CN101232895A - 用于治疗转移性癌症的治疗肽 - Google Patents

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Abstract

用与MUC1上的结合位点特异性结合的多肽或者抗体能够中断MUC1和β－联蛋白之间的相互作用。相互作用的中断提供了抑制、减轻和/或者阻滞癌症的侵入或转移的有益作用。提供了融合多肽和抗体以获得治疗作用。

Description

用于治疗转移性癌症的治疗肽
[01]本申请要求2005年4月15日提交的临时专利申请第60/671,956号的权益，该专利申请的公开内容在此全部引用作为参考。
技术领域
[02]本发明涉及癌症治疗领域。具体地，本发明涉及抑制、延缓和减轻转移癌生长的方法。
背景技术
[03]乳腺上皮细胞从有序的、依赖激素和生长因子的组织发展到一种转移性瘤的过程包括许多步骤。这个发展过程包括生长控制的丧失，逃避细胞凋亡和衰老，侵入间叶细胞和随后在二级位点处的血管内渗和外渗。侵入能力是该过程的关键步骤，侵入主要被黏合连接的正常功能抑制。黏合连接正常发挥功能依赖于一系列蛋白质的相互作用，这些蛋白质的相互作用连接周边细胞(通过E-钙粘着蛋白同型相互作用)和胞内肌动蛋白细胞骨架(通过β-联蛋白)。肿瘤抗原MUC1蛋白是一种通过隔离β-联蛋白和E-钙粘着蛋白促使黏合链接功能失调的蛋白。这个提议旨在理解MUC1/β-联蛋白相互作用在细胞入侵中的功能重要性和识别中断这些相互作用的机制，作为抑制细胞入侵和转移的手段。
[04]在癌变进程中，黏合链接(物)的蛋白组分常常失调。许多癌症患者的E-钙粘着蛋白表达能力丧失并且细胞不再维持同型相互作用。另外，β-联蛋白因其不但作为细胞黏附蛋白而且还作为原癌基因而具有特殊的重要性。β-联蛋白之所以具有这些功能是因为它不但参与了E-钙粘着蛋白介导的细胞粘附，而且还存在于分散的细胞质和核库中，它作为Wnt-介导的信号途径中关键的参与者和作为核辅助因子发挥着功能(Orsulic等，1999)。在极化的上皮细胞中，β-联蛋白是黏合链接物和肌动蛋白细胞骨架之间的重要的连接物。在这些正常的细胞条件下，任何多余的β-联蛋白通过复杂的信号级联途径被降解，该信号级联牵涉肿瘤抑制因子APC(腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis coli))(Polakis，2000)。作为选择，在转化条件下，多余的β-联蛋白常常在乳腺癌肿瘤和转移瘤的细胞质中积累(Schroeder等，2003)，在那里它与同E-钙粘着蛋白竞争β-联蛋白结合位点的蛋白相互作用(Polakis，2000；Sommers，1996)。其中研究地最透彻的是β-联蛋白与核内的tcf/lef转录因子之间的相互作用，这种相互作用导致了包括c-myc和细胞周期蛋白D1在内的多种基因产物的转录(He等，1998；Shtutman等，1999；Tetsu和McCormick，1999)。在包括乳腺癌在内的其他转化组织中，也发现了β-联蛋白与包括erbB受体和肿瘤抗原MUC1在内的跨膜蛋白的相互作用(Li等，1998；Yamamoto等，1997)。
[05]除了在超过90％的人乳腺癌和转移癌中过量表达(高10倍)外，MUC1是在泌乳期乳腺中大量表达的高度O-糖基化的蛋白(Hilkens等1995；Zotter等1988)。在正常的乳腺中，MUC1主要在乳腺上皮细胞的顶面表达；然而在乳腺癌中，MUC1被过表达，糖基化不足和顶端定位丧失(Hilkens等，1995)。MUC1的胞质结构域存在含SH2蛋白的潜在停泊位点，还含有多种假定的激酶识别位点，该结构域不论在体内或体外都被酪氨酸磷酸化的(Schroeder等，2001；Zrihan-Licht，1994#248)。MUC1通过类似于在APC蛋白中发现的胞质尾中的基序与GSK3β和β-联蛋白结合。MUC1与β-联蛋白的结合降低了ZR-75-1乳腺癌细胞中β-联蛋白与E-钙粘着蛋白的结合(Li等，1998；Yamamoto等1997)。这可能潜在地破坏了上皮细胞中E-钙粘着蛋白介导的细胞粘附，从而促进了细胞迁移(Li等，1998)。事实上，通过利用反义寡核苷酸而导致的人乳腺癌细胞系(ZR-75-1S和YMB-S)中的MUC1的减少，造成细胞粘附的E-钙粘着蛋白依赖性增加(Kondo等，1998)。此外，对侵入性人乳腺癌样品的分析表明，MUC1和β-联蛋白的相互作用发生在原发性肿瘤中，但是在淋巴结转移癌中发生的频率更高(Schroeder等，2003)。研究已表明，MUC1/β-联蛋白之间的相互作用依赖由c-src激酶(Li等，2001b)和蛋白激酶C δ(PKCδ)(Ren等，2002)引起的MUC1的磷酸化。在该系统中，由c-src或者PKCδ引起的MUC1的磷酸化降低了其对GSK3β的亲和力和增加了与β-联蛋白的结合。
[06]Muc1在β-联蛋白诱导的乳腺癌进程中的作用已经在体内肿瘤模型MMTV-Wnt-1中得到了遗传学验证。Wnt是一个分泌性的糖蛋白，它与跨膜卷曲的(frizzled)受体结合，从而触发了信号级联反应，使得β-联蛋白的降解机制失效(He等1998；Polakis，2000；Shtutman等，1999；Tetsu和McCormic，1999)。这导致在MMTV-Wnt-1转基因小鼠的细胞质中产生了显著的更高水平的β-联蛋白和随机地形成单病灶乳腺肿瘤(Tsukamoto等，1988)。在MMTV-Wnt-1转基因小鼠的肿瘤中发现，在转化的上皮细胞的细胞质和细胞膜中，MUC1和β-联蛋白以一种肿瘤特异性的方式发生生物化学相互作用。为了确定MUC1在该模型癌变进程中是否具有功能重要性，将MMTV-Wnt-1转基因小鼠与Muc1基因敲除小鼠进行杂交(Schroeder等，2003)。小鼠Muc1基因的敲除使得肿瘤的发作时间推迟几乎50％。在同样的研究中，发现含有MUC-1细胞质结构域蛋白片段的脉冲(pulsing)侵袭性乳腺癌细胞系侵袭能力增加。这些片段代表多个蛋白质相互作用位点，其功能类似于转染整个MUC1胞质尾区。定位试验表明这些肽跟踪侵袭伪足(invadopodia)并与β-联蛋白共存。这暗示MUC1和β-联蛋白的结合促使β-联蛋白远离黏合连接取而代之定位在膜突起位点上。在该位点，β-联蛋白与细胞骨架调节蛋白质相互作用的能力促使这些蛋白重新分布和促进细胞侵袭。因此，当MUC1与β-联蛋白形成复合体后，它可能作为支架蛋白将多个激酶与肌动蛋白细胞骨架在膜侵袭位点处集合在一起，从而促进β-联蛋白与侵袭细胞边界之间新的相互作用。该复合体的形成不但在非转移疾病中促进从增生转化为癌症，而且也诱导了转移侵入所需的动态改变。
