KR20180111870A - Pd-l1에 대한 결합 성분 - Google Patents

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타이투스 크레추마어
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셀 메디카 스위처란트 아게
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Abstract

본 발명은 항-PD-L1 결합 성분, 및 특히, 매우 안정적이고 가용성인 1가, 고효능 PD-L1-결합 항체 단편에 관한 것이다. 이러한 결합 성분은 암 및 염증성 질병의 치료뿐만 아니라 진단에서 사용될 수 있다. 또한, 관련된 핵산, 벡터, 세포, 및 조성물이 제공된다.

Description

PD-L1에 대한 결합 성분
치료 용도 및 진단 용도를 위해 적용 가능한, PD-L1에 대한 결합 성분(binding member), 예를 들어, 인간화된 항체 단편, 특히, 1가, 매우 강력하고 안정한 항-PD-L1 scFv가 제공된다. 또한, 이러한 결합 성분을 암호화하는 핵산 분자, 개개 핵산 분자의 서열을 함유하는 벡터, 개개 핵산 분자의 벡터 또는 핵산 서열을 함유하는 숙주 세포, 결합 성분 또는 핵산 분자를 함유하는 약제 및 진단 조성물뿐만 아니라, 이의 용도가 제공된다.
프로그램된 세포사 단백질 1(Programmed cell death protein 1: PD-1)은 활성화된 T 세포, B 세포 및 골수 세포 상에서 발현되는 세포 표면 수용체이다. PD-1은 2개의 리간드, 즉, PD-L1(Dong H, et al. Nat Med. 1999; 5:1365-1369) 및 PD-L2(Latchman Y. et al. Nat Immunol. 2001; 2:261-8)를 결합시킨다. PD-1에 대한 리간드 PD-L1 또는 PD-L2 중 어느 하나의 결합 시에, 저해 신호전달 캐스케이드는 IL-2 생산 및 T 세포 증식의 TCR-매개 활성화를 저해하는 T 세포내에서 촉발된다. PD-L1(프로그램된 죽음-리간드 1(programmed death-ligand 1))은 대부분의 인간 암세포 및 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)의 표면 상에서 IFNγ에 의해 구성적으로 발현되거나 유도되는 타입 1 막관통 단백질이다.
PD-1에 추가하여, PD-L1은 CD28 및 CTLA-4를 결합시킬 수 있는 막 수용체인 CD80에 결합한다(Butte M.J. et al. (2007) 27: 111-122). 그러나, PD-L1은 CD80보다는 PD-1과 더욱 강력하게 상호작용한다. PD-1과 같이, CD80은 T 세포 및 B 세포 상에서 발현되는 막 수용체이다. PD-1 또는 CD80 중 어느 하나에 결합하는 PD-L1은 T-림프구로 저해 신호를 전달하여, 세포독성 매개체의 T-세포 이동, 증식 및 분비를 저해하고 종양 세포 사멸을 감소시킨다. 그러나, PD-1/PD-L1 상호작용이 T 세포 고갈을 유도하는 반면, PD-L1/CD80 상호작용은 T 세포 아네르기(T cell anergy)를 유도한다. 이러한 것은 아네르기는 적절한 공동 자극의 부재 하에서 항원 자극 후에 빠르게 유도되는 동안, 고갈이 몇 주 또는 몇 달의 기간에 걸쳐 진행되고 만성 항원 자극에 따른다는 것과는 별개의 과정이다.
그 결과, PD-L1 발현은 T 세포-매개 파괴로부터 종양 세포를 보호한다(Haile S.T. 등 (2011), J Immunol.; 186(12):6822-9; Haile S.T. et al (2013), J Immunol.; 191(5): 2829-2836). PD-L1의 상향-조절된 수준은 종양 공격성의 증가 및 사망 위험의 증가와 상관관계가 있다. 동물 연구에서는, 단클론성 항체를 통한 PD-L1:PD-1 상호작용의 차단이 T 세포 활성화를 개선시키고 종양 진행을 감소시킨다는 것이 입증되었다. 또한, T 세포-발현 CD80을 통한 PD-L1 신호전달의 항체 차단(antibody blocking)은 T 세포 아네르기를 막는다.
PD-1 또는 PD-L1 중 어느 하나를 차단하는 단클론성 항체는 진행 단계 및 전이 단계의 질병에서도, 광범위한 암 하위타입에 걸쳐 인상적인 활성을 나타내었다(Maute et al (2015), PNAS, 112(47): E6506-E6514). 초기 연구에서 PD-1 또는 CD80 단독과 PD-L1 상호작용의 차단이 면역병리학의 위험을 최소화하면서 면역력을 증가시킨다는 측면에서 더욱 유익할 수 있지만(Butte MJ (2008), Mol Immunol; 45(13):3567-72), PD-1 및 CD80 둘 모두와 PD-L1 상호작용을 차단하는 단클론성 항체를 이용한 최근 임상 시험은 여러 암에서 주목할 만한 임상적 성공을 나타내었으며, 이러한 것은 전통적인 화학요법보다 독성이 낮다. 단지 하위세트의 환자만이 관문 차단에 반응하지만, 면역 기억으로 인해 이러한 반응의 지속시간은 놀랄만하고, 난치성 질병에서 임의의 다른 제제로 기대되는 것보다 더 길다(Janakiram M et al (2016), Immunotherapy; 8(7):809-19).
아테졸리주맙(atezolizumab)(MPDL3280A, 예를 들어, 미국 특허 제8,217,149호에 기술됨)은 PD-1 및 CD80에 대한 수용체 결합이 차단되도록, PD-L1을 표적으로 하는 인간화된 IgG1 항체이다. 항체는 감소된 Fc-효과기 기능 및 이와 함께 PD-L1을 발현시키는 세포 고갈의 감소를 갖도록 설계되었다. 2016년 10월에, FDA는 백금-함유 화학요법 동안 또는 이후에 질병이 진행된 전이성 비-소세포 폐암(NSCLC)에 걸린 환자의 치료용으로 아테졸리주맙을 승인하였다. 종양이 EGFR 또는 ALK 게놈 수차(genomic aberration)를 갖는 경우에, 환자는 항체를 수용하기 전에 이러한 수차에 대한 FDA-승인된 치료법에서 질병이 진행되어야 한다. 기본 임상 연구는 이의 PD-L1 상태와는 무관하게 환자를 등록하였고, 편평 및 비-편평 질병 타입 둘 모두를 포함하였다. 2016년 5월에, FDA는 백금 함유 화학요법 동안 또는 후에 질병이 진행되는, 국소 진행 또는 전이성 요로상피 암종에 걸린 환자의 치료용으로 아테졸리주맙을 승인하였다.
두르발루맙(MEDI4736; 예를 들어, 미국 특허 제8,779,108호, WO2010077634호 참조)은 PD-L1 결합 시에 PD-1 및 CD80 상호작용 둘 모두를 차단하는 인간 IgG1 단클론성 항-PD-L1 항체이다. 항체는 IgG2 및 IgG4 XenoMouse 동물을 면역화하고 인간 IgG1 트리플-돌연변이 도메인에 대해 불변 도메인을 교체함으로써 생성되었다. 이러한 불변 도메인은 C1q 및 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 감소시켜 감소된 항체-의존 세포의 세포독성 및 보체-의존성 세포독성을 야기시키는 3개의 점돌연변이를 함유한다. 항체는 국소 진행 또는 전이성 NSCLC, 요로 상피암, 두경부, 자궁경부, 대장, 식도, 난소, 유방, SCLC 및 위암, 및 두경부의 재발 또는 전이성 PD-L1-양성 편평상피 세포 암종(SCCHN)을 포함하는, 다수의 적응증(indication)에 대한 단일요법으로서 임상 연구 중에 있다. 병용 요법 임상 연구가 진행 중에 있다.
PD-1을 표적화하고 PD-L1과 PD-1 및 CD80 둘 모두의 상호작용을 차단하는 추가 항체는 아벨루맙(MSB0010718C, WO2013079174호에 기술됨)이다. 전체 인간 IgG1 단클론성 항체는 고유 Fc-영역을 보유하고, 이에 따라, 항체-의존 세포-매개 세포독성(ADCC)을 유도할 수 있다. 항체는 고형 종양, 위암, 메르켈 세포 암종, 및 NSCLC에 대해 임상 연구 중에 있다.
면역 관문 저해제를 표적으로 하는 개선된 화합물 및 면역계-관련 장애, 예를 들어, 암, 면역 결핍, 자가면역 질병, 알레르기, 염증성 장애, 이식 거부반응, 및 다른 장애를 치료하기 위한 안전하고 효과적인 치료 방법을 제공하는 것이 여전히 요구되고 있다.
본 발명은 PD-L1에 결합하는 결합 성분, 이러한 결합 성분을 암호화하는 핵산 및 벡터, 이러한 결합 성분을 발현시키는 숙주 세포 및 이러한 결합 성분을 함유하는 조성물뿐만 아니라 치료법에서 이의 용도를 제공한다.
이러한 결합 성분은 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다:
(a) 면역글로불린으로서 뿐만 아니라 scFv와 같은 1가 항체 단편 포맷(format) 둘 모두에서, PD-L1에 대한 높은 친화력을 가짐;
(b) 1가에 대해 실시예 4에서 명시된 조건 또는 2가 포맷에 대해 실시예 9에서 명시된 조건 하에서 역학적 배제 검정에 의해 측정하는 경우 10pM 미만의 결합 해리 평형 상수(KD)로 인간 PD-L1을 결합시킴;
(c) 인간 PD-1 및 인간 CD80 둘 모두와의 인간 PD-L1 상호작용을 저해하는 PD-L1 상의 에피토프에 결합시킴;
(d) 원숭이 PD-L1과 교차반응함;
(e) 인간 PD-L1과 마찬가지로 원숭이 PD-L1에 대해 적어도 강력한, 더욱 바람직하게는, 적어도 2배 강력한 결합 친화력으로, 원숭이 PD-L1을 결합시킴;
(f) 인간 PD-L2 또는 인간 B7-H3에 결합하지 않음;
(g) HCC827 인간 폐암 모델에서 종양 성장을 저해함; 및
(h) scFv 포맷에서 pH 7.2에서 PBS 중 10 mg/㎖의 농도에서 37℃에서 1 또는 2주의 저장 후에 3% 미만의 다이머를 형성함.
이러한 결합 성분은 바람직하게는, (i) 각각 서열번호 6, 7 및 8에 기술된 바와 같은 가변 중쇄 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열 중 적어도 하나; 및/또는 (ii) 각각 서열번호 3, 4 및 5에 기술된 바와 같은 가변 경쇄 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열 중 적어도 하나; 또는 이의 변이체를 포함한다.
이러한 결합 성분은 암 및 염증성 질병의 치료뿐만 아니라, 진단에서 사용될 수 있다. 또한, 관련된 핵산, 벡터, 세포, 조성물, 방법 및 키트가 제공된다.
도 1은 scFv1이 세포 기반 시스템에서 재조합 인간(rh) PD-L1 및 rhPD-1 매개 면역 관문 저해 신호를 차단하는 것을 도시한 것이다.
도 2는 scFv1이 ELISA에서 rhPD-L1과 rhPD-1 간의 상호작용을 차단하는 것을 도시한 것이다. 배경 수준은 scFc 및 PD-1의 부재 하에서 결정되었다.
도 3은 scFv1이 ELISA에서 rhPD-L1과 rhCD80 간의 상호작용을 차단하는 것을 도시한 것이다. 배경 수준은 PD-1의 부재 하에서 결정되었다.
도 4는 ELISA에 의해 측정된, rhPD-L1에 결합하는 scFv1의 능력이 37℃에서 인간 혈청 중에 저장 후 영향을 받지 않음을 도시한 것이다.
도 5는 scFv1이 역학적 배제 검정에서 rhPD-L1에 결합하는 것을 도시한 것이다.
도 6은 결합 ELISA에 의해, scFv1이 재조합 인간 및 원숭이 PD-L1에 결합하지만, 래트(rat) PD-L1에 결합하지 않음을 도시한 것이다. 배경 수준은 scFv의 부재 하에서 도시된 것이며, 단백질의 작용성은 실시예 5에서 규정된 바와 같은 양성 대조군 항체의 사용에 의해 확인된다.
도 7은 scFv1이 역학적 배제 검정에서 재조합 원숭이 PD-L1에 결합함을 도시한 것이다.
도 8은 scFv1이 역학적 배제 검정에서 세포의 표면 상의 인간 천연 형태의 PD-L1에 결합함을 도시한 것이다.
도 9는 대장균 봉입체(inclusion body)로부터 생성되거나 CHO 세포에 의해 분비된 scFv1이 세포 기반 시스템에서 PD-L1과 PD-1 간의 상호작용의 유사한 저해를 나타낸다는 것을 도시한 것이다.
도 10은 scFv1이 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)가 투여된 누드 마우스에서의 HCC827 인간 폐암 모델에서 종양 수축을 증진시키는 것을 도시한 것이다. A: 실시예 8에서 규정된 바와 같은 대조군(비-결합 scFv2)에 대한 치료군(scFv1 또는 양성 대조군 IgG) 비율. B: 실시예 8에서 규정된 바와 같은 종양 성장 저해(비-결합 scFv2와 비교한 scFv1 또는 양성 대조군 IgG).
도 11은 IgG_1 및 IgG_2가 rhPD-L1과 rhPD-1 간의 상호작용의 저해에서 IgG_3 및 IgG_4에 비해 더욱 효과적임을 도시한 것이다. 배경 수준은 IgG 및 PD-1의 부재 하에서 결정되었다.
도 12는 IgG_1(A)이 IgG와 PD-L1 간의 상호작용에서 IgG_2(B)보다 더 강력한 친화력을 갖는 것을 도시한 것이다.
본 명세서에 개시된 결합 성분, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 방법, 및 용도에 대한 설명이 더욱 용이하게 이해될 수 있도록, 먼저 특정 용어들이 정의된다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 설명, 도면 및 청구범위에서 사용되는 모든 다른 과학 용어 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이 이의 통상적인 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 명세서에 개시된 결합 성분, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 방법 및 용도의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 하기에는 적합한 방법 및 물질이 기술된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허출원, 특히, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참고로 포함된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선한다. 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이고, 제한적인 것으로 의도되지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "투여하는(administering)"은 대상체에 물질, 예를 들어, 화합물, 예컨대, 약제학적 화합물, 또는 다른 제제, 예를 들어, 항원을 이동, 전달, 도입 또는 운반하는 임의의 모드를 지칭한다. 투여 모드는 비경구 투여, 경구, 직장, 전신, 정맥내, 피하, 비뇨생식기, 국소, 유리체내, 안구내, 귀, 비강내, 경피, 피부내, 피부, 복강내, 근육내, 설하, 또는 협측 투여를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 하나 이상의 치료제와 같은 추가 물질"과 조합한" 투여는 동시(병행) 투여 및 임의 순서로의 연속 투여를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "보존적 변형(conservative modification)" 및 "보존적 치환(conservative substitution)"은 각각, 해당 기준에 대한 성질들을 물리적으로, 생물학적으로, 화학적으로 및/또는 기능적으로 유지시키는, 변형 및 치환을 지칭한다. 보존적 치환을 갖는 서열을 포함하는 분자는 예를 들어, 공유 결합 또는 수소 결합을 포함하는 유사한 크기, 형상, 전기적 전하, 화학적 성질, 및/또는 동등한 극성을 갖는다. 이러한 보존적 변형은 하나 이상의 핵염기 및 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것을 포함한다. 예를 들어, 항원에 대한 결합과 관련하여 비필수적인 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있으며, 예를 들어, 세린은 트레오닌으로 치환될 수 있다. 아미노산 잔기는 대개 통상적인, 유사한 측쇄 성질들을 기초로 하여, 하기와 같은 패밀리로 나누어진다:
1. 비극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 메티오닌),
2. 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 프롤린, 시스테인, 트립토판),
3. 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 프롤린),
4. 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산),
5. 베타-분지된 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신), 및
6. 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘).
보존적 치환은 상기 6개 그룹들 중 동일한 그룹 내의 추가 아미노산에 의해 상기 6개 그룹들 중 하나 내의 제1 아미노산의 치환인 것으로 여겨질 수 있다. 바람직한 보존적 치환은 하기를 포함한다:
1. 알라닌(A)을 발린(V)으로 치환시킴;
2. 아르기닌(R)을 라이신(K)으로 치환시킴;
3. 아스파라긴(N)을 글루타민(Q)으로 치환시킴;
4. 아스파르트산(D)을 글루탐산(E)으로 치환시킴;
5. 시스테인(C)을 세린(S)으로 치환시킴;
6. 글루탐산(E)을 아스파르트산(D)으로 치환시킴;
7. 글리신(G)을 알라닌(A)으로 치환시킴;
8. 히스티딘(H)을 아르기닌(R) 또는 라이신(K)으로 치환시킴;
9. 아이소류신(I)을 류신(L)으로 치환시킴;
10. 메티오닌(M)을 류신(L)으로 치환시킴;
11. 페닐알라닌(F)을 티로신(Y)으로 치환시킴;
12. 세린(S)을 트레오닌(T)으로 치환시킴;
13. 티립토판(W)을 티로신(Y)으로 치환시킴;
14. 페닐알라닌(F)을 트립토판(W)으로 치환시킴; 및/또는
15. 발린(V)을 류신(L)으로 치환시킴,
및 이의 반대도 포함함. 프롤린(P)을 알라닌(A)으로 치환하는 것과 같은 다른 치환은 또한 허용될 수 있고, 경험적으로 또는 다른 공지된 보존적 치환 또는 비-보존적 치환에 따라 결정될 수 있다. 보존적 치환은 또한 비-천연 아미노산의 사용을 포함할 수 있다.
비-보존적 치환, 즉, 하나의 패밀리의 구성원을 다른 패밀리의 구성원으로의 교환은 예를 들어, 결합 성분의 전하, 쌍극자 모멘트, 크기, 친수성, 소수성 또는 형태(conformation)와 관련하여, 실질적인 변화를 일으킬 수 있으며, 이는 특히, 표적 분자에 결합하는 데 필수적인 아미노산이 영향을 받는 경우에, 결합 활성을 변화시킬 수 있다. 비-보존적 치환은 또한, 비-천연 아미노산의 사용을 포함할 수 있다.
보존적 변형 및 비-보존적 변형은 당해 분야에 공지된 다양한 표준 기술, 예를 들어, 조합 화학, 부위-지향적 DNA 돌연변이유발, PCR-매개 및/또는 카세트 돌연변이유발, 펩타이드/단백질 화학적 합성, 결합 성분을 암호화하는 신규한 핵산 서열에 적절한 변형의 도입 또는 이를 작제화함 및/또는 부모 결합 성분에서 반응성 기를 특이적으로 변형시키는 화학적 반응에 의해 부모 결합 성분에 도입될 수 있다. 변이체는 이의 화학적, 생물학적, 생물리학적 및/또는 생화학적 성질에 대해 통상적인 방법에 의해 시험될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환은 부모 서열의 기능적, 및 일반적으로 또한 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않는다. 이에 따라, 보존적 치환을 포함하는 결합 성분의 결합 특징은 적어도 본질적으로 변경되지 않는다. 또한, 보존적 아미노산 치환은 일반적으로 부모 서열의 2차 구조를 실질적으로 변형시키거나 파괴하지 않는다.
본 명세서에서 용어 "라벨"은 물리적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로, 검출 또는 측정이 샘플에서 선택된 표적 생물독립체(bioentity)의 존재를 나타내는 임의의 물질을 지칭하는 데 사용된다. 유용한 검출 가능한 라벨의 예시적인 예는 흡광도, 형광, 반사도, 광산란, 인광, 또는 발광 성질을 기초로 하여 직접 또는 간접적으로 검출 가능한 분자 또는 이온, 또는 이의 핵자기공명 또는 상자성 성질에 의해 검출 가능한 분자 또는 이온을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 라벨은 일부 실시형태에서, 흡광도 또는 형광을 기초로 하여 간접적으로 검출될 수 있는 분자, 예를 들어, 적절한 물질을 예를 들어, 비-광 흡수 분자에서 광 흡수 분자로, 또는 비-형광 분자에서 형광 분자로 전환시키는 다양한 효소일 수 있다.
본 명세서에 개시된 결합 성분을 포함하는 화합물과 같은 항목의 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 단일 용량으로서 또는 일련의 용량의 일부로서, 적용되는 투약 요법에서, 요망되는 치료 효과를 산출하는 양, 즉, 특정 치료 목표에 도달하는 양이다. 치료적 유효량은 일반적으로 관련 병리학적 질환의 치료 또는 관리에 치료상 이점을 제공하거나 질환의 존재와 관련된 하나 이상의 증상을 지연시키거나 최소화하는 데 충분한 양이다. 투여량은 환자 및 임상적 인자(예를 들어, 환자의 연령, 체중, 성별, 임상적 경력, 장애의 중증도 및/또는 치료에 대한 반응), 치료될 장애의 특성, 투여되는 특정 조성물, 투여 경로, 및 기타 요인들을 포함하는 다양한 요인에 의존적일 것이다.
용어 "본질적으로 포함한다(essentially consists of)"는 샘플 또는 조성물의 성질에 영향을 미치지 않는 샘플 또는 조성물에 추가 성분들의 존재를 가능한 것으로 이해된다. 예시적인 예로서, 약제 조성물은 활성 성분을 본질적으로 포함하는 경우에 부형제를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 범위 내에서, 용어 "항체"는 전장 면역글로불린뿐만 아니라 이의 단편을 지칭한다. 이러한 전장 면역글로불린은 단클론성, 다클론성, 키메라, 인간화된, 베니어드(veneered) 및/또는 인간 항체일 수 있다. 키메라 항체는 예를 들어, 상이한 종 및/또는 상이한 아이소타입의 불변 영역을 포함할 수 있거나, 인공 이중특이적 또는 다중특이적 작제물, 예를 들어, 예컨대, 쿼드로마(quadroma), 노브-인투-홀(knob-into-hole: KIH) 또는 CrossMab 또는 DuoBody일 수 있다. 이러한 용어는 또한, 전장 면역글로불린이 항체 단편 또는 비-항체 스캐폴드에 융합된 작제물을 포함한다. 이의 예시적인 예는 문헌[Dimasi N. et al (2009), JMB 393, 672-692]에 기술된 바와 같은 Bs1Ab, Bs2Ab, Bs3Ab, Bs4Ab, Ts1Ab 및 Ts2Ab를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 추가 키메라 항체는 DVD-Ig, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, scFv-KIH, FynomABs, 또는 BiTE-KIH를 포함한다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체는 일부 실시형태에서, 글리코실화될 수 있으며, 다른 실시형태에서, 항체는 글리코실화되지 않는다.
