JP7080819B2 - Ｐｄ－ｌ１に対する結合メンバー - Google Patents

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Description

ヒト化抗体フラグメントなどのＰＤ－Ｌ１に対する結合メンバー、詳細には、治療および診断用途に適用可能な、一価の、非常に強力で安定な抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖが与えられる。当該結合メンバーをコードする核酸分子、それぞれの核酸分子の配列を含むベクター、ベクターまたはそれぞれの核酸分子の塩基配列を含む宿主細胞、結合メンバーまたは核酸分子を含む医薬組成物および診断用組成物、ならびにそれらの使用も与えられる。
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄細胞上に発現される細胞表面レセプターである。ＰＤ－１は、２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１（Dong H, et al.Nat Med.1999;5:1365-1369）およびＰＤ－Ｌ２（Latchman Y. et al Nat Immunol.2001;2:261-8）に結合する。
リガンドＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２のいずれかがＰＤ－１に結合すると、ＩＬ－２産生およびＴ細胞増殖のＴＣＲ媒介性の活性化を阻害する阻害性シグナル伝達カスケードがＴ細胞内で誘発される。ＰＤ－Ｌ１（プログラム死－リガンド１）は、ほとんどのヒト癌細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＩＦＮγによって構成的に発現または誘導される１型膜貫通タンパク質である。
ＰＤ－１に加えて、ＰＤ－Ｌ１は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ－４に結合することができる膜レセプターであるＣＤ８０（Butte M.J. et al (2007) 27:111-122）に結合する。しかしながら、ＰＤ－Ｌ１は、ＣＤ８０よりもＰＤ－１と強く相互作用する。ＰＤ－１と同様に、ＣＤ８０は、Ｔ細胞およびＢ細胞上に発現される膜レセプターである。ＰＤ－１またはＣＤ８０のいずれかへのＰＤ－Ｌ１結合は、Ｔリンパ球への阻害シグナルを伝達し、Ｔ細胞遊走、増殖、および細胞傷害性メディエーターの分泌を抑制し、腫瘍細胞の殺滅を減少させる。しかし、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用はＴ細胞疲弊を誘発するが、ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８０相互作用はＴ細胞アネルギーを誘発する。疲弊は、数週間または数ヶ月の期間にわたって進行性であり、慢性的な抗原刺激に依存し、一方、アネルギーは、適当な共刺激の非存在下で抗原刺激後に迅速に誘発されるので、これらは別個のプロセスである。
結果として、ＰＤ－Ｌ１発現は、腫瘍細胞をＴ細胞媒介性破壊から保護する（Haile S.T. et al (2011), J Immunol.;186(12):6822-9; Haile S.T. et al (2013), J Immunol.; 191(5): 2829-2836）。ＰＤ－Ｌ１レベルのアップレギュレートは、腫瘍の攻撃性の増加および死亡リスクの増加と相関する。動物研究は、モノクローナル抗体によるＰＤ－Ｌ１：ＰＤ－１相互作用の遮断が、Ｔ細胞活性化を改善し、腫瘍の進行を低減することを実証した。さらに、Ｔ細胞発現ＣＤ８０によるＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の抗体遮断は、Ｔ細胞アネルギーを妨げる。
ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１のいずれかを遮断するモノクローナル抗体は、疾患の進行期および転移期であっても広範な癌サブタイプにわたって優れた活性を示している（Maute et al (2015), PNAS, 112(47): E6506-E6514）。これまでの研究では、免疫病理のリスクを最小限に抑えながら免疫を増強する観点から、ＰＤ－１またはＣＤ８０単独とのＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断がより有益であると示唆されたが（Butte MJ (2008), Mol Immunol;45(13):3567-72）、ＰＤ－１とＣＤ８０の両方とのＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断するモノクローナル抗体による最近の臨床試験は、いくつかの癌において顕著な臨床的成功を示し、従来の化学療法よりも毒性が低い。患者のサブセットのみがチェックポイント遮断に応答するが、免疫記憶によるこのような応答の持続時間は注目に値し、難治性疾患で他の薬剤で予想されるよりも長い（Janakiram M et al (2016), Immunotherapy; 8(7):809-19）。
アテゾリズマブ（例えば、米国第８，２１７，１４９号に記載されているＭＰＤＬ３２８０Ａ）は、ＰＤ－１およびＣＤ８０へのレセプター結合が遮断されるようにＰＤ－Ｌ１を標的とするヒト化ＩｇＧ１抗体である。抗体は、Ｆｃ－エフェクター機能が低下し、それと共にＰＤ－Ｌ１を発現する細胞の枯渇が減少するように改変された。２０１６年１０月、ＦＤＡは、白金含有化学療法中または当該療法後の疾患進行がある転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者の治療用にアテゾリズマブを承認した。腫瘍がＥＧＦＲまたはＡＬＫゲノム異常を有する場合、患者は、抗体を受ける前に、これらの異常についてＦＤＡ認可の療法で疾患の進行があるべきである。基礎となる臨床試験では、ＰＤ－Ｌ１の状態にかかわらず患者を登録し、扁平上皮疾患および非扁平上皮疾患の両方のタイプを含めた。２０１６年５月、ＦＤＡは、白金含有化学療法中または当該療法後の疾患進行がある局所進行性または転移性の尿路上皮癌を有する患者の治療用にアテゾリズマブを承認した。
デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６；例えば、米国第８，７７９，１０８号、国際公開第２０１００７７６３４号参照）は、ＰＤ－Ｌ１に結合するとＰＤ－１およびＣＤ８０の両方の相互作用を遮断するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４ XenoMouse動物を免疫し、定常ドメインをヒトＩｇＧ１トリプル変異体ドメインと交換することによって当該抗体を作製した。この定常ドメインは、Ｃ１ｑおよびＦｃガンマレセプターへの結合を低下させる３つの点変異を含み、当該変異は、抗体依存性細胞傷害性および補体依存性細胞傷害性を低下させる。当該抗体は、局所進行性または転移性ＮＳＣＬＣ、尿路上皮癌、頭頸部癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、卵巣癌、乳癌、ＳＣＬＣおよび胃癌、ならびに頭頸部の再発性または転移性ＰＤ－Ｌ１陽性扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）を含む多くの適応症の単独療法として臨床試験中である。併用療法の臨床試験は進行中である。
ＰＤ－１を標的とし、ＰＤ－Ｌ１とのＰＤ－１およびＣＤ８０の相互作用の両方を遮断する他の抗体は、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、国際公開第２０１３０７９１７４号に記載）である。完全ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体は、天然のＦｃ領域を保持し、したがって、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導し得る。当該抗体は、固形腫瘍、胃癌、メルケル細胞癌、およびＮＳＣＬＣについて臨床試験中である。
免疫チェックポイントインヒビターを標的とする改良された化合物の必要性、ならびに免疫系関連障害、例えば、癌、免疫不全、自己免疫疾患、アレルギー、炎症性障害、移植拒絶、および他の障害を治療するための安全かつ有効な治療方法を提供する必要性が依然として存在する。
本発明はＰＤ－Ｌ１に結合する結合メンバーを与え、本発明は、当該メンバーを、コードする核酸およびベクター、発現する宿主細胞、含む組成物、ならびに療法におけるそれらの使用を含む。
当該結合メンバーは、以下の特性のうちの１つ以上を有する。
（ａ）免疫グロブリンとして、ならびにｓｃＦｖなどの一価抗体フラグメントフォーマットでの両方で、ＰＤ－Ｌ１に対して高い親和性を有する。
（ｂ）一価型の場合は実施例４に示した条件下で、または二価型の場合は実施例９に示した条件下で、結合平衡除外法（Kinetic Exclusion Assay）によって測定して１０ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＰＤ－Ｌ１に結合する。
（ｃ）ヒトＰＤ－１およびヒトＣＤ８０の両方とのヒトＰＤ－Ｌ１相互作用を妨げるＰＤ－Ｌ１上のエピトープに結合する。
（ｄ）サルＰＤ－Ｌ１と交差反応する。
（ｅ）サルＰＤ－Ｌ１と結合し、サルＰＤ－Ｌ１に対する結合親和性がヒトＰＤ－Ｌ１に対してと少なくとも同等、より好ましくは少なくとも２倍強い。
（ｆ）ヒトＰＤ－Ｌ２またはヒトＢ７－Ｈ３に結合しない。
（ｇ）ＨＣＣ８２７ヒト肺癌モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する。
（ｈ）ｓｃＦｖフォーマットで、ｐＨ７．２のＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌの濃度で３７℃で１または２週間の保存後に３％未満の二量体を形成する。
当該結合メンバーは、好ましくは、（ｉ）それぞれ配列番号６、７、および８に示される可変重鎖ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３配列のうちの少なくとも１つ、ならびに／もしくは（ｉｉ）それぞれ配列番号３、４、および５に示される可変軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列のうちの少なくとも１つ、またはそれらの変異体を含む。
当該結合メンバーは、癌および炎症性疾患の治療ならびに診断に使用され得る。関連する核酸、ベクター、細胞、組成物、方法、およびキットも与えられる。
ｓｃＦｖ１が細胞ベースの系において組み換えヒト（ｒｈ）ＰＤ－Ｌ１およびｒｈＰＤ－１媒介性免疫チェックポイント阻害シグナルを遮断することを示す。 ｓｃＦｖ１がＥＬＩＳＡでｒｈＰＤ－Ｌ１とｒｈＰＤ－１との間の相互作用を遮断することを示す。バックグラウンドレベルはｓｃＦｖおよびＰＤ－１の非存在下で測定した。 ｓｃＦｖ１がＥＬＩＳＡでｒｈＰＤ－Ｌ１とｒｈＣＤ８０との間の相互作用を遮断することを示す。バックグラウンドレベルはＰＤ－Ｌ１の非存在下で測定した。 ＥＬＩＳＡによって測定したｒｈＰＤ－Ｌ１に結合するｓｃＦｖ１の能力は、ヒト血清中で３７℃で保存した後でも影響を受けないことを示す。 結合平衡除外法（Kinetic Exclusion Assay）でｓｃＦｖ１がｒｈＰＤ－Ｌ１に結合することを示す。 結合ＥＬＩＳＡによって、ｓｃＦｖ１が組み換えヒトおよびサルＰＤ－Ｌ１に結合するが、ラットＰＤ－Ｌ１に結合しないことを示す。バックグラウンドレベルは、ｓｃＦｖの非存在下で示され、タンパク質の機能性は、実施例５で定義される陽性対照抗体の使用によって確認される。 結合平衡除外法（Kinetic Exclusion Assay）でｓｃＦｖ１が組み換えサルＰＤ－Ｌ１に結合することを示す。 結合平衡除外法（Kinetic Exclusion Assay）でｓｃＦｖ１が細胞の表面上のヒト天然型のＰＤ－Ｌ１に結合することを示す。 大腸菌封入体から産生されたｓｃＦｖ１またはＣＨＯ細胞から分泌されたｓｃＦｖ１が、細胞ベースの系においてＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用の類似の阻害を示すことを示す。 ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共に投与されたヌードマウスにおけるＨＣＣ８２７ヒト肺癌モデルにおいてｓｃＦｖ１が腫瘍の縮小を促進することを示す。Ａ：実施例８で定義される対照（非結合ｓｃＦｖ２）に対する治療（ｓｃＦｖ１または陽性対照ＩｇＧ）の比。Ｂ：実施例８で定義される腫瘍増殖阻害（非結合ｓｃＦｖ２と比較したｓｃＦｖ１または陽性対照ＩｇＧ）。 ＩｇＧ＿１およびＩｇＧ＿２は、ｒｈＰＤ－Ｌ１とｒｈＰＤ－１との間の相互作用の阻害においてＩｇＧ＿３およびＩｇＧ＿４より有効であることを示す。バックグラウンドレベルはＩｇＧおよびＰＤ－１の非存在下で測定した。 ＩｇＧ＿１（Ａ）は、ＩｇＧとＰＤ－Ｌ１との間の相互作用においてＩｇＧ＿２（Ｂ）よりも親和性が強いことを示す。
詳細な説明
本明細書に開示される結合メンバー、核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、方法、および使用に関する説明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。
定義
別段の定義がない限り、説明、図、および特許請求の範囲で使用される全ての他の科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解されるような通常の意味を有する。本明細書で開示される結合メンバー、核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、方法、および使用の実施または試験において、本明細書に記載された方法および材料と類似または均等の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体で参照により援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。材料、方法、および実施例は、例示的なものに過ぎず、限定するものではない。
本明細書で使用される用語「投与」は、物質、例えば、化合物、例えば医薬品、または他の薬剤、例えば抗原を対象に移入、送達、導入、または輸送する任意の様式を指す。投与様式には、限定はされないが、非経口投与、経口、直腸内、全身、静脈内、皮下、泌尿生殖器、局所、硝子体内、眼内、耳内、鼻腔内、経皮、皮内、皮膚、腹腔内、筋肉内、舌下、または口腔投与が含まれる。１つ以上の治療薬などの他の物質との「併用」での投与には、同時（simultaneous）（同時（concurrent））および任意の順序での連続投与が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「保存的修飾」および「保存的置換」は、対応する基準に関して物理的、生物学的、化学的、および／または機能的に特性を維持する修飾および置換をそれぞれ指す。例えば、保存的置換を有する配列を含む分子は、類似のサイズ、形状、電荷、化学的特性、例えば共有結合もしくは水素結合を形成する同等の能力、および／または同等の極性を有し得る。このような保存的修飾には、１つ以上の核酸塩基およびアミノ酸の置換、付加、および欠失が含まれるが、これらに限定されない。
例えば、保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものが含まれる。例えば、抗原への結合に関して必須ではないアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換することができ、例えば、スレオニンをセリンで置換し得る。アミノ酸残基は、通常、以下のように、共通、類似の側鎖特性に基づいてファミリーに分けられる。
１． 非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン）
２． 非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、プロリン、システイン、トリプトファン）
３． 塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン）
４． 酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）
５． ベータ－分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および
６． 芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）
保存的置換は、上記の６つのグループのうちの１つに含まれる第１のアミノ酸を、６つのグループのうちの同じグループ内の他のアミノ酸により置換することとみなすことができる。好ましい保存的置換には、以下が含まれる。
１． アラニン（Ａ）をバリン（Ｖ）により置換すること
２． アルギニン（Ｒ）をリシン（Ｋ）により置換すること
３． アスパラギン（Ｎ）をグルタミン（Ｑ）により置換すること
４． アスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）により置換すること
５． システイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）により置換すること
６． グルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｄ）により置換すること
７． グリシン（Ｇ）をアラニン（Ａ）により置換すること
８． ヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）により置換すること
９． イソロイシン（Ｉ）をロイシン（Ｌ）により置換すること
１０． メチオニン（Ｍ）をロイシン（Ｌ）により置換すること
１１． フェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）により置換すること
１２． セリン（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）により置換すること
１３． トリプトファン（Ｗ）をチロシン（Ｙ）により置換すること
１４． フェニルアラニン（Ｆ）をトリプトファン（Ｗ）により置換すること
および／または
１５． バリン（Ｖ）をロイシン（Ｌ）により置換すること
ならびにそれらの逆。プロリン（Ｐ）をアラニン（Ａ）により置換するなどの他の置換も許容され、経験的に、または他の公知の保存的置換もしくは非保存的置換を踏まえて決定することができる。保存的置換はまた、非天然アミノ酸の使用を伴い得る。
非保存的置換、すなわち、あるファミリーの構成要素を別のファミリーの構成要素と交換することは、 特に標的分子への結合に不可欠なアミノ酸が影響を受ける場合には、例えば、結合メンバーの電荷、双極子モーメント、サイズ、親水性、疎水性、またはコンフォメーションに関して、実質的な変化につながり得、結合活性を変化させる可能性がある。非保存的置換はまた、非天然アミノ酸の使用を伴い得る。
保存的および非保存的修飾は、当技術分野で公知の様々な標準的技術によって、例えば、コンビナトリアルケミストリー、部位特異的ＤＮＡ突然変異誘発、ＰＣＲ媒介および／またはカセット突然変異誘発、ペプチド／タンパク質化学合成、適当な改変の導入、結合メンバーをコードする新しい塩基配列の構築、および／または親結合メンバー中の反応性基を特異的に修飾する化学反応によって、親結合メンバーに導入することができる。変異体は、それらの化学的、生物学的、生物物理学的、および／または生化学的特性について、常法により試験することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、親配列の機能的特徴を実質的に変化させず、通常は構造的特徴も実質的に変化させない。したがって、保存的置換を含む結合メンバーの結合特性は、少なくとも本質的に変わらない。さらに、保存的アミノ酸置換は、通常、親配列の二次構造を実質的に修飾または破壊しない。
用語「標識」は、本明細書では、物理的または化学的手段による直接的または間接的なその検出または測定が、試料中の選択された標的の生物学的実在を示す物質を指すために使用される。有用な検出可能な標識の代表的な例には、光吸収、蛍光、反射率、光散乱、リン光、もしくは発光特性に基づいて直接的もしくは間接的に検出可能な分子もしくはイオン、放射性特性によって検出可能な分子もしくはイオン、または核磁気共鳴もしくは常磁性によって検出可能な分子もしくはイオンが含まれるが、これらに限定されない。標識は、いくつかの実施形態において、吸光または蛍光に基づいて間接的に検出することができる分子、例えば適当な基質を、例えば非光吸収性分子から光吸収性分子に、または非蛍光性分子から蛍光分子に変換させる様々な酵素であり得る。
本明細書に開示される結合メンバーを含む化合物などの物品の「有効量」または「治療有効量」は、単回用量としてまたは一連の用量の一部として、適用される投薬計画で所望の治療効果をもたらす、すなわち特定の治療目標に達する量である。治療有効量は、通常、関連する病的状態の治療もしくは管理において治療上の利益を与えるのに、または当該状態の存在に関連する１つ以上の症状を遅延もしくは最小限にするのに十分な量である。投与量は、患者および臨床学的因子（例えば、患者の年齢、体重、性別、病歴、障害の重症度、および／または治療に対する応答）、治療される障害の性質、投与される具体的な組成物、投与経路、ならびに他の因子を含む様々な因子に依存する。
用語「から本質的になる」は、試料または組成物の特性に影響を与えない試料または組成物中の追加の成分の存在を可能にすると理解される。実例として、医薬組成物は、活性成分から本質的になる場合、賦形剤を含み得る。
本開示の範囲内で、用語「抗体」は、全長免疫グロブリンおよびそのフラグメントを指す。当該全長免疫グロブリンは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ベニヤ（veneered）抗体、および／またはヒト抗体であり得る。キメラ抗体は、例えば、異なる種および／もしくは異なるアイソタイプの定常領域を含み得るか、または人工の二重特異性もしくは多重特異性のコンストラクト、例えば、クアドローマ（quadroma）、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ（ＫｉＨ）、またはCrossMabまたはDuoBodyであり得る。当該用語はまた、全長免疫グロブリンが抗体フラグメントまたは非抗体骨格に融合されているコンストラクトを包含する。これらの例示的な例として、Dimasi N. et al (2009), JMB 393, 672-692に記載されているＢｓ１Ａｂ、Ｂｓ２Ａｂ、Ｂｓ３Ａｂ、Ｂｓ４Ａｂ、Ｔｓ１Ａｂ、およびＴｓ２Ａｂが挙げられるが、これらに限定されない。他のキメラ抗体には、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ－ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、ＦｙｎｏｍＡＢｓ、またはＢｉＴＥ－ＫＩＨが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、グリコシル化されていることがあり得、他の実施形態において、当該抗体はグリコシル化されていない。
抗体またはタンパク質性結合分子などのポリペプチドに関して「フラグメント」とは、全長免疫グロブリン配列よりも短く、かつ、目的のタンパク質の機能を果たすこと、抗体の場合には、所望の標的、例えば抗原（例えば、ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合することが可能である限り、対応するポリペプチド中に存在する任意のアミノ酸配列を意味する。用語「抗体フラグメント」は、特定の標的、典型的には分子に対する特異的結合親和性を示す抗体の部分を指し、しばしば超可変領域および周囲の重鎖および軽鎖の部分を指す。超可変領域は、ポリペプチド標的に物理的に結合する抗体の一部分である。したがって、抗体フラグメントは、抗体の標的特異性を保持する全長抗体の１つ以上の部分を含むか、またはそれらからなる。当該抗体フラグメントは、例えば、全長抗体の定常領域（Ｆｃ領域）を少なくとも部分的に欠くことがある。いくつかの実施形態において、全長抗体の消化によって抗体フラグメントが産生される。抗体フラグメントは、抗体の１つ以上の部分を含む合成または組み換えコンストラクトであってもよい（例えば、Holliger P and Hudson J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains.Nature Biotechnol.2005, vol. 23, 9, p.1126を参照）。抗体フラグメントの例には、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂ、ＶＨＨ、ナノボディ、Ｖ（ＮＡＲ）またはいわゆる最小認識ユニット、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、線状二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ－ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ－ｓｃＤｂ）、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、タンデムｓｃＦｖ、またはタンデムジ－ｓｃＦｖとも呼ばれる）、ＤＡＲＴ、タンデムトリｓｃＦｖ、トリ（ア）ボディ、二重特異性Ｆａｂ２、ジミニ抗体、テトラボディ、ジダイアボディ、またはｓｃＦａｂ－ｄｓｓｃＦｖが含まれるが、これらに限定されない。