[07]近来的研究表明MUC1是一个癌基因。体内和体外实验都表明MUC1(特别是MUC1的胞质尾)的过度表达会导致乳腺上皮细胞的转化(Li等2003和Schroeder等提交给JBC)。当MUC1在转基因小鼠(MMTV-MUC1)内过度表达时，大约60％的多胎雌鼠发生乳腺肿瘤，其潜伏期长且高度可变(Schroeder等，2004)。形成原发性乳腺肿瘤的小鼠中的90％也会患上肺转移瘤。MUC1和β-联蛋白之间的免疫沉淀研究表明，这两种蛋白之间的相互作用发生在肿瘤组织中而不是正常的乳腺中。该资料说明MUC1和β-联蛋白之间的相互作用并局限在已经公布的MMTV-Wnt-1模型中(Schroeder等，2003)，也发生在MUC1引发的乳腺肿瘤发生模型中。重要的是，MMTV-MUC1转基因是转移性的，这进一步潜在地暗示了在转移性乳腺癌中发生这种相互作用。最后，体外证据显示，大鼠3Y1成纤维细胞用MUC1转染，也不但导致了转化，而且导致MUC1和β-联蛋白之间形成特定的复合体(Li等，2003)。
[08]在MUC1胞质结构域中的β-联蛋白结合位点被酪氨酸激酶c-src、EGFR和色氨酸/苏氨酸激酶PKCδ的结合位点包围，乳腺癌细胞系和肿瘤组织中的MUC1与这些激酶的相互作用增加。而且，src和PKCδ诱导的MUC1磷酸化促进了MUC1和β-联蛋白之间的结合(Li等，2001)。当提供给细胞模拟整个结构域的肽时，MUC1和β-联蛋白共同定位于共存于侵入性细胞系的侵袭伪足中，并且细胞侵入增加5-10倍(Schroeder等，2003)。当提供给细胞只含有EGFR或GSK3β结合位点的较短的蛋白片段时，则没有观察到细胞侵入和β-联蛋白定位的改变(Schroeder等，2003)。这些资料表明：全长的MUC1细胞质结构域充当支架蛋白，通过将β-联蛋白和细胞激酶在伪足处集合在一起，促进侵入。
[9]开发有效地治疗癌症，特别是晚期癌症和转移性癌的治疗是本领域长期的需要。
发明内容
[10]根据本发明的第一个实施方式，提供了融合肽。该融合肽具有如下结构：
A-B-C或C-B-A。
A是蛋白转导域(protein transduction domain)，其增强粘附的大分子转运通过细胞膜。B是0-5个氨基酸残基的间隔子(spacer)。C是由6-15个氨基酸残基组成的多肽，其包括PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分序列，C的部分序列包括GGSSLS(SEQ ID NO：2)。
[11]根据本发明另一个实施方式，提供了融合肽，其结构为：
A-B-C或C-B-A。
A是蛋白转导域，其增强粘附的大分子转运通过细胞膜。B是0-5个氨基酸残基的间隔子。C是6-15个氨基酸残基的多肽。C包括PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分序列，C的部分序列包括GGSSLS(SEQ ID NO：2)。而且，所述的6-15个氨基酸残基至少有一个被保守地替换，这样不带电荷的极性氨基酸替换不带电荷的极性氨基酸残基，或者非极性的氨基酸替换非极性的氨基酸残基，或者酸性氨基酸替换酸性氨基酸残基。
[12]根据本发明另一个实施方式，提供了融合肽，其具有如下结构：
A-B-C或C-B-A。
A是蛋白转导域，它增强粘附的大分子转运通过细胞膜。B是0-5个氨基酸残基的间隔子。C是6-15个氨基酸残基的多肽。C包括PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分序列，C的部分序列包括GGSSLS(SEQ ID NO：2)。而且，所述的6-15个氨基酸残基中的一个残基被A残基代替。
[13]本发明另一方面提供了一种治疗癌细胞的方法。将癌细胞与上述融合肽接触。癌细胞的侵入性因此被减轻或被阻滞。
[14]本发明另一方面提供了一种治疗癌症患者的方法。给患者施用上述的融合肽，癌的侵入因此被减轻或被阻滞。
[15]根据本发明的另一个实施方式，提供了一种治疗癌症患者的方法。给患者施用能够与PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)结合的抗体，癌的侵入因此被减轻或被阻滞。
[16]根据本发明的另一方面，提供了一种产生用于治疗癌症患者的多肽的方法。将携带编码上述多肽的载体的细胞培养在允许细胞表达所述多肽的条件下。然后从细胞或细胞培养基中收获多肽。
[17]根据本发明的另一方面，提供了一种治疗癌症患者的方法。患者将编码上述多肽的载体施用于癌症患者。多肽因此被表达，癌症的侵入因此被减轻或被阻滞。
[18]通过阅读说明书，这些和其它实施方式对于本领域技术人员将是显然的，其为本领域提供了治疗癌症特别是转移性癌的新工具。
附图说明
[19]图1.肽M2(MUC1-β-联蛋白结合域)抑制MDA-MB-468乳腺癌细胞的侵袭。将胶原凝胶基质倒在8μm孔径的Transwell插入物(transwell insert)(改进的Boyden室)底部，然后倒置入20％的FBS中。细胞用100ng/ml的肽温育(含有Bioporter试剂，以允许细胞摄取)，然后将细胞加入到Tanswell的上部。允许细胞(不含血清)侵入凝胶，将胶去掉，并对侵入细胞计数。
[20]图2.根据MUC1细胞质结构域设计的肽。上面的序列(SEQ IDNO：13)显示了MUC1导向的肽，当被脉冲(pulse)入侵袭性乳腺癌细胞系时，其促进侵袭(Schroeder等，2003)。激酶PKCδ(&)，GSK3β(#)、src和EGFR(@)磷酸化的残基加亮显示(Ren等，2002)。已知与β-联蛋白相互作用的序列用下划线表示。列出了设计用于抑制MUC1/β-联蛋白相互作用的模拟肽(M2、M2P、M2E和ME；SEQ ID NO：7、7、8和14)，其中磷酸化的残基(M2P，-P)和酪氨酸替代为谷氨酸也被示出(M2E和ME)。
