KR101529894B1 - 코폴리머-안정화된 에멀션 - Google Patents

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티머시 제이. 데밍
제로드 에이. 핸슨
코니 비. 창
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더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

에멀션은, 실질적으로 연속적인 액체 매질, 및 이 실질적으로 연속적인 액체 매질 내부에 분산된 복수의 액적 구조를 포함한다. 복수의 액적 구조의 각각의 액적 구조는, 외부 표면을 갖는 제 1 액체의 외부 액적; 제 1 액체의 외부 액적의 외부 표면 내부에 포함되는 내부 표면을 갖는 제 2 액체의 내부 액적으로서, 제 2 액체는 제 1 액체에 비혼화성이고, 내부 액적 및 외부 액적은 그 사이에 경계 표면 영역을 갖는, 상기 제 2 액체의 내부 액적; 외부 액적의 외부 표면 상에 배치된 블록 공중합체의 외부층; 및 내부 액적의 내부 표면 상에 배치된 블록 공중합체의 내부층을 포함한다. 블록 공중합체는 친수성 폴리머 블록 및 소수성 폴리머 블록을 포함하고, 그 친수성 폴리머 블록 및 소수성 폴리머 블록은 함께 액적 구조를 안정화시키도록 작용하고, 제 1 액체는 실질적으로 연속적인 액체 매질에 비혼화성이다.

Description

코폴리머-안정화된 에멀션{COPOLYMER-STABILIZED EMULSIONS}
관련 출원의 상호-참조
이 출원은 2007년 8월 21일에 출원된 미국 가특허출원 제60/935,605호를 우선권 주장하고, 그 전체 내용이 참조로서 본 명세서에 통합되어 있다.
본 발명은 미국 국립과학재단 (National Science Foundation) 에 의해 수여되는 미국 정부 지원 (Grant No. CHE-0415275) 으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명의 일정 권리를 가진다.
발명의 분야
본 발명은, 액적 구조, 액적 구조의 에멀션, 그리고 액적 구조 및 에멀션을 제조하는 방법에 관한 것이며; 보다 구체적으로, 액적 구조, 액적 구조의 에멀션, 그리고 블록 공중합체에 의해 안정화되는 액적 구조를 제조하는 방법에 관한 것이다.
심플 에멀션 (simple emulsion) 은 하나의 액체의 액적의 다른 비혼화성 액체 내의 분산물이고; 액적은 통상 인가된 전단 (shear) 에 의해 형성되고 계면 반발을 제공하는 계면활성제에 의해 후속 유착 (coalescence) 에 대항하여 안정화된다 (J. Bibette, F. Leal-Calderon, and P. Poulin, Rep. Prog. Phys. 62, 969 (1999)). (이 명세서의 임의의 섹션 내의 어딘가에서 인용되는 모든 참조 문헌은 참조로서 본 명세서에 통합되어 있다) 가장 일반적인 타입 중 두 가지는 '다이렉트 (direct)' O/W (oil-in-water) 에멀션 및 '인버스 (inverse)' W/O (water-in-oil) 에멀션이다. 계면활성제는 여러 상이한 형태, 즉 이온성 (예컨대, 음이온성, 양이온성, 양쪽이온성), 비이온성 (예컨대, 에폭시화 알칸 사슬), 및 중합성 (예컨대, 심플, 디블록, 및 트리블록 폴리머) 을 취할 수 있는 양친매성 분자이다. 그들이 양친매성이기 때문에, 계면활성제는 오일-물 계면 상에 우선적으로 흡착되는 경향이 있다. 오일 및 물 속에서의 계면활성제의 상대적인 용해도, 계면활성제의 농도, 및 계면활성제가 그 계면 상에 흡착되었을 때 계면활성제가 제공하는 계면 반발의 정도는, 보다 큰 액적 구조를 보다 작은 액적 구조로 파열시킬 수 있는 인가된 전단 흐름 또는 비열적 (non-thermal) 외부 응력의 다른 소스에 의해 형성되는 에멀션의 장수 (longevity) 및 안정성을 결정하는데 있어서 중요한 인자이다.
심플 에멀션 이상으로, 보다 높은 레벨의 토폴로지 복잡성이 존재한다. 예컨대, W/O 에멀션은 수계 연속적인 액체 내로 전단될 수 있고, 이에 따라 그 자체가 보다 작은 물 액적을 함유하는 오일 액적의 분산물을 생성한다. 계면활성제의 현명한 선택을 통해, 자체의 보다 큰 오일 액적 뿐만 아니라, 오일 액적 내측의 '내부' 물 액적은 둘다, 오랜 기간에 걸쳐 안정하게 남아 있을 수 있다. 이런 종류의 에멀션을 W/O/W (water-in-oil-in-water) 에멀션이라 한다. 연속적인 액체상으로부터 시작하여, 가장 작은 액적 구조의 중심에 도달하기 위해 2 개의 오일-물 계면층을 침투하여야 하기 때문에, 이 레벨의 토폴로지 복잡성을 갖는 에멀션 시스템을 고유하게 '더블 에멀션' 이라 한다. 실제로, 계속해서 제어된 에멀션화 단계를 통해, 이 시스템의 가장 작은 액적 구조의 중심에 도달하기 위해 침투해야 하는 여러 계면층을 함유하는 트리플 에멀션 및 더욱 더 높은 토폴로지 차수의 다중 에멀션을 제조할 수 있다. W/O/W 더블 에멀션은, 오직 하나의 내부 물 액적을 각각 함유하는 외부 오일 액적을 가질 수도 있다. 그러나, W/O/W 더블 에멀션 내의 오일 액적이 수많은 내부 물 액적을 함유할 수도 있다. 때때로, 이것을 오해하여 "다중 에멀션" 이라 한다. 그보다는, 보다 적절하게, 복수의 다중 내부 액적을 일반적으로 각각 함유하는 외부 오일 액적을 갖는 W/O/W 더블 에멀션이라 해야 한다. 더블 에멀션을 대략적으로 특징짓기 위해 2 개의 평균 액적 체적 분율, 즉 오일 액적 내측의 물 액적의 평균 '내부 체적 분율', 및 연속적인 수용액 속에 존재하는 W/O 액적의 평균 '외부 체적 분율' 이 사용될 수 있다. 일반적으로, 내부 물 액적에 대응하는 반경의 완전한 분포 및 또한 외부 물 액적에 대응하는 반경의 상이한 분포가 있다. 액적 사이즈가 보다 고도로 제어되거나, 또는 '균일'하도록, 이들 분포는 상당히 첨예한 단조성의 (monomodal) 피크를 발현하는 것이 바람직할 수 있다. 더블 에멀션을 특징짓는 다른 구조적 양태는 외부 액적 당 내부 액적의 수의 확률 분포이다. 본 명세서에서 우리는 주로 W/O/W 더블 에멀션 (즉, 수성 (water-borne) 더블 액적) 을 생성하는데 초점을 두고 있지만, 수계 연속상을 갖지 않는 O/W/O (oil-in-water-in-oil) 더블 에멀션을 동일하게 생성할 수 있다. O/W 단일 에멀션 및 W/O/W 더블 에멀션에 대해, 오일 체적 분율 (에멀션 시스템 내부에 함유되는 오일의 체적을 에멀션 시스템의 전체 체적에 의해 나눔) 을 나타내기 위해 φ 가 통상 사용된다.
최근, 2 개의 주요 유형, 즉 구조적 미세유체 및 순차적 에멀션화가, 약 1 미크론보다 큰 평균 외부 액적 직경을 통상 갖는 고도로 균일한 W/O/W 더블 에멀션을 제공하였다. 첫번째 유형은 비교적 낮은 스루풋의 미세유체 방법에 의한다. 이 유형의 일 구현에 있어서, 제 1 크로스-채널 흐름 연합을 이용하여 오일 내에 물 액적을 생성한 후, 제 2 크로스-채널 흐름 연합을 이용하여 W/O 액적을 수계 연속상으로 파열함으로써 W/O/W 에멀션이 생성된다 (S. Okushima et al., Langmuir 20, 9905 (2004)). 또한, 보다 높은 스루풋으로 고도로 균일한 W/O 에멀션을 제공하기 위해, 미세 가공된 유체 채널보다는, 다공성 유리 에멀션화 및 멤브레인 에멀션화 방법이 이용될 수 있다. 이러한 구현은 수많은 내부 액적의 더블 에멀션으로의 매우 강건한 통합을 허용한다. 미세유체 파열의 제 2 구현은 미세유체 채널을 이용하여 최심부 물 젯 (jet), 중간 오일 젯, 및 최외부 물 젯의 흐름을 구성함에 의하므로, 내부 및 외부 계면의 모세관 불안정성이 동시에 발생한다 (A. S. Utada et al, Science 308, 537 (2005)). 이 방법은 단일 내부 액적을 함유하는 W/O/W 더블 에멀션 내로 최심부 수계 젯 속의 오브젝트를 캡슐화하는데 양호하다. 그러나, 특정 수의 다중 내부 액적을 함유하는 더블 에멀션이 원하는 내부 체적 분율로 형성되도록 흐름을 조정하는 것이 상당히 더욱 어렵게 된다. 이들 미세유체 접근법의 양방에 있어서, 에멀션의 형성후 안정성을 보존하기 위해 적절한 계면활성제는 액체상으로 존재해야 한다.
두번째 유형은 미세 가공된 채널을 사용하지 않는 보다 전통적인 형태의 순차적 에멀션화이다. 순차적 에멀션화에 있어서, 먼저 W/O 에멀션이 생성되고, 그후, 이번에는 이 심플 인버스 에멀션이 전단을 이용하여 수계 계면활성제 용액 내로 에멀션화된다 (W. Yafei, Z. Tao, and H. Gang, Langmuir 22, 67 (2006)). 필요에 따라, 이 W/O/W 더블 에멀션 내의 물 액적 및 오일 액적 둘다를 사이즈-분획화하여 그들을 단분산액 (monodisperse) 으로 제작할 수 있다. 분획화 (fractionation) 없이, 전통적인 방법은 매우 높은-스루풋일 수 있고, 시간 당 수많은 리터를 제조할 수 있다. 높은 레벨의 단분산성을 원한다면, 분획화는 필연적으로 그 프로세스를 늦추게 된다. 이러한 방법에 대한 변화에 있어서, 미리 혼합된 더블 에멀션을 얇은 갭으로 전단함으로써 오일 액적을 유사-단분산액으로 제작하는 높은-스루풋의 접근법 (C. Goubault et al, Langmuir 17, 5184 (2001)) 은 단분산액을 심플 에멀션으로 제작하기 위해 이미 개발된 방법을 이용한다 (T. G. Mason, and J. Bibette, Phys. Rev. Lett. 77, 3481 (1996); T. G. Mason, and J. Bibette, Langmuir 13, 4600 (1997)). 미세유체 방법을 이용하여 제조된 더블 에멀션에 대해, 릴리즈 (release) 및 안정성의 원하는 성질을 획득하기 위해서는 순차적 에멀션화용 계면활성제의 선정도 중요하다.
작은 분자 계면활성제 및 지방질과 유사하게, 합성 블록 공중합체는 중합 성분의 마이크로 상분리를 통해 정돈된 나노구조로 자기-조립할 수 있다 (A. J. Link, M. L. Mock, and D. A. Tirrell, Curr Opin Biotech 14, 603 (2003)). 그러나, 계층적 구조 물질 또는 별개의 제3 구조로 조립하는 블록 공중합체의 능력은, 생물학적 시스템 (예컨대, 단백질) 에서 발견되는 것과 유사하게, 폴리머 도메인의 제한된 기능성뿐만 아니라 대부분의 일반적인 폴리머의 무질서한 (random coiled) 성질에 의해 제한되었다. 수소-결합을 촉진하는 원소의 통합 (G. A. Silva et al, Science 303, 1352 (2004)), 양친매화 (D. E. Discher, and A. Eisenberg, Science 297, 967 (2002)), 결정화 (G. D. Fasman, Prediction of protein structure and the principles of protein conformation (Plenum Press, New York, 1989), pp. xiii), 및 액정 형성 (D. J. Pochan et al, Macromolecules 35, 5358 (2002)) 은 모두, 구조적 진화에 영향을 주도록 작용할 것이다 (J. Rodriguez-Hernandez, and S. Lecommandoux, J Am Chem Soc 127, 2026 (2005)). 공중합체 배열의 복잡성을 증가시키는 것 (디- 내지 트리- 내지 테트라-블록 등) 은 또한 계층적 조립을 위한 포텐셜을 증강시킬 것이다 (I. W. Hamley, Soft Matter 1, 36 (2005)). 이들 방법을 이용하는데 있어 주요 제한은, 기능성 다성분 블록 공중합체의 제조에 필요한 합성 화학물질이 소정의 중합법을 가진 상이한 모노머의 비상용성으로 인한 주요 방해물인 것이다 (A. J. Link, M. L. Mock, and D. A. Tirrell, Curr Opin Biotech 14, 603 (2003)). 또한, 대부분의 일반적인 합성 폴리머는 생물 고분자에서 발견되는 난해한 복잡성 (예컨대, 2차 구조, 복잡한 기능성 및 입체화학) 이 없기 때문에, 그들은 자기-조립된 생물학적 거대분자의 거동을 충실히 모방할 수 없을 것이다. 이런 이유로, 에멀션 시스템을 조사하기 이전에, 우리는 베시클 및 히드로겔을 포함하는, 특별히 정의된, 기능성 나노구조로 응집하는 능력을 갖는 합성 물질로서 블록 코폴리펩티드의 자기-조립을 연구하였다. 이들 비-에멀션 물질은 통상 "하의 상달식 (bottom-up)" 자기-조립을 야기하는 코폴리펩티드 분자들 사이의 상호작용을 통해 형성된다. 그러나, 합성 폴리머 블록을 형성하기 위한 합성 성분 (즉, 비-아미노산 모노머) 의 사용 및 보다 고차의 트리블록 및 다중블록 폴리머 구조의 사용은 본 발명의 일반적 개념 중 일부로부터 배제되지 않는다.
본 명세서에 기재되는 발명에 선행하는 작업으로, 우리는 작은 충전된 (charged) 디블록 코폴리펩티드 양친매성 물질의 조립에 대한 블록 조성 및 사슬 길이의 역할을 연구하는데 노력을 집중했고, 이때 우리는 소수성 도메인에서의 막대형상 (rod-like)
Figure 112010016960120-pct00001
-나선형 세그먼트의 구조 관리 특성을 이용하였다. 구체적으로, 우리는 폴리(L-글루타마트산)-b-폴리(L-류신) 블록 코폴리펩티드, E60L20 뿐만 아니라, 폴리(L-리신)-b-폴리(L-류신) 블록 코폴리펩티드의 시리즈, KxLy (여기서 x 는 20 내지 80 의 범위이고, y 는 10 내지 30 잔기의 범위임) 의 수계 자기-조립을 제조하여 연구하였다 (E. P. Holowka, D. J. Pochan, and T. J. Deming, J Am Chem Soc 127, 12423 (2005)). 폴리(L-리신·HBr) 및 폴리(L-글루타메이트-Na+) 세그먼트는 중성 pH 에서 고도로 충전된 고분자전해질이고, 물에 쉽게 용해한다. 보다 조기 작업으로, 우리는, 높은 K 대 L 몰비를 갖는 샘플 (예컨대. K180L2O) 을 탈이온수에 직접 용해시켜, 꼬인 섬유로 구성된 투명한 히드로겔을 산출할 수 있다는 것을 발견하였다 (A. P. Nowak et al, Nature 417, 424 (2002)). 우리는, 감소 충전된 세그먼트의 사용이 반발하는 고분자전해질 상호작용을 완화시키고 충전된 폴리펩티드 멤브레인의 형성을 허용할 것이라고 추론했다. 우리의 공중합체의 제 1 시리즈에 있어서, 올리고류신 도메인의 사이즈는 20 개의 잔기에서 일정하게 유지되었고, 올리고리신 도메인은 20 내지 80 잔기로 변화되었다. 샘플에 대해 THF/물 (1 : 1) 속의 건조 폴리머를 현탁한 후 투석 (dialysis) 함으로써 처리하였다. DIC 광학 현미경을 사용하여 이들 조립을 분석하여, K20L20 에 대해 큰 시트형상 멤브레인의 존재가 드러났고, K40L20 에 대해 얇은 섬유의 존재가 드러났다. K60L2O 샘플은, DIC (Differential Interference Contrast) 현미경에 의해 큰 소포성 (vesicular) 조립만이 관찰되었기 때문에, 가장 유망하다 (E. P. Holowka, D. J. Pochan, and T. J. Deming, J Am Chem Soc 127, 12423 (2005)).
투석으로부터 직접 획득된 K60L20 폴리펩티드 베시클은 DIC 및 DLS 을 이용하여 구해지는 바와 같이 약 0.8 ㎛ 내지 5 ㎛ 범위의 직경을 가지며, 다분산액이다 (도 1). 혈액 순환을 통한 약물 전달과 같은 적용을 위해, 약 50 nm 내지 약 100 nm (심지어 약 200 nm 까지) 의 베시클 직경이 요망된다. 우리는, K60L20 베시클의 수계 현탁액이 폴리펩티드 물질의 작은 손실로 핵 트랙-에칭된 폴리카보네이트 (PC) 멤브레인을 통해 압출될 수 있다는 것을 발견하였다. 필터를 2회 통과시킨 후, 베시클 직경이 필터 포어 사이즈에 가깝게 일치하는 값으로 감소되는 것이 관찰되었다. 이러한 결과들은, 충전된 폴리펩티드 베시클이 용이하게 압출되어, 수십 내지 수백 나노미터 범위의 베시클 직경에 걸쳐 양호한 제어를 가능하게 한다는 것을 나타내었다 (도 1). 동적 광 산란 (DLS) 사이즈 분석은, 압출된 베시클이 또한 교질입자 오염물질을 함유하지 않고 압출 이전보다 덜 다분산액이라는 것을 나타내었다. 소포성 모폴로지는 또한 서브-미크론 K60L20 현탁액의 TEM 이미지를 통해 확인되었다. 압출된 베시클은 DLS 를 이용하여 6 주 동안 모니터링되었고, 대부분에 샘플에 대해 평균 직경이 변화하지 않기 때문에 안정된 것으로 발견되었다. 베시클은 또한 높은 열적 안정성을 가지는 것이 발견되었다. 1 ㎛ 베시클의 수계 현탁액이 80 ℃ 에서 30분간 유지되었고, 그후 어떠한 베시클 붕괴도 검출할 수 없었다 (E. P. Holowka, D. J. Pochan, and T. J. Deming, J Am Chem Soc 127, 12423 (2005)). 100 ℃ 에서 30 분간 가열한 후에 겨우, 베시클이 붕괴되었고, 크고 평평한 멤브레인 시트를 산출하였다.
이온성 매질 내의 이들 고도로 충전된 폴리펩티드 베시클의 안정성은 개인적 간호 제품에서 약물 전달에 걸친 대부분의 적용에서 사용시에 중요하다. K60L20 베시클은 높은 염 농도 (>0.5 M) 에서 불안정하고 다발이 되지만, 그들은 혈청-프리 DMEM 세포 배지 (cell culture media) 뿐만 아니라 100 mM PBS 완충제 속에서 안정하다 (E. P. Holowka, D. J. Pochan, and T. J. Deming, J Am Chem Soc 127, 12423 (2005)). 음이온성 단백질을 함유하는 혈청의 첨가는, 필시 혈청 단백질과 반대로 충전된 폴리리신 사슬 사이의 폴리이온 착화로 인해 베시클 붕괴를 야기한다. 따라서, 우리는, E60L20 을 이용하여 제조된 음으로 충전된 폴리펩티드 베시클이 10 % 우태혈청 (fetal bovine serum) 을 갖는 DMEM 에서 안정하다는 것을 발견하였다. 이러한 결과에 기초하여, 우리는, 이들 충전된 폴리펩티드 베시클이 리포솜에 대한 대체물로서 수용성 용질에 대한 밀봉제 (encapsulant) 로서의 가능성을 나타낸다고 확신한다. 이들 충전된 폴리펩티드 베시클의 다른 특징은, 충전된 잔기의 주의깊은 선정에 의해, 또는 아민이나 카르복실레이트 잔기에 대한 화학적 콘쥬게이션 중 어느 것을 통해 베시클 표면에서의 친수성 폴리펩티드 사슬의 손쉬운 기능화에 대한 가능성이다. 예컨대, 우리는 최근에 아르기닌 세그먼트의 수많은 구아니디늄기로 인해 세포에 용이하게 들어갈 수 있는 아르기닌-류신 (즉, R60L20) 베시클의 제조를 보고하였다 (E. P. Holowka et al, Nat Mater 6, 52 (2007)). 이 경우, 아르기닌 잔기는 이중 역할을 수행하는데, 그들은 베시클 형성시의 구조 관리와, 세포 결합 및 진입을 위한 기능을 한다. 다기능 특성을 갖는 생체모방 멤브레인의 설계에 유리한 블록 코폴리펩티드의 주요 속성은, 폴리머 사슬 내부의 정밀한 위치에서 구조적 및 기능적 원소를 배치하는 능력이다. 본 발명의 실시형태에 있어서, 액적의 계면을 차지하는 코폴리펩티드는 또한, 그들이 적용시에 세포와 다른 타깃 물질과 상호작용하는 방식 그리고 액적 구조의 모폴로지 및 토폴로지를 제어하는 것을 포함하여, 이러한 다기능 특성을 이용할 수 있다.
그들의 구분된 내부 구조로 인해, W/O/W 더블 에멀션은, 캡슐화를 위한 심플 O/W (oil-in-water) 에멀션에 걸쳐 이점, 예를 들면, 극성 카고 (예컨대, 내부 물 액적 내의 수용성 분자 또는 수분산성 콜로이드) 와 비극성 카고 (예컨대, 외부 오일 액적 내의 유용성 분자 또는 오일 분산성 콜로이드) 의 양방을 동시에 담지하는 능력, (예컨대, 액적의 내부 표면 외부를 장식하는 분자 상의 목표로 하는 모이어티를 통해) 매우 특수한 국지화된 영역에 유용성 및 수용성 약물 분자의 전달 조합 테라피 (therapy), 뿐만 아니라 치료 분자의 일시적인 릴리즈에 대한 개선된 제어를 제공할 수 있다 (Pays, K. et al. Double emulsions: how does release occur? Journal of Controlled Release 79, 193-205 (2002); Davis, S. S. & Walker, I. M. Multiple Emulsions as Targetable Delivery Systems. Methods in Enzymology 149, 51-64 (1987); Okochi, H. & Nakano, M. Preparation and evaluation of W/O/W type emulsions containing vancomycin. Advanced Drug Delivery Reviews 45, 5-26 (2000)). 더블 에멀션의 제조는 통상 안정성을 위해 계면활성제의 혼합을 필요로 하고, 내부 액적 및 외부 액적 둘다는 100 nm 미만인 더블 나노에멀션의 형성은 예전에 결코 달성되지 못했다 (Garti, N. Double emulsions - Scope, limitations and new achievements. Colloids and Surfaces A-Physicochemical and Engineering Aspects 123, 233-246 (1997); Loscertales, I. G. et al. Micro/nano encapsulation via electrified coaxial liquid jets. Science 295, 1695-1698 (2002) ; Utada, A. S. et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science 308, 537-541 (2005)).
통상의 O/W 에멀션에 대해 특정 이점을 제공하면서, 안정한 W/O/W 에멀션은 일반적으로 종래의 방법에 따라 단일 계면활성제 및 표준 에멀션화 방법을 이용하여 동시에 형성되지 않는다 (Garti, N. Double emulsions - Scope, limitations and new achievements. Colloids and Surfaces A-Physicochemical and Engineering Aspects 123, 233-246 (1997); Morais, J. M., Santos, O. D. H., Nunes, J. R. L., Zanatta, C. F., Rocha-Filho, P. A. W/O/W Multiple emulsions obtained by one-step emulsification method and evaluation of the involved variables. Journal of Dispersion Science and Technology 29, 63-69 (2008)). 미세유체는 미크론 사이즈의 고도로 균일한 더블 에멀션을 제작하기 위해 사용될 수 있지만 (Loscertales, I. G. et al. Micro/nano encapsutation via electrified coaxial liquid jets. Science 295, 1695-1698 (2002); Utada, A. S. et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science 308, 537-541 (2005)), 그래도 다분산액 단일 에멀션을 제작하기 위한 상업적 프로세스에 비해 스루풋이 낮을 수 있다 (Mason, T. G., Wilking, J. N., Meleson, K., Chang, C. B. & Graves, S. M. Nanoemulsions: formation, structure, and physical properties. Journal of Physics-Condensed Matter 18, R635-R666 (2006)). W/O/W 에멀션을 제작하기 위한 통상의 방법은 먼저 '인버스' W/O (water-in-oil) 에멀션을 형성한 후, 계면활성제의 조합을 이용하여 수중에서의 이 혼합물의 에멀션화의 2-단계 프로세스를 수반한다 (Ficheux, M. F., Bonakdar, L., Leal-Calderon, F. & Bibette, J. Some stability criteria for double emulsions. Langmuir 14, 2702-2706 (1998); Wang, Y. F., Tao, Z. & Gang, H. Structural evolution of polymer-stabilized double emulsions. Langmuir 22, 67-73 (2006); Garti, N. Double emulsions - Scope, limitations and new achievements. Colloids and Surfaces A-Physicochemical and Engineering Aspects 123, 233-246 (1997); Goubault, C. et al. Shear rupturing of complex fluids: Application to the preparation of quasi-monodisperse water-in-oil-in-water double emulsions. Langmuir 17, 5184-5188 (2001); Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T. & Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfiuidic devices. Langmuir 20, 9905-9908 (2004)). 이 프로세스는, 두 단계에서의 에멀션이 단분산액이라면 내부 액적 체적 및 외부 액적 체적 둘다의 제어를 허용하지만, 그래도 이 프로세스를 이용하여 안정한 나노스케일 액적 (즉, 내부 액적 직경 및 외부 액적 직경 모두가 나노스케일인 것) 을 형성할 수는 없다. 또한, 이러한 접근법은 내부 액적 계면 또는 외부 액적 계면 중 어느 것도 불안정하게 하지 않고 공존할 수 있는 계면활성제 조합이라는 어려운 탐색을 요구한다 (Ficheux, M. F., Bonakdar, L., Leal-Calderon, F. & Bibette, J. Some stability criteria for double emulsions. Langmuir 14, 2702-2706 (1998)). 따라서, (예컨대, 유착 및/또는 조대화를 통해) 액적 사이즈의 진화에 대항하여 안정성을 향상시키고 응용을 위해 더블 에멀션의 개발시에 액적 사이즈를 감소시킬 필요가 있다 (Benichou, A., Aserin, A., Garti, N. Double emulsions stabilized with hybrids of natural polymers for entrapment and slow release of active matters. Advances in Colloid and Interface Science 108-109, 29-41 (2004)).
