CN103260635A - 具有高抗微生物活性和低毒性的材料的组合物和用途 - Google Patents

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Abstract

改进的合成共聚肽抗微生物剂含有阳离子氨基酸残基并且可以基于嵌段序列。这些抗微生物剂展示出低的哺乳动物毒性并且可以经受定向自组装。本发明的合成共聚肽在治疗伤口和其他感染中有用。

Description

具有高抗微生物活性和低毒性的材料的组合物和用途
先前申请的交叉引用
本申请要求于2010年8月23日提交的美国临时专利申请序列号61/376,195的权益和优先权，该临时申请以可适用法律所许可的程度通过引用并入本文。 
美国政府支持
不适用。 
发明背景
发明领域
本发明涉及能够杀死(或抑制)微生物、并且具有低哺乳动物毒性的物质的组合物。本发明还涉及某些组合物以及它们在各种背景包括但不限于防腐剂、杀菌剂以及预防和治疗伤口感染以及其他传染病中的用途。 
相关技术讨论
阳离子抗微生物剂已经证实效用；毒性是一个问题。半个多世纪以来，阳离子(带正电的)抗微生物剂已经被用于各种医疗和非医疗背景(范围从系统性抗生素到工业清洁剂)中。阳离子抗微生物剂优选结合细菌膜，这些细菌膜与哺乳动物膜相比通常展现出更多负电荷。这种相互作用可以破坏膜功能并且可能地导致细菌细胞死亡。阳离子抗微生物化合物包括某些抗生素类(例如，多粘菌素)、二双胍类(例如，氯己定)、聚合双胍类(例如，聚六亚甲基双胍)和季铵化合物(QAC)(例如，氯化苄烷铵)，以及天然抗微生物肽(AMP)(例如，防卫素)。虽然各个类别的阳离子抗微生物化合物已经在一种或多种背景中证实抗微生物活性，但毒性是一直的问题[1-12]。 
由多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)产生的多粘菌素是具有疏水尾的环肽[6，7]。该环肽部分(大约10个氨基酸残基；带正电)与在革兰氏阴性细菌的外膜上发现的带负电的脂多糖(LPS)进行强烈的相互作用。该疏水尾被认为与细菌膜进行相互作用并且在一些情况下将其破坏。多粘菌素对许多革兰氏阴性菌，包括绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa；P.aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli；E.coli)以及肠杆菌种具有抗微生物活性，但对变形杆菌属(Proteus)、大多数沙雷氏菌属(Serratia)或革兰氏阳性菌具有有限的活性[7]。显著的神经毒性和肾毒性导致了它们作为系统性抗生素的有限用途[13]。现今，多粘菌素有时被用作用于高度抗生素抗性的革兰氏阴性感染如由多药抗性绿脓杆菌引起的那些感染的最后手段。它们还被用作用于皮肤的小割伤和擦伤的局部抗微生物剂。 
氯己定在术前外科手术背景中被广泛用作一般皮肤清洁、术前洗澡以及外科手术部位准备的杀菌清洁剂[7]。氯己定对大范围的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌具有活性，但据报道一些革兰氏阴性菌(例如，绿脓杆菌，普罗威登斯菌(Providentia)物种)对其具有抗性[5，10]。含有2％至4％的氯己定的制品作为抗微生物剂似乎是最有效的，但会引起皮肤刺激。总的来说，氯己定在被施用于完好的皮肤上时是相对安全的，因为极小量的化合物被吸收。然而，由于刺激和毒性，氯己定禁用于眼、耳、脑组织以及脑膜附近[2]。低浓度(例如，0.05％至0.12％)有时用作伤口清洗和漱口。活性是pH依赖的，因为低pH环境减少活性。此外，氯己定与阴离子化合物(例如，硬水、肥皂、藻酸盐)不相容，并且在有机材料(例如，血液)的存在下显示出减少的活性。 
聚六亚甲基双胍(PHMB)已经在各种用户应用中使用了40多年。PHMB被用于游泳池消毒剂、增塑PVC的防腐剂、以及通用的环境杀生物剂中[1]。PHMB的早期生产产生了分子量范围从500至6,000g/mol的高度多分散性低聚物。有限的化学表征大大阻碍了PHMB在药物产品中的及早使用。最近的PHMB制品已经能够解决多分散性。类似于氯己定，PHMB禁用于眼、耳、脑组织、脑膜以及关节[4]。 
季铵化合物(QAC)是两性表面活性剂，典型地含有直接连接至四个烷基上的一个氮原子，其在疏水结构上可以变化[1，2]。QAC主要是抑菌的，但在较高浓度下对某些生物可以是杀菌的。QAC是抗革兰氏阳性菌的抗微生物剂，但对革兰氏阴性菌(例如，绿脓杆菌)不太有效。由于对革兰氏阴性菌的弱活性， QAC一般不在卫生保健背景中用于手部杀菌。感染的多次爆发已经被追踪至由革兰氏阴性杆菌污染的QAC化合物[8]。QAC似乎对通过多药外排泵介导的抗性机制更加易感。在有机物质的存在下，活性也大大减少。 
天然抗微生物肽(AMP)经常是阳离子性的。天然抗微生物肽(AMP)(典型地少于50个氨基酸)广泛分布在从昆虫到哺乳动物的大多数物种中，并且被认为在先天免疫中起到关键的作用[14]。AMP已经展示了对细菌、病毒、真菌以及寄生虫的强有力的杀死/抑制作用[15]。AMP被认为在预防和控制感染中具有重要性。AMP大量沉积在如皮肤、呼吸道以及胃肠内层的界面处，并且在炎症部位由白细胞释放。白细胞使用AMP作为它们在吞噬溶酶体中的直接杀死机制的一部分。某些AMP有助于调节炎症和适应性免疫[15]。此外，AMP已经展示了针对精子和癌细胞的抑制活性。 
大多数AMP共有产生了物理性的、受体非依赖性杀死模式的结构特征[9]。AMP的一个被广泛接受的作用机制是导致细胞死亡的微生物膜破坏或扰动(有时随后形成孔隙)。典型地，AMP含有空间上隔离的带正电的和疏水的结构域—阳离子两亲物。AMP的实质性疏水含量(典型地，30％至60％摩尔分数)是抗微生物活性的重要特点，因为它“控制了肽可以分开进入脂双层的程度”[16]。形成α螺旋的AMP“通常作为延长的或非结构化的构象异构体存在于溶液中”并且“在与两亲的磷脂膜进行相互作用时”变成螺旋的[16]。这表明，“在细菌外表面和膜处的局部环境是重要的并且可以诱导抗微生物肽构象变化，这些构象变化对肽附接至膜上并且插入其中是必要的”[3]。 
已显示尼生素(Nisin，一种细菌衍生的AMP，已被用作食物防腐剂)对于油-水混合物是一种弱乳化剂，该过程是显著地pH和温度依赖性的[17]。 
若干天然AMP和相关技术已经获得了专利。Lehrer和Selsted公开了与分离自巨噬细胞的防卫素的那些类似的AMP序列(美国专利号4,543,252)。最初分离自某些蛙类的皮肤的马加宁(magainin)类的AMP已经由Zasloff予以描述(美国专利号4,810,777)。修饰的马加宁，特别是序列缺失或取代，也已经被描述(例如，美国专利号4,962,277；5,221,732；5912231；以及5,792,831)。Selsted和Cullor公开了作为广谱抗微生物化合物的牛indolicidin AMP(美国专利号5,324,716)。 
基于合成肽的阳离子低聚物可以作为抗微生物剂起作用。Salick和同事已经公开了一种序列特异性β发夹肽(20-mer)，它可以在充足的盐浓度的存在下形 成抗微生物水凝胶(美国公开专利申请号2011/0171304)。当该肽“被溶解在水中时，由于带正电的侧链之间的电荷排斥，它仍是未折叠并且可溶的”。盐的添加被认为是“屏蔽来自侧链的电荷并且使得该肽可以折叠”成β发夹，该β发夹可以“组装成具有β片层富集纤丝的网状物”。该肽由60％的疏水含量组成并且含有两个精氨酸残基，这些残基似乎对抗甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)的有效抗微生物活性是重要的。这些肽本身似乎不是固有抗微生物的，因为发明人已经报道“从凝胶扩散的肽不是活性剂”。当使金黄色葡萄球菌经受肽的100μM(大约230μg/ml)水溶液(即，不是水凝胶)时，“细菌增生受到最低程度的影响”。因此，为了抗微生物活性，细菌必须直接接触水凝胶表面；“折叠但不胶化的”肽不抑制细菌增生。对于其他紧密相关的β发夹肽报道了类似的发现[18]。 
Gellman和合作者已经公开了包含具有明确定义的二级结构的β氨基酸低聚物的抗微生物组合物(美国专利号6,060,585；6,683,154；美国公开专利申请号2007/0087404；2008/0166388)。这些β肽在肽主链中含有环结构，这些环结构限制了构象柔性。DeGrado和合作者也已经描述了多种抗细菌β肽，这些肽含有三-β-肽的低聚物(7-mer或更短)(美国专利号6,677,431)。 