[21]图3A-C.在MMVT-pyMT转基因小鼠中，Muc1和β-联蛋白以肿瘤特异性的方式发生相互作用。将MMVT-pyMT转基因小鼠的正常乳腺和乳腺肿瘤均质化，将蛋白裂解物进行免疫沉淀获得β-联蛋白和进行免疫印迹获得Muc1(图3A)。图3B和3C显示了这些组织中β-联蛋白和Muc1的总水平。
[22]图4.在侵入试验中，与对照TAT肽相比，用MEBTAT处理MDA-MB-231细胞导致细胞侵入降低5倍。
发明祥述
[23]本发明发现致癌性MUC1和β-联蛋白不但促进癌症侵入，而且通过阻断它们之间的相互作用(使用MUC1模拟肽[MEB])，我们能够抑制癌的侵入和转移。
[24]本发明的融合蛋白可以使用任何蛋白转导域。这些蛋白转导域包括以前已经被鉴定并已应用于蛋白转导的任何结构域。参见例如Dietz和Bahr，Molecular and Cellular Neuroscience，27(2004)85-131中广泛的表1。这样的转导域中的一些在SEQ ID NO：3、4、5和6中示出，但本发明并不局限于应用这些转导域。这些转导域有利于细胞摄取粘附肽。
[25]本发明的间隔子是用于融合蛋白的另外的氨基酸残基，通常为了帮助合成或制造。它们可以基本上无毒，一般长度为0-5个氨基酸残基。接头可以是单一残基或混合残基。这些残基可以是随机的，或者是来自其它蛋白质的序列，或者为了特定的理由而设计。
[26]尽管人们已经发现MUC 1的一些部分能促进癌的侵袭和转移，但令人惊奇的是，现在发现它的某些长度的部分和组成实际上抑制侵袭和转移。如前所示，MUC1细胞质结构域肽如SEQ ID NO：14增加乳腺癌细胞的侵袭(Schroeder，2003)。令人惊奇的是，这些肽较短的部分实际上具有相反的作用。这些肽包括选自SEQ ID NO：1中的6-15个连续的氨基酸残基，并包括SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。肽精确序列的微调(微小的偏差)可以用于优化活性，例如通过替换肽的一个，两个或者三个氨基酸残基进行保守的改变或者用丙氨酸替换。保守改变是指相似的氨基酸残基之间相互替换，如用不带电荷的极性氨基酸替换不带电荷的极性氨基酸，或者用非极性氨基酸替换非极性氨基酸，或者用酸性氨基酸替换酸性氨基酸。G或S残基可以用G、S、T、C、Y、N和Q替换。L残基可以用A、V、I、P、F、W和M替换。A、V和P残基可以用A、V、L、I、P、F、W和M残基替换。Y或N残基可以用G、S、T、C、Y、N和Q残基代替。E残基可以用D残基代替。残基K可以用残基R或者H代替。丙氨酸可以替代任何残基，除非这种替代破坏侵袭和转移抑制活性。这些被替代的肽可以利用实施例中提到的侵袭试验容易地进行检测。
[27]在体外或体内，癌细胞可以与本发明的融合肽接触，或供应以本发明的融合肽。本发明的融合肽可以作为肽直接供给癌细胞，或者可以通过供给细胞以核酸载体而被内源性产生，所述核酸载体在细胞内表达和产生融合肽。对于体内用药，可以采用本领域已知的任何输送技术，包括但不局限于直接瘤内注射、肌肉注射、血管内注射、皮下注射和腹腔内注射等。体外输送可以例如简单地通过在培养基中补充融合肽的方法完成。
[28]根据本发明，可以治疗的癌和癌细胞包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肺癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肾癌和肝癌。用药后观察到的效果是侵袭和转移的降低的程度或延缓的速度。实施例阐述了用于测量这些过程的合适的分析方法。也可以利用本领域已知的其它分析方法。
[29]根据本领域已知的技术可以设计和修改合成融合肽。这可以包括共价修饰如封闭法(加帽，capping)或者聚乙二醇化，或者与微胶束或脂质体结合。这些修饰和设计可以增加体内的稳定性，从而使得较高百分数量的输入剂量到达目标癌症。本发明的融合肽也可以结合其它治疗措施使用。治疗可采取同时用药或连续用药。治疗癌症的其它合适的治疗方法包括化学治疗药剂给药或输注，抗肿瘤抗体、抗受体抗体，放射治疗，放射性标记的药物和手术。给患者使用两种作用形式不同的治疗手段可能增加疗效。
[30]通过提供给癌细胞或癌症患者各种抗体，可以获得对MUC1与β-联蛋白结合的相似的抑制效果。抗体可以是任何形式的抗体，单克隆抗体或者多克隆抗体，单链抗体或者多链抗体。抗体可以在宿主乳腺，细胞培养物或者重组细胞中产生。抗体结合到包含在SEQ ID NO：1中的表位上。用SEQ ID NO：1的肽作为免疫原，例如或者用本发明的融合肽作为免疫原，或者用其它融合肽作为免疫原，能够产生抗体。
[31]用于传递编码本发明的融合肽的核酸的载体可以是本领域中已知的任何载体。腺病毒载体和腺相关载体已为我们所熟知并且被广泛应用。另外也可以应用非病毒载体如纳米颗粒，脂质体和胶束。逆转录病毒载体可以用于一些实施方式中。本领域技术人员可以根据自己的目的选择合适的载体。同样，本领域技术人员可以选择载体和宿主细胞系统，用于在培养中重组制备本发明的融合蛋白。
[32]以上公开内容概括性地描述了本发明。所有在此公开的参考文献明确并入本文作为参考。通过参考下文的具体实施例，可以获得更全面的理解，提供的这些实施例仅仅是示意性的目的，并不为了限制本发明的范围。
实施例1--方法
[33]肽的设计：我们设计了MUC1胞质结构域的肽，它包含已经公开的β-联蛋白的结合位点(Li等，1998；Li等，2001a；Li等，2001b)。由于MUC1的酪氨酸被EGFR和c-src磷酸化，我们设计了酪氨酸残基磷酸化的新生25-聚体肽，以及将确定MUC1与β-联蛋白之间的相互作用对酪氨酸磷酸化的需求。而且，我们还设计了酪氨酸残基突变为谷氨酸残基的多肽，以确定这是否会进一步抑制细胞侵入。这些肽都将由加利福尼亚州桑尼维尔(Sunnyvale，CA)的美国肽公司(AmericanPeptide Company)合成。产生的肽的纯度水平为85％(HPLC纯化，质谱检测)，为了便于鉴定，C端进行了生物素化。