「単鎖可変断片」または「単鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」は、抗体フラグメントの種類の例である。ｓｃＦｖは、リンカーによって連結された抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む融合タンパク質である。したがって、ｓｃＦｖは、全長抗体に存在する定常Ｆｃ領域が欠けている。
本明細書で使用される「結合メンバー」は、本明細書に開示される１つ以上のＣＤＲと、必要に応じて可変軽鎖および／または重鎖とを含むタンパク質性結合分子を指す。このように、用語「結合メンバー」は、抗体（すなわち、上記の全長免疫グロブリンおよび抗体フラグメント）、タンパク質性非抗体骨格、ならびに／または他の結合化合物を含む。いくつかの実施形態において、非抗体骨格は、本明細書に開示される１つ以上のＣＤＲ配列を含む。当該結合メンバーは、一価または多価であること、すなわち１つ以上の抗原結合部位を有することができる。一価結合メンバーの非限定的な例には、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂ、ＶＨＨ、Ｖ（ＮＡＲ）（またはいわゆる最小認識ユニット）、ＤＡＲＰｉｎ、アフィリン、およびナノボディが含まれる。多価結合メンバーは、２、３、４、またはそれ以上の抗原結合部位を有することができる。全長免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ（またはタンデムｓｃＦｖまたはＢｉＴＥ）、ＤＡＲＴ、ダイアボディ、ｓｃＤｂ、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ｆｃ－ｓｃＦｖ、Ｆｖ２－Ｆｃ、ＦｙｎｏｍＡＢｓ、クアドローマ（quadroma）、CrossMab、DuoBody、トリアボディ、およびテトラボディは、多価結合メンバーの非限定的な例であり、例示的な多価結合メンバーにおいて、２つの結合部位が存在する、すなわち、結合メンバーは二価である。
いくつかの実施形態において、多価結合メンバーは、二重特異性であり、すなわち、結合メンバーは２つの異なる標的または１つの標的分子上の２つの異なる標的部位に対するものである。二重特異性抗体は、例えば、Muller D. and Kontermann R.E.Bispecific antibodies.Edited by Dubel S. Weinheim: Wiley-VCH, 2007.ISBN 3527314539. p. 345において概説されている。いくつかの実施形態において、多価結合メンバーは、３つ以上の異なる結合部位、例えば３つまたは４つの異なる抗原それぞれに対しての３つまたは４つの異なる結合部位を含む。このような結合メンバーは、それぞれ多価かつ多特異性、具体的には三重特異性または四重特異性である。
「非抗体骨格」は、 Fielder M. and Skerra A. Non-antibody scaffolds.Edited by Dubel S. Weinheim: Wiley-VCH, 2007ISBN 3527314539. p. 467またはGilbreth R.N. and Koide S. Structural insights for engineering binding proteins based on non-antibody scaffolds.Curr.Opin.Struct.Biol.2012, vol. 22, p.413などに記載されている抗原結合ポリペプチドである。非限定的な例には、アフィボディ、アフィリン分子、ＡｄＮｅｃｔｉｎ、リポカリンファミリーのポリペプチドをベースとする突然変異タンパク質（Anticalins（登録商標））、ＤＡＲＰｉｎ、Ｋｎｏｔｔｉｎ、Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン、Ａｖｉｍｅｒ、ｆｙｎｏｍｅｒ、テトラネクチン、およびトランスボディが含まれる。Ａｖｉｍｅｒは、いくつかの細胞表面レセプターにおいて複数のドメインのストリングとして生じるいわゆるＡドメインを含む（Silverman J., et al., Nature Biotechnol.2005, vol. 23, p.1556）。それぞれのヒトホモ三量体タンパク質に由来するテトラネクチンは同様に、所望の結合のために改変することができるＣ型レクチンドメインにループ領域を含む（同書）。
本明細書に開示される結合メンバーは、必要に応じて、ＰＥＧ化または高度にグリコシル化されていてもよく、以下も参照されたい。いくつかの実施形態において、結合メンバーは、上記の例示的なタンパク質性結合分子のうちの１つと、アルブミン結合ドメイン、例えば、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、結合メンバーは、抗体フラグメント、例えば単鎖ダイアボディと、抗体結合ドメイン、例えば細菌抗体結合ドメインとの融合タンパク質である。実例として、単鎖ダイアボディは、Unverdorben（Protein Eng., Design & Selection, 2012, vol. 25, p.81）らによって記載されているブドウ球菌プロテインＡのドメインＢに融合されていてもよい。
「ＩＣ５０」または「最大半阻害濃度」は、アンタゴニスト効力の尺度であり、生物学的または生化学的機能を阻害する化合物の有効性を定量的に記載する。したがって、この値は、特定の生物学的または生化学的プロセスまたは機能を５０％阻害するために、結合メンバーなどの特定の物品がどれくらい必要であるかを示す。親和性の直接的な指標はないが、ＩＣ５０およびＫｉ値は相関しており、Ｃｈｅｎｇ－Ｐｒｕｓｏｆｆ方程式により求めることができる（Cheng Y. and Prusoff W.H.Relationship between the inhibition constant (Ki) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (IC50) of an enzymatic reaction.Biochem.Pharmacol.1973, vol. 22, p.3099; Rammes G., et al., PLOSONE 2009, vol. 4, p. 1-14; Zhen J., et al., Concentration of receptor and ligand revisited in a modified receptor binding protocol for high-affinity radioligands: [3H] spiperone binding to D2 and D3 dopamine receptors.J. Neurosci.Meth.2010, vol. 188, p.32）。
用語「フレームワーク」（ＦＲ）は、可変抗体ドメインの骨格である、それぞれのＣＤＲを含む可変軽鎖（ＶＬ）または可変重鎖（ＶＨ）を指す。ＶＬおよび／またはＶＨフレームワークは、ＣＤＲ領域に隣接する４つのフレームワークセクション、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４を通常含む。したがって、当技術分野で知られているように、ＶＬは一般構造：（ＦＲ－Ｌ１）－（ＣＤＲ－Ｌ１）－（ＦＲ－Ｌ２）－（ＣＤＲ－Ｌ２）－（ＦＲ－Ｌ３）－（ＣＤＲ－Ｌ３）－（ＦＲ－Ｌ４）を有し、一方、ＶＨは一般構造：（ＦＲ－Ｈ１）－（ＣＤＲ－Ｈ１）－（ＦＲ－Ｈ２）－（ＣＤＲ－Ｈ２）－（ＦＲ－Ｈ３）－（ＣＤＲ－Ｈ３）－（ＦＲ－Ｈ４）を有する。
用語「ＣＤＲ」は、抗原結合に主に寄与する抗体の超可変領域を指す。通常、抗原結合部位は、フレームワーク骨格に埋め込まれた６つのＣＤＲを含む。本明細書において、ＶＬのＣＤＲをＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３と呼び、ＶＨのＣＤＲをＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３と呼ぶ。これらは、KABAT, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest.5th edition.Edited by U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES.NIH Publications, 1991. p. 91-3242に記載されているように同定することができる。しかしながら、本明細書で使用されるＣＤＲ－Ｈ１は、位置２７で開始し、位置３６より前で終わる点でKabatの定義とは異なる（ＡＨｏ位置２８～４２を含む）。
本明細書で使用される場合、抗体のＶＨおよびＶＬにおけるアミノ酸残基位置を同定するためのナンバリングシステムは、Honegger A.およびPluckthun A.によって記載された「ＡＨｏ」システムに対応する。免疫グロブリン可変ドメインのさらに別のナンバリングスキームはAn automatic modelling and analysis tool.J. Mol.Biol.2001, vol. 309, p.657である。この刊行物はさらに、ＡＨｏシステムとKabatシステムとの間の変換テーブルを与える（Kabat E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest.5th edition.Edited by U.S. Department of Health and Human Services.NIH Publications, 1991.No. 91-3242)。
「ヒト化」抗体は、非ヒト親抗体の１つ以上、典型的には６つ全てのＣＤＲ領域もしくはそれらの変異体、または合成ＣＤＲを含み、そのフレームワークが、例えば（ｉ）非ヒト親抗体の１つ以上のフレームワーク残基を含む可能性があるヒトフレームワーク、または（ｉｉ）天然に産生されるヒトフレームワークとの類似性を増加させるように改変された非ヒト抗体由来のフレームワークである抗体を指す。抗体をヒト化する方法は、当技術分野、例えば、Leger O., and Saldanha J. Antibody Drug Discovery.Edited by Wood C. London: Imperial College Press, 2011.ISBN 1848166281. p.1-23で公知である。
用語「単離」は、ペプチド、核酸分子、もしくは細胞などの物質が、その正常な生理環境、例えば天然源から取り出されたこと、またはペプチドもしくは核酸が合成されることを示す。用語「単離」の使用は、天然に存在する配列がその正常細胞（例えば、染色体）環境から取り出されたことを示す。したがって、配列は、無細胞溶液中に存在してもよく、または異なる細胞環境に置かれてもよい。ポリペプチドまたは核酸分子に関して「単離」とは、天然源から単離されるか、または合成されるポリペプチドまたは核酸分子を含む、互いに結合した２つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドのポリマーを意味する。用語「単離」は、配列に、アミノ酸鎖またはヌクレオチド鎖だけが存在することを意味するのではなく、配列が、それぞれ配列と自然に関連する非アミノ酸物質および／または非核酸物質などを実質的に含まないことを意味する。「単離細胞」は、細胞に自然に付随する分子および／または細胞成分から分離される細胞を指す。
本明細書で使用される用語「同一性」は、２つのタンパク質または核酸間の配列の一致を指す。比較するタンパク質または塩基配列を、例えば、EMBOSS Needle（ペアワイズアラインメント；www.ebi.ac.ukで利用可能）などのバイオインフォマティクスツールを使用するか、またはマニュアルアラインメントおよび目視検査により、比較ウィンドウにわたって一致が最大となるようにアラインメントする。比較する配列中の同じ位置が同じ核酸塩基またはアミノ酸残基によって占められている場合、それぞれの分子はちょうどその位置で同一である。したがって、「同一性パーセント」は、一致位置の数を比較した位置の数で割って１００％を掛けた関数である。例えば、１０個の配列位置のうち６個が同一である場合、同一性は６０％である。一致が最大となるように配列をアラインメントするには、ギャップを導入する必要があり得る。２つのタンパク質配列間の同一性パーセントは、例えば、EMBOSS Needleに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needlemann S.B. and Wunsch C.D.A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins.J. Mol.Biol.1970, vol. 48, p.443)を使用して、BLOSUM62マトリックス、「ギャップオープンペナルティ」１０、「ギャップ伸長ペナルティ」０．５、偽「エンドギャップペナルティ」、「エンドギャップオープンペナルティ」１０、および「エンドギャップ伸長ペナルティ」０．５を用いて、または同一性を最大にする方法でギャップを手動で導入する配列整列方法によって求めることができる。したがって、一実施形態では、配列同一性を最大化する方法で手動でギャップを導入することによって、本明細書に開示される配列をアラインメントする。同一の一次アミノ酸または塩基配列を有する２つの分子は、化学的および／または生物学的修飾にかかわらず同一である。例えば、同じ一次アミノ酸配列を有するが異なるグリコシル化パターンを有する２つの抗体は、この定義では同一である。核酸の場合、例えば、同じ配列を有するがリン酸の代わりにチオリン酸などの異なる結合成分を有する２つの分子は、この定義では同一である。いくつかの可変ドメインまたは１つ以上の定常ドメインを含むことなどにより本明細書で与えられるいずれかの配列よりも長い配列は、比較ウィンドウにわたる配列同一性が示されている場合、本明細書に開示される基準配列となおも同一であるものとする。本明細書で使用される比較ウィンドウは、請求項に係る配列全体を含む。同様に、環外修飾のためにのみ異なる核酸塩基、例えばシトシンおよび５－メチル－シトシンは、この定義では同一である。
本明細書で使用される用語「核酸分子」は、一本鎖、二本鎖、またはそれらの組み合わせなどの任意の可能な構成の任意の核酸を指す。核酸の例には、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ヌクレオチド類似体を用いて、または核酸化学を用いて得られるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、ロックド核酸分子（ＬＮＡ）、タンパク質核酸分子（ＰＮＡ）、アルキルホスホネートおよびアルキルホスホトリエステル核酸分子、およびｔｅｃｔｏ－ＲＮＡ分子（例えばLiu B. et al., J. Am. Chem.Soc.2004, vol. 126, 4076）が含まれる。ＬＮＡは、より高い二本鎖安定性およびヌクレアーゼ耐性をそれぞれの分子に与える、Ｃ４’とＯ２’との間のメチレン架橋を有する修飾ＲＮＡ骨格を有する。アルキルホスホネートおよびアルキルホスホトリエステル核酸分子は、それぞれ、核酸骨格中のリン酸基のＰ－ＯＨ基をアルキルおよびアルコキシ基に交換することによって核酸骨格のリン酸基が中和されているＤＮＡまたはＲＮＡ分子と見ることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、ゲノムまたは合成起源のものであってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。このような核酸は、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ合成ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの共重合体、オリゴヌクレオチドなどであることができる。それぞれの核酸は、非天然ヌクレオチド類似体をさらに含んでもよく、かつ／または親和性タグもしくは標識に連結されていてもよい。
多くのヌクレオチド類似体が公知であり、本明細書に開示される方法で使用される核酸に使用することができる。ヌクレオチド類似体は、例えば塩基、糖、またはリン酸部分に修飾を含むヌクレオチドである。実例として、ｓｉＲＮＡの２’－ＯＨ残基を２’Ｆ、２’Ｏ－Ｍｅ、または２’Ｈ残基で置換することは、それぞれのＲＮＡのインビボ安定性を改善することが分かっている。塩基部分における修飾は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ／Ｕの天然または合成修飾、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル、および２－アミノアデニン－９－イルなどの異なるプリンまたはピリミジン塩基、ならびに非プリンまたは非ピリミジンヌクレオチド塩基であり得る。他のヌクレオチド類似体はユニバーサル塩基として役立つ。ユニバーサル塩基の例には、３－ニトロピロールおよび５－ニトロインドールが含まれる。ユニバーサル塩基は、他の塩基と塩基対を形成することができる。塩基修飾を、例えば糖修飾、例えば２’－Ｏ－メトキシエチルなどと組み合わせて、二本鎖安定性の増加などの特異的性質を得ることができる。
本明細書において使用される場合、「薬剤的に許容できる」という表現は、正しい医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、妥当な利益／リスク比に見合って、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適している活性化合物、材料、組成物、担体、および／または剤形に関する。
医学的／生理学的状況における、すなわち生理学的状態と関連する「予防」という用語は、生物体が異常な状態にかかるか、または発症する可能性を低下させることを指す。
「類似の」タンパク質配列は、アラインメントした場合に、比較される配列の同じ位置に類似のアミノ酸残基、ほとんどの場合に必須ではないが同一のアミノ酸残基を共有する配列である。類似のアミノ酸残基は、側鎖の化学的特徴によってファミリーに分類される。これらのファミリーは、「保存的アミノ酸置換」に関して上述されている。配列間の「パーセントの類似性」は、比較される配列の同じ配列位置に同一または類似の残基を含む位置の数を、比較した位置の総数で割って、１００％を掛けたものである。例えば、１０の配列位置のうち６つが同一のアミノ酸残基を有し、１０の位置のうち２つが類似の残基を含む場合、配列は８０％の類似性を有する。２つの配列間の類似性は、例えば、EMBOSS Needleを使用して求めることができる。いくつかの可変ドメインまたは１つ以上の定常ドメインを含むことなどにより本明細書で与えられるいずれかの配列よりも長い配列は、比較ウィンドウにわたる配列類似性が示されている場合、本明細書に開示される基準配列となおも類似であるものとする。本明細書で使用される比較ウィンドウは、請求項に係る配列全体を含む。
本明細書において使用される用語「特異的」は、結合メンバーまたは結合化合物が、ＰＤ－Ｌ１などの所定の標的に、＜１０－６モルの平衡結合定数ＫＤで結合することを示すと理解される。この定数は、例えば、Attana装置で水晶発振子微量天秤（ＱＣＭ）を用いて、BIACORE装置で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて、または結合平衡除外法（Kinetic Exclusion Assay）（KinExA（登録商標））を用いて測定することができる。
本明細書で使用される用語「層別化する」および「層別化」は、個体が、本明細書に開示される結合メンバーに応答する対応する確率などのそれぞれのグループに合致する特徴に従って特定のグループに割り当てられることを示す。グループは、例えば、結合メンバーの試験、処方、投与調節、一時停止、または断念に使用され得る。したがって、本発明に係る方法または使用のいくつかの実施形態では、療法の臨床試験のサブグループに対象を層別化し得る。
個体とも呼ばれる、本明細書で使用される用語「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、通常哺乳動物を指す。対象は、哺乳類、例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル（monkey）、サル（ape）、またはヒトであり得る。したがって、本明細書に記載の方法、使用、および組成物は、ヒトおよび動物の疾患の両方に適用可能である。以下により詳細に説明するように、試料は対象から得られ得る。したがって、試料中の発現レベルから導き出される結論およびそれに基づく決定は、試料が採取された対象に関するものであることが理解される。さらに、対象は典型的には生体であるが、本明細書に記載の方法または使用は死亡後分析にも使用され得る。対象が疾患または容態のために医療を受けている生きているヒトである場合、対象は「患者」とも呼ばれる。
本明細書で使用される用語「治療」および「治療する」は、治療効果を有し、かつ／または対象の生物における病的状態を含む異常な状態を予防、減速（緩和）、もしくは少なくとも部分的に緩和もしくは抑制する、予防的または防止的手段を含む。本開示に係る治療は、薬剤的に有効な量の本明細書中に記載の分子、すなわちとりわけ、本明細書に開示される結合メンバー（例えば抗体）、核酸、ベクター、または細胞を、治療を必要とする対象に投与して、ＰＤ－Ｌ１関連障害の１つ以上の症状を予防、治癒、発症および／または進行の遅延、重症度の軽減、安定化、調節、治癒、または寛解することを伴う。典型的には、結合メンバー、核酸、ベクター、または宿主細胞は、本明細書に記載のものを含む医薬組成物で与えられる。治療を必要とする者には、すでに障害を有する者および障害を有しやすい者、または障害を防止（予防）すべき者が含まれる。一般に、治療は、疾患または病的状態の存在および／または進行に関連する症状の進行を軽減、安定化、または阻害する。
本明細書で使用される場合、「ＰＤ－Ｌ１」は、「プログラム細胞死リガンド１」、「表面抗原分類２７４（すなわちＣＤ２７４）」、または「Ｂ７ホモログ１（すなわちＢ７－Ｈ１）」としても知られているタンパク質を指す。天然タンパク質は、２つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む。当該用語は、全長および／またはプロセシングされていないＰＤ－Ｌ１、ならびに細胞内でのプロセシングから生じる中間体を包含する。ＰＤ－Ｌ１は、膜貫通タンパク質または可溶性タンパク質として存在し得る。したがって、本明細書で使用される当該用語は、当該タンパク質の全長または細胞外ドメインを指し得る。当該用語は、ＰＤ－Ｌ１の天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。当該タンパク質は、ｈｉｓタグまたはＦｃタグなどのタグをさらに含み得る。例示的なヒト全長ＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿０５４８６２で見ることができる。用語「ｈＰＤ－Ｌ１」は、ヒトＰＤ－Ｌ１を指し、天然ｈＰＤ－Ｌ１および組み換えヒトｒｈＰＤ－Ｌ１を含む。「ｒＰＤ－Ｌ１」は組み換えＰＤ－Ｌ１を指す。組み換えＰＤ－Ｌ１は、調製される方法に依存して、アミノ末端メチオニン残基を有すること、または有しないことがあり得る。「ｒｈＰＤ－Ｌ１」は組み換えヒトＰＤ－Ｌ１を指す。同様に、ＰＤ－Ｌ１は、ヒトまたはヒト以外の起源の生体試料から単離することによっても得ることができる。ｒｈＰＤ－Ｌ１は、例えば、米国のRnD Systemsよりカタログ番号156-B7で、または米国のPeprotechによりカタログ番号310-35で入手し得る。「サルＰＤ－Ｌ１」はアカゲザルのＰＤ－Ｌ１を指す。例示的なサルＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿００１０７７３５８で見ることができる。サルＰＤ－Ｌ１は、例えば、中国のSino Biologicalよりカタログ番号90251-C02Hで入手し得る。「ラットＰＤ－Ｌ１」は、ドブネズミ（ノルウェーラット）のＰＤ－Ｌ１を指す。例示的なラットＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿００１１７８８８３で見ることができる。ラットＰＤ－Ｌ１は、例えば、中国のSino Biologicalよりカタログ番号80450-R02Hで入手し得る。「マウスＰＤ－Ｌ１」は、ハツカネズミのＰＤ－Ｌ１を指す。例示的なマウスＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿０６８６９３で見ることができる。マウスＰＤ－Ｌ１は、例えば、中国のSino Biologicalよりカタログ番号50010-M03Hで、または米国のRnD Systemsよりカタログ番号1019-B7-100で入手し得る。
