CN103096874A - 前药组合物、前药纳米粒子及其使用方法 - Google Patents

前药组合物、前药纳米粒子及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开包含前药和连接于磷脂的前药的纳米粒子，其中所述键合促使前药从纳米粒子释放至靶细胞的位点或通过粒子与细胞膜的融合释放至细胞膜。本发明也公开了制备和及其使用纳米粒子及其成分的方法。

Description

前药组合物、前药纳米粒子及其使用方法
政府权利
本发明在政府支持的国立卫生研究院资助的NS059302和CA119342的奖励下完成。政府在本发明中享有一定权利。
发明领域
本发明包括前药组合物、包含一种或多种前药的纳米粒子及其使用方法。
发明背景
具有体外活性的已知活性化合物在体内疗法中可以不是易进入的，原因是难以传递这些化合物。例如，所述化合物可具有短的体内半衰期，致使该化合物实际上在体内无用。类似地，化合物可在体内不稳定，在生理条件下转化为无活性化合物，或者作为选择，化合物可与显著的毒性相关联，致使其在体内应用困难。因此，需要传递这些活性化合物的方法，既维持化合物在体内的活性，又直接传递至想要的靶细胞，避免潜在的毒性。
发明简述
本发明一个方面包括在体内传递化合物至靶细胞的组合物。该组合物包含非脂质体粒子和至少一种前药。粒子的外表面是包含至少一种前药的膜，其还包含约100％至约60％磷脂，其中在体内粒子的外表面能够融合至靶细胞膜的外层(outer leaflet)，这样的融合导致前药从粒子转移至靶细胞的外层。前药包含键接至磷酸甘油酯的酰基部分的、小于约3000da的化合物，其中该化合物可经由酶裂解从磷酸甘油酯主链释放。前药基本上保留在粒子的外表面膜中，直至前药转移至靶细胞的外层，且前药还从靶细胞膜的外层进一步转移至内层(innerleaflet)，导致化合物在细胞内经由酶可裂解的键合的裂解而释放。
本发明的另一个方面包括体内传递化合物至靶细胞的方法。该方法包括给予患者组合物，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的非脂质体粒子和至少一种前药。粒子的外表面是包含至少一种前药的膜，其还包含约100％至约60％磷脂，其中在体内粒子的外表面能够融合至靶细胞膜的外层，这样的融合导致前药从粒子转移至靶细胞的外层。该前药包含键接至磷酸甘油酯的酰基部分的、小于约3000da的化合物，其中该化合物可经由酶裂解从磷酸甘油酯主链释放。前药基本上保留在粒子的外表面膜中，直至前药转移至靶细胞的外层，且前药还从靶细胞膜的外层转移至内层，导致化合物在细胞内经由酶可裂解的键合的裂解而释放。
下文更详细地讨论本发明的其他方面和相互作用(iterations)。
参考彩图
本申请文件包含至少一张彩色照片(photograph executed in color)。将由事务所按需求提供这种带有彩色照片的专利申请出版物的副本并支付必需的费用。
图的简述
图1描绘用(A)由前药传递的多柔比星和(B)游离多柔比星药物处理的细胞的光学显微镜图像。
图2是描绘与未治疗的对照组比较的、游离多柔比星药物和前药多柔比星对细胞增殖的作用的图。
图3是描绘在大鼠基质胶塞(matrigel plug)模型(n＝2/组)中，对结合到整联蛋白整联蛋白-标靶的PFC纳米粒子的多柔比星和紫杉醇前药的血管新生应答的图。
图4描绘两个图，阐明在兔vx2肿瘤模型(n＝2/组)中(A)与非-前药紫杉醇对照，于1.5T血管新生增强无显著性变化，和(B)对掺入整联蛋白标靶的PFC纳米粒子的紫杉醇前药的血管新生应答。
图5描绘多柔比星和可用到的功能修饰的位点。
图6描绘PC-多柔比星共轭结合体(conjugate)1的合成流程。
图7描绘PC-多柔比星(PC-DXR)候选者-1前药和前药的1H NMR(400MHZ)波谱。
图8描绘紫杉酚前药的合成流程。
图9是描绘PC-紫杉醇(PC-PXTL)前药对2F2B内皮细胞的抗增殖效应的图。