[34]肽的处理和侵袭分析：将孔径8μm的Transwell insert(Corning公司)倒置并涂上90μl的I型胶原(鼠尾，BD Scientific)胶混合物(2.2％碳酸氢二纳，10×M199培养基)，凝固30分钟。然后将Transwell孔倒放入含有20％胎牛血清的DMEM中再水合。肽用BioPORTER试剂(Sigma，St.Louis MO)温育5分钟以促进细胞的摄取，涡旋，然后放进不含血清的细胞培养液中(检测如下浓度：10ng/ml，100ng/ml和ug/ml)，并放在Tranwell的上室。然后将细胞温育2，4，或者24小时。去除培养液，胶用4％的多聚甲醛固定30分钟后转移到PBS(pH 7.4)中。然后或者用bizbenzamide染色胶原凝胶40分钟，并对侵袭入胶内的所有细胞进行计数；或者用于免疫荧光分析。将肽处理的细胞侵袭与PBS/bioporter处理的对照或者无关肽处理的细胞侵袭进行比较。
[35]免疫沉淀和western印迹：使肽脉冲后的细胞侵袭进入倒入4孔的微量培养皿中的胶原凝胶中。侵袭后，裂解细胞，降解胶原(用胶原酶处理)和进行BCA分析(Pierce)。采用之前所述的方法(Schroeder等，2003)对蛋白裂解物进行免疫沉淀，以检测内源MUC1和β-联蛋白的共沉淀水平，肽和β-联蛋白的共沉淀水平，E-钙粘着蛋白和β-联蛋白的共沉淀水平。简单的说，裂解物或者通过SDS-PAGE分离并直接转移到PVDF膜(Immobilon)上，或者先进行免疫沉淀然后再通过SDS-PAGE分离。免疫印迹和免疫沉淀所用的抗体从以下来源获得：抗-Muc1(Santa Cruz Biochemical)，抗-β-联蛋白(H-102，用于免疫沉淀；C-18，用于免疫印迹；二者均来自Santa Cruz Biochemical)。
[36]免疫荧光：对正在侵袭通过胶原凝胶的细胞进行原位免疫荧光标记(在胶原凝胶中)。对于胶原凝胶上的免疫荧光，在室温下，用含有0.5％Triton X-100的10mM Pipe(pH 6.8)，50mM NaCl，300mM蔗糖和3mM MgCl2的对凝胶进行透化处理5分钟。然后用含有3％BSA(Sigma)和0.05％Tween 20的1∶1的PBS：增强洗涤缓冲液(EnhancingWash Buffer)(Innovex)的溶液封闭凝胶。一抗4℃温育过夜，在1∶1的PBS：Enhancing Wash Buffer中洗涤凝胶6小时。二抗4℃温育过夜，在室温下再次洗涤6小时。然后将凝胶安放在载玻片上，盖上盖玻片，并用Zeiss激光扫描共焦显微镜分析。所用的抗体有：抗生物素(链亲和素-Alexa594，1∶500，Moleculat Probes)，抗-Muc1(1∶100，Santa Cruz)，抗纽蛋白(V9131，1∶400，Sigma化学公司)，抗β-联蛋白(H-102，1∶100，Santa Cruz Biochemical)，抗成束蛋白(FCN01，1∶50，Neomarkers)和抗-鬼笔环肽(phalloidin)-Alexa546(1∶100，Moleculat Probes)。二抗可以是Molecular Probes的Alexa488或566。
[37]靶向肽组织：为了验证肽穿过质膜的能力，在合成过程中将肽连接倒FITC标签。将肽与HIV蛋白TAT(反式激活的转录激活子蛋白)的蛋白转导域结合，这使得肽能够以胞吞和能量非依赖性方式穿过细胞膜(Torchilin等，2001b)。肽的序列为：NH2-FITC-GGG-YARAAARQARA-MUC1肽-COOH。用我们的体外系统对肽进行检验，然后进行静脉内或腹腔内注射。为了减少肽在全身输送过程中降解，用修饰的PEG将肽缀合到小的胶束或脂质体上(Torchilin等，2001a；Valero等，1999)，或者对肽进行末端修饰如C-端酰胺化或N-端乙酰化。注意在以前的研究中，把TAT的PTD结构域作为β-半乳糖苷酶的肽标签，伴随肽被转导入小鼠体内大部分(如果不是全部的话)组织中，获得全身体输送(Schwarze等，1999)。
[38]实验动物：为了获得我们的研究所需的统计学相关的动物数量，我们每组处理采用20只动物，其包括野生型，转基因动物的三个优化剂量处理组。我们建立了额外的研究组，分别在6周龄，8周龄和10周龄时开始治疗，以对处于早期、中期和晚期肿瘤的转基因动物模型进行治疗。结果使用了180只转基因动物和80只野生型动物。我们分析了腹腔内注射和静脉内注射两种方式，以确定哪一种产生最好的输送结果。
[39]组织学：实验动物每周触诊三次以监测肿瘤的生长情况。当肿瘤负荷达到体重的5％或动物生长到16周龄时(大约50％的动物已经形成肺转移瘤的时间点)，处死动物。取下乳腺，肿瘤和肺组织，并在Methacarn中固定或者制备蛋白裂解物进行分析。固定的肺在解剖显微镜下分析以确定转移性损害。我们以前在MMTV-pyMT模型中分析了该方法，并与肺部的连续切片和苏木精与曙红染色鉴定转移肿瘤的方法进行比较(数据没有显示)。我们发现，在鉴定该转基因模型的肺转移肿瘤中，两种方法之间有100％的一致性。
[40]免疫荧光：根据前述的方法(Schroeder等，2001)分析了组织切片。用于组织免疫荧光的抗体有：抗-Muc1(Santa Cruz Biochemical)和抗β-联蛋白(H-102，1∶500，Santa Cruz Biochemical和A11010-Alexa546，1∶500，Molecular Probes)。对组织片段进行石蜡包埋，切片和确定荧光标记的肽存在与否。
[41]免疫沉淀：采用前述的方法(Schroeder等，2003)制备蛋白裂解物。我们分析了不同的处理组，以确定肽的处理是否降低了β-联蛋白和MUC1形成生化复合物的能力。
[42]统计分析：我们利用了亚利桑那州癌症中心的生物统计学核心(Arizona Cancer Center’s Biometry Core)来确定产生显著性统计结果所需要的动物数量。
实施例2-MUC1的表达对乳腺癌侵袭的作用
[43]为了探讨MUC1的表达对乳腺癌侵袭的功能意义，我们用MUC1模拟肽温育侵袭性乳腺癌细胞系，所述MUC1模拟肽针对β-联蛋白相互作用结构域而设计。然后监测肽处理对侵入通过滤膜并进入胶原凝胶中的影响。
[44]在MDA-MB-468细胞中，我们用这些β-联蛋白结合位点(M2)肽进行初步试验。用MUC1/β-联蛋白(M2)肽处理导致这些细胞侵入胶原凝胶的能力被抑制大约8倍(图1)。4小时后我们发现只有不到15个M2肽处理的细胞侵入胶原凝胶中，与之相比，在PBS对照中大约125个细胞侵入胶原凝胶中。用非特异性肽(M3)处理得到与PBS处理的对照相似的结果。
