CN104195175A - 慢病毒载体介导pedf在抑制肾细胞癌血行转移中的应用 - Google Patents
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Abstract
慢病毒载体介导PEDF在抑制肾细胞癌血行转移中的应用属于生物技术领域，该方法构建了重组质粒pBobi-Luc及pBobi-PEDF-IRES-Luc以及将慢病毒包装、纯化，通过分子影像学技术，在体外和体内实时、动态、定量地观察慢病毒介导的PEDF基因抑制肾癌干细胞的增殖、促进其凋亡的过程，发现能够明显抑制肾细胞癌细胞的侵袭转移能力，并活体观测PEDF基因治疗肾细胞癌原位移植瘤的效果，本发明介导PEDF的重组慢病毒载体可能成为肾细胞癌基因治疗的有力工具。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要涉及慢病毒载体介导PEDF在抑制肾细胞癌血行转移中的应用。
背景技术
分子影像学(molecular imaging，MI)的概念，是指活体状态下在细胞和分子水平上应用影像学方法对体内分子的生物化学过程进行定性和定量研究可以直观地显示特定分子在体内的生物学行为。在分子影像学诞生之前，无法观察活体内微小肿瘤病灶和早期的微转移，更无法直观、无创地观察肿瘤细胞在活体内发生、发展以及转移等变化。分子影像学不仅可以可以解决以上问题，还可以在活体动物上获取肿瘤发生、发展、侵袭以及转移机制方面的分子生物学信息。生物发光成像仪是近年来发展起来的一项分子、基因表达的分析检测系统，可以将报告基因即荧光素酶(Luciferase，Luc)基因通过IRES和目的基因相连，当体内报告基因表达后，产生萤火虫素酶，同时外源注入相应的底物后，萤火虫素酶与萤火虫素酶反应将产生荧光，利用生物发光成像仪就可以检测到此荧光，从而反映目的基因的表达。此类技术的主要优点是无辐射，可以连续、实时、无创、定量、直观地检测肿瘤细胞的生物学行为，因为只有报告基因的表达产物与底物(如D-luciferin)发生反应才能检测到信号，所以只对活的细胞成像，且没有背景噪声的影响。分子成像技术具有以上诸多优点，所以可将此技术应用于临床和基础研究。将分子成像研究引入肾癌干细胞基因治疗具有其他方法无可比拟的优势，将解决在活体内无创、实时、直观、定量地检测肾癌干细胞的各种生物学行为的难题。
肾癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤，近年来肾癌发病率与致死率呈逐年上升。由于对其发生、发展和恶化机理的研究一直未见明显突破，加之肾癌对放射治疗和化学治疗都不敏感，所以肾癌的基因治疗显得尤为重要。色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor，PEDF)是目前已知的人体最强的血管生长抑制因子，是最有希望成为治疗肿瘤和血管增生性疾病的候选基因。PEDF属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)家族蛋白。PEDF对维持眼内组织无血管状态具有重要作，可能是维持角膜，玻璃体等眼内组织无血管形成的主要原因。在大鼠脉络膜新生血管(CNV)模型中，注入编码PEDF基因的Adenovirus(Ad-PEDF)，能在视网膜表达PEDF蛋白和mRNA，使CNV受到显著抑制。正常视网膜组织中VEGF和PEDF含量保持平衡，VEGF和PEDF比值改变与新生血管形成程度呈正相关，表明PEDF作为血管抑制剂参与了血管形成的调控。