图10描绘顺铂前药-1的合成流程。
图11描绘顺铂前药-2的合成流程。
图12描绘甲氨蝶呤前药的合成流程。
图13描绘硼替佐米(brotezomib)前药的合成流程。
图14描绘myc-抑制剂前药(A)和供选择的变体(B)的合成流程。
图15描绘来那度胺前药的合成流程。
图16描绘烟曲霉素(又称夫马洁林，fumagillin)前药1(顶部)和烟曲霉素前药2(底部)的合成流程。
图17描绘光动力学疗法(PDT)前药的合成流程。
图18描绘多西他赛前药(A)和供选择的变体(B)的合成流程。
图19描绘两个图，阐明溶解于脂质膜的烟曲霉素在体外是稳定的，但在体内迅速丢失。(A)烟曲霉素的体外释放持续4天。(B)烟曲霉素的体内释放发生在大约数分钟内。
图20描绘显示给予用αvβ3标靶的烟曲霉素前药减少植入物体积增加(implant volume enhancement)的图。
图21描绘两个图，阐明αvβ3标靶的烟曲霉素前药减少如由CyQuant分析检测的细胞增殖(A)，以及经阿尔玛蓝试验(Alamar blueassay)在HUVEC细胞检测的细胞代谢活性(B)。
图22描绘阐明用多西他赛前药进行阿尔玛蓝试验的结果的图。将七千个2F2B细胞/孔暴露于不含药物(对照组)、含多西他赛或多西他赛前药的αvβ3标靶的粒子。
图23描绘显微图和直方图，证明多西他赛前药对肿瘤生长的作用。(A)四个小图，阐明暴露于或者含多西他赛前药的αvβ3标靶的粒子或者不含多西他赛的αvβ3标靶的粒子于基线和于注射后3hr组织的显微图。(B)给予多西他赛前药，肿瘤体积减少。(C)阐明含多西他赛前药的αvβ3标靶的粒子(左侧小图)或不含多西他赛的αvβ3标靶的粒子(右侧小图)治疗的肿瘤体积。
图24描绘多西他赛前药对增殖指数的作用。(A)用αvβ3标靶且含多西他赛前药的粒子使肿瘤细胞的增殖指数减少。(B)显微图证明在暴露于含多西他赛的αvβ3标靶的粒子之后减少的增殖。增殖指数等于PCNA阳性面积除以仅甲基绿核阳性的面积。
图25描绘多西他赛前药对凋亡指数的作用。(A)用αvβ3标靶且含多西他赛前药的粒子使肿瘤细胞的凋亡指数减少。(B)显微图证明在暴露于含多西他赛的αvβ3标靶的粒子之后减少的凋亡。凋亡指数等于TUNEL阳性面积除以仅甲基绿核阳性面积。
图26描绘(A)myc药物的结构和(B)图，阐明myc药物对多发性骨髓瘤细胞系i.H-929 ii LP-1 iii.KMS-11 iv.UTMC-2增殖的作用，用不同浓度的myc-药物孵育细胞，以含相应体积的DMSO作对比，采用台盼蓝拒染法(Trypan Blue Exclusion)进行实验。
图27描绘阐明于48小时αvβ3标靶的myc-前药PFC纳米粒子减少SMC增殖的图。
图28描绘阐明于(A)48hrs和(B)72hrs，myc-max拮抗剂前药体外抑制黑色素瘤增殖的图。Tg：标靶的；PFC：全氟化碳粒子；tween：聚山梨醇酯胶束。
图29描绘聚山梨醇酯胶束的图解。
图30描绘沉积的玻璃表面之上的(nanocelle)滴的水分散体的轻敲模式原子力显微镜图像(tapping mode AFM image)的图解。
图31描绘包含甲基泼尼松龙的前药。
图32描绘喜树碱(A)的前药和合成喜树碱(campothecin)前药(B)的流程。
图33描绘两个包含PNA的前药。
图34描绘产生烟曲霉素类似物的流程。
发明详述
本发明提供一个或多个前药组合物、含一个或多个前药的粒子及其使用方法。有利地，本发明提供组合物和体内传递化合物至靶细胞的方法。
在一个方面，本发明由含包埋在非脂质体纳米粒子(在以下第II节描述)的前药(在以下第I节描述)的药物传递系统组成。纳米粒子还可任选包含如本文描述的归巢配体(homing ligand)。药物传递系统允许细胞内传递前药，同时保护前药免于可使药物失活的生理条件的影响。
I.前药组合物