[45]通过这些初步试验，对MUC1结合域的分析，使得我们能够创建蛋白质相互作用的模型。为了MUC1有效地结合到β-联蛋白并促进肿瘤细胞的转化和侵袭，它必须首先同c-crc、PLCδ和EGFR激酶相互作用(结合域见图2)(Li等，2001b)。M2肽含有MUC1的β-联蛋白的结合位点，但是不含有用于同前面所述的任何激酶相互作用的位点。
假如M2肽能够与内源β-联蛋白相互作用，它就能潜在地阻止内源MUC1与β-联蛋白发生相互作用。因此，肽M2可能作为一个显性的负蛋白发挥功能，其与β-联蛋白结合，但这阻止了它与完整的MUC1以侵袭-促进模式进行相互作用。我们还产生了一些新生的和磷酸化的肽，试图优化这种侵袭抑制(图2)。我们的设计策略集中在使Muc1和β-联蛋白之间的相互作用域最小化，同时调整酪氨酸激酶残基，试图确定酪氨酸磷酸化在蛋白结合过程中的功能意义。
实施例3-小鼠模型中的MUC1和β-联蛋白的相互作用
[46]在转移乳腺癌自发模型中MUC1和β-联蛋白发生相互作用。尽管很多模型已经显示Muc1和β-联蛋白的相互作用是肿瘤特异性的(MMTV-Wnt-1，MMTV-MUC1和乳腺癌细胞系)，但由于各种原因(包括与人类疾病的相关性，肿瘤的发生和潜伏)，它们不是最好的临床前模型。因此我们找到了另外的老鼠模型，其可能作为测试我们的肽治疗的合适的模型。乳腺癌模型MMTV-pyMT(鼠乳腺癌病毒启动子驱动的多瘤Middle T抗原)是一个转基因小鼠，它形成乳腺癌，并且在超过70％的所分析的动物中转移成肺癌(Guy等，1992a)。这是一个很好的研究乳腺癌进展的模型，因为它是a)转移的，b)由pyMT癌基因驱动的，该癌基因与大量的包括MUC1在内的细胞信号转导途径相互作用，c)在12-15周龄时形成肿瘤，这使得它成为一个药物实验的好模型，d)在组织学上是一个高变和渐进性疾病(Maglione等，2001)。我们考察了该模型中MUC1和β-联蛋白之间的相互作用，发现它们以肿瘤特异性的方式相互作用(图3)。尽管Muc1和β-联蛋白在正常的乳腺和乳腺肿瘤中都被表达(图3，下面的两个图)，但是在正常的乳腺中通过免疫沉淀观察不到这两个蛋白有显著的生化相互作用。然而，在肿瘤中观察到Muc1和β-联蛋白之间显著的相互作用(图3，显示的数据来源于不同小鼠的两个肿瘤，我们在其它7个肿瘤中重复了该结果)。这些数据说明这两个蛋白之间的相互作用是肿瘤特异性的，从而使之成为用于我们基于肽的治疗的理想模型。我们打算将该转基因鼠应用于我们的抑制性MUC1模拟肽的临床前实验中。
实施例4-TAT缀合的MUC1-模拟肽
[47]我们设计了TAT缀合的MUC1-模拟肽，因为它能够抑制MDA-MB-231和MDA-MB-468侵袭性乳腺癌细胞系的侵袭。设计的肽携带TAT转导域，以便进入细胞。设计、产生和测试了下面这些肽：
[48]MTAT1(TAT-SSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNP；SEQ ID NO：12)这个肽代表MUC1胞质结构域，已知该结构域能与包括β-联蛋白在内的多种肽发生相互作用。该肽用作阳性对照。
[49]TAT这是TAT转导域，它能够促进细胞摄取缀合的肽。该肽用作阴性对照。
[50]MBTAT(TAT-SAGNGGSSLS；SEQ ID NO：9)该肽代表β-联蛋白/MUC1相互作用位点，还有4个额外的残基包围着该最小相互作用位点。
[51]MB’TAT(TAT-GGSSLS；SEQ ID NO：2)该肽代表已经报道的最小β-联蛋白/MUC1相互作用位点。
[52]MEBTAT(TAT-PYEKVSAGNGGSSLS；SEQ ID NO：1)该肽为含有额外的EGFR相互作用位点的MBTAT肽。
[53]在我们的分析中，MTAT1增加18倍的侵袭能力，而MBTAT则抑制侵袭能力8倍。这些数据表明全长的MUC1模拟肽能够促进细胞侵袭，在本质上模拟了内源MUC1的作用。相反，较短的MBTAT肽可能通过抑制内源MUC1和β-联蛋白相互作用的能力阻断侵袭。MEBTAT阻断MDA-MB-231乳腺癌细胞侵袭的达6倍，我们正在探讨这是否是由于阻断了MUC1和β-联蛋白之间，MUC1和EGFR之间或者MUC1与β-联蛋白和EGFR之间的相互作用的缘故。因为以前的公开资料表明MUC1和β-联蛋白之间的这种相互作用在乳腺癌的扩散中是重要的，我们提出利用肽MBTAT和METAT对动物进行治疗。
[54]我们利用MBTAT和MEBTAT(荧光标记)来处理转基因小鼠。使用MMTV-pyMT转基因小鼠。
实施例5
[55]用肽处理MDA-MB-231细胞显示出β-联蛋白的不同定位。TAT对照肽处理导致分散的定位。MEBTAT肽处理导致β-联蛋白定位于病灶性粘附和伪足处。
实施例6--严重联合免疫缺陷(scid)异种移植模型试验
[56]试验1.将MDA-MB-231细胞系(在基质胶中)注射到24只鼠的乳腺脂肪垫中。然后将这些鼠分成3组，每天注射一次MWF，注射两周。
组IA用10μg/g体重的肽MEBTAT处理
组IB用20μg/g体重的肽MEBTAT处理
组IC用20μg/g体重的肽TAT处理
[57]在两周末，在组IA中1/7的动物中出现了27％的肿瘤消退，组IB中1/7的动物中出现了7％的肿瘤消退，而组IC中没有动物(0/7)出现肿瘤消退。分析了所有的处理组的肿瘤体积，结果显示：MEBTAT处理的鼠同TAT处理的鼠比较，前者的肿瘤体积减少20％。
[58]最后一次用药3天后把所有的肿瘤手术切除，再观察老鼠10天。所有3个组的肿瘤都重新生长，并且生长速率没有显著差异。通过监测动物随时间推移的存活率，结果发现三个组的存活率存在显著差异。存活分析发现，IA组小鼠100％的存活时间为38天，IB组小鼠100％的存活时间为43天，然而IC组小鼠100％的存活时间只有32天。这与注射了20μg/g体重的肽MEBTAT的动物100％的总体存活时间要比注射TAT的动物增加25％相一致。重要的是，在任何动物中都没有肽处理的可检测到毒性。
[59]试验II：将MDA-MB-231细胞系(在基质胶中)注射到16只小鼠的乳腺脂肪垫中。然后将这些小鼠分成两组，每天注射一次MTWThF，注射两周。
组IIA用20μg/g体重的肽MEBTAT(静脉内)处理
