml/min a una fase sólida que contenía fusión PD-L1 Fc inmovilizada. El scFv1 capturado se detectó a continuación inyectando 0,5 ml de proteína L biotinilada 250 ng/ml (M00097, GenScript), seguido de 0,5 ml de conjugado de estreptavidina DyLight 650 250 ng/ml (Jackson ImmunoResearch), cada uno a un caudal de 0,25 ml/min. Todas las etapas se llevaron a cabo a temperatura ambiente. La señal de fluorescencia, que es directamente proporcional a la concentración de scFv1 libre en las muestras equilibradas, se convierte en una señal de tensión. Esta señal de tensión se usa para calcular el valor de Kd y la actividad del scFv usando el "análisis de curva n" del programa informático KinExA® Pro versión 4.1.9 o 4.2.10 (figura 5) usando la opción "titulante como referencia de concentración de análisis". El valor Kd calculado para scFv1 fue de 8,8 pM. El valor Kd calculado para otros scFv osciló entre 12 y 92 pM.
Ejemplo 5 - Selectividad de scFv
La reactividad cruzada de scFv1 y scFv3 para PD-L1 de otras especies se determinó mediante ELISA. Se aplicaron fusiones PD-L1 Fc de ser humano (RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 156-B7), rata (Sino Biological, China, n.° de cat. 80450-R02H) o mono (Sino Biological, China, n.° de cat. 90251-C02H) durante una noche sobre microplacas Maxisorp de 96 pocillos a una concentración de 1 jg/m l en PBS, pH 7,2 a 4 °C. Las placas se bloquearon con BSA al 1 % y Tween-20 al 0,5 % en PBS, pH 7,2. Se preparó una dilución en serie de scFv con concentraciones de 1 jg/ml, 333 ng/ml y 111 ng/ml y se añadió a las placas. Como control negativo, se usó PBS sin scFv y, como controles positivos, se incluyó 1 jg/m l de anticuerpo de ratón anti-PD-L1 humano (BioLegend, Estados Unidos, n.° de cat.
329716) o fusión de rhPD-1 Fc biotinilada (BPS Bioscience, Estados Unidos, n.° de cat. 71109). Los scFv unidos se detectaron con la proteína L-HRP (Sigma-Aldrich, Estados Unidos, n.° de cat. P3226), se detectó anticuerpo de ratón anti-PD-L1 humano unido con IgG-HRP de cabra anti-ratón (Southern Biotech, Estados Unidos, n.° de cat. 1033-01) y la fusión de rhPD-1 Fc biotinilada unida se detectó con estreptavidina-HRP (BD Pharmingen, Estados Unidos, n.° de cat. 554060). El desarrollo se realizó con la solución de sustrato de ELISA TMB (eBioscience, Estados Unidos, n.° de cat. 00-4201-56). Los resultados indicaron que scFv1 y scFv3 se unieron específicamente a PD-L1 de ser humano y mono, pero no a PD-L1 de rata (figura 6).
La reactividad cruzada de scFv1 con proteínas humanas recombinantes que comparten similitud de secuencia con PD-L1 se determinó mediante ELISA. Se aplicaron fusión rhPD-L1 Fc (RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 156-B7), fusión rhPD-L2 Fc (RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 1224-PL) o fusión rhB7-H3 Fc (RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. 1027-B3) durante una noche sobre microplacas Maxisorp de 96 pocillos a una concentración de 1 jg /m l en PBS, pH 7,2 a 4 °C. Las placas se bloquearon con BSA al 1 % y Tween-20 al 0,5 % en PBS, pH 7,2. Se preparó una dilución en serie de scFv con concentraciones de 5, 1 y 0,2 jg/m l y se añadió a las placas. Como control negativo, se usó scFv2 que no se une y, como controles positivos, se incluyeron 5, 1 y 0,2 jg/m l de anticuerpo de ratón anti-B7-H3 humano (RnD Systems, Estados Unidos, n.° de cat. MAB1027) o 30 y 15 ng/ml de fusión rhPD-1 Fc biotinilada (BPS Bioscience, Estados Unidos, n.° de cat. 71109). Los scFv unidos se detectaron con la proteína L-HRP (Sigma-Aldrich, Estados Unidos, n.° de cat. P3226), se detectó anticuerpo de ratón anti-B7-H3 humano unido con IgG-HRP de cabra anti-ratón (Southern Biotech, Estados Unidos, n.° de cat. 1033-01) y la fusión de rhPD-1 Fc biotinilada unida se detectó con estreptavidina-HRP (BD Pharmingen, Estados Unidos, n.° de cat. 554060). El desarrollo se realizó con la solución de sustrato de ELISA TMB (eBioscience, Estados Unidos, n.° de cat. 00-4201-56). Los resultados indicaron que scFv1 se unió específicamente a PD-L1 humano, sin reactividad cruzada con PD-L2 o B7-H3 humanos.