可以模拟天然AMP的总体结构的其他基于合成肽的化合物已经得到描述。DeGrado报道了基于天然AMP马加宁和天蚕抗菌肽(cecropin)的结构特性的两亲序列无规β肽[19]。Gellman和合作者已经描述了一种无规序列、β肽低聚物，该低聚物具有的平均长度为21个残基、多分散性指数(Mn/Mw)为1.4、并且具有40％的疏水残基[20]。在其他研究中，Gellman鉴定了多种螺旋β肽[19]。发现沿着螺旋圆柱的60％的“疏水面”具有最佳抗微生物活性，而40％的面展现出低活性。 
由非天然结构单元构成的合成阳离子聚合物可以作为抗微生物剂起作用。已经描述了具有非天然结构单元或重复单元的若干类别的合成抗微生物聚合物；它们是Tew 2007年综述的主题[22]。这些聚合物由在自然界中未发现的结构/单体单元组成。这些非天然聚合物经常具有容易且有成本效益的合成以及对酶降解的稳定性的特点。然而，这些以及其他非天然聚合物的局限可能包括有限的抗微生物活性、以及缺乏生物相容性和生物可降解性。这种类别中的材料由非天然结构单元(例如，芳基酰胺、高度共轭的芳香族基团)构成，并且被认为处在本发明的范围以外[21-25]。(例如，参见美国专利号7,173,102；美国公开专 利申请号2008/0176807；2010/0105703)。 
Winter和合作者已经描述了抗微生物的类肽(N-取代的甘氨酸)[28]。针对广谱的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌测试了一系列短(3-单体)类肽，并且溶血活性(HC50)低于抗微生物活性(最小抑制浓度，MIC)。一种代表性三-类肽(tri-peptoid)在简单感染模型中在体内保护了感染金黄色葡萄球菌的小鼠。 
用于共聚肽的合成方法论(Deming法)。传统的合成方法论已经阻碍了利用多种特性的正交(或半正交)修饰的低聚肽文库的有效合成。待修饰的重要特性包括氨基酸序列、总体链长以及阳离子氨基酸与疏水氨基酸的比率。而且，低多分散性(PDI在1.0与1.4之间)共聚肽混合物的实用、有成本效益的合成也不是可容易地达到的[25]。 
对多种特性的控制以及产生低多分散性化合物的能力将允许多种结构-功能关系的优化。在合成多肽AMP研究中的一个主要挑战是固相合成中高昂的生产成本。此外，固相与溶液相合成方法的显著化学局限包括缺乏对链增长的控制。这引起链支化、多分散性以及低产物产率。 
1997年，Deming开发了使氨基酸衍生物聚合至低聚肽链中的明确定义的引发剂[25，26]。此方法论将氨基酸单体分批添加至增长的链中。这些引发剂是过渡金属络合物，这些络合物允许受控合成以产生高分子量、窄分布、多嵌段多肽制品。这些引发剂和合成方法很好地描述在文献以及若干专利中(美国专利号6,680,365；6,632,922；6,686,446；6,818,732；7,329,727；美国公开专利申请号2008/0125581)。 
典型地，这些合成多肽具有简单的二元组合物(例如，赖氨酸(K)、亮氨酸(L)共聚物)。两亲多肽含有与中性疏水氨基酸(例如，亮氨酸、丙氨酸(A))共聚的离子氨基酸单体(例如，赖氨酸、精氨酸(R)、谷氨酸(E))。通过改变单体添加的方法，可以实行共聚以沿着共聚物链获得嵌段的、无规的或两者的组合(即，无规序列的嵌段)的氨基酸残基序列。 
溶液中的无规合成共聚肽证实抗微生物活性。Deming实验室观察了一系列可溶于水的共聚肽的抗微生物活性，这些共聚肽含有不同比率的无规排列的阳离子氨基酸(赖氨酸(K))和疏水氨基酸(亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)或丙氨酸(A))[27]。共聚肽在悬浮生长测定中证实了对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)、绿脓杆菌(革兰氏阴性)以及大肠杆菌(革兰氏阴性)不同的抗微生物活性。赖氨酸-丙氨酸共聚肽展示了“对所研究的所 有3种细菌的广泛的毒性作用”并被总结为是“最有效的抗微生物共聚物组合”。赖氨酸-丙氨酸和赖氨酸-亮氨酸共聚肽的圆二色谱显示出“当在溶液中游离时明确的无规卷曲构象”。这项工作没有检查特意配制为胶束、或并入乳液/纳米乳液中的合成嵌段序列共聚肽或合成共聚肽的抗微生物活性(也参见[28，29])。 
最近，Chan-Park和同事使用Deming合成方法研究了含有2至3个不同的氨基酸的可溶的、无规序列共聚肽的抗微生物活性[26]。包括赖氨酸-苯丙氨酸或赖氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸的无规25-mer共聚肽证实了对五种微生物的最广泛的活性并且具有最低的MIC。调研了总肽长和疏水含量对抗微生物活性的作用。据报道，“与更短或更长的长度相比，当是25个残基长时，赖氨酸-苯丙氨酸共聚肽具有更广泛的抗细菌活性”。发现赖氨酸-苯丙氨酸化合物(以及其他无规共聚肽)的最佳疏水含量是约60％。然而，与其他天然和合成肽相比，优化的赖氨酸-苯丙氨酸和赖氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸化合物显示出高溶血活性。作者提出，化合物的“高疏水性(60％)或存在的更多疏水种类可能导致了对哺乳动物红细胞的高毒性”。此外，赖氨酸-丙氨酸和赖氨酸-亮氨酸无规共聚肽对真菌生物白色念珠菌(Canidia albicans)没有显示出显著的活性。圆二色性分析指示，赖氨酸-苯丙氨酸和赖氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸无规共聚肽显示“缺乏独特的二级结构”并且未形成α螺旋或β片层。 
合成共聚肽可以被配制以实现分级结构(hierarchical structure)。聚合电解质和疏水结构域两者的存在导致微相隔离的材料。生成的超结构可以包括多聚体(呈溶液形式)、胶束、乳液(与油一起)、片层、囊泡以及形成水凝胶的纤丝。自组装成不同分级结构的可以通过以下项来控制：不同的构成和链长；不同的浓度；L-、D-或外消旋氨基酸的存在以及侧链和链末端的修饰(例如，聚乙二醇(PEG))。疏水结构域的二级结构(即，无规卷曲对α螺旋)在超结构形成中起到重要的作用。疏水结构域或聚合物区段的性质决定了在链之间建立的分子间相互作用的类型。这些吸引相互作用通过与溶剂的相互作用而平衡。对于每个分子以及对于超分子的每个区段，在自缔合的自由能与水合的自由能之间存在一个平衡。 
合成共聚肽也可设计成形成水凝胶。某些表征，如长-亲水嵌段(阳离子的或阴离子的)和有序的疏水嵌段(例如，α螺旋的)已显示有助于水凝胶的形成。研究表明，若干基于合成共聚肽的水凝胶(包括K180L20(以及其他KxLy)嵌段共聚肽)在体内是生物可相容的。Deming等人先前报道称，嵌段共聚肽水凝胶 可以在小鼠中枢神经系统(CNS)中充当组织支架[27]。将水凝胶注入小鼠前脑中并且在体内产生3D凝胶沉积物。毒性、炎症以及神经胶质增生是极少的并且类似于盐水对照物。8周后，在许多情况下，共聚肽沉积物被血管化，而细胞密度类似于邻近组织，这表明水凝胶支持细胞迁移和增殖。 
Deming(PCT公开WO 2009/025802)公开了通过合成嵌段共聚肽稳定的纳米乳液和双纳米乳液[27]。乳化的共聚肽的抗微生物活性在其中没有公开。 
未用共聚肽制备的纳米乳液可以展现出一些抗微生物活性。Baker和合作者已经聚焦在纳米乳液作为抗微生物剂的用途上。他们报道了通过基于磷酸盐的或其他小分子表面活性剂稳定的抗微生物乳液(美国专利号6,015,832；6,506,803；6,559,189；6,635,676；5,618,840；5,547,677；以及5,549,901)。 
阳离子两亲物的抗微生物活性和/或哺乳动物细胞毒性与它们形成更高级结构的组装之间的潜在关系没有得到很好的理解。已经报道了有限的相关信息。例如，相对于溶液中的游离EPL，ε-聚-赖氨酸(EPL)的抗微生物活性通过配位至脂质以及乳化而被稍微减少[33]。 
发明概述
本发明描述了具有高抗微生物活性(在体外或体内)和低哺乳动物毒性的合成共聚肽的物质组合物以及用途。特别地，阳离子(带正电的)抗微生物剂已经在各种医疗和非医疗背景(范围从系统性抗生素到工业清洁剂)中使用了五十多年。尽管具有实质性功效，但由于大量毒性它们在许多医疗背景中的使用受到限制。本发明克服了阳离子抗微生物剂的固有毒性的局限。简单来说，通过控制阳离子元素和疏水元素之间的关系，我们设计具有高抗微生物活性和低哺乳动物毒性的材料，通常利用独特的分级结构。本发明包括将亲水和/或疏水氨基酸残基沿着共聚肽链分组为嵌段序列以获得嵌段两亲性。这不同于表征许多天然AMP以及无规序列和交替序列和特定序列合成共聚肽和肽的面型两亲性(facial amphiphilicity)。出于本发明的目的，嵌段(blocky)或嵌段序列(block-sequence)共聚肽被表征为由一个或多个不同的结构域组成的共聚肽，每个结构域含有一个单一氨基酸(例如，赖氨酸或亮氨酸)或氨基酸类型(阳离子的或疏水的)的至少5个残基的连续重复。相比之下，无规共聚肽被表征为由序列内两个或更多个不同的氨基酸残基(或氨基酸类型)的无序、统计分 布组成的共聚肽。 
