ES2622498T3 - Composiciones y usos de materiales con actividad antimicrobiana elevada y toxicidad baja - Google Patents

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Abstract

Una composición de agente antimicrobiano que comprende: al menos una especie de copolipéptido sintético de al menos cuarenta residuos de aminoácidos que comprende: al menos un segmento hidrófilo que contiene al menos cinco residuos de aminoácidos catiónicos contiguos; y 5 al menos un segmento hidrófobo que contiene al menos cinco residuos de aminoácidos hidrófobos contiguos; en el que el segmento hidrófilo contiene un número mayor de residuos de aminoácidos que el segmento hidrófobo; y agua; en la que la composición de dicho copolipéptido en medio acuoso forma estructuras; y en la que la composición inhibe o destruye microbios.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones y usos de materiales con actividad antimicrobiana elevada y toxicidad baja Antecedentes de la invencion Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a composiciones de materia que son capaces de destruir (o inhibir) microbios, y que tienen una toxicidad baja en mairnferos. La presente invencion tambien se refiere a ciertas composiciones y a sus usos en una diversidad de situaciones, que incluyen, pero sin limitacion, los conservantes, antisepticos, y la prevencion y el tratamiento de infecciones de heridas, asf como otras enfermedades infecciosas.
Discusion de la tecnica relacionada
Los agentes antimicrobianos cationicos han demostrado tener utilidad; la toxicidad es un problema. Durante mas de medio siglo, se han usado agentes antimicrobianos cationicos (cargados positivamente) en una diversidad de situaciones medicas y no medicas, que vanan desde los antibioticos sistemicos hasta los detergentes industriales. Los agentes antimicrobianos cationicos se unen de manera preferente a las membranas bacterianas, que en general muestran una carga mas negativa que las membranas de los mamfferos. Esta interaccion puede alterar la funcion de la membrana y conducir potencialmente a la muerte de la celula bacteriana. Los compuestos antimicrobianos cationicos incluyen ciertos antibioticos (p.ej., polimixinas), bisbiguanidas (p.ej., clorhexidina), biguanidas polimericas (p.ej., polihexametilen biguanida) y compuestos de amonio cuaternario (QAC) (p.ej., cloruro de benzalconio), asf como peptidos antimicrobianos naturales (AMPs) (p.ej., defensinas). Aunque cada clase de compuestos antimicrobianos cationicos ha demostrado tener actividad antimicrobiana en una o mas situaciones, la toxicidad ha sido un problema constante [1-12].
Las polimixinas, producidas por Bacillus polymyxa, son peptidos dclicos con colas hidrofobas[6, 7]. La porcion de peptido cfclico (aprox. 10 residuos de aminoacidos; cargada positivamente) interacciona intensamente con el lipopolisacarido (LPS) cargado negativamente hallado en la membrana externa de las bacterias gramnegativas. Se cree que la cola hidrofoba interacciona con, y en algunos casos altera, la membrana bacteriana. Las polimixinas tienen actividad antimicrobiana contra muchas bacterias gramnegativas, que incluyen las especies Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Escherichia coli (E. coli) y Enterobacter, pero tienen una actividad limitada contra Proteus, la mayona de Serratia o las bacterias grampositivas [7]. La neurotoxicidad y nefrotoxicidad significativas han contribuido a su uso limitado como antibioticos sistemicos [13]. Actualmente, las polimixinas se usan a veces como ultimo recurso para infecciones por bacterias gramnegativas que son muy resistentes a los antibioticos, tales como las provocadas por P. aeruginosa multirresistente. Tambien se usan como agentes antimicrobianos topicos para pequenos cortes y rasgunos de la piel.
La clorhexidina se usa de manera generalizada en el ambito quirurgico preoperatorio como limpiador antiseptico para la limpieza general de la piel, en el bano preoperatorio y en la preparacion de la zona quirurgica [7]. La clorhexidina es activa contra una amplia diversidad de bacterias grampositivas y gramnegativas, aunque se ha informado de la resistencia por parte de algunas bacterias gramnegativas (p.ej., las especies P. aeruginosa, Providentia) [5, 10]. Las formulaciones que contienen un 2-4% de clorhexidina parecen ser las mas eficaces como agentes antimicrobianos, pero pueden provocar irritacion de la piel. En general, la clorhexidina es relativamente segura al aplicarla a la piel intacta, porque se absorben cantidades mmimas del compuesto. Sin embargo, debido a la irritacion y la toxicidad, la clorhexidina esta contraindicada para el uso cerca de los ojos, ofdos, tejidos cerebrales y meninges [2]. A veces se usan concentraciones bajas (p.ej., del 0,05% al 0,12%) como lavados de heridas y enjuagues bucales. La actividad depende del pH, ya que los medios de pH bajo reducen la actividad. Ademas, la clorhexidina no es compatible con los compuestos anionicos (p.ej., agua dura, jabon, alginato) y muestra una actividad reducida en presencia de materiales organicos (p.ej., sangre).
La polihexametilen biguanida (PHMB) se ha usado en diversas aplicaciones de consumo durante mas de 40 anos. La PHMB se usa en desinfectantes de piscinas, conservantes o PVC plastificado, y en biocidas ambientales de uso general [1]. La produccion inicial de PHMB dio como resultado oligomeros muy polidispersos con pesos moleculares en el intervalo 500-6.000 g/mol. La caracterizacion qmmica limitada impidio en gran medida el uso inicial de PHMB en los productos farmaceuticos. Las formulaciones recientes de PHMB han podido afrontar la polidispersidad. De manera similar a la clorhexidina, el uso de PHMB esta contraindicado para los ojos, ofdos, tejidos cerebrales, meninges y articulaciones [4].
Los compuestos de amonio cuaternario (QACs) son tensioactivos anfoteros, que en general contienen un atomo de nitrogeno unido directamente a cuatro grupos alquilo, que pueden variar en cuanto a la estructura hidrofoba [1, 2]. Los QACs son principalmente agentes bacteriostaticos, pero a concentraciones superiores pueden ser bactericidas contra ciertos organismos. Los QACs son agentes antimicrobianos contra las bacterias grampositivas, pero son menos eficaces contra las bacterias gramnegativas (p.ej., P. aeruginosa). Debido a su actividad debil contra las bacterias gramnegativas, los QAC en general no se usan en ambitos sanitarios para la antisepsia de las manos. Varios brotes de infeccion se han rastreado hasta compuestos QAC contaminados con bacilos gramnegativos [8]. Los QAC parecen ser mas sensibles a los mecanismos de resistencia mediados por las bombas de expulsion de
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multiples farmacos. Su actividad tambien se reduce en gran medida en presencia de la materia organica.
Los peptidos antimicrobianos naturales (AMPs) a menudo son cationicos. Los peptidos antimicrobianos naturales (AMps) (en general, menos de 50 aminoacidos) estan distribuidos de manera generalizada en la mayona de las especies, desde insectos hasta mairnferos, y se cree que desempenan papeles cruciales en la inmunidad innata [14]. Los AMPs han demostrado una potente destruccion / inhibicion de bacterias, virus, hongos y parasitos [15]. Se cree que los AMPs son importantes para prevenir y controlar las infecciones. Los AMPs se depositan intensamente en interfases tales como la piel, las vfas respiratorias y el recubrimiento gastrointestinal, y los leucocitos los liberan en los sitios de inflamacion. Los leucocitos usan los AMPs como parte de sus mecanismos de destruccion directa en los fagolisosomas. Ciertos AMPs contribuyen a la regulacion de la inflamacion y la inmunidad adaptativa [15]. Ademas, los AMPs han demostrado una actividad inhibitoria contra los espermatozoos y las celulas cancerosas.
La mayona de AMPs comparten caractensticas estructurales que conducen a modos de destruccion ffsicos, independientes de receptores [9]. Un mecanismo de accion aceptado de manera generalizada de los AMPs es la alteracion o perturbacion de la membrana microbiana (seguida a veces por la formacion de poros), lo que conduce a la muerte celular. En general, los AMPs contienen dominios cargados positivamente e hidrofobos que estan separados espacialmente - anfffilos cationicos. El contenido hidrofobo sustancial de los AMPs (en general, una fraccion molar del 30 al 60%) es una caractenstica importante para la actividad antimicrobiana, ya que "controla el grado en el que un peptido se puede repartir en la bicapa lipfdica" [16]. Los AMPs que forman helices alfa "existen con frecuencia como conformeros extendidos o desestructurados en disolucion", y se hacen helicoidales "tras la interaccion con membranas fosfolipfdicas anfipaticas" [16]. Esto sugiere que el "medio local en la superficie externa bacteriana y las membranas es importante y puede inducir cambios conformacionales en los peptidos antimicrobianos que son necesarios para la union y la insercion de los peptidos en la membrana" [3].
Se ha demostrado que la nisina (un AMP derivado de bacterias que se ha usado como conservante alimentario) es un agente emulsionante debil para las mezclas aceite-agua, y el proceso es significativamente dependiente del pH y la temperatura [17].
Se han patentado varios AMPs naturales y las tecnologfas relacionadas. Lehrer y Selsted describieron secuencias de AMP analogas a las de las defensinas aisladas de macrofagos (patente de EE.UU. n° 4.543.252). La clase de AMPs de las magaininas, aisladas por primera vez a partir de la piel de ciertas ranas, ha sido descrita por Zasloff (patente de EE.UU. n° 4.810.777). Tambien se han descrito magaininas modificadas, en particular con deleciones o sustituciones en la secuencia (p.ej., patentes de EE.UU. n°s 4.962.277; 5.221.732; 5912231; y 5.792.831). Selsted y Cullor describieron el AMP bovino indolicidina como compuesto antimicrobiano de amplio espectro (patente de EE.UU. n° 5.324.716).
Los oligomeros cationicos basados en peptidos sinteticos pueden funcionar como agentes antimicrobianos. Salick y colaboradores han descrito un peptido en forma de horquilla beta espedfico de secuencia (20-mero) que puede formar un hidrogel antimicrobiano en presencia de una concentracion salina suficiente (solicitud de patente publicada de EE.UU. n° 2011/0171304). Cuando el peptido "se disuelve en agua, permanece sin plegar y soluble debido a la repulsion de cargas entre las cadenas laterales cargadas positivamente". Se cree que la adicion de sal "apantalla la carga derivada de las cadenas laterales y permite que el peptido se pliegue" hasta una horquilla beta, que se puede "ensamblar hasta una red de fibrillas ricas en laminas beta". El peptido consiste en un 60% de contenido hidrofobo y contiene dos residuos de arginina que parecen ser importantes para la actividad antimicrobiana eficaz contra Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM). Los peptidos propiamente dichos no parecen ser inherentemente antimicrobianos, ya que los inventores han informado que el "peptido que se difunde del gel no es el agente activo". Cuando S. aureus se sometio a disoluciones acuosas (es decir, no hidrogeles) 100 |jM (aprox. 230 |jg/mL) de peptido, "la proliferacion bacteriana se vio mmimamente afectada". Asf, para la actividad antimicrobiana, las bacterias deben estar en contacto directamente con la superficie del hidrogel; el peptido "plegado pero no gelificado" no inhibe la proliferacion bacteriana. Se informo de hallazgos similares para otros peptidos en horquilla beta estrechamente relacionados [18].