본 발명의 실시형태에 따른 에멀션은, 실질적으로 연속적인 액체 매질; 및 상기 실질적으로 연속적인 액체 매질 내부에 분산된 복수의 액적 구조를 포함한다. 본 발명의 이 실시형태에 따른 복수의 액적 구조의 각각의 액적 구조는, 외부 표면을 갖는 제 1 액체의 외부 액적; 제 1 액적 내부의 제 2 액체의 내부 액적으로서, 제 2 액체는 제 1 액체에 비혼화성이고, 내부 액적 및 외부 액적은 그 사이에 경계 표면 영역을 갖는, 상기 제 2 액체의 내부 액적; 외부 액적의 외부 표면 상에 배치된 블록 공중합체의 외부층; 및 외부 액적과 내부 액적 사이의 경계 표면 영역 상에 배치된 블록 공중합체의 내부층을 포함한다. 블록 공중합체는 친수성 폴리머 블록 및 소수성 폴리머 블록을 포함하고, 친수성 폴리머 블록 및 소수성 폴리머 블록은 함께 액적 구조를 안정화시키도록 작용하고, 제 1 액체는 상기 실질적으로 연속적인 액체 매질에 비혼화성이다.
본 발명의 실시형태에 따른 에멀션은, 액체 매질; 및 액체 매질 내부에 분산된 복수의 나노액적을 포함한다. 복수의 나노액적 각각은, 제 2 액체에 의해 둘러싸인 제 1 액체의 내부 액적을 포함하고, 제 1 액체는 제 2 액체에 비혼화성이고 제 2 액체는 액체 매질에 비혼화성이다. 복수의 나노액적은 적어도 약 10 nm 그리고 약 200 nm 미만의 앙상블 평균 (ensemble average) 직경을 갖는다.
본 발명의 실시형태에 따른 에멀션은, 실질적으로 연속적인 액체 매질; 및 실질적으로 연속적인 액체 매질 내부에 분산된 복수의 액적 구조를 포함한다. 복수의 액적 구조의 각각의 액적 구조는, 외부 표면을 갖는 액체의 액적, 및 액적의 외부 표면 상에 배치된 블록 공중합체의 층을 포함한다. 블록 공중합체는 친수성 폴리머 블록 및 소수성 폴리머 블록을 포함하고, 친수성 폴리머 블록 및 소수성 폴리머 블록은 함께 액적 구조를 안정화시키도록 작용하고, 복수의 액적 구조의 액체는 실질적으로 연속적인 액체 매질에 비혼화성이다.
본 발명의 실시형태에 따른 에멀션의 제조 방법은, 제 2 액체와 이 제 2 액체에 비혼화성인 제 1 액체를 제공하는 단계; 제 1 액체 및 제 2 액체 중 적어도 하나에 선택된 양의 블록 공중합체를 첨가하는 단계; 및 제 2 액체 내에 제 1 액체를 에멀션화하여 제 2 액체 내에 분산된 제 1 액체의 복수의 액적을 제조하는 단계를 포함한다. 블록 공중합체는 상기 복수의 액적이 유착하는 것으로부터 안정화시킨다.
본 발명의 실시형태에 따른 에멀션의 제조 방법은, 제 1 액체 및 제 2 액체 중 적어도 하나에 계면활성제를 첨가하는 단계, 또는 제 1 액체 및 제 2 액체 중 적어도 하나에 계면활성제 전구체를 첨가하는 단계 중 적어도 하나의 단계; 제 2 액체 내에 제 1 액체를 에멀션화하여 제 2 액체 내에 침지된 제 1 액체의 복수의 액적을 형성함으로써 심플 에멀션 (simple emulsion) 을 제공하는 단계로서, 제 1 액체는 제 2 액체에 비혼화성인, 상기 심플 에멀션을 제공하는 단계; 상기 계면활성제 또는 상기 계면활성제 전구체 중 적어도 하나를 제 3 액체에 첨가하는 단계; 및 제 3 액체 내에 심플 에멀션을 에멀션화하여 심플 에멀션의 복수의 액적을 형성함으로써 더블 에멀션 (double emulsion) 을 제공하는 단계로서, 제 2 액체는 제 3 액체에 비혼화성인, 상기 더블 에멀션을 제공하는 단계를 포함한다. 더블 에멀션의 복수의 액적 각각은 그 내부에 제 1 액체의 적어도 하나의 액적을 포함한다.
본 발명의 추가적인 특징은, 도면과 관련하여 발명의 다양한 실시형태의 하기 상세한 설명에 제공된다. 또한, 본 발명의 상기 서술된 이점 및 다른 부수적인 이점은 상세한 설명을 참조하여 첨부 도면과 관련하여 취해질 때 더욱 잘 이해될 것이다.
도 1 의 A 및 B 는 1.0 ㎛ 폴리카보네이트 (PC) 멤브레인 (바 (bar) = 5 ㎛) 을 통해 압출된 폴리펩티드 베시클의 1% (w/v) 현탁액의 DIC (Differential Interference Contrast) 를 이용한 광학 현미경사진을 도시한다. (A) = K60L20 및 (B) = E60L20. 도 1 의 C 는 0.1 ㎛ PC 멤브레인 (바 = 350 nm) 을 통해 여과된 우라닐 아세테이트 네거티브 스테인드 (negatively stained) 0.1 % (w/v) K60L20 베시클 현탁액의 TEM 이미지를 나타낸다. 도 1 의 D 는 PC 멤브레인 포어 사이즈의 함수로서 K60L2O (가득 찬 원형) 및 E60L2O (속이 빈 마름모꼴) 의 베시클의 1 % (w/v) 수계 현탁액의 평균 직경을 도시한다. 베시클 직경은 동적 광 산란 (DLS : dynamic light scattering) 을 이용하여 구하였다.
도 2 의 A 및 B 는 에멀션화를 위해 사용되는 개략적인 대표적 블록 코폴리펩티드, 각각 KxrLy 및 KxLy 를 도시한다. 도 2 의 C 는 KxrLy 블록 코폴리펩티드를 이용하여 W/O/W (water-in-oil-in-water) 더블 에멀션을 발생시키는 본 발명의 몇몇 실시형태에 따른 에멀션화 프로세스의 개략도이다. 도 2 의 D 는 KxLy 블록 코폴리펩티드를 이용하여 단일 O/W (oil-in-water) 에멀션을 발생시키는 본 발명의 몇몇 실시형태에 따른 에멀션화 프로세스의 개략도이다. 도 2 의 C 및 D 에 대해, 단계 (i) 는 마이크로스케일 액적을 제조하기 위해, 로터리 믹서를 이용하여 제조될 수 있는 바와 같은 통상의 에멀션화를 나타내고, 단계 (ii) 는, 나노스케일 액적을 제조하기 위해, 미세유체 균질기 (microfluidic homogenizer) 를 이용하여 제조될 수 있는 바와 같은, 더욱 심한 에멀션화를 나타낸다. 더블 에멀션 및 다이렉트 에멀션에 대해, 계면에서의 코폴리펩티드를 도시하는, 결과로서 생기는 액적 구조의 계면의 상세도가 또한 각각 도 2 의 C 및 D 의 우측에 개략적으로 도시되어 있다.
도 3 의 A 내지 D 는 미세유체 균지기 (75 ㎛ 채널 치수 상호작용 챔버가 장착된 Microfluidics Microfluidizer? 11OS) 를 이용하여 제조된 KxrLy 블록 코폴리펩티드 더블 에멀션에 대한 동적 광 산란 (DLS) 데이터 및 극저온 투과 전자 현미경 (Cryo-TEM) 이미지를 도시한다. 모든 에멀션은 하기 조건 하에서 제조되었다 : 미세유체 균질기를 통한 별도 패스 (pass) 의 수 N = 6, 미세유체 균질기에 대한 입력 공기 압력 p = 130 psi, 수중에서의 코폴리펩티드 농도 C = 1 mM 및 전체 오일 체적 분율 φ = 0.20. 오일은 10 sCt 점도를 갖는 폴리디메틸실록산 (PDMS) 실리콘 오일이다. DLS 데이터로부터의 액적 반경은 큐뮬런트 분석을 이용하여 구하였다. KxrLy 에멀션의 Cryo-TEM 이미지 (바 = 100 nm), (A) = K4OrL5, (B) = K4OrL10, (C) = K4OrL20, 및 (D) = K4OrL30. 도 3 의 E 는 코폴리펩티드에서의 K 및 rL 블록의 길이의 함수로서 DLS (나노미터) 에 의한 더블 에멀션의 측정된 유효 액적 반경 (외부 액적 반경 부근) 을 도시한다. 도 3 의 F 는 Cryo-TEM 이미지로부터 측정된 K4OrL10 에 대한 외부 액적 반경에 대한 내부 액적 반경의 비율의 히스토그램 (즉, 확률 분포) 이다. 도 3 의 G 는 K40rL10 에 대한 블록 공중합체 농도 C (mM) 의 함수로서의 평균 액적 반경, <a> (nm) 를 도시한다. 이 농도는 이 코폴리펩티드가 가용성인 수계 상에 대응한다. 도 3 의 H 는 고정된 K40 블록 길이에서의 라세믹-류신 (rL) 블록 길이의 함수로서의, DLS 에 의해 구해진 평균 액적 반경, <a> (nm) 를 도시한다.
도 4 의 A 내지 D 는 W/O/W 더블 에멀션 액적의 사이즈를 조정하는 방법을 상술하는 이미지를 도시한다. 도 4 의 A 는 초음파 팁 균질기 (ultrasonic tip homogenizer) (바 = 5 ㎛) 를 이용하여 제조된 0.1 mM FITC 라벨링된 K40rL10 에멀션 (전체 오일 체적 분율 φ = 0.20, 10 sCt PDMS 실리콘 오일) 의 레이저 공초점 주사형 현미경 (LSCM) 이미지를 도시한다. 도 4 의 B 내지 D 는 미세유체 균질기 (75 ㎛ 상호작용 챔버) 를 이용하여 제조된 에멀션이다. (B) K4OrL10 에멀션의 Cryo-TEM 이미지 : N = 6, p = 130 psi, C = 1 mM 및 φ = 0.20 (바 = 100 nm). (C) K4OrL20 에멀션의 초원심분리에 의해 분리된 플러그의 Cryo-TEM 이미지 : N = 6, p = 130 psi, C = 1.5 mM 및 φ = 0.20, (바 = 100 nm). (D) K4OrL20 에멀션의 초원심분리 및 분리에 의해 획득되는 보다 작은 더블 나노에멀션의 잔여물 현탁액 : N = 6, p = 130 psi, C = 1.5 mM 및 φ = 0.20, (바 = 100 nm). 도 4 의 E 는 코폴리펩티드 농도의 함수로서 DLS 에 의해 구한 K4OrL20 에멀션의 평균 액적 반경, <a> 를 도시한다 : N = 6, p = 130 psi, C = 0.1 내지 1.5 mM 및 φ = 0.20. 도 4 의 F 는 라세믹-류신 (rL) 블록 길이 y 의 함수로서 DLS 에 의해 구한 K4OrLy 의 평균 액적 반경, <a> 을 도시한다 : N = 6, p = 130 psi, C = 1 mM 및 φ = 0.20.
도 5 의 A 는 초음파 팁 균질기 (10 초, 바 = 5 ㎛) 를 이용하여 제조된 FITC 라벨링된 0.1 mM K4OrL1O 더블 에멀션 (φ = 0.20, 10 cSt PDMS 실리콘 오일) 의 LCSM 이미지를 도시한다. FITC 라벨링된 코폴리펩티드는 녹색 형광을 발한다. 도 5 의 B 는 10 cSt 실리콘 오일 (φ = 0.20) 의 외부 액적 내의 0.01 M 피렌 (청색 형광을 발함) 및 내부 수계 액적 (바 = 5 ㎛) 내의 나노스케일 InGaP/ZnS 퀀텀 도트 (적색 형광을 발함) 에 의해 초음파 균질기 (10 초) 를 이용하여 제조된 FITC 라벨링된 C = 0.1 mM K4OrL1O 더블 에멀션의 다중색상 현광 현미경사진 오버레이를 도시한다.
도 6 의 A 내지 B 는 초음파 팁 균질기 (10 초) 를 이용하여 제조된 FITC 라벨링된 0.1 mM 코폴리펩티드 더블 에멀션 (φ = 0.20, 10 cSt PDMS 실리콘 오일) 의 LCSM 이미지를 도시한다. (A) = K60L20, (B) = K4OrL1O. 도 6 의 C 는 미세유체 균질기를 이용하여 제조된 1.0 mM E40rL10 에멀션의 cryo-TEM 이미지를 도시한다 : N = 6, p = 130 psi, C = 1 mM 및 φ = 0.20 (바 = 250 nm). 도 6 의 D 는 미세유체 균질기를 이용하여 제조된 1.0 mM K40rL10 의 Cryo-TEM 이미지를 도시한다 : N = 6, p = 130 psi, C = 1 mM 및 φ = 0.20 (바 = 250 nm). 도 6 의 E 는, 다른 패널에 대해 유사한 폴리펩티드 농도 및 전체 오일 체적 분율에서 유사한 외부적 여기 (excitation) 를 이용한 에멀션 및/또는 더블 에멀션을 제작하고자 하는 유사한 시도 이후에 수용성 K60 호모폴리머 폴리펩티드에 의해 오일의 비-에멀션화로 인해 실리콘 오일과 물의 상분리의 사진을 도시한다.
도 7 의 A 내지 C 는 하기 조건 하에서 미세유체 균질기를 이용하여 제조된 Kx(rac-L)y 안정화된 더블 에멀션에 대한 CTEM 이미지를 도시한다 : 패스의 수 N = 6, 균질기 인렛 공기 압력 p = 130 psi, 블록 코폴리펩티드 농도 C = 1.0 mM, 및 전체 오일 체적 분율 φ = 0.20 (PDMS 실리콘 오일 10 cSt). (바 = 200 nm) : (a) = K40(rac-L)5, (b) = K40(rac-L)10, 및 (c) = K40(rac-L)30. 도 7 의 D 는 K40(rac-L)10 에멀션의 cryo-TEM 이미지에서 관찰되는 적어도 50 개의 더블 에멀션 액적으로부터 내부 반경 ai 및 외부 반경 ao 를 측정함으로써 구한 외부 반경 ao 에 대한 내부 반경 ai 의 비율 (즉, I/O 비율) 의 함수로서 관찰된 확률 분포 (%) 를 표시하는 히스토그램을 도시한다.
도 8 의 A 내지 D 는 더블 에멀션을 안정화시키기 위해 사용되는 다양한 블록 코폴리펩티드의 cryo-TEM (CTEM) 이미지를 도시한다. 하기 조건 하에서 미세유체 균질기를 이용하여 제조된 (도 8 의 A) R40(rac-L)10 (중합시에 사용된 R = L-아르기닌 하이드로브로마이드) 및 (도 8 의 B) E40(rac-L)10 (중합시에 사용된 E = L-글루타민산 나트륨 염) 안정화된 더블 에멀션의 CTEM 이미지 : N = 6, 균질기 인렛 공기 압력 p = 130 psi, 블록 코폴리펩티드 농도 C = 1.0 mM, 및 오일 체적 분율 φ = 0.20 (PDMS 실리콘 오일 10 cSt). 블록 코폴리펩티드 농도 C = 1.O mM 및 오일 체적 분율 φ = 0.20 (PDMS 실리콘 오일 10 cSt) 로 1 분간 초음파 균질기를 이용하여 생성된 (도 8 의 C) K60(rac-V)20 (V = 발린) 및 (도 8 의 D) K60(rac-A)20 (A = 알라닌) 안정화된 더블 에멀션의 CTEM 이미지. 모든 스케일 바 = 200 nm.
도 9 의 A 및 B 는 코폴리펩티드의 에멀션화 특성의 비교를 도시한다. (도 9 의 A) 블록 코폴리펩티드 농도 C = 0.1 mM, 및 오일 체적 분율 φ = 0.20 으로 1 분간 초음파 균질기를 이용하여 생성된 K60L20 및 K40(rac-L)20 계면활성제를 사용하여 오일상으로서 톨루엔을 함유하는 에멀션의 사진. 이 이미지는 에멀션화 3 시간 후에 찍었으며, 여기서 K60L20 샘플은 현저한 상분리를 나타냈다 (최상부에 오일층). (도 9 의 B) 계면활성제로서 호모폴리펩티드 K60 을 사용하여 PDMS 실리콘 오일 및 물의 시도된 에멀션화의 사진. 이 샘플은 급속하게 완전히 상분리되었고, 호모폴리머 폴리펩티드 K60 은 오일-물 계면의 적절한 안정화를 제공하지 못하며 여기 동안 일시적으로 제조되었던 임의의 액적이 여기가 중지된 후에 급속하게 유착되었음을 나타낸다.
도 10 의 A 내지 C 는 더블 에멀션 액적 사이즈가 상이한 실험 파라미터에 의해 어떻게 영향을 받는지를 도시하는 동적 광 산란 (DLS) 데이터의 플롯이다. 모든 샘플은 하기 조건 하에서 미세유체 균질기 (75 ㎛ 상호작용 챔버) 를 이용하여 제조되었다 : 패스의 수 N = 6, 균질기 인렛 공기 압력 p = 130 psi. 직경은 (DLS) 상관 함수의 큐뮬런트 분석을 이용하여 구하였고, W/O/W 더블 에멀션의 평균 외부 액적 직경의 추정치이다. (도 10 의 A) 더블 액적 구조의 측정된 평균 직경 대 K4O(rac-L)20 블록 코폴리펩티드 농도 C 의 플롯. (도 10 의 B) 측정된 평균 직경 대 오일 체적 분율 φ 의 플롯. (도 10 의 C) 더블 액적 구조의 평균 직경 대 K40(rac-L)x 의 상이한 샘플에서 x 를 변화시킴으로써 획득되는 소수성 (rac-L) 길이의 플롯.
도 11 의 A 내지 D 는 에멀션의 오일상에서의 수소 결합에 대한 아세트아미드기 (PBA) 로 캡핑된 실리콘 오일의 영향을 도시하는 형광 현미경 및 CTEM 이미지이다. (도 11 의 A) 다중 내부 물 액적을 함유하는 형광 염색된 FITC-K60(rac-L)2O (L-블록은 라세믹임에 유념함) 을 사용하여 안정화된 W/O/W 더블 에멀션의 형광 현미경 이미지 : 10 초간 초음파 팁 균질기를 이용하여 생성됨 C = 0.1 mM, PBA 오일 체적 분율 φ = 0.20. (도 11 의 B) FITC-K60L2O (L-블록은 라세믹이 아님에 유념함) 에 의해 안정화된 단일 O/W 에멀션의 형광 현미경 이미지 : 10 초간 초음파 팁 균질기를 이용하여 생성됨 C = 0.1 mM, PBA 오일 체적 분율 φ = 0.20. (도 11 의 C) 오일상으로서 PBA 를 사용하여 제조된 다중 내부 물 액적을 가진 나노스케일 W/O/W 더블 에멀션 액적의 CTEM 이미지. (도 11 의 D) 대조군 오일상으로서 300 cSt PDMS (PBA 와 동일한 점도) 를 사용한 나노스케일 더블 에멀션 액적의 CTEM 이미지로서, 여기서 단일 내부 수계 액적이 우세하다. (도 11 의 C) 및 (도 11 의 D) 에 대한 에멀션 샘플은 하기 조건 하에서 미세유체 균질기 (75 ㎛ 상호작용 챔버) 를 이용하여 K60(rac-L)2O 에 의해 제조되었다 : 패스의 수 N = 6, 균질기 인렛 공기 압력 p = 130 psi, 블록 코폴리펩티드 농도 C = 1.0 mM, 및 오일 체적 분율 φ = 0.20. 스케일 바 : (도 11 의 A) 및 (도 11 의 B) = 5 ㎛; (도 11 의 C) 및 (도 11 의 D) = 100 ㎛. PBA = 비스[3-(아세트아미도)-프로필] 말단 폴리디메틸실록산 (수-가중된 분자량 Mn = 2,500 및 점도 300 cSt).
도 12 의 A 내지 C 는 미세유체 균질기를 이용하여 제조된 코폴리펩티드-안정화된 단일 및 더블 에멀션에 대한 극저온 투과 전자 현미경 (CTEM) 이미지를 도시하며, L-블록의 라세믹 성질이 발생된 에멀션의 종류에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 나타낸다. 유리화된 물은 경량 백그라운드 및 실리콘 오일을 제공하고, 이는 보다 높은 원자 번호 원자의 보다 큰 밀도를 가지며, 보다 어두우며, 콘트라스트를 제공한다. 에멀션은 하기 조건 하에서 제조되었다 : N = 6, p = 130 psi, C = 1.0 mM, 및 오일 체적 분율 φ = 0.20 (PDMS 실리콘 오일 10 cSt). (도 12 의 A) K40(rac-L)20 안정화된 W/O/W 더블 에멀션의 CTEM 이미지. (도 12 의 B) K60L20 안정화된 단일 O/W 에멀션의 CTEM 이미지. (도 12 의 C) 저속 원심분리 이후 초원심분리 (약 3,000 내지 약 25,000 RPM 의 통상 속도로 버킷 로터를 회전시키는 SW28 을 갖는 Beckman 초원심분리기를 이용) 에 의해 K40(rac-L)2O 안정화된 더블 에멀션으로부터 분리된 사이즈-분획화된 액적의 CTEM 이미지. 모든 바 = 200 nm.
도 13 의 A 및 B 는 극성 및 비극성 카고를 함유하는 더블 에멀션의 형광 현미경사진을 도시한다. 샘플은 초음파 팁 균질기 (35 % 전원에서 10 초) 를 이용하여 φ = 0.2 및 C = 0.1 mM 로 제조되었다. 오일상은 포획된 피렌 (0.01 M) 으로 인해 청색 형광을 발하고, 존재하는 경우에 내부 수계 상은 InGaP 퀀텀 도트 (2 μM 의 농도에서) 의 캡슐화로 인해 적색 형광을 발한다. 폴리펩티드는 플루오레세인 (FITC) 에 의한 레벨링으로 인해 녹색 형광을 발한다. 촬상 이전에, 액적에 대해 순수로 투석하고 후속하여 순수로 희석하여, 외부적 연속적인 수계 상으로부터 대부분의 퀀텀 도트 (따라서 적색 형광) 를 제거하였다. (도 13 의 A) 외부 오일 액적 내의 피렌 (청색 형광) 및 내부 물 액적 내의 퀀텀 도트 (적색 형광) 가 로딩되어 있는 FITC-라벨링된 K40(rac-L)10 안정화된 W/O/W (water-in-oil-in-water) 더블 에멀션. (도 13 의 B) 오일 액적 내의 피렌 (청색 형광) 이 로딩되어 있는 FITC-라벨링된 K60L20 안정화된 O/W (oil-in-water) 에멀션. K60L20 이 다이렉트 에멀션을 형성하기 때문에, 액적 내부에 적색 형광이 보여지지 않으며, 이러한 특정 조성물에 대해 내부 물 액적의 부재를 확인한다. 양방의 스케일 바는 5 ㎛ 이다.
도 14 는 초순수 내에서의 블록 코폴리펩티드 용액 (1.0 mg/mL) 의 원형 이색성 스펙트럼을 도시한다. (rac-K)60L2O 샘플에서의 208 및 222 nm 에서의 극소는
Figure 112010016960120-pct00002
-나선형 배좌 (conformation) 의 특징이다. ◆ = (rac-K)60L2O 및 □ = (rac-K)40(rac-L)20.