本发明的合成共聚肽拥有一种或多种以下的分子特征，这些分子特征使它们相区别于先前描述的天然和合成抗微生物剂。第一，相对高的总体链长(每条链40至250或更多个氨基酸残基)；第二，亲水(典型地，阳离子的)结构域的多聚体展现；第三，相对低的疏水残基含量(典型地，40％摩尔分数或更少)；以及第四，通过疏水结构域的相互作用(通常是基于嵌段序列)的自缔合/自组装。通过解释的方式，而非限制本发明的范围，据信高抗微生物活性是由长亲水(阳离子的)区段、多聚体亲水(阳离子的)区段或两者的展现而引起的，这些区段与微生物表面处的阴离子(负)电荷进行非常有效的相互作用。另外，通过解释的方式而非限制本发明的范围，据信相对低的疏水物含量、疏水结构域的自缔合性质(通常基于嵌段序列)或两者起到限制组织暴露于高疏水或高两亲材料浓度的作用，从而降低哺乳动物毒性。在某些情况下，这种受限的疏水物或两亲暴露可以允许在体内施用更大量的抗微生物材料，而具有随时间的持久、缓释效应以及更大的抗微生物活性(以及更少的哺乳动物毒性)的潜能。 
不限制本发明的范围，应认识到获得高抗微生物活性(在体外或体内)以及低毒性可能取决于一种或多种因素，这些因素包括以下各项：单体选择(例如，特定阳离子和疏水物)；单体的空间分布(例如，嵌段对无规序列)；疏水单体的摩尔分数；单体的光学纯度；有序的对无序的疏水结构域(例如，α螺旋对无规卷曲)；单体/残基的化学修饰；杂化组合物(例如，共聚肽-聚合物共轭物)。 
这些合成共聚肽可被设计成部分地通过不良溶剂化的疏水区的相互作用而自缔合/自组装，其通过充分溶解的亲水(典型地，阳离子的)结构域而稳定。具体实例包括涉及多聚体(呈溶液形式)、胶束、片层、囊泡和形成水凝胶的纤丝、以及与油混合时的乳液的制剂。例如，我们已经开发出抗微生物洗液、抗微生物水凝胶以及抗微生物乳液。所有这些制剂可以应用于伤口、其他组织或其他各种表面。本发明的定向分子自组装确定了化学和生物特征，包括分级结构。这不同于各种无规序列合成共聚肽的自缔合，该自缔合是基于亲水和疏水残基的不均匀分布并且典型地产生不规则且定义不明确的材料。 
优选的实施例还可以考虑可以影响在人或动物疾病中的总体功效和毒性的某些品质，包括但不限于预防和治疗伤口感染或其他传染病。这些特征包括但不限于：流动性(使便于应用)、组织覆盖、抗微生物类生物活性的持续时间、生物相容性、降解、生物分布、以及对炎症应答、组织修复、血管生成、止血、 免疫原性及其他的影响。在某些医疗背景(例如，外科手术或创伤伤口)中，功效和毒性可能实质上取决于合成共聚肽与组织的相互作用。某些优点可能源于容易地沉淀至受损组织上和/或结合至受损组织的合成共聚肽，在受损组织处这些共聚肽可以提供局部、集中的抗微生物活性。在人或动物疾病中的总体功效和安全性将取决于具体的疾病以及患者的一般情况。预计，体内生物活性将实质上取决于制品和分级结构，并且通过体外测试可能不可以完全展现体内活性，。 
附图说明
图1是一个图表，示出了可以用于构建共聚肽的不同分子结构单元； 
图2是在d-TFA中的K55(rac-L)20嵌段共聚肽的1H-NMR； 
图3是一个图表，示出了选择的抗微生物嵌段共聚肽的结构：A)Kx(rac-L)y；B)无规K55(rac-L)20；C)K55(rac-A)20；D)K55(rac-V)20；E)K55(rac-V)20；F)K55(rac-L/F)20；G)RH 55(rac-L)20；H)E64(rac-L)20；I)PEG205(rac-L)20；以及J)K60L20； 
图4示出了K55(rac-L)20嵌段共聚肽对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌以及绿脓杆菌的抗微生物活性；在铺板(plating)以生长之前，将K55(rac-L)20与细菌孵育30分钟； 
图5示出了具有不同含量的疏水氨基酸残基的共聚肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗微生物活性； 
图6示出了共聚肽在100μg/mL的浓度下对白色念珠菌的抗微生物活性； 
图7示出了K55(rac-L)20嵌段共聚肽对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes(P.acnes))的抗微生物活性；在铺板以生长之前，将K55(rac-L)20与细菌孵育30分钟； 
图8示出了具有不同大小的嵌段疏水结构域的共聚肽在10μg/mL的肽浓度下对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗微生物活性； 
图9示出了具有不同大小的疏水结构域的共聚肽在10μg/mL的肽浓度下对痤疮丙酸杆菌的抗微生物活性； 
图10示出了用嵌段或无规空间分布的单体配制的共聚肽在10μg/mL的肽浓度下对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗微生物活性； 
图11示出了K55(rac-L)20在啮齿动物模型中的抗微生物活性；将用PBS或 K55(rac-L)20预浸泡的聚丙烯丝网以及另外的共聚肽皮下插入到大鼠中，并且添加106金黄色葡萄球菌6538或绿脓杆菌(临床猪分离株)接种物；两天之后，对植入的丝网进行铺板以用于细菌计数； 
图12示出了K55(rac-L)20在啮齿动物模型中的抗微生物活性；将用PBS或K55(rac-L)20预浸泡的聚丙烯丝网以及另外的共聚肽皮下插入到大鼠中，并且添加106金黄色葡萄球菌6538或绿脓杆菌(临床猪分离株)接种物；在不同的时间点，对植入的丝网进行铺板以用于细菌计数； 
图13示出了K55(rac-L)20在啮齿动物模型中的抗微生物活性；将用PBS或2mg/ml K55(rac-L)20预浸泡的聚丙烯丝网以及另外的共聚肽皮下插入到大鼠中，并且添加106金黄色葡萄球菌6538或绿脓杆菌(临床猪分离株)接种物；两天之后，对周围组织铺板以用于细菌计数。 
图14示出了测定啮齿动物模型中的炎症的结果；将用K55(rac-L)20共聚肽预浸泡的聚丙烯丝网以及另外的共聚肽皮下插入到大鼠中，并且添加106金黄色葡萄球菌6538接种物；48小时之后，通过组织学分析组织炎症：0＝正常，1＝轻度，2＝中度，3＝重度； 
图15示出了K55(rac-L)20在猪模型中的抗微生物活性；将K55(rac-L)20(10mg/mL)施用于伤口，并且四小时之后，抽吸残留的材料并且向伤口添加107金黄色葡萄球菌6538；48小时之后，评估细菌计数； 
图16示出了测定猪模型中的炎症的结果；将K55(rac-L)20(10mg/mL)应用于伤口，并且30分钟之后，向伤口添加104或107金黄色葡萄球菌或绿脓杆菌；48小时之后，通过组织学分析组织炎症(包括细胞浸润和坏死)； 
图17示出了猪模型中的伤口愈合，其中伤口用500μg/mL的K55(rac-L)20来治疗并且监测整21天的时间段； 
图18示出了被配制为溶液或乳液的K55(rac-L)20嵌段共聚肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗微生物活性； 
图19示出了具有不同大小的疏水结构域、被配制为溶液或乳液的共聚肽在10μg/mL的肽浓度下对金黄色葡萄球菌的抗微生物活性； 
图20示出了被配制为乳液的K55(rac-L)20共聚肽对金黄色葡萄球菌的体内抗微生物活性；将用共聚肽预浸泡的聚丙烯丝网以及另外的共聚肽皮下插入到大鼠中，并且添加106金黄色葡萄球菌6538的接种物；两天之后，对植入的丝网进行铺板以用于细菌计数； 
图21示出了测定啮齿动物模型中的炎症的结果；将K55(rac-L)20共聚肽配制为乳液，并将用共聚肽预浸泡的聚丙烯丝网以及另外的共聚肽皮下插入到大鼠中；添加106金黄色葡萄球菌6538的接种物；并且在48小时之后，通过组织学分析组织炎症：0＝正常，1＝轻度，2＝中度，3＝重度； 
图22示出了猪模型中的伤口愈合，其中伤口用配制为乳液的500μg/mL的K55(rac-L)20来治疗并且监测整21天的时间段； 
图23示出了K180L20嵌段共聚肽的抗微生物活性。在铺板以生长之前，将K180L20与细菌孵育30分钟； 
图24示出了K180L20在啮齿动物模型中的抗微生物活性；将用PBS或K180L20预浸泡的聚丙烯丝网以及另外的共聚肽皮下插入到大鼠中；添加106金黄色葡萄球菌6538或绿脓杆菌(临床猪分离株)接种物；48小时之后，对植入的丝网和周围组织进行铺板以用于细菌计数； 
图25示出了测定啮齿动物模型中的炎症的结果；将用PBS或K180L20共聚肽预浸泡的聚丙烯丝网以及另外的共聚肽皮下插入到大鼠中，并且添加106金黄色葡萄球菌6538接种物；48小时之后，通过组织学分析周围组织炎症(包括细胞浸润和坏死)； 