Gellman y colaboradores han descrito composiciones antimicrobianas que contienen oligomeros de aminoacidos beta (patentes de EE.UU. n°s 6.060.585; 6.683.154; solicitudes de patentes publicadas de EE.UU. n°s 2007/0087404; 2008/0166388) con estructuras secundarias bien definidas. Los peptidos beta contienen estructuras dclicas en el esqueleto peptfdico que limitan la flexibilidad conformacional. DeGrado y colaboradores tambien han descrito peptidos beta antibacterianos que contienen oligomeros (7-meros o mas cortos) de un tri-beta-peptido (patente de EE.UU. 6.677.431).
Se han descrito otros compuestos basados en peptidos sinteticos que pueden imitar la estructura global de los AMPs naturales. DeGrado informo de peptidos beta anfifflicos de secuencia aleatoria basados en las propiedades estructurales de los AMPs naturales magainina y cecropina [19]. Gellman y colaboradores han descrito un oligomero de peptido beta de secuencia aleatoria con una longitud media de 21 residuos, un mdice de polidispersidad (Mn / Mw) de 1,4 y un 40% de residuos hidrofobos [20]. En otros estudios, Gellman identifico peptidos beta helicoidales [19]. Se descubrio que una "cara hidrofoba" del 60% a lo largo del cilindro helicoidal tuvo una actividad antimicrobiana optima, mientras una cara del 40% mostro una actividad baja.
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Los poUmeros cationicos sinteticos compuestos de bloques de construccion no naturales pueden funcionar como agentes antimicrobianos. Se han descrito varias clases de poKmeros antimicrobianos sinteticos con bloques de construccion o unidades repetitivas no naturales; son el objeto de una revision del 2007 de Tew [22]. Estos polfmeros estan compuestos por estructuras / unidades monomericas que no se hallan en la naturaleza. Estos polfmeros no naturales presentan a menudo smtesis sencillas y rentables, y estabilidad contra la degradacion enzimatica. Sin embargo, las limitaciones de estos y otros polfmeros no naturales pueden incluir una actividad antimicrobiana limitada, asf como la carencia de biocompatibilidad y biodegradabilidad. Los materiales de esta clase estan compuestos por bloques de construccion no naturales (p.ej., aril amidas, grupos aromaticos altamente conjugados) y se consideran fuera del alcance de esta invencion [21-25]. (Para ejemplos, vease la patente de EE.UU. n° 7.173.102; solicitudes de patentes publicadas de EE.UU. n°s 2008/0176807; 2010/0105703).
Winter y colaboradores han descrito peptoides antimicrobianos (glicinas N-sustituidas) [28]. Se ensayo una serie de peptoides cortos (3-monomeros) frente a un amplio espectro de bacterias grampositivas y gramnegativas, y la actividad hemolttica (HC50) fue inferior que la actividad antimicrobiana (concentraciones inhibitorias mmimas, ClMs). Un tripeptoide representativo protegio a ratones infectados por S. aureus in vivo en un modelo de infeccion simple.
Metodologfas sinteticas para copolipeptidos (metodo de Deming). Las metodologfas sinteticas tradicionales han impedido la smtesis eficaz de bibliotecas de oligopeptidos con la modificacion ortogonal (o semi-ortogonal) de multiples propiedades. Las propiedades importantes a modificar incluyen la secuencia de aminoacidos, la longitud total de la cadena y la proporcion de aminoacidos cationicos respecto de los hidrofobos. Ademas, tampoco ha sido facilmente accesible la smtesis practica y rentable de mezclas de copolipeptidos de baja polidispersidad (PDI entre 1,0 y 1,4) [25].
El control sobre multiples propiedades, y la capacidad de crear compuestos de baja polidispersidad, permitinan la optimizacion de multiples relaciones estructura-funcion. Un reto importante en la investigacion de AMPs que son polipeptidos sinteticos son los costes de produccion prohibitivos de la smtesis en fase solida. Ademas, las limitaciones qmmicas significativas de los metodos sinteticos en fase solida y en fase de disolucion incluyen la falta de control sobre el crecimiento de la cadena. Esto conduce a la ramificacion de la cadena, a polidispersidad y a rendimientos de productos bajos.
En 1997, Deming desarrollo iniciadores bien definidos para polimerizar derivados de aminoacidos hasta cadenas de oligopeptidos [25, 26]. Esta metodologfa anadio monomeros de aminoacidos a una cadena en crecimiento por lotes. Los iniciadores fueron complejos de metales de transicion que posibilitaron una smtesis controlada para producir formulaciones de polipeptidos de peso molecular elevado, de distribucion estrecha y con multiples bloques. Los iniciadores y los metodos sinteticos estan bien descritos en la bibliograffa y en varias patentes (patentes de EE.UU. n°s 6.680.365; 6.632.922; 6.686.446; 6.818.732; 7.329.727; solicitud de patente publicada de EE.UU. n° 2008/0125581).
En general, los polipeptidos sinteticos tienen una composicion binaria simple (p.ej., copolfmeros de lisina (K) y leucina (L)). Los polipeptidos anfifflicos contienen monomeros de aminoacidos ionicos (p.ej., lisina, arginina (R), glutamato (Z)) copolimerizados con aminoacidos hidrofobos neutros (p.ej., leucina, alanina (A)). Mediante la variacion del metodo de adicion de monomeros, se pueden llevar a cabo copolimerizaciones para obtener secuencias de residuos de aminoacidos a lo largo de la cadena del copolfmero que son en bloque, aleatorias o una combinacion de ambas (es decir, bloques de secuencias aleatorias).
Los copolipeptidos sinteticos aleatorios en disolucion muestran actividad antimicrobiana. El laboratorio de Deming ha observado actividad antimicrobiana para una serie de copolipeptidos hidrosolubles que conteman varias proporciones de aminoacidos cationicos (lisina (K)) e hidrofobos (leucina (L), isoleucina (I), valina (V), fenilalanina (F) o alanina (A)) que estuvieron dispuestos de manera aleatoria [27]. Los copolipeptidos mostraron una actividad antimicrobiana variable contra S. aureus (grampositivo), P. aeruginosa (gramnegativo) y E. coli (gramnegativo) en ensayos de cultivo en suspension. Los copolipeptidos de lisina-alanina mostraron un amplio "efecto toxico en las tres especies de bacterias estudiadas", y se concluyo que eran la "combinacion copolimerica antimicrobiana mas eficaz". Los espectros de dicrofsmo circular de los copolipeptidos de lisina-alanina y lisina-leucina mostraron "conformaciones de cadenas aleatorias inequvocas al estar libres en disolucion". Este trabajo no examino la actividad antimicrobiana de los copolipeptidos sinteticos de secuencia en bloque o los copolipeptidos sinteticos formulados deliberadamente en forma de micelas o incorporados en emulsiones / nanoemulsiones (vease tambien [28, 29]).
Mediante el uso de los metodos de smtesis de Deming, Chan-Park y colaboradores estudiaron recientemente la actividad antimicrobiana de copolipeptidos solubles de secuencia aleatoria que conteman 2-3 aminoacidos diferentes [26]. Los copolipeptidos 25-mericos aleatorios, compuestos de lisina-fenilalanina o lisina-fenilalanina-leucina, mostraron la actividad mas amplia contra cinco microbios y tuvieron las CIMs mas bajas. Se investigaron los efectos de toda la longitud del peptido y del contenido hidrofobo sobre la actividad antimicrobiana. Se informo que el copolipeptido de lisina-fenilalanina tuvo una "actividad antibacteriana mas amplia cuando tuvo una longitud de 25 residuos que cuando tuvo una longitud menor o mayor". Se descubrio que el contenido hidrofobo optimo para los compuestos de lisina-fenilalanina (y otros copolipeptidos aleatorios) fue de alrededor de un 60%. Sin embargo, los compuestos de lisina-fenilalanina y lisina-fenilalanina-leucina optimizados mostraron una actividad hemolftica
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elevada en comparacion con otros peptidos naturales y sinteticos. Los autores propusieron que la "elevada hibrofobicidad (60%) de los compuestos o mas especies hidrofobas presentes pueden haber dado como resultado una elevada toxicidad para los eritrocitos de mairnferos". Ademas, los copolipeptidos aleatorios de lisina-alanina y lisina-leucina no mostraron una actividad significativa contra el organismo fungico Candida albicans. El analisis de dicrofsmo circular indico que los copolipeptidos aleatorios de lisina-fenilalanina y lisina-fenilalanina-leucina "carecen de una estructura secundaria mtida" y no forman helices alfa ni laminas beta.
Se pueden formular copolipeptidos sinteticos para conseguir estructuras jerarquicas. La presencia de polielectrolitos y dominios hidrofobos conduce a materiales segregados en microfases. Las superestructuras resultantes pueden incluir multimeros en disolucion, micelas, emulsiones (con aceite), laminas, vesfculas y fibrillas que forman hidrogeles. El autoensamblaje hasta las diferentes estructuras jerarquicas se puede controlar mediante: la variacion de la composicion y la longitud de la cadena; la variacion de la concentracion; la presencia de aminoacidos L, D o racemicos; y la modificacion de las cadenas laterales y de los extremos de la cadena (p.ej., polietilen glicol (PEG)). La estructura secundaria de los dominios hidrofobos (es decir, la cadena aleatoria frente a helice alfa) desempena un papel importante en la formacion de la superestructura. La naturaleza del dominio hidrofobo o de los segmentos polimericos determina el tipo de interacciones intermoleculares que se establecen entre las cadenas. Estas interacciones atractivas estan en equilibrio con las interacciones con el disolvente. Existe un equilibrio entre la energfa libre de la autoasociacion y la energfa libre de la hidratacion para cada molecula y para cada fragmento de la supermolecula.
Los copolipeptidos sinteticos tambien se pueden disenar para que formen hidrogeles. Se demostro que ciertas caractensticas, tales como los bloques hidrofilos largos (cationicos o anionicos) y los bloques hidrofobos ordenados (p.ej., helice alfa) favorecen la formacion del hidrogel. Los estudios sugieren que varios hidrogeles basados en copolipeptidos sinteticos, lo que incluye los copolipeptidos en bloque K180L20 (y otros KxLy), son biocompatibles in vivo. Deming et al. informaron previamente que los hidrogeles de copolipeptidos en bloque pueden servir como andamiaje tisular en el sistema nervioso central (SNC) murino [27]. Se inyectaron hidrogeles en el prosencefalo de ratones, y se crearon depositos de los geles en 3D in vivo. La toxicidad, la inflamacion y la gliosis fueron mmimas y similares a los controles de solucion salina. Despues de 8 semanas, en muchos casos, los depositos de copolipeptido se vascularizaron con una densidad celular similar a la del tejido adyacente, lo que sugiere que los hidrogeles pueden dar apoyo a la proliferacion y migracion celular.
Deming (publicacion PCT WO 2009/025802) describio nanoemulsiones y nanoemulsiones dobles estabilizadas mediante copolipeptidos en bloque sinteticos [27]. La actividad antimicrobiana de los copolipeptidos emulsionados no se describio en ese documento.
Las nanoemulsiones preparadas sin copolipeptidos pueden mostrar cierta actividad antimicrobiana. Baker y colaboradores se han centrado en el uso de nanoemulsiones como agentes antimicrobianos. Informaron de emulsiones antimicrobianas estabilizadas mediante tensioactivos basados en fosfato u otras moleculas pequenas (patentes de EE.UU. n°s 6.015.832; 6.506.803; 6.559.189; 6.635.676; 5.618.840; 5.547.677; y 5.549.901).