「ＰＤ－１」はプログラム細胞死タンパク質１であり、ＰＤ－Ｌ１の細胞表面レセプターであるＣＤ２７９としても知られている。ＰＤ－１は、２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に結合する。ＰＤ－１は、細胞外ドメインとそれに続く膜貫通領域および細胞内ドメインを含む膜貫通タンパク質である。当該用語は、全長および／またはプロセシングされていないＰＤ－１、ならびに細胞内でのプロセシングから生じる中間体を包含する。ＰＤ－１は、膜貫通タンパク質または可溶性タンパク質として存在し得る。したがって、本明細書で使用される当該用語は、当該タンパク質の全長または細胞外ドメインを指し得る。当該用語は、ＰＤ－１の天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。当該タンパク質は、ｈｉｓタグまたはＦｃタグなどのタグをさらに含み得る。例示的なヒトＰＤ－１タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿００５００９で見ることができる。用語「ｈＰＤ－１」は、ヒトＰＤ－１を指し、その天然型（ｈＰＤ－１）および組み換えヒト型（ｒｈＰＤ－１）を含む。「ｒＰＤ－１」は組み換えＰＤ－１を指す。
「ＣＤ８０」は、Ｂ７－１、Ｂ７．１、ＢＢ１、ＣＤ２８ＬＧ、ＣＤ２８ＬＧ１、ＬＡＢ７としても知られている表面抗原分類８０を指す。ＣＤ８０は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ－４ならびにＰＤ－Ｌ１に対する膜レセプターであり、細胞外ドメインとそれに続く膜貫通領域および細胞内ドメインを含む。当該用語は、全長および／またはプロセシングされていないＣＤ８０、ならびに細胞内でのプロセシングから生じる中間体を包含する。ＣＤ８０は、膜貫通タンパク質または可溶性タンパク質として存在し得る。したがって、本明細書で使用される当該用語は、当該タンパク質の全長または細胞外ドメインを指し得る。当該用語は、ＣＤ８０の天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。当該タンパク質は、ｈｉｓタグまたはＦｃタグなどのタグをさらに含み得る。例示的なヒトＣＤ８０タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿００５１８２で見ることができる。ＣＤ８０は、例えば、米国のRnD Systemsよりカタログ番号9050-B1-100で入手し得る。用語「ｈＣＤ８０」は、ヒトＣＤ８０を指し、その天然型（ｈＣＤ８０）および組み換えヒト型（ｒｈＣＤ８０）を含む。「ｒＣＤ８０」は組み換えＣＤ８０を指す。
「ＰＤ－Ｌ２」は、「プログラム細胞死１リガンド２」、「Ｂ７－ＤＣ」、または「ＣＤ２７３」（表面抗原分類２７３）としても知られているタンパク質を指す。本明細書で使用される当該用語は、全長および／またはプロセシングされていないＰＤ－Ｌ２、ならびに細胞内でのプロセシングから生じる中間体を包含する。ＰＤ－Ｌ２は、膜貫通タンパク質または可溶性タンパク質として存在し得る。したがって、本明細書で使用される当該用語は、当該タンパク質の全長または細胞外ドメインを指し得る。当該用語は、ＰＤ－Ｌ２の天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。当該タンパク質は、ｈｉｓタグまたはＦｃタグなどのタグをさらに含み得る。例示的なヒト全長ＰＤ－Ｌ２タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿０７９５１５で見ることができる。ＰＤ－Ｌ２は、例えば、米国のRnD Systemsよりカタログ番号1224-PLで入手し得る。用語「ｒｈＰＤ－Ｌ２」は組み換えヒトＰＤ－Ｌ２を指す。
「Ｂ７－Ｈ３」は、ＣＤ２７６（表面抗原分類２７６）としても知られているタンパク質を指す。本明細書で使用される当該用語は、全長および／またはプロセシングされていないＢ７－Ｈ３、ならびに細胞内でのプロセシングから生じる中間体を包含する。Ｂ７－Ｈ３は、膜貫通タンパク質または可溶性タンパク質として存在し得る。したがって、本明細書で使用される当該用語は、当該タンパク質の全長または細胞外ドメインを指し得る。当該用語は、Ｂ７－Ｈ３の天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。当該タンパク質は、ｈｉｓタグまたはＦｃタグなどのタグをさらに含み得る。例示的なヒト全長Ｂ７－Ｈ３タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿０７９５１６で見ることができる。Ｂ７－Ｈ３は、例えば、米国のRnD Systemsよりカタログ番号1027-B3で入手し得る。用語「ｒｈＢ７－Ｈ３」は組み換えヒトＢ７－Ｈ３を指す。
「変異体」は、本明細書で開示される親配列の少なくとも１つの所望の活性を保持しながら、１つ以上のアミノ酸残基または核酸塩基の付加（挿入を含む）、欠失、修飾、および／または置換により親配列と異なるアミノ酸または塩基配列を指す。抗体の場合、このような所望の活性には特異的抗原結合が含まれ得る。同様に、変異体塩基配列は、1つ以上の核酸塩基の付加、欠失、および／または置換により親配列と比較して改変されていることがあり得るが、コードされる抗体は上記の所望の活性を保持する。変異体は、対立遺伝子またはスプライス変異体などの天然に存在するものであってもよく、または人工的に構築されるものであってもよい。
核酸ハイブリダイゼーション反応は、様々なストリンジェントな条件下で行うことができる。「ストリンジェントな条件」は、当技術分野で周知であり、公表されている。典型的には、ハイブリダイゼーション反応の間、ＳＳＣが０．１５Ｍ ＮａＣｌであり、１５ｍＭクエン酸緩衝液がｐＨ７．０を有する、ＳＳＣをベースとする緩衝液を使用することができる。緩衝液濃度の増加および変性剤の存在は、ハイブリダイゼーションステップのストリンジェンシーを増加させる。例えば、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、（ｉ）０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で４２℃で洗浄しながら、４２℃の５０％（体積／体積）のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０ｍｃｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸；（ｉｉ）４２℃の０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を含む５０％（体積／体積）のホルムアミド、または（ｉｉｉ）５５℃の１０％デキストラン硫酸、２×ＳＳＣ、および５０％ホルムアミド、次いで５５℃のＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄液、の使用を伴うことができる。追加的または代替的に、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で例えば使用するハイブリダイゼーションプロトコルに、低イオン強度および高温の洗浄溶液を使用する１回、２回、またはそれ以上の洗浄ステップを含めることができる。
用語の使用の範囲および意味は、その用語が使用される具体的な文脈から明らかとなるであろう。本明細書を通して使用されている選択された用語についての特定の他の定義は、適宜、詳細な説明の適当な文脈において与えられる。
用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含む（containing）」、「有する」は、広範囲にまたは無制限に、限定なく読まれるものとする。「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」などの単数形は、文脈上別段の明示がない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「ベクター」への言及は、単一のベクターと、同一－例えば同一のオペロン－または異なる複数のベクターとを含む。同様に、「細胞」への言及は、単一細胞と複数の細胞とを含む。別段の定めがない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、その一連のすべての要素に関するものであると理解されるべきである。用語「少なくとも１つ」および「のうちの少なくとも１つ」は、例えば、１、２、３、４、または５、またはそれ以上の要素を含む。記載された範囲を上回る、および下回る僅かな変動を、範囲内の値と実質的に同じ結果を達成するために使用することができることがさらに理解される。また、別段の定めがない限り、範囲の開示は、最小値と最大値の間のあらゆる値を含む連続的な範囲として意図されている。
本明細書に具体的かつ明示的に列挙された実施形態は、単独で、または１つ以上の他の実施形態と組み合わせて、除くクレームの基礎を形成し得る。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本明細書に記載の発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての刊行物および特許は、本発明に関連して使用され得る刊行物に記載されている構築物および方法論などを記載および開示する目的で、その全体が参照により本明細書に援用される。
本開示の様々な態様は、以下のサブセクションでさらに詳細に説明される。様々な実施形態、選好、および範囲は自由に組み合わせ得ることが了解される。さらに、特定の実施形態に応じて、選択された定義、実施形態、または範囲が適用されないこともある。
結合メンバーキャラクタリゼーション
本明細書で与えられる結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。結合メンバーの結合特異性は、当技術分野で周知の技術を用いて確認し得る。いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１はヒトＰＤ－Ｌ１である。
結合メンバーのＰＤ－Ｌ１への結合は、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１および／またはＣＤ８０との、好ましくはＰＤ－１およびＣＤ８０の両方との相互作用を遮断する。
いくつかの実施形態において、本明細書で与えられる結合メンバーは二価であり、KinExA（登録商標）により測定して１０ｐＭ未満、好ましくは５ｐＭ未満、より好ましくは約３ｐＭ、例えば２．９ｐＭ、２．８ｐＭ、または２．７ｐＭのＫＤでｈＰＤ－Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態において、このような二価結合メンバーは全長免疫グロブリンである。一実施形態において、二価の結合メンバーについての前記KinExA（登録商標）測定は、室温で行われる。一実施形態において、結合メンバーは二価であり、実施例９に明記された条件がKinExA（登録商標）測定に使用される。
いくつかの実施形態において、本明細書で与えられる結合メンバーは一価であり、KinExA（登録商標）により測定して５０ｐＭ未満のＫＤでｈＰＤ－Ｌ１に結合する。前記ＫＤは、好ましくは、１０ｐＭ未満、例えば約９ｐＭ未満、例えば９．０ｐＭ、８．９ｐＭ、８．８ｐＭ、または８．７ｐＭである。一実施形態において、一価の結合メンバーについての前記KinExA（登録商標）測定は、室温で行われる。一実施形態において、結合メンバーは一価であり、実施例４に明記された条件がKinExA（登録商標）測定に使用される。
いくつかの実施形態において、前記一価結合メンバーはｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、前記一価結合メンバーは、約６０ｋＤａ以下、例えば約５５ｋＤａ、５０ｋＤａ、４５ｋＤａ、４０ｋＤａ、３５ｋＤａ、３０ｋＤａ、もしくは２７ｋＤａ、またはそれ以下の分子量を有する抗体フラグメントである。一実施形態において、結合メンバーの分子量は、約２６ｋＤａ、例えば、２３、２４、２５、２６、または２７ｋＤａである。特に癌治療では、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路を標的とする場合、抗体フラグメントは全長抗体よりも利点を有し得る（Maute et al (2015), PNAS, Nov 24; 112(47): E6506-E6514）。抗体フラグメントは、そのより小さいサイズに起因して、典型的には約１５０ｋＤａの分子量を有する全長抗体、または同程度もしくはそれ以上の分子量を有する他の抗体フォーマットの場合よりも、より深く腫瘍に浸透すると考えられる。全長抗体、特にＩｇＧに関連する別の欠点は、それらのＦｃ領域（例えば、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰまたはＣＤＣ）を介した細胞傷害性免疫応答を媒介する能力である。この阻害は、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１軸を標的とする場合、両方のタンパク質が抗腫瘍細胞傷害性Ｔ細胞の表面上に発現されるので、望ましくない可能性がある。したがって、機能的Ｆｃ部分を有する全長モノクローナル抗体を投与すると、活性化しようとするリンパ球そのものが枯渇する可能性がある。抗ＰＤ－１抗体による治療は、患者における循環Ｔ細胞数の低下と相関することが分かった。したがって、分子量が小さい（例えば、６０ｋＤａ以下、例えば、約５５ｋＤａ、５０ｋＤａ、４５ｋＤａ、４０ｋＤａ、３５ｋＤａ、３０ｋＤａ、もしくは２７ｋＤａ、またはそれ以下）抗体フラグメントは、癌の治療における全長抗体治療薬のより有効な代替物を提供し得る。したがって、好ましい実施形態において、結合メンバーは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメント、ナノボディ、ＶＨＨ、ｄＡｂ、最小認識ユニット、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、ＢｉＴＥ、またはＤＡＲＴからなる群から選択される抗体フラグメントである。前記フォーマットは、６０ｋＤａ未満の分子量を有し、Ｆｃドメインを含まない。
結合メンバーのサイズおよび／または構造は、その半減期と関係がある。治療的設定において副作用を減少させるために、短い半減期を有する結合メンバーを使用することが有利であり得る。これは、例えば、Ｆｃ部分を欠くか、または改変されたＦｃ部分を有する結合メンバーを用いることによって達成され得る。
特定の用途では、細胞傷害性免疫応答を誘導すること、および／または補体を活性化することが有利であり得、そのため、Ｆｃドメインの存在が望まれる場合がある。したがって、一実施形態において、結合メンバーは、細胞傷害性免疫応答を媒介することができるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインを含む結合メンバーの非限定的な例は、全長免疫グロブリン、ＤＶＤ－Ｉｇ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、およびｓｃＦｖ－Ｆｃ．ｓｃＦｖ融合体、ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ－ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２－Ｆｃ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体（例えば、ｂｓＡｂ、Ｂｓ１Ａｂ、Ｂｓ２Ａｂ、Ｂｓ３Ａｂ、Ｔｓ１Ａｂ、Ｔｓ２Ａｂ、Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ（ＫｉＨｓ）など）、DuoBody、CrossMabである。
一実施形態において、結合メンバーは、細胞傷害性免疫応答を誘導しない、かつ／または補体を活性化しないように改変されているＦｃドメインおよび／またはヒンジを含む。このような不活性化されたＦｃドメインおよび／またはヒンジは、当技術分野で考えられているように１つ以上の置換を導入することによって作製することができる。当該結合メンバーは、細胞傷害性免疫応答を媒介せず、６０ｋＤａ未満の分子量を有する抗体フラグメントと比較したときに半減期が長くなるという利点を有する。
一実施形態において、結合メンバー誘導体はＦｃドメインを欠いている。Ｆｃドメインを欠く例示的な結合メンバーは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメント、ナノボディ、ＶＨＨ、最小認識ユニット、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、線状二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ－ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ－ｓｃＤｂ）、ＢｉＴＥ（タンデムジ－ｓｃＦｖもしくはタンデムｓｃＦｖとも呼ばれる）、タンデムトリ－ｓｃＦｖ、トリ（ア）ボディ、二重特異性Ｆａｂ２、ジミニ抗体、ジ－ダイアボディ、ｓｃＦａｂ－ｄｓｓｃＦｖ、またはＤＡＲＴである。
一実施形態において、結合メンバーは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプからなる群から選択される定常領域を含む。
一実施形態において、結合メンバーは、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、またはＩｇＧ３アイソタイプからなる群から選択される定常領域を含む。
一態様において、本発明は、
ａ）それぞれ配列番号６、７、および８に示されるＶＨ ＣＤＲ配列ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、もしくはＣＤＲ－Ｈ３、もしくはそれらの変異体のうちの少なくとも１つ、ならびに／または
ｂ）それぞれ配列番号３、４、および５に示されるＶＬ ＣＤＲ配列ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、もしくはＣＤＲ－Ｌ３、もしくはそれらの変異体のうちの少なくとも１つ、を含むＰＤ－Ｌ１に対する結合メンバーを与える。いくつかの実施形態において、結合メンバーは、少なくとも配列番号５のＣＤＲ－Ｌ３および／もしくは配列番号８のＣＤＲ－Ｈ３、またはそれらの変異体を含む。いくつかの実施形態において、結合メンバーは、配列番号６、７、および８からなる群から選択される２つのＣＤＲ配列、またはそれらの変異体を含む。いくつかの実施形態において、結合メンバーは、配列番号３、４、および５からなる群から選択される２つのＣＤＲ配列、またはそれらの変異体を含む。いくつかの実施形態において、結合メンバーは、配列番号６、７、および８の全３つのＣＤＲ、またはそれらの変異体を含む。いくつかの実施形態において、結合メンバーは、配列番号３、４、および５の全３つのＣＤＲ、またはそれらの変異体を含む。好ましくは、結合メンバーは、配列番号３～８に示される全てのＣＤＲ、またはその変異体を含む。
本明細書で与えられる結合メンバーは、ヒトＰＤ－Ｌ１に対する強い結合親和性を有する。例えば、当該結合メンバーは、１００ｐＭ未満、好ましくは７５ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、１５ｐＭ未満の平衡結合定数ＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合することができ、最も好ましくは、ＫＤは、約１０ｐＭ以下、例えば約９ｐＭ（例えば、９．０ｐＭ、８．９ｐＭ、８．８ｐＭ、もしくは８．７ｐＭ）、約８ｐＭ、約７ｐＭ、約６ｐＭ、約４ｐＭ、約３ｐＭ（２．９ｐＭ、２．８ｐＭ、もしくは２．７ｐＭ）、またはそれ以下である。親和性は、以下の実施例のセクションに記載されているように、または当技術分野で利用可能な他の方法によって測定することができる。好ましい実施形態では、親和性は、室温で、より好ましくは、一価結合メンバーの場合は実施例４に示した条件下で、または二価結合メンバーの場合は実施例９に示した条件下で、結合平衡除外法（Kinetic Exclusion Assay）（KinExA（登録商標））によって測定する。
本明細書に記載の結合メンバーは、抗体（例えば、全長免疫グロブリン）、または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメント、ナノボディ、ＶＨＨ、もしくは最小認識ユニット）、または非抗体骨格、であり得る、から本質的になり得る、または含み得る。いくつかの結合メンバーは、本明細書に開示される可変軽鎖および／または重鎖の１以上のコピー、例えば、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディまたは単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ、線状二量体ｓｃＤｂ、環状二量体ｓｃＤｂ、ＢｉＴＥ；タンデムトリ－ｓｃＦｖ、トリ（ア）ボディ、二重特異性Ｆａｂ２、ジミニ抗体、ＩｇＧ、トリアボディ、テトラボディ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ融合、ジ－ダイアボディ、ＤＶＤ－１ｇ、ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ－ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２－Ｆｃ、またはＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体（例えば、限定はされないが、Ｂｓ１Ａｂ、Ｂｓ２Ａｂ、Ｂｓ３Ａｂ、Ｂｓ４Ａｂ、Ｔｓ１Ａｂ、およびＴｓ２Ａｂ）、クアドローマ（quadroma）、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ（ＫＩＨ）、二重特異性抗体、CrossMab、およびDuoBodyからなる群から選択されるフォーマットを含む。
いくつかの実施形態において、結合メンバー、特に上記の一価抗体フラグメントは、ｓｃＦｖである。ＶＨおよびＶＬドメインは、可動性リンカーによって、ＶＬ－リンカー－ＶＨまたはＶＨ－リンカー－ＶＬのいずれかの配向で連結されることができる。好ましい実施形態では、配向はＶＬ－リンカー－ＶＨであり、すなわち軽鎖可変領域はＮ末端にあり、重鎖可変領域はポリペプチドのＣ末端にある。
結合メンバーは、好ましくは、ヒト化結合メンバー、例えばヒト化抗体、特にヒト化抗体フラグメント、例えばｓｃＦｖである。結合メンバーはモノクローナルおよび／またはキメラであることができる。
したがって、いくつかの実施形態では、結合メンバーは、サブタイプＶＨ３の可変重鎖領域および／またはサブタイプＶＫａｐｐａ１の可変軽鎖領域を含む。
好ましい実施形態において、結合メンバーは、配列番号２のＶＨ配列またはその変異体を含む。当該変異体は、配列番号２と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。言い換えると、一実施形態において、結合メンバーは、配列番号２と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最も好ましくは１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。
追加的または代替的に、本明細書で開示される結合メンバーは、配列番号１のＶＬ配列またはその変異体を含む。当該変異体は、配列番号１と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。言い換えると、一実施形態において、結合メンバーは、配列番号１と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最も好ましくは１００％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む。