组IIB用20μg/g体重的肽TAT(静脉内)处理
[60]在两周末，观察到在组IIA中3/8的小鼠出现了肿瘤消退(肿瘤体积分别减少7％，9％和21％)，组IIB中的小鼠没有出现肿瘤消退(0/8)。处死所有的动物并分析肿瘤转移。组IIA动物的不同组织可见的转移分别为：肺0/8，隔膜4/8，肝1/8。组IIB动物的不同组织可见的转移分别为：肺0/8，隔膜4/8，肝3/8。(注意：在该实验中，由于处死时间过早，没有期望出现肺转移)。没有发现处理对动物的可见毒害。这些数据说明肽MEBTAT处理可导致肿瘤生长减慢和肿瘤远距离转移减少。
[61]这些数据表明肽MEBTAT对乳腺癌具有抗肿瘤和抗转移的作用，更重要的是它没有毒性。
实施例7-丙氨酸扫描突变体(alanine-scanning mutant)的侵袭分析
[62]用丙氨酸替换MEB序列[PYEKVSAGNGGSSLS；SEQ ID NO：1]的氨基酸，一次替换一个氨基酸。(注意由于母链中已有一个丙氨酸，所以只有14个氨基酸突变体)。也要注意该实验做了一次，每个数据点有4个重复。
[63]采用96孔板形式进行了新的分析。尽管对侵袭的抑制没有在24孔板形式中观察的那样显著，但我们仍然观察到用MEBTAT处理对侵袭的抑制比用TAT或者PBS处理高3倍。改变#9氨基酸(N)或者#14氨基酸(L)对MEBTAT抑制侵袭的能力没有明显的影响。而改变任何剩下的氨基酸完全消除了所述影响，这说明了TYEKV(EGFR/src结合位点)和SAGNGGSSLS(β-联蛋白结合位点)具有关键的作用。连接MEB和TAT的P(在残基#1上)也是重要的。脯氨酸可能为该肽到达MUC1结合位点提供了重要的入口。
[64]用MEBTAT(M)，TAT(T)，PBS(P)，或者MEBTAT的丙氨酸扫描突变体处理MDA-MB-231细胞1小时。细胞用钙黄绿素乙酰甲酯(Calcein-AM)处理并使其侵袭穿过8μm的Transwell进入I型胶原凝胶中18小时。侵袭采用分光光度计进行分析。
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所有引用的参考文献的公开内容都明确并入本文。
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<151>2005-04-15
<160>14
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>15
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser
 1               5                  10                  15
<210>2
<211>6
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Gly Gly Ser Ser Leu Ser
 1               5
<210>3
<211>14
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>3
Ser Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Cys
 1                5                 10
<210>4
<211>19
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Ser Gly Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp
 1               5                  10                  15
Lys Lys Cys
<210>5
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala
 1               5                  10
<210>6
<211>34
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>6
Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr
 1               5                  10                  15
Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro
            20                  25                  30
Val Glu
<210>7
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>7
Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr
 1               5                  10
<210>8
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>8
Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Glu
 1               5                  10
<210>9
<211>10
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>9
Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser
 1               5                  10
<210>10
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>10
Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser
 1               5                  10