No se entienden bien las relaciones potenciales entre la actividad antimicrobiana y / o la toxicidad para las celulas de marnfferos de los anfffilos cationicos y su ensamblaje hasta estructuras de orden superior. Se ha publicado una informacion relevante limitada. Por ejemplo, la actividad antimicrobiana de epsilon-poli-lisina (EpL) se redujo ligeramente mediante la coordinacion con un lfpido y emulsificacion, con respecto a la EPL libre en disolucion [33].
Sumario de la invencion
La presente invencion describe composiciones de materia y usos de copolipeptidos sinteticos con una actividad antimicrobiana elevada (in vitro o in vivo) y una toxicidad baja en mamfferos. En particular, los agentes antimicrobianos cationicos (cargados positivamente) se han usado durante mas de cincuenta anos en una diversidad de situaciones medicas y no medicas, que vanan desde los antibioticos sistemicos hasta los detergentes industriales. A pesar de tener una eficacia sustancial, su uso en muchas situaciones medicas se ha limitado debido a unas toxicidades sustanciales. Esta invencion supera la limitacion de la toxicidad inherente de los agentes antimicrobianos cationicos. En pocas palabras, al controlar la relacion entre los elementos cationicos y los elementos hidrofobos, se han disenado materiales con una actividad antimicrobiana elevada y una toxicidad baja en mamfferos, a menudo aprovechando estructuras jerarquicas unicas. Esta invencion incluye el agrupamiento de residuos de aminoacidos hidrofilos y / o hidrofobos a lo largo de una cadena copolipeptfdica para alcanzar una anfifilicidad en bloque. Esto difiere de la anfifilicidad facial que caracteriza a muchos AMPs naturales, asf como a los copolipeptidos sinteticos de secuencia aleatoria, de secuencia alternante y de secuencia espedfica. Para los fines de esta invencion, los copolipeptidos en bloque o de secuencia en bloque se caracterizan como copolipeptidos que consisten en uno o mas dominios diferentes que contienen cada uno una repeticion contigua de al menos 5 residuos de un unico aminoacido (p.ej., lisina o leucina) o tipo de aminoacido (cationico o hidrofobo). En contraste, los copolipeptidos aleatorios se caracterizan como copolipeptidos que consisten en distribuciones estadfsticas desordenadas de dos o mas residuos de aminoacidos (o tipos de aminoacidos) diferentes en una secuencia.
Los copolipeptidos sinteticos de la presente invencion poseen una o mas de las siguientes caractensticas moleculares que los distinguen de los agentes antimicrobianos naturales y sinteticos descritos previamente. Primero,
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una longitud total de cadena relativamente elevada (de 40 a 250 o mas residuos de aminoacidos); segundo, la exposicion multimerica de los dominios hidrofilos (en general cationicos); tercero, un contenido hidrofobo relativamente bajo (en general, un 40% o menos); y cuarto, una autoasociacion / autoensamblaje por medio de interacciones de los dominios hidrofobos (a menudo basado en una secuencia en bloque). A modo de explicacion, sin limitar el alcance de esta invencion, se cree que la actividad antimicrobiana elevada es el resultado de la exposicion de segmentos hidrofilos (cationicos) largos, segmentos hidrofilos (cationicos) multimericos, o ambos, que interaccionan de manera muy eficaz con las cargas anionicas (negativas) de la superficie de los microbios. Ademas, a modo de explicacion y sin limitar el alcance de esta invencion, se cree que el contenido hidrofobo relativamente bajo, la naturaleza de autoasociacion de los dominios hidrofobos (a menudo basada en una secuencia en bloque), o ambos, sirven para limitar la exposicion de los tejidos a concentraciones de material altamente hidrofobo o altamente anfipatico, por lo que disminuye la toxicidad en mairnferos. En ciertos casos, esta exposicion hidrofoba o anfipatica limitada puede permitir la administracion de cantidades mayores del material antimicrobiano in vivo, con la posibilidad de liberacion retardada y liberacion lenta, y una mayor actividad antimicrobiana (con menos toxicidad en marnfferos) a lo largo del tiempo.
Se reconoce que conseguir una actividad antimicrobiana elevada (in vitro o in vivo) y una toxicidad baja puede depender de uno o mas factores, que incluyen los siguientes: la seleccion de los monomeros (p.ej., cationes espedficos e hidrofobos); la distribucion espacial de los monomeros (p.ej., en bloque frente a aleatoria); la fraccion molar de los monomeros hidrofobos; la pureza optica de los monomeros; los dominios hidrofobos ordenados frente a desordenados (p.ej., helice alfa frente a cadena aleatoria), la modificacion qmmica de los monomeros / residuos; las composiciones hfbridas (p.ej., conjugados de copolipeptido-polfmero).
Estos copolipeptidos sinteticos se pueden disenar para autoasociarse / autoensamblarse, en parte, por medio de interacciones de las regiones hidrofobas parcialmente solvatadas, mientras se mantienen completamente disueltos los dominios hidrofilos (en general, cationicos). Los ejemplos espedficos incluyen preparaciones que implican multimeros en disolucion, micelas, laminas, vesfculas y fibrillas que forman hidrogeles, asf como emulsiones cuando se mezclan con aceites. A modo de ejemplo, se han desarrollado disoluciones de lavado antimicrobianas, hidrogeles antimicrobianos y emulsiones antimicrobianas. Todas estas preparaciones se pueden aplicar a heridas, otros tejidos u otras diversas superficies. El autoensamblaje molecular dirigido de esta invencion determina las caractensticas qmmicas y biologicas, que incluyen la estructura jerarquica. Este difiere de la autoasociacion de diversos copolipeptidos sinteticos de secuencia aleatoria, que se basa en la distribucion no uniforme de residuos hidrofilos e hidrofobos, y en general da como resultado materiales irregulares y mal definidos.
Las realizaciones preferidas pueden considerar tambien ciertas cualidades que pueden influir en la eficacia y la toxicidad global en enfermedades humanas o animales, que incluyen, pero sin limitacion, la prevencion y el tratamiento de infecciones de heridas u otras enfermedades infecciosas. Estas caractensticas incluyen, pero sin limitacion, la fluidez (que facilita la aplicacion), cobertura del tejido, duracion de la bioactividad antimicrobiana, biocompatibilidad, degradacion, biodistribucion, y efectos sobre la respuesta inflamatoria, reparacion del tejido, angiogenesis, hemostasia, inmunogenicidad, y otros. En ciertas situaciones medicas (p.ej., heridas quirurgicas o traumaticas), la eficacia y la toxicidad pueden depender sustancialmente de las interacciones de los copolipeptidos sinteticos con los tejidos. Se pueden obtener ciertas ventajas de los copolipeptidos sinteticos que precipitan facilmente sobre y / o se unen directamente a los tejidos danados, donde pueden proporcionar una actividad antimicrobiana local y concentrada. La eficacia y la seguridad globales en las enfermedades humanas o animales dependeran de la enfermedad espedfica y el estado general del paciente. Es de esperar que las bioactividades in vivo dependeran sustancialmente de la formulacion y de la estructura jerarquica, y que la actividad in vivo puede no determinarse completamente mediante los ensayos in vitro.
Descripcion de las figuras
La FIGURA 1 es un diagrama que muestra la diversidad de bloques de construccion moleculares que se pueden usar para construir los copolipeptidos;
La FIGURA 2 es 1H-RMN del copolipeptido en bloque K55(rac-L)20 en d-TFA;
La FIGURA 3 es un diagrama que muestra las estructuras de copolipeptidos en bloque antimicrobianos seleccionados: A) Kx(rac-L)y; B) K55(rac-L)20 aleatorio; C) K55(rac-A)20; D) K55(rac-V)20; E) K55(rac-V)20; F) K55(rac-
L/F)20; G) RH55(rac-L)20; H) E64(rac-L)20; I) PEG205(rac-L)20; y J) K60L20;
La FIGURA 4 muestra la actividad antimicrobiana del copolipeptido en bloque K55(rac-L)20 contra S. aureus, S. epidermidis, E. coli, y P. aeruginosa; se incubo K55(rac-L)20 con bacterias durante 30 min antes de la colocacion en placas para el cultivo;
La FIGURA 5 muestra la actividad antimicrobiana contra S. aureus y E. coli, de copolipeptidos con un contenido variable de residuos de aminoacidos hidrofobos;
La FIGURA 6 muestra la actividad antimicrobiana contra C. albicans de copolipeptidos a una concentracion de 100 Hg/mL;
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La FIGURA 7 muestra la actividad antimicrobiana del copolipeptido en bloque K55(rac-L)20 contra S. aureus y Propionibacterium acnes (P. acnes); se incubo K55(rac-L)20 con bacterias durante 30 min antes de la colocacion en placas para el cultivo;
La FIGURA 8 muestra la actividad antimicrobiana contra S. aureus y E. coli de copolipeptidos con tamanos variables de dominios hidrofobos en bloque a una concentracion de peptidos de 10 pg/mL;
La FIGURA 9 muestra la actividad antimicrobiana contra P. acnes de copolipeptidos con tamanos variables de dominios hidrofobos a una concentracion de peptidos de 10 pg/mL;
La FIGURA 10 muestra la actividad antimicrobiana contra S. aureus y E. coli de copolipeptidos formulados con una distribucion espacial en bloque o aleatoria de monomeros a una concentracion de peptidos de 10 pg/mL;
La FIGURA 11 muestra la actividad antimicrobiana de K55(rac-L)20 en un modelo de roedores; se inserto de manera subcutanea una malla de polipropileno empapada previamente con PBS o K55(rac-L)20 en ratas, con copolipeptido adicional, y se anadio un inoculo de 106 de S. aureus 6538 o P. aeruginosa (aislamiento clmico de cerdo); despues de dos dfas, la malla implantada se coloco en placas para la enumeracion bacteriana;
La FIGURA 12 muestra la actividad antimicrobiana de K55(rac-L)20 en un modelo de roedores; se inserto de manera subcutanea una malla de polipropileno empapada previamente con PBS o K55(rac-L)20 en ratas, con copolipeptido adicional, y se anadio un inoculo de 106 de S. aureus 6538 o P. aeruginosa (aislamiento clmico de cerdo); en varios momentos, la malla implantada se coloco en placas para la enumeracion bacteriana;
La FIGURA 13 muestra la actividad antimicrobiana de K55(rac-L)20 en un modelo de roedores; se inserto de manera subcutanea una malla de polipropileno empapada previamente con PBS o 2 mg/ml de K55(rac-L)20 en ratas, con copolipeptido adicional, y se anadio un inoculo de 106 de S. aureus 6538 o P. aeruginosa (aislamiento clmico de cerdo); despues de dos dfas, el tejido circundante se coloco en placas para la enumeracion bacteriana;
La FIGURA 14 muestra los resultados de ensayar la inflamacion en un modelo de roedores; se inserto de manera subcutanea una malla de polipropileno empapada previamente con el copolipeptido K55(rac-L)20 en ratas, con copolipeptido adicional, y se anadio un inoculo de 106 de S. aureus 6538; despues de 48 hrs, se analizo el tejido mediante histologfa en busca de inflamacion: 0=normal, 1=leve, 2=moderado, 3=grave;