항체 또는 단백질성 결합 분자와 같은 폴리펩타이드와 관련된 "단편"은, 전장 면역글로불린 서열보다 짧은 한 그리고 단백질의 고려되는 기능을 수행할 수 있는 한, 요망되는 표적, 예를 들어, 항원(예를 들어, PD-L1)에 대해 특이적으로 결합하는 항체의 경우에, 상응하는 폴리펩타이드에 존재하는 임의의 아미노산 서열을 의미한다. 용어 "항체 단편"은 특정 표적, 통상적으로, 분자에 대한 특이적 결합 친화력을 나타내는, 항체의 일부, 종종 주변 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역 및 부분을 지칭한다. 초가변 영역은 폴리펩타이드 표적에 물리적으로 결합하는 항체의 일부이다. 이에 따라, 항체 단편은 항체의 표적화 특이성을 보유하는 전장 항체의 하나 이상의 일부를 포함하거나 이로 이루어진다. 이러한 항체 단편은 예를 들어, 전장 항체의 불변 영역(Fc 영역)이 적어도 일부 결여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 단편은 전장 항체의 소화에 의해 생성된다. 항체 단편은 또한, 항체의 하나 이상의 부분을 함유하는 합성 또는 재조합 작제물일 수 있다(예를 들어, 문헌[Holliger P and Hudson J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnol. 2005, vol. 23, 9, p.1126] 참조). 항체 단편의 예는 scFv, Fab, Fv, Fab', F(ab')2 단편, scFab, dAb, VHH, 나노바디, V(NAR) 또는 소위 최소 인식 단위, 이중체, 단쇄 이중체(scDb), 텐덤 scDb(Tandab), 선형 다이머 scDb(LD-scDb), 환형 다이머 scDb(CD-scDb), BiTE(또한 소위 이중특이적 T-세포 관여 항체, 텐덤 scFv 또는 텐덤 디-scFv), DART, 텐덤 트라이-scFv, 삼중체, 이중특이적 Fab2, 다이-미니항체, 사중체(tetrabody), 다이-이중체, 또는 scFab-dsscFv를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
"단쇄 가변 단편" 또는 "단쇄 항체" 또는 "scFv"는 한 타입의 항체 단편의 예이다. scFv는 링커에 의해 연결된 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 이에 따라, 이는 전장 항체에 존재하는 불변 Fc 영역이 결여되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 "결합 성분"은 하나 이상의 CDR 및 선택적으로, 본 명세서에 개시된 바와 같은 가변 경쇄 및/또는 중쇄를 포함하는 단백질성 단백질 분자로 지칭된다. 이와 같이, 용어 "결합 성분"은 항체(즉, 상기에 규정된 바와 같은 전장 면역글로불린 및 항체 단편), 단백질성 비-항체 스캐폴드 및/또는 다른 결합 화합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-항체 스캐폴드는 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다. 이러한 결합 성분은 하나 이상의 항원 결합 부위를 갖는 1가 또는 다가일 수 있다. 1가 결합 성분의 비제한적인 예는 scFv, Fab, scFab, dAb, VHH, V(NAR)(또한 소위 최소 인식 단위), DARPins, 아필린 및 나노바디를 포함한다. 다가 결합 성분은 2, 3, 4개 또는 그 이상의 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 전장 면역글로불린, F(ab')2 단편, 비스-scFv(또는 텐덤 scFvor BiTE), DART, 이중체, scDb, DVD-Ig, IgG-scFab, scFab-Fc-scFab, IgG-scFv, scFv-Fc, scFv-fc-scFv, Fv2-Fc, FynomABs, 쿼드로마, CrossMab, DuoBody, 삼중체 및 사중체는 다가 결합 성분의 비-제한적인 예이며, 예시적인 다가 결합 성분에서, 2개의 결합 부위가 존재하며, 즉, 결합 성분은 2가이다.
일부 실시형태에서, 다가 결합 성분은 이중특이적이며, 즉, 결합 성분은 2개의 상이한 표적 또는 1개의 표적 분자 상의 2개의 상이한 표적 부위에 대해 지향된다. 이중특이적 항체는 예를 들어, 문헌[Muller D. and Kontermann R.E. Bispecific antibodies. Edited by Duebel S. Weinheim: Wiley-VCH, 2007. ISBN 3527314539. p. 345]에서 검토된다. 일부 실시형태에서, 다가 결합 성분은 각각 3 또는 4개의 상이한 항원에 대한 2개 초과, 예를 들어, 3 또는 4개의 상이한 결합 부위를 포함한다. 이러한 결합 성분은 다가이고 다중특이적이고, 특히, 각각, 트라이-특이적 또는 테트라-특이적이다.
"비-항체 스캐폴드"는 예를 들어, 문헌[Fielder M. and Skerra A. Non-antibody scaffolds. Edited by Duebel S. Weinheim: Wiley-VCH, 2007. ISBN 3527314539. p. 467; 또는 Gilbreth R.N. and Koide S. Structural insights for engineering binding proteins based on non-antibody scaffolds. Curr. Opin. Struct. Biol. 2012, vol. 22, p.413]에 기술된 항원-결합 폴리펩타이드이다. 비-제한적인 예는 아피바디(affibody), 아필린 분자, AdNectin, 리포칼린 패밀리의 폴리펩타이드를 기초로 한 뮤테인(Anticalins®), DARPin, Knottin, Kunitz-타입 도메인, 아비머(Avimer), 피노머(fynomer), 테트라넥틴 및 트랜스-바디를 포함한다. 아비머는 여러 세포 표면 수용체에서 다수의 도메인의 문자열(string)로서 발생하는 소위 A-도메인을 함유한다(Silverman J., et al, Nature Biotechnol. 2005, vol. 23, p.1556). 개개 인간 호모트라이머 단백질로부터 유래된 테트라넥틴은 마찬가지로, 요망되는 결합을 위해 조작될 수 있는 C-타입 렉틴 도메인에서 루프 영역을 포함한다(동일한 문헌).
본 명세서에 개시된 바와 같은 결합 성분은 요망되는 경우에 PEG화되거나 과글리코실화될 수 있다(또한 하기 참조). 일부 실시형태에서, 결합 성분은 상기 예시적인 단백질성 결합 분자들 중 하나 및 알부민-결합 도메인, 예를 들어, 스트렙토코칼 단백질 G의 알부민-결합 도메인의 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 결합 성분은 항체 단편, 예를 들어, 단쇄 이중체, 및 항체 결합 도메인, 예를 들어, 박테리아 항체 결합 도메인의 융합 단백질이다. 예시적인 예로서, 단쇄 이중체는 문헌[Unverdorben et al (Protein Eng., Design & Selection, 2012, vol. 25, p.81)]에 기술된 바와 같은 스타필로코칼 단백질 A의 도메인 B에 융합될 수 있다.
"IC50" 또는 "반수-최대 저해 농도(half-maximum inhibitory concentration)"는 길항제 효능의 척도이고, 생물학적 또는 생화학적 기능을 저해하는 화합물이 유효성(effectiveness)을 정량적으로 기술한다. 이에 따라, 이러한 값은 특정 생물학적 또는 생화학적 과정 또는 기능을 50%까지 저해하는 데 결합 성분과 같은 특정 항목이 얼마나 많이 요구되는 지의 여부를 나타낸다. 친화력의 직접 지표는 아니지만, IC50 및 K 값은 상관관계가 있고, Cheng-Prusoff 방정식을 통해 결정될 수 있다(Cheng Y. and Prusoff W.H. Relationship between the inhibition constant (Ki) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (IC50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 1973, vol. 22, p.3099; Rammes G., et al, PLOSONE 2009, vol. 4, p. 1-14; Zhen J., et al, Concentration of receptor and ligand revisited in a modified receptor binding protocol for high-affinity radioligands: [3H] spiperone binding to D2 and D3 dopamine receptors. J. Neurosci. Meth. 2010, vol. 188, p.32).
용어 "프레임워크(framework)"(FR)는 개개 CDR을 임베딩하는, 가변 경쇄(VL) 또는 가변 중쇄(VH) 중 어느 하나인, 가변 항체 도메인의 스캐폴드를 지칭한다. VL 및/또는 VH 프레임워크는 통상적으로, CDR 영역에 인접한, 4개의 프레임워크 섹션, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다. 이에 따라, 당해 분야에 공지된 바와 같이, VL은 일반 구조: (FR-L1)-(CDR-L1)-(FR-L2)-(CDR-L2)-(FR-L3)-(CDR-L3)-(FR-L4)를 가지며, VH는 일반 구조: (FR-H1)-(CDR-H1)-(FR-H2)-(CDR-H2)-(FR-H3)-(CDR-H3)-(FR-H4)를 갖는다.
용어 "CDR"은 주로 항원 결합에 기여하는 항체의 초가변 영역을 지칭한다. 통상적으로, 항원 결합 부위는 프레임워크 스캐폴드내에 임베딩된, 6개의 CDR을 포함한다. 여기에서, VL의 CDR은 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로서 지칭되며, VH의 CDR은 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로서 지칭된다. 이러한 것들은 문헌[KABAT, E.A., et al Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th edition. Edited by U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. NIH Publications, 1991. p. 91-3242]에 기술된 바와 같이 식별될 수 있다. 그러나, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CDR-H1은 이러한 것이 위치 27에서 시작하고 위치 36 이전에 종료된다는 점에서 Kabat 정의와는 다르다(AHo 위치 28 내지 42, 경계값 포함(inclusive)).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 항체의 VH 및 VL에서 아미노산 잔기 위치를 식별하는 넘버링 시스템(numbering system)은 문헌[Honegger A. and Plueckthun A. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: An automatic modelling and analysis tool. J. Mol. Biol. 2001, vol. 309, p.657]에 기술된 "AHo"-시스템에 해당한다. 이러한 간행물은 AHo와 Kabat 시스템 간의 변환 표(conversion table)를 추가로 제공한다(Kabat E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th edition. Edited by U.S. Department of Health and Human Services. NIH Publications, 1991. No. 91-3242).
"인간화된(humanized)" 항체는 비-인간 부모 항체 또는 이들의 변이체 또는 합성 CDR의 하나 이상의, 통상적으로, 모두 6개의 CDR 영역을 포함하는 항체를 지칭하며, 이들 중에서, 프레임워크는 예를 들어, (i) 비-인간 부모 항체의 하나 이상의 프레임워크 잔기를 잠재적으로 포함하는 인간 프레임워크, 또는 (ii) 자연적으로 생산된 인간 프레임워크와의 유사성을 증가시키기 위해 변형된 비-인간 항체로부터의 프레임워크이다. 항체를 인간화하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[예를 들어, Leger O., and Saldanha J. Antibody Drug Discovery. Edited by Wood C. London: Imperial College Press, 2011. ISBN 1848166281. p.1-23].
용어 "단리된(isolated)"은 펩타이드, 핵산 분자 또는 세포와 같은 물질이 이의 정상적인 생리학적 환경, 예를 들어, 천연 소스(natural source)로부터 제거되었거나, 펩타이드 또는 핵산이 합성된 것을 명시하는 것이다. 용어 "단리된"의 사용은 자연 발생 서열이 이의 정상 세포(예를 들어, 염색체) 환경으로부터 제거된 것을 명시하는 것이다. 이에 따라, 서열은 무-세포 용액 중에 존재하거나 상이한 세포 환경에 배치될 수 있다. 폴리펩타이드 또는 핵산 분자와 관련하여 "단리된"은 천연 소스로부터 단리되거나 합성된 폴리펩타이드 또는 핵산 분자를 포함하는, 서로 결합된 둘 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 폴리머를 의미한다. 용어 "단리된"은 서열이 단지 아미노산 사슬 또는 뉴클레오타이드 사슬에 존재하고, 본질적으로, 예를 들어, 이와 자연적으로 관련된, 비-아미노산 물질 및/또는 비-핵산 물질 각각이 존재하지 않음을 시사하는 것은 아니다. "단리된 세포(isolated cell)"는 자연적으로 세포를 동반하는 분자 및/또는 세포 성분들로부터 분리된 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "동일성(identity)"은 2개의 단백질 또는 핵산 간에 서열 매치(sequence match)를 지칭하는 것이다. 비교되는 단백질 또는 핵산 서열들은 예를 들어, 생물정보학 툴(bioinformatics tool), 예를 들어, EMBOSS Needle을 이용하여 비교 윈도우(comparison window)에 대한 최대 상응도(maximum correspondence)를 위해 정렬된다(쌍 정렬(pair wise alignment); www.ebi.ac.uk에서 입수 가능하거나 수작업 정렬 및 육안 검사에 의함). 비교되는 서열들에서 동일한 위치가 동일한 핵염기 또는 아미노산 잔기에 의해 점유될 때, 개개 분자는 바로 그 위치에서 동일하다. 이에 따라, "동일성 퍼센트(percent identity)"는 매칭 위치의 수를 비교되는 위치의 수로 나누고 100%를 곱한 함수이다. 예를 들어, 10개의 서열 위치에서 6개가 동일한 경우에, 동일성은 60%이다. 최대 상응도를 위해 서열을 정렬하는 것은 갭을 도입하는 것을 필요로 할 수 있다. 2개의 단백질 서열들 간의 동일성 퍼센트는 예를 들어, BLOSUM62 매트릭스, 10의 "갭 개방 패널티(gap open penalty)", 0.5의 "갭 확장 패널티(gap extend penalty)", 거짓 "말기 갭 패널티"(false "end gap penalty"), 10의 "말기 갭 개방 패널티(end gap open penalty)" 및 0.5의 "말기 갭 확장 패널티(end gap extend penalty)"를 이용하여, EMBOSS Needle내에 도입된, Needleman 및 Wunsch 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있거나(Needlemann S.B. and Wunsch CD. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J. Mol. Biol. 1970, vol. 48, p.443), 동일성을 최대화하는 방식으로 수작업으로 갭을 도입하는 서열을 정렬하는 방법이 사용될 수 있다. 이에 따라, 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 서열은 서열 동일성을 최대화하는 방식으로 갭을 수작업으로 도입함으로써 정렬된다. 동일한 1차 아미노산 또는 핵산 서열을 갖는 2개의 분자는 임의의 화학적 및/또는 생물학적 변형과는 무관하게 동일하다. 예를 들어, 동일한 1차 아미노산 서열을 가지지만 상이한 글리코실화 패턴을 갖는 2개의 항체는 이러한 정의에 의해 동일하다. 핵산의 경우에, 동일한 서열을 가지지만 포스페이트 대신에 티오포스페이트와 같은 연결 성분을 갖는 2개의 분자는 이러한 정의에 의해 동일하다. 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 여러 가변 도메인 또는 하나 이상의 불변 도메인을 포함하기 때문에, 본 명세서에 제공된 임의의 서열들보다 더 긴 서열은 비교 범위에 대한 서열 동일성이 제공되는 경우에 본 명세서에 개시된 참조 서열과 동일해야 한다. 본 명세서에서 사용되는 비교 윈도우는 청구되는 바와 같은 전체 서열을 포함한다. 유사하게, 외환성 변형(exocyclic modification)으로 인해서만 상이한 핵염기, 예를 들어, 시토신 및 5-메틸-시토신은 이러한 정의에 의해 동일하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 분자"는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 이들의 조합과 같은, 임의의 가능한 배열의 임의의 핵산을 지칭한다. 핵산의 예는 예를 들어, DNA 분자, RNA 분자, 뉴클레오타이드 유사체를 사용하거나 핵산 화학, 잠금 핵산 분자(LNA), 단백질 분자(PNA), 알킬 포스포네이트 및 알킬포스포트라이에스터 핵산 분자 및 텍토-RNA 분자를 포함한다(예를 들어, Liu B. et al, J. Am. Chem. Soc. 2004, vol. 126, 4076). LNA는 C4'와 O2' 간에 메틸렌 브릿지를 갖는 변형된 RNA 골격을 가져서, 더 높은 이중 안정성 및 뉴클레아제 내성을 갖는 개개 분자를 제공한다. 알킬포스포네이트 및 알킬포스포트라이에스터 핵산 분자는 DNA 분자 또는 RNA 분자로서 볼 수 있으며, 여기서, 핵산 골격의 포스페이트기는 핵산 골격에서의 포스페이트기의 P-OH 기를 각각 알킬 기로 및 알콕시기로 교환함으로써 중화된다. DNA 또는 RNA는 게놈 또는 합성 기원일 수 있고, 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 이러한 핵산은 예를 들어, mRNA, cRNA, 합성 RNA, 게놈 DNA, cDNA 합성 DNA, DNA와 RNA의 코폴리머, 올리고뉴클레오타이드 등일 수 있다. 또한, 개개 핵산은 비-천연 뉴클레오타이드 유사체를 함유하고/하거나친화력 태그 또는 라벨에 연결될 수 있다.
다수의 뉴클레오타이드 유사체는 공지되어 있고, 본 명세서에 개시된 방법에서 사용되는 핵산에서 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 예를 들어, 염기, 당, 또는 포스페이트 모이어티에서 변형을 함유하는 뉴클레오타이드이다. 예시적인 예로서, siRNA의 2'-OH 잔기의 2'F, 2'O-Me 또는 2'H 잔기로의 치환은 개개 RNA의 생체내 안정성을 개선시키는 것으로 알려져 있다. 염기 모이어티에서의 변형은 A, C, G, 및 T/U, 상이한 퓨린 또는 피리미딘 염기, 예를 들어, 우라실-5-일, 하이포잔틴-9-일, 및 2-아미노아데닌-9-일뿐만 아니라 비-퓨린 또는 비-피리미딘 뉴클레오타이드 염기의 천연 또는 합성 변형일 수 있다. 다른 뉴클레오타이드 유사체는 유니버셜 염기(universal base)로서 역할을 한다. 유니버셜 염기의 예는 3-니트로피롤 및 5-니트로인돌을 포함한다. 유니버셜 염기는 임의의 다른 염기와 염기 쌍을 형성할 수 있다. 염기 변형은 종종 예를 들어, 증가된 이중 안정성과 같은 독특한 성질을 달성하기 위해, 예를 들어, 2'-O-메톡시에틸과 같은, 예를 들어, 당 변형과 조합될 수 있다.
이러한 문헌에서 사용되는 표현 "약제학적으로 허용되는"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기성 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비율에 비례하는, 그러한 활성 화합물, 물질, 조성물, 담체, 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
의학적/생리학적 맥락에서, 즉, 생리학적 상태의 맥락에서 용어 "예방하는(preventing)"은 유기체가 비정상적인 상태를 수축 또는 발병시킬 확률을 감소시키는 것을 지칭한다.
"유사한" 단백질 서열은, 정렬될 때, 유사한 아미노산 잔기, 가장 자주, 그러나 의무적으로 비교되는 서열들의 동일한 위치에서 동일하지 않은 아미노산 잔기를 공유하는 서열이다. 유사한 아미노산 잔기는 측쇄의 화학적 특징에 의해 패밀리(family)들로 그룹핑된다. 이러한 패밀리는 "보존적 아미노산 치환"에 대해 상기에서 기술된다. 서열들 간의 "유사성 퍼센트"는 비교되는 서열들의 동일한 서열 위치에서 동일한 또는 유사한 잔기를 함유하는 위치의 수를 비교되는 위치의 총수로 나누고 100%를 곱한 것이다. 예를 들어, 10개의 서열 위치 중 6개가 동일한 아미노산 잔기를 가지고 10개의 위치 중 2개가 유사한 잔기를 함유하는 경우에, 서열은 80% 유사성을 갖는다. 2개의 서열들 간의 유사성은 예를 들어, EMBOSS Needle을 이용하여 결정될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 명세서에 제공된 임의의 서열들보다 더 긴 서열은, 예를 들어, 여러 가변 도메인 또는 하나 이상의 불변 도메인을 포함하기 때문에, 비교 윈도우에 대한 서열 유사성이 제공되는 경우에 본 명세서에 개시된 참조 서열과 유사해야 한다. 본 명세서에서 사용되는 비교 윈도우는 청구된 바와 같은 전체 서열을 포함한다.
본 문헌에서 사용되는 용어 "특이적(specific)"은 결합 성분 또는 결합 화합물이 10-6 몰(molar) 미만의 평형 결합 상수 KD로 PD-L1과 같은 규정된 표적에 결합함을 명시하는 것으로 이해된다. 이러한 상수는 예를 들어, Attana 기기에서 석영 결정 미량저울(Quartz Crystal Microbalance, QCM), BIACORE 기기에서 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 기술, 또는 역학적 배제 검정(KinExA®)을 이용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "계층화하는(stratifying)" 및 "계층화(stratification)"는 개체(individual)가 본 명세서에 개시된 결합 성분에 반응하는 대응하는 확률과 같은 개개 그룹과 매칭하는 특징에 따라 특정 그룹으로 지정되는 것을 명시한다. 이러한 그룹은 예를 들어, 결합 성분의 시험, 처방, 투약 조절, 중단 또는 포기를 위해 사용될 수 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 방법 또는 용도의 일부 실시형태에서, 대상체는 치료법의 임상 연구의 하위그룹으로 계층화될 수 있다.
개체로서도 다루어지는, 본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 인간 또는 비-인간 동물, 일반적으로, 포유류를 지칭한다. 대상체는 포유 동물, 예를 들어, 토끼, 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 개, 고양이, 돼지, 소, 염소, 양, 말, 원숭이, 유인원 또는 인간일 수 있다. 이에 따라, 이러한 문헌에 기술된 방법, 용도 및 조성물은 인간 질병 및 가축 질병 둘 모두에 적용 가능하다. 하기에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 샘플은 대상체로부터 얻어질 수 있다. 이에 따라, 샘플에서의 발현 수준 및 이를 기초로 한 결정으로부터 도출된 결론이 샘플이 수집된 대상체와 관련이 있는 것으로 이해된다. 또한, 대상체가 통상적으로 살아있는 유기체이지만, 본 문헌에 기술된 방법 또는 용도는 또한 사후 분석(post-mortem analysis)에서 사용될 수 있다. 대상체가 질병 또는 질환에 대해 의학적 관리(medical care)를 받고 있는 살아있는 인간인 경우에, 이는 또한 "환자(patient)"로서 다루어진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료(treatment)" 및 "치료하는(treating)"은 대상체의 유기체에서 치료 효과를 가지고/거나 병리학적 상태를 포함하는 비정상적 상태를 예방하거나, 늦추거나(감소시키거나) 적어도 부분적으로 경감시키거나 없애는, 예방적(prophylactic 또는 preventative) 조치를 포함한다. 본 개시내용에 따른 치료는 PL-L1-관련 장애를 예방하거나, 치유하거나, 발병 및/또는 진행을 지연하거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 이의 하나 이상의 증상들 안정화시키거나, 조절하거나, 치유하거나, 개선시키기 위해 필요로 하는 대상체에, 약제학적 유효량의 본 명세서에 기술된 바와 같은 분자, 즉, 그 중에서도, 본 명세서에 개시된 결합 성분(예를 들어, 항체), 핵산, 벡터 또는 세포의 투여를 수반한다. 통상적으로, 결합 성분, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포는 본 명세서에 기술된 것을 포함하는 약제 조성물에 제공된다. 치료를 필요로 하는 대상체는 이미 장애를 갖는 대상체뿐만 아니라 장애를 갖기 쉬운 대상체 또는 장애가 예방되어야 하는 대상체(예방)를 포함한다. 일반적으로, 치료는 질병 또는 병리학적 질환의 존재 및/또는 진행과 관련된 증상의 진행을 감소시키거나, 안정화하거나, 저해한다.