PEDF抑制肿瘤细胞生长主要通过：诱导肿瘤细胞分化和诱导肿瘤细胞凋亡的途径。最近研究显示：PEDF可以调节IκB磷酸化，或者使其降解，从而调节NF-κB活性。Morais等研究发现NF-κB的激活可以促进肾癌的发生、发展和转移，并且他们发现用四氢吡咯二硫代氨基甲酸盐(PDTC)抑制NF-κB的活性，具有抑制肾癌细胞增殖及促进其凋亡的作用。在基因治疗过程中，基因表达的作用在很大程度上受到转染效率的限制，提高转染效率是一个关键的环节。慢病毒是一种逆转录病毒载体，不但能感染分裂期的细胞并整合到其基因组中，而且还可以感染非分裂期的细胞。
目前慢病毒作为载体包装质粒技术已广泛的应用于基因治疗领域。现有技术中未见报道慢病毒介导的靶向PEDF在在抑制肾细胞癌血行转移中的应用。通过上述研究有望为肾癌的治疗提供一个新的方法，也为临床应用PEDF基因治疗肾癌提供实验依据。
发明内容
本发明提供了一种慢病毒载体介导PEDF在抑制肾细胞癌血行转移中的应用的方法，达到利用慢病毒作为载体包装质粒抑制肾癌细胞增殖的目的。
慢病毒载体介导PEDF在抑制肾细胞癌血行转移中的应用，该方法主要步骤如下：
(1)采用RT-PCR扩增PEDF、IRES、Luc基因，测序并鉴定，将其导入质粒进行扩增；
(2)采用Luciferase PCR产物以限制性内切酶BamHI/XhoI接入pBobi载体，得到pBobi-Luc，构建pBobi-Luc载体，对pBobi-Luc(+)质粒进行扩增、提纯，鉴定；
(3)采用PEDF PCR产物以限制性内切酶BamHI/XhoI接入pBobi载体，得到pBobi-PEDF；Luciferase PCR产物以限制性内切酶BamHI/XhoI接入pcDNA3.1(+)，得到pN31-Luc；IRESPCR产物以限制性内切酶BamHI/XhoI接入pN31-Luc，得到pN31-IL；以BamHI/XhoI酶切pN31-IL，得到IRES-Luc片段，接入XhoI单酶切的pBobi-PEDF，构建pBobi-PEDF-IRES-Luc载体，对pBobi-PEDF-IRES-Luc(+)质粒进行扩增、提纯，鉴定；
(4)分别对pBobi-Luc及pBobi-PEDF-IRES-Luc重组质粒进行包装，得到Lenti-Luc病毒及Lenti-PEDF-Luc病毒。
(5)将Lenti-Luc病毒及Lenti-PEDF-Luc病毒导入进行裸鼠肾癌治疗试验和肾癌细胞试验。
所述步骤(1)中扩增所需引物分别为：
Lucf：TTTGGATCCCCATGGAAGACGCCAAAA；
Lucr：TTTCTCGAGTTACACGGCGATCTTTCC；
IRESF：TTTAAGCTTCCAATTCCGCCCCTC；
IRESr：TTTGGATCCGCTTATCATCGTGTTTTCAA。
步骤(5)所述的裸鼠肾癌治疗试验，针对人PEDF基因的质粒治疗肾癌裸鼠移植瘤模型的建立及治疗的给药方式及剂量，并利用分子影像学技术无辐射，可以连续、实时、无创、直观地监测肿瘤细胞的生物学行为及治疗效果。
步骤(5)所述的肾癌细胞试验，应用慢病毒将荧光酶基因PEDF导入肾癌细胞，并整合到染色体中稳定表达，通过精诺真生物发光分子成像仪，采集Luc基因标记的肿瘤细胞内生物发光信号，使标记细胞在动物体内有复杂的定位，可以精确定量分析肾癌细胞治疗效果。
所述的PEDF基因的质粒构建，能够有效抑制肾癌细胞的体外侵袭、迁移、增殖和凋亡，抑制肾癌原位移植瘤的生长。
本研究应用分子影像学技术，分别从细胞水平和动物实验方面验证慢病毒介导PEDF(Lenti-PEDF)诱导肾癌细胞凋亡和抑制肾癌组织血管生成的作用，并检测PEDF对IκB/NF-κB/Telomerase信号传导路径的影响程度与诱导肾癌细胞凋亡的关系，以阐明PEDF诱导肾癌细胞凋亡的作用机理，同时应用AS2O3治疗作为化疗组与基因治疗组作对比，具有显著疗效。
附图说明
图1是利用慢病毒载体介导PEDF抑制肾细胞癌血行转移中作用流程图；