La FIGURA 15 muestra la actividad antimicrobiana de K55(rac-L)20 en un modelo porcino; se aplico K55(rac-L)20 (10 mg/mL) a heridas, y despues de cuatro hrs se aspiro el material restante y se anadieron 107 de S. aureus 6538 a las heridas; despues de 48 hrs, se determinaron los recuentos bacterianos;
La FIGURA 16 muestra el resultado de ensayar la inflamacion en un modelo porcino; se aplico K55(rac-L)20 (10 mg/mL) a heridas, y despues de 30 min se anadieron 104 o 107 de S. aureus o P. aeruginosa a las heridas; despues de 48 hrs, los tejidos se analizaron mediante histologfa en busca de inflamacion (que incluye la infiltracion celular y la necrosis);
La FIGURA 17 muestra la cicatrizacion de heridas en un modelo porcino en el que las heridas se trataron con 500 pg/mL de K55(rac-L)20 y se monitorizaron a lo largo de un periodo de 21 dfas;
La FIGURA 18 muestra la actividad antimicrobiana contra S. aureus y E. coli de copolipeptidos en bloque K55(rac- L)20 formulados como disoluciones o emulsiones;
La FIGURA 19 muestra la actividad antimicrobiana contra S. aureus de copolipeptidos formulados como disoluciones o emulsiones con tamanos variables de dominios hidrofobos a una concentracion de peptidos de 10 pg/mL;
La FIGURA 20 muestra la actividad antimicrobiana in vivo contra S. aureus del copolipeptido K55(rac-L)20 formulado como una emulsion; se inserto de manera subcutanea una malla de polipropileno empapada previamente con copolipeptido en ratas, con copolipeptido adicional, y se anadio un inoculo de 106 de S. aureus 6538; despues de 2 dfas, la malla implantada se coloco en placas para la enumeracion bacteriana;
La FIGURA 21 muestra los resultados de ensayar la inflamacion en un modelo de roedores; el copolipeptido K55(rac- L)20 se formulo como una emulsion, y se inserto de manera subcutanea una malla de polipropileno empapada previamente con copolipeptido en ratas, con copolipeptido adicional; se anadio un inoculo de 106 de S. aureus 6538, y despues de 48 hrs, el tejido se analizo mediante histologfa en busca de inflamacion: 0=normal, 1=leve, 2=moderado, 3=grave;
La FIGURA 22 muestra la cicatrizacion de heridas en un modelo porcino en el que las heridas se trataron con 500 pg/mL de K55(rac-L)20 formulado como una emulsion y se monitorizaron a lo largo de un periodo de 21 dfas;
La FIGURA 23 muestra la actividad antimicrobiana de copolipeptidos en bloque K180L20. Se incubo K180L20 con bacterias durante 30 min antes de colocarlas en placas para el cultivo;
La FIGURA 24 muestra la actividad antimicrobiana de K180L20 en un modelo de roedores; se inserto de manera
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subcutanea una malla de polipropileno empapada previamente con PBS o K180L20 en ratas, con copolipeptido adicional; se anadio un inoculo de 106 de S. aureus 6538 o P. aeruginosa (aislamiento clmico de cerdo); despues de 48 hrs, la malla implantada y el tejido circundante se colocaron en placas para la enumeracion bacteriana;
La FIGURA 25 muestra los resultados de ensayar la inflamacion en un modelo de roedores; se inserto de manera subcutanea una malla de polipropileno empapada previamente con PBS o el copolipeptido K180L20 en ratas, con copolipeptido adicional, y se anadio un inoculo de 106 de S. aureus 6538; despues de 48 hrs, el tejido circundante se analizo mediante histologfa en busca de inflamacion (que incluye la infiltracion celular y la necrosis);
La FIGURA 26 muestra la actividad antimicrobiana de K180L20 en un modelo porcino; se aplico K180L20 (40 mg/mL) a heridas, y despues de 4 hrs se anadieron 107 de S. aureus 6538 a las heridas; despues de 48 hrs, se determinaron los recuentos bacterianos finales;
La FIGURA 27 muestra el efecto de los copolipeptidos sobre el tiempo de coagulacion en sangre completa, a una concentracion de copolipeptido de 10 pg/mL;
La FIGURA 28 muestra los resultados de un ensayo de tromboelastograffa (TEG) para medir los efectos de los copolipeptidos sobre la coagulacion sangumea a una concentracion de copolipeptidos de 10 pg/mL; el tiempo R es el tiempo de latencia entre la colocacion de sangre en el aparato de tEg y el incremento inicial de viscosidad (medida mediante el incremento de la senal de 0 - 2 mm); el tiempo R corresponde a la actividad enzimatica de los factores de coagulacion antes de que se incremente el entrecruzamiento; el tiempo K corresponde a la amplitud que se incrementa de 2 - 20 mm; el angulo alfa es la pendiente de la senal de TEG entre los tiempos R y K; el angulo alfa mide la velocidad de desarrollo de coagulos, y la amplitud maxima (MA) es la senal mas alta y proporciona una medida absoluta de la resistencia del coagulo;
La FIGURA 29 muestra el efecto de los copolipeptidos sobre la agregacion plaquetaria en plasma rico en plaquetas con una concentracion de copolipeptidos de 100 pg/mL;
La FIGURA 30 muestra el efecto de los copolipeptidos sobre la agregacion plaquetaria;
La FIGURA 31 muestra un ensayo en placas de gel de fibrina usado para medir los efectos sobre la fibrinolisis del copolipeptido RH55(rac-L)20 a concentraciones de 100, 1000 pg/ml y 1000 pg/ml con 1 mg/ml de albumina;
La FIGURA 32 muestra imagenes de hemorragias venosas porcinas que representan heridas de 15 mm a los 5 min rellenadas de geles basados en PEG que contienen copolipeptidos; y
La FIGURA 33 es una tabla (Tabla 1) de datos sinteticos de polipeptidos en la que a = Mn y PDI se determina mediante el uso de cromatograffa de permeabilidad en gel (GpC) del primer segmento, poli(NE-CBZ-L-lisina); las composiciones se calcularon mediante el uso de: b = GPC y 1H-RMN o c = 1H-RMN en d-TFA. d = Sintetizado mediante guanilacion de K55(rac-L)20;
La FIGURA 34 es una tabla (Tabla 2) del tiempo de contacto de mmimo (min) para un 99,99% de inhibicion del crecimiento de E. coli 11229 y E. coli 0157:H7, a una concentracion de copolipeptido de 100 pg/mL;
La FIGURA 35 es una tabla (Tabla 3) que muestra la concentracion inhibitoria minima (CIM) de copolipeptidos contra diversos microbios que incluyen microbios relacionados con los alimentos;
La FIGURA 36 es una tabla (Tabla 4) que muestra el logaritmo de la reduccion contra gripe A (virus con envoltura) mediante copolipeptidos a una concentracion de 1 mg/ml despues de 30 seg de tiempo de contacto;
La FIGURA 37 es una tabla (Tabla 5) que muestra la concentracion inhibitoria minima (CIM) de copolipeptidos formulados como emulsiones contra endosporas de B. subtilis;
La FIGURA 38 es una tabla (Tabla 6) que muestra la citotoxicidad in vitro en queratinocitos humanos, de copolipeptidos formulados como disoluciones o emulsiones, a una concentracion de 100 pg/mL; y
La FIGURA 39 es una tabla (Tabla 7) que muestra los parametros de tromboelastograffa (TEG) para copolipeptidos a una concentracion de 10 pg/mL; *Los valores fueron significativamente diferentes (p<0,05) que los controles sin tratar.
Descripcion detallada de la invencion
La descripcion siguiente se proporciona para permitir que cualquier persona experta en la tecnica realice y use la invencion, y expone los mejores modos contemplados por el inventor de llevar a cabo esta invencion. Sin embargo, seguiran siendo facilmente evidentes diversas modificaciones para los expertos en la tecnica, ya que los principios generales de la presente invencion se han definido en la presente memoria espedficamente para proporcionar copolipeptidos sinteticos con una actividad antimicrobiana elevada y una toxicidad baja.
Las composiciones de copolipeptidos antimicrobianos de esta invencion pueden contener uno o mas aminoacidos
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cationicos (p.ej., lisina, arginina, homoarginina, ornitina) y uno o mas aminoacidos hidrofobos (p.ej., leucina, valina, isoleucina, fenilalanina, alanina) dispuestos en bloques (Figs. 1-3, Fig. 33 (Tabla 1)). Los polipeptidos anfifflicos policationicos (p.ej., que contienen grupos amina que estan protonados a pH neutro, amonios peralquilados o guanidinios) muestran una actividad antimicrobiana elevada. Por ejemplo, como se representa en la Fig. 4, se ha demostrado que un copolipeptido sintetico que consiste en un bloque de 55 lisinas seguido de un bloque de 20 leucinas D y L (racemica) (K55(rac-L)2o) tiene una actividad antimicrobiana sustancial contra S. aureus (grampositivo), S. epidermidis (grampositivo), E. coli (gramnegativo) y P. aeruginosa (gramnegativo). Tambien se ha demostrado una actividad contra otros diversos organismos bacterianos y fungicos (vease mas adelante). Se han sintetizado otros multiples copolipeptidos sinteticos (Fig. 33 (Tabla 1)), y presentan una actividad antimicrobiana sustancial. En contraste, a pH neutro (~7) los polipeptidos polianionicos (p.ej., E64(rac-L)2o) muestran una actividad antimicrobiana baja.
Como se representa en la Fig. 5, los copolipeptidos sinteticos dibloque basados en el aminoacido cationico lisina y otros aminoacidos hidrofobos muestran una actividad antimicrobiana intensa. En otros estudios, se demostro que la guanilacion parcial de los residuos de lisina dio como resultado una actividad antimicrobiana elevada, por ejemplo X55(rac-L)2o para X = K / RH (homoarginina) alcanzo una actividad antimicrobiana elevada. Variando la composicion de aminoacidos hidrofobos, mientras se manteman constantes todas las demas propiedades, tambien se mantuvo una actividad antimicrobiana elevada in vitro (Fig. 5). De manera espedfica, poli(L-lisina-HCl)55-blogue- poli(aminoacido hidrofobo racemico)2o, K55(rac-X)2o, para X = Alanina (A), Isoleucina (I), Leucina/Fenilalanina (L/F), o Valina (V), a una concentracion muy baja (1o pg/ml), alcanzo una reduccion observable maxima (6 unidades logantmicas) de las cuentas bacterianas para bacterias grampositivas (S. aureus) y gramnegativas (E. coli). Tambien se demostro que los copolipeptidos seleccionados fueron bastante eficaces contra otros microbios, que incluyen E. coli o157:H7, asf como contra otros patogenos alimentarios, e incluso contra ciertas formas de endosporas de microbios (Figs. 34 y 35 (Tablas 2 y 3)). Tambien se demostro que estos compuestos fueron eficaces contra ciertos organismos fungicos, como se representa para Candida albicans en la Fig. 6. Como se representa en la Fig. 7, ciertos organismos microbianos (p.ej., P. acnes) pueden ser menos sensibles a ciertos copolipeptidos que otros microorganismos (p.ej., S. aureus). Los copolipeptidos en fase de disolucion tambien mostraron actividad antiviral contra el virus de la gripe H1N1 (Fig. 33 (Tabla 4)). En este experimento, se observo que el copolipeptido dibloque Rh/K (lisina parcialmente guanilada) fue especialmente activo.