본 명세서에서 사용되는 "PD-L1"은 "프로그램된 세포사 리간드 1(programmed cell death ligand 1)", "분화 클러스터(cluster of differentiation) 274(즉, CD274)" 또는 "B7 동족체 1(즉, B7-H1)"로도 알려진 단백질을 지칭한다. 고유 단백질(native protein)은 2가지 세포외 도메인, 즉, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인을 포함한다. 이러한 용어는 전장 및/또는 처리되지 않은 PD-L1뿐만 아니라 세포에서의 처리로부터 얻어진 임의의 중간체를 포함한다. PD-L1은 막관통 단백질로서 또는 가용성 단백질로서 존재할 수 있으며, 이에 따라, 본 명세서에서 사용되는 이러한 용어는 단백질의 전장 또는 세포외 도메인을 지칭할 수 있다. 이러한 용어는 또한 PD-L1의 자연발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체(splice variant), 또는 대립형질 변이체(allelic variant)를 포함한다. 단백질은 추가적으로 태그, 예를 들어, his 태그 또는 Fc 태그를 함유할 수 있다. 예시적인 인간 전장 PD-L1 단백질의 아미노산 서열은 예를 들어, NCBI 단백질 데이터베이스 수탁 번호 NP_054862로 확인될 수 있다. 용어 "hPD-L1"은 인간 PD-L1을 지칭하고, 천연 hPD-L1 및 재조합 인간 rhPD-L1을 포함한다. "rPD-L1"은 재조합 PD-L1을 지칭한다. 재조합 PD-L1은 이를 제조하는 방법에 따라, 아미노 말단 메티오닌 잔기를 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있다. "rhPD-L1"은 재조합 인간 PD-L1을 지칭한다. 마찬가지로, PD-L1은 또한, 인간 또는 비-인간 기원의 생물학적 샘플로부터 단리에 의해 얻어질 수 있다. rhPD-L1은 예를 들어, RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 156-B7로부터 또는 Peprotech, 미국 소재, 카탈로그 번호 310-35로부터 얻어질 수 있다. "원숭이 PD-L1"은 히말라야 원숭이(Rhesus macacque, Macaca mulatta)dml PD-L1을 지칭한다. 예시적인 원숭이 PD-L1 단백질의 아미노산 서열은 예를 들어, NCBI 단백질 데이터베이스 수탁 번호 NP_001077358로 확인될 수 있다. 원숭이 PD-L1은 예를 들어, Sino Biological, China, 카탈로그 번호 90251-C02H로부터 얻어질 수 있다. "래트 PD-L1"은 시궁쥐(Rattus norvegicus, Norway rat)를 지칭한다. 예시적인 래트 PD-L1 단백질의 아미노산 서열은 예를 들어, NCBI 단백질 데이터베이스 수탁 번호 NP_001178883로 확인될 수 있다. 래트 PD-L1은 예를 들어, Sino Biological, China, 카탈로그 번호 80450-R02H로부터 얻어질 수 있다. "마우스 PD-L1"은 생쥐(Mus musculus)의 PD-L1을 지칭한다. 예시적인 마우스 PD-L1 단백질의 아미노산 서열은 예를 들어, NCBI 단백질 데이터베이스 수탁 번호 NP_068693로 확인될 수 있다. 마우스 PD-L1은 예를 들어, Sino Biological, China, 카탈로그 번호 50010-M03H로부터 또는 RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 1019-B7-100으로부터 얻어질 수 있다.
"PD-1"은 프로그램된 세포사 단백질 1로서, 이는 PD-L1에 대한 세포 표면 수용체인 CD279로서도 알려져 있다. PD-1은 2개의 리간드, 즉, PD-L1 및 PD-L2를 결합한다. PD-1은 세포외 도메인 이후에 막관통 영역 및 세포내 도메인을 포함하는 막관통 단백질이다. 이러한 용어는 전장 및/또는 처리되지 않은 PD-1뿐만 아니라 세포에서 처리로부터 생성된 임의의 중간체를 포함한다. PD-1은 막관통 단백질로서 또는 가용성 단백질로서 존재할 수 있으며, 이에 따라, 본 명세서에서 사용되는 이러한 용어는 단백질의 전장 또는 세포외 도메인을 지칭할 수 있다. 이러한 용어는 또한, PD-1의 자연발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 단백질은 추가적으로, 태그, 예를 들어, his 태그 또는 Fc 태그를 함유할 수 있다. 예시적인 인간 PD-1 단백질의 아미노산 서열은 예를 들어, NCBI 단백질 데이터베이스 수탁 번호 NP_005009로 확인될 수 있다. 용어 "hPD-1"은 인간 PD-1을 지칭하고, 이의 천연 형태(hPD-1)뿐만 아니라 재조합 인간 형태(rhPD-1)를 포함한다. "rPD-1"은 재조합 PD-1을 지칭한다.
"CD80"은 B7-1, B7.1, BB1, CD28LG, CD28LG1, LAB7로서도 알려진, 분화 클러스터 80을 지칭한다. 이는 CD28 및 CTLA-4뿐만 아니라 PD-L1에 대한 막 수용체이고, 세포외 도메인 이후 막관통 영역 및 세포내 도메인을 포함한다. 이러한 용어는 전장 및/또는 처리되지 않은 CD80뿐만 아니라 세포에서 처리로부터 생성된 임의의 중간체를 포함한다. CD80은 막관통 단백질로서 또는 가용성 단백질로서 존재할 수 있으며, 이에 따라, 본 명세서에서 사용되는 이러한 용어는 단백질의 전장 또는 세포외 도메인을 지칭할 수 있다. 이러한 용어는 또한, CD80의 자연발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체, 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 단백질은 추가적으로, 태그, 예를 들어, his 태그 또는 Fc 태그를 함유할 수 있다. 예시적인 인간 CD80 단백질의 아미노산 서열은 예를 들어, NCBI 단백질 데이터베이스 수탁 번호 NP_005182로 확인될 수 있다. CD80은 예를 들어, RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 9050-B1-100으로부터 얻어질 수 있다. 용어 "hCD80"은 인간 CD80을 지칭하고, 이의 천연 형태(hCD80)뿐만 아니라 재조합 인간 형태(rhCD80)를 포함한다. "rCD80"은 재조합 CD80을 지칭한다.
"PD-L2"는 "프로그램된 세포사 1 리간드 2", "B7-DC", 또는 "CD273"(분화 클러스터 273)으로도 알려진 단백질을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 이러한 용어는 전장 및/또는 처리되지 않은 PD-L2뿐만 아니라, 세포에서 처리로부터 생성된 임의의 중간체를 포함한다. PD-L2는 막관통 단백질로서 또는 가용성 단백질로서 존재할 수 있으며, 이에 따라, 본 명세서에서 사용되는 이러한 용어는 단백질의 전장 또는 세포외 도메인을 지칭할 수 있다. 이러한 용어는 또한 PD-L2의 자연발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 단백질은 추가적으로, 태그, 예를 들어, his 태그 또는 Fc 태그를 함유할 수 있다. 예시적인 인간 전장 PD-L2 단백질의 아미노산 서열은 예를 들어, NCBI 단백질 데이터베이스 수탁 번호 NP_079515로 확인될 수 있다. PD-L2는 예를 들어, RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 1224-PL로부터 얻어질 수 있다. 용어 "rhPD-L2"는 재조합 인간 PD-L2를 지칭한다.
"B7-H3"은 CD276(분화 클러스터 276)으로도 알려진 단백질을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 이러한 용어는 전장 및/또는 처리되지 않은 B7-H3뿐만 아니라 세포에서 처리로부터 생성된 임의의 중간체를 포함한다. B7-H3은 막관통 단백질로서 또는 가용성 단백질로서 존재할 수 있으며, 이에 따라, 본 명세서에서 사용되는 이러한 용어는 단백질의 전장 또는 세포외 도메인을 지칭할 수 있다. 이러한 용어는 또한 B7-H3의 자연발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 단백질은 추가적으로, 태그, 예를 들어, his 태그 또는 Fc 태그를 함유할 수 있다. 예시적인 인간 전장 B7-H3 단백질의 아미노산 서열은 예를 들어, NCBI 단백질 데이터베이스 수탁 번호 NP_079516으로 확인될 수 있다. B7-H3은 예를 들어, RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 1027-B3으로부터 얻어질 수 있다. 용어 "rhB7-H3"은 재조합 인간 B7-H3을 지칭한다.
"변이체(variant)"는 본 명세서에 개시된 부모 서열의 적어도 하나의 요망되는 활성을 보유하면서, 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 핵염기의 부가(삽입을 포함함), 결실, 변형 및/또는 치환에 의해 부모 서열과는 상이한 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 항체의 경우에, 이러한 요망되는 활성은 특이적 항원 결합을 포함할 수 있다. 유사하게, 변이체 핵산 서열은 하나 이상의 핵염기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 부모 서열과 비교할 때 변형될 수 있지만, 암호화된 항체는 전술한 바와 같이 요망되는 활성을 보유한다. 변이체는 자연 발생, 예를 들어 대립형질 또는 스플라이스 변이체일 수 있거나, 인공적으로 구성될 수 있다.
핵산 혼성화 반응은 상이한 엄격성(stringency)의 조건 하에서 수행될 수 있다. "엄격한 조건(stringent condition)"은 널리 공지되어 있고, 당해 분야에 공지되어 있다. 통상적으로, 혼성화 반응 동안, SSC-기반 완충제가 사용될 수 있는데, 여기서, SSC는 7.0의 pH를 갖는 0.15M NaCl 및 15mM 시트레이트 완충제이다. 완충제 농도의 증가 및 변성제(denaturing agent)의 존재는 혼성화 단계의 엄격성을 증가시킨다. 예를 들어, 높은 엄격성의 혼성화 조건은 42℃에서 0.2 × SSC 및 0.1% SDS 중에서의 세척과 함께 42℃에서 50%(vol/vol) 폼아마이드, 5 × SSC(0.75M NaCl, 0.075M 시트르산나트륨), 50mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 소듐 피로포스페이트, 5 × 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 초음파처리된 연어 정자 DNA(50 mcg/㎖), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트; (ii) 42℃에서 750mM 염화나트륨, 75mM 시트르산나트륨과 함께 pH 6.5의 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50mM 인산나트륨 완충제를 함유하는 50%(vol/vol) 폼아마이드 또는 (iii) 55℃에서 10% 덱스트란 설페이트, 2 × SSC, 및 50% 폼아마이드, 이후 55℃에서 0.1 × EDTA를 함유하는 SSC로 이루어진 높은-엄격성의 세척의 사용을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 낮은 이온 강도의 세척 용액 및 고온을 이용한 1, 2 또는 그 이상의 세척 단계는 50℃에서 예를 들어, 0.015M 염화나트륨/0.0015M 시트르산나트륨/0.1% 도데황산나트륨을 사용하는 혼성화 프로토콜에 포함될 수 있다.
용어의 임의의 사용의 범위 및 의미는 이러한 용어가 사용되는 특정 상황으로부터 명백하게 될 것이다. 이러한 문헌 전반에 걸쳐 사용되는 선택된 용어들에 대한 특정의 추가 정의는 적용 가능한 경우, 상세한 설명의 적절한 문맥에 제공된다.
용어 "포함하는(comprising, including)", "함유하는(containing)", "갖는(having)" 등은 배타적으로 또는 개방 종결되게 그리고 비제한적으로 읽혀져야 한다. 단수 형태의 표현은 문맥이 달리 명확하게 명시하지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다. 이에 따라, 예를 들어, "벡터"에 대한 언급은 단수 벡터뿐만 아니라 복수의 벡터, 동일한, 즉, 예를 들어, 동일한 오페론(operon), 또는 상이한 것 중 어느 하나를 포함한다. 마찬가지로, "세포"에 대한 언급은 단일 세포뿐만 아니라 복수의 세포를 포함한다. 달리 명시하지 않는 한, 요소들의 시리즈(series) 앞에 있는 용어 "적어도"는 이러한 시리즈에서 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "적어도 하나의" 및 "~ 중 적어도 하나"는 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 또는 그 이상의 요소들을 포함한다. 또한, 기술된 범위 위 및 아래의 약간의 변화가 그러한 범위내의 값과 실질적으로 동일한 결과를 달성하기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 달리 명시하지 않는 한, 범위의 개시내용은 최소값과 최대값 사이의 모든 값을 포함하는 연속 범위로서 의도된다.
본 명세서에 상세하게 그리고 명시적으로 열거된 임의의 실시형태는 단독으로 또는 하나 이상의 추가 실시형태와 조합하여 고지사항(disclaimer)의 근거를 형성할 수 있다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 명세서에 기술된 발명이 속하는 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 이의 전문이 예를 들어, 현재 기술된 발명과 관련하여 사용될 수 있는, 간행물에 기술된 작제물 및 방법을 기술하고 개시할 목적을 위해 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 개시내용의 다양한 양태는 하기 하위섹션에서 더욱 상세히 기술된다. 다양한 실시형태, 선호, 및 범위가 자유로이 조합될 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 특정 실시형태에 따라, 선택된 정의, 실시형태 또는 범위가 적용되지 않을 수 있다.
결합 성분 특징분석
본 명세서에 제공된 결합 성분은 PD-L1을 특이적으로 결합한다. 결합 성분의 결합 특이성은 당해 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 검증될 수 있다. 일부 실시형태에서, PD-L1은 인간 PD-L1이다.
PD-L1에 대한 결합 성분의 결합은 PD-1 및/또는 CD80과, 바람직하게는, PD-1 및 CD80 둘 모두와 PD-L1의 상호작용을 차단한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 결합 성분은 2가이고, KinExA®에 의해 측정하는 경우에, 10pM보다 낮은, 바람직하게는, 5pM보다 낮은, 더욱 바람직하게는, 약 3pM, 예를 들어, 2.9pM, 2.8pM 또는 2.7pM의 KD로 hPD-L1을 결합한다. 일부 실시형태에서, 이러한 2가 결합 성분은 전장 면역글로불린이다. 일 실시형태에서, 2가 결합 성분에 대한 상기 KinExA® 측정은 실온에서 이루어진다. 일 실시형태에서, 결합 성분은 2가이며, 실시예 9에 기술된 바와 같은 조건은 KinExA® 측정을 위해 이용된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 결합 성분은 1가이고, KinExA®에 의해 측정하는 경우, 50pM보다 낮은 KD로 hPD-L1을 결합한다. 상기 KD는 바람직하게는, 10pM보다 낮은, 예를 들어, 약 9pM, 예를 들어, 9.0pM, 8.9pM, 8.8pM 또는 8.7pM이다. 일 실시형태에서, 1가 결합 성분에 대한 상기 KinExA® 측정은 실온에서 이루어진다. 일 실시형태에서, 결합 성분은 1가이며, 실시예 4에서 특정된 바와 같은 조건은 KinExA® 측정을 위해 이용된다.
일부 실시형태에서, 상기 1가 결합 성분은 scFv이다. 일부 실시형태에서, 상기 1가 결합 성분은 약 60 kDa 또는 그 미만, 예를 들어, 약 55 kDa, 50 kDa, 45 kDa, 40 kDa, 35 kDa, 30 kDa 또는 27 kDa 또는 그 미만의 분자량을 갖는 항체 단편이다. 일 실시형태에서, 결합 성분의 분자량은 약 26 kDa, 예를 들어, 23, 24, 25, 26, 또는 27 kDa이다. 특히, 암 치료를 위하여, 항체 단편은 PD-1:PD-L1 신호전달 경로를 표적으로 할 때 전장 항체에 비해 장점을 가질 수 있다(Maute et al (2015), PNAS, Nov 24; 112(47): E6506-E6514). 이의 더 작은 크기로 인하여, 항체 단편은 통상적으로 약 150 kDa의 분자량을 갖는 전장 항체, 또는 유사한 분자량 또는 더 높은 분자량을 갖는 임의의 다른 항체 포맷을 갖는 경우 보다 더 깊게 종양내로 침투하는 것으로 여겨진다. 전장 항체, 특히, IgG와 관련된 다른 단점은 이의 Fc 영역(예를 들어, ADCC/ADCP 또는 CDC)을 통해 세포독성 면역 반응을 매개하는 이의 능력이다. 두 단백질 모두가 항종양 세포독성 T 세포의 표면 상에서 발현하기 때문에, 이러한 저해는 PD-1:PD-L1 축을 표적으로 할 때 요망되지 않을 수 있다. 이에 따라, 기능성 Fc 부분을 갖는 전장 단클론성 항체를 투여하는 것은 이러한 것이 활성화시키려고 하는 바로 그 림프구의 결실을 야기시킬 수 있다. 항-PD-1 항체로의 치료는 환자에서 순환하는 T-세포 수의 감소와 상관관계가 있는 것으로 확인되었다. 이에 따라, 저분자량(예를 들어, 60 kDa 또는 그 미만, 예를 들어, 약 55 kDa, 50 kDa, 45 kDa, 40 kDa, 35 kDa, 30 kDa 또는 27 kDa 또는 그 미만)을 갖는 항체 단편은 암의 치료에서 전장 항체 치료제의 더욱 효과적인 대안을 제공할 수 있다. 이에 따라, 바람직한 실시형태에서, 결합 성분은 Fab, Fab', scFab, scFv, Fv 단편, 나노바디, VHH, dAb, 최소 인식 단위, 이중체, 단쇄 이중체(scDb), BiTE 또는 DART로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다. 상기 포맷은 60 kDa 미만의 분자량을 가지고, Fc 도메인을 포함하지 않는다.
결합 성분의 크기 및/또는 아키텍처(architecture)는 이의 반감기에 영향을 미친다. 치료 셋팅에서 부작용을 감소시키기 위하여, 짧은 반감기를 갖는 결합 성분을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 이는 예를 들어, Fc 부분이 결여되어 있거나 변형된 Fc 부분을 갖는 결합 성분을 사용함으로써 달성될 수 있다.
특정 적용에서, 세포독성 면역 반응을 유도하고/거나, 보체를 활성화시키는 것이 유리할 수 있으며, 이에 따라, Fc 도메인의 존재가 요망될 수 있다. 이에 따라, 일 실시형태에서, 결합 성분은 세포독성 면역 반응을 매개할 수 있는 Fc 도메인을 포함한다. Fc 도메인을 포함하는 결합 성분의 비제한적인 예에는 전장 면역글로불린, DVD-Ig, scFv-Fc 및 scFv-Fc.scFv 융합체, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, IgG-scFv 융합체(예를 들어, 예컨대, bsAb, Bs1Ab, Bs2Ab, Bs3Ab, Ts1Ab, Ts2Ab, 노브-인투-홀(KiHs)), DuoBody, CrossMab가 있다.
일 실시형태에서, 결합 성분은 세포독성 면역 반응을 유도하지 않고/거나 보체를 활성화시키지 못하도록 변형된 Fc 도메인 및/또는 힌지(hinge)를 포함한다. 이러한 비활성화된 Fc 도메인 및/또는 힌지는 당해 분야에서 교시된 바와 같이 하나 이상의 치환을 도입함으로써 생성될 수 있다. 이러한 결합 성분은 매개 세포독성 면역 반응을 매개하지 않으면서, 60 kDa 미만의 분자량을 갖는 항체 단편과 비교할 때, 증가된 반감기의 장점을 갖는다.
일 실시형태에서, 결합 성분 유도체는 Fc 도메인이 결여되어 있다. Fc 도메인이 결여된 예시적인 결합 성분은 Fab, Fab', scFab, scFv, Fv 단편, 나노바디, VHH, 최소 인식 단위, 이중체, 단쇄 이중체(scDb), 텐덤 scDb(Tandab), 선형 다이머 scDb(LD-scDb), 환형 다이머 scDb(CD-scDb), BiTE(또한 텐덤디-scFv 또는 텐덤 scFv로 불리워짐), 텐덤트라이-scFv, 삼중체, 이중특이적 Fab2, 다이-미니항체, 다이-이중체, scFab-dsscFv 또는 DART이다.
일 실시형태에서, 결합 성분은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입으로 이루어진 군으로부터 선택된 불변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 결합 성분은 뮤린 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3 아이소타입으로 이루어진 군으로부터 선택된 불변 영역을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은
(a) 각각 서열번호 6, 7 및 8에 기술된 바와 같은 VH CDR 서열 CDR-H1, CDR-H2 또는 CDR-H3 중 적어도 하나, 또는 이들의 변이체; 및/또는
(b) 각각 서열번호 3, 4 및 5에 기술된 바와 같은 VL CDR 서열 CDR-L1, CDR-L2 또는 CDR-L3 중 적어도 하나, 또는 이들의 변이체를 포함하는, PD-L1에 대한 결합 성분을 제공한다. 일부 실시형태에서, 결합 성분은 적어도 서열번호 5의 CDR-L3 및/또는 서열번호 8의 CDR-H3, 또는 이들의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합 성분은 서열번호 6, 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 CDR 서열, 또는 이들의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합 성분은 서열번호 3, 4 및 5로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 CDR 서열, 또는 이들의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합 성분은 서열번호 6, 7 및 8의 3개 CDR 모두, 또는 이들의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합 성분은 서열번호 3, 4 및 5의 3개 CDR 모두, 또는 이들의 변이체를 포함한다. 바람직하게는, 결합 성분은 서열번호 3 내지 8에 기술된 바와 같은 모든 CDR, 또는 이들의 변이체를 포함한다.
본 명세서에 제공된 결합 성분은 인간 PD-L1에 대한 강한 결합 친화력을 지닌다. 예를 들어, 이러한 결합 성분은 100pM 미만, 바람직하게는, 75pM, 50pM, 25pM, 15pM 미만의 평형 결합 상수 KD로 인간 PD-L1을 결합할 수 있으며, 가장 바람직하게는, KD는 약 10pM 또는 그 미만, 예를 들어, 약 9pM(예를 들어, 9.0pM, 8.9pM, 8.8pM 또는 8.7pM), 8pM, 7pM, 6pM, 4pM, 3pM(2.9pM, 2.8pM 또는 2.7pM) 또는 그 미만이다. 친화력은 하기 실시예 섹션 및 당해 분야에서 이용 가능한 다른 방법에서 기술된 바와 같이 결정될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 친화력은 실온에서, 더욱 바람직하게는, 1가 결합 성분의 경우에 실시예 4 또는 2가 결합 성분의 경우에 실시예 9에 명시된 조건 하에서 역학적 배제 검정(KinExA®)에 의해 결정된다.
본 명세서에 기술된 결합 성분은 항체(예를 들어, 전장 면역글로불린) 또는 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, scFab, scFv, Fv 단편, 나노바디, VHH 또는 최소 인식 단위) 또는 비-항체 스캐폴드를 본질적으로 포함하거나 포함할 수 있다. 일부 결합 성분은 본 명세서에 개시된 바와 같은 가변 경쇄 및/또는 중쇄의 하나 이상의 사본(copy), 예를 들어, 텐덤 scFv, 이중체 또는 단쇄 이중체(scDb), 텐덤 scDb, 선형 다이머 scDb, 환형 다이머 scDb, BiTE; 텐덤트라이-scFv, 삼중체, 이중특이적 Fab2, 다이-미니항체, IgG, 삼중체, 사중체, scFv-Fc-scFv 융합, 다이-이중체, DVD-1g, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, 또는 IgG-scFv 융합(Bs1Ab, Bs2Ab, Bs3Ab, Bs4Ab, Ts1Ab 및 Ts2Ab를 포함하지만, 이로 제한되지 않음), 쿼드로마(quadroma), 노브-인투-홀(KIH), 이중특이적 항체, CrossMabs 및 DuoBodies로 이루어진 군으로부터 선택된 포맷을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 결합 성분 및 특히, 1가 항체 단편은 scFv이다. VH 및 VL 도메인은 가요성 링커에 의해 어느 하나의 배향, 즉, VL-링커-VH 또는 VH-링커-VL에 연결될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 배향은 VL-링커-VH이며, 즉, 경쇄 가변 영역은 N-말단 단부에 존재하며, 중쇄 가변 영역은 폴리펩타이드의 C-말단 단부에 존재한다.
결합 성분은 바람직하게는, 인간화된 결합 성분, 예를 들어, 인간화된 항체, 특히, 인간화된 항체 단편, 예를 들어, scFv이다. 결합 성분은 단클론성 및/또는 키메라일 수 있다.
이에 따라, 일부 실시형태에서, 결합 성분은 서브타입 VH3의 가변 중쇄 영역 및/또는 서브타입 Vkappa1의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 결합 성분은 서열번호 2의 VH 서열, 또는 이의 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는 서열번호 2와 적어도 85%, 더욱 바람직하게는, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 가장 바람직하게는, 100% 서열 동일성을 갖는다. 달리 말하면, 일 실시형태에서, 결합 성분은 서열번호 2와 적어도 85%, 더욱 바람직하게는, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 가장 바람직하게는, 100% 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 명세서에 개시된 결합 성분은 서열번호 1의 VL 서열, 또는 이의 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는 서열번호 1과 적어도 85%, 더욱 바람직하게는, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 가장 바람직하게는, 100% 서열 동일성을 갖는다. 달리 말하면, 일 실시형태에서, 결합 성분은 서열번호 1과 적어도 85%, 더욱 바람직하게는, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 가장 바람직하게는, 100% 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 이러한 결합 성분은 서열번호 2와 적어도 85%, 더욱 바람직하게는, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 가장 바람직하게는, 100% 서열 유사성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 결합 성분은 서열번호 1과 적어도 85%, 더욱 바람직하게는, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 가장 바람직하게는, 100% 서열 유사성을 갖는 VL 서열을 포함한다.