图26示出了K180L20在猪模型中的抗微生物活性；将K180L20(40mg/mL)应用于伤口，并且在4小时之后，向伤口添加107金黄色葡萄球菌6538；48小时之后，评估最终细菌计数。 
图27示出了共聚肽在10μg/mL的共聚肽浓度下对全血的凝血时间的作用； 
图28示出了用于测量共聚肽在10μg/mL的共聚肽浓度下对凝血的影响的血栓弹性描记法(TEG)测定的结果；R时间是将血液放置在TEG仪器中与粘度初始增加(从0-2mm的轨迹增加所测量的)之间的等待时间；R时间对应于交联加速(ramp-up)之前凝结因子的酶活性；K时间对应于从2增加至20mm的幅度；α角是在R和K时间之间的TEG轨迹的斜率；α角衡量凝块发展的速度，并且最大幅度(MA)是最高轨迹并提供了凝块强度的绝对度量； 
图29示出了共聚肽浓度为100μg/mL的共聚肽对富血小板血浆中血小板聚集的影响； 
图30示出了共聚肽对血小板聚集的影响； 
图31示出了一种纤维蛋白凝胶板测定，该测定用于测量RH 55(rac-L)20共聚肽在100、1000μg/ml以及与1mg/ml白蛋白一起的1000μg/ml的浓度下对纤维蛋 白溶解的作用； 
图32示出了来自猪静脉出血的图像，这些图像描绘出在5分钟时的15mm的伤口，这些伤口充满含有共聚肽的基于PEG的凝胶；并且 
图33是多肽合成数据表(表1)，其中a＝Mn并且PDI是使用第一区段(聚(Nε-CBZ-L-赖氨酸))的凝胶渗透色谱法(GPC)来确定的；组合物使用以下来计算：b＝GPC和1H-NMR或c＝在d-TFA中的1H-NMR。d＝通过K55(rac-L)20的胍基化合成的； 
图34是在100μg/mL的共聚肽浓度下，对于大肠杆菌11229和大肠杆菌O157:H7的99.99％生长抑制的最小接触时间(分钟)的表(表2)； 
图35是示出了共聚肽对不同微生物(包括食物相关微生物)的最小抑制浓度(MIC)的表(表3)； 
图36是示出了共聚肽在1mg/ml的浓度下在30秒的接触时间之后对流感A(包膜病毒)的log减少的表(表4)； 
图37是示出了配制为乳液的共聚肽对枯草芽孢杆菌内孢子的最小抑制浓度(MIC)的表(表5)； 
图38是示出了配制为溶液或乳液的共聚肽在100μg/mL的浓度下在人角质化细胞中的体外细胞毒性的表(表6)；并且 
图39是示出了浓度为10μg/mL的共聚肽的血栓弹性描记法(TEG)参数的表(表7)；*值与未治疗的对照显著不同(p＜0.05)。 
发明详细说明
提供以下说明以使本领域技术人员能够做出并使用本发明，并且以下说明提出了发明人考虑到的、实现其发明的最佳模式。然而，各种修改对本领域技术人员来说仍将是容易明白的，因为在此已经将本发明的一般性原则确切定义以提供具有高抗微生物活性和低毒性的合成共聚肽。 
本发明的抗微生物共聚肽组合物可以含有安排在嵌段中的一种或多种阳离子氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、高精氨酸、鸟氨酸)和一种或多种疏水氨基酸(例如，亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸)(图1-3、图33(表1))。聚阳离子的两亲多肽(例如，含有在中性pH下质子化的胺基、全烷基化的铵、或胍鎓)展现出高抗微生物活性。例如，如图4中所描绘，我们已经证明，由具有55个赖氨酸的嵌段、后跟随具有20个D和L(外消旋)亮氨酸的嵌段所组成的合成共聚肽(K55(rac-L)20)对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)、 表皮葡萄球菌(革兰氏阳性)、大肠杆菌(革兰氏阴性)以及绿脓杆菌(革兰氏阴性)具有实质性抗微生物活性。我们还已经证明了对若干其他细菌和真菌生物的活性(参见下文)。多种其他合成共聚肽已经被合成(图33(表1))并且显示出实质性抗微生物活性。相比之下，在中性pH(约7)下，聚阴离子多肽(例如，E64(rac-L)20)展现出低抗微生物活性。 
如在图5中所描绘，基于阳离子氨基酸赖氨酸和其他疏水氨基酸的二嵌段合成共聚肽证实强的抗微生物活性。在其他研究中，我们证明，赖氨酸残基的部分胍基化产生了高抗微生物活性，例如对于X＝K/RH(高-精氨酸)，X55(rac-L)20获得了高抗微生物活性。改变疏水氨基酸构成而同时保持所有其他特性不变，也维持了高体外抗微生物活性(图5)。确切的说，对于X＝丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、亮氨酸/苯丙氨酸(L/F)、或缬氨酸(V)，在非常低的浓度下(10μg/ml)，聚(L-赖氨酸-HCl)55-嵌段-聚(外消旋-疏水氨基酸)20，K55(rac-X)20，对革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性(大肠杆菌)细菌均达到了细菌计数的最大可观察到的(6-log)减少。选择的共聚肽还显示针对其他微生物，包括大肠杆菌O157:H7、以及其他食源性病原体、以及甚至微生物的某些内孢子形式是相当有效的(图34和35(表2和3))。这些化合物还显示对某些真菌生物有效，如在图6中针对白色念珠菌所描绘的。如在图7中所描绘，与其他微生物(例如，金黄色葡萄球菌)相比，某些微生物类生物(例如，痤疮丙酸杆菌)可能对某些共聚肽不太敏感。溶液相共聚肽还证实对H1N1流感病毒的抗病毒活性(图36(表4))。在这个实验中，注意到RH/K(部分胍基化的赖氨酸)二嵌段共聚肽特别具有活性。 
在这些嵌段共聚肽中，我们还证明了当改变疏水嵌段的长度时的高抗微生物活性(图8和9)。出乎意料的是，我们证明了若干系列的合成嵌段共聚肽，包括具有低于40％的疏水物含量的嵌段共聚肽中的高抗微生物活性。当与具有55个阳离子赖氨酸氨基酸一起构建时，即使是具有包含少至5或10个疏水亮氨酸氨基酸的嵌段的分子也展示出良好的抗微生物活性。 
在单独的研究中，我们证实，具有长亲水嵌段(即，比K90长)的嵌段共聚肽作为抗微生物剂是有效的(图10)。此外，我们证实，长度更长(大于100个氨基酸残基)的无规合成共聚肽是非常有效的抗微生物剂。具有不同疏水物含量的化合物也是如此。 
在单独的体外研究中，我们证实，呈溶液形式的嵌段序列共聚肽的细胞毒性 低于具有类似构成的无规序列共聚肽。例如，我们发现，呈溶液形式的嵌段序列K55L20在47.4ug/ml下将小鼠角质化细胞的细胞活力降低了50％(EC50)，而以溶液形式的呈无规序列的具有类似构成的合成共聚肽具有的EC50为21.0ug/ml。类似地，发现呈溶液形式的嵌段序列K55(rac-L)20的细胞毒性不如呈溶液形式的无规序列K55(rac-L)20。如以下所述，发现多种合成共聚肽在呈乳液制品时是抗微生物的。在这些制品中，也发现嵌段序列合成共聚肽的细胞毒性低于(更低的EC50)无规序列共聚肽，即使该嵌段序列共聚肽稳定的乳液通常证实相等的(并且有时更高的)抗微生物活性。 
一种溶液相嵌段序列合成共聚肽K55(rac-L)20也显示在预防伤口感染的啮齿动物模型中有效(图11至13)。我们已经证明了在抗金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的感染预防模型中细菌群的减少。观察到一致的、浓度依赖性减少—典型地，在20μg/ml的共聚肽(K55(rac-L)20)下的1-3log减少，以及在2mg/ml处的完全(或近似完全)减少。这些研究指示，共聚肽制品在暴露于复杂的生物流体时仍然具有活性。特别地，共聚肽可以被配制为水性悬浮液或与油和水混合并且自组装为纳米乳液；某些抗微生物共聚肽是有效的表面活性剂(对于乳液参见下文)。 
重要的是，呈溶液形式的嵌段序列合成共聚肽K55(rac-L)20似乎不刺激开放性伤口。如图14中所描绘，组织病理学证据表明炎症是处于对照治疗的水平或其以下。 
还发现溶液相抗微生物共聚肽在猪感染预防模型中是高度有效的。如图15中所描绘，在接种黄色葡萄球菌之前应用于开放性伤口的K55(rac-L)20溶液完全阻止了微生物感染。在单独的研究中，其中疏水嵌段是外消旋聚-D/L-亮氨酸的共聚肽K55(rac-L)20在动物模型中显现出优异的组织生物相容性。例如，在为期2天的猪开放性伤口的研究中(图16)，组织学分析(由一位兽医病理学家进行)显示，K55(rac-L)20治疗的动物相对于对照物，“浆细胞渗出物和中性粒细胞炎症分别是稍微和最低限度较不严重的”。在单核炎症、水肿或出血中没有观察到差异。在为期21天的猪伤口愈合研究(未感染)中，一位兽医病理学家发现K55(rac-L)20治疗的以及对照物治疗的伤口在炎症、坏死以及上皮覆盖方面是类似的(图17)。 