에멀션은, 통상 보다 큰 액적의 보다 작은 액적 내로의 흐름-유도 파열을 통해, 하나의 액체상 물질의 액적의 형성가능한 다른 비혼화성 액체상 물질 내의 분산물이다. 후속 액적 유착 (즉, 융합) 을 방지하고 시간 경과에 따라 액적의 사이즈 분포가 변화하지 않게 하기 위해, 표면 활성 (surface-active) 이고, 적어도 하나의 액체상에 가용성이고, 2종의 비혼화성 액체들 사이의 계면에 흡착하는 것을 선호하는 양친매성 분자로 이루어진 계면활성제가 통상 첨가된다. 심플 에멀션은 O/W (즉, oil-in-water 또는 "다이렉트") 및 W/O (즉, water-in-oil 또는 "인버스") 로서 일반적으로 분류되고, 이들 상이한 모폴로지는 적절한 안정성을 제공하는 적절한 계면활성제를 사용함으로써 획득될 수 있고, 때때로 전단 동안 성분의 첨가 순서에 의해 영향을 받을 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 아미노산, 올리고펩티드, 및 폴리펩티드 블록의 라세믹 형태를 지칭하기 위한 다음의 접두어 : 라세믹-, r, r- 및 rac- 그리고 유사한 공통 접두어 약자는 상호교환가능하게 (interchangeably) 사용된다. 마찬가지로, 극저온 투과 전자 현미경을 지칭하기 위한 cryo-TEM 및 CTEM 은 상호교환가능하게 사용된다. 미세유체 균질기에 대한 동일한 입력 가스 압력을 지칭하기 위한 변수 p 및 P 는 상호교환가능하게 사용되고, 전체 오일 체적 분율을 지칭하기 위한 변수 φ 및 Φ 는 상호교환가능하게 사용된다.
마이크로스케일 액적으로 구성되는 O/W (oil-in-water) 에멀션은 수세기 동안 이루어진 일반적인 제품이다. 간단한 예로는 통상 달걀 노른자위로부터 만들어진 마요네즈가 있으며, 마요네즈는 안정화하는 양친매성 지방질와 단백질 분자, 및 그 혼합물을 거품기 또는 스푼으로 뒤섞으면서 얇은 스트림으로 첨가되는 올리브 오일을 함유한다. 액적이 보다 작은 사이즈로 파열됨에 따라 생성되는 추가적인 액적 계면 영역에 기계적 전단 에너지의 일부가 저장된다. 통상의 기계적 디바이스는 액적이 통상 약 300 nm 인 액적 직경에 이르도록 파열이 달성될 수 있는 전단 레이트를 생성할 수 있지만, 사이즈 분포에서의 피크의 감소를 이러한 하한 미만으로 달성하는 것이 매우 어렵다. 역사적으로, 서브-미크론 에멀션은 "미니-에멀션"으로서 알려져 있고, 이들은 과거 20 년 동안 미세 유체 및 초음파 수단을 이용하여 생성되었다. 본 명세서에 사용되는 용어 에멀션화는, 일 비혼화성 액체의 다른 비혼화성 액체에 의해 실질적으로 둘러싸인 별도 액적을 형성하기 위해, 근접하여 및/또는 접촉하여 배치되는 2종의 비혼화성 액체 (각각이 그 내부에 혼합된, 블렌드된, 및/또는 현탁된 추가적인 성분을 포함할 수 있음) 를 여기시키고, 비-열적 에너지의 몇몇 형태를 도입하여 2종의 액체들 사이의 계면 경계를 여기시키고 파열하는 프로세스를 포함할 수 있는 넓은 의미를 가지도록 의도된다. 에멀션화 동안, 보다 큰 액적이 통상 보다 작은 액적으로 (예컨대, 보다 큰 액적이 충분히 변형될 때 발현되는 계면 모세관현상 불안정성을 통해) 분해됨으로써, 추가적인 계면 영역을 형성한다. 또한, 에멀션화 동안, 단일 에멀션, 더블 에멀션, 보다 높은 차수의 다중 에멀션, 및 그 조합이 형성될 수 있다. 에멀션화의 상술한 방법은 매우 작은 액적에서도 확장 및 파열할 수 있는 매우 높은 전단 레이트 또는 유량을 제공한다. 실제로, 액적을 나노스케일 도메인 (평균 액적 사이즈가 100 nm 미만임) 으로까지 획득한 초음파 분산기 또는 미세유체 균질기의 사용의 문헌에 보고되어 있다. "사이즈" 는 반경을 지칭하는지 또는 직경을 지칭하는지에 있어 다의성이지만, 2 내지 3 nm 의 교질입자 스케일로부터 거시적인 치수를 갖는 액적에 이르기까지 존재할 수 있는 광범위한 액적 사이즈를 고려하면, 두개의 이 인자는 매우 사소한 문제이다.
여기서, 우리는 W/O/W 더블 에멀션이 간단한 프로세스로 제조될 수 있고 본 발명의 몇몇 실시형태에 따라 단일-성분, 합성 양친매성 디블록 코폴리펩티드 계면활성제를 사용하여 수개월에 걸쳐 안정화될 수 있음을 나타낸다. 이들 계면활성제는 심지어 극심한 흐름에 의해 액적을 안정화시켜, 나노스케일 내부 액적 및 또한 나노스케일 외부 액적을 갖는 강건한 W/O/W 더블 에멀션의 직접 양산으로 이어지고, 따라서 식품, 화장품, 및 약물 전달에 있어서 나노구조의 캡슐화 적용에 쉽다.
양친매성 디블록 폴리펩티드가 베시클을 형성하는 그들의 성향을 반영하는 자기-조립의 특징을 가질 뿐만 아니라 오일-물 계면에서 계면활성제로서도 작용할 수 있기 때문에, 우리는 본 발명의 몇몇 실시형태에 따라 복잡한 액적 토폴로지에 대해 편중되지 않는 단일 계면제 및 최소의 전단을 이용하여 안정한 더블 에멀션을 발생시키는 가능성을 검토하였다.
본 발명의 몇몇 실시형태에 따라 양친매성 디블록 코폴리펩티드에 의해 안정화된, 더블 에멀션 및 더블 나노에멀션뿐만 아니라, 다이렉트 에멀션 및 나노에멀션도 제작할 수 있음을 발견하였다. 본 발명의 몇몇 실시형태에 따른 결과는, 실제로, 친수성 블록 및 소수성 블록의 광범위한 분자량에 대해, 전단을 적용한 후의 바람직한 모폴로지는 더블 에멀션임을 나타낸다. 더블 에멀션은 약물 전달 운반체, 예컨대, 수용성 약물 및 유용성 약물 둘다를 패키지화할 수 있는 약물 전달 운반체를 제공할 수 있다. 또한, 더블 에멀션 액적을 안정화시키는 코폴리펩티드는 또한, 생물학적 세포 타깃, 세포와 아세포 (subcellular) 의 멤브레인 붕괴, 및 효소 기능성과 같은 바람직한 생화학적 상호작용을 제공하도록 가공 및 맞춤될 수 있고, 이는 액적 구조에 통합될 수도 있는 약물 분자의 성능 및 전달을 증대시킬 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시형태에 따른, 에멀션의 제조 방법, 제조되는 에멀션 및 에멀션 내부의 액적 구조는, 도 2 의 C 및 D 에 개략적으로 도시되어 있다. 본 발명의 실시형태에 따른 방법은, 제 2 액체와 이 제 2 액체에 비혼화성인 제 1 액체를 제공하는 단계, 제 1 액체 및 제 2 액체 중 적어도 하나에 선택된 양의 블록 공중합체를 첨가하는 단계, 그리고 제 2 액체 내에 제 1 액체를 에멀션화하여 제 2 액체 내에 분산된 제 1 액체의 복수의 액적을 제조하는 단계를 포함한다. 블록 공중합체는 유착 또는 다른 불안정한 메커니즘을 통해 잠재적으로 발생할 수 있는 조대화 또는 다른 구조적 진화에 대항하여 복수의 액적을 안정화시키도록 작용한다. 블록 공중합체는 블록 코폴리펩티드일 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다. 또한, 블록 코폴리펩티드는 자연 발생 및/또는 합성 모노머로부터 형성될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 몇몇 실시형태에 따르면, 제 1 액체 및 제 2 액체는 오일 (예컨대, 비극성) 및 물 (예컨대, 극성) 일 수 있고, 또는 그 반대일 수도 있다. 그러나, 본 발명은 비혼화성 액체의 유일한 쌍으로서 단지 오일 및 물에 한정되지 않는다. 본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 비혼화성인 다른 종류의 극성 및 비극성 액체-유사 물질 (예컨대, 잠재적으로 또한 비혼화성인 불화-오일 및 탄화수소-오일) 이 사용될 수도 있다. 따라서, 본 명세서 및 청구범위에서 용어 소수성 및 친수성이 사용될 경우, 이들 용어는 보다 넓게, 상이한 종류의 비혼화성 액체 또는 비혼화성 액체-유사 물질 사이의 분자 상호작용에 있어서의 상대적인 차이를 지칭하도록 의도된다.
본 발명의 실시형태에 따른 에멀션은 실질적으로 연속적인 액체 매질, 및 상기 실질적으로 연속적인 액체 매질 내부에 분산된 복수의 나노액적을 포함할 수 있다. 도 2 의 C 및 D 는 2 가지 예시의 에멀션, 즉 더블 에멀션 (도 2 의 C) 및 다이렉트 에멀션 (도 2 의 D) 을 도시한다. 그러나, 본 발명의 다른 실시형태에 따라 보다 고차의 에멀션이 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에 따른 액적 구조는 외부 표면을 갖는 제 1 액체의 외부 액적과, 제 1 액적 내부의 제 2 액체의 내부 액적, 제 2 액체는 제 1 액체에 비혼화성이고, 내부 액적 및 외부 액적은 그 사이에 경계 표면 영역을 가진다. 액적 구조는 또한 외부 액적의 외부 표면 상에 배치되는 블록 공중합체의 외부층, 및 외부 액적과 내부 액적 사이의 경계 표면 영역 상에 배치되는 블록 공중합체의 내부층을 포함할 수 있다. 용어 "상에 배치된" 은, 그 표면 상으로 흡착을 포함할 수 있지만 이것에 한정되지 않는 일반적인 용어로서 의도된다. 예컨대, 도 2 의 C 및 D 의 우측의 액적에 개략적으로 도시되어 있듯이, 블록 공중합체는 액적의 부분 내로 연장하는 부분, 및 표면 영역에서 액적 외로 연장하는 다른 부분을 가질 수도 있다. 용어 "층" 은, 층이 완전히 에워싸인 표면을 형성하지 않는 경우뿐만 아니라 층이 침투가능한 경우를 포함할 수 있는, 블록 공중합체가 액적의 표면 영역 부근에 느슨하게 배치되어 있는 경우를 포함하는 넓은 용어로서 의도된다. 블록 공중합체는 친수성 폴리머 블록 및 소수성 폴리머 블록을 포함할 수 있으며, 그 친수성 폴리머 블록 및 소수성 폴리머 블록은 함께 액적 구조를 안정화시키도록 작용한다. 도시된 블록 공중합체층은 개략적인 표현이며, 일정한 비율로 되어 있지 않을 수도 있다. 제 1 액체는 본 발명의 이 실시형태에 따라 실질적으로 연속적인 액체 매질에 비혼화성이다.
안정한 더블 에멀션을 형성하는 대부분의 조성에 대해, 계면 상에 배치되는 블록 공중합체는 평형 열적 변동에 대응하는 "열 에너지" 보다 상당히 더 강한 상호작용의 반발하는 포텐셜 에너지 (kBT) 를 제공하는데, 여기서 kB 는 볼츠만 상수이고 T 는 본 발명의 몇몇 실시형태에 따라 포함되는 내부 액적의 계면과 외부 액적의 계면 사이의 온도이다. 추가적으로, 안정한 더블 에멀션을 형성하는 대부분의 조성에 대해, 블록 공중합체는 또한 열 에너지보다 상당히 더 강한 다른 외부 액적과 조우하는 외부 액적의 계면들 사이의 상호작용의 반발하는 포텐셜 에너지를 제공한다. 안정한 더블 에멀션을 형성하는 몇몇 조성에 대해, 블록 공중합체는 열 에너지보다 상당히 더 큰 외부 액적 내부의 다중 내부 액적의 계면들 사이의 상호작용의 반발하는 포텐셜 에너지를 제공할 수 있다. 그럼에도 불구하고 상기 서술된 상호작용의 반발하는 포텐셜 에너지는, 액체 계면들 사이의 상호작용의 끌어당기는 포텐셜 에너지와 또한 공존하는 것이 가능하다. 이러한 상호작용의 끌어당기는 포텐셜 에너지는, 유착을 야기하지 않고 필름 파열을 야기하지 않고 또한 단일, 더블 및 다중 에멀션에서의 액적 구조의 무결성을 파괴하지 않을 방식으로 외부 액적, 내부 액적, 또는 그 조합의 응집물로 이어질 수 있다. 상호작용의 임의의 이러한 끌어당기는 포텐셜은 액적 계면들 사이의 상호작용 포텐셜에서 제 2 극소의 형성으로 이어질 수도 있지만, 그래도 이것은 액적 구조가 불안정화될 것임을 반드시 함축하지는 않는다. 상호작용의 이러한 끌어당기는 포텐셜 에너지의 예는 연속적인 액체상으로 존재할 수도 있는 과잉 공중합체 함량의 결과로서 외부 액적들 사이에 일어날 수도 있는 공핍 인력이다.
W/O/W 더블 에멀션에 대해, 계면들에서 흡착된 양친매성 분자에 의해 수여되는 내부 물-오일 계면의 표면과 외부 오일-물 계면의 표면 사이의 오일 필름의 계면 안정성이 내부 및 외부 액적 사이즈의 진화에 대항하여 액적의 장기 안정성을 보장하는데 중요할 수 있지만, 추가적인 포텐셜 인자는 액적의 장기 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 하나의 잠재적인 인자는, 더블 에멀션 액적 내부의 액체상으로 로딩되는 물질의 친수성 함량 및/또는 소수성 함량 중 어느 것으로 인해 삼투압 및/또는 삼투압들의 잠재적인 존부이다. 예컨대, 더블 에멀션을 제조하는 몇몇 방법에 있어서, 내부 물 액적이 과잉 코폴리펩티드를 함유할 수 있고, 그 일부는 내부 물 액적의 표면에서 물-오일 계면에서만이 아니라 내부 액적의 수상으로 존재한다. 이러한 과잉 폴리머는 삼투압을 생성할 수 있다. 때때로, 수용성 물질 및/또는 수분산성 물질에 의해 이러한 삼투압이 생성되는 것은, 오스트발트 성숙 (Ostwald ripening) 과 같은 장기 조대화 프로세스에 대항하여 액적을 안정화시키는데 바람직할 수 있다. 다른 잠재적인 인자는 잠재적으로 삼투압을 생성할 수 있는 모든 더블 액적의 외측에 연속적인 수상에서의 가용성 물질의 잠재적인 존재이다. 또 다른 잠재적인 인자는 잠재적으로 삼투압을 생성할 수 있는 외부 오일 액적 내의 유용성 물질 및/또는 오일-분산성 물질의 잠재적인 존재이다. 각각의 다른 물질 각각에 있어서의 오일, 물 및 다른 물질의 상대적 용해도 및 이들 잠재적인 삼투압의 상대적 차이는 또한, 내부 액적 및 외부 액적의 사이즈를 잠재적으로 변화시킬 수 있는 물질의 이동에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있다. 몇몇 더블 에멀션에 대해 이루어진 장기 관찰은, 본 발명의 특정 실시형태에서 내부 액적 및 외부 액적 사이즈의 상당한 안정성이 달성될 수 있음을 나타낸다.
더블 에멀션 액적의 에멀션화와 동시에 또는 그에 후속하여, 내부 액적에서의 액체 물질의 변경이 이루어질 수 있고, 이러한 변경을 이용하여 고체화하거나 또는 내부 액적 물질에 탄성 구조를 도입할 수 있다. 더블 에멀션 액적의 에멀션화와 동시에 또는 그에 후속하여, 외부 액적에서의 액체 물질의 변경이 이루어질 수 있고, 이러한 변경을 이용하여 고체화하거나 또는 외부 액적 물질에 탄성 구조를 도입할 수 있다. 더블 에멀션 액적의 에멀션화와 동시에 또는 그에 후속하여, 더블 액적 외측의 연속적인 액체 물질의 변경이 이루어질 수 있고, 이러한 변경을 이용하여 고체화하거나 또는 연속적인 액체 물질에 탄성 에멀션 구조를 도입할 수 있다. 더블 에멀션 액적의 에멀션화와 동시에 또는 그에 후속하여, 내부 액적의 액체 물질의 변경, 외부 액적의 액체 물질의 변경, 또는 연속상의 액체 물질의 변경, 또는 그 조합이 이루어질 수 있고, 이러한 변경을 이용하여 고체화하거나, 구조 변화를 이루거나, 및/또는 더블 액적 구조에 탄성을 도입할 수 있다. 상기 변경은, 자기-조립, 분산성 종의 유리화 (예컨대, 분산성 종들 사이의 인력을 유도함으로써), 분산성 종의 재밍 (jamming), 가용성 및/또는 분산성 종의 체적 분율의 증가 (예컨대, 내부 액적 및/또는 외부 액적에서의 저분자량 물질의 이송을 통해), 화학 반응, 광중합, 중합, 가교, 겔화, 및 상 변화에 의해 유도된 (예컨대, 온도 변화에 의해 유도됨) 고체화 및/또는 구조 변화로 이루어질 수 있다. 마찬가지로, 더블 에멀션 액적의 에멀션화와 동시에 또는 그에 후속하여, 내부 및/또는 외부 액적의 계면에서 흡착되는 양친매성 분자 층의 탄성에 영향을 미치는 구조적 변화가 또한 변경될 수 있고 제어될 수 있다. 이러한 변경은, 잠재적으로 가교하여 내부 액적 및/또는 외부 액적의 계면에서 탄성 층을 생성할 수 있는 양친매성 분자를 선택함으로써 달성될 수도 있다. 이러한 가교는 전자 방사선, 가열, 화학 반응, 또는 그 조합에 의해 유도될 수도 있다.
약물 분자의 여러 부류가 있고, 이러한 부류는 상이한 기준을 강조함으로써 상이한 방식으로 제작될 수 있다. 몇몇 약물 분자는 소수성이고, 몇몇 약물 분자는 친수성이고, 몇몇 약물 분자는 심지어 상당한 레벨의 양친매성 성질을 가진다. 약물 분자를 언급함으로써, 우리는 생체분자, 세포하 구조, 생체막, 세포질, 핵, 세포외 기질 (extracellular matrix), 세포기관 (organelle), 세포, 시냅스 (synapse), 조직 (tissue), 기관 (organ), 및 유기체 (organism) 를 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 생물학적 구조 및 생물학적 엔티티와 상호작용하고 생물학적 구조 및 생물학적 엔티티의 생존능력 및 기능에 영향을 미치는데 사용될 수 있는 모든 종류의 분자를 포함한다.
에멀션, 더블 에멀션, 및 다중 에멀션의 액체상으로 도입될 수 있는 약물 분자 또는 복수의 약물 분자의 제제 (formulation) 와 같은 약물은 : 땀 억제제 (anti-perspirant drug), 가려움 방지제 (anti-itch drug), 항감염제 (anti-infection drug), 소염제 (antiinflammatory drug), 관절염 치료제 (anti-arthritis drug), 활액낭염 치료제 (anti-bursitis drug), 여드름 치료제 (anti-acne drug), 항통증제 (anti-pain drug), 항두통 약물 (anti-headache drug), 항편두통 약물 (anti-migraine drug), 항인플루엔자 약물 (anti-influenza drug), 항우울제 (anti-depression drug), 항당뇨병제 (anti-diabetes drug), 항바이러스제 (anti-viral drug), 항사독소 약물 (anti-venin drug), 항진균제 (anti-funga) drug), 항 메티실린 내성(耐性) 황색포도구균 약물 (anti-(methicillin resistant staphylococcus aureus) drug), 항생제 (anti-biotic drug), 항균 (anti-bacterial), 항미생물제 (anti-microbial, anti-hunger drug), 영양실조 방지제 (anti-malnutrition drug), 항후천성면역결핍증후군 약물 (anti-(acquired immunodeficiency syndrome) drug), 항사람면역결핍바이러스 약물 (anti-(human immunodeficiency virus) drug), 항헤르페스제 (anti-herpes drug), 항간염제 (anti-hepatitis drug), 항스피로헤타 약물 (anti-spirochete drug), 항라임병 약물 (anti-(Lyme disease) drug), 항콜레스테롤 약물 (anti-cholesterol drug), 비듬 치료제 (ti-dandruff drug), 탈모 방지제 (anti-(hair loss) drug), 항피부염제 (anti-dermatitis drug), 항종창제 (anti-swelling drug), 항중독 약물 (anti-addiction drug), 치매 치료제 (anti-dementia drug), 항알츠하이머병 약물 (anti-(Alzheimer's disease) drug), 항파킨슨병 약물 (anti-(Parkinson's disease) drug), 항프리온 약물 (anti-prion drug), 항요로감염증 약물 (anti-(urinary tract infection) drug), 항정신분열제 (anti-schizophrenia drug), 항치질 약물 (anti-hemorrhoid drug), 항충제 (anti-worm drug), 항암제 (anti-cancer drug), 항발작제 (antiseizure drug), 항간질제 (anti-epileptic drug), 항조제 (anti-manic drug), 항불안제 (anti-anxiety drug), 항히스타민제 (anti-histamine drug), 항응혈제 (anti-coagulant drug), 소독제 (anti-septic drug), 항균제 (anti-bacterial drug), 항결핵 역물 (anti-tuberculosis drug), 항불면증제 (anti-insomnia drug), 항섬유조직염 약물 (anti-fibrositis drug), 항실금 약물 (anti-incontinence drug), 항피부염제 (anti-dermatitis drug), 신생혈관형성 억제제 (anti-angiogenesis drug), 항알레르기 약물 (anti-allergy drug), 항건초열 약물 (anti-(hay fever) drug), 항천식 약물 (anti-asthma drug), 항고혈압제 (anti-(high blood pressure) drug), 항혈액응고 약물 (anti-(blood clotting) drug), 항멀미약 (anti-(motion sickness) drug), 체중중가 억제제 (anti-(weight gain) drug), 체중감소 억제제 (anti-(weight loss) drug), 비만 억제제 (anti-obesity drug), 항고창 약물 (anti-flatulence drug), 항트림제 (anti-burp drug), 항변비약 (anti-constipation drug), 항말라리아제 (anti-malaria drug), 항사마귀제 (anti-wart drug), 피부화상 치료제 (anti-(skin burn) drug), 피부그을림 치료제 (anti-(skin sunburn) drug), 피부주름 치료제 (anti-(skin wrinkle) drug), 항두드러기제 (anti-hives drug), 결막염 치료제 (anti-conjunctivitis drug), 피부부스럼 치료제 (anti-(skin boil) drug), 입술 헤르페스 치료제 (anti-(cold sore) drug), 항정신제 (anti-psychotic drug), 항피부암 약물 (anti-(skin cancer) drug), 항습진제 (anti-eczema drug), 항빈혈제 (anti-anemia drug), 항황달 약물 (anti-jaundice drug), 항뇌염 약물 (anti-encephalitis drug), 치매 치료제 (anti-dementia drug), 월경전 통증 억제제 (anti-(premenstrual pain) drug), 항클라미디아제 (anti-chlamydia drug), 항원생동물제 (anti-protozoan drug), 항혈전증제 (anti-thrombosis drug), 치통 억제제 (anti-toothache drug), 이통 억제제 (anti-earache drug), 항결핵 약물 (anti-tuberculosis drug), 기관지염 치료제 (anti-bronchitis drug), 항폐렴제 (anti-pneumonia drug), 항폴리오 약물 (anti-polio drug), 항파상풍 약물 (anti-tetanus drug), 성병 치료제 (anti-(venereal disease) drug), 주의력 결여 장애 치료제 (anti-(attention deficit disorder) drug), 입술 틈 치료제 (anti-(lip chapping) drug), 항골다공증 약물 (anti-osteoporosis drug), 항심장병 약물 (anti-(heart disease) drug), 항심근경색 (anti-(heart attack) drug), 항심부전 약물 (anti-(heart failure)), 항뇌졸증 약물 (anti-stroke drug), 항부정맥제 (anti-arrhythmia drug), 말초동맥질환 치료제 (anti-(peripheral artery disease) agent), 항혈소판제 (anti-platelet agent), 협심증 치료제 (anti-anginal drug), 노화방지제 (anti-ageing drug), 기억상실 치료제 (anti-(memory loss) drug), 항고혈압제 (anti-hypertension drug), 건선 치료제 (anti-psoriasis drug), 식욕부진 치료제 (anti-anorexia drug), 설사 치료제 (anti-diarrhea drug), 항통풍 약물 (anti-gout drug), 갑상선 기능 저하증 치료제 (anti-hypothyroid drug), 장기이식거부 억제제 (anti-(organ transplant rejection) drug), 항기생충제 (anti-parasite drug), 발기부전 치료제 (anti-(erectile dysfunction) drug), 질염 치료제 (anti-vaginitis drug), 일과성 열감 억제제 (anti-(hot flash) drug), 곤충 및 거미 퇴치제 (insect and spider repellant), 마취제 (anesthesia agent), 호르몬 (hormone), 효소 (enzyme), 촉매 (catalyst), 억제제 (inhibitor), 촉진제 (promoter), 모이스처라이저 (moisturisurizer), 활력 강화제 (vitality enhancer), 피부 재생제 (skin regeneration agent), 피부 재성장제 (skin re-growth agent), 모발 성장제 (hair growth agent), 모발 재성장제 (hair re-growth agent), 주의력 강화제 (attention enhancer), 근력 강화제 (muscular strength enhancer), 남성 정력 강화제 (male potency enhancer), 여성 생식력 강화제 (female fertility enhancer), 산아제한제 (birth control agent), 충혈 완화제 (decongestant), 마취제 (anesthetic agent), 안과 치료제 (ocular treatment agent), 금연 방조제 (smoking cessation enabling agent), 니코틴 대체제 (nicotine substitution agent), 페니실린-관련 약물 (penicillin-related drug), 세팔로스포린-관련 약물 (cephalosporin-related drugs), 술파제-관련 약물 (sulfa-related drug), 마이신-관련 약물 (mycin-related drug), 내분비 약물 (endocrine drug), 심장혈관 약물 (cardiovascular drug), 폐 약물 (pulmonary drug), 중추 신경계 약물 (central nervous system drug), 위장 약물 (gastrointestinal drug), 근이완제 (muscle relaxant drug), 진정제 (sedative drug), 신경안정제 (tranquilizer), 최면제 (hypnotic drug), 진통제 (analgesic drug), 전신 마취제 (general anesthetic drug), 백신 (vaccine), 갱년기 약물 (menopause-related drug), 및 이뇨제 (diuretic drug) 를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
에멀션, 더블 에멀션, 및 다중 에멀션의 액체상으로 도입될 수 있는 이미징 증강제 (imaging enhancement) 는, 자기공명이미징 (MRI; Magnetic Resonance Imaging) 증강제, X선 컴퓨터단층촬영 (CT; Computerized Tomography) 증강제, 양전자 방사 단층촬영 (PET; Positron Emission Tomography) 증강제, 초음파 이미징 (ultrasound imaging) 증강제, 및 광학 이미징 증강제를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
비열적 에너지에 의하면, 에멀션 시스템이 단일 에멀션인지 또는 더블 에멀션인지의 여부에 관계없이, 에멀션 시스템의 성분의 평형 변동에 관련되지 않는 에너지의 모든 형태를 의미한다. 예컨대, 에멀션 시스템에서의 성분 물질의 국지적 농도의 평형 외의 불균형은 하나의 액체 물질의 액적이 외부 점성 흐름의 직접적인 적용 없이 다른 비혼화성 액체 물질 내에 형성되도록 하기에 충분히 센 엔트로피 구동 응력으로 이어질 수 있다. 이런 종류의 "자발적인 에멀션화" 는 액적의 형성을 구동하기에 잠재적으로 충분히 강할 수 있는 에멀션 시스템 내부의 성분의 화학적 포텐셜의 국지적인 차이로부터 획득된다. 따라서, 종래 기술에서의 이러한 분류에 대해 다소 숙고할 수도 있었다고 할지라도, 우리는 "자발적인 에멀션화"를 일으키는 재구성 프로세스를 비열적 에너지의 형태로서 간주한다. 게다가, 에멀션 시스템에서의 종들의 화학적 포텐셜의 "자발적인 에멀션화" 및 다른 비평형 불균형을 또한 이용하여 코폴리펩티드 안정화된 더블 에멀션의 형성을 구동할 수 있다. 그리하여, 우리는 비열적 에너지의 형태로서 의도하는 자발적인 에멀션화 및 비평형 전달 프로세스 (예컨대, 열- 및 대류-발생 화학 반응) 의 다른 형태로 이어지는 엔트로피 구동 응력을 포함한다.