훨씬 바람직한 실시형태에서, 결합 성분은 서열번호 1에 기술된 바와 같은 VL, 및 서열번호 2에 기술된 바와 같은 VH를 포함한다. 서열번호 1 및 서열번호 2 둘 모두의 프레임워크 서열은 WO 03/097697 A호(ESBATech AG)에 기술된 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 이의 VH 및 VL 프레임워크 서열은 토끼 항체의 인간화 및 안정화를 위해 변형되었다[예를 들어, WO 2009/155726 A호(ESBATech, AN ALCON BIOMEDICAL RESEARCH UNIT LLC); Borras, L., et al, JBC 2010, vol. 285(12), p. 9054 참조].
일부 실시형태에서, 결합 성분은 서열번호 12 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의, 바람직하게는, 모든 VL 프레임워크 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 성분은 서열번호 16 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의, 바람직하게는, 모든 VH 프레임워크 서열을 포함한다.
결합 성분은, 예를 들어, scFv 또는 이중특이적 분자, 예를 들어, 텐덤 scFv, 이중체 또는 단쇄 이중체의 경우에, 링커 서열을 포함할 수 있다. scFv의 경우에, 이러한 링커 서열은 통상적으로, 10개 내지 약 25개의 아미노산을 갖는다. 대개, 링커 펩타이드는 글리신에 풍부하여 가요성을 부여할 뿐만 아니라, 가용성을 개선시키기 위해 세린 및/또는 트레오닌에 풍부하다. 바람직한 실시형태에서, (GGGGS)4 링커(서열번호 10) 또는 이의 변이체가 사용된다. 2개 내지 5개의 반복부(repeat)를 갖는 상기 모티프(motif)의 변이가 또한 사용될 수 있다. 추가의 적합한 링커는 예를 들어, 문헌[Alfthan, K., Protein Eng 1995, vol. 8(7), p. 725]에 기술되어 있다.
이에 따라, 일 실시형태에서, 이러한 결합 성분은 서열번호 9를 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나, 가지거나, 본질적으로 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 결합 성분은 서열번호 11을 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나, 가지거나, 본질적으로 포함하거나, 이로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 결합 성분의 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항원 결합, 항체-의존 세포-매개 세포독성(ADCC), 보체-의존 세포독성(CDC)을 개선시키고/거나, 단백질분해에 대한 감수성 및/또는 산화에 대한 감수성을 감소시키고/거나, 안정성 또는 용해도를 증가시키고/거나, 면역원성을 감소시키고/거나, 결합 성분의 다른 생물학적, 생화학적 또는 생물리학적 성질을 변경시키는 것이 요망될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체는 부모 결합 성분에 비해 어떠한 개선도 나타내지 않는다. 변이체는 일부 실시형태에서, 이의 아미노산 서열의 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과의 위치에서, 제공된 결합 성분과는 상이한 단백질성 분자일 수 있다. 이러한 차이는 예를 들어, 치환, 부가, 변형 또는 결실일 수 있다.
본 명세서에 제공된 결합 성분의 변이체는 단백질 및/또는 화학적 공학에 의해, 결합 성분을 암호화하는 핵산 서열 내에 적절합 변형의 도입, 또는 단백질/펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 결실, 치환, 부가, 변형 및 삽입의 임의의 조합(들)은 프레임워크에 또는 CDR에 이루어질 수 있으며, 단, 생성된 결합 성분은 적절한 방법을 이용하여 스크리닝될 수 있는 요망되는 특징을 지닌다. 치환, 바람직하게는, 전술한 바와 같은 보존적 치환이 특별히 고려된다.
본 명세서에 기술된 결합 성분은 하나 이상의, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 초과의 이러한 보존적 치환을 포함할 수 있다.
비-보존적 치환은 예를 들어, 폴리펩타이드의 전하, 쌍극자 모멘트, 크기, 친수성, 소수성 또는 형태에 대해, 보다 실질적인 변화를 야기시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 결합 성분은 하나 이상의, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 초과의 이러한 비-보존적 치환을 포함한다.
변형은 CDR에 및/또는 프레임워크 서열에 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 CDR은 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 변형을 포함한다. 예를 들어, 전체적으로 취해진 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열은 본 명세서에 제공된 CDR, 특히, 서열번호 3, 4, 및 5와 적어도 75%, 바람직하게는, 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 더욱 바람직하게는, 99% 동일하다. 추가적으로 또는 대안적으로, 전체적으로 취해진 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열은 본 명세서에 제공된 CDR, 특히, 서열번호 6, 7 및 8과 적어도 80%, 바람직하게는, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 95%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 더욱 바람직하게는, 99% 동일하다.
일 실시형태에서, 전체적으로 취해진 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3은 본 명세서에 제공된 CDR, 특히, 서열번호 3, 4 및 5와 적어도 85%, 바람직하게는, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 더욱 바람직하게는, 99% 유사하다. 추가적으로 또는 대안적으로, 전체적으로 취해진 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3은 본 명세서에 제공된 CDR, 특히, 서열번호 6, 7 및 8과 적어도 85%, 바람직하게는, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 더욱 바람직하게는, 99% 유사하다.
일 실시형태에서, 변이체는 서열 서열번호 1 내지 19 중 어느 하나에 1, 2, 3 또는 4개의 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 변이체는 서열 서열번호 1, 2, 9 또는 11 중 어느 하나에서 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 치환을 포함한다.
특히 바람직한 타입의 변이체는 하나 이상의 전체 CDR이 대체된 것이다. 통상적으로, CDR-H3 및 CDR-L3은 항원 결합에 가장 크게 기여한다. 예를 들어, 전체 CDR-L1, CDR-L2, CDR-H1 및/또는 CDR-H2는 천연 또는 인공 기원의 상이한 CDR에 의해 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 CDR은 알라닌-카세트에 의해 대체된다.
추가적으로 또는 대안적으로, 항체의 VH는 용해도 향상 점 돌연변이를 포함한다. WO2009/155725호(ESBATech, Novartis Company)에는 항체의 전체 용해도를 증가시키는 것으로 입증된, 모티프가 기술되어 있다. 잔기는 항체의 가변 도메인 및 불변 도메인의 계면에 위치된 위치에 배치되고, 불변 도메인이 결여된, 특히 항체 단편, 예를 들어, scFv를 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 결합 성분의 변이체에서, 하기 잔기들 중 1, 2개 또는 3개 모두가 존재한다:
(i) (AHo 넘버링에 따라) 중쇄 아미노산 위치 12에 세린(S);
(ii) (AHo 넘버링에 따라) 중쇄 아미노산 위치 103에 세린(S) 또는 트레오닌(T); 및/또는
(iii) (AHo 넘버링에 따라) 중쇄 아미노산 위치 144에 세린(S) 또는 트레오닌(T). 바람직한 실시형태에서, 이러한 변이체는 VH 위치 12에 세린; VH 위치 103에서 세린; 및 VH 위치 144 위치에 트레오닌을 갖는다(모두 AHo 넘버링).
추가적으로 또는 대안적으로, 변이체는 본 명세서에 참고로 포함된, EP2158315B1호에서 청구된 바와 같은 하나 이상의 점 돌연변이를 포함할 수 있다.
변이체는 예를 들어, 특히, WO2014/206561호의 VL 프레임워크 서열 서열번호 15 내지 22를 포함하는, 본 명세서에 참고로 포함된 WO2014/206561호에 기술된 바와 같은 변형을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 변이체 결합 성분은,
(i) PD-L1에 대한 특히, hPD-L1에 대한 특이적 결합을 보유하고/거나;
(ii) KinExA®에 의해 측정하는 경우, 100pM 미만, 바람직하게는, 75pM, 50pM, 40pM, 30pM, 20pM 미만, 더욱 바람직하게는, 10pM 미만의 인간 PD-L1에 대한 KD를 가지고/거나(측정은 1가 결합 성분의 경우 실시예 4 또는 2가 결합 성분의 경우 실시예 9에 기술된 조건을 이용하여 이루어짐);
(iii) 마우스 PD-L1과 교차-반응하지 않고/거나;
(iv) 원숭이 PD-L1과 교차-반응하고/거나;
(v) PD-L1에 결합하기 위한 본 명세서에 개시된 결합 성분과 경쟁적이고/거나;
(vi) 본 명세서에 개시된 서열과 적어도 80%, 바람직하게는, 적어도 85%, 90%, 95% 또는 97% 서열 동일성을 갖는다.
변이체는 또한, 경쇄 및 중쇄의 사슬 셔플링(chain shuffling)에 의해 제조될 수 있다. 단일 경쇄는 변이체의 라이브러리를 수득하기 위해 중쇄의 라이브러리와 조합될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 단일 경쇄는 상기에 열거된 VL 서열의 군으로부터 선택되고/되거나, 상기 중쇄 라이브러리는 상기에 열거된 VH 서열들 중 하나 이상을 포함한다. 마찬가지로, 단일 중쇄는 경쇄 라이브러리와 조합될 수 있다. 바람직하게는, 상기 단일 중쇄는 상기에 열거된 VH 서열의 군으로부터 선택되고/되거나 상기 경쇄 라이브러리는 상기에 열거된 VL 서열들 중 하나 이상을 포함한다.
결합 성분은 상기에 언급된 VL 서열 및/또는 VH 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 단일 도메인 포맷, 예를 들어, 나노바디 또는 VHH를 갖는 결합 성분은 상기에 언급된 VL 또는 VH 서열 중 어느 하나, 바람직하게는, VH 서열의 단지 하나를 포함한다. 다가 결합 성분, 특히 F(ab')2 단편, 비스-scFv(또한, 텐덤 scFv로서 알려짐), 이중체, scDb, 삼중체 또는 사중체 등, 바람직하게는, 이중특이적 결합 성분은 상기에 언급된 VL 서열 중 하나 이상 및/또는 상기 언급된 VH 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 성분, 바람직하게는, 1가 항체 단편, 더욱 바람직하게는, scFv가 특히 안정하다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "안정성"은 장시간 항온처리 및/또는 상승된 온도에서의 항온처리 후에 용액 중에 모노머로 잔류하는 폴리펩타이드의 생물리학적 성질을 지칭한다. 불안정한 폴리펩타이드는 다이머화하거나 올리고머화하고 심지어 침전하는 경향이 있어서, 저장 수명을 감소시키고, 약제학적 적용을 위해 덜 적합하게 된다.
본 명세서에 제공된 결합 성분, 및 특히, 상기 1가 항체 단편은 추가적으로 또는 대안적으로, 또한, 22℃ 또는 37℃에서 동일한 조건 하에서 항온처리하였을 때, 4℃의 온도에서 2주 동안 pH 7.2의 완충제 중에서 10 mg/㎖의 농도로 항온처리된 후에, 적어도 85%까지, 바람직하게는, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%까지, 가장 바람직하게는, 95%까지 모노머로 존재한다. 일부 실시형태에서, 결합 성분 및 특히, 상기 1가 항체 단편은 추가적으로 또는 대안적으로, 또한, 22℃ 또는 37℃에서 동일한 조건 하에서 항온처리하였을 때, 4℃의 온도에서 3주 동안 pH 7.2의 완충제 중에서 10 mg/㎖의 농도로 항온처리된 후에, 적어도 85%까지, 바람직하게는, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%까지, 가장 바람직하게는, 97%까지 모노머로 존재한다.
일부 실시형태에서, 결합 성분은 scFv이고, pH 7.2의 PBS 중에서 10 mg/㎖의 농도로 37℃에서 1주 후 또는 2주 후에 3% 미만의 다이머를 형성한다.
모노머의 정도는 예를 들어, SE-HPLC(크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(Size Exclusion HighPerformance Liquid Chromatography))에 의해 결정될 수 있다. 이러한 시험을 위한 적합한 이동상은 예를 들어, pH 7.2의 PBS이다. 모노머 함량은 단백질 크로마토그래피 동안 측정된 UV280 신호의 피크 적분에 의해 정량화될 수 있다. 적합한 시스템은 예를 들어, 또한 후속 크로마토그램 분석 및 피크 정량화를 가능하게 하는 Chromeleon® 6.8 소프트웨어에 의해 제어된 Dionex Summit HPLC이다.
결합 성분, 바람직하게는, 상기 1가 항체 단편, 더욱 바람직하게는, scFv는 4 내지 10, 바람직하게는, 4 내지 9의 범위, 가장 바람직하게는, 약 7.6의 이론적 등전점(isoelectric point)(pI)을 가질 수 있다. 이론적 pI는 예를 들어, ExPASy Server 상의 ProtParam 툴(tool)을 이용함으로써 계산될 수 있다(http://web.expasy.org/protparam/에서 입수 가능함; 또한, GASTEIGER E. et al Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. (In) The Proteomics Protocols Handbook. Edited by Walker J.M. Totowa: Humana Press Inc., 2005. ISBN 9781588295934. p. 571-607 참조).
결합 성분은 동물 모델에서 결합 성분의 시험을 위한 장점을 갖는 비-인간 종으로부터의 PD-L1과 교차-반응적일 수 있다. 바람직하게는, 결합 성분은 원숭이 PD-L1과 교차-반응적이다. 일부 실시형태에서, 원숭이 PD-L1에 대한 scFv 포맷에서 실온에서의 1가 결합 성분의 KD는 KinExA®에 의해 측정하는 경우, 예를 들어, 실시예 5에 명시된 조건 하에서 측정하는 경우, 약 3.3pM이다. 일부 실시형태에서, 결합 성분의 친화력은 인간 PD-L1과 마찬가지로, 원숭이 PD-L1에 대해 적어도 강력하고, 더욱 바람직하게는, 적어도 2배 강력하다. 일부 실시형태에서, 결합 성분은 마우스 PD-L1에 대해 교차-반응적이지 않다. 종종, 제공된 인간 표적에 대한 항체는 덜 가치 있는 생체내 동물 데이터를 설치류에 제공하는 설치류 오쏘로그(rodent ortholog)에 대한 더 낮은 친화력을 갖는다. 본 명세서에 개시된 결합 성분이 인간 및 원숭이 PD-L1에 대해 유사한 KD 값을 갖기 때문에, 생체내 동물 데이터는 인간의 질병을 더 잘 반영할 것으로 기대된다. 추가적으로, 원숭이에 대한 교차 반응성은 원숭이를 독성학 종으로서 사용할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 결합 성분은 B7 패밀리의 다른 구성원(member), 예를 들어, PD-L2 및/또는 B7-H3과 교차-반응적이지 않다. 두 단백질 모두는 PD-L1에 대한 높은 서열 유사성을 가지며, 이에 따라, 이러한 B7 패밀리 구성원에 대한 결합은 안전성 문제를 상승시킬 것이다.
이에 따라, 일부 실시형태에서, 서열번호 1의 적어도 하나의 가변 경쇄 및 서열번호 2의 적어도 하나의 가변 중쇄를 포함하는, PD-L1에 특이적으로 결합하는 결합 성분이 제공되며, 여기서, 상기 결합 성분은 10pM 미만의 인간 PDL1에 대한 평형 결합 상수 KD를 갖는다. 바람직하게는, 상기 결합 성분은 10 mg/㎖ 농도로 PBS 중에서 37℃에서 1주 또는 2주 동안의 항온처리 후에 scFv 포맷에서 모노머를 적어도 95%까지 유지한다. 더욱 바람직하게는, 상기 결합 성분은 마우스 PD-L1에 대해 교차-반응하지 않는다.
본 발명은 인간 PD-L1에 결합시키기 위한 본 명세서에 개시된 결합 성분과 경쟁하는 결합 성분을 제공한다. 예를 들어, 이러한 경쟁(또는 교차-차단) 결합 성분은 중화될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 경쟁 결합 성분은 250pM 또는 그 미만, 예를 들어, 약 100pM, 40pM, 30pM, 20pM 10pM 미만 또는 약 5pM 미만의 인간 PD-L1에 결합하는 평형 결합 상수(KD)를 갖는다. 이에 따라, 일 실시형태에서, 결합 성분은 약 5pM 미만의 KD를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "경쟁하는(competing)"은 동일한 표적에 결합하는 결합 성분들 간의 경쟁을 지칭한다. 경쟁은 고려되는 결합 성분이 동일한 항원(여기에서, PD-L1 또는 이의 단편 각각)에 대한 본 명세서에 개시된 결합 성분의 특이적 결합을 막거나 저해하거나 감소시키는 경쟁적 결합 검정(competitive binding assay)에 의해 결정될 수 있다. 이러한 경쟁적 결합 검정은 당해 분야에 공지되어 있고, 고체상 직접 또는 간접 방사면역검정(RIA) 및 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정(ELISA)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 통상적으로, 이러한 검정은 고체 표면에 결합된 정제된 항원, 시험되는 결합 성분, 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 기준 결합 성분의 사용을 포함한다. 경쟁적 저해는 (i) 시험되는 결합 성분의 존재 하에서 고체 표면에 결합된 기준 결합 성분, 또는 (ii) 기준 결합 성분의 존재 하에서 고체 표면에 결합된 시험되는 결합 성분 중 어느 하나의 양을 결정함으로써 측정된다. 경쟁 결합 성분은 (i) 기준 결합 성분과 동일한 에피토프에, (ii) 중첩 에피토프에, 또는 (iii) 동일한 표적 분자 상에 있지만 이의 표적에 대한 기준 결합 성분의 결합을 입체적으로 방해하는 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
대개, 경쟁 결합 성분이 과량으로 존재할 때, 이는 PD-L1에 대한 본 명세서에 기술된 바와 같은 결합 성분의 특이적 결합을 감소시킬 것이며, 즉, 이는 적어도 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75% 또는 75% 또는 그 초과까지 결합을 교차-차단한다. 바람직하게는, 경쟁 결합 성분의 존재 하에서 본 명세서에 기술된 결합 성분의 결합은 적어도 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 95 내지 97%, 또는 97% 또는 그 초과까지 감소된다.
일 실시형태에서, 결합 성분은 1가, 예를 들어, scFv 또는 Fab 단편이다. 다른 실시형태에서, 결합 성분은 다가이다. 이러한 다가 분자는 2가(예를 들어, 전장 항체 또는 F(ab')2 단편)일 수 있거나, 적어도 3개의 표적 결합 부위를 포함한다. 다가 결합 성분은 이중특이적 항체, 예를 들어, 예컨대, 이중체, 단쇄 이중체, 비스-scFv 또는 DART일 수 있다(예를 들어, Kontermann R.E. Methods in Mol. Biol. Edited by LO, B. Totowa, N.J.: Humana Press, 2004. ISBN 1588290921. p. 227 참조). 상기 이중특이적 항체는 scFv에 대해 전술한 것보다 더 짧은 링커, 즉, 서열번호 10의 염기성 모티프의 단지 1 내지 3개의 반복부를 갖는 짧은 링커를 잘 사용할 수 있다(예를 들어, Holliger, P., et al, PNAS, 1993, vol. 90(14), p.6444 참조). 다른 실시형태에서, 다가 결합 성분은 삼중체, 미니바디, 또는 사중체이다. 다가 결합 성분의 다른 예는 단쇄 이중체, 텐덤 scDb, 선형 다이머 scDb, 환형 다이머 scDb, BiTEs, 텐덤트라이-scFv, 삼중체, 이중특이적 Fab2, 다이-미니항체, scFv-Fc-scFv 융합체, 다이-이중체, DVD-Igs, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fcs, 또는 IgG-scFv 융합체(Bs1Ab, Bs2Ab, Bs3Ab, Bs4Ab, Ts1Ab 및 Ts2Ab, 쿼드로마, 노브-인투-홀(KIH), 이중특이적 항체, CrossMabs 및 DuoBodies를 포함하지만, 이로 제한되지 않음)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 개시내용에 따른 결합 성분은 일부 실시형태에서, 캡처 모이어티, 예를 들어, 스트렙타비딘 결합 태그, 예를 들어, 미국 특허 출원 US 2003/0083474호, 미국 특허 제5,506,121호 또는 제6,103,493호에 기술된 STREP-TAGS®를 포함할 수 있다. 캡처 모이어티의 추가 예는 말토스-결합 단백질, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST), 칼모둘린 결합 펩타이드(CBP), FLAG-펩타이드(예를 들어, 서열 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly), T7 에피토프(Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly), 말토스 결합 단백질(MBP), 단순 포진 바이러스 당단백질 D의 서열 Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp의 HSV 에피토프, 서열 Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys의 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G) 에피토프, 서열 Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala의 혈구응집소(HA) 에피토프, 및 서열 Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu의 전사 인자 c-myc의 "myc" 에피토프를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
캡처 모이어티의 추가 예는 금속 킬레이트제로서, 이는 금속 이온을 결합시킬 수 있다. 개개 캡처 모이어티는 에틸렌디아민, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA), 다이에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), N,N-비스(카복시메틸)글리신(또한 니트릴로트라이아세트산, NTA로 불리워짐), 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산(BAPTA), 2,3-디메르캅토-1-프로판올(-디메르카프롤), 포르핀 또는 헴일 수 있다. 당해 분야에서 사용되는 고정된 금속 친화력 크로마토그래피의 표준 방법에 따라, 예를 들어, 올리고히스티딘 태그는 예를 들어, 킬레이트제 니트릴로트라이아세트산(NTA)에 의해 크로마토그래피 목적을 위해 제시될 수 있는, 구리(Cu2+), 니켈(Ni2+), 코발트(Co2+), 또는 아연(Zn2+) 이온과 착물을 형성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 결합 성분은 PD-L1에 대한 공지된 결합 성분에 비해 더 낮은 면역원성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 결합 성분은 PD-L1에 대한 공지된 결합 성분과는 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 결합 성분은 PD-L1에 대한 공지된 결합 성분과는 상이한 제거율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 결합 성분은 PD-L1에 대한 공지된 결합 성분에 비해 증가된 응집 및/또는 프로테아제 분해에 대한 내성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 결합 성분은 PD-L1에 대한 공지된 결합 성분에 비해 개선된 IC50 및/또는 EC50을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 결합 성분은 PD-L1에 대한 공지된 결합 성분에 비해 개선된 결합 파라미터, 예를 들어, kon, koff 또는 KD를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 결합 성분은 PD-L1에 대한 공지된 결합 성분과는 상이한 종 교차-반응성 패턴을 갖는다. 일부 실시형태에서, 결합 성분은 PD-L1에 대한 공지된 결합 성분과는 상이한 pH 안정성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 결합 성분은 PD-L1에 대한 공지된 결합 성분과는 상이한 명시된 온도에서의 장기 안정성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 결합 성분은 PD-L1에 대한 공지된 결합 성분과는 상이한 조직 능력을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 결합 성분은 PD-L1에 대한 공지된 결합 성분과는 상이한, 이의 수용체 PD-1 및/또는 CD80과의 PD-L1 상호작용의 차단 효능을 갖는다.
또한, PD-L1에 결합에 대한 본 명세서에 개시된 결합 성분과 경쟁하는 결합 성분이 고려된다.