<210>11
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>11
Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr
 1               5                  10
<210>12
<211>25
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>12
Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly
 1               5                  10                  15
Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro
            20                  25
<210>13
<211>26
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>13
Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val
            20                  25
<210>14
<211>24
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>14
Asp Arg Ser Pro Glu Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser
 1               5                  10                  15
Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val
            20

Claims (51)

1.一种融合肽，具有如下结构：
A-B-C或者C-B-A
其中A是蛋白转导域，其增强粘附的大分子转运通过细胞膜；
其中B是0-5个氨基酸残基的间隔区；
其中C是6-15个氨基酸残基的多肽，其中C包括PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分，其中C的部分包含GGSSLS(SEQ ID NO：2)。
2.权利要求1所述的融合肽，其中A包含人免疫缺陷病毒TAT蛋白的蛋白转导域(SGYGRKKRRQRRRC；SEQ ID NO：3)。
3.权利要求1所述的融合肽，其中A包含触角足的蛋白转导域(SGRQIKIWFQNRRMKWKKC SEQ ID NO：4)。
4.权利要求1所述的融合肽，其中A包含PTD-4(YARAAARQARA；SEQ ID NO：5)。
5.权利要求1所述的融合肽，其中A包含HSV I型蛋白VP22的蛋白转导域(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE；SEQID NO：6)。
6.权利要求1所述的融合肽，其中A包含聚精氨酸、聚赖氨酸，或者精氨酸和赖氨酸的共聚物。
7.权利要求1所述的融合肽，其中B包含甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸。
8.权利要求1所述的融合肽，其中C由SAGNGGSSLSY(SEQ IDNO：7)组成。
9.权利要求1所述的融合肽，其中C由SAGNGGSSLSE(SEQ IDNO：8)组成。
10.权利要求1所述的融合肽，其中C由SAGNGGSSLS(SEQ IDNO：9)组成。
11.权利要求1所述的融合肽，其中C包含EKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：10)，但是不含有被PKCδ、GSK3β、SRC和EGFR磷酸化的残基。
12.权利要求1所述的融合肽，其中C由SAGNGGSSLSY(SEQ IDNO：11)组成，其中残基Y被磷酸化。
13.权利要求1所述的融合肽，其中C由PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)组成。
14.权利要求1所述的融合肽，其中A是PTD-4(YARAAARQARA；SEQ ID NO：5)，其中B是GGG，C是PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ IDNO：1)。
15.一种融合肽，具有结构：
A-B-C或者C-B-A；
其中A是蛋白转导域，它增强粘附的大分子转运通过细胞膜；
其中B是0-5个氨基酸残基的间隔区；
其中C是6-15个氨基酸残基的多肽，其中C包括PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分，其中C部分包含GGSSLS(SEQ ID NO：2)，其中所述的6-15个氨基酸残基中至少有一个被保守地替换，这样，不带电荷的极性氨基酸替换不带电荷的极性氨基酸残基，或者非极性的氨基酸替换非极性的氨基酸残基，或者酸性氨基酸替换酸性氨基酸。
16.权利要求15所述的融合肽，其中所述多肽的G或者S残基中的其中一个残基用选自G、S、T、C、Y、N和Q的不带电荷的极性氨基酸残基替换。
17.权利要求15所述的融合肽，其中所述的L残基中的一个残基用选自A、V、I、P、F、W和M的非极性氨基酸残基替换。
18.权利要求15所述的融合肽，其中所述的A、V和P氨基酸残基中的一个残基用选自A、V、L、I、P、F、W和M的非极性氨基酸残基替换。
19.权利要求15所述的融合肽，其中所述的Y或者N氨基酸残基中的一个残基用选自G、S、T、C、Y、N和Q的不带电荷的极性氨基酸残基替换。
20.权利要求15所述的融合肽，其中所述的E残基用D残基替换。
21.权利要求15所述的融合肽，其中所述的K残基用R或者H残基替换。
22.一种融合肽，具有结构：
A-B-C或者C-B-A；
其中A是蛋白转导域，它增强粘附的大分子转运通过细胞膜；
其中B是0-5个氨基酸残基的间隔区；