도 2 의 C 는 본 발명의 몇몇 실시형태에 따라 더블 에멀션을 제조하는 예를 도시한다. 도 2 의 D 는 본 발명의 몇몇 실시형태에 따라 단일 에멀션을 제조하는 예를 도시한다. 본 발명은 다이렉트 에멀션 및 더블 에멀션에만 한정되는 것은 아니며, 액적이 단일 내부 액적만을 가지는 더블 에멀션에 한정되는 것은 아니다. 트리플 및 고차의 에멀션도 본 발명의 범위 내에 포함되도록 의도된다. 또한, 보다 큰 액적 내부에 1개, 2개 또는 3개 이상의 액적을 가지는 더블 에멀션도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 도 2 의 C 및 D 의 예에 있어서, 단계 i 이후에 초래되는 더블 에멀션 및 다이렉트 에멀션은 더블 및 다이렉트 에멀션은 미세유체 균질기 (75 ㎛ 마이크로채널 상호작용 챔버를 갖는 Microfluidizer? 110S) 로 더 프로세싱되어 액적 사이즈를 감소시킬 수 있다 (예컨대, 도 2 의 C 및 D 에서 단계 ii 이후를 참조). 초기 에멀션화 이후의 다양한 추가적인 프로세싱도 본 발명의 범위 내에서 수행될 수 있다.
양친매성 블록 코폴리펩티드, KxrLy (여기서 rL (또는 등가적으로 rac-L) 은 라세믹 올리고류신 도메인을 만족함) 는,
Figure 112010016960120-pct00003
-아미노산 N-카르복시 무수물의 전이금속 매개성 중합을 이용하여 합성되었다 (T. J. Deming, Macromolecules 32, 4500 (1999)). 블록 코폴리펩티드는 안정한 2차 구조가 결여된 라세믹 올리고류신 블록에 결합된 불규칙하게 양으로 충전된 L-리신 블록으로 구성된다 (도 2 의 A). 본 발명의 실시형태에 따라 에멀션을 형성하기 위해, 우리는 원하는 농도 (C) 로 수중에 블록 코폴리펩티드를 용해시킨 후, 오일을 첨가하여 특정한 최종 오일 체적 분율 φ 을 제공함으로써 시작하였다 (도 2 의 C). 라세믹 소수성 블록을 통상 갖는 코폴리펩티드에 대해, 핸드헬드 로터리 전단 완드 (handheld rotary shearing wand) (S8N-8G 분산 엘리먼트를 갖는 IKA Ultra-Turrax T8) 를 이용하여 전단의 적용은, 1 내지 20 ㎛ 사이즈 범위의 다분산액 (W/O/W) 더블 에멀션 액적으로 구성된 마이크로스케일 미리 혼합된 에멀션을 형성하였다 (예컨대, 단계 i 이후의 도 2 의 C). (이 단계에서의 더블 에멀션은, 종래 기술의 몇몇 종래 프로세스에서 설명한 2단계 에멀션화 또는 미세유체 유화기 (emulsifier) 없이 본 발명의 이 실시형태에 따라 획득되었음에 유념함) 그후, 이와 같이 미리 혼합된 에멀션은 인렛 가스 압력 p = 130 psi (이러한 인렛 가스 압력의 대략 240 배인 상호작용 챔버에서 액체 압력에 대응함) 를 통상 갖는 고압 미세유체 균질기 (e.g. Microfluidizer? Model 110S) 로 공급되었고, 여기서 큰 액적을 서브미크론 및 나노스케일 액적으로 전단하였다 (예컨대, 단계 ii 이후의 도 2 의 C). 선택적으로, 더욱 더 단분산액 액적을 획득하기 위해, 결과로서 생기는 서브미크론 및 나노스케일 에멀션을 N 개의 다중 패스 동안 미세유체 균질기 내로 재도입시킬 수 있고, 여기서 정수 N 은 패수 수이다. 이 방법은 대량의 서브미크론 및 나노스케일 더블 에멀션 액적을 제조하기 위한 간단한 방식을 가능하게 한다 (도 2 의 C). 이러한 에멀션화 방법에 대해, 우리는 미세유체 균질기를 통해 N 개의 별도 패스를 이용함으로써 에멀션화를 통상 수행하지만, 에멀션화를 수행하기에 또한 적합한 상호작용 챔버를 통해 에멀션의 연속적인 재순환이라는 대안적인 방법 (즉, 연속적인 재순환 에멀션화) 이 있다. 다중 패스 및/또는 재순환의 이용은 액적 구조의 전체적인 직경을 감소시키고 또한 액적 사이즈 분포의 다분산성을 감소시키는 바람직한 결과를 가질 수 있다. 유사한 방식으로, 폴리머 합성을 제어하고 맞춤한 후 동일한 물리적 에멀션화 프로세스에 의해 코폴리펩티드의 소수성 블록을 비라세믹이 되도록 변경함으로써, 코폴리펩티드로 코팅되는 다이렉트 O/W (oil-in-water) 에멀션이 또한 형성될 수 있다 (도 2 의 D).
극저온 투과 전자 현미경 (cryo-TEM or CTEM) 을 사용하여, 염색제 (staining agent) 를 도입하지 않고 아이스 속에서 급속하게 유리질화되었는 다이렉트 에멀션 및 더블 에멀션 둘다에서 흐트러짐이 없는 액적 구조를 관찰하고 이미징할 수 있다. 그 이미지는 더블 에멀션에 실제로 다양한 KxrLy 폴리펩티드 계면활성제 1.0 mM 이 형성되어 있음을 나타낸다 (도 3 의 A 내지 D). 또한, 특히 K4OrL2O and K4OrL30 의 cryo-TEM 이미지에서, 약 100 nm 이하의 직경을 갖는 액적이 큰 무리로 존재한다 (각각 도 3 의 C 및 D). 이것은 놀랍게도 용액 내의 블록 코폴리펩티드의 비교적 낮은 농도를 제공한다. 또한, 본 발명의 일 실시형태에 따라 제조되는 에멀션은 내부 액적의 구조에 관한 몇몇 흥미로운 경향을 보인다. 미세유체 균질기를 통과한 수많은 액체 및 코폴리펩티드 조성물에 대해, 오일 액적 당 하나의 내부 수계 액적만이 형성된다. 이 프로세스의 효율은 매우 높을 수 있다 (>95%). 이들 이미지 (도 3 의 A 내지 D) 로부터, 이들 샘플에서의 모든 더블 액적에 대하여 외부 액적 반경에 대한 내부 액적 반경의 비교적 일관된 비율로 있다. 내부 액적의 반경
Figure 112010016960120-pct00004
i 을 그것을 포함하는 외부 액적의 반경
Figure 112010016960120-pct00005
0 로 나눔으로써 주어지는 무차원 비율 (즉, "I/O 비율") 을 관찰하는 확률을 상술하는 히스토그램이 도 3 의 F 에 도시되어 있다. 이 히스토그램은 K4OrL1O 에멀션에 대해 약 <
Figure 112010016960120-pct00006
i/
Figure 112010016960120-pct00007
0>
Figure 112010016960120-pct00008
단조성의 피크에 대응하는 0.5 (즉, 50 %) 의 일관된 평균값을 나타낸다 (도 3 의 F). 실제로, 액적마다
Figure 112010016960120-pct00009
i 및
Figure 112010016960120-pct00010
0 의 변화가 있지만, 이미징되었는 더블 에멀션의 일부 다른 조성에 대해서도 <
Figure 112010016960120-pct00011
i/
Figure 112010016960120-pct00012
0>
Figure 112010016960120-pct00013
0.5 의 이런 평균 비율이 관찰되었다. 또한, 다양한 블록 코폴리펩티드를 사용하여 이루어진 에멀션에 대한 유체역학 반경의 동적 광 산란 (DLS) 결과는, 넓은 범위의 블록 코폴리펩티드 조성에 대해 서브미크론 액적이 형성되는 것을 확인시킨다 (도 3 의 E, G 및 H).
액적 사이즈의 제어는 약물 전달 적용을 위한 중요한 문제일 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시형태에 따라 우리의 더블 에멀션의 사이즈를 제어하는 3개의 주요 수단이 있다. 하나의 방법은, 비열적 여기의 에너지 (예컨대, 적용되는 전단 및 확장된 흐름 응력), 액체의 흐름 특성 (예컨대, 점도 또는 점탄성), 및 액체들 간의 계면 장력을 통한 에멀션화 조건의 조작에 의존한다. 두번째 방법은, 에멀션화 이후의 사이즈 분리 (예컨대, 수행되는 에멀션 내의 액적의 분급, 여과 및 원심분리) 를 수행하는 것을 수반한다. 세번째 방법은 합성을 통해 블록 코폴리펩티드의 조성 및 농도를 변화시킨다. 간접적으로, 이 세번째 방법은 또한 중요한 물리적 특성 (예컨대, 액체 내의 코폴리펩티드의 용해도, 흡착되는 코폴리펩티드의 존재시에 액체들 간의 계면 장력, 코폴리펩티드를 함유하는 액체 용액의 점도, 계면 유착을 억제하고 액적의 안정성을 보존하는 계면 안정성을 수여할 수도 있는 코폴리펩티드의 블록 각각의 구조적 모폴로지)을 변화시키는 수단을 제공한다. 우리는 화학적 프로세스를 이용하여 코폴리펩티드를 합성하지만, 코폴리펩티드의 제조에 걸친 제어는 다른 수단 (예컨대, 유전학적으로 변형된 바이오유기체를 함유하는 바이오리액터 내에서 유전자 발현 (genetic expression)) 을 통해 달성될 수 있다. 앞서 서술한 바와 같은, (서브미크론 외부 액적 및 심지어 더 작은 내부 액적을 갖는) 작은 더블 에멀션 액적을 제조하는 것뿐만 아니라, 보다 큰 더블 에멀션 액적 (>1 ㎛) 도 제조하는 능력을 가진다. 미크론스케일 에멀션 액적은 핸드헬드 균질기로부터 획득되는 낮은 유량 또는 초음파 균질화를 통한 (예컨대, 초음파 팁 균질기를 이용한) 다소 보다 높은 유량을 사용하여 제작될 수 있다. 초음파 균질화를 사용하여 0.1 mM FITC 라벨링된 K4OrL1O 코폴리펩티드 에멀션을 에멀션화하였을 경우, 레이저 주사형 공초점 현미경 (LCSM) 은 1 ㎛ 내지 20 ㎛ 의 사이즈 범위의 보다 큰 더블 에멀션 액적을 형성할 수 있음을 증명하였다 (도 4 의 A). 추가적으로, 우리는 이러한 보다 큰 더블 에멀션 액적의 용액을 취할 수 있고, 미세유체 균질기를 통해 그것을 통과시킴으로써 보다 작은 더블 에멀션 액적으로 더욱 에멀션화할 수 있다 (도 4 의 B).
특정 응용을 위해, 추가적인 사이즈 분리가 요망될 수도 있다. 이러한 응용을 위해, 우리는 또한 원심분리를 이용하여 에멀션을 분획화하여 원하는 사이즈 범위의 에멀션을 분리시킬 수 있다. 이러한 분리를 달성하기 위해, 6 개의 패스 (N=6) 동안 미세유체 균질기를 통과하였는 1.5 mM K4OrL20 에멀션 (φ = 0.2) 을, 4 시간 동안 3,500 rpm (분당 회전운동) 의 저속으로 설정된 탁상용 원심분리기 세트 내에 배치하였다. 연속적인 액체상에 대하여 액적 구조의 질량 밀도의 차이로 인하여, 보다 큰 액적은 보다 신속하게 플러그로서 상단부에 올라가고, 보다 작은 액적의 극도로 희석된 현탁액 (즉, 잔여물) 으로부터 쉽게 분리되어 나올 수 있다. 우리는 300 nm 초과의 직경을 가진 보다 큰 액적을 분리할 수 있었다. 잔여물 현탁액은 300 nm 미만의 액적 직경을 가지며, 액적의 사이즈를 더욱 분획화하기 위해서는 보다 고속의 원심분리기가 필요하였다. 잔여물 현탁액은 초원심분리기 내에 배치되어, 20,000 rpm 에서 24 시간 동안 원심분리되었다. 이들 층의 cryo-TEM 이미지는, 액적 사이즈가 매우 좁은 사이즈 범위로 분리될 수 있음을 나타내었다 (도 4 의 C 및 D). 원심분리된 샘플의 상단부에 형성된 플러그 및 이미지는, 외부 액적의 직경이 약 30 nm 내지 약 200 nm 범위에 있고 (도 4 의 C), 잔여물 현탁액은 약 10 nm 내지 약 30 nm 범위에 있는 외부 액적 직경을 가짐 (도 4 의 D) 을 나타내었다. 이러한 분획화 절차는, 10 nm 와 10 ㎛ 사이의 원하는 사이즈의 에멀션 액적의 분리가 매우 알맞음을 증명한다. 이러한 원심분리 절차를 통해, 우리는 또한, 내부 액적 계면 또는 외부 액적 계면 중 어느 것을 불안정하게 하지 않고 W/O/W 더블 에멀션에서의 내부 물 액적을 함유하는 오일 액적 및 O/W 에멀션에서의 오일 액적의 체적 분율을 증가시킬 수 있음을 증명하였다.
더블 에멀션 액적 사이즈를 제어하는 다른 수단은 블록 코폴리펩티드의 변화를 통해 행해졌다. 이렇게 하는 간단한 방식은 폴리펩티드 농도를 변경시킴으로써 행해졌다. 동적 광 산란 (DLS) 결과는, K4OrL20 코폴리펩티드 농도가 0.1 mM 로부터 1.5 mM 로 증가됨에 따라, 평균 액적 반경이 0.1 mM 에서 약 400 nm 로부터 1.5 mM 에서 약 160 nm 로 감소됨을 나타내었다. 에멀션 액적의 사이즈를 감소시키는 다른 방식은 코폴리머에서의 올리고류신 세그먼트의 길이를 증가시키는 것이다. 리신 길이를 동일하게 유지하면서 (K40), 올리고류신 길이가 K4OrL5 로부터 K4OrL30 으로 증가됨에 따라, 외부 오일 액적의 사이즈가 약 470 nm 로부터 320 nm 로 감소되었다.
베시클은 외부 연속적인 액체로부터 내부 수계 구획부를 분리하는 겹판 (lamellar) 멤브레인으로 구성되고, 여기서 내부 액체는 친수성 카고의 컨테이너로서 작용할 수 있다. 유사한 방식으로, 더블 에멀션은 2개의 별개의 오일-물 계면에 존재하는 양친매성 분자의 층들 사이에 존재하는 비교적 두꺼운 오일 필름을 이용하여 내부 수계 액적을 캡슐화한다. 이 시스템에서의 하나의 이점은, 내부 액적과 외부 액적의 계면들 사이에 위치되는 오일 필름 ('오일층'이라고도 함) 이 소수성 카고에 대한 저장소로서 작용할 수 있음을 들 수 있다. 이러한 생각을 검증하기 위해, 우리는 우리의 코폴리펩티드 안정화된 에멀션 내에 수용성 형광 마커 및 유용성 형광 마커 둘다를 통합하였다. 수용성 형광 마커는 630 nm 에서 방출 파장을 갖는 InGaP/ZnS 퀀텀 도트이었고 (적색), 소수성 형광 마커는 실리콘 오일 속에서의 높은 용해도 및 청색 형광으로 인해 피렌이었다. 추가적으로, 녹색-형광으로 라벨링된 FITC 기능화된 K40rL10 공중합체를 사용하여 에멀션을 안정화시킴으로써, 우리는 코폴리펩티드뿐만 아니라 친수성 마커와 소수성 마커 둘다의 국지화를 동시에 이미징할 수 있었다. 피렌 또는 퀀텀 도트 없이 0.1 mM FITC 라벨링된 K4OrL1O 에멀션의 형광 LSCM 이미징은, 약 1 ㎛ 내지 약 5 ㎛ 직경 범위의 큰 더블 에멀션 액적을 나타내었다 (도 5 의 A). InGaP/ZnS 퀀텀 도트의 존재시에 10 cSt 실리콘 오일 (φ = 0.2) 내에서의 0.01 M 피렌으로 0.1 mM FITC 라벨링된 K40rL1O 을 에멀션화함으로써 트리플 라벨링된 에멀션이 제작되었다. 3 개의 상이한 형광 염료는 형광 오버레이 현미경을 사용하여 이미징되었다. 오버레이된 형광 이미지는, 내부 수계 액체 내로의 친수성 퀀텀 도트 (적색), 오일 액체 내로의 소수성 피렌 (청색), 및 외부 계면을 안정화시키는 FITC 라벨링된 폴리펩티드 (녹색) 의 분리를 나타낸다 (도 5 의 B). 내부 액적 계면의 라벨링은, 내부 액적에 함유되는 퀀텀 도트에 의한 FITC 라벨링된 폴리펩티드의 형광의 소멸로 인해 어쩌면 보이지 않을 수 있다. 이러한 가설을 뒷받침하여, 내부 액적 주위의 FITC 형광이 퀀텀 도트 없이 FITC-K4OrL1O 에멀션의 LCSM 이미지에서 보여질 수 있다 (도 5 의 A).
우리의 합성 방법을 이용함으로써, 우리는 우리의 코폴리펩티드의 배좌 및 조성을 변경할 수 있고, 또한 폴리펩티드 사슬 내에 다른 아미노산을 통합할 수 있다. 사슬 배좌를 변경하는 효과를 증명하기 위해, 우리는 랜덤 공중합된 라세믹 올리고류신 세그먼트 (예, K4OrL10) 로부터 안정한
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-나선형 구조를 채용하는 거울상 이성질체적으로 순수한 (enantiomerically pure) 올리고류신 세그먼트 (예, K60L2O) 로 소수성 도메인을 변경하였다. 이들 FITC-라벨링된 폴리펩티드 0.1 mM 둘다의 초음파처리 (ultrasonication) 로부터 제조되는 에멀션의 LCSM 이미지는, 샘플 둘다가 유사한 더블 에멸선을 형성함을 나타내었다 (도 6 의 A 및 B). 또한, 더블 에멀션 형성은 친수성 블록으로서 폴리 L-리신을 함유하는 블록 코폴리펩티드에만 한정된 것은 아니며, 예컨대, 음으로 충전된 폴리 L-글루타메이트 친수성 세그먼트를 가지고 형성할 수도 있음에 유념하는 것이 중요하다. 미세유체 균질기를 사용하여 1.0 mM E4OrL10 코폴리펩티드 에멀션이 제조되었다. 이 샘플의 cryo-TEM 이미지는, 더블 에멀션이 블록 코폴리펩티드 K4OrL10 를 갖는 더블 에멀션과 유사하게 형성되었음을 나타내었다 (도 6 의 C 내지 D). 추가적으로, 소수성 도메인을 함유하지 않는 호모폴리머 K60 을 사용하여 에멀션화가 시도되었고, 초음파처리 이후에 에멀션이 형성되지 않는다 (도 6 의 E). K6O 이 수중에서 양호한 용해도를 가지지만, K6O 은 소수성 블록이 결여되어 있기 때문에 강한 양친매성 특성을 가질 것이라고 기대할 수 없을 것이다. 또한, 전단의 적용 없이 더블 에멀션의 자발적인 형성이 발생되는지를 확인하기 위해, 우리는 KxrLy 코폴리펩티드의 수용액이 오일층과 접촉하여 잔존하도록 했다. 1-주일 배양 기간 이후에 자발적인 형성은 관찰되지 않았다.
추가적인 특징 및 변동:
코폴리펩티드 -안정화된 에뮬레이션
마이크로스케일, 서브마이크로스케일, 및 나노스케일 반경을 갖는 액적으로 구성되는 더블 에멀션 및 심플 에멀션을 제작하기 위해 발견한 기본 프로세스에서 수많은 잠재적인 구성 변화가 이용될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시형태에 따른 프로세스의 기본 엘리먼트는 : 제 1 액체 (예컨대, 물), 상이한 제 2 비혼화성 액체 (예컨대, 오일), 및 양친매성 코폴리펩티드이며, 이 양친매성 코폴리펩티드는 2 가지 액체 중 적어도 하나 또는 어쩌면 둘다에서도 충분한 용해도를 가진다 (예컨대, 물에 가용성). 코폴리펩티드는 이 코폴리펩티드가 용해가능한 액체들 중 적어도 하나에 첨가되고, 액체 및 코폴리펩티드의 시스템에 비열적 에너지가 공급되어 2개의 액체들 사이의 계면을 교란시키고, 액적의 형성 및 준안정 에멀션의 생성을 통해 계면 표면 영역의 비가역 네트 성장을 야기한다. 이러한 인가되는 비가역 에너지는, 확장 흐름을 야기하는 압력 강하를 통해, 농도 경사, 중력, 전자기파, 전자기장, 또는 초음파를 통해, 기계적 전단 흐름을 포함하는, 수많은 상이한 형태로 공급될 수 있다. 액체들 사이의 계면은 도입되는 비열적 에너지에 의해 확장되어 에멀션화를 야기하고, 계면은 모세관현상 불안정성으로 불안정하게 될 수 있고, 보다 큰 액적 또는 필름을 분해하여 보다 작은 액적으로 되게 한다. 계면을 안정화시키기 위해 사용되는 코폴리펩티드의 구조와 조성 및 액체의 종류에 따라, 이들 보다 작은 액적은 다른 액체상의 내부 액적을 함유할 수도 있고 또는 함유하지 않을 수도 있다 (예컨대, W/O/W 더블 에멀션을 형성함).