핵산, 벡터, 숙주 세포 및 생산 방법
본 명세서에 기술된 바와 같은 결합 성분은 단일 핵산 서열에 의해 또는 복수의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 복수의 핵산 서열의 경우에, 각 서열은 하나의 가변 영역을 암호화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 둘 이상의 가변 영역을 암호화할 수 있다. 일반적으로, 복수의 핵산 서열은 결합 성분의 가변 영역을 암호화한다. 통상적으로, 각 가변 영역은 하나의 별개의 핵산 서열에 의해 암호화된다. 가변 영역을 암호화하는 개개 핵산 서열은 단일 핵산 분자에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가변 영역을 암호화하는 둘 이상의 핵산 서열은 단일 핵산 분자에 포함된다. 일부 실시형태에서, 가변 영역을 암호화하는 각 핵산 서열은 단일의 별개의 핵산 분자에 포함된다. 이에 따라, 복수의 핵산 분자는 결합 성분, 예를 들어, 각각이 적어도 하나의 가변 영역을 암호화하는 결합 성분의 생산에서 사용될 수 있다. 개개 핵산 분자는 일부 실시형태에서, 발현 카세트를 규정할 수 있다. 상기에 명시된 바와 같이, 발현 카세트는 적절한 숙주 세포에서 특정 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도할 수 있는 핵산 분자이다.
발현 카세트는 하나 이상의 종결 신호에 작동 가능하게 연결된, 고려되는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터(promoter)를 포함한다. 이는 또한, 뉴클레오타이드 서열의 적절한 번역을 위해 요구되는 서열을 포함할 수 있다. 코딩 영역은 고려되는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있고, 또한, 센스 또는 안티센스 방향에서, 안티센스 RNA 또는 비-번역된 RNA를 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 고려되는 기능성 RNA를 암호화할 수 있다. 고려되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있으며, 이는 이의 성분들 중 적어도 하나가 이의 다른 성분들 중 적어도 하나와 관련하여 이종 기원임의 의미한다. 발현 카세트는 또한, 자연 발생인 것일 수 있지만, 이종 발현을 위해 유용한 재조합 형태로 얻어졌다. 그러나, 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 숙주에 대해 이종 기원이며, 즉, 발현 카세트의 특정 핵산 서열은 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않고, 형질전환 사건에 의해 숙주 세포 또는 숙주 세포의 선조(ancestor)내로 도입되었다. 발현 카세트에서 뉴클레오타이드 서열의 발현은 구성 프로모터(constitutive promoter) 또는 숙주 세포가 일부 특정 외부 자극에 노출될 때에만 전사를 개시하는 유도성 프로모터(inducible promoter)의 조절 하에서 이루어질 수 있다. 식물 또는 동물과 같은 다세포 유기체의 경우에, 프로모터는 또한, 특정 조직, 장기, 또는 발달 단계에 특이적일 수 있다.
결합 성분 또는 이의 부분의 서열을 알고 있는 경우에, 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 cDNA는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 유전자 합성에 의해 발생될 수 있다. 이러한 cDNA는 표준 클로닝 및 돌연변이유발 기술에 의해 적합한 벡터, 예를 들어, 발현 벡터 또는 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 선택적으로, 항체의 가변 중쇄에 비해 가변 경쇄가 항체의 별개의 벡터에 의해 암호화된다. 또한, 추가적인 서열, 예를 들어, 태그(예를 들어, His-태그), Fab 또는 전장 항체의 생산을 위한 불변 도메인, 링커, 제2 결합 특이성의 코딩 서열, 또는 융합 작제물 또는 이중특이적 분자를 생성시키기 위한 효소와 같은 다른 기능적 폴리펩타이드가 유전적 작제물내에 포함될 수 있다.
선택된 클로닝 전략을 기초로 하여, 유전적 작재물은 N-말단 또는 C-말단 단부에 하나 이상의 추가적인 잔기를 갖는 결합 성분을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 출발 코돈 또는 추가 알라닌으로부터 유래된 N-말단 메티오닌은 번역후 단축되지 않는 한, 발현된 폴리펩타이드에 존재할 수 있다. 이에 따라, 본 명세서에 개시된 항체가 개시된 서열로 이루어지기 보다는 개시된 서열을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 이에 따라, 일 실시형태에서, 결합 성분은 서열번호 9의 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 결합 성분은 서열번호 11의 서열을 포함한다. 결합 성분이 배향 VH-링커-VL을 갖는 scFv 또는 VH가 N-말단에 배치되는 임의의 다른 항체 단편인 경우에, 분자의 VH 서열 부분은 N-말단에 메틸화될 수 있다. 이에 따라, 일 실시형태에서, 서열번호 2는 N-말단 메티오닌을 갖는다.
표준 클로닝, 돌연변이유발 및 분자 생물학 기술의 기초 프로토콜은 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Green M. and Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 4th edition. Cold Spring Harbor Laboratory, 2012. ISBN 1936113422)]에 기술되어 있다.
또한, 엄격한 조건 하에서 본 명세서에 기술된 핵산과 혼성화하는 단리된 핵산이 또한 고려된다.
또한, 본 명세서에 개시된 결합 성분을 재조합으로 발현시키는 세포가 고려된다. 유전적 작제물의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 원핵성 또는 진핵성일 수 있다. 적합한 원핵성 숙주 세포는 그램-음성 또는 그램-양성이고, 에쉐리히아(Escherichia), 에르비니아(Ervinia), 엔테로박터(Enterobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 슈도모나스(Pseudomonas) 또는 바실러스(Bacillus) 패밀리의 종을 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 대장균, 예를 들어, 대장균 균주 BL21(DE3)(예를 들어, Invitrogen, 미국 소재, 카탈로그 번호 C600003) 및 Origami™ 2(DE3)(예를 들어, Novagen, 미국 소재, 카탈로그 번호 71345-3) 중 하나 이상이다.
번역후 변형, 예를 들어, 글리코실화 또는 포스포릴화가 요망되는 경우에, 진핵성 숙주 세포를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 진핵성 미생물, 예를 들어, 일반적으로 사용되는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주는 숙주 세포로서 역할을 할 수 있다. 숙주 세포의 적합한 예는 또한, 식물 또는 동물 세포, 특히, 곤충 또는 포유류 세포를 포함한다. 적합한 포유류 세포는 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 인간 배아 신장 세포(HEK), 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC) 또는 NS0 골수종 세포를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 원핵성 숙주 세포에서 글리코실화는 또한, 문헌[예를 들어, Jaffe S.R.P. et al, Curr. Opin. Biotechnol. 2014, vol. 30, p. 205 참조]에 보고되었다.
결합 성분은 적합한 숙주 세포에서 발현에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 전술한 발현 벡터는 전기영동 또는 화학적 형질전환과 같은 표준 기술에 의해 숙주 세포내에 도입된다. 형질전환된 세포는 이후에 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하거나 고려되는 암호화 서열을 증폭시키기 위해 선택적으로 변형된, 통상적으로 적절한 영양 배지에서 재조합 단백질 발현을 위해 적절한 조건 하에서 배양된다. 결합 성분은 배양물로부터 회수되고, 선택적으로, 당해 분야의 표준 기술을 이용하여 정제된다. 재조합 단백질의 수율은 배지 및 배양 조건, 예를 들어, 온도 또는 산소 공급을 최적화함으로써 개선될 수 있다. 원핵 생물에서, 결합 성분은 주변 세포질에서, 세포내로 봉입체로서 생성되거나 배지내로 분비될 수 있다. 동물 세포는 통상적으로 결합 성분을 배지내로 분비할 것이다. 수확 시에, 단백질은 젤 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 소수성 상호작용, 혼합 모드 크로마토그래피 및/또는 친화력 크로마토그래피와 같은 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 정제될 수 있다.
일 실시형태에서, 결합 성분은 무-세포 시스템에서 생성된다. 이는 통상적으로, 시험관내 전사, 이후에, 본 명세서에 기술된 바와 같은 단백질을 암호화하는 핵산 생성물 주형, 예를 들어, 플라스미드 DNA 또는 PCRT 생성물 주형의 시험관내 번역을 포함한다. 예를 들어, 성장하는 세포로부터의 미정제 용해물이 사용되어, 필수적인 효소뿐만 아니라 세포 단백질 합성 기계를 제공한다. 필수적인 빌딩 블록, 예를 들어, 아미노산 또는 핵염기뿐만 아니라 에너지 전달 분자 등은 외인성으로 공급될 수 있다. 무-세포 발현 시스템은 예를 들어, 용해된 토끼 망상 적혈구(예를 들어, Rabbit Reticulocyte Lysate System, Promega, 카탈로그 번호 L4540), HeLa 세포(예를 들어, 1-Step Human In Vitro Translation Kit, 88881, Thermo Scientific), 곤충 세포(예를 들어, EasyXpress Insect Kit II, 32561, Qiagen), 맥아(예를 들어, Wheat Germ Extract, L4380, Promega), 또는 대장균 세포(예를 들어, PURExpress® In Vitro Protein Synthesis Kit, E6800S, NEB)를 기초로 할 수 있다. 또한, 개선된 디설파이드 결합 생성을 위한 최적화된 무-세포 항체 발현 시스템이 생산을 위해 사용될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 키트는 곤충 세포 용해물(예를 들어, EasyXpress Disulfide Insect Kit, 32582, Qiagen) 또는 대장균 세포 용해물(예를 들어, EasyXpress Disulfide E. coli Kit, 32572, Qiagen)을 포함한다. 무-세포 단백질 합성은 예를 들어, 빠르고, 높은 생성물 수율을 달성하고, 반응 조건의 용이한 변형을 가능하게 하고, 낮은 정도의 부산물을 형성하거나 심지어 부산물을 형성하지 않는다는 장점을 갖는다. 무-세포 단백질 합성은 순전히 생물학적 또는 화학적 생산 시스템에서 수행될 수 없는 생물학적 및/또는 화학적 단계를 수반할 수 있다. 예를 들어, 비-천연 또는 화학적으로-개질된 아미노산은 요망되는 위치에서 단백질 내에 도입될 수 있다. ScFv-독소 융합 단백질은 무-세포 시스템에서 성공적으로 생산되었다(Nicholls, P. J., et al, JBC 1993, vol. 268, pp. 5302-5308). 이에 따라, 일 실시형태에서, (a) 무-세포 시스템을 제공하는 단계, (b) 상기 결합 성분을 암호화하는 핵산 생성물 주형을 제공하는 단계, (c) 핵산 생성물 주형을 전사시키고 번역하는 단계, (d) 결합 성분을 회수하는 단계, 및 선택적으로 (e) 결합 성분을 각각 정제하는 단계를 포함하는, 본 명세서에 기술된 결합 성분을 생산하는 방법이 제공된다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 명세서에 기술된 결합 성분을 생산하는 방법은 화학적 합성의 적어도 하나의 단계를 포함한다. 예를 들어, 이러한 방법은 전부 화학적일 수 있다. 다른 실시형태에서, 전술한 세포-기반 또는 무-세포 생산 시스템은 화학적 합성의 이러한 적어도 하나의 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 결합 성분은 대장균에서 세포내 발현을 위한 발현 벡터를 사용하여 세포-기반 시스템에서 생산된다. 발현 시에, 폴리펩타이드는 추가 세포 입자로부터 분리되고 이후에 변성제, 예를 들어, 구아니딘 하이드로클로라이드(GndHCl)에 가용화된 숙주 세포내에 봉입체로서 생성되고, 당업자에게 널리 공지된 재생 절차에 의해 재폴딩된다.
요망되는 결합 성분은 또한, 형질전환 동물에서 생성될 수 있다. 적합한 형질전환 동물은 예를 들어, (i) 예를 들어, 결합 성분의 코딩 서열뿐만 아니라 적합한 대조 서열을 달걀내에 포함시키는 DNA 작제물을 미세주입함으로써 형질전환 배아를 제조하는 단계; (ii) 달걀을 모의-임신한 수용체 암컷으로 옮기는 단계; (iii) 잉태(gestation) 또는 임신(pregnancy)을 모니터링하는 단계; 및 (iv) 요망되는 항체를 발현시키는 후손(descendant)을 선택하는 단계를 포함하는, 표준 동물에 따라 얻어질 수 있다.
전술한 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 생산 방법이 또한, 본 명세서에 기술된 결합 성분(이러한 것이 단백질인 한)에 적용하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 또한, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 세포가 고려된다. CAR 발현 세포는 암 치료에서 충분한 사용을 확인하였다. 자가 또는 동족이계 기원 중 어느 하나의 이러한 세포는 예를 들어, 렌티바이러스 벡터로 세포를 형질전환시킴으로써, CAR를 발현시키도록 유전적으로 변형된다. 세포는 통상적으로 T 세포이며, NK 세포는 또한 사용을 발견하였다. CAR은 통상적으로, 항원 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인, 동시자극 신호전달 도메인, 및 신호전달 도메인을 포함하는, 여러 섹션을 갖는다.
세포외 항원-결합 도메인은 대개, 암 세포 상에서의 제공된 표적 단백질을 특이적으로 인식한다. 표적에 결합 시에, CAR 세포는 활성화되고, 또한 암 세포 부근에 유지된다. 항원-결합 도메인은 스페이서를 통해 막관통 도메인에 연결되고, 이는 이후에, 세포내 동시자극 신호전달 도메인에 연결된다. 스페이서의 길이는 항원-결합 도메인 및 이의 표적 단백질의 특징에 따라, 최적화되어야 할 수 있다. 암 세포에 대한 표적의 결합은 신호전달 도메인, 예를 들어, CD3 제타 신호전달 도메인에 의해 활성화 신호를 야기시키는 형태 변화(conformational change)를 촉발시킨다. 통상적으로, 막관통 도메인과 신호전달 도메인 사이에 위치된 동시자극 신호전달 도메인은 활성화 신호를 증폭시키는 역할을 한다. 동시자극 신호전달 도메인의 예시적인 실시형태는 CD28 또는 4-1BB이다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 본 명세서에 기술된 바와 같은 VL 서열 및/또는 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 본 명세서에 기술된 바와 같은 scFv를 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR 발현 세포는 "장갑 CAR" 세포, 즉, CAR 세포가 투여된 대상체의 종양 미세환경 내에서 면역 반응을 변형시키기 위해 가용성 단백질을 분비하는 CAR 발현 세포이다. 일부 실시형태에서, 이러한 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 결합 성분, 특히, scFv를 분비한다.
화학적 및/또는 생물학적 변형
일 양태에서, 본 명세서에 개시된 결합 성분은 화학적으로 및/또는 생물학적으로 변형된다. 이러한 변형은 글리코실화, PEG화, HES화, 알부민 융합 기술, PAS화, 염료 및/또는 방사성 동위원소로의 표지화(labelling), 효소 및/또는 독소과의 컨쥬게이션, 포스포릴화, 하이드록실화 및/또는 설페이트화를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 마찬가지로, 전술한 임의의 결합 성분, 핵산 서열, 벡터 및/또는 숙주 세포는 이에 따라 변형될 수 있다.
화학적 및/또는 생물학적 변형은 단백질의 약력학 또는 수용해도를 최적화하거나 이의 부작용을 낮추기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, PEG화, PAS화 및/또는 HES화는 신장 제거율을 늦추고 이에 의해 결합 성분의 혈장 반감기를 증가시키기 위해 적용될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 변형은 단백질에 대한 다른 기능성, 예를 들어, 더욱 효율적인 대항 암세포에 대한 독소, 또는 진단 목적을 위한 검출 분자를 부가할 수 있다.
글리코실화는 단백질에 탄수화물을 부착시키는 과정을 지칭한다. 생물학적 시스템에서, 이러한 과정은 동시-번역 및/또는 번역후 변형의 형태로서 세포내에서 효소적으로 수행된다. 단백질, 여기에서, 결합 성분, 예를 들어, 항체는 또한, 화학적으로 글리코실화될 수 있다. 통상적으로, 그러나, 비제한적으로, 글리코실화는 (i) 아스파라긴 또는 아르기닌 측쇄의 질소에 N-연결되거나; (ii) 세린, 트레오닌, 티로신, 하이드록시라이신, 또는 하이드록시프롤린 측쇄의 하이드록시 산소에 O-연결되거나; (iii) 포스포-세린에 대한 자일로스, 푸코스, 만노스, 및 N-아세틸글루코사민의 부착을 수반하거나; (iv) 만노스 당이 특정 인식 서열에서 발견된 트립토판 잔기에 첨가된 C-만노실화 형태이다. 글리코실화 패턴은 예를 들어, 적절한 세포주, 배양 배지, 단백질 공학 제조 모드 및 공정 전략을 선택함으로써 조절될 수 있다(HOSSLER, P. Optimal and consistent Protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology 2009, vol. 19, no. 9, p. 936-949.). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 결합 성분의 글리코실화 패턴은 ADCC 및 CDC 효과기 기능을 향상시키기 위해 변형된다.
글리코실화 패턴을 조절하거나 변경시키기 위한 단백질 공학은 하나 이상의 글리코실화 부위의 결실 및/또는 부가를 수반할 수 있다. 글리코실화 부위의 생성은 결합 성분의 아미노산 서열 내에 상응하는 효소 인식 서열을 도입함으로써 또는 상기 나열된 아미노산 잔기 중 하나 이상을 부가하거나 치환함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
결합 성분을 PEG화하는 것이 바람직할 수 있다. PEG화는 단백질의 약력학 및 약동학적 성질을 변경시킬 수 있다. 적절한 분자량의 폴리에틸렌-글리콜(PEG)은 단백질 골격에 공유 결합된다(예를 들어, Pasut G. and Veronese F. State of the art in PEGylation: the great versatility achieved after forty years of research. J. Control Release, 2012, vol. 161, no. 2, p.461 참조). PEG화는 추가적으로, 면역계로부터 PEG화된 단백질을 차폐시킴으로써 면역원성을 감소시킬 수 있고/있거나, 예를 들어, 결합 성분의 생체내 안정성을 증가시키고 이를 단백질 가수분해 분해로부터 보호하고, 이의 반감기를 연장시키고 이의 생체분포를 변경시킴으로써 이의 약동학을 변경시킬 수 있다.
유사한 효과는 예를 들어, 항체를 HES화시키거나 PAS화시키는, PEG 모방체(mimetic)에 의해 달성될 수 있다. HES화는 하이드록시에틸 전분("HES") 유도체를 사용하며, PSA화 동안, 항체는 아미노산 프롤린, 알라닌 및 세린으로 이루어진 형태학적으로 불규칙화된(conformationally disordered) 폴리펩타이드 서열에 연결된다. 이러한 PEG 모방체 및 관련된 화합물은 예를 들어, 문헌[Binder U. and Skerra, A. Half-Life Extension of Therapeutic Proteins via Genetic Fusion to Recombinant PEG Mimetics, in Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives. Edited by Kontermann R., Weinheim, Germany: Wiley-VCH, 2012. ISBN: 9783527328499. p. 63]에 기술된다.
결합 성분은 구제 수용체 결합 에피토프와 같은 에피토프를 포함할 수 있다. 이러한 구제 수용체 결합 에피토프는 통상적으로, IgG 분자(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭하고, 분자의 생체내 반감기를 증가시키는 효과를 갖는다.
추가적으로 또는 대안적으로, 결합 성분은 표적 결합 후 보조 기능을 나타내는 제2 모이어티와 표지화되거나 여기에 접합된다. 제2 모이어티는 예를 들어, 추가적인 면역학적 효과기 기능을 가질 수 있거나, 약물 표적화에서 효과적이거나, 검출에 유용할 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 제2 모이어티는 예를 들어, 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 결합 성분에 화학적으로 연결되거나 유전적으로 융합될 수 있다.
제2 모이어티로서 역할을 할 수 있는 분자는 방사성 핵종(또한, 방사성 동위원소로서 지칭됨), 아포효소(apoenzyme), 효소, 보조-인자, 펩타이드 모이어티, 예를 들어, HIS-태그, 단백질, 탄수화물, 예를 들어, 만노스-6-포스페이트 태그, 형광단(fluorophore), 예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리스린, 녹색/청색/적색 또는 다른 형광 단백질, 알로피코시아닌(APC), 발색단, 비타민, 예를 들어, 바이오틴, 킬레이트제, 대사길항물질, 예를 들어, 메토트렉세이트, 리포솜, 독소, 예를 들어, 세포독성 약물, 또는 방사성 독소를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 방사성 핵종의 예시적인 예에는 35S, 32P, 14C, 18F, 및 125I가 있다. 적합한 효소의 예는 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다아제 및 안지오제닌을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 적합한 단백질의 예시적인 예는 레시틴이다. 적합한 세포독성 약물의 예는 탁솔, 그라미시딘 D 및 콜히친을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
표지된 결합 성분은 시험관내 및 생체내 검출 또는 진단 목적을 위해 특히 유용하다. 예를 들어, 적합한 방사성 동위원소, 효소, 형광단 또는 발색단으로 표지된 결합 성분은 각각 방사면역검정(RIA), 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA), 또는 유동 세포 분석법-기반 단세포 분석(예를 들어, FACS 분석)에 의해 검출될 수 있다. 유사하게, 본 명세서에 개시된 핵산 및/또는 벡터는 예를 들어, 혼성화 검정에서 프로브로서 이의 표지된 단편을 사용하여 검출 또는 진단 목적을 위해 사용될 수 있다. 표지화 프로토콜은 예를 들어, 문헌[Johnson I. and Spence, M. T.Z. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. Life Technologies, 2010. ISBN: 0982927916]에서 확인될 수 있다.
조성물
본 명세서에 개시된 바와 같은 결합 성분, 핵산 서열 및/또는 벡터는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 조성물에 제공될 수 있다. 통상적인 실시형태에서, 개개 조성물은 본 명세서에 기술된 항체를 포함한다.
이러한 조성물은 예를 들어, 진단, 화장 또는 약제 조성물일 수 있다. 치료 또는 화장 목적을 위하여, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 즉, 사용되는 투여량 및 농도에서 독성을 나타내지 않는, 약제 조성물이다.
적합한 "담체", "부형제" 또는 "희석제"는 (i) 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 등, 유기산; (ii) 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 및 토코페롤; (iii) 보존제, 예를 들어, 3-펜탄올, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤질 알코올, 알킬 파라벤, 카테콜, 또는 사이클로헥산올; (iv) 아미노산, 예를 들어, 예컨대, 히스티딘, 아르기닌; (v) 펩타이드, 바람직하게는, 10개 이하의 잔기, 예를 들어, 폴리라이신; (vi) 단백질, 예를 들어, 소 또는 인간 혈청 알부민; (vii) 친수성 폴리머, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; (viii) 글루코스, 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 소르비톨, 아미노덱스트란 또는 폴리아미도아민을 포함하는, 단당류, 이당류, 다당류 및/또는 다른 탄수화물; (ix) 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA; (x) 염-형성 이온, 예를 들어, 나트륨, 칼륨 및/또는 클로라이드; (xi) 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); (xii) 이온성 및 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및/또는 (xiii) 동결보존제, 예를 들어, 다이메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
다수의 예시적인 화합물은 상이한 기능을 가지고, 예를 들어, 담체로서 및 희석제로서 작용할 수 있다. 또한, 조성물이 각 담체, 희석제 또는 부형제 중 하나 초과를 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
결합 성분, 핵산 서열, 또는 벡터는 비드, 마이크로입자 또는 나노입자와 같은 고체 지지 물질 상에 제공될 수 있다. 통상적으로, 결합 성분 분자는 공유 결합(선택적으로, 링커를 포함함), 비공유 결합 또는 둘 모두를 통해 이러한 담체에 연결된다. 이러한 비드 및 마이크로입자는 예를 들어, 전분, 셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 폴리아세테이트 폴리글리콜레이트, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 라텍스, 또는 덱스트란을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 전술한 바와 같은 결합 성분, 핵산 서열 또는 벡터를 포함하는 약제 조성물이 제공된다. 또한, 조성물은 치료적 유효량의 하나 이상의 추가 치료학적 활성 화합물을 포함할 수 있다. 추가 치료학적 활성 화합물은 일부 실시형태에서, PD-L1-매개 질병에 대해 활성인 화합물이다.