En estos copolipeptidos en bloque, tambien se ha demostrado una actividad antimicrobiana elevada cuando se vana la longitud del bloque hidrofobo (Figs. 8 y 9). De manera inesperada, se demostro una actividad antimicrobiana elevada en varias series de copolipeptidos en bloque sinteticos, que incluyen los copolipeptidos en bloque con un contenido hidrofobo por debajo del 4o%. Incluso las moleculas con un bloque de solamente 5 o 1o aminoacidos hidrofobos de leucina mostraron una buena actividad antimicrobiana al construirlos con un bloque de 55 aminoacidos cationicos de lisina.
En estudios diferentes se ha demostrado que los copolipeptidos en bloque con bloques hidrofilos largos (es decir, mas largos de K9o) fueron eficaces como agentes antimicrobianos (Fig. 1o). Ademas, se ha demostrado que los copolipeptidos sinteticos aleatorios de longitud superior (mas de 1oo residuos de aminoacidos) fueron agentes antimicrobianos muy eficaces. Esto fue cierto para los compuestos de contenido hidrofobo variable.
En estudios in vitro diferentes, se ha demostrado que los copolipeptidos de secuencia en bloque en disolucion fueron menos citotoxicos que los copolipeptidos de secuencia aleatoria de composicion similar. Por ejemplo, se descubrio que una secuencia en bloque K55L2o en disolucion disminuyo la viabilidad celular de queratinocitos de raton en un 5o% (CEso), a 47,4 pg/ml, mientras un copolipeptido sintetico de composicion similar de secuencia aleatoria tuvo una CEso de 21,o pg/ml en disolucion. De forma similar, se descubrio que la secuencia en bloque K55(rac-L)2o en disolucion fue menos citotoxica que la secuencia aleatoria K55(rac-L)2o en disolucion. Como se describe mas adelante, se descubrio que una diversidad de copolipeptidos sinteticos fueron antimicrobianos en preparaciones en emulsion. En estas preparaciones, tambien se descubrio que los copolipeptidos sinteticos de secuencia en bloque fueron menos citotoxicos (CE5o inferior) que los copolipeptidos de secuencia aleatoria, aunque las emulsiones estabilizadas de los copolipeptidos de secuencia en bloque mostraron en general una actividad antimicrobiana equivalente (y a veces superior).
Tambien se demostro que un copolipeptido sintetico de secuencia en bloque K55(rac-L)2o en fase de disolucion fue eficaz en un modelo de roedores de prevencion de la infeccion de heridas (Figs. 11 - 13). Se han demostrado reducciones de las poblaciones bacterianas en un modelo de prevencion de la infeccion contra S. aureus y P. aeruginosa. De manera coherente, se observaron reducciones dependientes de la concentracion, en general una reduccion de 1-3 unidades logantmicas a 2o pg/ml de copolipeptido K55(rac-L)2o, y una reduccion completa (o casi completa) a 2 mg/ml. Estos estudios indican que las formulaciones de copolipeptidos siguen siendo activas cuando se exponen a un fluido biologico complejo. En particular, los copolipeptidos se podnan formular como suspensiones acuosas, o mezclarlos con aceite y agua y autoensamblarse en nanoemulsiones; ciertos copolipeptidos antimicrobianos son tensioactivos eficaces (vease mas adelante para las emulsiones).
De manera importante, los copolipeptidos sinteticos de secuencia en bloque K55(rac-L)2o en disolucion no parecieron irritar las heridas abiertas. Como se representa en la Fig. 14, las pruebas histopatologicas sugieren que la inflamacion estuvo al mismo nivel o a un nivel inferior que en los tratamientos de control.
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Tambien se descubrio que los copolipeptidos antimicrobianos en fase de disolucion fueron muy eficaces en un modelo porcino de prevencion de la infeccion. Como se representa en la Fig. 15, una disolucion de K55(rac-L)20 aplicada a una herida abierta antes de la inoculacion con S. aureus previno completamente la infeccion microbiana. En estudios diferentes, el copolipeptido K55(rac-L)20, en el que el bloque hidrofobo es poli-D/L-leucina racemica, mostro una biocompatibilidad tisular excelente en los modelos animales. Por ejemplo, en un estudio porcino de herida abierta de dos dfas (Fig. 16), el analisis histologico (llevado a cabo por un patologo veterinario) mostro que "los exudados serocelulares y la inflamacion neutrofflica fueron levemente y mmimamente menos graves, respectivamente" en los animales tratados con K55(rac-L)20 respecto de los controles. No se observaron diferencias en la inflamacion mononuclear, edema o hemorragia. En un estudio porcino de cicatrizacion de heridas de 21 dfas (sin infectar), se descubrio que las heridas tratadas con K55(rac-L)20 y tratadas con control fueron similares con respecto a la inflamacion, necrosis y cobertura epitelial por parte de un patologo veterinario (Fig. 17).
Emulsiones antimicrobianas basadas en copolipeptidos sinteticos. Estos copolipeptidos sinteticos se pueden disenar para que sean tensioactivos eficaces que puedan estabilizar (y / o mostrar actividad en) emulsiones. Se ha demostrado que una diversidad de preparaciones en emulsion de copolipeptidos sinteticos son agentes antibacterianos eficaces in vitro (Figs. 18 y 19). En particular, se descubrio que estas emulsiones antimicrobianas fueron activas contra endosporas de B. subtilis (Fig. 33 (Tabla 5)). Como se describio previamente para los copolipeptidos en fase de disolucion, las preparaciones en emulsion mostraron actividad antiviral contra el virus de la gripe H1N1 (Fig. 34 (Tabla 4)), asf como contra un bacteriofago sin envoltura.
Tambien se descubrio que las emulsiones antimicrobianas basadas en copolipeptidos sinteticos fueron eficaces en un modelo de prevencion de la infeccion en roedores (Fig. 20). Se han demostrado reducciones de las poblaciones bacterianas en un modelo de prevencion de la infeccion contra S. aureus. De manera coherente, se observaron reducciones dependientes de la concentracion, en general una reduccion de 1-4 unidades logantmicas a 20 pg/ml de emulsiones basadas en copolipeptido K55(rac-L)20, y una reduccion completa (o casi completa) a 2 mg/ml. Estos estudios indican que las formulaciones de emulsiones de copolipeptidos siguen siendo activas cuando se exponen a un fluido biologico complejo. Parece que las heridas toleran bien estas emulsiones antimicrobianas, y no dieron como resultado una inflamacion incrementada respecto de los tratamientos de control, tal como se determino mediante examen histologico (Fig. 21). Ademas, se descubrio que estas emulsiones antimicrobianas se toleraron bien en un modelo porcino de 21 dfas de cicatrizacion de heridas (no infectadas) (Fig. 22).
Los estudios adicionales indicaron que las emulsiones de copolipeptidos sinteticos antimicrobianos tienen menos citotoxicidad in vitro (Fig. 34 (Tabla 6)). En otros estudios, esta observacion fue coherente para multiples copolipeptidos sinteticos, que incluyen K55(rac-L)20, K55L20, K55(rac-L/F)20. En conjunto, estos datos indican que la disposicion de los copolipeptidos sinteticos de secuencia en bloque en las estructuras jerarquicas de las emulsiones y nanoemulsiones puede mejorar la actividad antimicrobiana, reducir la toxicidad en mairnferos, o ambos.
Hidrogeles antimicrobianos basados en copolipeptidos sinteticos. Esta invencion tambien describe copolipeptidos en bloque que se autoensamblan en fibrillas que forman hidrogeles antimicrobianos. Como se describe mas adelante, K180L20 es un agente formador de hidrogeles y ha mostrado una actividad antimicrobiana intensa in vitro y una prevencion eficaz del crecimiento microbiano en estudios in vivo. Como se representa en la Fig. 23, K180L20 mostro una actividad intensa de agente antimicrobiano in vitro (reduccion 5+ unidades logantmicas a 6,3 pg/mL) contra bacterias grampositivas (S. aureus, S. epidermidis) y gramnegativas (E. coli, P. aeruginosa) que se sabe que son importantes en la infeccion de heridas. En los ensayos de destruccion en funcion del tiempo, K180L20 a 100 pg/mL mostro una reduccion mayor de 3 unidades logantmicas en 5 min contra S. epidermidis, E. coli, y P. aeruginosa.
Otros estudios demostraron que los copolipeptidos en bloque K180L20 son agentes antimicrobianos in vivo. Como se representa en la Fig. 24, K180L20 fue eficaz en la inhibicion del crecimiento microbiano en un modelo en roedores de herida cerrada con cuerpo extrano. En este modelo, se inserto de manera subcutanea una malla empapada previamente con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) o K180L20 en la region cervical dorsal de ratas Sprague-Dawley, seguido de 106 de S. aureus o P. aeruginosa. Se anadio mas PBS o K180L20, se cerraron las heridas y los animales se devolvieron a sus jaulas durante 48 h. K180L20 (2 mg/mL y 20 mg/mL) disminuyo sustancialmente el numero de bacterias (tanto S. aureus como P. aeruginosa) cultivadas a partir de la malla y el tejido adyacente. No se observo una inflamacion incrementada con este hidrogel antimicrobiano en el modelo de infeccion en roedores (Fig. 25).
En un estudio diferente, el hidrogel basado en el copolipeptido de secuencia en bloque K180L20 fue eficaz en la inhibicion de S. aureus en un modelo porcino de herida abierta (Fig. 26). Se hicieron heridas de 1 cm de diametro de espesor completo en el torax dorsal y lateral de un cerdo cruzado Yorkshire de 25-35 kg. Se aplico el hidrogel de K180L20 (o tampon de control), y despues de cuatro hr, las heridas se inocularon con S. aureus. Las heridas se estudiaron despues de 48 hr con respecto al recuento bacteriano mediante metodos habituales de microbiologfa. Como se representa en la Fig. 26, el hidrogel de K180L20 redujo completamente el recuento de S. aureus.