图2是体外实验证实Lenti-PEDF抑制肾癌细胞生长；
图3是体内实验利用肾细胞癌裸鼠模型证实Lenti-PEDF抑制肾癌细胞生长。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明；慢病毒载体介导PEDF在抑制肾细胞癌血行转移中的应用，该方法主要步骤如下：
(1)采用RT-PCR扩增PEDF、IRES、Luc基因，测序并鉴定，将其导入质粒进行扩增；
(2)采用Luciferase PCR产物以限制性内切酶BamHI/XhoI接入pBobi载体，得到pBobi-Luc，构建pBobi-Luc载体，对pBobi-Luc(+)质粒进行扩增、提纯，鉴定；
(3)采用PEDF PCR产物以限制性内切酶BamHI/XhoI接入pBobi载体，得到pBobi-PEDF；Luciferase PCR产物以限制性内切酶BamHI/XhoI接入pcDNA3.1(+)，得到pN31-Luc；IRESPCR产物以限制性内切酶BamHI/XhoI接入pN31-Luc，得到pN31-IL；以BamHI/XhoI酶切pN31-IL，得到IRES-Luc片段，接入XhoI单酶切的pBobi-PEDF，构建pBobi-PEDF-IRES-Luc载体，对pBobi-PEDF-IRES-Luc(+)质粒进行扩增、提纯，鉴定；
(4)分别对pBobi-Luc及pBobi-PEDF-IRES-Luc重组质粒进行包装，得到Lenti-Luc病毒及Lenti-PEDF-Luc病毒。
(5)将Lenti-Luc病毒及Lenti-PEDF-Luc病毒导入进行裸鼠肾癌治疗试验和肾癌细胞试验。
所述步骤(1)中扩增所需引物分别为：
Lucf：TTTGGATCCCCATGGAAGACGCCAAAA；
Lucr：TTTCTCGAGTTACACGGCGATCTTTCC；
IRESF：TTTAAGCTTCCAATTCCGCCCCTC；
IRESr：TTTGGATCCGCTTATCATCGTGTTTTCAA。
步骤(5)所述的裸鼠肾癌治疗试验，针对人PEDF基因的质粒治疗肾癌裸鼠移植瘤模型的建立及治疗的给药方式及剂量，并利用分子影像学技术无辐射，可以连续、实时、无创、直观地监测肿瘤细胞的生物学行为及治疗效果。
步骤(5)所述的肾癌细胞试验，应用慢病毒将荧光酶基因PEDF导入肾癌细胞，并整合到染色体中稳定表达，通过精诺真生物发光分子成像仪，采集Luc基因标记的肿瘤细胞内生物发光信号，使标记细胞在动物体内有复杂的定位，可以精确定量分析肾癌细胞治疗效果。
所述的PEDF基因的质粒构建，能够有效抑制肾癌细胞的体外侵袭、迁移、增殖和凋亡，抑制肾癌原位移植瘤的生长。
实施例：
第一阶段：肾癌干细胞的分离和筛选
临床肾癌组织标本中分离和筛选肾癌干细胞。取临床肾癌瘤体组织深部无囊性变、无坏死的肿瘤组织标本，置于肿瘤干细胞培养基中。修剪去除外周坏死组织，培养基冲洗，剪碎，微量加样器反复吹打成单细胞悬液，100微米孔径筛网过滤，取单细胞以2*107接种。饱和湿度培养，待培养基中悬浮的单克隆细胞团形状规则后，弃贴壁细胞，吸取培养基并离心后，重悬，按比例传代。扩增后流式细胞术(FACS)检测CD133及NCAM等肾癌干细胞表面标志物，分选肾癌干细胞。
第二阶段：组织收集
术中收集肾癌组织(分为转移组和非转移组)、癌旁组织和正常肾脏组织共4组标本，应用RT-PCR、Western Blot、免疫组化等方法检测标本中CD34、VEGF、PI3K、Telomerase、NF-κB、Fas、caspase-3家族等基因的表达。以上4组标本中PEDF表达水平在前期工作已经完成，其结果为以下实验提供可靠的理论依据。
第三阶段：PEDF基因诱导肾癌干细胞的凋亡的体外实验
1.Lenti-Luc及Lenti-PEDF-Luc慢病毒载体的构建：