La reactividad cruzada de scFv1 con PD-L1 de mono se investigó adicionalmente usando KinExA®. El método fue como se ha descrito en el ejemplo 4, excepto que las perlas de PMMA se recubrieron con 20 pg/ml de fusión PD-L1 Fc de mono (Sino Biological, China, n.° de cat. 90251-C02H) y la afinidad se determinó usando un conjunto de dos curvas, en el que se valoró una serie de diluciones dobles de fusión PD-L1 Fc de mono frente a una cantidad constante de scFv. En la primera curva, se incubó scFv1 50 pM con 12 concentraciones de fusión PD-L1 Fc diferentes con mediciones duplicadas, a partir de una fusión PD-L1 Fc 2,5 nM. Estas mezclas se incubaron durante 6 horas. En una segunda curva, se incubó scFv1 10 pM con 12 concentraciones de fusión PD-L1 Fc diferentes, a partir de una fusión PD-L1 Fc 1 nM. Estas mezclas se incubaron durante 16 horas para detectar la cantidad de scFv sin unir presente en estas mezclas, las muestras se expusieron a un caudal de 0,25 ml/min a una fase sólida que contenía fusión PD-L1 Fc inmovilizada. Todas las etapas se llevaron a cabo a temperatura ambiente. El valor Kd calculado para scFv1 usando el "análisis de curva n" del programa informático KinExA® Pro versión 4.2.10 usando la opción "titulante como referencia de concentración de análisis" fue de 3,3 pM (figura 7). Los resultados demuestran que scFv1 se une a PD-L1 de mono con una afinidad aproximadamente 2,7 veces más fuerte que la unión a PD-L1 humano.
Ejemplo 6 - Unión a la forma natural de PD-L1
La capacidad de scFv1 y el scFv de control que no se une, scFv2, para unirse a la forma natural de PD-L1 expresada en la superficie de las células tumorales se determinó mediante análisis FACS extracelular. Se tiñeron células SE-2 (ATCC, Estados Unidos, n.° de cat. CRL-1978) durante 30 minutos en hielo con 5 pg/ml o 1 pg/ml de scFv o IgG2 de ratón anti-PD-L1 humano (BioLegend, Estados Unidos, n.° de cat. 329716). Los scFv unidos se detectaron mediante tinción con proteína L biotinilada (Pierce, n.° de cat. PI-29997), seguido de tinción con estreptavidina-ficoeritrina (BD Pharmingen, Estados Unidos, n.° de cat. 554061). Tras el lavado, se usó yoduro de propidio para excluir las células muertas y las células se analizaron en FACSAria III (BD Biosciences). Las intensidades de fluorescencia media y mediana se muestran en la tabla 3. Los resultados demuestran que scFv1 es capaz de reconocer específicamente la forma natural de PD-L1 expresada en la superficie de las células ES-2.
Tabla 3
Figure imgf000033_0001
La unión de scFv1 a PD-L1 de superficie celular se investigó adicionalmente usando KinExA®. El método fue como se ha descrito en el ejemplo 4, excepto que la afinidad se determinó usando doce diluciones dobles en serie de células ES-2 (a partir de 26,4 millones por ml) que se valoraron por duplicado frente a una cantidad constante de scFv1 (50 pM). Estas mezclas se incubaron durante 5 horas, se centrifugaron durante 10 minutos a 3800 x g y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Para detectar la cantidad de scFv, las muestras se expusieron a un caudal de 0,25 ml/min a una fase sólida que contenía fusión PD-L1 Fc inmovilizada. Todas las etapas se llevaron a cabo a temperatura ambiente. El análisis con el software KinExA® Pro dio como lugar a un valor Kd calculado para la unión de scFv1 a PD-L1 superficie celular de 12,8 pM (figura 8).
Los resultados demuestran que scFv1 se une a la forma natural de PD-L1 expresada en la superficie de las células tumorales.