바람직한 카고를 갖는 W/O/W 더블 에멀션의 내부 액적을 로딩하기 위해, 에멀션화 이전에, 연속적인 액체상은 에멀션화 이전에 수많은 상이한 종류의 바람직한 용해 및 분산된 카고 엘리먼트를 함유할 수도 있다. 우리하 조사한 대부분의 일반적인 경우에, 연속적인 액체상은 물이다. 이 경우, 하기 종류의 카고가 수계 내부 액적 (및 또한 연속적인 수계 상) 에 로딩될 수 있다 : 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 RNA, 이중-가닥 RNA, mRNA, tRNA, rRNA, miRNA, siRNA, piRNA, rasiRNA, tasiRNA, hcRNA, scnRNA, RNA 폴리메라아제, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 트랜스포존, 펩티드, 올리고-펩티드, 폴리펩티드, 폴리펩티드단백질, 미세소관, 액틴 필라멘트, 중간 필라멘트, 다발 단백질, 가교 단백질, 트랜스펙션 약제, 염, 음이온, 양이온, 산, 염기, 완충제, 바이러스, 비타민, 혈청, 리세이트, ATP 및 GTP (예컨대, 분자 에너지 소스), 몰레큘러 모터, 친수성 약물 분자, 세포, 베시클, 나노액적, 나노에멀션, 풀러렌, 단일 및 다중벽 탄소 나노튜브, 세포질, 리보솜, 효소, 글루코오스, 골지, 덴드리머, 계면활성제, 지방질, 리포단백질, 올리고뉴클레오티드-페펩티드 공중합체, 글로불린, 알부민, 사람 혈청 알부민, 소 혈청 (bovin serum) 알부민, 설탕, 에멀산, 당류, 올리고-당류, 폴리-당류, 생체에 적합한 (biocompatible) 폴리머, 생물 분해성 (biodegradable) 폴리머, 퀀텀 도트, 점토 나노파티클, 금속 나노클러스터 및 나노파티클, 자기 반응성 산화철 나노파티클, 유기 및 무기 나노스피어 및 나노파티클, 동위원소적으로 치환된 (isotopically substituted) 친수성 분자, 이미징 증강제, 및 형광 염료. 이들 성분의 혼합물이 안정하게 분산되어 잔존한다면, 연속상 내의 이들 성분의 혼합물이 또한 제작될 수 있다. 양친매성 코폴리펩티드에 의해 안정화된 W/O/W 더블 에멀션에 대해, 최종 액적 사이즈보다 더 작으며 (또는 내부 물 액적 체적보다 더 작은 체적으로 압축될 수 있고) 수계 상 내에 있는 것을 선호하는 광범위한 친수성 물질 및 수분산성 물질이, 내부 물 액적 내로 잠재적으로 통합될 수 있다.
W/O/W 더블 에멀션의 경우, 내부 물 액적 내의 분산된 물질의 조성은, 액체들 사이의 계면을 교란시키는 (즉, 에멀션화) 비열적 에너지의 적용 이전에 수계 액체의 조성에 의해 정해진다. 에멀션화 이후, 내부 물 액적은 외부 연속적인 물 부분 내에 있는 동일한 성분을 함유할 것이다. 에멀션화가 끝난 후에, 외부 물 부분은 그안에 유익한 성분을 가질 수도 있기 때문에, 외부 물 부분은 액적으로부터 분리되어 유지될 수 있다. 이러한 분리 이후에, 더블 에멀션은 블록 코폴리펩티드를 함유하고 어쩌면 다른 계면활성제도 함유하는 상이한 연속적인 수계 액체 내에 재분산될 수 있는데, 상기 다른 계면활성제는 바람직한 생성물 내에서 장기간에 걸쳐 액적의 안정성을 유지하기 위해 적합할 것이다. 이러한 방식으로, 연속적인 수계 액체의 조성 및 내부 물 액적 (즉, 오일 액적 내측) 의 조성은 상이하게 설정될 수 있고 : 내부 물 액적은 바람직한 농도의 바람직한 약물 분자 및 파티클을 함유할 수 있고, 한편 연속적인 수계 액체는 바람직한 약물 분자 및 파티클을 함유하지 않아야 한다.
제 2 비혼화성 액체 (예컨대, 오일) 는 또한 상이한 분자, 폴리머, 및 미립자 물질의 넓은 어레이를 함유할 수 있다. 제 2 액체가 소수성 (예컨대, 오일) 이라고 가정하면, 분산된 액적 액체 내에 이하의 것이 통합될 수 있다 : 지방, 지방질, 왁스, 천연 오일, 에센셜 오일, 방향제, 콜레스테롤, 스테로이드, 소수성 약물 분자, 소수성 폴리머, 소수성 폴리펩티드, 폴리-(락트산), 폴리-(락틱-코글리콜산), 폴리-(락틱-글리콜산), 생체에 적합한 폴리머, 생물 분해성 폴리머, 미셀, 퀀텀 도트, 나노파티클, 나노클러스터, 탄소 나노튜브, 풀러렌, 자성유체, 이미징 증강제, 형광 염료, 및 액정. W/O/W 더블 에멀션의 경우, 오일은 유용성 약물 분자 및 지시약 (indicator) 을 함유할 수 있는데, 이 지시약은 내부 물 액적을 둘러싸고, 협력 방식으로 물 액적의 내용물의 바람직한 기능을 잠재적으로 용이하게 하고 및/또는 향상시킨다.
에멀션이 형성된 후에 액적 및/또는 에멀션의 액체 부분은 고체 또는 액체 결정질 부분으로 변화될 수도 있다. 중합성 오일이 사용될 경우 (예컨대, 자외선 가교성 실리콘 오일), 에멀션 또는 더블 에멀션을 자외선으로 조사함으로써 그 오일은 경질 가교된 폴리머로 제작될 수 있다. 택일적으로, 오일이 파라핀인 경우, 일단 형성되면, 액체 오일이 고체화되게 되는 파라핀의 고체화 온도 미만으로 에멀션 또는 더블 에멀션을 냉각시킨다.
안정한 에멀션 및 더블 에멀션을 형성하는 능력은 10 cSt PDMS 실리콘 오일에 한정되지 않는다. 우리는, 약 1 cP 내지 약 1,000 cP 범위의 점도에 대응하는, 실온에서 약 0.65 cSt 내지 1,000 cSt 범위의 동적 점도를 갖는 다른 실리콘 오일이 또한 안정한 에멀션 및 안정한 더블 에멀션을 형성하는 것을 발견하였다. 본 발명의 다른 실시형태는 이러한 점도 범위를 약 0.1 cP 내지 10,000 cP 초과로 확장시킬 수 있다. 액체를 가열하는 것은 일반적으로 액체의 점도를 저하시키기 때문에, 바람직한 에멀션 조성 (예컨대, 보다 높은 점성 오일) 및 구조 (예컨대, 감소된 액적 사이즈) 를 획득하기 위해 뜨거운 온도에서의 에멀션화가 이용되는 것이 고려될 수 있다. 또한, 콩기름 (soybean oil) 및 올레인산메틸을 포함하는, 천연 오일이 우리의 코폴리펩티드로 에멀션화될 수 있다. 유기 용매 (예컨대, 톨루엔, 디클로로벤젠 및 도데칸) 는 또한 블록 코폴리펩티드를 사용하여 물의 연속상으로 에멀션화된다.
우리는 희석 극한 (예컨대, 10-5) 내지 농축된 형태 (0.9 이상) 범위의 오일 체적 분율 φ 를 사용하여 W/O/W 더블 에멀션 내의 안정한 더블 액적 및 O/W 에멀션 내의 안정한 액적을 제조할 수 있다. 통상적으로, O/W 에멀션을 형성하거나 또는 W/O/W 더블 에멀션을 형성하기 위해, φ< 0.5 에 대해 에멀션화가 수행되고, 보다 일반적으로, O/W 에멀션 및 W/O/W 더블 에멀션은 φ
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0.1 내지 φ
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0.2 에서 이루어진다. 보다 높은 φ 를 사용하는 것은, 에멀션화 프로세스에서의 액적 제조의 스루풋을 증대시킬 수 있어서, 바람직할 수 있지만, 그래도 액적 구조의 평균 치수도 역시 φ 에 의존될 수 있다. 내부 액적 반경 및 체적 분율도 광범위하게 변화될 수 있다. 또한, 우리는 마이크로스케일 내지 나노스케일의 광범위한 반경에 걸쳐 규정 다이렉트 에멀션 및 더블 에멀션을 제작할 수 있다.
에멀션 또는 더블 에멀션을 생성하기 위해 계면을 교란시키는 에너지를 공급하기 위해 수많은 상이한 종류의 장비 및 디바이스가 사용될 수 있다 : 콜로이드 밀, 믹서, 교반기 (stirrer), 균질기, 초음파 분산기, 자기 분산기, 전자기 유전영동 여기 (electromagnetic dielectrophoretic excitation), 미세유체 디바이스, 및 다공성 멤브레인 압출. 우리의 연구는, 코폴리펩티드 안정화에 대해, 계면을 교란시키는 비열적 에너지 여기를 제공하는 다양한 상이한 방법이 이용될 수 있는데, 이 비열적 에너지 여기는, 그 에너지가 계면을 상당히 교란시키기에 충분하다면 동일한 에멀션 모폴로지가 획득된다. 우리는, 교반기, 초음파 분산기, 및 미세유체 균질기를 사용하여 코폴리펩티드를 포함하는 동일한 조성으로 W/O/W 더블 에멀션이 제조될 수 있음을 보였다.
이하, 상기 서술된 예에 이용되는 더욱 상세한 실험 절차를 설명한다.
일반적인 방법 및 물질
테트라히드로푸란 (THF) 은, 사용 전에 질소 하에서 알루미나로 패킹된 칼럼을 통과시킴으로써 건조되었다 (A. B. Pangborn et al, Organometallics 15, 1518 (1996)). 분자량은 Wyatt DAWN EOS 광 산란 검출기 및 Wyatt Optilab DSP 가 장착된 SSI 펌프 상에서 60 ℃ 에서 수행되는 겔 투과 크로마토그래피/광 산란 (GPC/LS) 에 의해 획득되었다. 분리는 대략 5 mg/㎖ 의 폴리펩티드 농도 및 용리액으로서의 DMF 내의 0.1 M LiBr 을 사용하여 105, 104, 및 103 Å Phenomenex 5 ㎛ 칼럼에 의해 행해졌다. 적외선 스펙트럼은 폴리스티렌 필름을 사용하여 보정된 Perkin Elmer RXl FTIR 분광광도계 상에서 기록되었다. 1H NMR 스펙트럼은 Bruker AVANCE 400 MHz 분광계 상에서 기록되었다. 탈이온 (DI) 수는 Purelab Option 560 역삼투 정수기를 사용하여 정수되었다. 밀리포어 워터 (Millipore water) 는 Millipore Milli-Q Biocel A1O 정수 유닛으로부터 획득되었다. 실리콘 오일 (폴리-(디메틸실록산) 또는 PDMS) 은 (PDMS 의 상이한 평균 분자량에 대응하는) 1 cSt 내지 1,000 cSt 범위의 점도를 가지며 Gelest, Inc. 에 의해 공급된 것이다.
블록 코폴리펩티드의 일반적 합성
α-아미노산-N-카르복시무수물 NCA 모노머는 이미 공표된 문헌 프로토콜을 이용하여 합성되었다 (H. R. Kricheldorf, α-Aminoacid-N-Carboxyanhydrides and Related Materials (Springer-Verlag, NY, 1987)). 모든 블록 코폴리펩티드는 (PMe3)4Co 개시제를 사용하여 중합되었다 (H. F. Klein, and H. H. Karsch, Chem. Ber. 108, 944 (1975)). 결과로서 생기는 폴리펩티드는 GPC, 1H NMR 및 IR 분광법을 이용하여 특징지워진다 (T. J. Deming, Macromolecules 32, 4500 (1999)). 공중합체의 조성은 D2O 에 기록되는 1H NMR 스펙트럼의 적분값의 분석에 의해 결정된다. 모든 조성은 예측값의 5 % 이내에 있는 것으로 발견되었다. 측정된 폴리머 사슬 길이 분포로부터, 다분산 지수 (Mw/Mn) 는 1.1 내지 1.3 범위에 있었다.
폴리(N ε CBZ-L-리신) 40 -b- 폴리(rac-류신) 20
드라이박스 내에서, L-리신 NCA (10.00 g, 33 mmol) 이 THF (200 ㎖) 내에 용해되어 (플라스틱 스토퍼로 밀봉될 수 있는) 500 ㎖ 평저 플라스크 속에 배치되었다. 그후, (PMe3)4Co 의 분취액 (aliquot) (THF 내의 48 mg/㎖ 용액의 16 ㎖) 을 주사기를 통해 플라스크에 첨가하였다. 교반바 (stir bar) 를 부가하고, 플라스크를 밀봉하여 45 분간 교반하였다. GPC 분석을 위해 중합으로부터 분취액 (50 ㎕) 을 제거하였다 (Mn = 11,000, Mw/Mn = 1.24). L-류신 NCA (1.3 g, 8.2 mmol) 및 D-류신 NCA (1.3 g, 8.2 mmol) 를 THF (52 ㎖) 내에 용해시킨 후, 중합 혼합물에 첨가하였다. 별도 16 시간 동안 교반한 후, 그 용액을 드라이박스로부터 제거하고, 감압 하에서 THF 를 제거하였다. FTIR 분석은 모노머의 완전한 소진을 나타내었고, 이전에 보고된 결과와 유사하였다 (V. Breedveld et al., Macromolecules 37, 3943 (2004)).
폴리(L-리신-HBr) 40 -b- 폴리(rac-류신) 20 , K 4O rL 10
상기 내용으로부터의 폴리(NεCBZ-L-리신)40-b-폴리(rac-류신)20 을 트리플루오로아세트산 (TFA) (350 ㎖) 에 용해하고, 1ℓ 평저 플라스크에 옮겨 아이스배쓰 속에 배치하였다. 그후, HBr (아세트산 내 33%) 을 첨가하고 (40 ㎖, 131 mmol), 반응물을 2 시간 동안 교반하였다. 탈보호된 (deprotected) 폴리머는 반응 혼합물에 디에틸 에테르의 첨가 후 원심분리에 의해 분리되었다. 그후, 분리된 폴리머를 탈이온수에 용해하고, 테트라소듐 EDTA (3 mmol, 4 일), 0.1 M HCl (2 일), 탈이온수 (1 일), 0.1 M LiBr (2 일), 탈이온수 (2 일) 로, 각 용액을 3 회/하루 변경하면서 투석하였다 (6,000-8,000 MWCO 멤브레인). 투석된 폴리머를 동결건조에 의해 분리하여 건조 백색 분말로서의 생성물을 제공하였다 (4.8 g, 70.2 %). FTIR 및 1H-NMR 을 수행하고, 이전 결과와 유사하게 나타났다 (V. Breedveld et al., Macromolecules 37, 3943 (2004)).
FITC 기능화된 K 4O rL 1O
상기 서술된 바와 같이 K4OrL10 공중합체를 제조하였다. 제 1 세그먼트 (폴리 CBZ-리신) 의 GPC 분석 : Mn=10,500, Mw/Mn = 1.20. 탈보호된 공중합체 (150 mg, 1.3 × 10-2 mmol) 를 수중에 용해하고 125 ㎖ 평저 플라스크 내에 배치하였다. NaHCO3 (162 mg, 19 mmol) 을 그 용액에 첨가하였다. 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) (5 mg, 1.3 × 10-2 mmol) 를 건조 DMSO (1 ㎖) 에 용해시켜 폴리머 용액에 첨가하였다. 교반바를 부가하고, 반응 혼합물을 하룻밤 동안 교반하였다. 폴리머 용액을 탈이온수로 3 일 동안, 물을 3 회/ 하루 변경하면서 투석하였다 (6,000-8,000 MWCO 멤브레인). 투석된 폴리머를 동결건조에 의해 분리하여 폴리머 사슬 당 대략 1 플루오레세인 단위를 함유하는 황색-적황색 폴리머를 산출하였다 (130 mg, 87%).
K 40 rL 10 을 이용한 실리콘 오일의 에멀션화
동결건조된 K4OrL10 코폴리펩티드를 먼저 바람직한 농도로 탈이온수에 용해시킨다. 블록 코폴리펩티드 농도 C 의 범위는 1.0 × 10-4 mM 내지 1.7 mM 에 있다. 실리콘 오일 (10 cSt, Gelest PDMS) 을 첨가하여 바람직한 오일 체적 분율 φ 을 연속 상으로 제공한다 (0.01 ≤ φ ≤ 0.8). 미리 혼합된 에멀션은, 핸드헬드 균질기 (S8N-8G 분산 엘리먼트를 갖는 IKA Ultra-Turrax T8) 또는 핸드헬드 초음파 균질기 (35-40% 의 출력에서의 Cole-Palmer 4710 시리즈 모델 ASI) 중 어느 것을 사용하여 전단을 가함으로써 제조된다. 그후, 이러한 미리 혼합된 에멀션은 75 ㎛ 스테인리스강/세라믹 상호작용 챔버 및 입력 공기 압력 p = 130 psi 를 갖는 M-110S Microfluidizer? Processor 를 통과하였다. 에멀션은 미세유체 균질기의 생성물 아웃렛에서 수집된 후, 5 개 보다 많은 패스 (전체 N = 6) 로 미세유체 균질기를 통과하여, 평균 액적 반경 <a> 을 감소시키고 샘플의 단분산성을 증가시켰다. 우리는 콩기름 및 올레인산메틸을 포함하는, 10 cSt 및 100 cSt 실리콘 오일 이외에 코폴리펩티드, 물, 및 다양한 오일의 더블 에멀션을 형성하였다. Cryo-TEM 은 또한 하기 코폴리펩티드 조성을 이용하여 더블 에멀션의 형성을 확인하였다 : K2OrL10, K4OrL5, K4OrL10, K4OrL20, K4OrL30, K4OrL20, 및 E40rL10 (E = 글루타민산).
에멀션의 분획화
1.5 mM K4OrL20 에멀션 (상기 내용에서 제조됨) 을, IEC HN-S 테이블탑 원심분리기를 사용하여 24 시간 동안 3,500 rpm 에서 15 ㎖ 플라스틱 원심분리기 튜브 내에서 원심분리하였다. 0.5 mm 플러그 (plug) 를 형성하고, 잔여물로부터 분리하였다. 일 플러그가 실리콘 오일 및 물의 상이한 밀도 (10 cSt PDMS 실리콘 오일에 대해 0.973 g/㎖ 와 물에 대해 1.0 g/㎖) 로 인해 튜브의 상단부에 형성된다 (액적 사이즈 > 300 nm, cryo-TEM 에 의함). 상기 플러그는 일차 잔여물로서 지정되는 샘플의 나머지로부터 분리되고, 이들 일차 잔여물은 Beckman L8-55 초원심분리기를 사용하여 4 시간 동안 20,000 rpm 에서 더욱 분획화된다. 이차 잔여물 (10 nm 내지 30 nm 범위의 액적 사이즈, cryo-TEM 에 의함) 로서 현탁액 내에 잔류하는 액적과 함께 현탁액의 상단부에 일 플러그 (30 nm 내지 200 nm 범위의 액적 사이즈, cryo-TEM 에 의함) 가 형성된다.
동적 광 산란 ( DLS )
에멀션 액적의 직경은 Photocor-FC 보드 및 소프트웨어를 갖는 동적 광 산란 (DLS) 에 의해 추정되었다. 샘플을 희석하여 1 × 105 과 6 × 105 사이의 세기 판독을 획득하였다. 각각의 측정은 선형 채널 스페이싱 및 조절가능한 베이스라인에 대해 90°의 산란각에서 500 초간 수행되었다. 이용되는 피팅 절차는 데이터를 피팅하고 평균 액적 반경을 계산하기 위한 조절가능한 베이스라인에 의한 큐뮬런트 분석이다.
K 40 rL 10 에멀션의 상이한 성분으로 3개의 형광 프로브를 로딩
소수성 액체를 라벨링하기 위해, 우리는 0.01 M 의 농도로 실리콘 오일 성분 내에 피렌을 용해시키고, 퀀텀 도트 (Evident Technologies, Type T2-MP 650 nm Macoun Red InGaP/ZnS, 아민-기능화됨) 를 2 μM 의 농도로 물 성분 내에 분산시켰다. 에멀션을 제조하기 위해, FITC-K4OrL1O (0.1 mM 용액 150 ㎕) 을 InGaP 퀀텀 도트 (8 μM 용액 50 ㎕) 및 10 cst 실리콘 오일 중의 피렌 (0.01 M 피렌 용액 50 ㎕) 과 조합하였다. 이 혼합물을 초음파 팁 균질기 (35% 의 출력) 를 사용하여 10 초간 에멀션화하였다.
레이저 주사형 공초점 현미경 ( LSCM )
0.1 mM FITC-K4OrL10 폴리펩티드 용액 800 ㎕ 및 10 cSt PDMS 실리콘 오일 200 ㎕ 를 조합한 후, 핸드헬드 초음파 균질기 (35% 의 출력) 를 사용하여 10 초간 에멀션화함으로써 0.1 mM FITC-K40rL10 에멀션 (φ = 0.2, 10 cSt 실리콘 오일) 을 제조하였다. 이미징 이전에, 0.1 mM FITC-K4OrL1O 에멀션 현탁액의 분취액을 탈이온수로 10 의 인자 만큼 희석하였다. 에멀션 1 방울 (drop) 을 유리 슬라이드 (glass slide) 상에 배치한 후, 커버 슬립 (cover slip) 을 배치하였다. 이 샘플은, Tsunami Ti (자외선 여기에 대해 768 nm 에서 튜닝된 사파이어 피코초-펄스화된 적외선 레이저) 및 Spectra-Physics Millenia X 532 nm (녹색) 다이오드 펌프 레이저로 이루어진 2-광자 레이저 셋업 및 561 nm (녹색) 다이오드 레이저 (DPSS: Melles Griot) 및 488 nm (청색) 아르곤 레이저 (JDS Uniphase) 가 장착된 Leica-SP MP 공초점 및 다광자 역상 현미경을 사용하여 이미징되었다.
형광 현미경
형광 이미징 이전에, 에멀션 현탁액을 탈이온수로 10배 희석하였다. 그후, 에멀션의 방울을 유리 슬라이드 상에 배치하고, 유리 커버 슬립을 사용하여 커버하였다. 이 샘플은 Zeiss 200 형광 현미경을 사용하여 이미징되었다.
극저온 TEM 이미징
각 에멀션 샘플을 이미징 이전에 탈이온수로 10배 희석하였다. 그후, 각 샘플의 분취액 (5 ㎕) 을 카본 그리드 상에 배치하였다. 이 그리드를, 액체 에탄 중의 자동 샘플 블로팅 및 유리화를 위해 Vitrobot (FEI) 자동 유리화 디바이스 (automated vitrification device) 속에 로딩하였다. 이 그리드를 액체 질소 하에서 보관한 후, 콜드 스테이지 (cold stage) 를 사용하여, 가속 전압 120 kV 를 갖는 Phillips Tecnai F20 전자 현미경 내에 배치하였다. Leginon 소프트웨어 패키지에 커플링된 Teitz SCX 슬로우-스캔 CCD 검출기 상에서 이미지를 획득하였다.
추가적인 실시예
우리가 본 발명의 몇몇 실시형태에 따라 지정한 블록 코폴리펩티드 계면활성제는, 일반식 폴리(L-리신·HBr)x-b-폴리(라세믹-류신)y, Kx(rac-L)y 를 가지며, 여기서 x 는 20 내지 100 의 범위에 있고, y 는 5 내지 30 잔기의 범위에 있다 (도 1 의 A). 친수성 폴리(L-리신·HBr) 세그먼트는 중성 pH 에서 고도로 충전되고, 양호한 물 용해도를 제공하고 (Katchalski, E. & Sela, M. Synthesis and chemical properties of poly-alpha-amino acids. Advances in Protein Chemistry 13, 243-492 (1958)), 화학 기능화를 위해 풍부한 아민기를 가진다 (Niederhafner, P., Sebestik, J. & Jezek, J. Peptide dendrimers. Journal of Peptide Science 11, 757-788 (2005)). 다른 중합성 양친매성 물질의 소수성 세그먼트와 달리, 폴리(L-류신) 세그먼트는 일반적인 유기 용매 내에서의 열악한 용해도 및 강한 사슬간 회합을 일으키는 막대형상
Figure 112010016960120-pct00017
-나선형 배좌를 채택한다 (Nowak, A. P. et al. Rapidly recovering hydrogel scaffolds from self-assembling diblock copolypeptide amphiphiles. Nature 417, 424-428 (2002)). 우리는, 구조 KxLy (예컨대, K60L20) 의 블록 공중합체는 수중에서 강하게 회합하여 소수성 세그먼트의 패킹을 통해 멤브레인을 형성 (Holowka, E. P., Pochan, D. J. & Deming, T. J. Charged polypeptide vesicles with controllable diameter. Journal of the American Chemical Society 127, 12423-12428 (2005)) 함을 나타내었다. 따라서, 우리는 폴리(rac-류신) 에 초점을 맞추었는데, 이는 폴리(rac-류신)의 펩티드 성질이 오일상에서의 사슬간 H-결합을 통해 액적 계면의 추가 기계적인 안정화를 허용하면서 (Lapp, C. & Marchal, J. Preparation De La Poly-D,L-Phenylalanine En Helice Par Polymerisation De La D,L-Benzyl-4 Oxazolidine Dione-2- 5. Journal De Chimie Physique Et De Physico-Chimie Biologique 60, 756-766 (1963)), 폴리(rac-류신) 의 무질서한 사슬 배좌가 용해도 (표 1) 를 향상시키고 (Kricheldorf, H. R. & Mang, T. C-13-NMR Sequence-Analysis, 20. Stereospecificity of the Polymerization of D,L-Leu-NCA and D,L-Val- NCA. Makromolekulare Chemie-Macromolecular Chemistry and Physics 182, 3077-3098 (1981); Breitenbach, J. W., Allinger, K. & Koref, A. Viskositatsstudien an Losungen von DL- Phenylalanin-Polypeptiden. Monatsh. Chem. 86, 269 (1955)), 표면 활성 (표 1) 증진을 돕기 때문이다.