(1)重组质粒pBobi-Luc及pBobi-PEDF-IRES-Luc的构建
1)设计引物，RT-PCR扩增PEDF、IRES、Luc基因，测序并鉴定，并将其导入质粒扩增：引物分别为：Lucf：TTTGGATCCCCATGGAAGACGCCAAAA；Lucr：TTTCTCGAGTTACACGGCGATCTTTCC；IRESF：TTTAAGCTTCCAATTCCGCCCCTC；IRESr：TTTGGATCCGCTTATCATCGTGTTTTCAA。
2)pBobi-Luc载体构建：Luciferase PCR产物以BamHI/XhoI接入pBobi载体，得到pBobi-Luc，构建pBobi-Luc载体。对pBobi-Luc(+)质粒进行扩增、提取和纯化，测定DNA的浓度与纯度。
3)pBobi-PEDF-IRES-Luc载体构建：PEDF PCR产物以BamHI/XhoI接入pBobi载体，得到pBobi-PEDF；Luciferase PCR产物以BamHI/XhoI接入pcDNA3.1+，得到pN31-Luc；IRESPCR产物以BamHI/XhoI接入pN31-Luc，得到pN31-IL以BamHI/XhoI酶切pN31-IL，得到IRES-Luc片段，接入XhoI单酶切的pBobi-PEDF，构建pBobi-PEDF-IRES-Luc载体。对pBobi-PIL(+)质粒进行扩增、提纯，鉴定及病毒包装。
(2)慢病毒包装及低度测定
分别对pBobi-Luc及pBobi-PEDF-IRES-Luc重组质粒进行包装，得到Lenti-Luc病毒及Lenti-PEDF-Luc病毒，纯化，滴度测定。
2.将肾癌干细胞分为A、B、C、D四组。A：基因治疗组(Lenti-PEDF-Luc转染肾癌干细胞)；B：对照组(Lenti-Luc转染肾癌干细胞)；C：PBS空白对照组；D：化疗组(As2O3化疗组)。
3.观察以上四组治疗后肾癌干细胞生长、凋亡、侵袭、迁移及相关血管活性因子等各项指标的变化情况：
(1)MTT法检测肾癌干细胞增殖抑制率
(2)流式细胞仪检测肾癌干细胞的凋亡情况
(3)ELISA检测细胞上清液的血管活性因子VEGF
(4)肾癌干细胞体外侵袭实验：将肾癌干细胞平铺于有明胶的Transwell小室，培养后应用精诺真可见光成像仪观察细胞向明胶内的侵袭情况；Western Blot法检测MMP-2、MMP-9表达
(5)使用荧光定量PCR和Western Blot等方法，检测PEDF和As2O3诱导肾癌干细胞凋亡相关因子NF-κB、Fas、caspase-3、Telomerase等的变化。
第四阶段：PEDF基因诱导肾癌干细胞凋亡的体内实验
1.建立动物模型：以1％水合氯醛溶液腹腔内注射麻醉BALC/c裸鼠，75％酒精消毒裸鼠背部皮肤，剪开裸鼠背侧皮肤，暴露肾脏，用微量加样器将2*106 Luc标记的肾癌干细胞制成200μl悬液注射于4周龄裸鼠的肾实质内，缝合皮肤后置于SPF条件下继续饲养。
2.动物模型分组和治疗方案：肾癌干细胞悬液接种2周后，应用精诺真可见光成像仪观察裸鼠成瘤，通过鼠尾静脉对肾癌干细胞原位移植瘤分别进行治疗。70只裸鼠(每组10只)堆积分为A、B、C、D、E、F、G 7组，鼠尾静脉给药，连续7天，每天一次。给药剂量如下：
A、Lenti-PEDF载体治疗组(注射含慢病毒2*107TU的PBS 200μl)；
B、Lenti-PEDF载体治疗组(注射含慢病毒5*107TU的PBS 200μl)；
C、空病毒对照组(注射慢病毒2*107TU的PBS 200μl)；
D、空病毒对照组(注射慢病毒5*107TU的PBS 200μl)；
E、PBS空白对照组(注射PBS 200μl)；
F、As2O3化疗组(2mg/kg)；
G、As2O3化疗组(8mg/kg)。.