치료 적용
본 명세서에 기술된 분자, 특히, 결합 성분(예를 들어, 항체), 핵산 분자, 숙주 세포 또는 벡터는 약제로서 유용하다. 통상적으로, 이러한 약제는 치료적 유효량의 본 명세서에 제공된 바와 같은 분자 또는 세포를 포함한다. 이에 따라, 개개 분자 또는 숙주 세포는 하나 이상의 PD-L1 관련 장애의 치료에서 유용한 약제의 생산을 위해 사용될 수 있다.
일 양태에서, PD-L1 관련/PD-L1 매개 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 본 방법은 이를 필요로 하는 대상체에, 약제학적 유효량의 본 명세서에 기술된 바와 같은 분자 또는 숙주 세포, 특히, 항체 또는 숙주 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 이러한 약제학적 유효량의 결합 성분, 예를 들어, 항체, 또는 숙주 세포를 포함하는, 전술한 약제 조성물은 대상체에 투여된다. 상기에 지칭된 약제는 대상체에 투여될 수 있다.
치료를 필요로 하는 대상체는 인간 또는 비-인간 동물일 수 있다. 통상적으로, 대상체는 포유류, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 개, 고양이, 원숭이, 유인원, 염소, 양, 말, 닭, 기니아 피그 또는 돼지이다. 통상적인 실시형태에서, 대상체는 PD-L1-관련 장애로 진단되거나 이러한 장애를 얻을 수 있다. 동물 모델의 경우에, 동물은 PD-L1 관련 장애를 일으키기 위해 유전적으로 조작될 수 있다. 동물 모델에서, 동물은 또한, PD-L1 매개 질병의 특징을 나타내는 방식으로 유전적으로 조작될 수 있다.
NSCLC(비소세포 폐암종), 요로 상피암, 흑색종, 신장 세포 암종, 호지킨 림프종, 두경부 편평세포 암종, 난소암, 위장암, 간세포암, 신경교종, 유방암, 림프종, 소세포 폐암종, 골수이형성 증후군, 전립선암, 방광암, 자궁경부암, 비-투명 세포 신장암, 대장암, 육종, 결장암, 신장암, 폐암, 췌장암 또는 위암, 피부암, 자궁암, 교아 세포종, 백혈병, 암종, 메르켈 세포 암종 또는 신장 세포 암종(RCC), 혈액암, 다발성 골수종, 림프모구 백혈병(ALL), B 세포 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 및 난소암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, PD-L1의 길항제가 치료 효과를 나타내는, 다양한 PD-L1 관련 장애가 공지되어 있으며, 여기서, 상기 질병은 전신 홍반성 루푸스가다.
PD-1 경로는 또한, 패혈증 및 관련된 장애에 관여하는 것으로 나타났다(예를 들어, WO2015038538호 참조). 이에 따라, 일 실시형태에서, PD-L1 관련 질병은 패혈증, 패혈성 쇼크, 전신성 염증 반응 증후군, 또는 상보적 항-염증 반응 증후군이다.
문헌[Bodhankar et al ((2015) Stroke 46(10): 2926-34)]에는 실험 뇌졸중의 중간 대뇌 동맥 폐색 마우스 모델에서 항-PD-L1 단클론성 항체로의 치료의 유리한 치료 효과가 입증되어 있다.
PD-1 및 PDL-1은 원발성 중추 신경계 림프종에서 면역조직화학적으로 검출 가능하고, 면역저해 미세환경의 생성에 관여될 수 있다(Berghoff et al, (2014) Clinical Neuropathology 33(1):42-9). 이러한 질병에서 실험 치료 방법으로 특정 면역 관문 저해제가 고려될 수 있다.
이식후 환경에서 급성 백혈병에 대한 PD-1/PD-L1 상호작용의 영향은 마우스 및 인간 둘 모두에서 평가되었다. 문헌[Koestner et al ((2011), Blood 117(3): 1030-1041)]에서는 마우스 모델에서 PD-L1 차단에 의한 이식편대숙주 질병을 촉발시키지 않으면서 이식편대림프종 효과의 복원이 관찰되었다. 조혈 줄기 세포의 이식 후 조기에 유전자-변형된 동종이계 T 세포의 입양 전달은 이식편대숙주 질병 없이 강력한 이식편대림프종 효과를 제공하였으며, 나중의 입양 전달은 동시 PD-L1 차단만으로 효과적이었다. T 세포는 수용자 백혈병-특이적 항원에 대해 T-세포 수용체(TCR)를 발현시키기 위해 조작되었다.
약제 조성물은 하나 이상의 다양한 적합한 투여 경로에 의해 적용될 수 있다. 투여는 예를 들어, 비경구로 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 근육내로 수행된다. 일부 실시형태에서, 투여는 정맥내로 볼루스(bolus)로서 또는 연속 주입에 의해 수행된다. 투여는 일부 실시형태에서, 예를 들어, 관절내, 활막내, 피하내, 국소로(예를 들어, 피부 또는 안구에), 비경구로, 직장으로, 피부내로, 피하로, 경피로, 피부로, 또는 국소로 수행된다. 추가의 적합한 투여 모드는 대뇌로, 뇌척수내로, 척추강내로, 경막외로, 또는 복강내로, 경구로, 비뇨생식기로, 유리체내로, 전신으로, 정맥내로, 복강내, 근육내로, 안구내, 귀로, 비강내로, 흡입에 의해, 설하로, 두개내로, 근육내로, 복강내로, 또는 협측을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본 명세서에 개시된 결합 성분, 본 명세서에 개시된 핵산 서열, 벡터 또는 숙주 세포는 하나 이상의 추가의 치료학적으로 효과적인 화합물과 조합될 수 있다. 이러한 화합물은 일부 실시형태에서, PD-L1 수용체를 통해 신호전달을 방해할 수 있을 수 있다. 개개 화합물은 일부 실시형태에서, 예를 들어, 염증 반응의 다른 매개체와 같은 하나 이상의 추가적인 표적을 저해할 수 있을 수 있다. 이러한 화합물(들)은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
치료 적용을 위하여, 결합 성분은 또한, 방사성표지되거나, 독소에 연결되거나, 전술한 바와 같은 다른 효과기 기능에 연결될 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에 기술된 결합 성분의 치료 용도는 항체 요법, 화학요법, 사이토카인 요법, 수지상 세포 요법, 유전자 요법, 호르몬 요법, 레이저광 요법, 방사선 요법 또는 백신 요법의 군으로부터 선택된 하나 이상의 치료법과 조합하여 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 결합 성분은 하나 이상의 상이한 약제학적 화합물과 조합하여 투여된다. 예시적인 예는 CTLA-4 저해제(예를 들어, 트레멜리무맙 및/또는 이필리무맙), VEGF 저해제(예를 들어, 베바시주맙), EGF 수용체 저해제(예를 들어, 에를로티닙), 세포 증식 저해제(cytostatic)(예를 들어, 시스플라틴, 페메트렉세드, 카르보플라틴, 및/또는 파클리탁셀), IFN-g, 암, 백신, 가용성 CD80 또는 이들의 조합을 포함한다. 하나 이상의 약제학적 화합물과 조합한 항-PD-L1 항체를 수반하는 임상 연구의 개요는 문헌[He J et al (2015), Nature Scientific Reports; 5: 13110; DOI: 10.1038/srep13110]에 제공된다. 조합하여 투여될 수 있는 화학치료제는 알킬화제, 대사실항물질, 항종양 항생제, 알칼로이드, 니트로소우레아제, 토포아이소머라아제 저해제, 호르몬 또는 이의 길항제, 아로마타제 저해제, P-당단백질 저해제 및/또는 백금 착물 유도체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 화학치료제의 예시적인 실시형태에는 겜시타빈, 사이클로프스파민, 5-플루오로우실, 옥살리플라틴이 있다.
문헌[Black et al (2016) Oncotarget 7(9): 10557-67]에는 PD-1/PD-L1 면역 관문의 활성화가 전이 증가와 관련된 종양 세포 화학적 내성을 부여하는 PD-L1-발현 인간 및 마우스 유방 및 전립선 암 세포주의 패널에 나타났다. 이는 또한, 항-PD-1 항체를 사용한 PD-1/PD-L1 축의 저해가 전이성 유방암의 동계 유선 동소 마우스 모델에서의 전이를 저해하기 위해 독소루비신 화학요법을 향상시킴을 나타내었다. 이는 화학요법 및 면역 관문 차단의 조합이 화학내성 및 전이성 질병에 대한 진행을 제한할 수 있다고 결론지었다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 항체는 만성 바이러스 감염증을 갖는 대상체에 백신과 조합하여 투여된다. 뮤린 모델에서, 치료 백신 접종과 조합하여, 배출된 CD8+ T 세포에서 PD-1/PD-L1 저해 신호의 차단이 기능적 CD8+ T 세포 반응을 상승적으로 향상시키고 심지어 CD4(+) T 세포 도움 없이도 바이러스 조절을 개선시킨다는 것이 밝혀졌다(예를 들어, Ha SJ et al, J Exp Med. 2008 Mar 17; 205(3):543-55 및 EP2079760B1호 참조). 대상체는 아데노바이러스 시토메갈로바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 파보바바이러스, 파필로마바이러스, 파르보바이러스, T 세포 백혈병 바이러스, T-림프종 바이러스(HTLV) 및/또는 바리셀라-조스터 바이러스로의 만성 바이러스 감염증을 가질 수 있다.
또한, 종양 또는 종양 세포를 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 결합 성분과 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 또는 종양 세포의 성장을 저해하는 방법이 고려된다. 일 실시형태에서, 투여는 종양 성장을 감소시키며, 다른 실시형태에서, 투여는 종양 크기를 감소시킨다.
진단 적용 및/또는 검출 목적
본 명세서에 개시된 바와 같은 결합 성분은 시험관내 및/또는 생체내에서 검출 또는 진단 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 세포 또는 조직에서 발현을 검출하기 위한 항체를 수반하는 광범위한 면역검정은 당업자에게 알려져 있다. 마찬가지로, 앞의 텍스트에 기술된 임의의 결합 성분, 핵산 서열, 벡터 및/또는 숙주 세포는 이에 따라 이러한 섹션에서 상세히 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.
종양 PD-L1의 발현 상태는 흑색종, 신장 세포 암종, 및 비소세포 폐암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 다수의 종양 타입에서 예후인자인 것으로 나타났다. PD-L1 발현은 항-PD-L1 항체가 필수적인 면역조직화학(IHC)에 의해 측정될 수 있다.
이러한 적용을 위하여, 본 명세서에 개시된 결합 성분(예를 들어, 항체), 핵산 서열, 벡터 또는 숙주 세포는 검출 가능한 라벨을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 결합 성분, 핵산 서열, 벡터 또는 숙주 세포는 검출 가능한 라벨을 포함하지 않는다. 예시적인 예로서, 표지되지 않은 항체가 결합 성분, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 항체 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 2차 항체에 의해 사용되고 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, 결합 성분, 핵산 서열, 벡터 및/또는 숙주 세포는 검출기 물질에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 물질에 결합된다. 일 예로서, 결합 성분은 바이오틴에 공유 결합될 수 있으며, 이는 스트렙타비딘에 결합하는 이의 능력에 의해 검출될 수 있다. 마찬가지로, 본 명세서에 개시된 핵산 및/또는 벡터는 예를 들어, 혼성화 검정에서 프로브로서 이의 표지된 단편을 사용함으로써 검출 또는 진단 목적을 위해 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 분자, 특히, 항체는 샘플, 바람직하게는, 생물학적 기원의 샘플에 PD-L1의 존재를 검출하는 데 유용하다. 이러한 맥락에서 사용되는 용어 "PD-L1"은 전장 PD-L1, 이의 단편 및/또는 이의 전구체를 포함한다. 용어 "검출하는(detecting)"은 정량적 및/또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 인간 환자로부터의 세포 또는 조직을 포함한다. 생물학적 샘플의 비제한적인 예는 혈액, 소변, 뇌척수액, 생검, 림프, 및/또는 비-혈액 조직을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 방법은 존재하는 경우에, 이의 표적 PD-L1에 저해제의 결합을 허용하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 본 명세서에 기술된 바와 같은 PD-L1에 대한 결합 성분(예를 들어, 항-PD-L1 항체)과 접촉시키고, 저해제-표적 착물을 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 결합 성분은 본 명세서에 기술된 결합 성분으로 치료할 수 있는 대상체를 선택하기 위해 사용되며, 예를 들어, 여기서, PD-L1은 환자의 선택을 위한 바이오마커이다.
다른 양태에서, 결합 성분, 예를 들어, 항체는 화장품 적용에서, 예를 들어, 피부의 심미적 외관을 개선시키기 위해 사용된다.
마찬가지로, 전술한 핵산 서열, 벡터, 및/또는 숙주 세포는 이에 따라, 상기에서 상세히 설명된 바와 같이 사용될 수 있다.
제조 물품(Article of Manufacture)
추가 양태에서, 제조 물품(즉, 키트)이 제공된다. 제조 물품은 (i) PD-L1 관련 장애의 치료, 예방, 또는 진행의 지연을 위해, (ii) 진단을 위해, 또는 (iii) 화장 목적을 위해 유용한, 물건(matter), 예를 들어, 물질(material)을 포함한다. 제조 물품은 사용 설명서 및 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지, 카트리지, 플레이트, 및 시험관을 포함하고, 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 적어도 하나의 용기는 본 명세서에 개시된 바와 같은 결합 성분을 포함하는 조성물을 보유한다. 용기는 멸균 액세스 포트(sterile access port)를 가질 수 있다. 개개 용기는 통상적으로 표지된다.
시약은 통상적으로 용해후, 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함하는, 사전결정된 양의 건조 분말, 대개 동결건조된 분말로 제공된다. 다른 첨가제, 예를 들어, 안정화제 및/또는 완충제가 또한 포함될 수 있다. 결합 성분이 효소로 표지되는 경우에, 키트는 통상적으로 이에 따라 기질 및 보조인자를 포함할 것이다.
사용 설명서는 선택된 장애의 치료, 예방 및/또는 진행의 지연을 위한 조성물이 사용된다는 표시(indication); 또는 검출 또는 진단 검정을 수행하기 위한 설명을 제공할 수 있다. 설명서는 라벨 상에 그리고/또는 패키지 삽입물(package insert) 상에 제공될 수 있다.
서열에 대한 참조
본 명세서에 개시된 서열은 다음과 같다:
서열번호 1 - scFv1의 VL
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEDIYSLLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNYGSSSSSSYGAVFGQGTKLTVLG
서열번호 2 - scFv1의 VH
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGIDLSSYTMGWVRQAPGKGLEWVGIISSGGRTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYTGYPYYFALWGQGTLVTVSS
서열번호 3 -scFv1 CDR-L1
QASEDIYSLLA
서열번호 4 - scFv1의 CDR-L2
DASDLAS
서열번호 5 - scFv1의 CDR-L3
QGNYGSSSSSSYGAV
서열번호 6 -scFv1 CDR-H1
IDLSSYTMG
서열번호 7 -scFv1의 CDR-H2
IISSGGRTYYASWAKG
서열번호 8 - scFv1의 CDR-H3
GRYTGYPYYFAL
서열번호 9 - scFv1
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEDIYSLLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNYGSSSSSSYGAVFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGIDLSSYTMGWVRQAPGKGLEWVGIISSGGRTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYTGYPYYFALWGQGTLVTVSS
서열번호 10 - 링커
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
서열번호 11 - 메틸화된 scFv1
MEIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEDIYSLLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNYGSSSSSSYGAVFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGIDLSSYTMGWVRQAPGKGLEWVGIISSGGRTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYTGYPYYFALWGQGTLVTVSS
서열번호 12 - FR-L1
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC
서열번호 13 - FR-L2
WYQQKPGKAPKLLIY
서열번호 14 - FR-L3
GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC
서열번호 15 - FR-L4
FGQGTKLTVLG
서열번호 16 - FR-H1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSG
서열번호 17 - FR-H2
WVRQAPGKGLEWVG
서열번호 18 - FR-H3
RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
서열번호 19 - FR-H4
WGQGTLVTVSS
서열번호 20 -IgG_1의 중쇄
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGIDLSSYTMGWVRQAPGKGLEWVGIISSGGRTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYTGYPYYFALWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 21 -IgG_2의 중쇄
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 22 -IgG_3의 중쇄
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 23 -IgG_4의 중쇄
EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMTWVRQAPGRGLEWVSGIHWHGKRTGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLKGEDTALYHCVRGGMSTGDWFDPWGQGTLVIVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
서열번호 24 -IgG_1의 경쇄
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEDIYSLLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNYGSSSSSSYGAVFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 25 -IgG_2의 경쇄
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 26 -IgG_3의 경쇄
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 27 -IgG_4의 경쇄
DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQSINSYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
하기는 실시예로서, 이는 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물을 예시하는 것이다. 다양한 다른 실시형태가 상기에 제공된 일반적인 설명에 따라, 실행될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
실시예 1 - PD-L1 결합 scFv의 동정
토끼의 면역화: 토끼를 재조합 인간(rh) PD-L1 Fc 융합체(RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 156-B7)로 면역화하였다. 최종 부스트(boost) 후에 림프구를 추출하고, 세포를 냉동보존하였다.
PD-L1 특이성의 확인: PD-L1에 대한 토끼 혈청의 반응성의 확인을 결합 ELISA에 의해 수행하였다. 간단하게, PD-L1-Fc 융합체(RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 156-B7) 또는 PD-L1-His(Bio Vision, 미국 소재, 카탈로그 번호 7429)를 Maxisorp 96-웰 마이크로플레이트 상에 37℃에서 1시간 동안 PBS 중 2 mcg/㎖의 농도로 코팅하였다. 5% 탈지 분유 및 1% BSA로 차단시킨 후에, 증가하는 농도의 토끼 혈청을 첨가하고, 결합된 IgG를 염소 항-토끼 IgG HRP(Southern Biotech, 미국 소재, 카탈로그 번호 4050-05)에 의해 검출하였다. ELISA를 TMB ELISA 기질 용액(eBioscience, 미국 소재, 카탈로그 번호 00-4201-56)으로 현상시켰다. 모든 토끼 혈청은 Fc 융합된 및 Hig 태그화된 PD-L1 둘 모두에 결합하였는데, 이는 면역화가 PD-L1에 대한 B 세포 반응을 성공적으로 유도하였음을 나타내는 것이다.
토끼 B 세포의 유동 세포 분석법 분류 및 배양: PD-L1-특이적 메모리 B 세포를 FACSAria III(BD Biosciences)을 이용하여 96-웰 마이크로플레이트에 단일 세포로서 분류하였다. 단일 B 세포 클론을 피더 세포(feeder cell) 및 10% 태아 송아지 혈청(FCS)을 함유하는 컨디셔닝된 배지의 존재 하에서 배양하였다.
900개 이상의 단일 B 세포 클론을 분류하고, 배양하고, 세포 배양 상청액을 항-PD-L1-특이적 IgG의 존재에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 간단하게, rhPD-L1 Fc 융합체(RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 156-B7)를 Maxisorp 96-웰 마이크로플레이트 상에 4℃에서 밤새 PBS 중 2 mcg/㎖의 농도로 코팅하였다. 5% 탈지 분유, 1% BSA 및 0.05% 트윈-20으로 차단시킨 후에, 세포 배양 상청액을 첨가하였다. PD-L1 특이적 IgG를 항-토끼 IgG-HRP(Southern Biotech, 카탈로그 번호 4050-05)에 의해 검출하였다. ELISA를 TMB ELISA 기질 용액(eBioscience, 미국 소재, 카탈로그 번호 00-4201-56)으로 현상시켰다. PD-L1-특이적 IgG-생성 B 세포 클론을 동정하고, IgG 항체를 PD-L1과 PD-1의 상호작용을 차단하는 이의 능력에 대해 추가로 분석하였다. 간단하게, PD-L1 발현 CHO 세포(Promega, 미국 소재, 카탈로그 번호 CS187103)를 96-웰 마이크로플레이트에 파종하였다. PD-L1-특이적 IgG를 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 20분 동안 항온처리하였다. PD-1 발현 효과기 주르카트 세포(Promega, 미국 소재, 카탈로그 번호 CS187105)를 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 추가 6시간 동안 항온처리하였다. TCR/CD3 활성화를 Bio-Glo Luciferase Assay System(Promega, G7941)으로의 발광 검출에 의해 측정하였다. 69개의 IgG-생성 B 세포 클론은 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 저해하는 것으로 확인되었다.
PD-L1-중화 IgG의 서열화: 중화 항-PD-L1 IgG 항체를 생산하는 모든 토끼 B 세포 클론을 RNeasy Mini Kit(Qiagen, 독일 소재, 카탈로그 번호 74106)를 이용하여 mRNA 단리로 처리하였다. mRNA를 제조업체 프로토콜(OneStep RT-PCR kit, Qiagen, 독일 소재, 카탈로그 번호 210212)에 따라 역전사를 위한 주형으로서 사용하였다. 후속하여, 토끼 IgG 중쇄 및 경쇄 암호화 서열을 특이적으로 증폭시키기 위해 올리고뉴클레오타이드를 사용한 PCR 반응을 수행하였다(Biometra Thermocycler T3). 중쇄 및 경쇄 PCR 단편을 독립적으로 서열화시키고(ABI, Sanger 3730xl; Microsynth AG, 스위스 발가흐 소재), 얻어진 뉴클레오타이드 서열을 EMBOSS Transeq(http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/)를 이용하여 아미노산 서열로 번역하고, CLUSTALW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)를 이용하여 정렬하였다.
항-PD-L1 scFv 유전자의 작제화 및 scFv 단백질 발현: 상기에서 규정된 바와 같은 가변 경쇄 및 가변 중쇄의 토끼 IgG CDR 영역을 동정하고 인간 경쇄 및 중쇄 수용체 프레임워크 상에 이식하였다. 일부의 경우에, 점 돌연변이를 도입하였다. C-말단 가변 중쇄에 서열 서열번호 10에 의해 연결된 N-말단 가변 경쇄를 갖는 scFv 단백질을 암호화하여 박테리아 발현 벡터를 생성하였다. ScFv 단백질을 봉입체로서 대장균 BL21(DE3); Novagen, 미국 소재, 카탈로그 번호 69450-3)에서 발현시키고, 이를 단리시키고, 용해시키고, 단백질을 재폴딩하였다. 재폴딩된 scFv를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하고, 대략 26 kDa에 해당하는 모노머 피크 분획을 수집하였다.