基于合成共聚肽的抗微生物乳液。这些合成共聚肽可以被设计成可稳定乳液(和/或在乳液上展现)的有效表面活性剂。我们已经证明，多种合成共聚肽- 乳液制品是有效的体外抗细菌剂(图18和19)。特别地，发现这些抗微生物乳液对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)内孢子具有活性(图37(表5))。如以上针对溶液相共聚肽所述，乳液制品展示出对H1N1流感病毒的抗病毒活性(图36(表4))以及对非包膜噬菌体的抗病毒活性。 
还发现基于合成共聚肽的抗微生物乳液在啮齿动物感染预防模型中有效(图20)。我们已经证明了在抗金黄色葡萄球菌的感染预防模型中细菌群的减少。观察到一致的、浓度依赖性减少—典型地，在20μg/ml的基于共聚肽(K55(rac-L)20)的乳液下的1-4log减少，以及在2mg/ml处的完全(或近似完全)减少。这些研究指示，共聚肽乳液制品在暴露于复杂的生物流体时仍然具有活性。这些抗微生物乳液似乎在伤口中耐受性良好并且不引起超过对照治疗的增加的炎症，如组织学检查所评估的(图21)。此外，发现这些抗微生物乳液在为期21天的猪伤口愈合模型(未感染)中耐受性良好(图22)。 
另外的研究表明，抗微生物合成共聚肽乳液在体外具有更少的细胞毒性(图38(表6))。在其他研究中，此观察跨多种合成共聚肽(包括K55(rac-L)20、K55L20、K55(rac-L/F)20)是一致的。总之，这些数据指示，将合成嵌段序列共聚肽安排为乳液和纳米乳液的分级结构可以改进抗微生物活性、减少哺乳动物毒性，或两者皆可。 
基于合成共聚肽的抗微生物水凝胶。本发明还描述了自组装成形成抗微生物水凝胶的纤丝的嵌段共聚肽。如以上所述，K180L20是一种水凝胶形成物，并且已经在体外证实强的抗微生物活性并在体内研究中展示出对微生物生长的有效预防。如在图23中所描绘，K180L20在体外展示了对已知在伤口感染中重要的革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)和革兰氏阴性(大肠杆菌、绿脓杆菌)细菌的有力抗微生物活性(在6.3μg/mL，5+log减少)。在时间杀死测定中，100μg/mL的K180L20在5分钟内对表皮葡萄球菌、大肠杆菌以及绿脓杆菌显示了多于3log减少。 
其他研究证明K180L20嵌段共聚肽在体内是抗微生物的。如图24中所描绘，K180L20在抑制具有异物的啮齿动物闭合性伤口模型中的微生物生长中是有效的。在此模型中，将用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或K180L20预浸泡的丝网皮下插入到Sprague-Dawley大鼠的背颈区中，随后是106金黄色葡萄球菌或绿脓杆菌。添加另外的PBS或K180L20，闭合伤口，并且将动物返回笼中48小时。K180L20(2mg/ml和20mg/ml)实质性降低了自该丝网和邻近组织培养的细菌(金黄色 葡萄球菌和绿脓杆菌)的数量。使用这种抗微生物水凝胶，在啮齿动物感染模型中没有观察到增强的炎症(图25)。 
在单独的研究中，基于嵌段序列共聚肽K180L20的水凝胶在抑制猪开放性伤口模型中的金黄色葡萄球菌中是有效的(图26)。在25-35kg的约克夏(Yorkshire)杂交猪的背部和侧胸中，制作全层1cm直径的伤口。应用K180L20水凝胶(或对照缓冲液)，并且在四小时之后，给伤口接种金黄色葡萄球菌。48小时之后，通过标准微生物学方法来评估伤口的细菌计数。如图26中所描绘，K180L20水凝胶充分减少了金黄色葡萄球菌计数。 
嵌段序列结构。在某些实施例中，这些抗微生物的共聚肽组合物可以具有嵌段序列结构，该结构包括包含2个或更多个连续的阳离子氨基酸/单体(例如，赖氨酸、精氨酸)的区段，或2个或更多个连续的疏水氨基酸/单体(例如，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸)的区段的一个或多个嵌段。在某些情况下，三嵌段或多嵌段化合物(即，不同氨基酸、单体的若干嵌段和/或其他聚合物嵌段)可以是特别有效的。交替氨基酸或单体的嵌段也可以有效，而无规序列的嵌段在某些背景中也可以是有利的。其他实施例还可以化学附接至不同聚合物的相同氨基酸/单体或不同氨基酸/单体的共聚肽嵌段或区段为特征。还预计，与无规共聚肽/共聚物相比，嵌段共聚肽/共聚物的生物活性和化学构成对于不同批次可以更具可再现性。还预计，嵌段共聚肽可具有比无规共聚肽相比更低的免疫原性。嵌段可以由展现出不同程度的亲水性或疏水性的天然和/或非天然氨基酸组成。可以使用天然氨基酸(疏水的，例如但不限于丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸；以及亲水的，例如但不限于精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸)或非天然氨基酸(例如但并不限于氟化的或不饱和的烃类)，以及对映体纯或外消旋混合物。此外，含有合成聚合物和肽区段或嵌段的多肽材料或杂交体也可以展现出增加的抗微生物活性、降低的哺乳动物毒性或两者。例如，疏水多肽可以共轭至亲水聚合物或低聚物，或者疏水合成聚合物或低聚物可以共轭至亲水肽，并且与完全由连接的氨基酸组成的材料相比，展现出类似的表征。肽区段、嵌段或结构域还可以被合成低聚物或聚合物区段替换，包括直接并入聚合物主链中，或作为接枝。 
我们已经证明，嵌段序列结构可被用于直接的分子自缔合或自组装。例如，通过测定临界聚集浓度(CAC)，我们证明嵌段序列共聚肽K55L20显现出比无规 序列K55L20(CAC＝160uM)相比实质更强的自缔合(CAC＝0.33uM)。这种分子设计元素在我们的发明的包括设计的分级结构的优选实施例中是重要的。 
设计的分级结构。这些组合物可被配制成分级结构，如多聚体、胶束、水凝胶或囊泡，或其混合物。增强的抗微生物活性或降低的哺乳动物毒性或两者可以源于抗微生物元素成为高级结构的组织，这些高级结构展现出呈更有效方式的或具有更高局部浓度的活性物。例如，在乳液的液体界面的亲水部分处的更高密度的阳离子电荷可以引起与微生物类生物的更好的相互作用。类似地，其他高级结构，如囊泡、胶束、薄片或水凝胶与一种分离的单独的抗微生物元素相比，能够更有效地递送多种抗微生物元素。另一方面，存在的、并且有时对两亲聚合物中疏水区段的更高级排序结构负责的次级相互作用可以是减少的哺乳动物毒性的原因。 
这些设计的合成共聚肽可以自组装成分级结构(例如，多聚体、胶束、乳液、水凝胶、囊泡)，从而增强抗微生物活性(体外或体内)、降低毒性或两者皆可。而且，这些化合物可以容易地沉淀至受损组织上和/或直接结合至受损组织，在受损组织处这些化合物可以提供局部、集中的抗微生物活性。 
在某些实施例中，这些组合物可以配制为乳液、微乳液或纳米乳液，或混合至其中。具体来说，这些乳液可以被设计成具有高抗微生物活性、低哺乳动物毒性或两者。应意识到，这些活性可以取决于一种或多种另外的因素，如油相的构成或液滴大小。 
在某些实施例中，这些抗微生物共聚肽可被配制为水凝胶。这些抗微生物分子将自组装为水凝胶。预计将存在物理水凝胶的优点，这些水凝胶是固有抗微生物的、能够穿过小口径开口(例如，20号注射针)或进入小组织间隙中并且然后快速再胶化。这些形成水凝胶的抗微生物共聚肽可被设计成是轻度组织粘附和光学透明的。预计它们将提供局部化的、集中的抗微生物活性，以及标准水凝胶的益处(例如，流体潴留)。自组装成形成水凝胶的纤丝的这些共聚肽的抗微生物特性已经在远低于胶凝浓度的浓度被证实。例如，在10ug/ml的浓度下的K180L20已经显示是有力的抗微生物剂，而其胶凝浓度为大约10mg/ml。这确立了该材料是固有抗微生物的，而同时可以自缔合成给制品提供宏观特性的分级结构。而且，在水凝胶形成浓度(例如，20mg/ml)处的K180L20已经显示在体内感染预防模型中是有效的抗微生物剂，并且在体内若干模型中具有低毒性。 
长链长度。在某些实施例中，这些抗微生物共聚肽组合物可以具有相对长的链长(例如，超过100个氨基酸)。预计具有更长链长的合成共聚肽可被优化以在某些背景中展现增加的功效、降低的哺乳动物毒性或两者。特别地，它们可以更有效地展现出多个活性位点、构象、结构域或片段，并且因此可以甚至在部分络合或降解之后继续展现出抗微生物活性。长链共聚肽可以与微生物表面进行更有效的相互作用，并且一次与多于一种微生物进行相互作用。通过细菌膜的阴性成分的交联，更长的多肽可以能够更有效地破坏该细菌膜。它们还可以能够与某些可溶的生物分子或组织成分进行相互作用，而同时使一种分子区段自由以与微生物进行相互作用。 