其中C是6-15个氨基酸残基的多肽，其中C包括PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分，其中C部分包括GGSSLS(SEQ ID NO：2)，其中所述的6-15个氨基酸残基的其中一个被A残基替换。
23.一种治疗癌细胞的方法，所述方法包括：
将癌细胞与具有下述结构：
A-B-C或者C-B-A
的融合肽接触，
因此所述癌细胞的侵入被降低或者阻滞，
其中A是蛋白转导域，其增强粘附的大分子转运通过细胞膜；
其中B是0-5个氨基酸残基的间隔区；
其中C是6-15个氨基酸残基的多肽，其中C包括PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分，其中C的所述部分包括GGSSLS(SEQ ID NO：2)，或者其中所述的6-15个氨基酸残基中至少一个被保守地替换，这样不带电荷的极性氨基酸替换不带电荷的极性氨基酸，或者非极性的氨基酸替换非极性的氨基酸残基，或者酸性氨基酸替换酸性氨基酸，或者其中所述的6-15个氨基酸残基中的一个残基用A残基代替。
24.权利要求23所述的方法，其中所述癌细胞为乳腺癌细胞。
25.权利要求23所述的方法，其中所述癌细胞为卵巢癌细胞。
26.一种治疗癌症病人的方法，所述方法包括：
给癌症患者施用具有下述结构：
A-B-C或者C-B-A
的融合肽，因此所述癌症的侵入被减轻或者阻滞，
其中A是蛋白转导域，它增强粘附的大分子转运通过细胞膜；
其中B是0-5个氨基酸残基的间隔区；
其中C是6-15个氨基酸残基的多肽，其中C包括PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分，其中C的所述部分包括GGSSLS(SEQ ID NO：2)，或者其中所述的6-15个氨基酸残基中至少一个被保守地替换，这样不带电荷的极性氨基酸替换不带电荷的极性氨基酸，或者非极性的氨基酸替换非极性的氨基酸残基，或者酸性氨基酸替换酸性氨基酸，或者其中所述的6-15个氨基酸残基中的一个残基用A残基代替。
27.权利要求26所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌。
28.权利要求26所述的方法，其中所述癌症为卵巢癌。
29.权利要求26所述的方法，其中所述融合肽经血管内给药。
30.权利要求26所述的方法，其中所述融合肽经皮下给药。
31.权利要求26所述的方法，其中所述融合肽经腹腔内给药。
32.权利要求26所述的方法，其中所述融合肽缀合到胶束或脂质体上。
33.权利要求26所述的方法，其中所述融合肽被乙酰胺封闭。
34.权利要求26所述的方法，其中化学治疗药物也被施用给所述患者。
35.权利要求34所述的方法，其中所述化学治疗药物是紫杉醇。
36.权利要求34所述的方法，其中所述化学治疗药物是顺氯氨铂。
37.权利要求26所述的方法，其中抗肿瘤抗体也被施用给所述患者。
38.权利要求37所述的方法，其中所述抗体结合到HER2受体上。
39.权利要求34所述的方法，其中所述化学治疗药物是放射性的。
40.权利要求26所述的方法，其中外部光束照射也被施用于所述患者。
41.一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括：
给患者施用能够与多肽PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)结合的抗体，因此所述癌症的侵入被减轻或者阻滞。
42.一种生产用于治疗癌症患者的多肽的方法，所述方法包括：
培养含有编码具有下述结构：
A-B-C或者C-B-A
的融合多肽的载体的细胞，培养条件为所述细胞表达所述多肽，
其中A是蛋白转导域，它增强粘附的大分子转运通过细胞膜；
其中B是由0-5个氨基酸残基组成的间隔区；
其中C是由6-15个氨基酸残基组成的多肽，其中C包括PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分，其中C的所述部分包括GGSSLS(SEQ ID NO：2)，或者其中所述的6-15个氨基酸残基中至少一个残基被保守地替换，这样不带电荷的极性氨基酸替换不带电荷的极性氨基酸残基，或者非极性的氨基酸替换非极性的氨基酸残基，或者酸性氨基酸替换酸性氨基酸残基，或者其中所述的6-15个氨基酸残基中的一个残基被A残基代替；和
从所述细胞或者所述细胞培养物中收集所述多肽。
43.一种治疗癌症患者的方法，该方法包括：
给所述癌症患者施用编码具有下述结构：
A-B-C或者C-B-A
的融合多肽的载体，因此所述多肽被表达并且所述癌症的侵入被减轻或者阻滞，
其中A是蛋白转导域，它增强粘附的大分子转运通过细胞膜；
其中B是0-5个氨基酸残基的间隔区；
其中C是6-15个氨基酸残基的多肽，其中C包括PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO：1)的全部或部分，其中C的所述部分包括GGSSLS(SEQ ID NO：2)，或者其中所述的6-15个氨基酸残基的至少一个残基被保守地替换，这样不带电荷的极性氨基酸替换不带电荷的极性氨基酸残基，或者非极性的氨基酸替换非极性的氨基酸残基，或者酸性氨基酸替换酸性氨基酸残基，或者其中所述的6-15个氨基酸残基中的一个残基被A残基代替。
44.权利要求43所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌。
45.权利要求43所述的方法，其中所述癌症为卵巢癌。
46.权利要求22所述的方法，其中SEQ ID NO：1中的位置9上的N残基被A残基替换。
47.权利要求22所述的方法，其中SEQ ID NO：1中的位置14上的L残基被A残基替换。
48.权利要求23所述的方法，其中SEQ ID NO：1中的位置9上的N残基被A残基替换。
49.权利要求23所述的方法，其中SEQ ID NO：1中的位置14上的L残基被A残基替换。
50.权利要求26所述的方法，其中SEQ ID NO：1中的位置9上的N残基被A残基替换。
51.权利要求26所述的方法，其中SEQ ID NO：1中的位置14上的L残基被A残基替换。
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