인간화된 scFv를 전술한 바와 같이, ELISA에 의해 인간 PD-L1 Fc 융합 결합에 대해 분석하였다. 이러한 절차에 의해, 47개의 시험된 scFv로부터, 28개의 scFv가 인간 PD-L1의 바인더로서 동정되었다. 인간화된 scFv를 ELISA에 의해 마우스 PD-L1에 대한 결합에 대해 추가로 분석하였다. 간단하게, 마우스 PD-L1 Fc 융합체(Sino Biological, China, 카탈로그 번호 50010-M03H 또는 RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 1019-B7-100)를 Maxisorp 96-웰 마이크로플레이트 상에서 4℃에서 밤새 PBS pH 7.2 중 5 mcg/㎖ 또는 1 mcg/㎖의 농도로 코팅하였다. BPS, pH 7.2 중 1% BSA 또는 PBS, pH 7.2 중 1% BSA를 함유하는 5% 탈지 분유로 차단시킨 후에, 증가하는 농도의 scFv(0.0016, 0.008, 0.04, 0.2, 1.0 및 5.0 mcg/㎖ 또는 0.02, 0.06, 0.19, 0.56, 1.67 및 5.0 mcg/㎖)를 웰에 첨가하였다. 마우스 PD-L1 Fc 융합체의 성공적인 코팅은 마우스 PD-L1 특이적 항체(Sino Biological, China, 카탈로그 번호 50010-M08H)로 확인하였다. scFv가 단백질 L-HRP(Sigma-Aldrich, 미국 소재, 카탈로그 번호 P3226)에 의해 검출된 반면, 전장 IgG 대조 항체는 HRP에 접합된 염소 항-토끼 IgG(Southern Biotech, 미국 소재, 카탈로그 번호 4050-05)에 의해 검출되었다. TMB ELISA 기질 용액(eBioscience, 미국 소재, 카탈로그 번호 00-4201-56)으로 현상시키고, 흡광도를 450㎚에서 측정하였다. scFv1은 5 mcg/㎖의 농도까지 마우스 PD-L1과 교차-반응하지 않았다. 1개의 시험된 scFv는 마우스 PD-L1에 대한 약한 교차-반응성을 나타내었다. 인간 PD-L1 결합 scFv를 실시예 2에 나타낸 바와 같은 인간 PD-L1의 활성을 중화시키는 이의 능력, 실시예 3에 나타낸 바와 같은 이의 안정성, 실시예 4에 나타낸 바와 같은 인간 PD-L1에 대한 이의 친화력, 및 실시예 5에 나타낸 바와 같은 이의 특이성에 있어서 추가로 특징분석하였다. scFv1을 실시예 6에 나타낸 바와 같이, 자연 형태(natural form)의 인간 PD-L1에 대한 결합의 분석에 의해, 실시예 7에 나타낸 바와 같이, 세포로부터 분비된 scFv1의 분석에 의해, 및 실시예 8에 의해 나타낸 바와 같이, 생체내 효능의 결정에 의해 추가로 특징분석하였다. IgG 포맷으로의 전환 후에, scFv1에 해당하는 항체를 인간 PD-L1과 인간 PD-1 간의 상호작용을 저해하는 능력에 의해 및 실시예 9에 나타낸 바와 같이 인간 PD-L1에 대한 친화력의 분석에 의해 추가로 분석하였다.
실시예 2 - 인간 PD-L1의 중화
26개의 scFv 및 1개의 비-결합 scFv(scFv2)를 PD-1/PD-L1 차단 검정에서 이의 PD-L1 중화 능력에 대해 추가로 시험하였다. 이러한 검정에서, 루시페라제 활성을 T 세포의 활성에 의해 증진시켰다. PD-L1과 PD-L1의 상호작용은 저해 신호, 및 루시페라제 활성의 감소를 생성시키고, 이는 PD-L1의 저해제로 세포를 처리함으로써 극복된다. PD-L1 발현 CHO 세포(Promega, CS187103)를 96-웰 마이크로플레이트 내에 파종하였다. 증가하는 농도의 scFv를 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 20분 동안 항온처리하였다. PD-1 발현 효과기 주르카트 세포(Promega, CS 187105)를 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 6시간 동안 항온처리하였다. TCR/CD3 활성을 Bio-Glo Luciferase Assay System(Promega, G7941)으로의 형광 검출에 의해 측정하였다. 저해 곡선을 플롯팅하고, IC50 값을 GraphPad Prism® 소프트웨어, 버전 6.05을 이용하여 계산하였다. scFv1 및 scFv2에 대한 결과는 도 1에 도시되어 있다. scFv1은 750pM의 IC50으로 면역 관문 저해 신호를 효율적으로 차단하였다. 비-결합 scFv2는 면역 관문 저해 신호에 대해 어떠한 영향도 미치지 않았다. scFv1은 시험된 27개의 scFv의 가장 높은 효능을 나타내었다. 가장 낮은 효능 scFv의 IC50은 10 mcg/㎖ 이하의 농도 범위를 사용하여 결정되지 못할 수 있다.
PD-1에 PD-L1의 결합을 저해하는 scFv1, 비-결합 scFv2 및 3개의 다른 scFv의 능력을 경쟁 ELISA에 의해 시험하였다. rhPD-L1 Fc 융합체(RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 156-B7)를 Maxisorp 96-웰 마이크로플레이트 상에서 4℃에서 밤새 PBS 중 2 mcg/㎖의 농도로 코팅하였다. 플레이트를 PBS, pH 7.2 중 1% BSA 및 0.05% Tween-20으로 차단하였다. 1 mcg/㎖에서 시작하여 11개의 1:3 희석으로 scFv의 일련의 희석액을 제조하고, 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 1시간 후에, 1/2의 scFv 희석액을 제거하고, 15 ng/㎖의 최종 농도에서 바이오티닐화된 PD-1 Fc 융합체(BPS Bioscience, 미국 소재, 카탈로그 번호 71109)로 대체하였다. 결합된 PD-1 Fc 융합체를 스트렙타비딘-HRP(BD Pharmingen, 미국 소재, 카탈로그 번호 554060)로 검출하였다. 배경 수준을 PD-1의 부재 하에서 결정하였다. ELISA를 TMB ELISA 기질 용액(eBioscience, 미국 소재, 카탈로그 번호 00-4201-56)으로 발현시켰다. 이러한 검정을 PD-1과 상호작용하는 PD-L1의 능력은 도 2에 도시된 바와 같이, 비-결합 scFv2가 아닌 scFv1에 의해 효과적으로 중화되는, 흡광도 신호를 생성시킨다. 3개의 다른 scFv는 또한, scFv1과 유사한 정도로 상호작용을 중화시켰다.
CD80에 대한 PD-L1의 결합을 저해하는 scFv1 및 비-결합 scFv2의 능력을 경쟁 ELISA에 의해 시험하였다. rhCD80-His(RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 9050-B1-100)를 Maxisorp 96-웰 마이크로플레이트 상에서 4℃에서 밤새 PBS 중 2 mcg/㎖의 농도로 코팅하였다. 플레이트를 PBS, pH 7.4 중 1% BSA 및 0.05% Tween-20으로 차단하였다. 1mM에서 시작하여 11개의 1:3 scFv 희석으로, 일정한 농도의 50nM rhPD-L1 Fc 융합체(RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 156-B7)로 scFv의 일련 희석액을 제조하였다. 이러한 혼합물을 실온에서 2시간 동안 CD80 코팅된 플레이트와 함께 항온처리하였다. 어떠한 PD-L1-Fc의 부재 하에서 희석 계열의 scFv1을 포함시킴으로써 CD80에 대한 PD-L1의 결합이 없는 것에 해당하는 배경 수준을 결정하였다. 결합된 PD-L1 Fc 융합체를 염소 항-인간 IgG Fc-HRP(Southern Biotech, 미국 소재, 카탈로그 번호 2048-05)로 검출하였다. ELISA를 TMB ELISA 기질 용액(eBioscience, 미국 소재, 카탈로그 번호 00-4201-56)으로 현상시켰다. 이러한 검정에서, CD80과 상호작용하는 PD-L1의 능력은 도 3에 도시된 바와 같이, 비-결합 scFv2가 아닌 scFv1에 의해 배경 수준으로 효과적으로 중화되는, 흡광도 신호를 생성시킨다.
종합하면, 이러한 결과는, scFv1이 PD-1 및 CD80 둘 모두와 PD-L1의 상호작용을 차단하는 것을 나타낸다.
실시예 3 - scFv의 안정성
scFv의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 2개의 상이한 과정이 관찰될 수 있다. 첫째로, scFv는 다이머화되기 쉽고, 종종 이후에, 올리고머화 및 추가 응집 및 침전이 이어질 수 있다. 둘째로, 더 작은 단편을 야기시키는 scFv 분해가 시간 경과에 따라 일어날 수 있다.
PBS pH 7.2에서 포뮬레이션된 scFv1 및 4개의 다른 scFv의 안정성을 상이한 온도 조건에서 저장 시에 조사하였다. scFv를 1.5㎖ 폴리프로필렌 튜브에서 4℃, 22℃, 37℃ 및 -20℃에서 10 mg/㎖ 농도로 저장하였다. 전체 피크 면적에 대한 모노머, 다이머 및 고분자량 올리고머의 수준(%)을 결정하기 위해 샘플을 SE-HPLC에 의해 분석하였다: TOSOH TSKgel G2000 SWXL 컬럼(상 디올, L × I.D. 30 cm × 7.8 mm, 5 ㎛ 입자 크기)(Sigma Aldrich, 미국 소재, 카탈로그 번호 08540)을 이용하였다. 5 ㎕의 scFv를 10 mg/㎖로 로딩하였다. 이동상 PBS pH 7.2를 선택하였다.
scFv1은 시험된 5개의 scFv 중 가장 안정한 것이었다. scFv1의 SE-HPLC 분석은 전술한 실험 조건에서 검출 가능하지 않은 저분자량 분해 생성물을 나타내었다. 단지 소량의 scFv1의 다이머화 또는 고분자량 분자의 형성이 4℃, 22℃ 및 37℃에서 2주 동안 저장 시에 관찰되었다. scFv1은 37℃에서 1주 또는 2주의 저장 후에 각각 최대 1.8% 및 2.7%의 다이머화를 형성하였다(표 1).
Figure pct00001
scFv1의 열적 안정성을 또한, 시차 주사 형광법(DSF)에 의해 평가하였다. PBS pH 7.2에서 포뮬레이션된 0.4 mg/㎖의 scFv1을 실시간 PCR 디바이스(Corbett, Rotor-Gene)에서, PBS pH 7.2 중 20x SYPRO® Orange(Sigma-Aldrich, 미국 소재, 카탈로그 번호 S5692, 5000x)의 존재 하에서 30℃에서 95℃까지 1℃/5초의 스캔 속도로 가열하였다. 형광 값을 구배 구동(gradient run) 동안 측정하였다(470㎚의 여기 파장; 555㎚의 방출 파장). Rotor-Gene 6000 Series Software 1.7을 이용하여 계산된 scFv1의 중간점 용융 온도(Tm)는 81.5℃였다.
단백질성 생물체는 응집 및 분해를 야기시킬 수 있는 제조, 저장 및 선적 동안 냉동/해동 스트레스에 노출될 수 있다. 냉동/해동 사이클 동안 scFv1의 안정성을 평가하기 위하여, 이를 1.5㎖ 폴리프로필렌 튜브에서 PBS pH 7.2 중에 10 mg/㎖로 포뮬레이션하였다. 바이알을 1분 동안 액체 질소에 담그고, 이후에, 실온에서 5분 동안 수욕에서 항온처리하였다. 3, 5, 7 또는 10회의 냉동/해동 사이클을 수행하였다. 샘플을 16,100 × g에서 10분 동안 원심분리하고, 펠릿을 폐기하였다. 상청액을 상기 언급된 바와 같이 SE-HPLC에 의해 분석하고, 단백질 함량을 UV 분광법에 의해 결정하였다. 사실상 100%의 scFv1은 10회의 냉동/해동 사이클 후에 모노머로 잔류하였으며(표 2), 단백질 손실 또는 침전이 관찰되지 않았다.
Figure pct00002
인간 혈청(Sigma-Aldrich, 미국 소재, 카탈로그 번호 H4522)에서 scFv1의 안정성을 37℃에서 0, 4 및 20시간 동안 10 mcg/㎖로 항온처리한 후에 ELISA에 의해 평가하였다. 결합 신호를 항온처리하지 않은, PBS, pH 7.4 중 scFv1과 비교하였다. 간단하게, rhPD-L1 Fc 융합체(RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 156-B7)를 Maxisorp 96-웰 마이크로플레이트 상에서 4℃에서 밤새 PBS 중 1 mcg/㎖의 농도로 코팅하였다. 1% BSA 및 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS, pH 7.4로 차단시킨 후에, 2.5 mcg/㎖ 내지 42 ng/㎖ 혈청/scFv 샘플의 일련의 1:3 희석액을 ELISA 플레이트에 2중으로 첨가하였다. 결합된 scFv1을 단백질 L-HRP(Sigma-Aldrich, 미국 소재, 카탈로그 번호 P3226)로 검출하였다. ELISA를 TMB ELISA 기질 용액(eBioscience, 미국 소재, 카탈로그 번호 00-4201-56)으로 현상시켰다. 도 4에 도시된 바와 같이, 37℃에서 최대 20시간 동안 인간 혈청과 함께 항온처리한 후에 scFv1의 결합 활성이 상실되지 않았다.
실시예 4 - 가용성 PD-L1에 결합
PD-L1-Fc 융합체에 대한 scFv1 및 3개의 다른 scFv의 친화력을 오토샘플러(Sapidyne Instruments, 미국 소재, 5004)를 포함하는 KinExA 3200(Sapidyne Instruments, 미국 소재, 카탈로그 번호 5001)으로 역학적 배제 검정(KinExA®)에 의해 결정하였다. KinExA®는 용액 중의 변형되지 않은 분자들 간의 평형 결합 친화력 및 동력학을 측정한다. 이러한 측정은 용액 중 상응하는 결합 파트너의 농도를 결정하기 위한 프로브로서 작용하기 위해 고체상 상에서의 하나의 상호작용 파트너의 고정화만을 필요로 한다. 여기에서, PD-L1 Fc 융합체(RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 156-B7)를 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA) 비드(440176, Sapidyne Instruments Inc.) 상에 30 mcg/㎖의 농도로 고정하였다. 0.02% NaN3, pH 7.4를 함유하는 PBS를 진행 완충제(running buffer)로서 사용하였다. PD-L1 Fc 융합체에 대한 scFv의 친화력을 통상적으로 한 세트의 2개의 곡선을 이용하여 결정하였으며, 여기서, PD-L1 Fc 융합체의 2배 희석 계열을 일정한 양의 scFv에 대해 적정하였다. 각 데이터 포인트에 대해 중복 측정을 준비하였다. scFv1에 대하여, 제1 곡선에서, 20pM scFv1을, 5nM PD-L1 Fc 융합체로 출발하여, 11개의 상이한 PD-L1 Fc 융합체 농도로 인큐베베이션하였다. 이러한 혼합물을 5시간 동안 항온처리하였다. 제2 곡선에서, 10pM scFv1을 2.5nM PD-L1 Fc 융합체로 출발하여, 12개의 상이한 PD-L1 Fc 융합체 농도로 항온처리하였다. 이러한 혼합물을 9시간 동안 항온처리하였다. 이러한 혼합물에 존재하는 결합되지 않은 scFv의 양을 검출하기 위하여, 샘플을 고정화된 PD-L1 Fc 융합체를 함유하는 고체상에 0.25 ㎖/분의 유량으로 노출시켰다. 0.5㎖의 250 ng/㎖ 바이오티닐화된 단백질-L(M00097, GenScript)을 주입하고, 이후에 0.5㎖의 250 ng/㎖ 스트렙타비딘 DyLight 650 컨쥬게이트(Jackson ImmunoResearch)를 주입함으로써 캡처된 scFv1을 이후에, 검출하였으며, 이들 각각의 주입은 0.25 ㎖/분의 유량으로 수행하였다. 모든 단계들을 실온에서 수행하였다. 평형 샘플에서 자유 scFv1의 농도에 직접적으로 비례하는 형광 신호는 전압 신호로 변환된다. 이러한 전압 신호는 옵션 "분석 농도 기준으로서 적정제"를 이용하여, KinExA® Pro 소프트웨어 버전 4.1.9 또는 4.2.10의 "n-곡선 분석"을 이용하여 scFv의 KD 값 및 활성을 계산하기 위해 사용된다(도 5). scFv1에 대해 계산된 KD 값은 8.8pM이었다. 다른 scFv에 대해 계산된 KD 값은 12 내지 92pM의 범위이었다.
실시예 5 - scFv의 선택성
다른 종으로부터의 PD-L1에 대한 scFv1 및 scFv3의 교차-반응성을 ELISA에 의해 결정하였다. 인간(RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 156-B7), 래트(Sino Biological, China, 카탈로그 번호 80450-R02H) 또는 원숭이(Sino Biological, China, 카탈로그 번호 90251-C02H)로부터의 PD-L1 Fc 융합체를 4℃에서 PBS, pH 7.2 중 1 mcg/㎖의 농도로 Maxisorp 96-웰 마이크로플레이트 상에 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS, pH 7.2 중 1% BSA 및 0.5% Tween-20로 차단하였다. 1 mcg/㎖, 333 ng/㎖ 및 111 ng/㎖의 농도로 scFv의 일련 희석액을 제조하고, 플레이트에 첨가하였다. 음성 대조군으로서, scFv를 함유하지 않는 PBS를 사용하였으며, 양성 대조군으로서, 1 mcg/㎖의 마우스 항-인간 PD-L1 항체(BioLegend, 미국 소재, 카탈로그 번호 329716) 또는 바이오티닐화된 rhPD-1 Fc 융합체(BPS Bioscience, 미국 소재, 카탈로그 번호 71109)를 포함하였다. 결합된 scFv를 단백질 L-HRP(Sigma-Aldrich, 미국 소재, 카탈로그 번호 P3226)로 검출하였으며, 결합된 마우스 항-인간 PD-L1 항체를 염소 항-마우스 IgG-HRP(Southern Biotech, 미국 소재, 카탈로그 번호 1033-01)로 검출하였으며, 결합된 바이오티닐화된 rhPD-1 Fc 융합체를 스트렙타비딘-HRP(BD Pharmingen, 미국 소재, 카탈로그 번호 554060)로 검출하였다. TMB ELISA 기질 용액(eBioscience, 미국 소재, 카탈로그 번호 00-4201-56)로 현상시켰다. 결과는, scFv1 및 scFv3이 래트 PD-L1이 아닌 인간 및 원숭이 PD-L1에 특이적으로 결합함을 나타내었다(도 6).
PD-L1에 대한 서열 유사성을 공유하는 재조합 인간 단백질에 대한 scFv1의 교차-반응성을 ELISA에 의해 결정하였다. rhPD-L1 Fc 융합체(RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 156-B7), rhPD-L2 Fc 융합체(RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 1224-PL) 또는 rhB7-H3 Fc 융합체(RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 1027-B3)를 Maxisorp 96-웰 마이크로플레이트 상에서 4℃에서 PBS, pH 7.2 중 1 mcg/㎖의 농도로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS pH 7.2 중 1% BSA 및 0.5% Tween-20으로 차단하였다. 5, 1 및 0.2 mcg/㎖의 농도로 scFv의 연속 희석액을 제조하고, 플레이트에 첨가하였다. 음성 대조군으로서, 비-결합 scFv2를 사용하였고, 양성 대조군으로서, 5, 1 및 0.2 mcg/㎖의 마우스 항-인간 B7-H3 항체(RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 MAB1027) 또는 30 및 15 ng/㎖의 바이오티닐화된 rhPD-1 Fc 융합체(BPS Bioscience, 미국 소재, 카탈로그 번호 71109)를 포함하였다. 결합된 scFv를 단백질 L-HRP(Sigma-Aldrich, 미국 소재, 카탈로그 번호 P3226)로 검출하였으며, 결합된 마우스 항-인간 B7-H3 항체를 염소 항-마우스 IgG-HRP(Southern Biotech, 미국 소재, 카탈로그 번호 1033-01)로 검출하였으며, 결합된 바이오티닐화된 rhPD-1 Fc 융합체를 스트렙타비딘-HRP(BD Pharmingen, 미국 소재, 카탈로그 번호 554060)로 검출하였다. TMB ELISA 기질 용액(eBioscience, 미국 소재, 카탈로그 번호 00-4201-56)으로 현상시켰다. 결과는, scFv1이 인간 PD-L2 또는 B7-H3에 대한 교차-반응성을 가지지 않으면서, 인간 PD-L1에 특이적으로 결합함을 나타내었다.
원숭이 PD-L1에 scFv1의 교차반응성을 KinExA®를 사용하여 추가로 조사하였다. PMMA 비드가 20 mcg/㎖의 원숭이 PD-L1 Fc 융합체(Sino Biological, China, 카탈로그 번호 90251-C02H)로 코팅되는 것을 제외하고 본 방법을 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였으며, 친화력을 한 세트의 2개의 곡선을 이용하여 결정하였으며, 여기서, 2배 희석 계열의 원숭이 PD-L1 Fc 융합체를 일정한 양의 scFv에 대해 적정하였다. 제1 곡선에서, 50pM scFv1을 2.5nM PD-L1 Fc 융합체로 출발하여, 이중 측정으로 12개의 상이한 PD-L1 Fc 융합체 농도로 항온처리하였다. 이러한 혼합물을 6시간 동안 항온처리하였다. 제2 곡선에서, 10pM scFv1을 1nM PD-L1 Fc 융합체로 출발하여, 12개의 상이한 PD-L1 Fc 융합체 농도로 항온처리하였다. 이러한 혼합물에 존재하는 결합되지 않은 scFv의 양을 검출하기 위해 이러한 혼합물을 16시간 동안 항온처리하였으며, 샘플을 고정화된 PD-L1 Fc 융합체를 함유하는 고체상에 0.25 ㎖/분의 유량으로 노출하였다. 모든 단계를 실온에서 수행하였다. 옵션 "분석 농도 기준으로서 적정제"를 이용한 KinExA® Pro 소프트웨어 버전 4.2.10의 "n-곡선 분석"을 이용하여 scFv1에 대해 계산된 KD 값은 3.3pM이었다(도 7). 결과는, scFv1이 인간 PD-L1에 대한 결합보다 대략 2.7배 더 단단한 친화력으로 원숭이 PD-L1에 결합한다는 것을 나타낸다.
실시예 6 - 천연 형태의 PD- L1에 대한 결합
종양 세포의 표면 상에서 발현되는 천연 형태의 PD-L1을 결합하는 scFv1 및 비-결합 대조 scFv, scFv2의 능력을 세포외 FACS 분석에 의해 결정하였다. ES-2 세포(ATCC, 미국 소재, 카탈로그 번호 CRL-1978)를 5 mcg/㎖ 또는 1 mcg/㎖의 scFv 또는 항-인간 PD-L1 마우스 IgG2(BioLegend, 미국 소재, 카탈로그 번호 329716)로 얼음 상에서 30분 동안 염색하였다. 바이오티닐화된 단백질 L(Pierce, 카탈로그 번호 PI-29997)로 염색하고 이후에 스트렙타비딘-피코에리스린(BD Pharmingen, 미국 소재, 카탈로그 번호 554061)을 염색함으로써 결합된 scFv를 검출하였다. 세척 후에, 죽은 세포를 배제하기 위해 프로피듐 요오다이드를 사용하였으며, 세포를 FACSAria III(BD Biosciences) 상에서 분석하였다. 평균 및 중간 형광 세기는 표 3에 나타내었다. 결과는, scFv1이 ES-2 세포의 표면 상에서 발현된 천연 형태의 PD-L1을 특이적으로 인식할 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00003
세포 표면 PD-L1에 대한 scFv1의 결합을 KinExA®를 이용하여 추가로 조사하였다. 일정한 양의 scFv1(50pM)에 대해 이중으로 적정한, 12개의 2배 ES-2 세포의 일련 희석액(1㎖당 2640만개로 출발함)을 이용하여 친화력을 결정하는 것을 제외하고 본 방법을 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다. 이러한 혼합물을 5시간 동안 항온처리하고, 10분 동안 3800 × g로 원심분리하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. scFv의 양을 검출하기 위해, 샘플을 고정화된 PD-L1 Fc 융합체를 함유하는 고체상에 0.25 ㎖/분의 유량으로 노출하였다. 모든 단계를 실온에서 수행하였다. KinExA® Pro 소프트웨어를 이용한 분석은 12.8pM의 세포 표면 PD-L1에 scFv1 결합에 대한 계산된 KD 값을 야기시켰다(도 8).
결과는, scFv1이 종양 세포의 표면 상에서 발현된 천연 형태의 PD-L1을 결합함을 나타낸다.