一般而言，本发明的前药包括键接至磷酸甘油酯的酰基部分的化合物。适宜的磷酸甘油酯可包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸。化合物可键接至磷酸甘油酯中的任一位置。例如，化合物可键接至磷酸甘油酯的sn1位或sn2位。在优选的实施方案中，化合物键接至sn2位。
(a)适宜的化合物
一般而言，适宜的本发明化合物小于3000da。在一个实施方案中，化合物小于约3000、2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2100、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200或100da。在另一个实施方案中，化合物介于约2500da和约200da之间。在还一个实施方案中，化合物介于约2000da和约200da之间。在一些实施方案中，化合物可大于3000da，只要含化合物的前药维持从细胞膜外层转移细胞膜内层的能力。
典型地，适宜的化合物包含化合物活性位点外面的反应性基团。如下描述的，该反应性位点使得化合物键接至甘油酯主链。本发明适宜的化合物可典型地选自小分子、金属原子、有机金属复合物、放射性化合物、氨基酸聚合物(如蛋白质、肽等)、碳水化合物、脂质、核酸聚合物，或其组合。一般而言，适宜的化合物可如本文描述的键接至磷酸甘油酯。一旦化合物从甘油酯主链裂解下来，释放的形式可为活性化合物或前-活性化合物。可使化合物衍生以增强想要的化合物的特性。使化合物衍生的方法为本领域已知。
在一些实施方案中，例如，化合物可为药物、治疗性化合物、类固醇、核酸基物质，或其衍生物、类似物或它们的组合，以其原生形式或带有疏水或荷电部分以增强掺和或吸附于纳米粒子的衍生形式呈现。这样的化合物可为水溶性的或可为疏水性的。化合物的非限制性实例可包括免疫相关制剂、甲状腺制剂、呼吸产品、抗肿瘤药、抗-蠕虫药、抗-疟药、有丝分裂抑制剂、激素、抗-原生动物药、抗-结核药、心血管产品、血液制品、生物应答改进剂、抗-真菌药、维生素、肽、抗-过敏药、抗凝剂、循环药物、代谢增强剂、抗-病毒剂、抗-心绞痛剂、抗生素、抗-炎症剂、抗风湿药、麻醉止痛剂、强心苷、神经肌肉阻断剂、镇静剂、局部麻醉药、全身麻醉药或放射性原子或离子。在某些实施方案中，化合物是适配子或核酸衍生物、诸如肽核酸(PNA)或锁核酸(locked nucleic acid)(LNA)。
在作为范例的实施方案中，所述化合物可为多柔比星、紫杉醇、紫杉酚、来那度胺、甲氨蝶呤、硼替佐米(bortezomib)、myc-抑制剂、来那度胺、顺铂、甲基泼尼松龙、烟曲霉素、喜树碱、肽核酸、PDT药物或其保留药学活性的衍生物或类似物。在一个实施方案中，所述化合物可为烟曲霉素的类似物。在一些实施方案中，烟曲霉素的类似物选自在实施例12中详细描述的类似物。在其他实施方案中，所述化合物可为PDT药物，诸如式XI的前药。另外的适宜的PDT药物为本领域已知，且可包括卟吩姆钠(porfimer sodium)、氨基乙酰丙酸和氨基乙酰丙酸的甲基酯。
在其他的示例性实施方案中，所述化合物可为选自列于下表A中的化合物。
表A：化合物的非限制性实例
Figure BDA00002599181800071
Figure BDA00002599181800081
Figure BDA00002599181800091
Figure BDA00002599181800101
(b)键合
如在以上第I节(a)中定义的，本发明的前药包括键接至磷酸甘油酯的化合物。甘油酯主链和所述化合物之间的键合可为本领域已知的任何适宜的链。在示例性实施方案中，适宜的键合可包括碳、氧、氮或其组合。
从甘油酯主链计算，该键合可包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或超过二十个原子。在示例性实施方案中，从甘油酯主链计算，该键合包含至少五个原子。
一般而言，选择键合以使甘油酯主链的sn2位置可经酶裂解。典型地，这样的酶可在细胞内发现。