一実施形態において、当該結合メンバーは、配列番号２と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最も好ましくは１００％の配列類似性を有するＶＨ配列を含む。追加的または代替的に、結合メンバーは、配列番号１と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最も好ましくは１００％の配列類似性を有するＶＬ配列を含む。
より好ましい実施形態において、結合メンバーは、配列番号１に示されるＶＬおよび配列番号２に示されるＶＨを含む。配列番号１および配列番号２の両方のフレームワーク配列は、国際公開第０３／０９７６９７Ａ号（ESBATech AG）に記載のヒト免疫グロブリンに由来する。そのＶＨおよびＶＬフレームワーク配列は、ウサギ抗体のヒト化および安定化のために改変されており、例えば、国際公開第２００９／１５５７２６Ａ号（ESBATech, AN ALCON BIOMEDICAL RESEARCH UNIT LLC); Borras, L., et al., JBC 2010, vol. 285(12), p. 9054を参照されたい。
いくつかの実施形態において、結合メンバーは、配列番号１２～１５からなる群から選択される１つ以上、好ましくは全てのＶＬフレームワーク配列を含む。
いくつかの実施形態において、結合メンバーは、配列番号１６～１９からなる群から選択される１つ以上、好ましくは全てのＶＨフレームワーク配列を含む。
結合メンバーは、例えばｓｃＦｖまたはタンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、もしくは単鎖ダイアボディなどの二重特異性分子の場合、リンカー配列を含み得る。ｓｃＦｖの場合、このようなリンカー配列は、典型的には１０～約２５個のアミノ酸を有する。通常、リンカーペプチドは、柔軟性を与えるグリシン、ならびに可溶性を向上させるためのセリンおよび／またはスレオニンを豊富に含む。好ましい実施形態では、（ＧＧＧＧＳ）４リンカー（配列番号１０）またはその変異体が使用される。２～５リピートを有する前記モチーフの変異体もまた使用され得る。他の好適なリンカーは、例えばAlfthan, K., Protein Eng 1995, vol. 8(7), p. 725に記載されている。
したがって、一実施形態では、当該結合メンバーは、配列番号９を含むアミノ酸配列、を含むか、を有するか、から本質的になるか、または、からなる。いくつかの実施形態において、当該結合メンバーは、配列番号１１を含むアミノ酸配列、を含むか、を有するか、から本質的になるか、または、からなる。
特定の実施形態では、本明細書で与えられる結合メンバーの変異体が企図される。例えば、抗原結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を改善すること、タンパク質分解に対する感受性および／もしくは酸化感受性を低減すること、安定性もしくは溶解性を増加させること、免疫原性を低下させること、ならびに／または結合メンバーの他の生物学的、生化学的、もしくは生物物理学的特性を変化させることが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、変異体は、親結合メンバーに対して改善を示さない。変異体は、いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列の１、２、３、４、５、またはそれ以上の位置において、所与の結合メンバーと異なるタンパク質性分子であり得る。このような違いは、例えば、置換、付加、修飾、または欠失であり得る。
本明細書で与えられる結合メンバーの変異体は、タンパク質および／もしくは化学工学、結合メンバーをコードする塩基配列への適当な改変の導入、またはタンパク質／ペプチド合成によって調製し得る。得られる結合メンバーが適当な方法を用いてスクリーニングすることができる所望の特性を有するならば、フレームワークまたはＣＤＲに、欠失、置換、付加、修飾、および挿入の任意の組み合わせをなすことができる。特に対象となるのは、置換であり、好ましくは上記の保存的置換である。
本明細書に記載の結合メンバーは、このような保存的置換を１つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上含み得る。
非保存的置換は、例えば、ポリペプチドの電荷、双極子モーメント、サイズ、親水性、疎水性、またはコンフォメーションに関して、より実質的な変化をもたらし得る。一実施形態において、結合メンバーは、このような非保存的置換を１つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上含む。
修飾は、ＣＤＲおよび／またはフレームワーク配列中に存在し得る。例えば、本明細書で与えられるＣＤＲは、１、２、３、４、５、またはそれ以上の修飾を含み得る。例えば、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列は全体として、本明細書で与えられるＣＤＲ、具体的には配列番号３、４、および５と、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、またはより好ましくは９９％同一である。追加的または代替的に、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３配列は全体として、本明細書で与えられるＣＤＲ、具体的には配列番号６、７、および８と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、９５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、またはより好ましくは９９％同一である。
一実施形態において、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３は全体として、本明細書で与えられるＣＤＲ、具体的には配列番号３、４、および５と、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、またはより好ましくは９９％類似である。追加的または代替的に、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３は全体として、本明細書で与えられるＣＤＲ、具体的には配列番号６、７、および８と、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、またはより好ましくは９９％類似である。
一実施形態において、変異体は、配列番号１～１９の配列のいずれか１つに１、２、３、または４個の置換を含む。一実施形態において、変異体は、配列番号１、２、９、または１１の配列のいずれか１つに５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の置換を含む。
特に好ましいタイプの変異体は、１つ以上のＣＤＲ全体が置換されているものである。通常、ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３は、抗原結合に最も顕著に寄与する。例えば、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｈ１、および／またはＣＤＲ－Ｈ２全体を、天然または人工起源の異なるＣＤＲにより置き換え得る。いくつかの実施形態において、１つ以上のＣＤＲがアラニンカセットにより置き換えられている。
追加的または代替的に、抗体のＶＨは、溶解性向上点変異を含む。国際公開第２００９／１５５７２５号（ESBATech, a Novartis Company）は、抗体の全体的な溶解性を増加させることが証明されたモチーフを記載している。残基は、抗体の可変ドメインと定常ドメインとの界面にある位置に配置され、特に、定常ドメインを欠くｓｃＦｖなどの抗体フラグメントを安定化させる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される結合メンバーの変異体では、以下の残基のうちの１つ、２つ、または３つ全てが存在する。
（ｉ）重鎖アミノ酸１２位のセリン（Ｓ）（ＡＨｏナンバリングによる）；
（ｉｉ）重鎖アミノ酸１０３位のセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）（ＡＨｏナンバリングによる）；および／または
（ｉｉｉ）重鎖アミノ酸１４４位のセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）（ＡＨｏナンバリングによる）。好ましい実施形態において、当該変異体は、ＶＨ１２位にセリン；ＶＨ１０３位にセリン；ＶＨ１４４位にスレオニン（すべてＡＨｏナンバリング）を有する。
追加的または代替的に、変異体は、本明細書に参照により援用される欧州第２１５８３１５Ｂ１号の請求項に係る１つ以上の点変異を含み得る。
変異体は、例えば、本明細書に参照により援用される国際公開第２０１４／２０６５６１号に記載の修飾、具体的に挙げると、国際公開第２０１４／２０６５６１号の配列番号１５～２２のＶＬフレームワーク配列を含み得る。
好ましくは、本明細書に記載の変異体結合メンバーは、
（ｉ）ＰＤ－Ｌ１、特にｈＰＤ－Ｌ１に対する特異的結合を保持する；かつ／または
（ｉｉ）KinExA（登録商標）で測定して１００ｐＭ未満、好ましくは７５ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、４０ｐＭ未満、３０ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、より好ましくは１０ｐＭ未満のヒトＰＤ－Ｌ１に対するＫＤを有する（好ましくは、一価結合メンバーの場合は実施例４に記載の条件、または二価結合メンバーの場合は実施例９に記載の条件を用いて測定がなされる）；かつ／または
（ｉｉｉ）マウスＰＤ－Ｌ１に対して交差反応性でない、かつ／または；
（ｉｖ）サルＰＤ－Ｌ１に対して交差反応性である；かつ／または
（ｖ）ＰＤ－Ｌ１への結合に関して本明細書に開示される結合メンバーと競合する；かつ／または
（ｖｉ）本明細書に開示される配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９７％の配列同一性を有する。
変異体は、軽鎖および重鎖の鎖シャッフリングによっても調製され得る。単一の軽鎖を重鎖のライブラリと組み合わせて、変異体のライブラリを得ることができる。一実施形態において、前記単一の軽鎖は、上記のＶＬ配列の群から選択され、かつ／または前記重鎖のライブラリは、１つ以上の上記のＶＨ配列を含む。同様に、単一の重鎖は、軽鎖のライブラリと組み合わせることができる。好ましくは、前記単一の重鎖は、上記のＶＨ配列の群から選択され、かつ／または前記軽鎖のライブラリは、１つ以上の上記のＶＬ配列を含む。
結合メンバーは、上記のＶＬおよび／またはＶＨ配列のいずれかを含むことができる。ナノボディまたはＶＨＨなどの単一ドメインフォーマットを有する結合メンバーは、上記のＶＬまたはＶＨ配列のいずれか１つのみ、好ましくはＶＨ配列を含む。多価結合メンバー、具体的にはＦ（ａｂ’）２フラグメント、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ（タンデムｓｃＦｖとしても知られる）、ダイアボディ、ｓｃＤｂ、トリアボディ、またはテトラボディなど、好ましくは二重特異性結合メンバーは、１つ以上の上記のＶＬ配列、および／または１つ以上の上記のＶＨ配列を含み得る。
本発明の結合メンバー、好ましくは一価抗体フラグメント、より好ましくはｓｃＦｖは、特に安定である。本明細書で使用される場合、用語「安定性」は、長期のインキュベーションおよび／または高温でのインキュベーション後に溶液中でモノマー状態を維持するポリペプチドの生物物理学的特性を指す。不安定なポリペプチドは、二量体化またはオリゴマー化およびさらには沈殿する傾向があり、それにより貯蔵寿命が短くなり、医薬用途にはあまり適さなくなる。
本明細書で与えられる結合メンバー、特に上記の一価抗体フラグメントは、ｐＨ７．２のＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、４℃の温度で２週間インキュベートした後、追加的または代替的に、２２℃または３７℃で同じ条件下でインキュベートした場合にも、少なくとも８５％まで、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％まで、最も好ましくは９５％までモノマー状態を維持する。いくつかの実施形態において、結合メンバー、特に上記の一価抗体フラグメントは、ｐＨ７．２のＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、４℃の温度で３週間インキュベートした後、追加的または代替的に、２２℃または３７℃で同じ条件下でインキュベートした場合にも、少なくとも８５％まで、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％まで、最も好ましくは９７％までモノマー状態を維持する。
いくつかの実施形態において、結合メンバーは、ｓｃＦｖであり、ｐＨ７．２のＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌの濃度で３７℃で１週間または２週間の保存後に３％未満の二量体を形成する。
モノマーの程度は、例えば、ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除高速液体クロマトグラフィー）によって測定することができる。当該試験に適した移動相は、例えば、ｐＨ７．２のＰＢＳである。モノマー含有量は、タンパク質クロマトグラフィー中に測定したＵＶ２８０シグナルのピーク積分によって定量することができる。好適なシステムは、例えば、Chromeleon（登録商標）６．８ソフトウェアによって制御されるDionex Summit ＨＰＬＣであり、これは、その後のクロマトグラム分析およびピーク定量も可能にする。
結合メンバー、好ましくは上記一価抗体フラグメント、より好ましくはｓｃＦｖは、４～１０、好ましくは４～９、最も好ましくは約７．６の範囲の理論上の等電点（ｐＩ）を有し得る。理論上のｐＩは、例えば、ExPASy Server上のProtParamツールを用いて計算することができる（http://web.expasy.org/protparam/で利用可能；GASTEIGER E. et al.Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server.(In) The Proteomics Protocols Handbook.Edited by Walker J.M.Totowa: Humana Press Inc., 2005.ISBN 9781588295934. p. 571-607も参照）。
結合メンバーは、動物モデルにおいて結合メンバーを試験するのに有利である非ヒト種由来のＰＤ－Ｌ１と交差反応性であることができる。好ましくは、結合メンバーは、サルＰＤ－Ｌ１と交差反応性である。いくつかの実施形態において、サルＰＤ－Ｌ１に対するｓｃＦｖフォーマットでの室温での一価結合メンバーのＫＤは、KinExA（登録商標）で測定して、例えば実施例５に示した条件下で測定して、約３．３ｐＭである。いくつかの実施形態において、結合メンバーの親和性は、サルＰＤ－Ｌ１に対して、ヒトＰＤ－Ｌ１に対してと少なくとも同等、より好ましくは少なくとも２倍強い。いくつかの実施形態において、結合メンバーはマウスＰＤ－Ｌ１に対して交差反応性ではない。しばしば、所与のヒト標的に対する抗体は、げっ歯類のオルソログに対してより低い親和性を有し、そのため、げっ歯類のインビボの動物データがより価値の低いものとなる。本明細書に開示される結合メンバーは、ヒトおよびサルＰＤ－Ｌ１について同等のＫＤ値を有するので、インビボの動物データは、ヒトにおける疾患をより反映するものと予想される。さらに、サルに対する交差反応性は、毒性学種としてのサルの使用を可能にする。
好ましい実施形態において、結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ２および／またはＢ７－Ｈ３などのＢ７ファミリーの他の構成要素と交差反応性ではない。両方のタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１と高い配列類似性を有し、したがって、これらのＢ７ファミリーの構成要素への結合は、安全性の懸念を生じさせる。
したがって、いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する結合メンバーであって、配列番号１の少なくとも１つの可変軽鎖および配列番号２の少なくとも１つの可変重鎖を含み、ヒトＰＤ－Ｌ１に対する平衡結合定数ＫＤが１０ｐＭ未満である前記結合メンバーが、与えられる。好ましくは、前記結合メンバーは、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中、３７℃で１週間または２週間インキュベートした後、ｓｃＦｖフォーマットで少なくとも９５％までモノマー状態を維持する。より好ましくは、前記結合メンバーはマウスＰＤ－Ｌ１に対して交差反応性ではない。
本発明は、ヒトＰＤ－Ｌ１への結合について本明細書に開示される結合メンバーと競合する結合メンバーも与える。例えば、当該競合（または交差遮断）結合メンバーは中和性であり得る。好ましくは、当該競合結合メンバーは、２５０ｐＭ以下、例えば約１００ｐＭ未満、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、または約５ｐＭ未満のヒトＰＤ－Ｌ１への結合の平衡結合定数（ＫＤ）を有する。したがって、一実施形態では、結合メンバーは、約５ｐＭ未満のＫＤを有する。
本明細書で使用される場合、用語「競合」は、同じ標的への結合についての結合メンバー間の競合を指す。競合は、目的の結合メンバーが、本明細書に開示される結合メンバーの共通抗原（ここでは、それぞれＰＤ－Ｌ１またはそのフラグメント）への特異的結合を防止または阻害または低減する、競合結合測定によって測定することができる。当該競合結合測定は、当技術分野で公知であり、固相直接的または間接的ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および固相直接的または間接的酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含むが、これらに限定されない。典型的には、当該アッセイは、固体表面に結合した精製抗原、被検結合メンバー、および本明細書に記載の基準結合メンバーの使用を伴う。競合阻害は、（ｉ）被検結合メンバーの存在下で固体表面に結合した基準結合メンバー、または（ｉｉ）基準結合メンバーの存在下で固体表面に結合した被検結合メンバーのいずれかの量を求めることにより、測定する。競合結合メンバーは、（ｉ）基準結合メンバーと同じエピトープに、（ｉｉ）重複エピトープに、または（ｉｉｉ）同じ標的分子上であるがその標的への基準結合メンバーの結合を立体的に妨害する異なるエピトープに、結合し得る。
通常、競合結合メンバーは、過剰に存在する場合、ＰＤ－Ｌ１に対する本明細書に記載の結合メンバーの特異的結合を低減し、すなわち、少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、または７５％、またはそれ以上結合を交差遮断する。好ましくは、競合結合メンバーの存在下での本明細書に記載の結合メンバーの結合は、少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、または９７％以上低下する。
一実施形態において、結合メンバーは一価であり、例えばｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントである。別の実施形態において、結合メンバーは多価である。当該多価分子は、二価（例えば全長抗体またはＦ（ａｂ’）２フラグメント）であることができ、または少なくとも３つの標的結合部位を含む。多価結合メンバーは、二重特異性抗体、例えば、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＴであることができる（例えばKontermann R.E.Methods in Mol.Biol.Edited by LO, B. Totowa, N.J.: Humana Press, 2004.ISBN 1588290921. p. 227を参照されたい）。前記二重特異性抗体は、ｓｃＦｖについて上記したものよりも短いリンカー、すなわち配列番号１０の基本モチーフの１～３リピートのみを有するリンカーを十分に使用し得る（例えばHolliger, P., et al., PNAS, 1993, vol. 90(14), p.6444を参照）。別の実施形態では、多価結合メンバーは、トリアボディ、ミニボディ、またはテトラボディである。多価結合メンバーの他の例には、限定はされないが、単鎖ダイアボディ、タンデムｓｃＤｂ、線状二量体ｓｃＤｂ、環状二量体ｓｃＤｂ、ＢｉＴＥ、タンデムトリ－ｓｃＦｖ、トリ（ア）ボディ、二重特異性Ｆａｂ２、ジミニ抗体、ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ融合体、ジ－ダイアボディ、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ－ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２－Ｆｃ、またはＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体（例えば、限定はされないが、Ｂｓ１Ａｂ、Ｂｓ２Ａｂ、Ｂｓ３Ａｂ、Ｂｓ４Ａｂ、Ｔｓ１Ａｂ、およびＴｓ２Ａｂ、クアドローマ（quadroma）、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ（ＫＩＨ）、二重特異性抗体、CrossMab、およびDuoBody）が含まれる。
本開示に係る結合メンバーは、いくつかの実施形態では、捕捉部分、例えばストレプトアビジン結合タグ、例えば、米国特許出願第２００３／００８３４７４号、米国特許第５，５０６，１２１号、または第６，１０３，４９３号に記載されているSTREP-TAGS（登録商標）を含み得る。捕捉部分の他の例には、限定はされないが、マルトース結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ＦＬＡＧ－ペプチド（例えば、配列Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ）、Ｔ７エピトープ（Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｍｅｔ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｙ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄの配列Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－ＡｓｐのＨＳＶエピトープ、配列Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓの水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）エピトープ、配列Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ａｌａのヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ、および配列Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕの転写因子ｃ－ｍｙｃの「ｍｙｃ」エピトープが含まれる。