Estructura de secuencia en bloque. En ciertas realizaciones, estas composiciones de copolipeptidos antimicrobianos pueden tener una estructura de secuencia en bloque, que incluye uno o mas bloques que contienen segmentos de 2 o mas aminoacidos / monomeros cationicos consecutivos (p.ej., lisina, arginina), o segmentos de 2 o mas aminoacidos / monomeros hidrofobos consecutivos (p.ej., leucina, isoleucina, valina, alanina, fenilalanina). En ciertos
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casos, los compuestos tribloque o multibloque (es decir, varios bloques de aminoacidos distintos, monomeros y / u otros bloques polimericos) pueden ser especialmente eficaces. Los bloques de aminoacidos o monomeros alternantes tambien pueden ser eficaces, mientras los bloques de secuencias aleatorias tambien pueden ser ventajosos en ciertas situaciones. Otras realizaciones tambien pueden presentar un bloque o segmento de copolipeptido del mismo aminoacido / monomero o de diferentes aminoacidos / monomeros que estan unidos qmmicamente a un polfmero diferente. Tambien se preve que la bioactividad y la composicion qmmica de los copolipeptidos / copolfmeros en bloque pueden ser mas reproducibles de lote a lote que la de los copolipeptidos / copolfmeros aleatorios. Tambien se preve que los copolipeptidos en bloque pueden ser menos inmunogenos que los copolipeptidos aleatorios. Los bloques pueden estar compuestos de aminoacidos naturales y / o no naturales que muestran diferentes grados de hidrofilicidad o hidrofobicidad. Se pueden usar aminoacidos naturales (hidrofobos, tales como, pero sin limitacion, alanina, glicina, isoleucina, leucina, fenilalanina, valina, e hidrofilos, tales como, pero sin limitacion, arginina, acido aspartico, asparagina, acido glutamico, glutamina, lisina, serina, tirosina, o treonina) o aminoacidos no naturales, tales como, pero sin limitacion, hidrocarburos fluorados o insaturados, asf como mezclas enantiopuras o racemicas. Ademas, los materiales polipeptfdicos o tnbridos que contienen polfmeros sinteticos y segmentos o bloques peptfdicos tambien pueden mostrar una actividad antimicrobiana incrementada, una toxicidad disminuida en mairnferos, o ambas. Por ejemplo, se puede conjugar un polipeptido hidrofobo a un polfmero u oligomero hidrofilo, o un polfmero u oligomero sintetico hidrofobo se puede conjugar a un peptido hidrofilo y mostrar caractensticas similares a las de un material compuesto completamente por aminoacidos unidos. Tambien se puede sustituir un segmento, bloque o dominio peptfdico por un segmento oligomerico o polimerico sintetico, lo que incluye la incorporacion directa en el esqueleto del polfmero, o como un injerto.
Se ha demostrado que se puede usar la estructura de secuencia en bloque para dirigir la autoasociacion o el autoensamblaje molecular. Por ejemplo, se demostro determinando la concentracion de agregacion cntica (CAC) que el copolipeptido de secuencia en bloque K55L20 muestra una autoasociacion sustancialmente mas intensa (CAC=0,33 jM) que la secuencia aleatoria K55L20 (CAC=160 jM). Este elemento de diseno molecular es importante en las realizaciones preferidas de la invencion que implican estructuras jerarquicas disenadas.
Estructuras jerarquicas disenadas. Estas composiciones se pueden formular como estructuras jerarquicas, tales como multimeros, micelas, hidrogeles, o vesmulas, o mezclas de las mismas. La actividad antimicrobiana aumentada, o la toxicidad disminuida en marnfferos, o ambas, pueden proceder de la organizacion de los elementos antimicrobianos en estructuras de orden elevado que muestran las zonas activas de una manera mas eficaz o con una concentracion local mas elevada. Por ejemplo, la mayor densidad de carga cationica en las secciones hidrofilas de la interfase lfquida de una emulsion puede conducir a una mejor interaccion con los organismos microbianos. De forma similar, otras estructuras de orden elevado, tales como vesmulas, micelas, lamelas o hidrogeles pueden transportar los elementos antimicrobianos de manera mas eficaz que un elemento antimicrobiano aislado solo. Por otra parte, las interacciones secundarias presentes, y a veces responsables de las estructuras de orden superior de los segmentos hidrofobos en los polfmeros anfifflicos, pueden ser responsables de la toxicidad reducida en mamfferos.
Estos copolipeptidos sinteticos disenados se pueden autoensamblar en estructuras jerarquicas (p.ej., multimeros, micelas, emulsiones, hidrogeles, vesmulas), y de ese modo aumentan la actividad del agente antimicrobiano (in vitro o in vivo), disminuyen la toxicidad, o ambas. Ademas, estos compuestos pueden precipitar facilmente sobre y / o unirse directamente a los tejidos danados, en los que pueden proporcionar una actividad local, concentrada de agente antimicrobiano.
En ciertas realizaciones, estas composiciones se pueden formular como, o mezclar en, emulsiones, microemulsiones o nanoemulsiones. En particular, estas emulsiones se pueden disenar para que tengan una actividad elevada de agente antimicrobiano, una toxicidad baja en mamnferos, o ambas. Se reconoce que estas actividades pueden depender de uno o mas factores adicionales, tales como la composicion de la fase oleosa, o el tamano de las goticulas.
En ciertas realizaciones, estos copolipeptidos de agentes antimicrobianos se pueden formular como hidrogeles. Estas moleculas de agentes antimicrobianos se autoensamblanan en hidrogeles. Se preve que existinan ventajas con los hidrogeles ffsicos, que son intrmsecamente antimicrobianos que pueden ser capaces de pasar a traves de aberturas de orificios pequenos (p.ej., agujas de 0,8 mm) o en espacios de tejidos pequenos, y despues volver a gelificarse rapidamente. Estos copolipeptidos antimicrobianos que forman hidrogeles se pueden disenar para que sean ligeramente adherentes al tejido y opticamente transparentes. Se preve que proporcionaran una actividad antimicrobiana localizada, concentrada, asf como los beneficios de los hidrogeles estandar (p.ej., retencion de fluidos). Las propiedades antimicrobianas de los copolipeptidos que se autoensamblan en fibrillas que forman hidrogeles se han demostrado a concentraciones muy por debajo de la concentracion de gelificacion. Por ejemplo, se ha demostrado que K180L20 es un agente antimicrobiano potente a concentraciones de 10 jg/ml, mientras su concentracion de gelificacion es de aprox. 10 mg/ml. Esto establece que el material es intrmsecamente antimicrobiano, mientras al mismo tiempo puede autoasociarse hasta estructuras jerarquicas que proporcionan propiedades macroscopicas a las preparaciones. Ademas, se ha demostrado que K180L2 a concentraciones que forman hidrogeles (p.ej., 20 mg/ml) es un agente antimicrobiano eficaz en un modelo de prevencion de la infeccion in vivo, y tambien que tiene una toxicidad baja en varios modelos in vivo.
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Longitud de cadena larga. En ciertas realizaciones, estas composiciones de copolipeptidos antimicrobianos pueden tener una longitud de cadena relativamente larga (p.ej., mas de 100 aminoacidos). Se preve que los copolipeptidos sinteticos con una longitud de cadena mas larga se pueden optimizar para que muestren una eficacia incrementada, una toxicidad disminuida en mai^eras o ambas en ciertas situaciones. En particular, pueden mostrar multiples sitios activos, conformaciones, dominios, o fragmentos de manera mas eficaz, y por lo tanto podnan continuar mostrando una actividad antimicrobiana incluso despues de una complejacion o degradacion parcial. Los copolipeptidos de cadena larga pueden interaccionar de manera mas eficaz con las superficies microbianas, e interaccionar con mas de un microbio a la vez. Los polipeptidos mas largos pueden ser capaces de alterar las membranas bacterianas de manera mas eficaz mediante el entrecruzamiento de los componentes negativos de la membrana bacteriana. Tambien pueden ser capaces de interaccionar con ciertas biomoleculas solubles o componentes tisulares, a la vez que dejan un segmento molecular libre para interaccionar con los microbios.
Contenido hidrofobo bajo. Estas composiciones pueden tener fracciones molares bajas de monomero hidrofobo (p.ej., leucina, isoleucina, valina, alanina, fenilalanina, o monomero hidrofobo no peptfdico) en comparacion con otros peptidos antimicrobianos, por ejemplo un 35% o menos. En la presente invencion, se reconoce que los copolipeptidos en bloque con una fraccion molar baja de monomeros hidrofobos (p.ej., fHM = 8%, 18%, 25%, 35%) pueden producir una actividad antimicrobiana elevada y una toxicidad baja en mairnferos. Tales compuestos pueden superar las limitaciones espedficas inherentes a los copolfmeros con fHM alta. Los copolfmeros anfifflicos con fHM baja ofrecen varias ventajas diferentes. Por ejemplo, se preve que el contenido hidrofobo reducido disminuya la toxicidad en mamfferos. Se ha informado que el contenido hidrofobo incrementado en los peptidos antimicrobianos incrementa la actividad hemolttica, posiblemente reduciendo la selectividad hacia las membranas bacterianas respecto de las de celulas de mamffero [22]. Otras ventajas pueden incluir una solubilidad mejorada en disolucion acuosa. Ciertas composiciones de la presente invencion incorporan fHM bajas. De manera espedfica, se ha demostrado una actividad antimicrobiana elevada con una fraccion molar de monomeros hidrofobos de solo alrededor del 8%. Ademas, se ha demostrado que la actividad antimicrobiana elevada se puede obtener disminuyendo el contenido hidrofobo o incrementando el contenido hidrofilo.
La pureza enantiomerica influye en la estructura secundaria. En ciertas realizaciones, la pureza enantiomerica de los aminoacidos (especialmente en el dominio hidrofobo) se puede usar para controlar las caractensticas de autoensamblaje. Por ejemplo, se demostro que K55L20 y K55(rac-L)20 consiguen una reduccion de bacterias, para cepas grampositivas (S. aureus) y gramnegativas (E. coli, P. aeruginosa) a una concentracion muy baja (10 pg/ml). Las mezclas racemicas, o mezclas con una pureza optica variable, pueden ofrecer una solubilidad mejorada y una agregacion reducida. De manera importante, la incorporacion de una fraccion de D-aminoacidos puede tener ventajas particulares en las aplicaciones terapeuticas contra biopelroulas [38]. Ademas, la disminucion de la pureza optica elimina la estructura secundaria ordenada, que influye en las caractensticas de autoasociacion y / o autoensamblaje. Por ejemplo, determinando la concentracion de agregacion cntica (CAC) se demostro que el copolipeptido de secuencia en bloque K55L20 muestra una asociacion mas fuerte (CAC=0,33 |jM) que K55(rac-L)20 (CAC=8,1 jM).
Estabilidad en disolucion baja con un contenido hidrofobo bajo. En ciertas realizaciones, estas composiciones de copolipeptidos antimicrobianos se pueden disenar con una estabilidad en disolucion relativamente baja. Ademas, estos materiales se pueden disenar para unirse a / precipitar en sitios en los que interaccionan con elementos cargados negativamente hallados habitualmente en los microbios (p.ej., microcolonias bacterianas y biopelroulas) y en sitios de dano tisular. Estas moleculas antimicrobianas "metaestables" en disolucion pueden precipitar facilmente (por ejemplo, al interaccionar con microbios o materiales tisulares de marnffero de carga opuesta). Se pueden obtener ciertas ventajas de los copolipeptidos sinteticos que precipitan facilmente sobre y / o se unen directamente a los tejidos danados, donde pueden proporcionar una actividad antimicrobiana local y concentrada. Ademas, los copolipeptidos antimicrobianos (u otros materiales antimicrobianos) se pueden hacer mas eficaces en ciertas situaciones mediante la union a / precipitacion en sitios de microbios (p.ej., microcolonias bacterianas y biopelroulas). Se pueden incorporar ciertos elementos de diseno de forma que las estructuras jerarquicas de copolipeptidos sinteticos permanezcan completamente solvatadas en ausencia de materiales biologicos (p.ej., suero, fluidos de heridas, tejidos danados, biopelroulas bacterianas), pero se hagan metaestables tras unirse a materiales biologicos. Una vez que los materiales antimicrobianos se hacen metaestables, pueden depositarse en los tejidos o colonias bacterianas, y asf incrementan drasticamente la concentracion local que actua como agente antimicrobiano y / o como barrera antimicrobiana.