此外，键合本身可被酶裂解。在示例性实施方案中，键合可被细胞内酶裂解。在几个实施方案中，或者甘油酯sn2位置或者键合可经脂肪酶裂解。例如，在一个实施方案中，脂肪酶可为磷脂A2脂肪酶(也已知为磷酸化脂肪酶A2)。在另一个实施方案中，脂肪酶可为磷脂A1脂肪酶(也已知为磷酸化脂肪酶A1)。在还一个实施方案中，脂肪酶可为磷酸化脂肪酶B酶。在以上各实施方案中，酶能够裂解键合并因此将化合物从键合释放出来。
(c)化合物的释放的形式
当将本发明的前药从甘油酯主链裂解下来时，产生了化合物的释放的形式。该释放的形式可或者为活性化合物或者为前-活性化合物。如在本文使用的，“活性化合物”是对细胞发挥药学效应的化合物。这样的活性化合物可包含在以上第I节(b)中定义的键合或其部分。“活性化合物”也可以是用于产生前药的化合物的代谢物。
如在本文使用的，前-活性化合物是需要酶活化以变成如上定义的活性化合物的化合物。例如，本发明的前-活性化合物可包括在以上第I节(a)定义的化合物和在以上第I节(b)定义的键合或其部分。键合可包含在键合内的或键与化合物之间的酶识别部位。一般而言，酶结合至酶识别部位并使键合裂解，这样，从前-活性化合物去除该键合或其部分以产生如上定义的活性化合物。在备选的实施方案中，活性化合物可为前-活性化合物的代谢物。
(d)含前药的纳米粒子
在本申请的示例性实施方案中，前药包纳在纳米粒子中。在这样的实施方案中，前药基本上不从纳米粒子释放直至在纳米粒子与靶细胞膜融合之后。在示例性实施方案中，前药基本上不从纳米粒子释放直至在纳米粒子与靶细胞膜外层融合之后。以下更详细地描述这样的融合。然而，简要地，纳米粒子与靶细胞膜的融合使得脂质在纳米粒子和靶细胞膜之间转移。例如，在一些情况下，纳米粒子的脂质膜可与靶细胞膜的脂质膜的外层融合，使得纳米粒子衍生的脂质和/或前药向靶细胞膜转移。
在融合和后来的前药从纳米粒子转移至靶细胞之后，可裂解前药，使化合物的释放的形式从甘油酯主链分离。一般而言，在前药从靶细胞膜的外层转移至内层之后，发生该裂解。此导致化合物基本上在细胞内释放。释放的化合物可包含如上描述的键合或其部分。如要更详细情况，参见以下第II节和实施例。
(e)作为范例的实例
在示例性实施方案中，本发明的前药包括式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII或XIX的前药。在另一个示例性实施方案中，本发明的前药包括由式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII或XIX组成的前药。在又一个示例性实施方案中，本发明的前药包括式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII或XIX的前药，其中所述化合物以不显著改变前药的功能的方式进一步衍生。在还一个示例性实施方案中，本发明的前药包括式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII或XIX的前药，其中的磷酸甘油酯主链以不显著改变前药的功能的方式进一步衍生。
在以上的示例性实施方案中，式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII或XIX前药可具有介于甘油酯主链和化合物之间的键合，该键合可在式中表现的原子数目发生变化。例如，对于式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII或XIX而言，该键合可为1、2、3、4、5、6、7或超过7个原子的长度。
表B：示例性前药
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Figure BDA00002599181800131
Figure BDA00002599181800141
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II.纳米粒子