捕捉部分の他の例は、金属イオンを結合することができる金属キレート剤である。それぞれの捕捉部分は、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）グリシン（ニトリロ三酢酸、ＮＴＡとも呼ばれる）、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、２，３－ジメルカプト－１－プロパノール（ジメルカプロール）、ポルフィン、またはヘムであり得る。当技術分野で使用される固定化金属アフィニティークロマトグラフィーの標準的方法に従って、例えば、オリゴヒスチジンタグは、例えば、キレート剤であるニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を用いてクロマトグラフィー目的で与えられ得る、銅（Ｃｕ２＋）、ニッケル（Ｎｉ２＋）、コバルト（Ｃｏ２＋）、または亜鉛（Ｚｎ２＋）イオンと複合体を形成することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１に対する公知の結合メンバーよりも免疫原性が低い。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１に対する公知の結合メンバーとは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１に対する公知の結合メンバーとは異なるクリアランス速度を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１に対する公知の結合メンバーよりも、凝集および/またはプロテアーゼ分解に対する抵抗性が高い。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１に対する公知の結合メンバーよりも改善されたＩＣ５０および／またはＥＣ５０を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１に対する公知の結合メンバーよりも、改善されたｋｏｎ、ｋｏｆｆ、またはＫＤなどの結合パラメーターを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１に対する公知の結合メンバーとは異なる種交差反応パターンを有する。いくつかの実施形態において、結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１に対する公知の結合メンバーとは異なるｐＨ安定性を有する。いくつかの実施形態において、結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１に対する公知の結合メンバーとは異なる、指示温度での長期間の安定性を有する。いくつかの実施形態において、結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１に対する公知の結合メンバーとは異なる組織浸透能力を示す。いくつかの実施形態において、結合メンバーは、ＰＤ－Ｌ１に対する公知の結合メンバーよりも、そのレセプターであるＰＤ－１および／またはＣＤ８０とのＰＤ－Ｌ１相互作用の異なる遮断効率を有する。
ＰＤ－Ｌ１への結合について本明細書に開示される結合メンバーと競合する結合メンバーも企図される。
核酸、ベクター、宿主細胞、および製造方法
本明細書に記載の結合メンバーは、単一の塩基配列によって、または複数の塩基配列によってコードされ得る。複数の塩基配列の場合、各配列は１つの可変領域をコードし得る。いくつかの実施形態において、塩基配列は、２つ以上の可変領域をコードし得る。通常、複数の塩基配列は、結合メンバーの可変領域をコードする。典型的には、各可変領域は、１つの別々の塩基配列によってコードされる。可変領域をコードするそれぞれの塩基配列は、単一の核酸分子に含まれ得る。いくつかの実施形態において、可変領域をコードする２つ以上の塩基配列は、単一の核酸分子に含まれる。いくつかの実施形態において、可変領域をコードする各塩基配列は、単一の別個の核酸分子に含まれる。したがって、複数の核酸分子が、結合メンバーの製造に使用され得、例えば、それぞれが少なくとも１つの可変領域をコードする。それぞれの核酸分子は、いくつかの実施形態において、発現カセットを規定し得る。上記のように、発現カセットは、適当な宿主細胞中の特定の塩基配列の発現を指示することができる核酸分子である。
発現カセットは、１つ以上の終結シグナルに機能的に連結されている目的の塩基配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。発現カセットはまた、塩基配列の適切な翻訳に必要とされる配列も含み得る。コード領域は目的のポリペプチドをコードすることができ、センスまたはアンチセンス方向に、目的の機能的ＲＮＡ、例えば、限定されるものではないが、アンチセンスＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡをコードすることもできる。目的の塩基配列を含む発現カセットはキメラであることができ、これは、その成分の少なくとも１つがその他の成分のうちの少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットは、天然に存在するが、異種発現に有用な組み換え型で得られたものであることもできる。いくつかの実施形態において、しかしながら、発現カセットは、宿主に対して異種である、すなわち、発現カセットの特定の塩基配列は、宿主細胞中に自然に存在せず、形質転換事象によって宿主細胞または宿主細胞の母細胞に導入された。発現カセット中の塩基配列の発現は、構成的プロモーター、または宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に曝された場合にのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあり得る。植物または動物などの多細胞生物の場合、プロモーターは、特定の組織、器官、または発達段階に特異的であることもできる。
結合メンバーまたはその部分の配列が分かると、ポリペプチド配列をコードするｃＤＮＡは、当技術分野で周知の方法、例えば、遺伝子合成により作製できる。これらのｃＤＮＡは、標準的なクローニングおよび突然変異誘発技術によって、発現ベクターまたはクローニングベクターなどの適切なベクターにクローニングすることができる。必要に応じて、可変軽鎖は、抗体の可変重鎖とは別のベクターによってコードされる。さらに、追加の配列、例えば、タグ（例えば、Ｈｉｓ－タグ）、Ｆａｂもしくは全長抗体の産生のための定常ドメイン、リンカー、第２の結合特異性のコード配列、または他の機能的ポリペプチド、例えば融合コンストラクトもしくは二重特異性分子を生じさせるための酵素を遺伝子コンストラクトに含め得る。
選択されたクローニング法に基づいて、遺伝子コンストラクトは、Ｎ末端またはＣ末端に１つ以上の追加の残基を有する結合メンバーを生じさせ得る。例えば、開始コドンに由来するＮ末端メチオニンまたは追加のアラニンは、翻訳後に削り取られない限り、発現されたポリペプチド中に存在し得る。したがって、本明細書中に開示される抗体は、開示される配列からなるのではなく、むしろ開示される配列を含むことを理解されたい。したがって、一実施形態において、結合メンバーは、配列番号９の配列を含む。別の実施形態において、結合メンバーは、配列番号１１の配列を含む。結合メンバーが配向ＶＨ－リンカー－ＶＬを有するｓｃＦｖ、またはＶＨがＮ末端に配置される他の抗体フラグメントである場合、分子のＶＨ配列部分は、Ｎ－末端がメチル化されていることがあり得る。したがって、一実施形態において、配列番号２は、Ｎ末端メチオニンを有する。
標準的なクローニング、突然変異誘発、および分子生物学的手法の基本的なプロトコルは、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual（Green M. and Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual.4th edition.Cold Spring Harbor Laboratory, 2012.ISBN 1936113422.）に記載されている。
本明細書に記載の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離核酸がさらに企図される。
また、本明細書に開示される結合メンバーを組み換え発現する細胞も企図される。遺伝子コンストラクトの発現用の適当な宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であることができる。好適な原核生物の宿主細胞は、グラム陰性またはグラム陽性であり、エシェリキア属、エルウィニア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、シュードモナス属、またはバチルス属の種を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、大腸菌、亜例えば、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（例えば、米国のInvitrogen、カタログ番号C600003）およびOrigamiTM 2(DE3)（例えば、米国のNovagen、カタログ番号71345-3）のうちの１つ以上である。
グリコシル化またはリン酸化などの翻訳後修飾が望まれる場合、真核生物の宿主細胞を使用することが有利であり得る。例えば、一般的に使用されるサッカロマイセス・セレヴィシエ株またはピキア・パストリス株などの真核微生物は、宿主細胞として機能し得る。宿主細胞の好適な例には、植物細胞または動物細胞、特に昆虫細胞または哺乳類細胞も含まれる。好適な哺乳類細胞には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、またはＮＳ０骨髄腫細胞が含まれるが、これらに限定されない。原核生物の宿主細胞におけるグリコシル化もまた報告されており、例えば、Jaffe S.R.P. et al., Curr.Opin.Biotechnol.2014, vol. 30, p. 205を参照されたい。
好適な宿主細胞における発現によって結合メンバーを製造し得る。例えば、上記の発現ベクターを、エレクトロポレーションまたは化学的形質転換などの標準的な技術によって宿主細胞に導入する。次いで、形質転換細胞を、組み換えタンパク質発現に適した条件下で、典型的には適当な栄養培地中で培養し、必要に応じて、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または目的のコード配列を増幅するために改変する。結合メンバーを、培養物から回収し、必要に応じて、当技術分野の標準技術を用いて精製する。組み換えタンパク質の収率は、培地および温度または酸素供給などの培養条件を最適化することによって改善し得る。原核生物では、結合メンバーは、ペリプラズム内で、細胞内で封入体として産生されること、または培地中に分泌されることができる。動物細胞は、通常、結合メンバーを培地中に分泌する。タンパク質を採取したら、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用、混合モードクロマトグラフィー、および／またはアフィニティークロマトグラフィーなどの当技術分野で周知の方法を用いてタンパク質を精製することができる。
一実施形態において、結合メンバーを無細胞系で製造する。これは、典型的には、本明細書に記載のタンパク質をコードする核酸産物鋳型、例えばプラスミドＤＮＡまたはＰＣＲ産物鋳型のインビトロ転写とその後のインビトロ翻訳を伴う。例えば、増殖細胞由来の粗溶解産物を使用し、必要な酵素および細胞タンパク質合成機構を与える。アミノ酸または核酸塩基およびエネルギー送達分子およびその他のものなどの必要な構成要素は、外因的に供給することができる。無細胞発現系は、例えば、溶解したウサギ網状赤血球（例えば、Rabbit Reticulocyte Lysate System、Promega、カタログ番号L4540）、ヒーラ細胞（例えば、1-Step Human In Vitro Translation Kit、88881、Thermo Scientific）、昆虫細胞（例えば、EasyXpress Insect Kit II、32561、Qiagen）、小麦胚芽（例えば、Wheat Germ Extract、L4380、Promega）、または大腸菌細胞（例えば、PURExpress（登録商標）In Vitro Protein Synthesis Kit、E6800S、NEB）をベースとすることができる。また、ジスルフィド結合生成の改善のために最適化された無細胞抗体発現系を製造に使用することができる。市販のキットには、昆虫細胞溶解産物（例えば、EasyXpress Disulfide Insect Kit、32582、Qiagen）または大腸菌細胞溶解産物（例えばEasyXpress Disulfide E.coli Kit、32572、Qiagen）が含まれる。無細胞タンパク質合成は、例えば、速度が速いこと、高い産物収率を達成すること、反応条件の容易な変更を可能にすること、副産物の程度を低くするか、または全く形成しないことという利点を有する。無細胞タンパク質合成は、純粋に生物学的または化学的製造系で行うことができない生物学的および／または化学的ステップを伴い得る。例えば、非天然または化学的に修飾されたアミノ酸を、所望の位置でタンパク質に組み込むことができる。ｓｃＦｖ－毒素融合タンパク質は、無細胞系において成功裏に製造されている（Nicholls, P. J., et al., JBC 1993, vol. 268, pp. 5302-5308）。したがって、一実施形態では、本明細書に記載の結合メンバーを製造する方法が与えられ、前記方法は、（ａ）無細胞系を与えるステップ、（ｂ）上記結合メンバーをコードする核酸産物鋳型を与えるステップ、（ｃ）核酸産物鋳型の転写および翻訳を可能にするステップ、（ｄ）結合メンバーを回収するステップ、ならびに必要に応じて（ｅ）結合メンバーを精製するステップを含む。
追加的または代替的に、本明細書に記載の結合メンバーを製造する方法は、化学合成の少なくとも１つのステップを含む。例えば、当該方法は完全に化学的であってもよい。別の実施形態では、上記の細胞ベースまたは無細胞の製造系は、このような化学合成の少なくとも１つのステップを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の結合メンバーを、大腸菌における細胞内発現のための発現ベクターを用いて細胞ベースの系において製造する。発現されると、ポリペプチドは、宿主細胞内の封入体として得られ、他の細胞粒子から分離された後、塩酸グアニジン（ＧｎｄＨＣｌ）などの変性剤中で可溶化され、当業者に周知の再生方法によってリフォールディングされる。
所望の結合メンバーは、トランスジェニック動物でも製造し得る。好適なトランスジェニック動物は、標準的な方法に従って得られ得、当該方法は、（ｉ）結合メンバーのコード配列および好適な制御配列を含むＤＮＡコンストラクトを卵にマイクロインジェクションすることなどによって、トランスジェニック胚を作製するステップ、（ｉｉ）卵を偽妊娠レシピエントのメスに移入するステップ、（ｉｉｉ）妊娠をモニタリングするステップ、ならびに（ｉｖ）所望の抗体を発現する子孫を選択するステップを例えば含む。
上記の核酸、ベクター、宿主細胞、および製造方法は、本明細書に記載の結合メンバー（それらがタンパク質である限り）にも適用されることを理解されたい。
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する細胞が本明細書においてさらに企図される。ＣＡＲ発現細胞は、癌治療において充分に有用であることが分かっている。自己由来または同種異系由来の当該細胞は、細胞にレンチウイルスベクターを導入することなどにより、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変されている。細胞は一般にＴ細胞であるが、ＮＫ細胞もまた使用される。ＣＡＲは、典型的には、抗原結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含むいくつかのセクションを有する。
細胞外抗原結合ドメインは、通常癌細胞上にある、所与の標的タンパク質を特異的に認識する。標的に結合すると、ＣＡＲ細胞は活性化され、また、癌細胞の近くに保持される。抗原結合ドメインは、スペーサーを介して膜貫通ドメインに連結され、膜貫通ドメインは細胞内共刺激シグナル伝達ドメインに連結される。スペーサーの長さは、抗原結合ドメインおよびその標的タンパク質の特性に応じて最適化されなければならない場合がある。癌細胞への標的の結合は、シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインによる活性化シグナルをもたらすコンフォメーション変化として誘発する。膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの間に通常位置する共刺激シグナル伝達ドメインは、活性化シグナルを増幅するのに役立つ。共刺激シグナル伝達ドメインの例示的な実施形態は、ＣＤ２８または４－１ＢＢである。
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、本明細書に記載のＶＬおよび／またはＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、本明細書に記載のｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、「装甲（armored）ＣＡＲ」細胞、すなわち、可溶性タンパク質を分泌してＣＡＲ細胞が投与された対象の腫瘍微小環境内の免疫応答を変えるＣＡＲ発現細胞である。いくつかの実施形態において、当該細胞は、本明細書に記載の結合メンバー、特にｓｃＦｖを分泌する。
化学的および／または生物学的修飾
一態様において、本明細書に開示される結合メンバーは、化学的および／または生物学的に修飾されている。当該修飾には、グリコシル化、ＰＥＧ化、ＨＥＳ化、アルブミン融合技術、ＰＡＳ化、色素および／もしくは放射性同位元素による標識、酵素および／もしくは毒素との結合、リン酸化、ヒドロキシル化、ならびに／または硫酸化が含まれ得るが、これらに限定されない。同様に、上記の結合メンバー、塩基配列、ベクター、および／または宿主細胞は、それ相応に改変されていることができる。
タンパク質の薬理または水溶性を最適化するため、またはその副作用を低下させるために、化学的および／または生物学的修飾を行い得る。例えば、ＰＥＧ化、ＰＡＳ化、および／またはＨＥＳ化は、腎クリアランスを遅くし、それによって結合メンバーの血漿半減期を増加させるために適用され得る。追加的または代替的に、修飾は、タンパク質に異なる機能性を、例えば、癌細胞とより効果的に戦うための毒素、または診断目的のための検出分子を付加し得る。
グリコシル化は、タンパク質に炭水化物を結合させるプロセスを指す。生体系では、当該プロセスは、翻訳と同時および／または翻訳後の修飾の様式として細胞内で酵素的に行われる。タンパク質、ここでは抗体などの結合メンバーは、化学的にグリコシル化されていることもできる。典型的には、限定されるものではないが、グリコシル化は、（ｉ）アスパラギンもしくはアルギニン側鎖の窒素へのＮ結合型である、（ｉｉ）セリン、スレオニン、チロシン、ヒドロキシリジン、もしくはヒドロキシプロリン側鎖のヒドロキシ酸素へのＯ結合型である、（ｉｉｉ）キシロース、フコース、マンノース、およびＮ－アセチルグルコサミンのホスホセリンへの結合を伴う、または（ｉｖ）マンノース糖が特定の認識配列中に見られるトリプトファン残基に付加されるＣ－マンノシル化の様式である。グリコシル化パターンは、例えば、適当な細胞株、培養培地、タンパク質工学製造モード、およびプロセス戦略を選択することによって制御することができる（HOSSLER, P. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture.Glycobiology 2009, vol. 19, no. 9, p. 936-949.）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の結合メンバーのグリコシル化パターンは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を増強するように改変されている。
グリコシル化パターンを制御または改変するタンパク質工学は、１つ以上のグリコシル化部位の欠失および／または付加を伴い得る。グリコシル化部位の生成は、対応する酵素認識配列を結合メンバーのアミノ酸配列に導入することによって、または上記のアミノ酸残基の１つ以上を付加もしくは置換することによって、簡便に達成することができる。
結合メンバーをＰＥＧ化することが望ましい場合がある。ＰＥＧ化は、タンパク質の薬力学的特性および薬物動態学的特性を変化させる可能性がある。適当な分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、タンパク質骨格に共有結合させる（例えば、Pasut G. and Veronese F. State of the art in PEGylation: the great versatility achieved after forty years of research.J. Control Release, 2012, vol. 161, no. 2, p.461を参照）。ＰＥＧ化は、さらに、ＰＥＧ化タンパク質を免疫系から遮蔽することによって免疫原性を低減し得、かつ／または、例えば、結合メンバーのインビボ安定性を増加させ、結合メンバーをタンパク質分解から保護し、その半減期を延長することにより、および、その生体内分布を変化させることにより、ＰＥＧ化タンパク質の薬物動態を変え得る。
類似の効果は、ＰＥＧ模倣物、例えば、抗体のＨＥＳ化またはＰＡＳ化によって達成され得る。ＨＥＳ化は、ヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体を利用するが、ＰＡＳ化の間、抗体は、アミノ酸のプロリン、アラニン、およびセリンからなる立体構造的に不規則なポリペプチド配列に連結される。これらのＰＥＧ模倣物および関連化合物は、例えば、Binder U. and Skerra, A. Half-Life Extension of Therapeutic Proteins via Genetic Fusion to Recombinant PEG Mimetics, in Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives.Edited by Kontermann R., Weinheim, Germany: Wiley-VCH, 2012ISBN: 9783527328499. p. 63に記載されている。
結合メンバーは、サルベージレセプター結合エピトープなどのエピトープを含み得る。当該サルベージレセプター結合エピトープは、典型的には、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指し、分子のインビボ半減期を増加させる効果を有する。
追加的または代替的に、結合メンバーは、標的結合後の補助的な機能に帰属する第２の部分で標識されているか、または当該部分に結合されている。第２の部分は、例えば、追加の免疫性エフェクター機能を有すること、薬剤標的化において有効であること、または検出に有用であることがあり得るが、これらに限定されない。第２の部分は、例えば、当技術分野で公知の方法を使用して、結合メンバーに化学的に連結されるか、または遺伝子学的に融合されることができる。
第２の部分として機能し得る分子には、限定はされないが、放射性同位体とも呼ばれる放射性核種、アポ酵素、酵素、補因子、ＨＩＳタグなどのペプチド部分、タンパク質、マンノース－６－リン酸タグなどの炭水化物、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などのフルオロフォア、フィコエリトリン、グリーン／ブルー／レッドまたは他の蛍光タンパク質、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、発色団、ビオチンなどのビタミン、キレート剤、メトトレキサートなどの代謝拮抗物質、リポソーム、細胞傷害性薬剤などの毒素、または放射性毒素が含まれる。放射性核種の実例は、３５Ｓ、３２Ｐ、１４Ｃ、１８Ｆ、および１２５Ｉである。好適な酵素の例には、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、およびアンジオジェニンが含まれるが、これらに限定されない。好適なタンパク質の実例は、レクチンである。好適な細胞傷害性薬剤の例には、タキソール、グラミシジンＤ、およびコルヒチンが含まれるが、これらに限定されない。
標識された結合メンバーは、インビトロおよびインビボ検出または診断の目的に特に有用である。例えば、好適な放射性同位元素、酵素、フルオロフォア、または発色団で標識された結合メンバーは、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、またはフローサイトメトリーをベースとする単一細胞解析（例えば、ＦＡＣＳ解析）によってそれぞれ検出することができる。同様に、本明細書に開示される核酸および／またはベクターは、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてそれらの標識されたフラグメントをプローブとして使用して、検出または診断の目的のために使用することができる。標識プロトコルは、例えば、Johnson I. and Spence, M. T.Z.Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies.Life Technologies, 2010.ISBN: 0982927916に見られ得る。