低疏水物含量。与其他抗微生物肽相比，这些组合物可以具有低摩尔分数的疏水单体(例如，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或非肽疏水单体)，例如35％或更少。在本发明中，我们认识到具有低摩尔分数的疏水单体(例如，fHM＝8％、18％、25％、35％)的嵌段共聚肽可以产生高抗微生物活性和低哺乳动物毒性。这类化合物可以克服具有高fHM的共聚物固有的特定局限。具有低fHM的两亲共聚物提供了若干独特的优点。例如，预计，减少的疏水含量降低哺乳动物毒性。已经报道，在抗微生物肽中的增加的疏水含量增加了溶血活性，可能通过减少对细菌选择性超过对哺乳动物细胞膜[22]。其他优点可以包括改善的在水溶液中的溶解性。本发明的一些组合物结合了低fHM。确切来说，我们已经证明了在低至约8％的疏水单体的摩尔分数时的高抗微生物活性。再者，我们已经证实高抗微生物活性可以通过降低疏水含量或通过增加亲水含量来达到。 
对映纯度影响二级结构。在某些实施例中，氨基酸(尤其是在疏水结构域中)的对映纯度可以用于控制自组装表征。例如，我们证明了，K55L20和K55(rac-L)20均以非常低的浓度(10μg/ml)处达到细菌(革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性(大肠杆菌、绿脓杆菌)两者)的减少。外消旋混合物或具有不同光学纯度的混合物可以提供改善的溶解性和减少的聚集。重要的是，一小部分D-氨基酸的掺入在针对生物膜的治疗应用方面可具有特别的优点[38]。而且，降低光学纯度除去了有序的二级结构，这影响自缔合和/或自组装表征。例如，通过测定临界聚集浓度(CAC)，我们证明与K55(rac-L)20(CAC＝8.1uM)相比，嵌段序列共聚肽K55L20显现出更强的缔合(CAC＝0.33uM)。 
溶液亚稳态。在某些实施例中，这些抗微生物的共聚肽组合物可被设计成具 有相对低的溶液稳定性。而且，这些材料可被设计成在它们与微生物(例如，细菌微菌落和生物膜)上常见的带负电的元素进行相互作用的位点或在组织损伤的位点结合/沉淀。这些溶液“亚稳的”抗微生物分子可以容易地沉淀(例如，当与具有相反电荷的微生物或哺乳动物组织材料进行相互作用的时候)。某些优点可以源于容易地沉淀至受损组织上和/或直接结合至受损组织的合成共聚肽，在受损组织处这些共聚肽可以提供局部、集中的抗微生物活性。而且，可以通过在微生物位点(例如，细菌微菌落和生物膜)结合/沉淀而使抗微生物共聚肽(或其他抗微生物材料)在某些背景中更有效。可以掺入某些设计元素，这样使得合成共聚肽分级结构在不存在生物材料(例如，血清、伤口流体、受损组织、细菌生物膜)的情况下仍然完全溶剂化，但是在结合生物材料时变成亚稳的。一旦这些抗微生物材料变成亚稳的，它们就可以沉降在组织或细菌菌落上，从而急剧地增加充当抗微生物剂和/或抗微生物屏障的局部浓度。 
多价。在某些实施例中，这些组合物可被工程化成包括多个抗微生物位点。这些抗微生物位点可以包括具有阳离子电荷的局部区和/或具有疏水性的局部区。因此，一种单一材料可以具有能够杀死/抑制微生物的若干不同的活性位点。以此方式，一种单一的超分子构建体可以实现“多击”方法，从而提供更大的有效性并且进一步降低微生物抗性的可能性。此外，可以观察到加成的或协同的活性。此外，该材料可以随着其被降解而释放抗微生物片段。 
微生物选择性。这些组合物可被工程化成相比于其他微生物优先靶向某些微生物。特别地，靶向传统的病原生物(例如，金黄色葡萄球菌、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA))超过传统的正常菌群(例如，痤疮丙酸杆菌)是具有特别益处。再者，选择的病毒、细菌或真菌的靶向可以与具体的医学背景(如用于洗手液或用于预防伤口感染)有关。我们已经开发出多种合成共聚肽，这些合成共聚肽在体外显示出对金黄色葡萄球菌比对痤疮丙酸杆菌更高的活性。 
混合物。在某些实施例中，这些组合物可以用两种或更多种不同的抗微生物共聚肽/共聚物进行配制。以此方式，一种组合物可以影响“双击”方法，从而提供更大的效果并且进一步降低微生物抗性的发展。此外，可以观察到加成的或协同的活性。 
在某些实施例中，这些组合物可以利用单体氨基酸或残基的化学修饰，例如，伯胺(例如，赖氨酸单体的)至胍鎓基团的转化来合成。其他修饰可包括烷基化、酰化、酰胺化、卤化、酯交换反应、还原胺化或添加官能度或修改单体氨 基酸或残基的现有官能度的其他化学转化。 
在某些实施例中，这些组合物可以与不同类别的其他抗微生物剂(例如，醇、基于氯的化合物、季铵化合物、酚类化合物、氯己定、抗生素、抗体)进行配制。这可以包括将本发明的组合物与已知的抗微生物剂混合。它可以包括将合成共聚肽/共聚物配制为递送剂或储库类型(例如，乳液、双纳米溶液、囊泡、水凝胶)并且结合一种或多种另外的抗微生物物质。 
在某些实施例中，这些组合物可以与生物活性材料或其他活性药物成分(API)进行配制。以此方式，这些配制品可以提供抗微生物活性以及第二或第三功能。可能性包括但不限于止血材料、支持伤口愈合的生长因子、促炎剂或抗炎剂以及免疫调节剂。 
在某些实施例中，这些合成抗微生物共聚肽/共聚物可被设计成含有其他生物活性元素(例如，特定序列、嵌段、分级结构或化学修饰)。例如，它们可以含有通过一种或多种机制，如血小板结合、血小板活化、凝血加速、纤维蛋白溶解减少、流体吸收或物理屏障效应来促进止血的元素。本发明预想性质上是止血的合成共聚肽，以及具有组合的抗微生物和止血活性的那些(图27-32、图39(表7))。 
实验
总述。在使用之前，通过在氮下，将无水四氢呋喃(THF)通经填充氧化铝的柱来制备无水四氢呋喃。通过在60℃在装备有Wyatt DAWN EOS光散射检测器和Wyatt Optilab DSP的SSI泵上进行的串联凝胶渗透色谱法/光散射(GPC/LS)，利用105、104以及
Figure BPA00001702377400201
Phenomenex 5μm柱，使用溶于DMF中的0.1M LiBr作为洗脱剂以及大约5mg/mL的多肽浓度，来获得分子量(Mn)和多分散性(PDI)。在使用聚苯乙烯膜校准的Perkin Elmer RX1 FTIR分光光度计上记录傅立叶变换红外光谱(FTIR)。在Bruker AVANCE 400MHz光谱仪上记录1H NMR光谱。去离子(DI)水使用Purelab Option 560反渗透净化器进行净化。从Millipore Milli-Q Biocel A10净化装置获得Millipore水。 
嵌段共聚肽合成—总述。α-氨基酸-N-羧基环内酸酐NCA单体使用先前公开的文献方案来合成。所有的嵌段共聚肽使用(PMe3)4Co引发剂来聚合。生成的多肽使用GPC、1H NMR和IR光谱学来表征。这些共聚物的构成通过分析所记 录在d-TFA中的1H NMR光谱的整合值来确定。发现所有构成都在预测值的5％之内。聚合物链长分布范围(Mw/Mn)为从1.1至1.3。 
聚(N ε -CBZ-L-赖氨酸) 55 -b-聚(rac-亮氨酸) 20 ，Z-K 55 (rac-L) 20 。在干燥箱中，将Nε-CBZ-L-赖氨酸(Z-K NCA)(11.34g，37mmol)放置在具有搅拌棒的500mL平底烧瓶中。添加无水THF(227mL)并且然后用塑料塞密封。然后经由注射器添加一等份的(PMe3)4Co(溶于无水THF中40mg/mL的18.9mL，2.1mmol)，并且密封该烧瓶并搅拌45分钟。从该聚合反应中取出一等份(50μL)用于GPC分析(Mn＝14.7×103g/mol，Mw/Mn＝1.12)。然后将储备聚(Nε-CBZ-L-赖氨酸)55在8个部分之间进行等分(每个部分中0.26mmol(PMe3)4Co引发剂)并且放置在125mL平底烧瓶中。根据需要向每个部分添加不同量的疏水D，L NCA。例如，为了合成Z-K55(rac-L)20，添加一等份的D，L亮氨酸(L)NCA(在THF中50mg/mL的5.3mL，1.7mmol)，并且允许聚合过夜。 
使用类似的程序来产生以下嵌段共聚物：Z-K55(rac-L)5，D，L亮氨酸NCA(溶于THF中50mg/mL的1.3mL，0.42mmol)；Z-K55(rac-L)10，D，L亮氨酸NCA(溶于THF中50mg/mL的2.7mL，0.84mmol)；Z-K55(rac-L)30，D，L亮氨酸NCA(溶于THF中50mg/mL的7.9mL，2.5mmol)；Z-K55(rac-I)20，D，L异亮氨酸(I)NCA(溶于THF中50mg/mL的5.3mL，1.7mmol)；Z-K55(rac-L/F)20，D，L亮氨酸NCA(溶于THF中50mg/mL的2.6mL，0.84mmol)以及D，L苯丙氨酸(F)NCA(溶于THF中50mg/mL的3.2mL，0.84mmol)；Z-K55(rac-A)20，D，L丙氨酸(A)NCA(溶于THF中50mg/mL的3.9mL，1.7mmol)；以及Z-K55(rac-V)20，D，L缬氨酸(V)NCA(溶于THF中50mg/mL的5.3mL，1.7mmol)。 