本发明的纳米粒子包含前药，如在以上第I节中讨论的，以及两性分子膜。在一些实施方案中，两性分子膜包含前药。该膜在体内稳定至少使粒子与靶细胞膜融合并使前药转移至靶细胞膜所需的时间。
有利地，本发明的纳米粒子可保护高度不稳定的化合物不在体内失活。这部分由于在两性分子膜中以前药形式呈现的化合物的隔离。该膜保护化合物免于由于生理条件，诸如pH或酶裂解的水解和失活。此允许活性化合物传递至细胞，延长化合物在体内的半衰期，由此提高化合物的药动学和药效学特性。作为结果，当配制成前药和掺入本文描述的纳米粒子时，此前不具有体内功效的化合物可变得在体内可行的治疗选项。
通常，本发明的纳米粒子可为约10nm至约10μm。在一些实施方案中，纳米粒子可为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000nm。在其他实施方案中，纳米粒子可为约1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75、5、5.25、5.5、5.75或6μm。在还一个实施方案中，本发明的纳米粒子可小于100nm。在甚至另一个实施方案中，纳米粒子可小于200nm。
(a)纳米粒子两性分子膜
本发明的纳米粒子包含两性分子膜。一般而言，两性分子膜可包含介于100％和50％之间的两性分子脂质，如磷脂。在一些实施方案中，该膜包含约100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50％磷脂。
两性分子膜的组成可变化，但典型地包含介于约0.1％至约75％之间的、在以上第I节中讨论的前药。在一个实施方案中，纳米粒子的脂质膜包含约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1％的前药。在另一个实施方案中，纳米粒子的脂质膜包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75％的前药。在一些实施方案中，纳米粒子的脂质膜包含约10％至约60％的前药。在其他实施方案中，纳米粒子的脂质膜包含约20％至约50％的前药。在又一个实施方案中，纳米粒子的脂质膜包含约30％至约40％的前药。
纳米粒子脂质膜可包含一种类型或超过一种类型的前药。例如，纳米粒子脂质膜可包含一种、两种、三种、四种、五种、六种或超过六种类型的前药。在各个情况下，包含前药的膜的总百分比将典型地为约0.1％至约70％。
典型地，本发明的纳米粒子的稳定的膜应该与体内应用相容。例如，纳米粒子的脂质膜应该基本上不启动补体途径或溶血。
稳定的膜的组成可变化，只要前药基本上不从粒子释放直至粒子与靶细胞膜融合之后，并且前药可从纳米粒子脂质膜转移至靶细胞膜。两性分子膜可包含聚合物或脂质和聚合物的组合。在一个实施方案中，稳定的膜包含两性分子物质。如在本文使用的，词组“两性分子物质”指的是具有疏水和亲水部分两者的物质，诸如脂质物质或两性分子聚合物。两性分子物质可为天然的、合成的或半合成的。如在本文使用的，“天然”指的是可在自然界发现的物质，“合成”指的是可在实验室设施中创造的物质，而“半合成”指的是已经在实验室设施中改变的天然物质。在一个实施方案中，两性分子物质是脂质物质。例如，外层可为单脂质层或可包括多层薄脂质层。本文所用的脂质物质，在其最广泛的意义上，包括但不限于衍生的、天然的或合成的磷脂、脂肪酸、胆固醇、溶血脂质(lysolipid)、脂质、神经鞘磷脂、维生素E、糖脂、硬脂酰胺(sterylamine)、心磷脂、缩醛磷脂、具醚或酯连接的脂肪酸的酯、聚合化的脂质、脂蛋白、糖脂、衍生的表面活性剂、药物功能化的脂质、标靶的配体功能化的脂质、造影剂共轭结合的脂质、脂质聚合物、表面活性剂，或其组合。
两性分子膜也可包括脂质-共轭结合的聚乙二醇(PEG)。一般而言，然而，所述膜不包含多于10％的PEG。在一些实施方案中，所述膜包含小于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的PEG。