디블록 코폴리펩티드는 수계 Kx(rac-L)y 용액에 PDMS 실리콘 오일을 첨가함으로써 에멀션화 활성을 위해 스크리닝된다 (표 1, 도 2 의 A 및 B, 도 11 의 A). 결과로서 생기는 혼합물은 핸드헬드 로터리 균질기를 사용하여 전단된 후, 고압 미세유체 균질기를 통해 6회 통과시켰다 (도 2 의 C). 모든 Kx(rac-L)y 샘플은 9 개월에 걸쳐 상분리 또는 숙성되지 않는 안정한 W/O/W 나노에멀션을 제공하였다. 오직 낮은 소수성 함량을 갖는 코폴리펩티드, 예컨대, K4O(rac-L)5 만이 1 년후에 서서히 상분리되는 에멀션을 제공하였다. 초음파 혼합을 포함하는 다른 혼합 방법이 또한 안정한 에멀션을 제공하였지만, 수 미크론까지의 직경을 갖는 액적으로 안정한 에멀션을 제공하였다. 30 잔기보다 더 긴 소수성 세그먼트의 사용은 수계 용해도 (표 1) 를 상당히 저감시켰고, 여기서 K40(rac-L)30 만이 1 mM 까지 용해될 수 있었다. 대조군으로서, K60L2O 및 K60 의 0.1 mM 현탁액이 또한 계면활성제로서 사용되었는데, 여기서 K60L2O 는 안정한 에멀션을 형성하였고 K60 은 오일과 물의 혼합물을 에멀션화하는데 실패하였다 (도 9 의 A 및 B). 이러한 결과는, Kx(rac-L)y 계면활성제가 광범위한 조성 및 농도에 걸쳐 안정한 에멀션을 제공함을 나타내었다.
액적 구조를 시험하기 위해, 블록 코폴리펩티드 안정화된 에멀션은 광학 현미경 및 극저온 투과 전자 현미경 (CTEM) 을 사용하여 이미징되었다. Kx(rac-L)y 를 갖는 모든 샘플은 오일 액적을 함유함이 발견되었고, 각각은 일관된 내부 체적 대 외부 체적 비율을 갖는 단일 내부 수계 액적을 우세하게 함유하고 있었다 (도 7 의 A 내지 도 8 의 D). 이러한 결과와 대조적으로, K60L20 을 사용하여 형성된 에멀션은 심플 오일 액적만을 함유하였으므로, 라세믹-류신 세그먼트가 본 발명의 이 실시형태에 있어서 더블 에멀션 구조를 안정화하는데 중요한 역할을 함을 나타냈다. 코폴리펩티드 소수성 함량이 감소됨에 따라, 액적 사이즈가 증대되어 (표 1, 도 10 의 C), 공중합체 조성이 계면 평균 곡률에 영향을 미친다는 것을 시사하였다. 또한, K40(rac-L)20 의 농도가 감소될 경우 평균 액적 직경은 증가됨이 발견되었다 (도 10 의 A). 마찬가지로, 오일 체적 분율을 감소시키는 것은 보다 작은 에멀션 액적을 산출하였다 (도 10 의 B). 에멀션은 항상, 물이 연속적인 액체로 잔류하고 50 % 에 가까운 오일 체적 분율까지 전화하지는 않도록 형성하였다. PDMS 이외에, 도데칸, 콩기름, 및 올레인산메틸과 같은 다른 비혼화성 액체는, 수중에서 1 mM K40(rac-L)20 을 사용하여 에멀션을 제공하였다. 본 발명의 다양한 실시형태의 다재다능함 (versatility) 은, L-아르기닌 (R) 및 L-글루타메이트 (E) 의 구아니디늄 또는 카르복실레이트 기능성을 각각 함유하는, R40(rac-L)10 또는 E40(rac-L)10 을 사용하여 안정한 에멀션을 형성함으로써 나타내었다 (도 8 의 A 및 B).
나노스케일 에멀션 액적의 형성은, 외부 액적 직경이 일반적으로 200 nm 미만, 바람직하게는 50 nm 와 100 nm 사이에 있을 필요가 있는 약물 전달과 같은 수많은 적용을 위해 필수적이다 (Kataoka, K., Kwon, G. S., Yokoyama, M., Okano, T. & Sakurai, Y. Block-Copolymer Micelles as Vehicles for Drug Delivery. Journal of Controlled Release 24, 119-132 (1993)). 여러가지 종래의 방법이 더블 에멀션의 제조에 이용가능하지만, 이러한 사이즈 범위의 외부 액적의 제조를 허용하는 것은 없다 (Garti, N. Double emulsions - Scope, limitations and new achievements. Colloids and Surfaces A-Physicochemical and Engineering Aspects 123, 233-246 (1997); Loscertales, I. G. et al. Micro/nano encapsulation via electrified coaxial liquid jets. Science 295, 1695-1698 (2002); Utada, A. S. et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science 308, 537-541 (2005); Benichou, A., Aserin, A., Garti, N. Double emulsions stabilized with hybrids of natural polymers for entrapment and slow release of active matters. Advances in Colloid and Interface Science 108-109, 29-41 (2004)). 초음파 균질화를 이용하여 약 400 nm 직경인 CTEM 에 의해 관찰되는 가장 작은 더블 에멀션 액적을 갖는 다분산액 샘플을 산출하는 K40(rac-L)20 에멀션을 제조하였다. 이러한 액적은 미세유체 균질기를 6회 통과함으로써 사이즈가 더욱 감소되어, 약 10 내지 수백 nm 범위의 액적 직경을 산출하였다. 외부적 및 내부적 유착 둘다에 대항한 이들 더블 에멀션의 안정성은, 원심분리의 이용이 바람직한 사이즈 범위로 액적을 분획화하는 것을 가능하게 하였다. 도 12 의 A 에서 샘플의 원심분리는 수백 nm 직경의 액적을 함유하는 부양 (buoyant) 분율을 제공하였다. 잔류하는 현탁액 내의 보다 작은 액적은 초원심분리에 의해 더욱 분리되어 (Mason, T. G., Wilking, J. N., Meleson, K., Chang, C. B. & Graves, S. M. Nanoemulsions: formation, structure, and physical properties. Journal of Physics-Condensed Matter 18, R635-R666 (2006)), 약 10 nm 내지 100 nm 직경 범위의 액적을 갖는 분율을 산출하였다 (도 12 의 C). 이러한 분획화 절차는, 나노스케일 범위에서의 안정한 더블 에멀션 액적의 분리가 전적으로 실현가능하고, 그들 안정한 더블 에멀션 액적이 전단 응력, 확장 응력, 및 삼투 압축 응력과 같은 인가된 외부적 응력에 상당히 안정함을 나타내었다.
그들의 캡슐화 능력을 증명하기 위해, 수용성 형광 마커 및 유용성 형광 마커 둘다를 코폴리펩티드 안정화된 더블 에멀션 내로 로딩하였다. InGaP/ZnS 퀀텀 도트의 분산물은, 피렌을 함유하는 PDMS 실리콘 오일로 에멀션화 이전에 플루오레세인 라벨링된 FITC-K40(rac-L)10 과 혼합되었다. 형광 현미경을 사용하여, 마커들 및 라벨링된 폴리펩티드 둘다를 더블 에멀션 액적 내에서 이미징하였다 (도 5 의 B). 또한, 이미지는 친수성 퀀텀 도트 (적색) 를 내부 수계 상으로, 소수성 피렌 (청색) 을 오일상으로, 그리고 외부 계면을 안정화시키는 라벨링된 폴리펩티드 (녹색) 를 구분하여 나타내었다. 내부 계면에서의 폴리펩티드는 아마 퀀텀 도트에 의한 플루오레세인 라벨의 소멸로 인해 관찰되지 않았다. K60L2O 계면활성제로 제조된 샘플에서, 내부적 수계 구획부를 갖지 않는 심플 오일 액적만이 관찰되었다 (도 13 의 B). 이들 카고는 적어도 3 개월 동안 액적 내부에 캡슐화되어 잔류하는 것이 관찰되었고, 대부분의 더블 에멀션 시스템과 비교해서 내부 수계 구획부의 전례 없는 개선된 안정성을 나타내었다 (Davis, S. S. & Walker, I. M. Multiple Emulsions as Targetable Delivery Systems. Methods in Enzymology 149, 51-64 (1987); Garti, N. Double emulsions - Scope, limitations and new achievements. Colloids and Surfaces A-Physicochemical and Engineering Aspects 123, 233-246 (1997); Benichou, A., Aserin, A., Garti, N. Double emulsions stabilized with hybrids of natural polymers for entrapment and slow release of active matters. Advances in Colloid and Interface Science 108-109, 29-41 (2004)).
이들 Kx(rac-L)y 계면활성제는 높은 친수성 함량 (HC), 즉 소수성 잔기에 대한 친수성 잔기의 비율이 높음으로 나타내지고, 이는 오일이 나노스케일 액적의 만곡된 계면의 오목한 측에 있는 O/W 에멀션의 안정화에 유리하다. 역으로, W/O/W 더블 에멀션의 내부 물-오일 계면은 오일이 계면의 볼록한 측에 있기 때문에 낮은 HC 를 갖는 계면활성제에 의해 최상으로 안정화된다. 이들 평균 계면 곡률의 반대 징후 (Strey, R. Microemulsion microstructure and interfacial curvature. Colloid and Polymer Science 272, 1005-1019 (1994)) 는, 단일 성분 계면활성제가 일반적으로 더블 에멀션 액적을 안정화시키지 못하며, 따라서, 계면활성제의 조합이 필요하다는 이유를 설명한다 (Ficheux, M. F., Bonakdar, L., Leal-Calderon, F. & Bibette, J. Some stability criteria for double emulsions. Langmuir 14, 2702-2706 (1998)). 또한, 이것은 막대형상 올리고류신 세그먼트는 오일에 의해 열악하게 용매화되고 오일상으로 응집하는 경향이 있기 때문에, K60L20 에 의해 제조된 오직 O/W 에멀션의 형성을 설명한다 (Nowak, A. P. et al. Rapidly recovering hydrogel scaffolds from self-assembling diblock copolypeptide amphiphiles. Nature 417, 424-428 (2002)). 이러한 관찰에 기초하여, W/O/W 더블 에멀션 내의 내부 수계 액적을 안정화시키는 것은, 아마도 소수성 폴리펩티드 세그먼트가 오일 내에 용이하게 분산됨으로서 수계 상 내의 많은 친수성 세그먼트의 입체적 붐빔 (steric crowding) 을 방지할 때, 현저해짐을 나타낸다.
Kx(rac-L)y 내의 라세믹-류신 세그먼트는 더블 에멀션 액적을 안정화시키는 특징의 조합을 제공한다. 이들 세그먼트의 배좌 유연성은, 폴리(rac-류신)은 CH2Cl2 및 (CH3)2SO 와 같은 유기 용매에 가용성인 반면 폴리(L-류신)은 가용성이 아님으로 나타나기 때문에, 이들 세그먼트의 배좌 유연성은 오일 용해도를 향상시킨다 (Kricheldorf, H. R. & Mang, T. C-13-NMR Sequence-Analysis, 20. Stereospecificity of the Polymerization of D,L-Leu-NCA and D,L-Val-NCA. Makromolekulare Chemie-Macromolecular Chemistry and Physics 182, 3077-3098 (1981); Breitenbach, J. W., Allinger, K. & Koref, A. Viskositatsstudien an Losungen von DL-Phenylalanin-Polypeptiden. Monatsh. Chem. 86, 269 (1955)). 이것은 소수성 세그먼트가 오일 내에 보다 용이하게 분산될 수 있을수록 Kx(rac-L)y 사슬이 내부 액적 오일-물 계면을 보다 양호하게 안정화시키게 한다. 폴리(rac-류신)의 오일 용매 내의 향상된 용해도에도 불구하고, 폴리(rac-류신)의 거의 모든 잔기는 또한 분자내 H-결합 및 분자간 H-결합 둘다에 체결될 것이다. 류신 및 페닐알라닌 둘다의 라세믹 폴리머에 대한 연구는, 그들이 H-결합을 통해 유기 용매 내에 회합하는 것을 증명하였다 (Lapp, C. & Marchal, J. Preparation De La Poly-D,L-Phenylalanine En Helice Par Polymerisation De La D,L-Benzyl-4 Oxazolidine Dione-2-5. Journal De Chimie Physique Et De Physico-Chimie Biologique 60, 756-766 (1963)). 오일과의 내부 수계 액적의 계면에서, 우리의 폴리머의 높은 HC 는, 사슬간 H-결합을 거의 허용하지 않고 약한 안정화된 계면을 제공할 것인 오일상 내의 rac-류신 세그먼트의 낮은 패킹 밀도에 유리하다 (도 2 의 C). 그러나, 외부 액적 오일-물 계면의 반대 곡률은, 오일상 내의 라세믹-류신 세그먼트의 치밀한 패킹을 허용하여, 사슬간 H-결합에 유리하다. 따라서, 내부 수계 액적이 어쩌면 불안정할지라도, 외부 계면이 H 결합 가교에 의해 보강될 것으로 예상되기 때문에, 내부 수계 액적은 외부 액적과의 병합으로부터 방지되며 심플 에멀션을 형성한다. 이러한 개념을 시험하기 위해, rac-류신 세그먼트에 H-결합할 수 있는 아세트아미드기로 캡핑된 실리콘 오일을 함유하는 에멀션을 제조하였다. K60(ra-L)2O 에 의한 에멀션화는 다중 내부적 액적을 함유하는 W/O/W 나노에멀션을 제공하며 (도 11 의 A 내지 D), rac-류신 세그먼트가 오일상 내의 H-결합 상호작용을 통해 액적을 안정화시킬 수 있으므로, 내부적 액적 유착을 억제한다는 가설을 뒷받침한다.
H-결합을 통해 상호작용하는 라세믹의 무질서한 소수성 폴리펩티드 세그먼트의 우리의 이용은 W/O/W 더블 에멀션을 안정화시키기 위한 신규한 수단이다. 이러한 접근법은, 더블 에멀션이 추가적인 계면활성제의 사용 없이 형성되지 않으며 정돈된 양친매성 나선이 표면 활성의 가장 흔한 소스인, 단백질 및 펩티드 안정화된 에멀션과는 크게 다르다 (Enser, M., Bloomberg, G. B., Brock, C, Clark, D. C. De novo design and structure-activity relationships of peptide emulsifiers and foaming agents. International Journal of Biological Macromolecules 12, 118-124 (1990); Dickinson, E. Structure and composition of adsorbed protein layers and the relationship to emulsion stability. Journal of the Chemical Society Faraday Transactions 88, 2973-2983 (1992); Saito, M., Ogasawara, M., Chikuni, K., Shimizu, M. Synthesis of a peptide emulsifier with an amphiphilic structure. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59, 388-392 (1995); Dalgleish, D. G. Conformations and structures of milk proteins adsorbed to oil-water interfaces. Food Research International 29, 541-547 (1996); Chang, C. B., Knobler, C. M., Gelbart, W. M., Mason, T. G. Curvature Dependence of Viral Protein Structures on Encapsidated Nanoemulsion Droplets. ACS Nano 2 281-286 (2008)). rac-발린 및 rac-알라닌 소수성 세그먼트를 함유하는 샘플이 또한 안정한 더블 나노에멀션을 제공하기 때문에 (도 8 의 C 및 D), 우리의 전략은 다른 코폴리펩티드에도 적용될 수 있다. 블록 코폴리펩티드 계면활성제의 사용은 나노스케일 액적의 전례 없는 직접적인 제조를 허용함으로써 W/O/W 더블 에멀션의 중요한 한계를 극복할 수 있으며, 이는 또한 유용성 카고 및 수용성 카고 둘다를 동시에 캡슐화하는데 사용될 수 있고 높은 안정성도 나타낸다. (용어 카고는, 더블 에멀션의 내부 액적 또는 외부 액적이든 또는 다이렉트 에멀션의 심플 액적이든, 그 액적 중 임의의 액적 내부에 함유되는 액체에 첨가될 수 있는 임의의 물질을 지칭하는데 사용된다.)
방법 개요
K40(rac-L)20 코폴리펩티드를 먼저 초순수 내에 바람직한 농도 (예컨대, 0.01 mM < C < 1.5 mM) 로 용해시켰다. PDMS 실리콘 오일 (10 cSt) 을 첨가하여 연속상으로 오일의 바람직한 체적 분율 φ 을 제공하였다 (0.05 < φ < 0.50). 마이크로스케일 에멀션 (즉, "미리 혼합된" 에멀션) 은, 핸드헬드 균질기 (S8N-8G 분산 엘리먼트를 갖는 IKA Ultra-Turrax T8) 를 사용하여 1 분간 혼합하거나 또는 핸드헬드 초음파 팁 균질기 (35-40% 의 출력에서의 Cole-Parmer 4710 시리즈 모델 ASI) 를 사용하여 10 초간 혼합하거나 중 어느 것에 의해 제조되었다. 그후, 이 에멀션을, 75 ㎛ 스테인리스강/세라믹 상호작용 챔버 및 입력 공기 압력 p = 130 psi 을 갖는 M-11OS Microfluidizer? Processor 에 통과시켰다. 에멀션을 생성물 아웃렛에서 수집한 후, 전체 6 개의 패스 (N = 6) 에 대해 반복적으로 미세유체 균질기를 통과시켜, (예컨대, 심플 에멀션 내의 단일 액적의, 그리고 더블 에멀션 내의 외부 액적 및 내부 액적의) 평균 액적 반경 <a> 을 감소시키고 에멀션 내의 액적의 단분산성을 증대시켰다. 다른 블록 코폴리펩티드 계면활성제를 사용하여 발생되는 에멀션에 대해 유사한 프로토콜을 사용하였다 (표 1, 도 7 의 A 내지 C). 내부 액적 반경을 외부 액적 반경으로 나눔으로써 주어지는 비율 ("I/O 비율" 로서 라벨링됨) 은 상이한 소수설 사슬 길이에 대해 대략 0.5 로 비교적 균일하였다 (표 1, 도 7 의 D). 리신 또는 류신 도메인이 상이한 친수성 잔기 또는 소수성 잔기로 각각 치환되어 있는 다른 양친매성 블록 코폴리펩티드가 또한 더블 에멀션을 형성하는 것으로 발견되었다 (도 8 의 A 내지 D). 상이한 폴리펩티드 계면활성제의 에멀션화 능력은 또한, 덜 안정한 에멀션을 형성하는 톨루엔을 사용하여 그리고 안정한 에멀션 또는 안정한 더블 에멀션을 산출하지 않는 대조군 호모폴리펩티드, K60 (도 9 의 A 및 B) 으로 질적으로 평가되었다.
보충 방법
물질.
테트라히드로푸란 (THF) 은, 사용 전에 질소 하에서 알루미나로 패킹된 칼럼을 통과시킴으로써 건조되었다 (Nowak, A. P. et al. Rapidly recovering hydrogel scaffolds from self-assembling diblock copolypeptide amphiphiles. Nature 417, 424-428 (2002)). 분자량은 Wyatt DAWN EOS 광 산란 검출기 및 Wyatt Optilab DSP 가 장착된 SSI 펌프 상에서 60 ℃ 에서 수행되는 탠덤 겔 투과 크로마토그래피/광 산란 (GPC/LS) 에 의해 획득되었다. 분리는 대략 5 mg/㎖ 의 폴리펩티드 농도 및 용리액으로서의 DMF 내의 0.1 M LiBr 을 사용하여 105, 104, 및 103 Å Phenomenex 5 ㎛ 칼럼에 의해 행해졌다. 적외선 스펙트럼은 폴리스티렌 필름을 사용하여 보정된 Perkin Elmer RXl FTIR 분광광도계 상에서 기록되었다. 1H NMR 스펙트럼은 Bruker AVANCE 400 MHz 분광계 상에서 기록되었다. 탈이온 (DI) 수는 Purelab Option 560 역삼투 정수기를 사용하여 정수되었다. 초순수 (18 MΩ) 는 Millipore Milli-Q Biocel AlO 정수 유닛으로부터 획득되었다. 실리콘 오일 (10 cSt, 폴리디메틸실록산, PDMS) 은 Gelest, Inc. 에 의해 공급되었다.
블록 코폴리펩티드 합성.
α-아미노산-N-카르복시무수물 NCA 모노머는 이미 공표된 문헌 프로토콜을 이용하여 합성되었다 (Id.). 결과로서 생기는 폴리펩티드는 GPC, 1H NMR 및 IR 분광법을 이용하여 특징지워졌다 (Id.). 공중합체의 조성은 D2O 에 기록되는 1H NMR 스펙트럼의 적분값의 분석에 의해 결정된다. 모든 조성은 예측값의 5 % 이내에 있는 것으로 발견되었다. 폴리머 사슬 길이 분포 (Mw/Mn) 는 1.1 내지 1.3 범위에 있었다. K60L20 은 공표된 절차를 이용하여 합성되었다 (Holowka, E. P., Pochan, D. J. & Deming, T. J. Charged polypeptide vesicles with controllable diameter. Journal of the American Chemical Society 127, 12423-12428 (2005)). 소수성 폴리(류신) 세그먼트의 사슬 배좌는 원형 이색성 분광법을 이용하여 확인되었고 (도 14), 여기서 폴리(리신) 세그먼트로부터의 기여는 상기 서술된 바와 같이 폴리(라세믹-리신) 세그먼트를 사용하여 제거되었다 (Nowak, A. P. et al. Rapidly recovering hydrogel scaffolds from self-assembling diblock copolypeptide amphiphiles. Nature 417, 424-428 (2002)).
폴리(N ε -CBZ-L-리신) 40 -b- 폴리(rac-류신) 20
질소 충진된 글러브 박스 내에서, CBZ-L-리신 NCA (10 g, 33 mmol) 이 THF (200 ㎖) 내에 용해되어 (플라스틱 스토퍼로 밀봉될 수 있는) 500 ㎖ 평저 플라스크 속에 배치되었다. 그후, (PMe3)4Co 의 분취액 (aliquot) (THF 내의 48 mg/㎖ 용액의 16 ㎖) 을 주사기를 통해 플라스크에 첨가하였다. 교반바를 부가하고, 그후 플라스크를 밀봉하여 45 분간 교반하였다. GPC 분석을 위해 중합 용액으로부터 분취액 (50 ㎕) 을 제거하였다 (Mn = 11,000, Mw/Mn = 1.24). L-류신 NCA (1.3 g, 8.2 mmol) 및 D-류신 NCA (1.3 g, 8.2 mmol) 를 THF (50 ㎖) 내에 용해시킨 후, 중합 혼합물에 첨가하였다. 별도 16 시간 동안 교반한 후, FTIR 분석은 모노머의 완전한 소진을 나타내었고, 이전에 보고된 결과와 유사하였다 (Id.).
폴리(L-리신-HBr) 40 -b- 폴리(rac-류신) 20 , K 4O ( rac-L) 20 .
상기 내용으로부터의 폴리(Nε-CBZ-L-리신)40-b-폴리(rac-류신)20 용액을 드라이박스로부터 제거하고, 감압 하에서 THF 를 제거하였다. 그후, 블록 코폴리펩티드를 트리플루오로아세트산 (TFA) (350 ㎖) 에 용해하고, 1ℓ 평저 플라스크에 옮겨 아이스배쓰 속에 배치하였다. 그후, HBr (아세트산 내 33%) 을 첨가하고 (40 ㎖, 131 mmol), 반응물을 2 시간 동안 교반하였다. 탈보호된 폴리머는 반응 혼합물에 디에틸 에테르 (400 ㎖) 의 첨가 후 원심분리에 의해 분리되었다. 그후, 분리된 폴리머를 탈이온수에 용해하고, 수계 테트라소듐 EDTA (3 mmol, 2 일), 수계 HCl (100 mmol, 2 일), 탈이온수 (1 일), 수계 LiBr (100 mmol, 2 일), 마지막으로 탈이온수 (1 일) 로, 각 용액을 3 회/하루 변경하면서 투석하였다 (6,000-8,000 MWCO 멤브레인을 사용). 투석된 폴리머를 동결건조에 의해 분리하여 건조 백색 분말로서의 생성물을 제공하였다 (4.8 g, 70 %). 블록 코폴리펩티드에 대해 FTIR 및 1H-NMR 을 수행하였고, 이전 결과와 유사함이 발견되었다 (Id.).
FITC 기능화된 K 4O (rac-L) 1O .