Multivalencia. En ciertas realizaciones, estas composiciones se pueden modificar para que incluyan multiples sitios de agentes antimicrobianos. Estos sitios antimicrobianos pueden incluir regiones locales de carga cationica y / o regiones locales de hidrofobicidad. Por lo tanto, un unico material podna tener varios sitios activos diferentes capaces de destruir / inhibir microbios. De esta manera, una unica construccion supramolecular podna realizar una aproximacion "de doble efecto", lo que proporciona una mayor eficacia y ademas disminuye la probabilidad de resistencia microbiana. Ademas, se puede observar una actividad aditiva o sinergica. Ademas, el material puede liberar fragmentos antimicrobianos a medida que se degrada.
Selectividad hacia microbios. Estas composiciones se pueden modificar para seleccionar como objetivo preferentemente ciertos microbios sobre otros. En particular, la seleccion como objetivo de organismos tradicionalmente patogenos (p.ej., S. aureus, S. aureus resistente a meticilina (sArM)) sobre la flora
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tradicionalmente normal (p.ej., P. acnes), puede ser especialmente beneficiosa. Ademas, la seleccion como objetivo de virus seleccionados, bacterias u hongos puede ser relevante en situaciones clmicas particulares, tales como el uso de un desinfectante de manos o en la prevencion de infecciones de heridas. Se han desarrollado multiples copolipeptidos sinteticos que han mostrado una actividad mayor contra S. aureus que contra P. acnes in vitro.
Mezclas. En ciertas realizaciones, estas composiciones se pueden formular con dos o mas copolipeptidos / copolfmeros antimicrobianos diferentes. De esta manera, una composicion podna realizar una aproximacion "de doble efecto", lo que proporciona una mayor eficacia y ademas disminuye el desarrollo de resistencia microbiana. Ademas, se puede observar una actividad aditiva o sinergica.
En ciertas realizaciones, estas composiciones se pueden sintetizar con la modificacion qmmica de aminoacidos o residuos monomericos, por ejemplo, la conversion de una amina primaria (p.ej., de un monomero de lisina) en un grupo guanidinio. Otras modificaciones pueden incluir la alquilacion, acilacion, amidacion, halogenacion, transesterificacion, aminacion reductora u otras transformaciones qmmicas que anaden una funcionalidad o modifican una funcionalidad existente de los aminoacidos o residuos monomericos.
En ciertas realizaciones, estas composiciones se pueden formular con clases diferentes de otros agentes antimicrobianos (p.ej. alcohol, compuestos basados en cloro, compuestos de amonio cuaternario, compuestos fenolicos, clorhexidina, antibioticos, anticuerpos). Esto puede incluir mezclar las composiciones de la invencion con agentes antimicrobianos conocidos. Puede incluir formular copolipeptidos / copolfmeros sinteticos como un tipo de agente de administracion o de liberacion retardada (p.ej., emulsion, nanoemulsion doble, vesfcula, hidrogel) e incorporar una o mas sustancias antimicrobianas adicionales.
En ciertas realizaciones, estas composiciones se pueden formular con materiales bioactivos u otros ingredientes farmaceuticos activos (IFAs). De esta manera, las formulaciones podrian proporcionar una actividad antimicrobiana, asf como una segunda o tercera funcion. Las posibilidades incluyen, pero sin limitacion, materiales hemostaticos, factores de crecimiento para favorecer la cicatrizacion de heridas, agentes pro- o antiinflamatorios, y moduladores inmunitarios.
En ciertas realizaciones, los copolipeptidos / copolfmeros antimicrobianos sinteticos se pueden disenar para que contengan otros elementos bioactivos (p.ej., secuencias espedficas, bloques, estructuras jerarquicas o modificaciones qmmicas). Por ejemplo, pueden contener elementos que estimularian la hemostasia mediante uno o mas mecanismos tales como la union de plaquetas, la activacion de plaquetas, la aceleracion de la coagulacion, la disminucion de la fibrinolisis, la absorcion de fluidos o efectos de barrera ffsica. Esta invencion preve copolipeptidos sinteticos que son de naturaleza hemostatica, asf como aquellos que tienen actividades antimicrobianas y hemostaticas combinadas (Figs. 27 - 32, Fig. 39 (Tabla 7)).
Seccion experimental
General. Se preparo tetrahidrofurano seco (THF) haciendolo pasar a traves de una columna empaquetada con alumina bajo nitrogeno antes del uso. Los pesos moleculares (Mn) y las polidispersidades (PDIs) se obtuvieron mediante cromatograffa de permeabilidad en gel/dispersion de luz en tandem (GPC/LS) llevada a cabo a 60 °C con una bomba SSI equipada con un detector de dispersion de luz Wyatt DAWN EOS y un aparato Wyatt Optilab DSP con columnas Phenomenex de 5 pm de 105, 104, y 103 A mediante el uso de LiBr 0,1 M en DMF como eluyente y una concentracion de polipeptido de aproximadamente 5 mg/mL. Se registraron los espectros infrarrojos con transformada de Fourier (FTlR) en un espectrofotometro Perkin Elmer RX1 FTIR calibrado mediante el uso de una pelfcula de poliestireno. Los espectros de 1H RMN se registraron en un espectrometro Bruker AVANCE de 400 MHz. Se purifico agua desionizada (DI) mediante el uso de un purificador de osmosis inversa Purelab Option 560. Se obtuvo agua Millipore de una unidad de purificacion Millipore Milli-Q Biocel A10.
Smtesis de copolipeptidos en bloque-General. Se sintetizaron monomeros de a-aminoacido-N-carboxiantudrido NCA mediante el uso de protocolos publicados previamente en la bibliograffa. Todos los copolipeptidos en bloque se polimerizaron mediante el uso del iniciador (PMe3)4Co. Los polipeptidos resultantes se caracterizaron mediante el uso de GPC, 1H RMN y espectroscopfa IR. Se determinaron las composiciones de los copolfmeros mediante analisis de los valores de integracion de los espectros de 1H RMN registrados en d-TFA. Se descubrio que todas las composiciones estuvieron dentro del 5% de los valores predichos. Las distribuciones de longitudes de cadenas de los polfmeros oscilaron (Mw/Mn) de 1,1 a 1,3.
Poli(NE-CBZ-L-lisina)55-d-poli(rac-leucina)20, Z-K55(rac-L)20. En la caja seca, se coloco NE-CBZ-L-lisina, Z-K NCA (11,34 g, 37 mmol) en un matraz de fondo plano de 500 mL con una barra de agitacion. Se anadio THF seco (227 mL) y despues se sello con un tapon de plastico. Despues se anadio una alfcuota de (PMe3)4Co (18,9 mL de una disolucion de 40 mg/mL en THF seco, 2,1 mmol) por medio de una jeringa, y el matraz se sello y se agito durante 45 minutos. Se extrajo una alfcuota (50 pL) de la polimerizacion para el analisis mediante GPC (Mn = 14,7 * 103 g/mol, Mw/Mn = 1,12). Despues, la reserva de poli(NE-CBZ-L-lisina)55 se dividio igualmente en 8 fracciones (0,26 mmol de iniciador (PMe3)4Co en cada una) y se coloco en matraces de fondo plano de 125 mL. A cada fraccion se le anadio una cantidad diferente de D,L NCA hidrofobo segun fue necesario. Por ejemplo, para sintetizar Z-K55(rac-L)20 se anadio una alfcuota de D,L leucina (L) NCA (5,3 mL de una disolucion de 50 mg/mL en THF, 1,7 mmol) y se dejo
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polimerizar durante la noche.
Se uso un procedimiento similar para producir los copoUmeros en bloque siguientes: Z-K55(rac-L)5, D,L leucina NCA (1,3 mL de una disolucion de 50 mg/mL en THF, 0,42 mmol); Z-K55(rac-L)10, D,L leucina NCA (2,7 mL de una disolucion de 50 mg/mL en THF, 0,84 mmol); Z-K55(rac-L)30, D,L leucina NCA (7,9 mL de una disolucion de 50 mg/mL en THF, 2,5 mmol); Z-K55(rac-I)20, D,L isoleucina (I) NCA (5,3 mL de una disolucion de 50 mg/mL en THF, 1,7 mmol); Z-K55(rac-L/F)20, D,L leucina NCA (2,6 mL de una disolucion de 50 mg/mL en THF, 0,84 mmol) y D,L fenilalanina (F) NCA (3,2 mL de una disolucion de 50 mg/mL en THF, 0,84 mmol); Z-K55(rac-A)20, D,L alanina (A) NCA (3,9 mL de una disolucion de 50 mg/mL en THF, 1,7 mmol); y Z-K55(rac-V)20, D,L valina (V) NCA (5,3 mL de una disolucion de 50 mg/mL en THF, 1,7 mmol).
Poli(L-Lisina HCl)55-^-poli(rac-Leucina)20, K55(rac-L)20. La poli(NE-CBZ-L-lisina)55-6-poli(rac-leucina)20 se extrajo de la caja seca. El THF se elimino a presion reducida y despues se disolvio en acido trifluoroacetico (TFA) (50 mL). A continuacion, el matraz se coloco en un bano de hielo seguido de la adicion de HBr (33% en acido acetico, 6,0 mL, 19,7 mmol) y se agito durante dos hrs. El polfmero desprotegido se aislo mediante la adicion de eter dietflico a la mezcla de reaccion (50 mL), seguido de centrifugacion (tres min a 3.000 rpm). El polfmero precipitado se lavo despues y se centrifugo dos veces mas con eter dietilico. El polfmero aislado se disolvio despues en agua Millipore y se dializo (membrana de MWCO 2.000) con EDTA tetrasodico (3 mmol, cuatro dfas), HCl 0,1 M (dos dfas), agua DI (un d^a), NaCl 0,1 M (dos dfas), agua Millipore (dos dfas), cambiando cada disolucion dos vecesMa. El poKmero dializado se aislo mediante liofilizacion para proporcionar el producto en forma de un polvo blanco seco (0,80 g, 84%).
Se uso un procedimiento similar para producir los copolfmeros en bloque siguientes: K55(rac-L)5 (0,51 g, 62%), K55(rac-L)10 (0,70 g, 81 %), K55(rac-L)30 (0,77 g, 74 %), K55(rac-I)20 (0,78 g, 81 %), K55(rac-L/F)20 (0,74 g, 79 %), K55(rac-A)20 (0,82 g, 92 %), y Mrac-V)20 (0,82 g, 88 %).