再有，稳定的膜可包含表面活性剂。在一些实施方案中，优选的表面活性剂是磷脂和胆固醇。此外，表面活性剂可包括，但不限于1，2-二棕榈酰基-sn-丙三醇-3-磷酸乙醇胺-N-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酰胺、胺-PEG2000-磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、阿拉伯树胶、胆固醇、二乙醇胺、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇、卵磷脂，包括蛋黄卵磷脂、单-和二-甘油酯、单-乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆、花生油、棕榈酸、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯(polyoxyl)35蓖麻油、聚氧乙烯10-油烯基醚、聚氧乙烯20十八十六醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、丙二醇二乙酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、月桂基硫酸钠、硬脂酸钠、山梨糖醇酐单月桂酸酯、山梨糖醇酐单油酸酯、山梨糖醇酐单-棕榈酸酯、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、硬脂酸、三乙醇胺和乳化蜡。可单独或组合使用以上的表面活性剂以帮助纳米粒子稳定。
在一个实施方案中，粒子的两性分子膜可包含聚山梨醇酯。例如，该膜可包含介于约1和约50％之间的聚山梨醇酯。在某些实施方案中，该膜可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50％的聚山梨醇酯。
此外，可使用的助悬剂和/或粘度增加剂包括，但不限于阿拉伯树胶、琼脂、褐藻酸、单-硬脂酸铝、皂土、岩浆、卡波姆934P、羧甲基纤维素、钙和钠和钠12、角叉菜胶、纤维素、糊精、明胶、瓜耳胶、羟乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、硅酸镁铝、甲基纤维素、胶质、聚氧乙烯、聚乙烯醇、聚维酮、海藻酸丙二醇酯、二氧化硅、海藻酸钠、西黄蓍胶和黄原胶。
在多个实施方案中，脂质膜的两性分子物质可被交联以稳定纳米粒子。然而，这样的交联应该仍然允许适当的脂质活动性，以促进前药从纳米粒子转移至靶细胞膜。在一些实施方案中，粒子可交联至外层的表面上。在其他实施方案中，粒子可在外层的内部交联。所述交联可为化学性交联或光化学性交联。简要地，适宜的交联剂将与外层的一个或多个活性基团反应。交联剂可为同型双功能的(homobifunctional)或异型双功能的(heterobifunctional)。适宜的化学交联器可包括戊二醛、双-羧酸间隔体(spacer)或双-羧酸-活性酯。再有，可通过碳二酰亚胺偶合方案采用双-连接剂胺/酸使外层经化学交联。或者，可采用点击化学(click chemistry)方案使粒子交联。在另外的其他实施方案中，可将碳二亚胺-偶合化学、酰化、活性酯偶合或烷化应用于交联外层。在示例性实施方案中，交联由碳二亚胺介导。在一些实施方案中，在4.0-6.0pH范围使用EDC(也有EDAC或EDCI、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、高度水溶性的碳二亚胺，以使羧基活化，偶合伯胺以得到酰胺键。为了增强耦合效率，可将EDC与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或磺基-NHS联合使用。本领域普通技术人员将会认识到，适宜的交联剂可并且将依粒子的组成和想要的用途不同而变化。
(b)融合