組成物
本明細書に開示される結合メンバー、塩基配列、および／またはベクターは、好適な担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む組成物中に与えられ得る。典型的な実施形態では、それぞれの組成物は、本明細書に記載の抗体を含む。
当該組成物は、例えば、診断用、美容用、または医薬用組成物であることができる。治療目的または美容目的では、組成物は、薬剤的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物であり、すなわち、使用される用量および濃度で毒性ではない。
好適な「担体」、「賦形剤」、または「希釈剤」には、限定はされないが、（ｉ）緩衝剤、例えばリン酸、クエン酸、もしくは他の有機酸；（ｉｉ）酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびトコフェロール；（ｉｉｉ）防腐剤、例えば３－ペンタノール、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、アルキルパラベン、カテコール、もしくはシクロヘキサノール；（ｉｖ）アミノ酸、例えばヒスチジン、アルギニン；（ｖ）ペプチド、好ましくは最大１０残基、例えばポリリシン；（ｖｉ）タンパク質、例えばウシもしくはヒト血清アルブミン；（ｖｉｉ）親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；（ｖｉｉｉ）単糖類、二糖類、多糖類、および／もしくは他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、アミノデキストラン、もしくはポリアミドアミン；（ｉｘ）キレート剤、例えばＥＤＴＡ；（ｘ）塩形成イオン、例えばナトリウム、カリウム、および／もしくは塩化物；（ｘｉ）金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；（ｘｉｉ）イオン性および非イオン性界面活性剤、例えばTWEENＴＭ、PLURONICSＴＭ、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびに／または（ｘｉｉｉ）凍結保存剤、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が含まれる。
例示的な化合物の多くは、異なる機能を有し、例えば、担体および希釈剤として作用し得る。組成物は、各担体、希釈剤、または賦形剤のうちの２つ以上を含み得ることも理解されたい。
結合メンバー、塩基配列、またはベクターは、ビーズ、微粒子、またはナノ粒子などの固体支持体材料上に与えられ得る。典型的には、結合メンバー分子は、共有結合（必要に応じてリンカーを伴う）、非共有結合、またはその両方を介してこのような担体に連結される。ビーズおよび微粒子は、例えば、デンプン、セルロース、ポリアクリレート、ポリアセテート、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）、ラテックス、またはデキストランを含むことができる。
一実施形態において、上記の結合メンバー、塩基配列、またはベクターを含む医薬組成物が与えられる。組成物は、治療有効量の１つ以上の追加の治療的に活性な化合物をさらに含み得る。追加の治療的に活性な化合物は、いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１媒介性疾患に対して活性な化合物である。
治療用途
本明細書に記載の分子、特に結合メンバー（抗体など）、核酸分子、宿主細胞、またはベクターは、薬剤として有用である。典型的には、当該薬剤は、本明細書で与えられる治療有効量の分子または細胞を含む。したがって、それぞれの分子または宿主細胞は、１つ以上のＰＤ－Ｌ１関連障害の治療に有用な薬剤の製造に使用することができる。
一態様において、ＰＤ－Ｌ１関連／ＰＤ－Ｌ１媒介性障害を治療する方法が与えられる。当該方法は、薬剤的に有効な量の本明細書に記載の分子または宿主細胞、特に抗体または宿主細胞を、治療を必要とする対象に投与するステップを含む。一実施形態において、このような薬剤的に有効な量の結合メンバー、例えば抗体または宿主細胞を含む、上記の医薬組成物を、対象に投与する。上記の薬剤を対象に投与し得る。
治療を必要とする対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。典型的には、対象は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、サル（monkey）、サル（ape）、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、モルモット、またはブタである。典型的な実施形態では、対象は、ＰＤ－Ｌ１関連障害と診断されるか、またはこのような障害を獲得し得る。動物モデルの場合、ＰＤ－Ｌ１関連障害を発症するように動物を遺伝子改変し得る。動物モデルでは、ＰＤ－Ｌ１媒介性疾患の特徴を示すようにも動物を遺伝子改変し得る。
ＰＤ－Ｌ１のアンタゴニストが治療効果を示す様々なＰＤ－Ｌ１関連障害が知られており、限定はされないが、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、尿路上皮癌、メラノーマ、腎細胞癌、ホジキンリンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、卵巣癌、胃腸癌、肝細胞癌、神経膠腫、乳癌、リンパ腫、小細胞肺癌、骨髄異形成症候群、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、非淡明細胞腎癌、結腸直腸癌、肉腫、結腸癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌または胃癌、皮膚癌、子宮癌、神経膠芽細胞腫、白血病、癌腫、メルケル細胞癌または腎細胞癌（ＲＣＣ）、血液癌、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞白血病、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、および卵巣癌が含まれるか、または前記疾患は、全身性エリテマトーデスである。
ＰＤ－１経路はまた、敗血症および関連障害に関与することも示されている（例えば、国際公開第２０１５０３８５３８号参照）。したがって、一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１関連疾患は、敗血症、敗血症性ショック、全身性炎症性反応症候群、または代償性抗炎症性反応症候群である。
Bodhankarら((2015) Stroke 46(10): 2926-34)は、実験的脳梗塞の中大脳動脈閉塞マウスモデルにおいて抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体による治療の有益な治療効果を実証した。
ＰＤ－１およびＰＤＬ－１は、原発性中枢神経系リンパ腫において免疫組織化学的に検出可能であり、免疫抑制性微小環境の生成に関与し得る（Berghoff et al., (2014) Clinical Neuropathology 33(1):42-9）。特定の免疫チェックポイント阻害剤は、この疾患における実験的治療アプローチのために検討され得る。
移植後設定における急性白血病に対するＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の影響は、マウスおよびヒトの両方で評価されている。Koestnerら((2011), Blood 117(3): 1030-1041）は、マウスモデルにおいて、ＰＤ－Ｌ１遮断による移植片対宿主病の誘発のない移植片対リンパ腫効果の回復を観察し、造血幹細胞の移植後早期での遺伝子改変同種異系Ｔ細胞の養子移入は、移植片対宿主病を伴わない強力な移植片対リンパ腫効果を示したが、後の養子移入は同時ＰＤ－Ｌ１遮断のみで有効であった。Ｔ細胞は、レシピエント白血病特異抗原に対するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現するように改変された。
医薬組成物は、様々な好適な投与経路のうちの１つ以上によって適用し得る。投与は、例えば、非経口的に行うことができる。いくつかの実施形態において、投与は筋肉内に行う。いくつかの実施形態において、投与はボーラスまたは連続注入によって静脈内に行う。投与は、いくつかの実施形態において、関節内、滑液嚢内、皮下、局所的（topically）（例えば、皮膚または眼）、非経口、直腸内、皮内、皮下、経皮（transdermally）、経皮（percutanously）、または局所的（locally）に行う。他の好適な投与様式には、限定はされないが、脳内、脳脊髄内、髄腔内、硬膜外、または腹腔内、経口、泌尿生殖器、硝子体内、全身、静脈内、腹腔内、筋肉内、眼内、耳内、鼻腔内、吸入、舌下、頭蓋内、筋肉内、腹腔内、または口腔が例えば含まれる。本明細書に開示される結合メンバー、塩基配列、ベクター、または宿主細胞は、１以上の他の治療上有効な化合物と組み合わせることができる。当該化合物は、いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１レセプターを介したシグナル伝達を乱すことができる場合がある。それぞれの化合物は、いくつかの実施形態では、例えば炎症反応の他のメディエーターなどの１つ以上のさらなる標的を阻害することができる場合がある。当該化合物は、同時にまたは連続して投与することができる。
治療用途では、結合メンバーは、放射性標識されていてもよく、毒素に連結されていてもよく、または上記の別のエフェクター機能に連結されていてもよい。
本明細書に記載の結合メンバーの治療的使用は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法、放射線療法、またはワクチン療法の群から選択される１つ以上の療法との併用であり得る。
いくつかの実施形態において、結合メンバーを、１つ以上の異なる医薬化合物との併用で投与する。例示的な実施例には、ＣＴＬＡ－４阻害剤（例えば、トレメリムマブおよび／もしくはイピリムマブ）、ＶＥＧＦ阻害剤（例えば、ベバシズマブ）、ＥＧＦレセプター阻害剤（例えば、エルロチニブ）、細胞増殖阻害剤（例えば、シスプラチン、ペメトレキセド、カルボプラチン、および／もしくはパクリタキセル）、ＩＦＮ－ｇ、癌ワクチン、可溶性ＣＤ８０、またはそれらの組み合わせが含まれる。１つ以上の医薬化合物との併用での抗ＰＤ－Ｌ１抗体に関しての臨床試験の概説は、He J et al (2015), Nature Scientific Reports; 5:13110; DOI: 10.1038/srep13110に与えられている。併用で投与し得る化学療法剤には、限定はされないが、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、アルカロイド、ニトロソ尿素剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモンまたはそのアンタゴニスト、アロマターゼ阻害剤、Ｐ－糖タンパク質阻害剤、および／または白金錯体誘導体が含まれる。化学療法剤の例示的な実施形態は、ゲムシタビン、ｃｙｃｌｏｐｈｓｐｈａｍｉｎｅ、５－ｆｌｕｏｒｏｕｃｉｌ、オキサリプラチンであり、Black et al.(2016) Oncotarget 7(9):10557-67は、ＰＤ－Ｌ１を発現するヒトおよびマウスの乳癌および前立腺癌細胞株のパネルにおいて、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイントの活性化が、転移の増加に関連する腫瘍細胞の化学療法抵抗性を与えることを示した。彼らはまた、抗ＰＤ－１抗体を用いるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸の阻害が、ドキソルビシン化学療法を強化して、転移性乳癌の同系乳房同所性マウスモデルにおける転移を阻害することも示した。彼らは、化学療法と免疫チェックポイント遮断の併用が、化学療法抵抗性と転移性疾患への進行とを制限し得ると結論づけている。
一実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ウイルスの持続感染を有する対象へワクチンとの併用で投与される。マウスモデルでは、疲弊したＣＤ８＋ Ｔ細胞上のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害シグナルの遮断が、治療的ワクチン接種との併用で、機能的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を相乗的に増強し、ＣＤ４（＋） Ｔ細胞の補助がない場合でもウイルス制御を改善することが示された（例えば、Ha SJ et al, J Exp Med.2008 Mar 17;205(3):543-55 and EP2079760B1を参照）。対象は、例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、Ｔ細胞白血病ウイルス、Ｔリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、および／または水痘－帯状疱疹ウイルスによるウイルスの持続感染を有し得る。
また、腫瘍または腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、前記腫瘍または腫瘍細胞を治療有効量の本明細書に開示される結合メンバーと接触させるステップを含む、前記方法も企図される。一実施形態において、投与は腫瘍増殖を引き起し、別の実施形態では、投与は腫瘍サイズを減少させる。
診断用途および／または検出目的
本明細書に開示される結合メンバーは、インビボおよび／またはインビトロでの検出または診断目的のために使用され得る。例えば、特定の細胞または組織における発現を検出するための抗体を含む幅広いイムノアッセイが当業者に知られている。同様に、前述の本文に記載されている結合メンバー、塩基配列、ベクター、および／または宿主細胞を、このセクションで詳述されるように、それ相応に使用することができる。
腫瘍性ＰＤ－Ｌ１の発現状態は、複数の腫瘍型、例えば、限定はされないが、メラノーマ、腎細胞癌、および非小細胞肺癌において予後徴候であることが示されている。ＰＤ－Ｌ１発現は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が必須である免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定することができる。
このような用途のために、本明細書に開示される結合メンバー（例えば、抗体）、塩基配列、ベクター、または宿主細胞は、検出可能な標識を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される結合メンバー、塩基配列、ベクター、または宿主細胞は、検出可能な標識を含まない。実例として、非標識抗体を使用し、本明細書に記載の結合メンバー、例えば抗体上のエピトープに特異的に結合する二次抗体により検出し得る。
いくつかの実施形態において、結合メンバー、塩基配列、ベクター、および／または宿主細胞は、検出物質が認識することができる１つ以上の物質に結合している。一例として、結合メンバーは、ストレプトアビジンに結合するその能力によって検出されることができるビオチンに共有結合していることがあり得る。同様に、本明細書に開示される核酸および／またはベクターは、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてそれらの標識されたフラグメントをプローブとして使用することにより、検出または診断の目的のために使用することができる。
特定の実施形態では、本明細書に与えられる分子のいずれか、特に抗体は、試料、好ましくは生体起源の試料中のＰＤ－Ｌ１の存在を検出するのに有用である。この文脈で使用される用語「ＰＤ－Ｌ１」は、全長ＰＤ－Ｌ１、そのフラグメント、および／またはその前駆体を含む。用語「検出」は、定量的および／または定性的検出を包含する。特定の実施形態において、生体試料は、ヒト患者由来の細胞または組織を含む。生体試料の非限定的な例には、血液、尿、脳脊髄液、生検、リンパ液、および／または非血液組織が含まれる。
特定の実施形態では、方法は、存在する場合、その標的ＰＤ－Ｌ１への阻害剤の結合を許容する条件下で、本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１に対する結合メンバー（抗ＰＤ－Ｌ１抗体など）と生体試料を接触させることと、阻害剤－標的複合体を検出することとを含む。当該方法は、インビトロまたはインビボの方法であり得る。一実施形態において、当該結合メンバーは、例えば、ＰＤ－Ｌ１が患者の選択のためのバイオマーカーである場合、本明細書に記載の結合メンバーによる治療に適格な対象を選択するために使用される。
別の態様では、結合メンバー、例えば抗体は、例えば、皮膚の美的外観を改善するために、化粧用途に使用される。
同様に、上述の塩基配列、ベクター、および／または宿主細胞は、上記のようにそれ相応に使用することができる。
製品
他の態様において、製品（すなわち、キット）が与えられる。製品には、物質、例えば（ｉ）ＰＤ－Ｌ１関連障害の治療、予防、進行の遅延、（ｉｉ）診断目的、または（ｉｉｉ）美容目的に有用な材料が含まれる。製品は、使用説明書および１つ以上の容器を含み得る。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、カートリッジ、プレート、および試験管が含まれ、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料からできていることができる。少なくとも１つの容器は、本明細書に開示される結合メンバーを含む組成物を保持する。容器は無菌のアクセスポートを有し得る。それぞれの容器は、典型的にはラベル付けされている。
試薬は、典型的には所定量の乾燥粉末で与えられ、通常は凍結乾燥され、溶解後に適当な濃度を有する試薬溶液を与える賦形剤を含む。安定剤および／または緩衝剤などの他の添加剤も含まれ得る。結合メンバーが酵素で標識されている場合、キットは、典型的には、それに応じた基質および補因子を含む。
使用説明書は、選択された障害の治療、予防、および／もしくは進行の遅延のために組成物を使用するという表示、または検出もしくは診断アッセイを実施するための説明を与え得る。説明書は、ラベルおよび／または添付文書に記載され得る。
言及されている配列
本明細書で開示される配列は以下である。
配列番号１－ｓｃＦＶ１のＶＬ
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEDIYSLLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNYGSSSSSSYGAVFGQGTKLTVLG
配列番号２－ｓｃＦＶ１のＶＨ
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGIDLSSYTMGWVRQAPGKGLEWVGIISSGGRTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYTGYPYYFALWGQGTLVTVSS
配列番号３－ｓｃＦＶ１のＣＤＲ－Ｌ１
QASEDIYSLLA
配列番号４－ｓｃＦＶ１のＣＤＲ－Ｌ２
DASDLAS
配列番号５－ｓｃＦＶ１のＣＤＲ－Ｌ３
QGNYGSSSSSSYGAV
配列番号６－ｓｃＦＶ１のＣＤＲ－Ｈ１
IDLSSYTMG
配列番号７－ｓｃＦＶ１のＣＤＲ－Ｈ２
IISSGGRTYYASWAKG
配列番号８－ｓｃＦＶ１のＣＤＲ－Ｈ３
GRYTGYPYYFAL
配列番号９－ｓｃＦＶ１
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEDIYSLLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNYGSSSSSSYGAVFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGIDLSSYTMGWVRQAPGKGLEWVGIISSGGRTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYTGYPYYFALWGQGTLVTVSS
配列番号１０－リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号１１－メチル化ｓｃＦＶ１
MEIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEDIYSLLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNYGSSSSSSYGAVFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGIDLSSYTMGWVRQAPGKGLEWVGIISSGGRTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYTGYPYYFALWGQGTLVTVSS
配列番号１２－ＦＲ－Ｌ１
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC
配列番号１３－ＦＲ－Ｌ２
WYQQKPGKAPKLLIY
配列番号１４－ＦＲ－Ｌ３
GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC
配列番号１５－ＦＲ－Ｌ４
FGQGTKLTVLG
配列番号１６－ＦＲ－Ｈ１
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSG
配列番号１７－ＦＲ－Ｈ２
WVRQAPGKGLEWVG
配列番号１８－ＦＲ－Ｈ３
RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
配列番号１９－ＦＲ－Ｈ４
WGQGTLVTVSS
配列番号２０－ＩｇＧ＿１の重鎖
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGIDLSSYTMGWVRQAPGKGLEWVGIISSGGRTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYTGYPYYFALWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号２１－ＩｇＧ＿２の重鎖
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号２２－ＩｇＧ＿３の重鎖
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号２３－ＩＧＧ＿４の重鎖
EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMTWVRQAPGRGLEWVSGIHWHGKRTGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLKGEDTALYHCVRGGMSTGDWFDPWGQGTLVIVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
配列番号２４－ＩｇＧ＿１の軽鎖
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEDIYSLLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNYGSSSSSSYGAVFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号２５－ＩｇＧ＿２の軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号26－IgG_3の軽鎖
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号27－IgG_4の軽鎖
DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQSINSYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
以下は、本明細書に開示される方法および組成物を例示する実施例である。上述の一般的な説明を考慮すると、様々な他の実施形態が実施され得ることが了解される。
実施例１－ＰＤ－Ｌ１結合ｓｃＦｖの同定
ウサギの免疫化：ウサギを組み換えヒト（ｒｈ）ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体で免疫化した（RnD Systems、米国、カタログ番号156-B7）。最後の追加免疫後にリンパ節を抜き取り、細胞を凍結保存した。