Poli(etilen glicol)205-6-poli(rac-leucina)20, PEG204(rac-L)20. Antes del uso, se secaron 0,50 g de eter monometflico de poli(etilen glicol) terminado en w-amino, PEG205-NH2, (Mn = 9.000 g/mol, PDI = 1,08) disolviendolo en benceno seco seguido de eliminacion del disolvente mediante destilacion para producir un solido seco. En una caja seca, se disolvio PEG205-NH2 (0,50 g, 5,6 * 10-5 moles) en 4,0 mL de DMF seca. A continuacion, se disolvio L-Leucina NCA (83 mg, 0,53 mmol) y D-Leucina NCA (83 mg, 0,53 mmol) en DMF seca (2,5 mL) y despues se anadio a la mezcla de polimerizacion. La disolucion se agito durante tres dfas a temperatura ambiente hasta que polimerizo completamente. Despues se extrajo de la caja seca y se anadieron 5 mL de agua Millipore, y despues se transfirio a una membrana de dialisis (membrana de MWCO 2.000) y se dializo con agua Millipore (tres dfas), cambiando cada disolucion dos veces/dfa. El polfmero dializado se aislo mediante liofilizacion para proporcionar el producto en forma de un polvo blanco seco (0,51 g, 82%). 1H-RMN
Poli(L-glutamato-Na)64-£>-poli(rac-leucina)20, E64(rac-L)20. En la caja seca, se coloco Y-bencil-L-glutamato, Bzl-Glu NCA (5,00 g, 19 mmol) en un matraz de fondo plano de 250 mL con una barra de agitacion. Se anadio THF seco (100 mL) y despues se sello con un tapon de plastico. Despues se anadio una alfcuota de (PMe3)4Co (11,5 mL de una disolucion de 40 mg/mL en THF seco, 1,27 mmol) por medio de una jeringa, y el matraz se sello y se agito durante 1 hora. Se extrajo una alfcuota (50 pL) de la polimerizacion para el analisis mediante GPC (Mn = 13,9 * 103 g/mol, Mw/Mn = 1,27). A continuacion, se anadio una alfcuota de D,L leucina (L) NCA (18,7 mL de una disolucion de 50 mg/mL en THF, 6,0 mmol) y se dejo polimerizar durante la noche. A continuacion, el THF se elimino a presion reducida y despues se disolvio en CH2Cl2 seco (100 mL). Para eliminar los grupos protectores bencilo, se anadio yodotrimetilsilano por medio de una jeringa (10,8 mL, 76 mmol). Se unio un condensador de reflujo al matraz y se sometio a reflujo durante la noche a 40 °C. A continuacion, el disolvente se elimino a presion reducida y se anadio NaOH 1 M y se agito durante la noche, despues se filtro para eliminar el precipitado y se dializo (membrana de MWCO 6-8.000) con bisulfato sodico 5 mM y NaOH 0,1 M (tres dfas), despues agua Millipore (cuatro dfas), cambiando cada disolucion dos vecesMa. La disolucion clara se liofilizo despues para proporcionar un solido blanco esponjoso (1,26 g, 36 %).
Poli(L-homoarginina HCl)55-^-poli(rac-Leucina)20, RH55(rac-L)20. A un matraz de fondo redondo de 500 mL que contema una barra de agitacion se le anadio K55(rac-L)20 (1,00 g, 0,09 mmol) y despues se disperso en NaOH 1 M (137 mL). A continuacion, se anadio nitrato de 3,5-dimetil-1-pirazol formamidinio (3,93 g, 19,6 mmol). El pH se ajusto a pH = 10 mediante el uso de HCl y despues se coloco en un bano de aceite a 40 °C y se agito durante 48 horas. Para detener la reaccion, la disolucion se acidifico con HCl 0,1 M a un pH = 3, despues se coloco en una bolsa de dialisis (MWCO 2.000) y se dializo con agua Millipore (cinco dfas), cambiando cada disolucion dos vecesMa. El polfmero dializado se aislo mediante liofilizacion para proporcionar el producto en forma de un polvo blanco (0,95 g, 78%).
Poli(L-LisinaHCl)80-co-poli(L-Lisina)s0, Ks0(rac-L)20. A un tubo de centnfuga de polipropileno de 50 mL que contema una barra de agitacion se le anadio Poli(L-Lisina-HCl)s0, Ks0 (75 mg, 5,7 pmol) y despues se disolvio en tampon de acido 2-(W-morfolino)etanosulfonico (MES) 50 mM (15 mL). A continuacion, se anadio tetrahidrofurano (THF) (14,3 mL). A esta disolucion, se le anadio N-hidroxi succinimida (530 pL de una disolucion de 10 mg/mL en THF/agua, 46 pmol), acido octanoico (660 pL de una disolucion de 10 mg/mL en THF, 46 pmol), y 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (2,6 mL de una disolucion de 50 mg/mL en THF/agua, 0,68 mmol). La disolucion se dejo con agitacion
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durante la noche. Al dfa siguiente, la disolucion se coloco en una bolsa de dialisis (MWCO 2.000) y se dializo con agua Millipore (tres dfas), HCl 0,01 M (dos dfas), NaOH 0,01 M (un dfa), HCl 0,01 M (un dfa), agua Millipore (dos dfas), cambiando cada disolucion dos vecesMa. El poKmero dializado se aislo mediante liofilizacion para proporcionar el producto en forma de un polvo blanco (68 mg, 85%).
Concentracion de agregacion cntica (CAC) por medio de fluorescencia de pireno. Se dispersaron disoluciones de polipeptido (2 mL) en agua en un intervalo de concentraciones (2,0 x 10-3 a 2,0 x 10-12 M). Se hizo una disolucion de reserva de pireno disolviendo pireno en acetona (6,0 x 10-2 M). A continuacion, se anadio una cantidad adecuada de la disolucion de reserva de pireno para proporcionar una concentracion final de 12 x 10-7 M en agua, y la acetona se evaporo. A cada disolucion de polipeptido se le anadieron 2,0 mL de la disolucion de reserva acuosa de pireno para proporcionar una concentracion final de 6,0 x 10-7 M. Despues, cada disolucion se dejo equilibrar durante la noche antes de las medidas. Para registrar los espectros de fluorescencia, se anadieron 3,0 mL de cada disolucion de polipeptido a una cubeta de poliestireno de 4,0 mL. Los espectros de excitacion se registraron en un intervalo de 300 - 360 nm a una longitud de onda de emision de 390 nm. Todos los espectros se realizaron con un tiempo de integracion de 1 seg/0,5 nm. Se represento la proporcion de las intensidades de dos picos I338/I333 como una funcion de la concentracion de polipeptido (M) para cada muestra. Las CACs se determinaron como la interseccion de los ajustes lineales extrapolados de la grafica.
Preparacion de emulsiones. En una formulacion tfpica, se anadieron 800 pL de una disolucion de polipeptido del 1 %p/v a un tubo de centnfuga esteril de 1,5 mL. A continuacion, se anadieron 200 pL de fase oleosa, en general polidimetilsiloxano (PDMS) con una viscosidad de 10 cSt (esterilizado mediante filtracion a traves de un filtro esteril de 0,2 pm), para proporcionar una fraccion de volumen final, 9 = 0,2. La disolucion se emulsiono durante un minuto mediante el uso de un homogeneizador ultrasonico manual (Cole-Parmer serie 4710 modelo ASI con una salida del 35-40%) para formar gotfculas de escala nanometrica (diametro de ~400-500 nm basado en las medidas de dispersion de luz dinamica DLS).
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Claims (14)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion de agente antimicrobiano que comprende:
    al menos una especie de copolipeptido sintetico de al menos cuarenta residuos de aminoacidos que comprende: al menos un segmento hidrofilo que contiene al menos cinco residuos de aminoacidos cationicos contiguos; y al menos un segmento hidrofobo que contiene al menos cinco residuos de aminoacidos hidrofobos contiguos; en el que el segmento hidrofilo contiene un numero mayor de residuos de aminoacidos que el segmento hidrofobo; y agua;
    en la que la composicion de dicho copolipeptido en medio acuoso forma estructuras; y en la que la composicion inhibe o destruye microbios.
  2. 2. La composicion como se describio en la reivindicacion 1, en la que el copolipeptido sintetico comprende sustancialmente solamente aminoacidos naturales, y/o en la que la proporcion del numero de aminoacidos del segmento hidrofilo respecto del numero de aminoacidos del segmento hidrofobo es al menos de 1,8 a 1.
  3. 3. La composicion como se describio en la reivindicacion 1, en la que las estructuras formadas en medio acuoso se seleccionan del grupo que consiste en multfmeros en disolucion, micelas, laminas, vesfculas, y fibrillas.
  4. 4. La composicion como se describio en la reivindicacion 1, en la que el copolipeptido se caracteriza por la capacidad de formar mezclas en agua sin un precipitado visible a temperatura ambiente a concentraciones de hasta 10 o 100 veces por encima de la concentracion de agregacion cntica (CAC), en particular a concentraciones de al menos 1000 pg/mL.
  5. 5. La composicion como se describio en la reivindicacion 1, en la que el copolipeptido tiene una concentracion de agregacion cntica (CAC) en agua que es al menos 1 unidad logantmica inferior a la de un copolipeptido de secuencia aleatoria de la misma composicion de aminoacidos.
  6. 6. La composicion como se describio en la reivindicacion 1, caracterizada porque destruye o inhibe microbios in vitro a una concentracion inferior que la que destruye celulas de mairnfero in vitro o en o sobre tejidos de mamffero in vivo a concentraciones que muestran una toxicidad baja para esos tejidos.
  7. 7. La composicion como se describio en la reivindicacion 1, caracterizada porque destruye o inhibe microbios in vitro tal como se mide por mas de 3 unidades logantmicas de destruccion de Staphylococcus epidermidis y Escherichia coli en ensayos de destruccion estandar de 60 minutos a concentraciones de copolipeptido de 100 pg/mL o menos.
  8. 8. La composicion como se describio en la reivindicacion 1, caracterizada porque el copolipeptido forma mezclas en agua sin un precipitado visible a temperatura ambiente a concentraciones al menos 10 veces por encima de la concentracion necesaria para inhibir o destruir microbios in vitro, tal como se mide por mas de 3 unidades logantmicas de destruccion de Staphylococcus epidermidis y Escherichia coli en ensayos de destruccion estandar de 60 minutos.
  9. 9. La composicion como se describio en la reivindicacion 1, que tiene un modulo de almacenamiento de al menos 50 Pa a una concentracion del copolipeptido de menos de 40 mg/mL.
  10. 10. La composicion como se describio en la reivindicacion 1, en la que la composicion estimula la agregacion plaquetaria o inhibe la fibrinolisis.
  11. 11. La composicion como se describio en la reivindicacion 1, que comprende ademas una combinacion de fases inmiscibles en una mezcla o emulsion dispersada.
  12. 12. La composicion como se describio en la reivindicacion 1, formulada como una disolucion, un gel, una crema, una espuma, o un aposito.
  13. 13. La composicion como se describio en la reivindicacion 1, que comprende ademas un ingrediente farmaceutico activo (IFA) anadido seleccionado de esteroides, agentes proinflamatorios, agentes antiinflamatorios, agentes antiacne, conservantes, agentes hemostaticos, agentes angiogenicos, agentes de cicatrizacion de heridas, agentes antineoplasicos y otros agentes antimicrobianos.
  14. 14. El uso de una cantidad eficaz de la composicion como se describio en la reivindicacion 1 para la fabricacion de un medicamento para la prevencion o el tratamiento de infecciones, para la anti-infeccion topica, para la descolonizacion microbiana, para el tratamiento de heridas, para el tratamiento de sitios quirurgicos, para el tratamiento de traumatismos, para el tratamiento de quemaduras, para el tratamiento de ulceras en el pie diabetico, para el tratamiento ocular, para las infecciones vaginales, o para las infecciones del tracto urinario.
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    Fig. 1
    Bloques de construction
    cationico v7v\7< ssisii'..
    VW' Libres < U }— £ VH^>, Micelas
    anionico vwi ITUWV^
    '\AAAr ..^SSSSf Laminas
    \J\J\J
    hidrofobo ,v /**""! desordenado ...." SS*
    w Fibrillas Hidrogeles
    ordenado
    ~i xiilliiimii
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