K40(rac-L)20 과 유사한 방식으로 K4O(rac-L)10 공중합체를 제조하였다. 제 1 세그먼트 (폴리 CBZ-L-리신) 의 GPC 분석 : Mn=10,500, Mw/Mn = 1.20. 탈보호된 공중합체 (150 mg, 1.3 × 10-2 mmol) 를 수중에 용해하고 125 ㎖ 평저 플라스크 내에 배치하였다. 그후, NaHCO3 (160 mg, 19 mmol) 을 그 용액에 첨가하였다. 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) (5.0 mg, 1.3 × 10-2 mmol) 를 건조 DMSO (1 ㎖) 에 용해시켜 폴리머 용액에 첨가하였다. 교반바를 부가하고, 반응 혼합물을 하룻밤 동안 교반하였다. 폴리머 용액을 탈이온수로 3 일 동안, 물을 3 회/ 하루 변경하면서 투석하였다 (6,000-8,000 MWCO 멤브레인을 사용). 투석된 폴리머를 동결건조에 의해 분리하여 폴리머 사슬 당 대략 1 플루오레세인 단위를 함유하는 황색-적황색 폴리머를 산출하였다 (130 mg, 87%). 유사한 절차를 이용하여 FITC 기능화된 K60L20 공중합체를 제조되었다.
FITC - K 40 ( rac -L) 1O 안정화된 더블 에멀션의 상이한 상으로 형광 프로브를 로딩.
소수성 상을 라벨링하기 위해, 0.01 M 의 농도로 실리콘 오일에 피렌을 용해시켰다. 수계 상을 라벨링하기 위해, 수용성 퀀텀 도트 (Evident Technologies, Type T2-MP 650 nm Macoun Red InGaP/ZnS, 아민-기능화됨) 를 2 μM 의 농도로 수계 상에 분산시켰다. 에멀션을 제조하기 위해, FITC-라벨링된 K4O(rac-L)1O (C = 0.1 mM 용액 150 ㎕) 및 InGaP 퀀텀 도트 (8 μM 용액 50 ㎕) 용액을 10 cSt 실리콘 오일 중의 피렌 (0.01 M 피렌 용액 50 ㎕) 과 혼합하였다. 이 혼합물을 초음파 팁 균질기 (35% 의 출력) 를 사용하여 10 초간 에멀션화하였다. 동일한 절차를 FITC-K60L20 블록 코폴리펩티드 계면활성제에 대해 수행하였다. 이미징 이전에, 비캡슐화된 퀀텀 도트를 탈이온수로 투석하여 제거하였다.
본 발명을 다양한 실시형태에 대해 상세하게 설명하였으며, 이제 당업자는 상기 내용으로부터 보다 넓은 양태에서 본 발명으로부터 벗어나지 않는 한 변화 및 변형이 이루어질 수도 있다는 것이 명백할 것이고, 따라서 청구범위에서 정의되는 바와 같이, 본 발명은 모든 이러한 변화 및 변형이 본 발명의 진정한 사상 내에 속하는 한 그들을 커버하도록 의도된 것이다.
예컨대, W/O/W 더블 에멀션을 보다 높은 오일 체적 분율 φ 로 제작하는 것이 바람직할 수 있다. 더블 에멀션은 외부 액적의 일차 분산된 상의 희석된 체적 분율 φ << 1 내지 φ
Figure 112010016960120-pct00018
0.4 까지 그리고 절차의 단순 및 적절한 변형을 통해, 몇몇 실시형태에 있어서 약 φ
Figure 112010016960120-pct00019
0.6 까지 범위의 φ 에서 에멀션화를 통해 일상적으로 형성될 수 있다. 이러한 알려진 체제를 확장시키는 어떤 특정 실시형태는 φ > 0.6, 약 φ
Figure 112010016960120-pct00020
0.9 까지 달성할 수 있다고 고려할 수 있다. 특정한 φ 에서 에멀션화한 후에, (심플 단일 액적 그리고 더블 액적도 포함하는) 액적 구조는 후속하여, 증발, 투석, 원심분리, 초원심분리, 여과, 및 미세유체 농도를 포함하는 방법을 통해 삼투 응력을 적용함으로써 보다 높은 φ 로 농출될 수 있다. 에멀션이 농축될 수 있고 여전히 안정하게 잔류하는 최대 체적 분율은, 공중합체가 탄성 계면을 안정화시키는 방식 및 액적 사이즈를 포함한 여러 인자에 의존될 수 있다. 특정 실시형태에 대해, 농도는 φ
Figure 112010016960120-pct00021
0.95 까지 달성될 수 있다. 나노스케일 액적에 대해, 에멀션화 프로세스 이후의 농축 프로세스를 통해 약 φ
Figure 112010016960120-pct00022
0.8 까지의 체적 분율에 도달하는 것은 보다 일반적이다.
더블 에멀션을 제작한 후에, 본 발명의 몇몇 실시형태에 따라 우리는 통상 원심분리, 초원심분리, 외부-액적 사이즈-의존 인력 등과 같은 사이즈 분획화의 방법을 이용하여 보다 큰 외부 액적으로부터 보다 작은 외부 액적을 분리할 수 있다. 또한, 액적의 부력은 내부 액적 체적 및 외부 액적 체적 둘다에 의해 결정되는 액적 밀도에 의존하기 때문에, 이것은 내부 액적 체적을 분리해내기 위해 잠재적으로 이용될 수도 있다.
본 명세서에서 지칭되는 "경계 표면 영역" 이란 하기의 것을 포함한다. 당업자는 통상, 이차 분산된 상 (즉, 물의 내부 액적) 과 연속상 (즉, 수용액) 사이에 일차 분산된 상 (즉, 오일) 의 "필름" 이 있다는 것을 말한다. 안정한 더블 에멀션에 있어서, 열적 구동 응력, 화학적 구동 응력, 및 은근한 외부적 휘젓기 (예컨대, 물리적 전단 응력) 에 견딜 수 있는 이 필름의 분해 압력 (disjoining pressure) 이 있으므로, 이 필름은 "안정" 하다고 불린다. 필름의 안정성은 (일반적으로 수락되는 컨벤션에 의해) 반대 징후의 평균 곡률을 갖는 2 개의 오일-물 계면의 유착에 대한 내성과 동등하다. 또한, 유착을 통한 조대화로부터의 외부 액적의 안정성은 일반적으로, 상온 보관가능하게 (shelf-stable) 잔류하는 유용한 생성물을 갖는 것이 바람직하다. 이 경우, 또한, 가까이 접근할 수도 있는 2 개의 외부 액적의 오일-물 계면을 분리하는 연속상의 물 필름 내에 반발하는 분해 압력을 생성하는 적어도 단기간 척력이 있다.
또한, 본 발명의 추가적인 실시형태에 따라, 다른 종류의 물질이 안정화제 또는 표면 개질제로서 사용될 수 있고, 이것은 더블 에멀션 및 다중 에멀션의 계면을 안정화시키는 블록 공중합체에 잠재적으로 통합될 수 있다. 몇몇 잠재적인 공중합체는, 리포-폴리펩티드, 글리코-폴리펩티드, 및 다중핵산-폴리펩티드 (즉, 폴리펩티드-폴리뉴클레오티드 공중합체) 를 포함한다. 예컨대, 충전된 올리고뉴클레오티드 또는 짧은 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, RNA 등) 은 친수성 블록으로 치환될 수 있고, 라세믹 소수성 블록 (예컨대, rac-L) 에 부착되어 바람직한 용해도 및 계면 안정성 특성을 제공한다.
다른 실시형태는 PEG-변형된 블록 공중합체 : 폴리-(에틸렌 글리콜)-폴리-(펩티드) 를 포함할 수 있으며, (이러한 PEG 화된 분자가 많은 추가적인 계면 안정성을 생성하지 않을 수도 있지만) 구체적으로 안정한 더블 에멀션의 표면을 장식하기 위해 그리고 더블 에멀션을 제작하는데 사용하기 위해 PEG-변형된 블록 공중합체가 포함된다. PEG 및 PEG 유도체는 약물 전달 운반체에 대한 양호한 저항성 코팅을 제공하는 것으로 알려져 있어서, PEG-변형된 더블 에멀션은 혈류의 순환에서 더 오래 잔존할 수 있다고 기대된다.
더블 에멀션 및 더블 나노에멀션에 함유되는 카고 (예컨대, 약물 분자) 의 릴리즈는 pH, 이온 세기, 온도, 화학적 환경, 또는 그 조합의 변화에 의해 유발될 수 있다고 합리적으로 예상할 수 있다. 이러한 변화는 배좌, 밀도, 및 오일-물 계면에서 잔류하는 코폴리펩티드들 간의 상호작용에 영향을 미칠 수 있고, 이에 따라 안정성을 변화시키고 릴리즈에 적합한 조건을 생성한다. 마찬가지로, 그들 액체 성질 때문에, 본 발명의 몇몇 실시형태에 따라, 더블 에멀션이 사람을 포함하는 유기체에 도입될 경우, 우수한 클리어런스 (clearance) 특성을 발현할 수 있고 예상할 수 있다. 이러한 클리어런스 특성은 유기체가 액적 물질 및 연관된 안정화 물질을 클리어하는 (clear) (즉, 소화하거나 (digest), 배설하거나 (excrete), 또는 다른 방식으로 없애는) 메커니즘을 지칭한다.
단일 액적, 더블 액적, 및 다중 액적 구조를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 액적 구조를 안정화시키는 공중합체의 분자 조성의 일부가 되도록 하기 천연 아미노산이 중합될 수 있다고 합리적으로 예상할 수 있다. 이러한 안정화는 나노스케일 및 보다 큰 액적 구조를 마무른다. 이들 아미노산은 키랄 (chiral), 거울상 이성질체적, 및 다른 분자 사양, 예컨대, H-, L-, Z- D-, LD-, 및 rac- 형태를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 형태로 나타날 수도 있다. '천연' 이라는 분류는 다소 임의적이지만, '천연' 아미노산에 대한 양호한 가이드는 Sigma-Aldrich? 와 같은 대형 생화학 및 화학 공급회사의 카탈로그에서의 제품 리스트로부터 추정될 수 있다. 예컨대, 그들의 카탈로그에서, 하기 아미노산에 대해 매우 다양한 합성 전구체가 이용가능하다 : 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인/시스틴, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 발린.
상기 서술된 예의 다수는, 코폴리펩티드 내의 소수성 블록에 대해 전적으로 라세믹 아미노산을 사용하는 것이 더블 에멀션 구조의 안정화 및 형성을 촉진할 수 있다고 증명하지만, 이 발명의 일반적인 양태는 이들 예에만 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 본 발명의 몇몇 실시형태에 따라 더블 에멀션의 안정화 및 형성을 촉진하는 바람직한 특성을 여전히 제공할 수 있고, 비라세믹 아미노산의 부분 (즉, 일부 라세믹 성질을 함유하는 소수성 블록 내부의 일렬로 몇몇 L-아미노산의 서브섹션 및/또는 일렬로 몇몇 D-아미노산의 서브섹션 중 어느 것) 을 함유하는 소수성 블록을 갖는 코폴리펩티드를 설계 및 합성하는 것이 가능하다. 마찬가지로, 우리는 코폴리펩티드 내의 소수성 블록에 비라세믹 아미노산을 사용하는 것은 단일 에멀션의 안정화 및 형성을 촉진하는 경향일 수 있는 예를 나타내었지만, 본 발명의 몇몇 실시형태에 따라 단일 에멀션의 안정화 및 형성을 촉진하는 바람직한 특성을 여전히 제공할 수 있고 라세믹 아미노산의 부분을 함유하는 소수성 블록을 갖는 코폴리펩티드를 설계 및 합성하는 것이 가능하다.
다른 천연 아미노산-관련 구조를 중합하여, 더블 에멀션 및 더블 나노에멀션 구조를 안정화시키는 공중합체의 분자 조성의 일부를 형성할 수 있다. 이들은 하기의 것을 포함한다 : 아미노 알콜, 아미노 알데히드, 아미노 락톤, 및 n-메틸 아미노산.
단일, 더블 및 다중 에멀션을 안정화시키는 공중합체의 일부일 수 있는 비천연 (unnatural) 아미노산 및 아미노산 유도체의 예는 : 알라닌 유도체, 지환식 아미노산, 아르기닌 유도체, 방향족 아미노산, 아스파라긴 유도체, 아스파르트산 유도체, 베타-아미노산, 시스테인 유도체, DAB (2,4-디아미노부티르산), DAP (2,3-디아미노프로피온산), 글루타민산 유도체, 글루타민 유도체, 글리신 유도체, 히스티딘 유도체, 호모-아미노산, 이소류신 유도체, 류신 유도체, 선형 코어 아미노산, 리신 유도체, n-메틸 아미노산, 노르류신, 노르발린, 오르니틴, 페니실라민, 페닐알라닌 유도체, 페닐글리신 유도체, 프롤린 유도체, 피로글루타민 유도체, 세린 유도체, 트레오닌 유도체, 트립토판 유도체, 타이로신 유도체, 발린 유도체와, 생화학 및 화학 공급회사의 일반적인 카탈로그에서 나열되는 분자 조성 및 구조의 100 초과의 '다른' 유도체가 있다. 예컨대, Sigma-Aldrich? in Aug., 2008 의 제품으로서 나열된 1000 종류 이상의 비천연 아미노산 유도체가 있다. 이러한 수치는, 에멀션, 더블 에멀션, 및 다중 에멀션을 안정화시키기 위해 사용되는 코폴리펩티드에 통합될 수 있는 대안적인 다른 분자 구조를 제공할 것이고, 성장시키는 경향이 있다. 단일 에멀션 또는 더블 에멀션을 안정화시키는데 적합한 복잡한 양친매성 공중합체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 잠재적인 분자 성분의 다른 소스로는, 수많은 종류의 아미노산 유도체, 특정 아미노산, 수지-연결된 아미노산, 및 다른 링커 (linker) 와 시약을 기술하는, BACHEM Americas Inc. 의 2008 "Building Blocks" 및 "Peptides and Biochemicals" 카탈로그 (www.bachem.com) 가 있다.
액적을 안정화시키는 공중합체는, 인접한 외부 액적의 계면 상의 공중합체 분자들 사이에, 인접한 내부 액적의 계면 상의 공중합체 분자들 사이에, 그리고 동일 더블 또는 다중 에멀션 구조 내의 인접한 내부 및 외부 계면상의 공중합체 분자들, 동일한 계면 상의 공중합체 분자들 사이에 연결 및/또는 커플링 기능성을 제공하기 위해, 화학적 또는 물리적 변화를 통해 활성화될 수 있는 반응성 기 (예컨대, 중합성 기, pH-민감성 기, 광반응성 기, 및 광중합성 기) 를 포함하는 분자 조성 및 구조를 가질 수 있다.
액적 구조를 안정화시키는 공중합체는, 효소 및 촉매 기능성을 가질 수 있다. 이들은 다음을 포함한다 : 효소, 분석 효소, 보인자 (Cofactor), 콜라게나제 (Collagenase), 효소 억제제, 효소-매개성 합성, 안정화제, 효소 기질 (Enzyme Substrate), 렉틴 (Lectin), 분자 생물학 효소, 키나아제 (Kinase), 포스파타제 (Phosphatase), 및 단백질 분해 (proteolytic) 효소 및 기질. 공중합체의 다른 바람직한 기능성 분자 성분이 또한 선택되고, 아민 보호제, 구아나딘 보호제 및 구아니딘화제 (guanidinylation) 와 같은 공중합체에 통합될 수 있다.
공중합체의 분자 조성의 일부를 형성하기 위해 중합될 수 있는 유용한 합성 구조는, 마이크로스케일 액적 구조이든 나노스케일 액적 구조이든, 단일 액적, 더블 액적, 및 다중 액적을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 액적 구조를 안정화시킨다. 이들 합성 구조는 하기의 것을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다 : 폴리-(에틸렌 글리콜) (PEG), 기능화된 올리고에틸렌 글리콜, 단일기능적 PEG, 호모이기능적 (homobifunctional) PEG, 헤테로이기능적 (heterobifunctional) PEG, PEG 화된 올리고뉴클레오티드, 및 PEG 화된 펩티드.
일반적으로, 우리가 본 명세서에 기재한 것과 유사한 더블 에멀션에 안정화를 제공하기 위해 조성, 구조 및 기능의 적어도 몇몇 양태를 모방하는 합성 유도체 분자를 합리적으로 예상할 수 있다. 따라서, 미래에 개발되는 새로운 비천연 아미노산-유사 분자가 또한 더블 및 다중 에멀션 구조를 안정화시키기 위해 사용될 수 있는 것을 합리적으로 예상할 수 있다.
Figure 112010016960120-pct00023
* = GPC-LS 를 사용하여 결정되는 수 평균 분자 질량
** = 이 샘플은 원심분리 이후 초원심분리에 의해 보다 큰 액적으로부터 분획화되었다.
# = 이 샘플은 심플 W/O 에멀션을 형성하였다.
Figure 112010016960120-pct00024
= 10 cSt PDMS 의 오일/물 계면 장력 데이터 : 10 mM 수계 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 용액과 접촉하여 = 12.4 dyne/cm ; 탈이온수와 접촉하여 = 40.7 dyne/cm.
N/A = 실험을 행하지 않았음
표 1. 에멀션을 제조하는데 사용되는 블록 코폴리펩티드 계면활성제. 모든 에멀션은 하기 조건하에서 미세유체 균질기를 사용하여 제조되었다 : 패스의 수 N = 6, 균질기 인렛 공기 압력 p = 130 psi, 블록 코폴리펩티드 농도 C = 1.0 mM, 및 오일 체적 분율 φ = 0.20. 외부 액적의 (직경) 및 내부/외부 직경비는 CTEM 이미지로부터 적어도 50 개의 액적의 측정치를 평균함으로써 구하였다. 임계 응집 농도 (CAC) 값은 20 ℃ 에서 피렌 형광을 이용하여 구하였다. 수용해도 한계는 광학적으로 클리어한 용액을 생성할 때까지 각각의 폴리펩티드의 15 mM 스톡 용액을 희석함으로써 측정되었다. 블록 공중합체는 PDMS 내에서 무시할 수 있는 용해도를 가지고 있었다. 오일/물 계면 장력 데이터는 10 cSt PDMS 및 블록 코폴리펩티드 용액을 사용하여 Du Nouy 링 방법을 이용하여 측정되었다 (0.1 mM, 풀 레이트 (pull rate) = 0.01 mm/s, 25 ℃).

Claims (64)

  1. 실질적으로 연속적인 액체 매질; 및
    상기 실질적으로 연속적인 액체 매질 내부에 분산된 복수의 액적 구조를 포함하고:
    상기 복수의 액적 구조의 각각의 액적 구조는,
    외부 표면을 갖는 제 1 액체의 외부 액적,
    상기 제 1 액적 내부에 내부 표면을 갖는 제 2 액체의 내부 액적으로서, 상기 제 2 액체는 상기 제 1 액체에 비혼화성이고, 상기 내부 액적 및 상기 외부 액적은 그 사이의 경계 표면 영역에 상기 제 1 액체의 필름을 갖는, 상기 제 2 액체의 내부 액적,
    상기 외부 액적의 상기 외부 표면 상에 배치된 블록 공중합체의 외부층, 및
    상기 외부 액적과 상기 내부 액적 사이의 상기 경계 표면 영역 근방에 상기 내부 액적의 상기 내부 표면 상에 배치된 블록 공중합체의 내부층을 포함하고,
    상기 블록 공중합체의 외부층 및 내부층은 친수성 폴리머 블록 및 소수성 폴리머 블록을 포함하고, 상기 친수성 폴리머 블록 및 상기 소수성 폴리머 블록은 함께 상기 액적 구조를 안정화시키도록 작용하고,
    상기 친수성 폴리머 블록은 친수성 아미노산을 포함하는 친수성 폴리펩티드 블록을 포함하고, 상기 소수성 폴리머 블록은 소수성 아미노산을 포함하는 소수성 폴리펩티드 블록을 포함하며,
    상기 제 1 액체는 상기 실질적으로 연속적인 액체 매질에 비혼화성이며,
    상기 액적 구조는 1000 nm 그리고 10 nm 초과인 미변형 액적 직경에 대응하는 최대 치수를 갖는 에멀션.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 액적 구조는 250 nm 미만 그리고 50 nm 초과인 미변형 액적 직경에 대응하는 최대 치수를 갖는, 에멀션.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 블록 공중합체의 내부층의 블록 공중합체는, 상기 블록 공중합체의 외부층의 블록 공중합체와 실질적으로 동일한 분자 형태인, 에멀션.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 친수성 폴리머 블록은 200 Da 내지 3,000,000 Da 범위의 분자량을 가지며,
    상기 소수성 폴리머 블록은 200 Da 내지 3,000,000 Da 범위의 분자량을 갖는, 에멀션.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 내부 액적의 평균 반경을 상기 외부 액적의 평균 반경에 의해 나눔으로써 정의되는 무차원 비율은, 0.9 미만 그리고 0.05 초과인, 에멀션.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 블록 공중합체의 내부층은 2개의 구별가능하게 상이한 모노머 종류의 중합으로부터 형성된 디블록 공중합체의 층이고,
    상기 블록 공중합체의 외부층은 상기 2개의 구별가능하게 상이한 모노머 종류의 중합으로부터 형성된 디블록 공중합체의 층인, 에멀션.
  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 친수성 폴리머 블록은 2개 이상의 종류의 친수성 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 블록이고,
    상기 소수성 폴리머 블록은 2개 이상의 종류의 소수성 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 블록인, 에멀션.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 친수성 아미노산은, L-아르게닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루타민산, L-글루타민, L-히스티딘, L-리신, L-세린, L-트레오닌, L-타이로신, D-아르게닌, D-아스파라긴, D-아스파르트산, D-시스테인, D-글루타민산, D-글루타민, D-히스티딘, D-리신, D-세린, D-트레오닌, D-타이로신, DL-아르게닌, DL-아스파라긴, DL-아스파르트산, DL-시스테인, DL-글루타민산, DL-글루타민, DL-히스티딘, DL-리신, DL-세린, DL-트레오닌, DL-타이로신, 및 그 임의의 조합으로 이루어진 친수성 아미노산 군으로부터 선택되는, 에멀션.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 소수성 아미노산은, 라세믹-알라닌, 라세믹-글리신, 라세믹-이소류신, 라세믹-류신, 라세믹-메티오닌, 라세믹-페닐아날린, 라세믹-프롤린, 라세믹-트립토판, 라세믹-발린, 및 그 임의의 조합으로 이루어진 소수성 아미노산 군으로부터 선택되는, 에멀션.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 소수성 아미노산은, 라세믹-알라닌, 라세믹-글리신, 라세믹-이소류신, 라세믹-류신, 라세믹-메티오닌, 라세믹-페닐아날린, 라세믹-프롤린, 라세믹-트립토판, 라세믹-발린 및 그 임의의 조합으로 이루어진 소수성 아미노산 군으로부터 선택되는, 에멀션.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 친수성 아미노산 및 상기 소수성 아미노산은, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 발린, 및 그 임의의 조합으로 이루어진 아미노산 군으로부터 선택되는, 에멀션.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 친수성 아미노산은 L-리신이고,
    상기 소수성 아미노산은 라세믹-류신인, 에멀션.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 블록 공중합체는, 식 KxrLy 를 만족하는 구조를 갖는 블록 코폴리펩티드이고,
    여기서 K 는 L-리신을 나타내고, rL 은 라세믹-류신을 나타내고, x 는 10 내지 200 범위의 정수이고, y 는 3 내지 30 범위의 정수인, 에멀션.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 내부 액적의 상기 제 2 액체는 친수성이고, 그 내부에 블렌드된 또는 분산된, 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 염, 바이러스, 비타민, 혈청, 리세이트, ATP, GTP, 몰레큘러 모터, 친수성 약물 분자, 세포, 베시클, 나노액적, 나노파티클, 풀러렌, 단일벽 탄소 나노튜브, 다중벽 탄소 나노튜브, 세포질, 리보솜, 효소, 글루코오스, 헤모글로빈, 골지, 덴드리머, 계면활성제, 지방질, 알부민, 음이온, 양이온, 완충제, 설탕, 당류, 퀀텀 도트, 점토 나노파티클, 금속 나노클러스터, 금속 나노파티클, 자기 반응성 산화철 나노파티클, 유기 나노스피어, 유기 나노파티클, 무기 나노스피어, 무기 나노파티클, 형광 염료, 트랜스펙션 약제, 안티셉틱 물질 (antiseptic material), 항균성 물질 (antimicrobial material), 전자 방사선 흡수 물질, 동위원소적으로 특정 물질 (isotopically specific material), 방사성 동위원소를 함유하는 분자, 조영 증강제 (imaging-contrast enhancement agent), 세포의 기능을 붕괴시키는 약제, 세포의 기능을 증강시키는 약제, 세포의 하위구조를 붕괴시키는 약제, 세포의 하위구조를 변경시키는 약제, 세포의 대사 경로 (cellular metabolic pathway) 에 영향을 주는 약제, 세포의 아포토시스 (cellular apoptosis) 를 트리거하는 약제, 및 그 조합 중 적어도 하나를 더 포함하는, 에멀션.