ＰＤ－Ｌ１特異性の確認：ＰＤ－Ｌ１に対するウサギ血清の反応性の確認は、結合ＥＬＩＳＡによって行った。簡潔には、ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合体（RnD Systems、米国、カタログ番号156-B7）またはＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ（BioVision、米国、カタログ番号7429）を、ＰＢＳ中２ｍｃｇ／ｍＬの濃度で、３７℃で１時間、Maxisorp ９６ウェルマイクロプレートにコーティングした。５％脱脂粉乳および１％ＢＳＡでブロッキングした後、濃度を増加させてウサギ血清を添加し、結合したＩｇＧをヤギ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（Southern Biotech、米国、カタログ番号4050-05）によって検出した。ＥＬＩＳＡは、ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質溶液（eBioscience、米国、カタログ番号00-4201-56）を用いて発色させた。全てのウサギ血清はＦｃ融合およびＨｉｓタグ化ＰＤ－Ｌ１の両方に結合し、免疫化がＰＤ－Ｌ１に対するＢ細胞応答を成功裏に誘導したことを示した。
ウサギＢ細胞のフローサイトメトリーソーティングおよび培養：ＰＤ－Ｌ１特異的メモリーＢ細胞をFACSAria III（BD Biosciences）を用いて９６ウェルマイクロプレートに単一細胞としてソーティングした。単一Ｂ細胞クローンを、フィーダー細胞および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する馴化培地の存在下で培養した。
９００を超える単一Ｂ細胞クローンをソーティングし、培養し、細胞培養上清を抗ＰＤ－Ｌ１特異的ＩｇＧの存在についてＥＬＩＳＡにより分析した。簡潔には、ｒｈＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体（RnD Systems、米国、カタログ番号156-B7）を、ＰＢＳ中２ｍｃｇ／ｍＬの濃度で、４℃で一晩、Maxisorp ９６ウェルマイクロプレートにコーティングした。５％脱脂粉乳、１％ＢＳＡ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０でブロッキングした後、細胞培養上清を添加した。ＰＤ－Ｌ１特異的ＩｇＧは、抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（Southern Biotech、カタログ番号4050-05）によって検出した。ＥＬＩＳＡは、ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質溶液（eBioscience、米国、カタログ番号00-4201-56）を用いて発色させた。ＰＤ－Ｌ１特異的ＩｇＧ産生Ｂ細胞クローンを同定し、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１との相互作用を遮断する能力についてＩｇＧ抗体をさらに分析した。簡潔には、ＰＤ－Ｌ１発現ＣＨＯ細胞（Promega、米国、カタログ番号CS187103）を９６ウェルマイクロプレートに播種した。ＰＤ－Ｌ１特異的ＩｇＧを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２０分間インキュベートした。ＰＤ－１発現エフェクタージャーカット細胞（Promega、米国、カタログ番号CS187105）を添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに６時間インキュベートした。ＴＣＲ／ＣＤ３活性化は、Bio-Glo Luciferase Assay System（Promega, G7941）による発光検出によって測定した。６９個のＩｇＧ産生Ｂ細胞クローンがＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害することが分かった
ＰＤ－Ｌ１中和ＩｇＧの配列決定：中和抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ抗体を産生する全てのウサギＢ細胞クローンを、RNeasy Mini Kit（Qiagen、ドイツ、カタログ番号74106）を用いるｍＲＮＡ単離に付した。ｍＲＮＡを、製造業者のプロトコル（OneStep ＲＴ－ＰＣＲキット、Qiagen、ドイツ、カタログ番号２１０２１２）に従って逆転写の鋳型として使用した。続いて、オリゴヌクレオチドを用いてウサギＩｇＧ重鎖および軽鎖をコードする配列を特異的に増幅するＰＣＲ反応を行った（Biometra Thermocycler T3）。重鎖および軽鎖ＰＣＲフラグメントを独立に配列決定し（ABI、Sanger 3730xl； Microsynth AG、スイスのバルガッハ）、得られた塩基配列をEMBOSS Transeq (http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) を用いてアミノ酸配列に翻訳し、CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)を用いてアラインメントした。
抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ遺伝子の構築およびｓｃＦｖタンパク質発現：上記に定義した可変軽鎖および可変重鎖のウサギＩｇＧ ＣＤＲ領域を同定し、ヒト軽鎖および重鎖アクセプターフレームワーク上へグラフト化した。一部において、点変異が導入された。配列番号１０の配列によってＣ末端可変重鎖に連結されたＮ末端可変軽鎖を有するｓｃＦｖタンパク質をコードする細菌発現ベクターを作製した。ｓｃＦｖタンパク質は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen、米国、カタログ番号69450-3）で封入体として発現させ、これを単離し、可溶化し、タンパク質をリフォールディングさせた。リフォールディングされたｓｃＦｖをサイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、約２６ｋＤａに対応するモノマーピーク画分を収集した。
上記のように、ヒト化ｓｃＦｖを、ＥＬＩＳＡにより、ヒトＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体結合について分析した。この手順により、試験した４７のｓｃＦｖのうち２８のｓｃＦｖをヒトＰＤ－Ｌ１の結合剤として同定した。ヒト化ｓｃＦｖを、ＥＬＩＳＡにより、マウスＰＤ－Ｌ１への結合についてさらに分析した。簡潔には、マウスＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体（Sino Biological、中国、カタログ番号50010-M03H、またはRnD Systems、米国、カタログ番号1019-B7-100）を、ｐＨ７．２のＰＢＳ中で、５ｍｃｇ／ｍＬまたは１ｍｃｇ／ｍＬの濃度で、４℃で一晩、Maxisorp ９６ウェルマイクロプレートにコーティングした。ｐＨ７．２のＰＢＳ中１％ＢＳＡ、またはｐＨ７．２のＰＢＳ中１％ＢＳＡを含む５％脱脂粉乳でブロッキングした後、濃度を増加させてｓｃＦｖ（０．００１６、０．００８、０．０４、０．２、１．０、および５．０ｍｃｇ／ｍＬ、または０．０２、０．０６、０．１９、０．５６、１．６７、および５．０ｍｃｇ／ｍＬ）をウェルに添加した。マウスＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体のコーティングの成功は、マウスＰＤ－Ｌ１特異的抗体（Sino Biological、中国、カタログ番号50010-M08H）を用いて確認した。ｓｃＦｖはプロテインＬ－ＨＲＰ（Sigma-Aldrich、米国、カタログ番号P3226）により検出したが、全長ＩｇＧ対照抗体はＨＲＰに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Southern Biotech、米国、カタログ番号4050-05）により検出した。ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質溶液（eBioscience、米国、カタログ番号00-4201-56）を用いて発色させ、吸光度を４５０ｎｍで測定した。ＳｃＦｖ１は、５ｍｃｇ／ｍＬの濃度までマウスＰＤ－Ｌ１と交差反応しなかった。１つの試験したｓｃＦｖは、マウスＰＤ－Ｌ１に対する弱い交差反応性を示した。ヒトＰＤ－Ｌ１結合ｓｃＦｖを、実施例２に示されているように、ヒトＰＤ－Ｌ１の活性を中和するそれらの能力について、実施例３に示されているように、それらの安定性について、実施例４に示されているように、それらのヒトＰＤ－Ｌ１に対する親和性について、実施例５に示されているように、それらの特異性について、さらにキャラクタリゼーションした。ｓｃＦｖ１を、実施例６に示されているように、天然型のヒトＰＤ－Ｌ１への結合の分析によって、実施例７に示されているように、細胞から分泌されたｓｃＦｖ１の分析によって、実施例８に示されているように、インビボ有効性の測定によって、さらにキャラクタリゼーションした。ＩｇＧフォーマットへの変換後、実施例９に示されているように、ｓｃＦｖ１に対応する抗体を、ヒトＰＤ－Ｌ１とヒトＰＤ－１との間の相互作用を阻害する能力によって、およびヒトＰＤ－Ｌ１に対する親和性の分析によって、さらに分析した。
実施例２－ヒトＰＤ－Ｌ１の中和
２６のｓｃＦｖおよび１つの非結合ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ２）を、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断アッセイにおいて、それらのＰＤ－Ｌ１中和能力についてさらに試験した。このアッセイにおいて、ルシフェラーゼ活性はＴ細胞の活性によって促進される。ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－Ｌ１との相互作用は、阻害シグナルおよびルシフェラーゼ活性の低下を生じ、これは、ＰＤ－Ｌ１の阻害剤で細胞を処理することによって克服される。ＰＤ－Ｌ１発現ＣＨＯ細胞（Promega、CS187103）を９６ウェルマイクロプレートに播種した。濃度を増加させてｓｃＦｖを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２０分間インキュベートした。ＰＤ－１発現エフェクタージャーカット細胞（Promega、CS187105）を添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに６時間インキュベートした。ＴＣＲ／ＣＤ３活性化は、Bio-Glo Luciferase Assay System（Promega, G7941）による発光検出によって測定した。阻害曲線をプロットし、GraphPad Prism（登録商標）ソフトウェア バージョン６．０５を用いてＩＣ５０値を計算した。ｓｃＦｖ１およびｓｃＦｖ２の結果を図１に示す。ｓｃＦｖ１は、７５０ｐＭのＩＣ５０で免疫チェックポイント阻害シグナルを効果的に遮断した。非結合ｓｃＦｖ２は、免疫チェックポイント阻害シグナルに対する効果を示さなかった。ＳｃＦｖ１は、試験した２７のｓｃＦｖのうち最も高い効力を示した。最低効力のｓｃＦｖのＩＣ５０は、１０ｍｃｇ／ｍＬまでの濃度範囲を用いて測定することができなかった。
ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を阻害するｓｃＦｖ１、非結合ｓｃＦｖ２、および３つの他のｓｃＦｖの能力を競合ＥＬＩＳＡによって試験した。Maxisorp ９６ウェルマイクロプレートに、ｒｈＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体（RnD Systems、米国、カタログ番号156-B7）をＰＢＳ中２ｍｃｇ／ｍＬの濃度で４℃で一晩コーティングした。プレートを、ｐＨ７．２のＰＢＳ中の１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０でブロッキングした。ｓｃＦｖの段階希釈液を調製し、１１の１：３希釈液は１ｍｃｇ／ｍＬで始まり、これらをプレートに添加した。室温で１時間後、ｓｃＦｖ希釈液の半分を除去し、ビオチン化ＰＤ－１ Ｆｃ融合体（BPS Bioscience、米国、カタログ番号71109）で１５ｎｇ／ｍＬの最終濃度で交換した。結合したＰＤ－１ Ｆｃ融合体をストレプトアビジン－ＨＲＰ（BD Pharmingen、米国、カタログ番号554060）で検出した。バックグラウンドレベルをＰＤ－１の非存在下で測定した。ＥＬＩＳＡは、ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質溶液（eBioscience、米国、カタログ番号00-4201-56）を用いて発色させた。このアッセイにおいて、図２に示されているように、ＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１と相互作用する能力は、吸光シグナルを生じ、ｓｃＦｖ１によって効果的に中和されるが、非結合ｓｃＦｖ２によって中和されない。３つの他のｓｃＦｖも、ｓｃＦｖ１に匹敵する程度まで相互作用を中和した。
ＰＤ－Ｌ１のＣＤ８０への結合を阻害するｓｃＦｖ１および非結合ｓｃＦｖ２の能力を競合ＥＬＩＳＡによって試験した。Maxisorp ９６ウェルマイクロプレートに、ｒｈＣＤ８０－Ｈｉｓ（RnD Systems、米国、カタログ番号9050-B1-100）をＰＢＳ中２ｍｃｇ／ｍＬの濃度で４℃で一晩コーティングした。プレートを、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０でブロッキングした。ｓｃＦｖの段階希釈液を、一定濃度の５０ｎＭ ｒｈＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体（RnD Systems、米国、カタログ番号156-B7）を用いて調製し、１１の１：３ ｓｃＦｖ希釈液は１ｍＭで始まるものであった。この混合物をＣＤ８０でコーティングしたプレートで室温で２時間インキュベートした。ＰＤ－Ｌ１のＣＤ８０への結合がないことに対応するバックグラウンドレベルは、ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃが存在しないｓｃＦｖ１の希釈系列を含めることによって測定した。結合したＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（Southern Biotech、米国、カタログ番号2048-05）で検出した。ＥＬＩＳＡは、ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質溶液（eBioscience、米国、カタログ番号00-4201-56）を用いて発色させた。このアッセイにおいて、図３に示されているように、ＰＤ－Ｌ１がＣＤ８０と相互作用する能力は、吸光シグナルを生じ、ｓｃＦｖ１によってバックグラウンドレベルまで効果的に中和されるが、非結合ｓｃＦｖ２によって中和されない。
まとめると、これらの結果は、ｓｃＦｖ１がＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１およびＣＤ８０の両方との相互作用を遮断することを示している。
実施例３－ｓｃＦｖの安定性
ｓｃＦｖの安定性に影響し得る２つの異なるプロセスを観察することができる。第一に、ｓｃＦｖは二量体化されやすく、その後オリゴマー化され、さらに凝集および沈殿することもよくある。第二に、より小さいフラグメントをもたらすｓｃＦｖの分解は、時間が経つにつれて起こり得る。
ＰＢＳ ｐＨ７．２中で製剤化されたｓｃＦｖ１および４種の他のｓｃＦｖの安定性を、様々な温度条件下での保存時に調べた。ｓｃＦｖを１．５ｍＬポリプロピレンチューブ中で、４℃、２２℃、３７℃、および－２０℃で１０ｍｇ／ｍＬ濃度で保存した。試料をＳＥ－ＨＰＬＣにより分析して、全ピーク面積に対するモノマー、ダイマー、および高分子量オリゴマーのレベル（％）を測定した。TOSOH TSKgel G2000 SWXLカラム、ジオール相、Ｌ×Ｉ．Ｄ．３０ｃｍ×７．８ｍｍ、５μｍ粒径（Sigma Aldrich、米国、カタログ番号08540）を使用した。１０ｍｇ／ｍＬのｓｃＦｖ５μＬをロードした。移動相としてＰＢＳ Ｈ７．２を選択した。
ｓｃＦｖ１は、試験した５つのｓｃＦｖのうち最も高い安定性であった。ｓｃＦｖ１のＳＥ－ＨＰＬＣ分析は、上記の実験条件において検出可能な低分子量分解生成物を示さなかった。４℃、２２℃、および３７℃で２週間保存すると、ｓｃＦｖ１の二量体化または高分子量分子の形成は、わずかにしか観察されなかった。ｓｃＦｖ１は、３７℃で１または２週間保存した後、それぞれ最大１．８％および２．７％の二量体を形成した（表１）。
Figure 0007080819000001
ｓｃＦｖ１の熱安定性も示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）によって評価した。ＰＢＳ ｐＨ ７．２で製剤化された０．４ｍｇ／ｍＬのｓｃＦｖ１を、リアルタイムＰＣＲ装置（Corbett, Rotor-Gene）で、ＰＢＳ ｐＨ７．２中２０×SYPRO（登録商標） Orange（Sigma-Aldrich、米国、カタログ番号S5692、５０００×）の存在下で、３０℃から９５℃まで１℃／５秒の走査速度で加熱した。勾配運転中に蛍光値を測定した（励起波長４７０ｎｍ；放射波長５５５ｎｍ）。Rotor-Gene 6000 Series Software 1.7.を用いて計算したｓｃＦｖ１の中点融解温度（Ｔｍ）は、８１．５℃であった。
タンパク質性生物製剤は、凝集および分解を引き起こし得る、製造、保存、および輸送中の凍結／融解ストレスにさらされることになり得る。凍結／融解サイクル中のｓｃＦｖ１の安定性を評価するために、１．５ｍＬのポリプロピレンチューブ中で１０ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ ｐＨ７．２で製剤化した。バイアルを液体窒素中に１分間浸し、次いで室温の水浴中で５分間インキュベートした。３回、５回、７回、または１０回の凍結／融解サイクルを行った。試料を１６，１００×ｇで１０分間遠心分離し、ペレットを廃棄した。上記のようにＳＥ－ＨＰＬＣにより上清を分析し、ＵＶ分光法によりタンパク質含有量を測定した。ｓｃＦｖ１の実質的に１００％は、１０回の凍結／融解サイクル後にモノマーのままであり（表２）、タンパク質の損失または沈殿は観察されなかった。
Figure 0007080819000002
ヒト血清（Sigma-Aldrich、米国、カタログ番号H4522）中のｓｃＦｖ１の安定性を、１０ｍｃｇ／ｍＬで３７℃で０、４、および２０時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡによって評価した。結合シグナルを、インキュベートしなかったｐＨ７．４のＰＢＳ中のｓｃＦｖ１と比較した。簡潔には、ｒｈＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体（RnD Systems、米国、カタログ番号156-B7）を、ＰＢＳ中１ｍｃｇ／ｍＬの濃度で、４℃で一晩、Maxisorp ９６ウェルマイクロプレートにコーティングした。１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳでブロッキングした後、２．５ｍｃｇ／ｍｌ～４２ｎｇ／ｍｌ血清／ｓｃＦｖ試料の１：３希釈系列をＥＬＩＳＡプレートに２連で加えた。結合したｓｃＦｖ１を、プロテインＬ－ＨＲＰ（Sigma-Aldrich、米国、カタログ番号P3226）で検出した。ＥＬＩＳＡは、ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質溶液（eBioscience、米国、カタログ番号00-4201-56）を用いて発色させた。図４に示されているように、３７℃でヒト血清での２０時間までのインキュベーション後にｓｃＦｖ１の結合活性の喪失はなかった。
実施例４－可溶性ＰＤ－Ｌ１への結合
ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合体に対するｓｃＦｖ１および３つの他のｓｃＦｖの親和性を、オートサンプラー（Sapidyne Instruments、米国、5004）を含むKinExA 3200（Sapidyne Instruments、米国、カタログ番号5001）を用いる結合平衡除外法（Kinetic Exclusion Assay）（KinExA（登録商標））によって測定した。KinExA（登録商標）は、溶液中の未改変分子間の平衡結合親和性および動態を測定する。測定は、溶液中の対応する結合パートナーの濃度を測定するためのプローブとしてのみ作用するように、固相上に１つの相互作用パートナーを固定化することを必要とする。ここで、３０ｍｃｇ／ｍｌの濃度で、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）ビーズ（440176, Sapidyne Instruments Inc.）上にＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体（RnD Systems、米国、カタログ番号156-B7）を固定化した。０．０２％ＮａＮ３を含むｐＨ ７．４のＰＢＳをランニングバッファーとして使用した。ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体に対するｓｃＦｖの親和性は、概して、ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体の２倍希釈系列を一定量のｓｃＦｖに対して滴定した２つの曲線のセットを用いて求めた。各データ点について２つの測定値を準備した。ｓｃＦｖ１については、第１の曲線において、５ｎＭ ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体から始まる、１１種類の異なるＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体濃度で、２０ｐＭ ｓｃＦｖ１をインキュベートした。これらの混合物を５時間インキュベートした。第２の曲線において、２．５ｎＭ ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体から始まる、１２種類の異なるＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体濃度で、１０ｐＭ ｓｃＦｖ１をインキュベートした。これらの混合物を９時間インキュベートした。これらの混合物中に存在する結合していないｓｃＦｖの量を検出するために、試料を固定されたＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体を含む固相に０．２５ｍｌ／分の流速でさらした。次いで、２５０ｎｇ／ｍＬのビオチン化プロテインＬ（M00097, GenScript）０．５ｍＬ、続いて２５０ｎｇ／ｍＬストレプトアビジンDyLight 650コンジュゲート（Jackson ImmunoResearch）０．５ｍＬをそれぞれ流速０．２５ｍｌ／分で注入することにより、捕捉されたｓｃＦｖ１を検出した。全ての工程は室温で行った。平衡試料中の遊離ｓｃＦｖ１の濃度に正比例する蛍光シグナルは、電圧信号に変換される。この電圧信号を用いて、KinExA（登録商標）Proソフトウェアバージョン４．１．９または４．２．１０の「ｎ曲線分析」を使用して（図５）、オプション「分析濃度基準としての滴定液」を用いて、ｓｃＦｖのＫＤ値および活性を計算する。ｓｃＦｖ１について計算されたＫＤ値は８．８ｐＭであった。他のｓｃＦｖについて計算されたＫＤ値は、１２～９２ｐＭの範囲であった。
実施例５－ｓｃＦｖの選択性