聚(L-赖氨酸·HCl) 55 -b-聚(rac-亮氨酸) 20 ，K 55 (rac-L) 20 。从干燥箱中取出聚(Nε-CBZ-L-赖氨酸)55-b-聚(rac-亮氨酸)20。将THF减压除去，然后溶解在三氟乙酸(TFA)(50mL)中。接着，将烧瓶放置在冰浴中，随后添加HBr(在乙酸中33％，6.0mL，19.7mmol)并且搅拌两小时。通过向反应混合物(50mL)中添加二乙醚、随后离心(在3,000rpm下进行三分钟)来分离脱保护的聚合物。然后将沉淀的聚合物用二乙醚洗涤并且离心两次。然后将分离的聚合物溶解在Millipore水中并进行用EDTA四钠(3mmol，四天)、0.1M HCl(两天)、DI水(一天)、0.1M NaCl(两天)、Millipore水(两天)透析(2,000MWCO膜)，每种溶液一天更换两次。将经透析的聚合物通过冻干来分离，得到为无水白色粉末的产物(0.80g，84％)。 
使用类似的程序来产生以下嵌段共聚物：K55(rac-L)5(0.51g，62％)、K55(rac-L)10(0.70g，81％)、K55(rac-L)30(0.77g，74％)、K55(rac-I)20(0.78g，81％)、K55(rac-L/F)20(0.74g，79％)、K55(rac-A)20(0.82g，92％)以及K55(rac-V)20(0.82g，88％)。 
聚(乙二醇) 205 -b-聚(rac-亮氨酸) 20 ，PEG 204 (rac-L) 20 。使用之前，将0.50g的ω-氨基酸封端的聚(乙二醇)单甲醚PEG205-NH2(Mn＝9,000g/mol，PDI＝1.08)通过溶解在无水苯中、随后蒸馏除去溶剂来进行干燥以产生无水固体。在干燥箱中，将PEG205-NH2(0.50g，5.6×10-5摩尔)溶解在4.0mL的干DMF中。接着，将L-亮氨酸NCA(83mg，0.53mmol)和D-亮氨酸NCA(83mg，0.53mmol)溶解在无水DMF(2.5mL)中并且然后添加至聚合混合物中。将该溶液在室温搅拌三天直到完全聚合。然后将它从干燥箱中取出并且添加5mL Millipore水，并且然后转移至透析膜(2,000MWCO膜)上并且对Millipore水进行透析(三天)，每种溶液一天更换两次。将该经透析的聚合物通过冻干来分离，得到为无水白色粉末的产物(0.51g，82％)。1H-NMR 
聚(L-谷氨酸-Na) 64 -b-聚(rac-亮氨酸) 20 ，E 64 (rac-L) 20 。在干燥箱中，将γ-苄基-L-谷氨酸，Bzl-Glu NCA(5.00g，19mmol)放置在具有搅拌棒的250mL平底烧瓶中。添加无水THF(100mL)并且然后用塑料塞密封。然后经由注射器添加一等份(PMe3)4Co(溶于无水THF中40mg/mL的11.5mL，1.27mmol)，并且密封该烧瓶并搅拌1小时。从该聚合反应中取出一等份(50μL)用于GPC分析(Mn＝13.9×103g/mol，Mw/Mn＝1.27)。接着，添加一等份的D，L亮氨酸(L)NCA(溶于THF中50mg/mL的18.7mL，6.0mmol)，并且允许聚合过夜。接着，将THF减压除去并且然后溶解在无水CH2Cl2(100mL)中。为了除去苄基保护基，经由注射器添加碘代三甲硅烷(10.8mL，76mmol)。将一个回流冷凝器附接至该烧瓶上并且在40℃回流过夜。接着，减压除去溶剂并且添加1MNaOH并搅拌过夜，然后过滤除去沉淀物并且对5mM亚硫酸氢钠和0.1M NaOH(三天)，然后是Millipore水(四天)进行透析(6-8,000MWCO膜)，每种溶液一天更换两次。然后将透明溶液冻干，得到白色蓬松固体(1.26g，36％)。 
聚(L-高精氨酸·HCl) 55 -b-聚(rac-亮氨酸) 20 ，R H 55 (rac-L) 20 。向含有搅拌棒的500mL圆底烧瓶中添加K55(rac-L)20(1.00g，0.09mmol)，并且然后分散在1M NaOH(137mL)中。接着，添加3，5-二甲基-1-吡唑甲脒硝酸盐(3.93g，19.6mmol)。使用HCl将pH调整为pH＝10，并且然后放置于40℃油浴中并搅拌48小时。 为了淬灭该反应，用0.1M HCl将该溶液酸化至pH＝3，然后放置在透析袋(2,000MWCO)中并且对Millipore水进行透析(五天)，每种溶液一天更换两次。将经透析的聚合物通过冻干来分离，得到呈白色粉末的产物(0.95g，78％)。 
聚(L-赖氨酸·HCl) 80 -共-聚(L-赖氨酸) 80 ，K 80 (rac-L) 20 。向含有搅拌棒的50mL聚丙烯离心管中添加聚(L-赖氨酸·HCl)80(K80)(75mg，5.7μmol)，并且然后溶解在50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲剂(15mL)中。接着，添加四氢呋喃(THF)(14.3mL)。向此溶液中添加N-羟基琥珀酰亚胺(530μL的溶于THF/水中的10mg/mL溶液，46μmol)、辛酸(660μL的溶于THF中的10mg/mL溶液，46μmol)以及1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(2.6mL的溶于THF/水中的50mg/mL溶液，0.68mmol)。使溶液搅拌过夜。第二天，将该溶液放置于透析袋(2,000MWCO)中并且对Millipore水(三天)、0.01M HCl(两天)、0.01M NaOH(一天)、0.01M HCl(一天)、Millipore水(两天)进行透析，每种溶液一天更换两次。将经透析的聚合物通过冻干来分离，得到呈白色粉末的产物(68mg，85％)。 
经由芘荧光的临界聚集浓度(CAC)。将多肽溶液(2mL)按照一个浓度范围(2.0x10-3至2.0x10-12M)分散在水中。通过将芘溶解在丙酮(6.0x10-2M)中来制备储备芘溶液。接着，添加适当量的芘储备溶液，得到在水中12x10-7M的最终浓度，并且将丙酮蒸发掉。向每个多肽溶液中添加2.0mL的储备芘水溶液，得到6.0x10-7M的最终浓度。然后，在测量之前使每个溶液平衡过夜。为了记录荧光光谱，将3.0mL的每个多肽溶液添加至4.0mL的聚苯乙烯比色杯中。在300-360nm的范围内在390nm的发射波长下记录激发光谱。所有光谱以1秒/0.5nm的积分时间运行。对于每个样品，将两个峰I338/I333的强度比率绘制为多肽浓度(M)的函数。将CAC确定为该曲线的外推线性拟合的相交点。 
乳液制备。在一个典型的配制中，将800μL的1w/v％多肽溶液添加至1.5mL的无菌离心管中。接着，添加200μL油相，典型地是粘度为10cSt的聚二甲基硅氧烷(PDMS)(通过过滤通过0.2μm的无菌过滤器来灭菌)，得到最终体积分数，φ＝0.2。使用手提式超声匀浆器(Cole-Parmer 4710系列型号ASI，输出为35％-40％)将溶液乳化一分钟，形成纳米级液滴(根据动态光散射DLS测量直径为约400-500nm)。 
以下这些权利要求因此应理解为包括以上具体说明并且描述的内容、概念上等效的内容、能够明显地取代的内容、还有以及实质上涵盖了本发明的基本思 想的内容。本领域的技术人员应当了解，在不背离本发明的范围的情况下，可以对刚刚说明的优选实施例进行各种适配和修改。所说明的实施例已经仅仅出于举例的目的而列出，并且不应作为对本发明的限制。因此，应理解的是，在所附权利要求的范围内，本发明可以按不同于在此具体描述的方式来实施。 
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Claims (50)

1.一种合成共聚肽，包含：
至少五个阳离子氨基酸残基；
嵌段氨基酸序列，其中这些嵌段中的至少一个含有至少十个亲水氨基酸残基并且其中这些嵌段中的至少一个含有至少五个疏水氨基酸残基；以及
抑制或杀死微生物的能力。
2.一种合成共聚肽，包含：
至少五个阳离子氨基酸残基；
促进定向自组装形成有序分级结构的氨基酸序列；以及
抑制或杀死微生物的能力。
3.如权利要求2所述的合成共聚肽，其中总体链长为二十五或更多个氨基酸残基。
4.如权利要求2所述的合成共聚肽，其中这些分级结构选自由胶束、囊泡、片层以及纤丝组成的组。
5.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其中这些微生物选自由细菌、病毒、真菌以及原生动物组成的组。
6.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其包含至少一个具有至少20个连续亲水氨基酸残基的嵌段。
7.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其包含至少一个具有至少50个连续亲水氨基酸残基的嵌段。