Ejemplo 7 - Secreción de ScFv
Para comparar las propiedades de scFv1 producido en cuerpos de inclusión por células de E. coli con las propiedades de scFv1 secretado por células de mamíferos, se produjo scFv1 en células CHO K1 adaptadas en suspensión (originalmente recibidas de ATCC y adaptadas al crecimiento sin suero en cultivo en suspensión) por Evitria (Zúrich, Suiza). La semilla se cultivó en un medio sin suero, químicamente definido, exento de componentes animales. Las células se transfectaron con un reactivo de transfección patentado, hecho a medida, y las células se cultivaron después de la transfección en un medio sin suero, exento de componentes animales. ScFv1 se purificó mediante cromatografía de afinidad de proteína L seguida de cromatografía de exclusión por tamaño.
La capacidad de neutralización de PD-L1 de scFv1 expresado en células CHO y células de E. coli se comparó en un ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1. En este ensayo, la actividad luciferasa es promovida por la actividad de los linfocitos T. La interacción de PD-L1 con PD-1 crea una señal inhibidora y una reducción de la actividad luciferasa, que se supera mediante el tratamiento de las células con un inhibidor de PD-L1. Se sembraron células CHO que expresaban PD-L1 (Promega, CS187103) en microplacas de 96 pocillos. Se añadieron concentraciones crecientes de scFv y las placas se incubaron durante 20 minutos a 37 °C, CO2 al 5 %. Se añadieron células efectoras Jurkat que expresan PD-1 (Promega, CS187105) y las placas se incubaron durante 6 horas más a 37 °C, CO2 al 5%. La activación de TCR/CD3 se midió mediante detección luminiscente con el sistema de ensayo de luciferasa Bio-Glo (Promega, G7941). Se representaron curvas de inhibición y los valores de CI50 se calcularon usando el programa informático GraphPad Prism®, versión 7.02. Los resultados para scFv1 expresado por células CHO, scFv1 y scFv2 expresados por células de E. coli se muestran en la figura 9. El scFv1 expresado por células CHO bloqueó eficazmente la señal inhibidora mediada por PD-L1 con una CI50 de 602 pM. El scFv1 expresado por células de E. coli bloqueó eficientemente la señal inhibidora del punto de control inmunitario con una CI50 de 874 pM. El scFv2 que no se une no mostró ningún efecto sobre la señal inhibidora del punto de control inmunitario.
Ejemplo 8 - Actividad in vivo
La eficacia in vivo de scFv1 se examinó usando un modelo de cáncer de pulmón humano HCC827 en ratonas NOG de 5-6 semanas de edad (Vital River Laboratory Animal Technology Co., Beijing, China). Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la sangre de cuatro donantes humanos sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad usando procedimientos convencionales. Después de la centrifugación, las células se lavaron con solución de PBS y se resuspendieron en PBS. Las PBMC de cada donante se transfirieron a ratones mediante inyección i.p. de 5x106 células en 0,1 ml de PBS tres días antes de la inoculación de células tumorales HCC827. A continuación, se inocularon a cada ratón por vía subcutánea en la región del flanco derecho 5 x 106 células tumorales HCC827 en 0,1 ml de PBS. La fecha de inoculación de las células tumorales se indicó como día 0. Los ratones se asignaron al azar el día 1 y se trataron dos veces al día con inyecciones intraperitoneales (i.p.) de 15 mg/kg de scFv1 o el scFv2 que no se une, o dos veces por semana con inyecciones intravenosas (i.v.) de 5 mg/kg de un anticuerpo IgG de control positivo (un análogo de MPDL3280A). El volumen tumoral se midió al menos dos veces por semana y se expresó en mm3 usando la fórmula V = 0,5 a x b2, donde a y b son la longitud y la anchura del tumor, respectivamente. La inhibición del crecimiento tumoral (Tumor Growth Inhibition, TGI) es una indicación de la eficacia antitumoral y se expresa como TGI (%) = 100 x (1-(volumen tumoral medio del grupo tratado)/(volumen tumoral medio del grupo de scFv2)). El día 14, los animales con PBMC de los dos donantes que mostraron la mayor inhibición del crecimiento tumoral se seleccionaron para la continuación del estudio. El día 21, se sacrificaron todos los animales. El tamaño del grupo fue n = 3 por grupo por donante, para un tamaño de grupo total de n = 6 con los dos donantes seleccionados. La relación de tratamiento con respecto a control (T/C) se calculó como la relación de la mediana de los volúmenes tumorales del grupo tratado con scFv1 o con IgG de control positivo en comparación con el grupo de control de scFv2 que no se une, usando la fórmula T/C (%) = (mediana del volumen tumoral del grupo tratado/mediana del volumen tumoral del grupo de control) x 100.