  17. 제 1 항에 있어서,
    상기 외부 액적의 상기 제 1 액체는 소수성이고, 그 내부에 블렌드된 또는 분산된, 지방, 지방질, 왁스, 천연 오일, 합성 오일, 실리콘 오일, 휘발유 (volatile oil), 에센셜 오일 (essential oil), 방향제 (fragrance), 콜레스테롤, 스테로이드, 소수성 약물 분자, 폴리머, 블록 공중합체, 다중산, 다염기, 폴리펩티드, 블록 코폴리펩티드, 미셀 (micelle), 퀀텀 도트, 나노파티클, 나노클러스터, 탄소 나노튜브, 풀러렌, 자성유체 (ferrofluid), 서모트로픽 액정, 리오트로픽 액정, 불소화된 액체, 브롬화된 액체, 식물 유래의 물질, 동물 유래의 물질, 박테리아 유래의 물질, 및 그 조합 중 적어도 하나를 더 포함하는, 에멀션.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 외부 액적의 상기 제 1 액체는 소수성이고, 그 내부에 블렌드된 또는 분산된, 지방, 지방질, 왁스, 천연 오일, 합성 오일, 실리콘 오일, 휘발유, 에센셜 오일, 방향제, 콜레스테롤, 스테로이드, 소수성 약물 분자, 폴리머, 블록 공중합체, 폴리펩티드, 블록 코폴리펩티드, 다중산, 다염기, 미셀, 퀀텀 도트, 나노파티클, 나노클러스터, 탄소 나노튜브, 풀러렌, 자성유체, 서모트로픽 액정, 리오트로픽 액정, 불소화된 액체, 브롬화된 액체, 식물 유래의 물질, 동물 유래의 물질, 박테리아 유래의 물질, 및 그 조합 중 적어도 하나를 더 포함하는, 에멀션.
  19. 액적 구조로서:
    외부 표면을 갖는 제 1 액체의 외부 액적;
    상기 제 1 액적 내부에 내부 표면을 갖는 제 2 액체의 내부 액적으로서, 상기 제 2 액체는 상기 제 1 액체에 비혼화성이고, 상기 내부 액적 및 상기 외부 액적은 그 사이의 경계 표면 영역에 상기 제 1 액체의 필름을 갖는, 상기 제 2 액체의 내부 액적;
    상기 외부 액적의 상기 외부 표면 상에 배치된 블록 공중합체의 외부층; 및
    상기 내부 액적의 상기 내부 표면 상에 배치된 블록 공중합체의 내부층을 포함하고,
    상기 블록 공중합체의 외부층 및 내부층은 친수성 폴리머 블록 및 소수성 폴리머 블록을 포함하고, 상기 친수성 폴리머 블록 및 상기 소수성 폴리머 블록은 함께 상기 외부 액적의 상기 외부 표면이 상기 내부 액적의 상기 내부 표면과 유착하는 것으로부터 안정화시키고 상기 액적 구조가 다른 액적 구조와 유착하는 것으로부터 안정화시키도록 작용하고,
    상기 친수성 폴리머 블록은 친수성 아미노산을 포함하는 친수성 폴리펩티드 블록을 포함하고, 상기 소수성 폴리머 블록은 소수성 아미노산을 포함하는 소수성 폴리펩티드 블록을 포함하며,
    상기 액적 구조는 1000 nm 미만 그리고 10 nm 초과인 미변형 액적 직경에 의해 주어지는 최대 치수를 갖는 액적 구조.
  20. 삭제
  21. 제 19 항에 있어서,
    상기 액적 구조는 250 nm 미만 그리고 50 nm 초과인 미변형 액적 직경에 의해 주어지는 최대 치수를 갖는, 액적 구조.
  22. 제 19 항에 있어서,
    상기 블록 공중합체의 내부층의 블록 공중합체는, 상기 블록 공중합체의 외부층의 블록 공중합체와 실질적으로 동일한 분자 형태인, 액적 구조.
  23. 제 19 항에 있어서,
    상기 친수성 폴리머 블록은 200 Da 내지 3,000,000 Da 범위의 분자량을 가지며,
    상기 소수성 폴리머 블록은 200 Da 내지 3,000,000 Da 범위의 분자량을 갖는, 액적 구조.
  24. 제 19 항에 있어서,
    상기 외부 액적의 반경을 상기 내부 액적의 반경에 의해 나눔으로써 주어지는 비율은, 0.9 미만 그리고 0.05 초과인, 액적 구조.
  25. 제 19 항에 있어서,
    상기 블록 공중합체의 내부층은 2개의 구별가능하게 상이한 모노머 종류의 중합으로부터 형성된 디블록 공중합체의 층이고,
    상기 블록 공중합체의 외부층은 상기 2개의 구별가능하게 상이한 모노머 종류의 중합으로부터 형성된 디블록 공중합체의 층인, 액적 구조.
  26. 삭제
  27. 제 19 항에 있어서,
    상기 친수성 폴리펩티드 블록 및 상기 소수성 폴리펩티드 블록 중 적어도 하나는 표면 기능성을 제공하기 위한 표면 모이어티를 포함하는, 액적 구조.
  28. 제 19 항에 있어서,
    상기 친수성 폴리머 블록은 2개 이상의 종류의 친수성 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 블록이고,
    상기 소수성 폴리머 블록은 2개 이상의 종류의 소수성 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 블록인, 액적 구조.
  29. 제 19 항에 있어서,
    상기 친수성 아미노산은, L-아르게닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루타민산, L-글루타민, L-히스티딘, L-리신, L-세린, L-트레오닌, L-타이로신, D-아르게닌, D-아스파라긴, D-아스파르트산, D-시스테인, D-글루타민산, D-글루타민, D-히스티딘, D-리신, D-세린, D-트레오닌, D-타이로신, DL-아르게닌, DL-아스파라긴, DL-아스파르트산, DL-시스테인, DL-글루타민산, DL-글루타민, DL-히스티딘, DL-리신, DL-세린, DL-트레오닌, DL-타이로신, 및 그 임의의 조합으로 이루어진 친수성 아미노산 군으로부터 선택되는, 액적 구조.
  30. 제 19 항에 있어서,
    상기 소수성 아미노산은, 라세믹-알라닌, 라세믹-글리신, 라세믹-이소류신, 라세믹-류신, 라세믹-메티오닌, 라세믹-페닐아날린, 라세믹-프롤린, 라세믹-트립토판, 라세믹-발린, 및 그 임의의 조합으로 이루어진 소수성 아미노산 군으로부터 선택되는, 액적 구조.
  31. 제 29 항에 있어서,
    상기 소수성 아미노산은, 라세믹-알라닌, 라세믹-글리신, 라세믹-이소류신, 라세믹-류신, 라세믹-메티오닌, 라세믹-페닐아날린, 라세믹-프롤린, 라세믹-트립토판, 라세믹-발린 및 그 임의의 조합으로 이루어진 소수성 아미노산 군으로부터 선택되는, 액적 구조.
  32. 제 19 항에 있어서,
    상기 친수성 아미노산 및 상기 소수성 아미노산은, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 발린, 및 그 임의의 조합으로 이루어진 아미노산 군으로부터 선택되는, 액적 구조.
  33. 제 19 항에 있어서,
    상기 친수성 아미노산은 L-리신이고,
    상기 소수성 아미노산은 라세믹-류신인, 액적 구조.
  34. 제 19 항에 있어서,
    상기 블록 공중합체는, 식 KxrLy 를 만족하는 구조를 갖는 블록 코폴리펩티드이고,
    여기서 K 는 L-리신을 나타내고, rL 은 라세믹-류신을 나타내고, x 는 10 내지 200 범위의 정수이고, y 는 3 내지 30 범위의 정수인, 액적 구조.
  35. 제 19 항에 있어서,
    상기 내부 액적의 상기 제 2 액체는 친수성이고, 그 내부에 블렌드된 또는 분산된, 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 염, 바이러스, 비타민, 혈청, 리세이트, ATP, GTP, 몰레큘러 모터, 친수성 약물 분자, 세포, 베시클, 나노액적, 나노파티클, 풀러렌, 단일벽 탄소 나노튜브, 다중벽 탄소 나노튜브, 세포질, 리보솜, 효소, 글루코오스, 헤모글로빈, 골지, 덴드리머, 계면활성제, 지방질, 알부민, 음이온, 양이온, 완충제, 설탕, 당류, 퀀텀 도트, 점토 나노파티클, 금속 나노클러스터, 금속 나노파티클, 자기 반응성 산화철 나노파티클, 유기 나노스피어, 유기 나노파티클, 무기 나노스피어, 무기 나노파티클, 형광 염료, 트랜스펙션 약제, 안티셉틱 물질, 항균성 물질, 전자 방사선 흡수 물질, 동위원소적으로 특정 물질, 방사성 동위원소를 함유하는 분자, 조영 증강제, 자기공명이미징 (magnetic resonance imaging) 증강제, X선 이미징 증강제, 중성자 이미징 (neutron imaging) 증강제, 양전자 방사 단층촬영 (positron-emission tomography) 증강제, 광산란 증강제, 세포의 기능을 붕괴시키는 약제, 세포의 기능을 증강시키는 약제, 세포의 하위구조를 붕괴시키는 약제, 세포의 하위구조를 변경시키는 약제, 세포의 대사 경로에 영향을 주는 약제, 세포의 아포토시스를 트리거하는 약제, 및 그 조합 중 적어도 하나를 더 포함하는, 액적 구조.
  36. 제 19 항에 있어서,
    상기 외부 액적의 상기 제 1 액체는 소수성이고, 그 내부에 블렌드된 또는 분산된, 지방, 지방질, 왁스, 천연 오일, 합성 오일, 실리콘 오일, 휘발유, 에센셜 오일, 방향제, 콜레스테롤, 스테로이드, 소수성 약물 분자, 폴리머, 블록 중합체, 다중산, 다염기, 폴리펩티드, 블록 폴리펩티드, 미셀, 퀀텀 도트, 나노파티클, 나노클러스터, 탄소 나노튜브, 풀러렌, 자성유체, 서모트로픽 액정, 리오트로픽 액정, 불소화된 액체, 브롬화된 액체, 식물 유래의 물질, 동물 유래의 물질, 박테리아 유래의 물질, 및 그 조합 중 적어도 하나를 더 포함하는, 액적 구조.
  37. 제 35 항에 있어서,
    상기 외부 액적의 상기 제 1 액체는 소수성이고, 그 내부에 블렌드된 또는 분산된, 지방, 지방질, 왁스, 천연 오일, 합성 오일, 실리콘 오일, 휘발유, 에센셜 오일, 방향제, 콜레스테롤, 스테로이드, 소수성 약물 분자, 폴리머, 블록 중합체, 다중산, 다염기, 폴리펩티드, 블록 폴리펩티드, 미셀, 퀀텀 도트, 나노파티클, 나노클러스터, 탄소 나노튜브, 풀러렌, 자성유체, 서모트로픽 액정, 리오트로픽 액정, 불소화된 액체, 브롬화된 액체, 식물 유래의 물질, 동물 유래의 물질, 박테리아 유래의 물질, 및 그 조합 중 적어도 하나를 더 포함하는, 액적 구조.
  38. 나노액적 구조로서:
    외부 표면을 갖는 제 1 액체의 외부 액적;
    상기 제 1 액적 내부에 배열된 내부 표면을 갖는 제 2 액체의 내부 액적으로서, 상기 제 2 액체는 상기 제 1 액체에 비혼화성이고, 상기 내부 액적 및 상기 외부 액적은 그 사이의 경계 표면 영역에 상기 제 1 액체의 필름을 갖는, 상기 제 2 액체의 내부 액적;
    상기 외부 액적의 상기 외부 표면 상에 배치된 블록 코폴리펩티드의 외부층; 및
    상기 외부 액적과 상기 내부 액적 사이의 상기 경계 표면 영역 근방의 상기 내부 표면 상에 배치된 블록 코폴리펩티드의 내부층을 포함하고,
    상기 블록 코폴리펩티드는 식 KxrLy 를 만족하는 구조를 가지며, 여기서 K 는 L-리신을 나타내고, rL 은 라세믹-류신을 나타내고, x 는 10 내지 200 범위의 정수이고, y 는 3 내지 30 범위의 정수이고,
    상기 나노액적 구조는 300 nm 미만 그리고 10 nm 초과인 미변형 외부 액적 직경에 의해 주어지는 최대 치수를 갖는, 나노액적 구조.
  39. 제 38 항에 있어서,
    상기 내부 액적의 상기 제 2 액체는 친수성이고, 그 내부에 블렌드된 또는 분산된, 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 염, 바이러스, 비타민, 혈청, 리세이트, ATP, GTP, 몰레큘러 모터, 친수성 약물 분자, 세포, 베시클, 나노액적, 나노파티클, 풀러렌, 단일벽 탄소 나노튜브, 다중벽 탄소 나노튜브, 세포질, 리보솜, 효소, 글루코오스, 헤모글로빈, 골지, 덴드리머, 계면활성제, 지방질, 알부민, 음이온, 양이온, 완충제, 설탕, 당류, 퀀텀 도트, 점토 나노파티클, 금속 나노클러스터, 금속 나노파티클, 자기 반응성 산화철 나노파티클, 유기 나노스피어, 유기 나노파티클, 무기 나노스피어, 무기 나노파티클, 형광 염료, 트랜스펙션 약제, 안티셉틱 물질, 항균성 물질, 전자 방사선 흡수 물질, 동위원소적으로 특정 물질, 방사성 동위원소를 함유하는 분자, 조영 증강제, 자기공명이미징 증강제, X선 이미징 증강제, 중성자 이미징 증강제, 양전자 방사 단층촬영 증강제, 광산란 증강제, 세포의 기능을 붕괴시키는 약제, 세포의 기능을 증강시키는 약제, 세포의 하위구조를 붕괴시키는 약제, 세포의 하위구조를 변경시키는 약제, 세포의 대사 경로에 영향을 주는 약제, 세포의 아포토시스를 트리거하는 약제, 및 그 조합 중 적어도 하나를 더 포함하는, 나노액적 구조.
  40. 제 38 항에 있어서,
    상기 외부 액적의 상기 제 1 액체는 소수성이고, 그 내부에 블렌드된 또는 분산된, 지방, 지방질, 왁스, 천연 오일, 합성 오일, 실리콘 오일, 휘발유, 에센셜 오일, 방향제, 콜레스테롤, 스테로이드, 소수성 약물 분자, 폴리머, 블록 공중합체, 폴리펩티드, 블록 폴리펩티드, 다중산, 다염기, 미셀, 퀀텀 도트, 나노파티클, 나노클러스터, 탄소 나노튜브, 풀러렌, 자성유체, 서모트로픽 액정, 리오트로픽 액정, 불소화된 액체, 브롬화된 액체, 식물 유래의 물질, 동물 유래의 물질, 박테리아 유래의 물질, 및 그 조합 중 적어도 하나를 더 포함하는, 나노액적 구조.
  41. 제 39 항에 있어서,
    상기 외부 액적의 상기 제 1 액체는 소수성이고, 그 내부에 블렌드된 또는 분산된, 지방, 지방질, 왁스, 천연 오일, 합성 오일, 실리콘 오일, 휘발유, 에센셜 오일, 방향제, 콜레스테롤, 스테로이드, 소수성 약물 분자, 폴리머, 블록 중합체, 폴리펩티드, 블록 폴리펩티드, 다중산, 다염기, 미셀, 퀀텀 도트, 나노파티클, 나노클러스터, 탄소 나노튜브, 풀러렌, 자성유체, 서모트로픽 액정, 리오트로픽 액정, 불소화된 액체, 브롬화된 액체, 식물 유래의 물질, 동물 유래의 물질, 박테리아 유래의 물질, 및 그 조합 중 적어도 하나를 더 포함하는, 나노액적 구조.
  42. 액체 매질; 및
    상기 액체 매질 내부에 분산된 복수의 나노액적을 포함하고:
    상기 복수의 나노액적의 각각의 액적은, 제 2 액체에 의해 둘러싸인 제 1 액체의 내부 액적을 포함하고, 상기 제 1 액체는 상기 제 2 액체에 비혼화성이고, 상기 제 2 액체는 상기 액체 매질에 비혼화성이고,
    상기 복수의 나노액적은 적어도 10 nm 그리고 300 nm 미만의 앙상블 평균 (ensemble average) 미변형 외부 액적 직경을 갖는, 에멀션.
  43. 제 42 항에 있어서,
    상기 액체 매질은 상기 제 1 액체와 동일한 물질인, 에멀션.
  44. 제 42 항에 있어서,
    상기 복수의 나노액적의 표면 및 상기 내부 액적의 표면 중 적어도 하나에 흡착되는 블록 공중합체를 더 포함하고,
    상기 블록 공중합체 각각은 친수성 아미노산을 포함하는 친수성 폴리펩티드 블록 및 소수성 아미노산을 포함하는 소수성 폴리펩티드 블록을 포함하는 에멀션.
  45. 제 44 항에 있어서,
    상기 블록 공중합체 각각은 친수성 폴리머 블록 및 소수성 폴리머 블록을 포함하고, 상기 친수성 폴리머 블록 및 상기 소수성 폴리머 블록은 함께 상기 복수의 나노액적 또는 상기 내부 액적 중 적어도 하나를 안정화시키도록 작용하는, 에멀션.
  46. 제 42 항에 있어서,
    상기 복수의 나노액적의 표면에 흡착되는 제 1 블록 공중합체 및 상기 내부 액적의 표면에 흡착되는 제 2 블록 공중합체를 더 포함하고,
    상기 제 1 블록 공중합체 및 상기 제 2 블록 공중합체 각각은 친수성 아미노산을 포함하는 친수성 폴리펩티드 블록 및 소수성 아미노산을 포함하는 소수성 폴리펩티드 블록을 포함하는, 에멀션.
  47. 제 46 항에 있어서,
    상기 제 1 블록 공중합체 및 상기 제 2 블록 공중합체 각각은 친수성 폴리머 블록 및 소수성 폴리머 블록을 포함하고, 상기 친수성 폴리머 블록 및 상기 소수성 폴리머 블록은 함께 상기 복수의 나노액적 또는 상기 내부 액적 중 적어도 하나를 안정화시키도록 작용하는, 에멀션.
  48. 제 47 항에 있어서,
    상기 제 1 블록 공중합체 및 상기 제 2 블록 공중합체는 실질적으로 동일한 분자 구조인, 에멀션.
  49. 실질적으로 연속적인 액체 매질; 및
    상기 실질적으로 연속적인 액체 매질 내부에 분산된 복수의 액적 구조를 포함하고:
    상기 복수의 액적 구조의 각각의 액적 구조는,
    외부 표면을 갖는 액체의 액적, 및
    상기 액적의 상기 외부 표면 상에 배치된 블록 공중합체의 층을 포함하고,
    상기 블록 공중합체는 각각 친수성 폴리머 블록 및 소수성 폴리머 블록을 포함하고, 상기 친수성 폴리머 블록 및 상기 소수성 폴리머 블록은 함께 상기 액적 구조를 안정화시키도록 작용하고,
    상기 친수성 폴리머 블록은 친수성 아미노산을 포함하는 친수성 폴리펩티드 블록을 포함하고, 상기 소수성 폴리머 블록은 소수성 아미노산을 포함하는 소수성 폴리펩티드 블록을 포함하며,
    상기 복수의 액적 구조의 상기 액체는 상기 실질적으로 연속적인 액체 매질에 비혼화성이고,
    상기 액적 구조는 1000 nm 미만 그리고 10 nm 초과인 비변형 액적 직경에 대응하는 최대 치수를 갖는 에멀션.
  50. 삭제
  51. 제 49 항에 있어서,
    상기 친수성 폴리머 블록은 2개 이상의 종류의 친수성 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 블록이고,
    상기 소수성 폴리머 블록은 2개 이상의 종류의 소수성 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 블록인, 에멀션.
  52. 제 49 항에 있어서,
    상기 친수성 아미노산 및 상기 소수성 아미노산은, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 발린, 및 그 임의의 조합으로 이루어진 아미노산 군으로부터 선택되는, 에멀션.
  53. 제 52 항에 있어서,
    상기 각각의 액적 구조는 300 nm 미만 그리고 10 nm 초과인 미변형 액적 직경에 대응하는 최대 치수를 갖는, 에멀션.
  54. 액적 구조로서:
    외부 표면을 갖는 액체의 액적; 및
    상기 액적의 상기 외부 표면 상에 배치된 블록 공중합체의 층을 포함하고,
    상기 블록 공중합체는 친수성 폴리머 블록 및 소수성 폴리머 블록을 포함하고, 상기 친수성 폴리머 블록 및 상기 소수성 폴리머 블록은 함께 상기 액적 구조를 안정화시키도록 작용하고,
    상기 친수성 폴리머 블록은 친수성 아미노산을 포함하는 친수성 폴리펩티드 블록을 포함하고, 상기 소수성 폴리머 블록은 소수성 아미노산을 포함하는 소수성 폴리펩티드 블록을 포함하며,
    상기 액적 구조는 1000 nm 미만 그리고 10 nm 초과인 비변형 액적 직경에 대응하는 최대 치수를 갖는, 액적 구조.
  55. 삭제
  56. 제 54 항에 있어서,
    상기 친수성 폴리머 블록은 2개 이상의 종류의 친수성 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 블록이고,
    상기 소수성 폴리머 블록은 2개 이상의 종류의 소수성 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 블록인, 액적 구조.
  57. 제 54 항에 있어서,
    상기 친수성 아미노산 및 상기 소수성 아미노산은, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 발린, 및 그 임의의 조합으로 이루어진 아미노산 군으로부터 선택되는, 액적 구조.
  58. 제 2 액체와 상기 제 2 액체에 비혼화성인 제 1 액체를 제공하는 단계;
    상기 제 1 액체 및 상기 제 2 액체 중 적어도 하나에 선택된 양의 블록 공중합체를 첨가하는 단계; 및
    상기 제 2 액체 내에 상기 제 1 액체를 에멀션화하여 상기 제 2 액체 내에 분산된 상기 제 1 액체의 복수의 액적을 제조하는 단계를 포함하고:
    상기 제 1 및 제 2 액체 중 적어도 하나로 첨가된 상기 블록 공중합체는 상기 복수의 액적이 유착하는 것으로부터 안정화시키고,
    상기 블록 공중합체는 각각 친수성 아미노산을 포함하는 친수성 폴리펩티드 블록 및 소수성 아미노산을 포함하는 소수성 폴리펩티드 블록을 포함하며,
    상기 복수의 액적은 1000 nm 미만 그리고 10 nm 초과인 비변형 액적 직경에 대응하는 평균 최대 치수를 갖는, 에멀션의 제조 방법.
  59. 제 58 항에 있어서,
    상기 제 1 액체의 상기 복수의 액적의 각각의 액적은, 상기 제 2 액체의 그 내부의 내부 액적을 포함하고, 상기 내부 액적은 상기 에멀션화 동안 상기 복수의 액적의 제조와 실질적으로 동시에 제조되는, 에멀션의 제조 방법.
  60. 제 58 항에 있어서,
    상기 제 1 액체의 상기 복수의 액적의 각각의 액적은, 상기 제 2 액체의 그 내부의 복수의 내부 액적을 포함하고, 상기 복수의 내부 액적은 상기 에멀션화 동안 상기 복수의 액적의 제조와 실질적으로 동시에 제조되는, 에멀션의 제조 방법.
  61. 제 58 항에 있어서,
    미리 선택된 앙상블 평균 직경을 갖는 상기 복수의 액적을 제공하기 위해 첨가되는 상기 블록 공중합체의 양을 선택하는 단계를 더 포함하는, 에멀션의 제조 방법.
  62. 제 58 항에 있어서,
    미리 선택된 앙상블 평균 직경을 갖는 상기 복수의 액적을 제공하기 위해 상기 첨가 동안 상기 블록 공중합체의 분자 조성을 선택하는 단계를 더 포함하는, 에멀션의 제조 방법.
  63. 제 1 액체 및 제 2 액체 중 적어도 하나에 계면활성제를 첨가하는 단계, 또는 상기 제 1 액체 및 상기 제 2 액체 중 적어도 하나에 계면활성제 전구체를 첨가하는 단계 중 적어도 하나의 단계;
    상기 제 2 액체 내에 상기 제 1 액체를 에멀션화하여 상기 제 2 액체 내에 침지된 상기 제 1 액체의 복수의 액적을 형성함으로써 심플 에멀션 (simple emulsion) 을 제공하는 단계로서, 상기 제 1 액체는 상기 제 2 액체에 비혼화성인, 상기 심플 에멀션을 제공하는 단계;
    상기 계면활성제 또는 상기 계면활성제 전구체 중 적어도 하나를 제 3 액체에 첨가하는 단계; 및
    상기 제 3 액체 내에 상기 심플 에멀션을 에멀션화하여 상기 심플 에멀션의 복수의 액적을 형성함으로써 더블 에멀션 (double emulsion) 을 제공하는 단계로서, 상기 제 2 액체는 상기 제 3 액체에 비혼화성인, 상기 더블 에멀션을 제공하는 단계를 포함하고:
    상기 더블 에멀션의 복수의 액적 각각은 그 내부에 상기 제 1 액체의 적어도 하나의 액적을 포함하고,
    상기 복수의 액적은 1000 nm 미만 그리고 10 nm 초과인 비변형 액적 직경에 대응하는 평균 최대 치수를 갖는, 에멀션의 제조 방법.
  64. 제 58 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 기재된 에멀션의 제조 방법에 따라 제조된, 에멀션.
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