실시예 7 - ScFv 분비
대장균 세포에 의해 봉입체에서 생성된 scFv1의 성질을 포유류 세포로부터 분비된 scFv1의 성질과 비교하기 위하여, scFv1을 Evitria(스위스 취리히 소재)에 의해 현탁액-구성된 CHO K1 세포(원래 ATCC로부터 입수되고 현탁 배양물 중에서 무-혈청 성장으로 구성됨)에서 생성하였다. 종자를 화학적으로 규정된, 동물-성분 부재, 무-혈청 배지에서 성장시켰다. 세포를 맞춤형, 독점적 트랜스펙션 시약으로 트랜스펙션시키고, 세포를 동물-성분 부재, 무-혈청 배지에서 트랜스펙션 후 성장시켰다. scFv1을 단백질 L 친화력 크로마토그래피 이후 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
CHO 세포 및 대장균 세포 발현된 scFv1의 PD-L1 중화 능력을 PD-1/PD-L1 차단 분석으로 비교하였다. 이러한 검정에서, 루시페라제 활성을 T 세포의 활성에 의해 증진시켰다. PD-L1과 PD-1의 상호작용은 저해 신호 및 루시페라제 활성의 감소를 생성시키며, 이는 PD-L1의 저해제로 세포의 치료에 의해 극복된다. PD-L1 발현 CHO 세포(Promega, CS 187103)를 96-웰 마이크로플레이트 내에 파종하였다. 증가 농도의 scFv를 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 20분 동안 항온처리하였다. PD-1 발현 효과기 주르카트 세포(Promega, CS 187105)를 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 추가 6시간 동안 항온처리하였다. TCR/CD3 활성을 Bio-Glo Luciferase Assay System(Promega, G7941)으로의 형광 검출에 의해 측정하였다. 저해 곡선을 플롯팅하고, IC50 값을 GraphPad Prism® 소프트웨어, 버전 7.02를 이용하여 계산하였다. CHO 세포 발현 scFv1, 대장균 세포 발현 scFv1 및 scFv2에 대한 결과는 도 9에 도시되어 있다. CHO 세포 발현 scFv1은 602pM의 IC50을 가지면서 PD-L1 매개 저해 신호를 효율적으로 차단하였다. 대장균 세포 발현 scFv1은 874pM의 IC50을 가지면서 면역 관문 저해 신호를 효율적으로 차단하였다. 비-결합 scFv2는 면역 관문 저해 신호에 아무런 영향을 미치지 않았다.
실시예 8 - 생체내 활성
scFv1의 생체내 효능을 5 내지 6주령 암컷 NOG 마우스(Vital River Laboratory Animal Technology Co., Beijing, China)에서 HCC827 인간 폐암 모델을 이용하여 시험하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 표준 절차를 이용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 4명의 건강한 인간 공여자의 혈액으로부터 단리하였다. 원심분리 후에, 세포를 PBS 용액으로 세척하고, PBS에 재현탁하였다. 각 공여자로부터의 PBMC를 HCC827 종양 세포 접종하기 3일 전에 0.1㎖ PBS 중 5 × 106개의 세포의 i.p. 주사에 의해 마우스로 전달하였다. 이후에, 각 마우스에 우측 옆구리 영역으로 0.1㎖의 PBS 중 5 × 106개의 HCC827 종양 세포를 피하 접종하였다. 종양 세포 접종 일은 0일로서 나타내었다. 마우스를 1일째에 무작위화하고, 하루에 2회 15 mg/kg의 scFv1 또는 비-결합 scFv2의 복강내(i.p.) 주사로 치료하거나, 1주일에 2회 5 mg/kg의 양성 대조 IgG 항체(MPDL3280A의 유사체)의 정맥내(i.v.) 주사로 치료하였다. 종양 용적을 1주일에 적어도 2회 측정하고, 수학식 V = 0.5 a × b2를 이용하여 mm3으로 표현하였으며, 상기 식에서, a 및 b는 각각 종양의 길이 및 폭이다. 종양 성장 저해(TGI)는 항종양 효과의 징후이고, TGI(%) =100 × (1-(치료군의 평균 종양 용적)/(scFv2 군의 평균 종양 용적))로서 표현된다. 14일째에, 가장 큰 종양 성장 저해를 나타낸 2명의 공여자로부터의 PBMC를 갖는 동물을 연구의 지속을 위해 선택하였다. 21일째에, 모든 동물을 희생시켰다. 군 크기는 공여자 당 군 당 n=3이었으며, 전체 군 크기는 2명의 선택된 공여자와 함께 n=6이었다. 대조군에 대한 치료군 비율(T/C)을 수학식 T/C(%) = (치료군의 평균 종양 용적/대조군의 평균 종양 용적)×100을 이용하여, 비-결합 scFv2 대조군과 비교한 scFv1의 평균 종양 용적 또는 양성 대조 IgG 치료군의 평균 종양용적의 비율로서 계산하였다.
2명의 선택된 공여자(n=6)에 대한 T/C 및 TGI는 도 10에 도시되어 있다. scFv1 및 양성 대조 IgG 항체의 효능을 21일째에 평가하였다(표 4). 6마리의 scFv1 치료된 마우스 중 3마리는 종양 부재이었으며, scFv1 치료된 동물에 대한 TGI는 47%이었다. T/C 비율은 28%이었다. 국립 암 연구소 표준(National Cancer Institute standards)에 따른 T/C% 비율에 대한 유효 기준은 42% 이하이다. 종합하면, 이러한 데이터는 scFv1의 생체내 효능을 나타낸다.
Figure pct00004
실시예 9 - IgG 포맷의 특징분석
scFv1을 중쇄 서열번호 20 및 경쇄 서열번호 24를 갖도록, IgG 포맷(IgG_1)내로 재포맷팅하였다. 또한, US2010/0203056호에 기술된 바와 같은 YW243.55.S70(중쇄 서열번호 21 및 경쇄 서열번호 25를 갖는, IgG_2), WO2011/066389/A1호에 기술된 바와 같은 2.14H9OPT(중쇄 서열번호 22 및 경쇄 서열번호 26을 갖는, IgG_3), 및 WO2015/112805A1호에 기술된 바와 같은 H2M8314N(중쇄 서열번호 23 및 경쇄 서열번호 27을 갖는, IgG_4)의 공개된 서열에 해당하는 항체를 준비하였다. Evitria(스위스 취리히 소재)에 의해 합성을 수행하였다. 본래 ATCC로부터 수용되고 현탁액 배양물 중에 무-혈청 성장에 대해 구성된 현탁액-구성 CHO K1 세포를 생산을 위해 사용하였다. IgG 항체를 단백질 A 크로마토그래피, 이후에 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
먼저 인간 PD-1과 인간 PD-L1의 상호작용을 저해하는 항체의 능력을 시험함으로써 IgG 항체를 특징분석하였다. rhPD-L1 Fc 융합체(RnD Systems, 미국 소재, 카탈로그 번호 156-B7)를 4℃에서 밤새 Maxisorp 96-웰 마이크로플레이트 상에 PBS 중 2 mcg/㎖의 농도로 코팅하였다. 플레이트를 PBS, pH 7.4 중 1% BSA 및 0.05% Tween-20로 차단하였다. 1 mcg/㎖로 시작하여 11개의 1:3 희석으로, IgG의 연속 희석액을 제조하고, 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 30분 후에, IgG 희석액의 절반을 제거하고, 15 ng/㎖의 최종 농도로 바이오티닐화된 PD-1 Fc 융합체(BPS Bioscience, 미국 소재, 카탈로그 번호 71109)로 대체하였다. 결합된 PD-1 Fc 융합체를 스트렙타비딘-HRP(BD Pharmingen, 미국 소재, 카탈로그 번호 554060)로 검출하였다. ELISA를 TMB ELISA 기질 용액(eBioscience, 미국 소재, 카탈로그 번호 00-4201-56)으로 현상시켰다. 비-결합 scFv2는 대조군으로서 포함되었다. 이러한 검정에서, PD-1과 상호작용하는 PD-L1의 능력은 도 11에 도시된 바와 같이, 비-결합 scFv2가 아닌 IgG_1 내지 IgG_4에 의해 효과적으로 중화되는, 흡광도 신호를 생성시킨다. 시험된 항체의 저해 프로파일은 두 군으로 나누어졌으며, 강한 효능 IgG_1 및 IgG_2는 각각 327 및 267pM의 IC50 값을 갖는다. 약한 효능 효능 IgG_3 및 IgG_4는 각각 560 및 606pM의 IC50 값을 갖는다. 강한 효능을 갖는 IgG를 결합 친화력의 특징분석을 위해 먼저 취하였다.
인간 PD-L1에 IgG_1 및 IgG_2의 결합을 KinExA®를 이용하여 조사하였다. 인간 PD-L1에 대한 IgG_2의 결합에 대해 공개된 데이터가 이용 가능하지만, 이러한 데이터는 통상적으로, 고체 표면 상에 하나의 상호작용 파트너의 고정화를 수반하는 기술을 기초로 한다. 이러한 방법은 용액 중 상호작용 조건을 반영하지 않을 수 있고, 또한, 매우 긴밀한 상호작용을 시험할 때 민감도의 문제가 있다. 이에 따라, 항체의 결합을 비교하기 위하여 용액 기반 방법을 선택하였다. 산염기강도(avidity)의 측정을 피하기 위하여 Fc 태그가 없는 PD-L1-His를 상호작용 파트너로서 선택하였다. 친화력을 한 세트의 2개의 곡선을 이용하여 결정하는 것을 제외하고 방법을 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였으며, 여기서, 인간 PD-L1-His(Bio Vision, 미국 소재, 카탈로그 번호 7429)의 2배 희석 시리즈를 일정한 양의 scFv에 대하여 적정하였다. 두 IgG 모두에 대하여, 제1 곡선에서, 100pM의 IgG를 5nM PD-L1-His로 출발하여, 이중 측정으로 12개의 상이한 PD-L1 Fc 융합체 농도로 항온처리하였다. 이러한 혼합물을 5시간 동안 항온처리하였다. 각각 500 마이크로리터의 샘플을 인간 PD-L1 Fc 융합체 코팅된 비드 상에 주입하였다. IgG_1에 대하여, 제2 곡선에서, 10pM의 IgG를 5nM PD-L1 His로 출발하여, 12개의 상이한 PD-L1-His 농도로 항온처리하였다. 이러한 혼합물을 10시간 동안 항온처리하였다. 각각 5㎖의 샘플을 PD-L1 Fc 융합체 코팅된 PMMA 비드 상에 주입하였다. IgG_2에 대하여, 제2 곡선에서, 20pM의 IgG를 1.25nM PD-L1 His로 출발하여, 12개의 상이한 PD-L1-His 농도로 항온처리하였다. 이러한 혼합물을 10시간 동안 항온처리하였다. 각각 5㎖의 샘플을 PD-L1 Fc 융합체 코팅된 PMMA 비드 상에 주입하였다. IgG에 대해 계산된 KD 값은 표 5에 보고되어 있으며, n-곡선 분석은 도 12에 도시되어 있다.
결과는, IgG_1(즉, scFv1은 IgG 포맷으로 전환됨)은 PD-L1에 대한 scFv1의 친화력보다 대략 3배 더 큰 친화력으로 PD-L1을 결합함을 나타낸다. IgG_2는 IgG_1과 비교할 때 PD-L1에 대한 더 약한 친화력을 갖는다.
Figure pct00005
본 발명의 현재 바람직한 실시형태가 도시되고 기술되었지만, 본 발명이 이로 제한되지 않고 이하의 청구범위 내에서 다양하게 구현되고 실행될 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명의 다수의 변형 및 대체 실시형태가 당업자에게 자명할 것이기 때문에, 이러한 설명은 단지 예시적인 것으로서 해석되고, 본 발명의 수행하기 위한 최상의 모드를 당업자에게 교시할 목적을 위한 것이다. 이에 따라, 모든 적합한 변형 및 균등물은 하기 청구범위 내에 속하는 것으로 여겨질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Cell Medica Switzerland AG <120> Binding members to PD-L1 <130> WO2017/144681 <140> PCT/EP2017/054367 <141> 2017-02-24 <150> EP16020057.2 <151> 2016-02-25 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of scFv1 <400> 1 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Leu 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Asn Tyr Gly Ser Ser Ser 85 90 95 Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105 110 Leu Gly <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of scFv1 <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg 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Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 22 <211> 451 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 23 <211> 450 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile His Trp His Gly Lys Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Gly Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys 85 90 95 Val Arg Gly Gly Met Ser Thr Gly Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser 180 185 190 Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 195 200 205 Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile 210 215 220 Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile 245 250 255 Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp 260 265 270 Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His 275 280 285 Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys 305 310 315 320 Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu 355 360 365 Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp 370 375 380 Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu 405 410 415 Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His 420 425 430 Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 24 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Leu 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Asn Tyr Gly Ser Ser Ser 85 90 95 Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 25 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 26 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 27 <211> 215 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala 100 105 110 Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser 115 120 125 Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp 130 135 140 Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val 145 150 155 160 Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser 180 185 190 Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215

Claims (42)

  1. PD-L1(programmed cell death ligand 1)에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 성분(binding member)으로서, 하기 (a) 내지 (g)의 특성 중 하나 이상을 갖는, 결합 성분:
    (a) 1가 포맷(format)의 경우 실시예 4에서 명시된 조건 또는 2가 포맷의 경우 실시예 9에서 명시된 조건 하에서 역학적 배제 검정(Kinetic Exclusion Assay)에 의해 측정하는 경우 10pM보다 더 낮은 결합 해리 평형 상수(KD)로 인간 PD-L1을 결합시킴;
    (b) 인간 PD-1 및 인간 CD80 둘 모두와의 인간 PD-L1 상호작용을 저해하는 PD-L1 상의 에피토프에 결함함;
    (c) 원숭이 PD-L1과 교차 반응함;
    (d) 인간 PD-L1과 마찬가지로 원숭이 PD-L1에 대해 적어도 강한, 더욱 바람직하게는, 적어도 2배 강한 결합 친화력으로, 원숭이 PD-L1을 결합시킴;
    (e) 인간 PD-L2 또는 인간 B7-H3에 결합하지 않음;
    (f) HCC827 인간 폐암 모델에서 종양 성장을 저해함;
    (g) scFv 포맷에서, pH 7.2의 PBS 중 10 mg/㎖의 농도에서 37℃에서 1 또는 2주의 저장 후에 3% 미만의 다이머를 형성함.
  2. 하기를 포함하는, PD-L1에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 성분, 특히, 제1항의 결합 성분:
    (a) 서열번호 6, 7 및 8에 기술된 바와 같은 가변 중쇄 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열 중 적어도 하나; 및/또는
    (b) 서열번호 3, 4 및 5에 기술된 바와 같은 가변 경쇄 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열 중 적어도 하나;
    또는 이들의 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간화된, 결합 성분.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 가변 경쇄; 및/또는
    (ii) 서열번호 2와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄, 또는
    이들의 변이체를 각각 포함하는, 결합 성분.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 서열을 더 포함하되, 상기 링커 서열이 서열번호 10에 기술된 바와 같은 서열, 또는 이의 변이체인, 결합 성분.
  6. 제4항에 있어서, 서열번호 9 또는 서열번호 11 또는 이들의 변이체를 포함하는, 결합 성분.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) Fab, Fab', F(ab)'2, scFv, Fv 단편, scFab, 나노바디(nanobody), VHH 또는 최소 인식 단위(minimal recognition unit)와 같은 항체 단편;
    (ii) 전장 항체 분자; 및/또는
    (iii) 아피바디(affibody), 아필린 분자, AdNectin, 리포칼린 뮤테인(lipocalin mutein), DARPin, Knottin, Kunitz-타입 도메인, Avimer, 테트라넥틴 또는 트랜스-바디(trans-body)와 같은, 비-항체 스캐폴드이거나, 이를 포함하는, 결합 성분.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 1가 또는 다가이며, 상기 결합 성분이 선택적으로, 다중특이적, 바람직하게는, 이중특이적, 더욱 바람직하게는, 이중체, 단쇄 이중체, DART, BiTE, 또는 텐덤 scFv인, 결합 성분.
  9. 제1항 내지 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인을 포함하는, 결합 성분.
  10. 제9항에 있어서, 상기 결합 성분이 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입으로 이루어진 군으로부터 선택된 불변 영역을 포함하는, 결합 성분.
  11. 제9항에 있어서, 상기 결합 성분이 뮤린 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3 아이소타입으로 이루어진 군으로부터 선택된 불변 영역을 포함하는, 결합 성분.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인이 세포독성 면역 반응을 유도하지 않도록 변형된, 결합 성분.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적으로 또는 생물학적으로 변형된, 결합 성분.
  14. 제13항에 있어서, 글리코실화되고, 예를 들어, PEG화되거나 HES화되고/되거나, 제2 모이어티로 표지되거나 제2 모이어티에 접합된, 결합 성분.
  15. 인간 PD-L1에 결합하기 위해 본 명세서에 개시된 결합 성분과 경쟁하는 결합 성분.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 상기 결합 성분을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  17. 제16항에 따른 상기 핵산 분자의 서열을 포함하는 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 발현 벡터 또는 클로닝 벡터인 벡터.
  19. 제16항의 상기 핵산 분자 또는 제17항 또는 제18항의 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  20. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 상기 결합 성분, 제16항의 상기 핵산 분자, 제17항 또는 제18항의 상기 벡터, 또는 제19항의 상기 숙주 세포; 및 추가로 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 화장품, 진단 또는 약제 조성물인, 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 약제 조성물이며, 상기 담체가 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제인, 조성물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 비경구, 경구, 직장, 전신, 정맥내, 피하, 비뇨생식기, 국소, 유리체내, 안구내, 귀, 비강내, 경피, 피부내, 피부, 설하, 두개골내, 근육내, 복강내, 또는 협측 투여를 위해 적합한 형태를 갖는, 조성물.
  24. PD-L1-매개 질병의 치료 방법으로서, 상기 질병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항의 상기 약제 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, PD-L1-매개 질병의 치료 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 PD-L1-매개 질병이 암인, PD-L1-매개 질병의 치료 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 암이 신장암, NSCLC(비소세포 폐암종), 요로 상피암, 흑색종, 신장 세포 암종, 호지킨 림프종, 두경부 편평세포 암종, 난소암, 위장암, 간세포암, 신경교종, 유방암, 림프종, 소세포 폐암종, 골수 형성이상 증후군, 전립선암, 방광암, 자궁경부암, 비-투명 세포 신장암, 대장암, 육종, 결장암, 신장암, 폐암, 췌장암 또는 위암, 피부암, 자궁암, 교아 세포종, 백혈병, 암종, 메르켈 세포 암종 또는 신장 세포 암종(RCC), 혈액암, 다발성 골수종, 림프모구 백혈병(ALL), B 세포 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 및 난소암 중 적어도 하나이거나; 상기 질병이 전신 홍반성 루푸스, 패혈증, 뇌졸중, 병원균 감염증 또는 자가면역 질환인, PD-L1-매개 질병의 치료 방법.
  27. PD-L1-매개 질병의 치료, 예방 또는 진행의 지연에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 결합 성분, 제16항의 핵산 분자, 제17항 또는 제18항의 벡터, 또는 제19항의 숙주 세포.
  28. 제27항에 있어서, 상기 PD-L1-매개 질병이 암, 예를 들어, NSCLC(비-소세포 폐암종), 요로 상피암, 흑색종, 신장 세포 암종, 호지킨 림프종, 두경부 편평세포 암종, 난소암, 위장암, 간세포암, 신경교종, 유방암, 림프종, 소세포 폐암종, 골수 형성이상 증후군, 전립선암, 방광암, 자궁경부암, 비-투명 세포 신장암, 대장암, 육종, 결장암, 신장암, 폐암, 췌장암 또는 위암, 피부암, 자궁암, 교아 세포종, 백혈병, 암종, 메르켈 세포 암종 또는 신장 세포 암종(RCC), 혈액암, 다발성 골수종, 림프모구 백혈병(ALL), B 세포 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 및 난소암 중 적어도 하나이거나; 상기 질병이 전신 홍반성 루푸스가거나, 상기 질병이 전신 홍반성 루푸스, 패혈증, 뇌졸중, 병원균 감염증 또는 자가면역 질환인, 결합 성분, 핵산 분자, 벡터 또는 숙주 세포.
  29. 결합 성분이 항체 요법, 화학요법, 사이토카인 요법, 수지상 세포 요법, 유전자 요법, 호르몬 요법, 레이저광 요법, 방사선 요법 또는 백신 요법의 군으로부터 선택된 하나 이상의 요법과 조합하여 투여되는, 제27항 또는 제28항의 결합 성분, 핵산 분자 벡터 또는 숙주 세포, 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항의 방법.
  30. (i) 특히, PD-L1 매개 질병의 치료에서, 약제로서 사용하기 위한,
    (ii) 진단에서 사용하기 위한,
    (iii) 화장품에서 사용하기 위한, 및/또는
    (iv) 검출 목적을 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 결합 성분, 제16항의 핵산 분자, 제17항 또는 제18항의 벡터, 또는 제19항의 숙주 세포.
  31. 종양 또는 종양 세포의 성장을 저해하는 방법으로서, 상기 종양 또는 종양 세포를 치료적 유효량의 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 상기 결합 성분과 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 또는 종양 세포의 성장을 저해하는 방법.
  32. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 결합 성분을 제조하는 방법으로서,
    (i) 제19항의 상기 숙주 세포를 배양하여, 상기 결합 성분을 발현시키는 단계;
    (ii) 상기 결합 성분을 회수하는 단계; 및
    (iii) 선택적으로, 상기 결합 성분을 정제하는 단계를 포함하는, 결합 성분을 제조하는 방법.
  33. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 결합 성분을 제조하는 방법으로서,
    (a) 무-세포 발현 시스템을 핵산 생성물 주형과 접촉시키는 단계로서, 상기 핵산 생성물 주형이 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 상기 결합 성분을 암호화하는, 상기 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 핵산 생성물 주형을 전사하고 번역하여 반응 혼합물을 형성시키는 단계;
    (c) 상기 반응 혼합물로부터 상기 결합 성분을 회수하는 단계;
    (d) 선택적으로, 상기 결합 성분을 정제하는 단계를 포함하는, 결합 성분을 제조하는 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 결합 성분을 제조하는 것이 화학적 합성 단계를 포함하는, 결합 성분을 제조하는 방법.
  35. 생물학적 샘플 내 PD-L1의 존재의 검출 방법으로서,
    (a) PD-L1에 대한 결합 성분의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서, 상기 생물학적 샘플을 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 상기 결합 성분과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 결합 성분과 PD-L1 간의 복합물이 형성되는 지의 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 내 PD-L1의 존재의 검출 방법.
  36. 제35항에 있어서, 시험관내 방법 또는 생체내 방법인, 생물학적 샘플 내 PD-L1의 존재의 검출 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 인간 기원인, 생물학적 샘플 내 PD-L1의 존재의 검출 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈액 샘플, 소변 샘플, 뇌척수액 샘플, 생검 샘플 및/또는 림프액 샘플 중 적어도 하나인, 생물학적 샘플 내 PD-L1의 존재의 검출 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 결합 성분으로 치료하는 데 적격인 대상체를 선택하기 위한 방법인, 생물학적 샘플 내 PD-L1의 존재의 검출 방법.
  40. PD-L1과 PD-1 하위단위의 수용체 복합체 간의 상호작용을 저해하는 방법으로서,
    (a) PD-L1뿐만 아니라 상기 수용체 복합체를 제공하는 단계; 및
    (b) PD-L1을 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 결합 성분과 접촉시키는 단계를 포함하는, PD-L1과 PD-1 하위단위의 수용체 복합체 간의 상호작용을 저해하는 방법.
  41. PD-L1 생물학적 활성을 저해하는 방법으로서,
    (a) PD-L1을 제공하는 단계; 및
    (b) PD-L1을 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 결합 성분과 접촉시키는 단계를 포함하는, PD-L1 생물학적 활성을 저해하는 방법.
  42. 설명서와 시약의 패키징된 조합체(packaged combination)와 함께 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 상기 결합 성분을 포함하는 키트.
KR1020187024673A 2016-02-25 2017-02-24 Pd-l1에 대한 결합 성분 KR20180111870A (ko)

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