Se muestran T/C y TGI para los dos donantes seleccionados (n = 6) en la figura 10. La eficacia de scFv1 y el anticuerpo IgG de control positivo se evaluó el día 21 (tabla 4). Tres de los seis ratones tratados con scFv1 estaban exentos de tumores y el TGI para los animales tratados con scFv1 fue del 47 %. La relación T/C fue del 28 %. El criterio eficaz para la relación de % de T/C según los patrones del Instituto Nacional del Cáncer es < 42 %. En conjunto, estos datos demuestran la eficacia in vivo de scFv1.
Tabla 4
Figure imgf000034_0001
Ejemplo 9 - Caracterización en formato IgG
ScFv1 se volvió a formatear en formato IgG (IgG_1), con la cadena pesada SEQ ID NO: 20 y la cadena ligera SEQ ID NO: 24. También se prepararon anticuerpos correspondientes a la secuencia publicada de YW243.55.S70 como se describe en el documento US2010/0203056 (IgG_2, con la cadena pesada Se Q ID NO: 21 y la cadena ligera SEQ ID NO: 25), 2.14H90PT como se describe en el documento WO2011/066389/A1 (IgG_3, con la cadena pesada SEQ ID NO: 22 y la cadena ligera SEQ ID NO: 26) y H2M8314N como se describe en el documento WO2015/112805A1 (IgG_4, con la cadena pesada SEQ ID NO: 23 y la cadena ligera SEQ ID NO: 27). La síntesis fue realizada por Evitria (Zúrich, Suiza). Para la producción se usaron células CHO K1 adaptadas a la suspensión recibidas originalmente de ATCC y adaptadas al crecimiento sin suero en cultivo en suspensión. Los anticuerpos IgG se purificaron mediante

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que tiene una especificidad de unión para PD-L1, que comprende
(i) la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1; y
(ii) la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 2.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende además una secuencia conectora, en donde la secuencia conectora es la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 10.
3. El anticuerpo de la reivindicación 2, que comprende la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 11 o secuencias al menos un 90 % idénticas a las mismas.
4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es o comprende
(i) un fragmento de anticuerpo tal como un Fab, un Fab', un F(ab)'2, un scFv, un fragmento Fv o un scFab; y/o (ii) una molécula de anticuerpo de longitud completa.
5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende un dominio Fc, por ejemplo, un dominio Fc que se modifica de modo que no induzca respuestas inmunitarias citotóxicas.
6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo comprende una región constante seleccionada del grupo que consiste en el isotipo IgG1, lgG2, lgG3 o lgG4 humano, o el isotipo lgG1, lgG2A, lgG2B o lgG3 murino.
7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo está glucosilado, tal como PEGilado o HESilado, y/o está marcado o conjugado con un segundo resto.
8. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Un vector, tal como un vector de expresión o un vector de clonación, que comprende la secuencia de la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8.
10. Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8 o el vector de la reivindicación 9.
11. Una composición, tal como una composición cosmética, de diagnóstico o farmacéutica, que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8, el vector de la reivindicación 9 o la célula hospedadora de la reivindicación 10; y además un vehículo, tal como un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8, el vector de la reivindicación 9 o la composición de la reivindicación 11, para su uso en el tratamiento, la prevención o el retardo de la progresión de una enfermedad mediada por PD-L1, en donde la enfermedad mediada por PD-L1 es cáncer, tal como al menos uno de CPNM (carcinoma de pulmón no microcítico), cáncer urotelial, melanoma, carcinoma de células renales, linfoma de Hodgkin, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer gastrointestinal, cáncer hepatocelular, glioma, cáncer de mama, linfoma, carcinoma de pulmón microcítico, síndromes mielodisplásicos, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer de riñón de células no claras, cáncer colorrectal, sarcomas, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas o cáncer gástrico, cáncer de piel, cáncer de útero, glioblastoma, leucemia, carcinoma, carcinoma de células de Merkel o carcinoma de células renales (CCR), neoplasia hemática, mieloma múltiple, leucemia linfoblástica (LLA), leucemia de linfocitos B, leucemia linfocítica crónica, linfoma no hodgkiniano y cáncer de ovario; o en donde dicha enfermedad es septicemia, ictus o infección por patógenos.
13. Un método in vitro de detección de la presencia de PD-L1 en una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de origen humano tal como una muestra de sangre, una muestra de orina, una muestra de líquido cefalorraquídeo, una muestra de biopsia y/o una muestra de linfa, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en condiciones permisivas para la unión específica del anticuerpo a PD-L1, y
(b) detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo y PD-L1.
14. El método de la reivindicación 13, en donde el método es un método para seleccionar sujetos elegibles para terapia con el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
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