8.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其包含至少一个具有至少80个连续亲水氨基酸残基的嵌段。
9.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其包含至少一个具有至少100个连续亲水氨基酸残基的嵌段。
10.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其包含至少一个具有至少120个连续亲水氨基酸残基的嵌段。
11.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其包含至少一个具有至少5个连续疏水氨基酸残基的嵌段。
12.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其包含至少一个具有至少10个连续疏水氨基酸残基的嵌段。
13.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其包含至少一个具有至少15个连续疏水氨基酸的嵌段。
14.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其包含至少一个具有至少20个连续疏水氨基酸的嵌段。
15.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其包含至少一个具有至少30个连续疏水氨基酸的嵌段。
16.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其包含至少一个具有至少40个连续疏水氨基酸的嵌段。
17.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其中疏水氨基酸残基构成了所述共聚肽的不多于30％的氨基酸残基。
18.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其中疏水氨基酸残基构成了所述共聚肽的不多于20％的氨基酸残基。
19.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其中疏水氨基酸残基构成了所述共聚肽的不多于10％的氨基酸残基。
20.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其进一步包含包括至少三个嵌段的氨基酸序列。
21.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其中所述合成共聚肽的临界聚集浓度比具有与所述合成共聚肽相同的氨基酸残基构成的无规序列合成共聚肽的临界聚集浓度低至少20％。
22.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其中所述合成共聚肽形成分级结构的缔合率比具有与所述合成共聚肽相同的氨基酸残基构成的无规序列合成共聚肽的缔合率高至少20％，或者其中由所述合成共聚肽形成的分级结构的离解率比具有与所述合成共聚肽相同的氨基酸残基构成的无规序列合成共聚肽形成的分级结构的离解率低至少20％。
23.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其中所述合成共聚肽形成具有至少50Pa储能模量的水凝胶。
24.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其中所述合成共聚肽在低至0.01％(w/w)的浓度下形成水凝胶。
25.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其中所述合成共聚肽被并掺入具有不混溶相的组合的混合物中以形成分散的混合物或乳液。
26.如权利要求25所述的合成共聚肽，其中所述不混溶相选自油可混溶相和水可混溶相。
27.如权利要求26所述的合成共聚肽，其中所述分散的混合物或乳液选自水包油型、油包水型、水包油包水型以及油包水包油型。
28.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，进一步包括在低于所述合成共聚肽杀死哺乳动物细胞的浓度下杀死或抑制微生物的能力。
29.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，所述合成共聚肽用于选自以下各项的应用：食物保存、溶液保存、手部消毒、局部抗感染、涂覆假体装置和植入物、伤口治疗、外科手术部位治疗、烧伤治疗、糖尿病足溃疡治疗以及创伤治疗。
30.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，进一步包含选自以下各项的添加的活性药物成分(API)：类固醇、促炎剂、抗炎剂、抗痤疮剂、防腐剂、止血剂、血管生成剂、伤口愈合剂以及抗癌剂。
31.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其中在有助于复杂的分级结构的形成或强度的一种或多种其他材料的存在下所述共聚肽被配制为这些复杂的分级结构。
32.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其中所述共聚肽是用修饰的单体氨基酸来合成或所述氨基酸残基是在聚合后修饰。
33.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其包含由选自由赖氨酸、精氨酸、高精氨酸以及鸟氨酸组成的组的带电氨基酸构成的亲水嵌段。
34.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其包含由选自由丝氨酸和酪氨酸组成组成的组的不带电极性氨基酸构成的亲水嵌段。
35.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其包含由选自由亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、丙氨酸及其混合物组合所组成的组的非极性、疏水氨基酸构成的亲水嵌段。
36.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其进一步包含一种或多种β-氨基酸残基。
37.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其中所述合成多肽选择性地靶向病原微生物。
38.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其包含至少一个含有具有共价修饰的侧链的氨基酸残基的嵌段。
39.如权利要求38所述的合成共聚肽，其中所述共价修饰的侧链选自由PEG-侧链和N-季铵化的侧链组成的组。
40.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，其中，亲水嵌段通过方法“点击化学”或含有选自由吲哚、乙二醇、丙二酸酯、二羧酸酯、三唑以及PEG组成的组的间隔体来共价附接。
41.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，包括其中一个或多个嵌段含有氨基酸残基的L-、D-、外消旋混合物或具有不同光学纯度的混合物。
42.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，包括在低于0.1％(w/w)的浓度下在体外抑制或杀死微生物的能力。
43.如权利要求1或2所述的合成共聚肽，所述合成共聚肽证实了抗微生物活性和止血特性。
44.两种或更多种如权利要求1或2所述的合成共聚肽的混合物。
45.一种或多种如权利要求1或2所述的抗微生物合成共聚肽与其他聚合物或共聚物的混合物。
46.如权利要求45所述的混合物，其中所述聚合物或共聚物选自由藻酸盐、壳聚糖、PEG、改性纤维素以及其他多糖组成的组。
47.一种或多种如权利要求1或2所述的抗微生物合成共聚肽与其他抗微生物剂的混合物。
48.如权利要求47所述的混合物，其中这些其他抗微生物剂选自由醇、基于氯的化合物、季铵化合物、酚类化合物、氯己定、抗生素以及抗体组成的组。
49.一种合成共聚肽-聚合物杂交体，该杂交体含有一个或多个具有8个或更多个氨基酸的肽嵌段以及一个或多个非肽嵌段。
50.抗微生物合成共聚肽和聚合物或共聚物以及生物活性材料或用以提供抗微生物活性以及另外活性的其他活性药物成分(API)的混合物，这些其他活性药物成分选自下组，该组由止血材料、支持伤口愈合的生长因子、促炎剂和抗炎剂以及免疫调节剂组成。
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