他の種からのＰＤ－Ｌ１に対するｓｃＦｖ１およびｓｃＦｖ３の交差反応性をＥＬＩＳＡによって測定した。ヒト（RnD Systems、米国、カタログ番号156-B7）、ラット（Sino Biological、中国、カタログ番号80450-R02H）、またはサル（Sino Biological、中国、カタログ番号90251-C02H）由来のＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体を、Maxisorp ９６ウェルマイクロプレートに、ｐＨ ７．２のＰＢＳ中１ｍｃｇ／ｍＬの濃度で、４℃で一晩コーティングした。プレートを、ｐＨ７．２のＰＢＳ中１％ＢＳＡおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０でブロッキングした。１ｍｃｇ／ｍＬ、３３３ｎｇ／ｍＬ、および１１１ｎｇ／ｍＬの濃度でｓｃＦｖの段階希釈液を調製し、プレートに添加した。陰性対照として、ｓｃＦｖを含まないＰＢＳを用い、陽性対照として、１ｍｃｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体（BioLegend、米国、カタログ番号329716）またはビオチン化ｒｈＰＤ－１ Ｆｃ融合体（BPS Bioscience、米国、カタログ番号71109）を含めた。結合したｓｃＦｖを、プロテインＬ－ＨＲＰ（Sigma-Aldrich、米国、カタログ番号P3226）で検出し、結合したマウス抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Southern Biotech、米国、カタログ番号1033-01）で検出し、結合したビオチン化ｒｈＰＤ－１ Ｆｃ融合体をストレプトアビジン－ＨＲＰ（BD Pharmingen、米国、カタログ番号554060）で検出した。ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質溶液（eBioscience、米国、カタログ番号00-4201-56）を用いて発色させた。結果は、ｓｃＦｖ１およびｓｃＦｖ３がヒトおよびサルＰＤ－Ｌ１に特異的に結合するが、ラットＰＤ－Ｌ１には特異的に結合しないことを示した（図６）。
ＰＤ－Ｌ１と配列類似性を共有する組み換えヒトタンパク質に対するｓｃＦｖ１の交差反応性をＥＬＩＳＡにより測定した。ｒｈＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体（RnD Systems、米国、カタログ番号156-B7）、ｒｈＰＤ－Ｌ２ Ｆｃ融合体（RnD Systems、米国、カタログ番号1224-PL）、またはｒｈＢ７－Ｈ３ Ｆｃ融合体（RnD Systems、米国、カタログ番号1027-B3）を、Maxisorp ９６ウェルマイクロプレートに、ｐＨ７．２のＰＢＳ中１ｍｃｇ／ｍＬの濃度で、４℃で一晩コーティングした。プレートを、ｐＨ７．２のＰＢＳ中１％ＢＳＡおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０でブロッキングした。５、１、および０．２ｍｃｇ／ｍＬの濃度でｓｃＦｖの段階希釈液を調製し、プレートに添加した。陰性対照として、非結合ｓｃＦｖ２を用い、陽性対照として、５、１、および０．２ｍｃｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体（RnD Systems、米国、カタログ番号MAB1027）または３０および１５ｎｇ／ｍＬのビオチン化ｒｈＰＤ－１ Ｆｃ融合体（BPS Bioscience、米国、カタログ番号71109）を含めた。結合したｓｃＦｖを、プロテインＬ－ＨＲＰ（Sigma-Aldrich、米国、カタログ番号P3226）で検出し、結合したマウス抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体を、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Southern Biotech、米国、カタログ番号1033-01）で検出し、結合したビオチン化ｒｈＰＤ－１ Ｆｃ融合体をストレプトアビジン－ＨＲＰ（BD Pharmingen、米国、カタログ番号554060）で検出した。ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質溶液（eBioscience、米国、カタログ番号00-4201-56）を用いて発色させた。結果は、ｓｃＦｖ１がヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ヒトＰＤ－Ｌ２またはＢ７－Ｈ３に対しては交差反応性がないことを示した。
サルＰＤ－Ｌ１に対するｓｃＦｖ１の交差反応性を、KinExA（登録商標）を用いてさらに調べた。方法は、ＰＭＭＡビーズを２０ｍｃｇ／ｍｌのサルＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体（Sino Biological、中国、カタログ番号90251-C02H）でコーティングしたことと、親和性は、サルＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体の２倍希釈系列を一定量のｓｃＦｖに対して滴定した２つの曲線のセットを用いて求めたこととを除いて、実施例４に記載した通りであった。第１の曲線において、２．５ｎＭ ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体から始まる、２回の測定での１２種類の異なるＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体濃度で、５０ｐＭ ｓｃＦｖ１をインキュベートした。これらの混合物を６時間インキュベートした。第２の曲線において、１ｎＭ ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体から始まる、１２種類の異なるＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体濃度で、１０ｐＭ ｓｃＦｖ１をインキュベートした。これらの混合物を１６時間インキュベートして、これらの混合物中に存在する結合していないｓｃＦｖの量を検出し、試料を固定されたＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体を含む固相に０．２５ｍｌ／分の流速でさらした。全ての工程は室温で行った。KinExA（登録商標）Proソフトウェアバージョン４．２．１０の「ｎ曲線分析」を用いて、オプション「分析濃度基準としての滴定液」を用いてｓｃＦｖ１について計算したＫＤ値は、３．３ｐＭであった（図７）。結果は、ｓｃＦｖ１が、ヒトＰＤ－Ｌ１に対する結合よりも約２．７倍強い親和性でサルＰＤ－Ｌ１に結合することを実証する。
実施例６－天然型のＰＤ－Ｌ１への結合
腫瘍細胞の表面上に発現された天然型のＰＤ－Ｌ１に結合するｓｃＦｖ１および非結合対照ｓｃＦｖであるｓｃＦｖ２の能力を、細胞外ＦＡＣＳ解析によって測定した。５ｍｃｇ／ｍＬまたは１ｍｃｇ／ｍＬのｓｃＦｖまたは抗ヒトＰＤ－Ｌ１マウスＩｇＧ２（BioLegend、米国、カタログ番号329716）を用いて氷上で３０分間ＥＳ－２細胞（ATCC、米国、カタログ番号CRL-1978）を染色した。結合したｓｃＦｖを、ビオチン化プロテインＬ（Pierce、カタログ番号PI-29997）で染色し、続いてストレプトアビジン－フィコエリトリン（BD Pharmingen、米国、カタログ番号554061）で染色することにより検出した。洗浄後、ヨウ化プロピジウムを用いて死細胞を除き、細胞をFACSAria III（BD Biosciences）で分析した。蛍光強度の平均および中央値を表３に示す。結果は、ｓｃＦｖ１が、ＥＳ－２細胞の表面上に発現された天然型のＰＤ－Ｌ１を特異的に認識することができることを実証する。
Figure 0007080819000003
細胞表面ＰＤ－Ｌ１へのｓｃＦｖ１の結合を、KinExA（登録商標）を用いてさらに調べた。方法は、一定量のｓｃＦｖ１（５０ｐＭ）に対して２回滴定したＥＳ－２細胞の（ｍＬあたり２６４０万から始まる）１２の２倍段階希釈液を用いて親和性を求めたことを除いて、実施例４に記載した通りであった。これらの混合物を５時間インキュベートし、３８００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。ｓｃＦｖの量を検出するために、試料を固定されたＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体を含む固相に０．２５ｍｌ／分の流速でさらした。全ての工程は室温で行った。KinExA（登録商標）Proソフトウェアを用いた分析の結果、細胞表面ＰＤ－Ｌ１へのｓｃＦｖ１の結合について計算されたＫＤ値は１２．８ｐＭであった（図８）。
結果は、ｓｃＦｖ１が、腫瘍細胞の表面上に発現された天然型のＰＤ－Ｌ１に結合することを実証する。
実施例７－ｓｃＦｖ分泌
大腸菌細胞により封入体中に産生されたｓｃＦｖ１の特性を哺乳類細胞から分泌されたｓｃＦｖ１の特性と比較するために、ｓｃＦｖ１を（最初ATCCから得、懸濁培養で無血清増殖に適合させた）懸濁液適合ＣＨＯ Ｋ１細胞でEvitria（スイスのチューリッヒ）により産生した。既知組成の動物成分を含まない無血清培地で種を増殖させた。細胞を特注の専売のトランスフェクション試薬でトランスフェクションし、トランスフェクション後、動物成分を含まない無血清培地で細胞を増殖させた。ＳｃＦｖ１をプロテインＬアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
ＣＨＯ細胞および大腸菌細胞発現ｓｃＦｖ１のＰＤ－Ｌ１中和能を、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断アッセイで比較した。このアッセイにおいて、ルシフェラーゼ活性はＴ細胞の活性によって促進される。ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１との相互作用は、阻害シグナルおよびルシフェラーゼ活性の低下を生じ、これは、ＰＤ－Ｌ１の阻害剤で細胞を処理することによって克服される。ＰＤ－Ｌ１発現ＣＨＯ細胞（Promega、CS187103）を９６ウェルマイクロプレートに播種した。濃度を増加させてｓｃＦｖを添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２０分間インキュベートした。ＰＤ－１発現エフェクタージャーカット細胞（Promega、CS187105）を添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに６時間インキュベートした。ＴＣＲ／ＣＤ３活性化は、Bio-Glo Luciferase Assay System（Promega, G7941）による発光検出によって測定した。阻害曲線をプロットし、GraphPad Prism（登録商標）ソフトウェア バージョン７．０２を用いてＩＣ５０値を計算した。ＣＨＯ細胞発現ｓｃＦｖ１、大腸菌細胞発現ｓｃＦｖ１、およびｓｃＦｖ２の結果を図９に示す。ＣＨＯ細胞発現ｓｃＦｖ１は、６０２ｐＭのＩＣ５０でＰＤ－Ｌ１媒介性阻害シグナルを効果的に遮断した。大腸菌細胞発現ｓｃＦｖ１は、８７４ｐＭのＩＣ５０で免疫チェックポイント阻害シグナルを効果的に遮断した。非結合ｓｃＦｖ２は、免疫チェックポイント阻害シグナルに対する効果を示さなかった。
実施例８－インビボ活性
５～６週齢のメスＮＯＧマウス（中国の北京のVital River Laboratory Animal Technology Co.）のＨＣＣ８２７ヒト肺癌モデルを使用して、ｓｃＦｖ１のインビボ有効性を調べた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的な手順を用いる密度勾配遠心分離によって４人の健康なヒトドナーの血液から単離した。遠心分離後、細胞をＰＢＳ溶液で洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。各ドナーからのＰＢＭＣを、ＨＣＣ８２７腫瘍細胞接種の３日前に、０．１ｍｌのＰＢＳ中５×１０６細胞の腹腔内注射により、マウスに移入した。次いで、各マウスに、０．１ｍｌのＰＢＳ中５×１０６のＨＣＣ８２７腫瘍細胞を右脇腹領域に皮下接種した。腫瘍細胞接種の日付を０日目とした。マウスを１日目に無作為化し、１５ｍｇ／ｋｇのｓｃＦｖ１もしくは非結合ｓｃＦｖ２の腹腔内注射で１日２回、または５ｍｇ／ｋｇの陽性対照ＩｇＧ抗体（ＭＰＤＬ３２８０Ａの類似体）の静脈内注射で毎週２回、治療した。腫瘍容積を少なくとも週に２回測定し、式Ｖ＝０．５ａ×ｂ２を用いてｍｍ３で表した。ここで、ａおよびｂはそれぞれ腫瘍の長さおよび幅である。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、抗腫瘍効果の指標であり、ＴＧＩ（％）＝１００×（１－（治療群の平均腫瘍容積）／（ｓｃＦｖ２群の平均腫瘍容積）として表される。１４日目に、最大の腫瘍増殖阻害を示した２人のドナー由来のＰＢＭＣを有する動物を、研究の継続のために選択した。２１日目に、全ての動物を屠殺した。群の大きさは、ドナーあたりの群あたりｎ＝３であり、２人の選択されたドナーでの合計の群の大きさはｎ＝６であった。対照に対する治療の比（Ｔ／Ｃ）は、非結合ｓｃＦｖ２対照群と比較したｓｃＦｖ１または陽性対照ＩｇＧ治療群の腫瘍容積の中央値の比として、式Ｔ／Ｃ（％）＝（治療群の腫瘍容積の中央値／対照群の腫瘍容積の中央値）×１００を用いて、計算した。
選択された２人のドナー（ｎ＝６）のＴ／ＣおよびＴＧＩを図１０に示す。ｓｃＦｖ１および陽性対照ＩｇＧ抗体の有効性を２１日目に評価した（表４）。６匹のｓｃＦｖ１治療マウスのうち３匹は腫瘍がなく、ｓｃＦｖ１で治療した動物のＴＧＩは４７％であった。Ｔ／Ｃ比は２８％であった。National Cancer Institute基準によるＴ／Ｃ％比の有効性基準は≦４２％である。まとめると、このデータはｓｃＦｖ１のインビボ有効性を実証する。
Figure 0007080819000004
実施例９－ＩｇＧフォーマットにおけるキャラクタリゼーション
ＳｃＦｖ１を、配列番号２０の重鎖および配列番号２４の軽鎖を有するＩｇＧフォーマット（ＩｇＧ＿１）に再フォーマットした。米国第２０１０／０２０３０５６号に記載のＹＷ２４３．５５．Ｓ７０の公表された配列（配列番号２１の重鎖および配列番号２５の軽鎖を有するＩｇＧ＿２）、国際公開第２０１１／０６６３８９／Ａ１号に記載の２．１４Ｈ９ＯＰＴ（配列番号２２の重鎖および配列番号２６の軽鎖を有するＩｇＧ＿３）、ならびに国際公開第２０１５／１１２８０５Ａ１号に記載のＨ２Ｍ８３１４Ｎ（配列番号２３の重鎖および配列番号２７の軽鎖を有するＩｇＧ＿４）に対応する抗体も調製した。合成は、Evitria（スイスのチューリッヒ）によって行われた。最初にＡＴＣＣから受け取り、懸濁培養で無血清増殖に適合させた懸濁液適合ＣＨＯ Ｋ１細胞を産生に使用した。ＩｇＧ抗体をプロテインＡクロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
ＩｇＧ抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１とヒトＰＤ－１との相互作用を阻害する抗体の能力を調べることにより最初にキャラクタリゼーションした。Maxisorp ９６ウェルマイクロプレートに、ｒｈＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体（RnD Systems、米国、カタログ番号156-B7）をＰＢＳ中２ｍｃｇ／ｍＬの濃度で４℃で一晩コーティングした。プレートを、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０でブロッキングした。ＩｇＧの段階希釈液を調製し、１１の１：３希釈液は１ｍｃｇ／ｍＬで始まり、これらをプレートに添加した。室温で３０分後、ＩｇＧ希釈液の半分を除去し、ビオチン化ＰＤ－１ Ｆｃ融合体（BPS Bioscience、米国、カタログ番号71109）で１５ｎｇ／ｍＬの最終濃度で交換した。結合したＰＤ－１ Ｆｃ融合体をストレプトアビジン－ＨＲＰ（BD Pharmingen、米国、カタログ番号554060）で検出した。ＥＬＩＳＡは、ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質溶液（eBioscience、米国、カタログ番号00-4201-56）を用いて発色させた。非結合ｓｃＦｖ２を対照として含めた。このアッセイにおいて、図１１に示されているように、ＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１と相互作用する能力は、吸光シグナルを生じ、ＩｇＧ１～４によって効果的に中和されるが、非結合ｓｃＦｖ２によって中和されない。試験された抗体の阻害プロファイルは２つの群に分かれ、より強力な効力のＩｇＧ＿１およびＩｇＧ＿２はＩＣ５０値がそれぞれ３２７ｐＭおよび２６７ｐＭであった。より弱い効力のＩｇＧ＿３およびＩｇＧ＿４は、それぞれ５６０ｐＭおよび６０６ｐＭのＩＣ５０値を有した。より強い効力を有するＩｇＧを、結合親和性のキャラクタリゼーションに進ませた。
ヒトＰＤ－Ｌ１へのＩｇＧ＿１およびＩｇＧ＿２の結合をKinExA（登録商標）を用いて調べた。公表されたデータは、ＩｇＧ＿２のヒトＰＤ－Ｌ１への結合に利用可能であるが、このデータは、通常、固体表面上に１つの相互作用パートナーを固定化することを伴う技術に基づく。これらの手法は、溶液における相互作用条件を反映しない場合があり、また、非常に緊密な相互作用を調べる際の感度の問題を抱えている。したがって、抗体の結合を比較するために、溶液をベースとする方法を選択した。結合活性の測定を回避するために、ＦｃタグのないＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓを相互作用パートナーとして選択した。方法は、親和性は、ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ（BioVision、米国、カタログ番号7429）の２倍希釈系列を一定量のｓｃＦｖに対して滴定した２つの曲線のセットを用いて求めたことを除いて、実施例４に記載した通りであった。両方のＩｇＧについて、第１の曲線において、５ｎＭ ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓから始まる、２回の測定での１２種類の異なるＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体濃度で、１００ｐＭのＩｇＧをインキュベートした。これらの混合物を５時間インキュベートした。５００マイクロリットルの各試料をヒトＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体でコーティングしたビーズに噴射した。ＩｇＧ＿１ついては、第２の曲線において、５ｎＭ ＰＤ－Ｌ１ Ｈｉｓから始まる、１２種類の異なるＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ濃度で、１０ｐＭのＩｇＧをインキュベートした。これらの混合物を１０時間インキュベートした。５ｍｌの各試料をＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体でコーティングしたＰＭＭＡビーズに噴射した。ＩｇＧ＿２ついては、第２の曲線において、１．２５ｎＭ ＰＤ－Ｌ１ Ｈｉｓから始まる、１２種類の異なるＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ濃度で、２０ｐＭのＩｇＧをインキュベートした。これらの混合物を１０時間インキュベートした。５ｍｌの各試料をＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ融合体でコーティングしたＰＭＭＡビーズに噴射した。ＩｇＧについて計算されたＫＤ値は、表５に報告されており、ｎ曲線分析は図１２に示されている。
結果は、ＩｇＧ＿１（すなわちＩｇＧフォーマットに変換されたｓｃＦｖ１）が、ＰＤ－Ｌ１に対するｓｃＦｖ１の親和性よりも約３倍強い親和性でＰＤ－Ｌ１に結合することを実証する。ＩｇＧ＿２は、ＩｇＧ＿１に比べてＰＤ－Ｌ１に対する親和性が弱い。
Figure 0007080819000005
本発明の現時点で好適な実施形態が示され記載されているが、本発明はこれらに限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲内で様々に具体化され、実施され得ることを理解されたい。本発明の多くの修正および代替の実施形態が当業者には容易に明らかとなるので、この説明は、単に例示的なものとして解釈されるべきであり、当業者に本発明を実施するための最良の形態を教示することを目的とするものである。したがって、全ての好適な修正および均等物は、以下の特許請求の範囲に含まれるとみなされ得る。

Claims (19)

  1. ＰＤ－Ｌ１に対する結合特異性を有する結合メンバーであって、
    （ｉ）配列番号６、７、及び８に示される可変重鎖ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３配列、ならびに
    （ｉｉ）配列番号３、４、及び５に示される可変軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３配列、
    を含み、
    前記結合メンバーが、抗体、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ 断片又はｓｃＦａｂである抗体フラグメントから成る群より選ばれる、前記結合メンバー。
  2. （ｉ）配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖、及び
    （ｉｉ）配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖、
    を含む、請求項１に記載の結合メンバー。
  3. （ｉ）配列番号１と１００％の配列同一性を有する可変軽鎖、及び
    （ｉｉ）配列番号２と１００％の配列同一性を有する可変重鎖、
    を含む、請求項２に記載の結合メンバー。
  4. リンカー配列をさらに含み、前記リンカー配列が、配列番号１０に示される、請求項１～３のいずれか一項に記載の結合メンバー。
  5. 配列番号９もしくは配列番号１１又はそれらと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項４に記載の結合メンバー。
  6. （ｉ）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、ＦｖフラグメントもしくはｓｃＦａｂである抗体フラグメント、又は
    （ｉｉ）全長抗体分子
    を含む、請求項１に記載の結合メンバー。
  7. 一価又は多価であり、多重特異性、二重特異性、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＢｉＴＥ、又はタンデムｓｃＦｖである、請求項１に記載の結合メンバー。
  8. Ｆｃドメインをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の結合メンバー。
  9. 前記Ｆｃドメインが、細胞傷害性免疫応答を誘導しない修飾Ｆｃドメインである、請求項８記載の結合メンバー。
  10. 前記結合メンバーが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプ、又はマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３アイソタイプからなる群から選択される定常領域を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の結合メンバー。
  11. 化学的又は生物学的に修飾されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の結合メンバー。
  12. 前記化学的又は生物学的な修飾は、グリコシル化、ＰＥＧ化、ＨＥＳ化、標識化、又は第２の部分への結合を含む、請求項１１記載の結合メンバー。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の結合メンバーをコードする配列を含む単離核酸分子。
  14. 発現ベクター又はクローニングベクターを含む、請求項１３記載の単離核酸分子。
  15. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の結合メンバー又は請求項１３若しくは１４記載の単離核酸分子と、担体、希釈剤又は賦形剤とを含む組成物。
  16. 化粧料組成物、診断組成物又は医薬組成物である、請求項１５記載の組成物。
  17. 医薬組成物であり、前記担体、希釈剤又は賦形剤が薬剤的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤である、請求項１６記載の組成物。
  18. PD-L1媒介疾患の治療、予防又は進行の遅延用である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の結合メンバー、請求項１３若しくは１４記載の核酸分子、又は請求項１５～１７のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 前記PD-L1媒介疾患ががん又は全身性エリテマトーデスである、請求項１８記載の結合メンバー、核酸分子、又は組成物。
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