3.基因治疗疗效评估及凋亡相关因子检测
(1)光学分子成像：应用精诺真可见光成像仪对7组肾癌干细胞原位移植瘤模型治疗效果(肿瘤区荧光强度)进行定量分析及评价
(2)测量肿瘤体积和重量，绘制各处理组肿瘤生长曲线
(3)免疫组化法检测各组肿瘤MVD及VEGF表达水平
(4)Western Blot法检测MMP-2、MMP-9表达
(5)使用荧光定量PCR、Western Blot检测肾癌干细胞凋亡相关因子PI3K、NF-κB、Fas、caspase-3、Telomerase等的变化。
Claims (5)
1.慢病毒载体介导PEDF在抑制肾细胞癌血行转移中的应用，其特征在于：该方法主要步
骤如下：
(1)采用RT-PCR扩增PEDF、IRES、Luc基因，测序并鉴定，将其导入质粒进行扩增；
(2)采用Luciferase PCR产物以限制性内切酶BamHI/XhoI接入pBobi载体，得到pBobi-Luc，构建pBobi-Luc载体，对pBobi-Luc(+)质粒进行扩增、提纯，鉴定；
(3)采用PEDF PCR产物以限制性内切酶BamHI/XhoI接入pBobi载体，得到pBobi-PEDF；Luciferase PCR产物以限制性内切酶BamHI/XhoI接入pcDNA3.1(+)，得到pN31-Luc；IRESPCR产物以限制性内切酶BamHI/XhoI接入pN31-Luc，得到pN31-IL；以BamHI/XhoI酶切pN31-IL，得到IRES-Luc片段，接入XhoI单酶切的pBobi-PEDF，构建pBobi-PEDF-IRES-Luc载体，对pBobi-PEDF-IRES-Luc(+)质粒进行扩增、提纯，鉴定；
(4)分别对pBobi-Luc及pBobi-PEDF-IRES-Luc重组质粒进行包装，得到Lenti-Luc病毒及Lenti-PEDF-Luc病毒。
(5)将Lenti-Luc病毒及Lenti-PEDF-Luc病毒导入进行裸鼠肾癌治疗试验和肾癌细胞试验。
2.根据权利要求1所述的慢病毒载体介导PEDF在抑制肾细胞癌血行转移中的应用，其特征在于：所述步骤(1)中扩增所需引物分别为：
Lucf：TTTGGATCCCCATGGAAGACGCCAAAA；
Lucr：TTTCTCGAGTTACACGGCGATCTTTCC；
IRESF：TTTAAGCTTCCAATTCCGCCCCTC；
IRESr：TTTGGATCCGCTTATCATCGTGTTTTCAA。
3.根据权利要求1所述的慢病毒载体介导PEDF在抑制肾细胞癌血行转移中的应用，其特征在于：步骤(5)所述的裸鼠肾癌治疗试验，针对人PEDF基因的质粒治疗肾癌裸鼠移植瘤模型的建立及治疗的给药方式及剂量，并利用分子影像学技术无辐射，可以连续、实时、无创、直观地监测肿瘤细胞的生物学行为及治疗效果。
4.根据权利要求1所述的慢病毒载体介导PEDF在抑制肾细胞癌血行转移中的应用，其特征在于：步骤(5)所述的肾癌细胞试验，应用慢病毒将荧光酶基因PEDF导入肾癌细胞，并整合到染色体中稳定表达，通过精诺真生物发光分子成像仪，采集Luc基因标记的肿瘤细胞内生物发光信号，使标记细胞在动物体内有复杂的定位，可以精确定量分析肾癌细胞治疗效果。
5.根据权利要求1所述的慢病毒载体介导PEDF在抑制肾细胞癌血行转移中的应用，其特征在于：所述的PEDF基因的质粒构建，能够有效抑制肾癌细胞的体外侵袭、迁移、增殖和凋亡，抑制肾癌原位移植瘤的生长。
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2014
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