本发明的纳米粒子可与靶细胞膜融合。如在本文使用的，“融合”指的是纳米粒子的脂质膜与靶细胞的脂质膜的链接(aligning)，这样在两个膜之间可发生相互作用。在示例性实施方案中，“融合”指的是粒子膜与靶细胞膜的外层的半融合(Lanza，等.Circulation2002；106：2842；Partlow等.Biomaterials 2008；29：3367；Soman，等.Nano Letters 2008；8：1131-1136)。在一个实施方案中，本发明的纳米粒子包含在体内是稳定的脂质膜，所述稳定至少保持使纳米粒子与靶细胞膜融合和使前药转移至靶细胞膜所需要的时间。还另一种方式的说法，本发明的纳米粒子基本上将前药保留在纳米粒子的脂质膜中，除非和直至纳米粒子与靶细胞膜融合和使前药从纳米粒子转移至靶细胞膜。在另一个实施方案中，本发明的纳米粒子包含在体内是稳定的脂质膜，所述稳定至少保持使纳米粒子与靶细胞膜融合以使纳米粒子能够胞吞所需要的时间。
使纳米粒子与靶细胞膜融合所需要的时间的长度可并且将依，除其他因素外，纳米粒子(如不管其是否包含归巢配体)、纳米粒子的尺寸、意欲的靶细胞的位置和所使用的前药不同而异。本领域技术人员将能实施本领域已知的分析法，以确定粒子纳米粒子/前药/靶细胞联合所需的理想的时间长度。
在一些实施方案中，时间长度是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分钟。在其他实施方案中，时间长度是20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或长于30分钟。例如，时间长度可为约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或长于100分钟。在示例性实施方案中，时间长度为大约20分钟。
(c)前药的转移
如上简要提及的，可使本发明的前药从纳米粒子的脂质膜转移至细胞的脂质膜。在某些实施方案中，为了使前药能够转移，纳米粒子的脂质膜必须是可运动的。此外，在某些实施方案中，纳米粒子脂质膜的脂质必须与靶细胞脂质膜自由交换。换另一种方式的说法，在这些实施方案中，纳米粒子脂质膜对与靶细胞膜的脂质交换应该不具有实质的表面势垒或能量势垒。此可，例如，对纳米粒子脂质膜的脂质组成产生影响。可采用本领域已知的方法测试脂质组成，以确保适当的脂质活动性，使其将前药从纳米粒子转移至靶细胞膜。如在实施例中显示的那样，在示例性实施方案中，粒子的膜与靶细胞膜的外层形成半融合结构。如在实施例中阐明的那样，可观察到这样的融合事件。因此，本领域技术人员将能够确定采用以上详细的指导形成的特定的膜是否与靶细胞膜形成半融合结构。
将前药从纳米粒子的膜转移到靶细胞的脂质膜所需的时间的量，可并且将依多种因素不同而异，所述因素，除其他因素外，包括纳米粒子(如其是否包含归巢配体)、纳米粒子的尺寸、意欲的靶细胞的位置和所用的前药。在一些实施方案中，时间长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分钟。在其他实施方案中，时间长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超过30分钟。例如，时间长度可为约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或超过分钟。
(d)归巢配体
在一些实施方案中，本发明的纳米粒子可包含归巢配体。如在本文使用的，“归巢配体”指的是协助纳米粒子与靶细胞膜融合的生物分子。
归巢配体可包括，但不限于抗体、抗体片段、蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、小分子、多糖、核酸、适配子、拟肽、其他模拟剂和药物的单个或组合。此外，归巢配体可包括微生物，诸如噬菌体或病毒。归巢配体也可为以上各种的基因工程改造的类似物或衍生物。归巢配体可直接或间接附着至纳米粒子。
归巢配体与纳米粒子的直接共轭结合指的是制备归巢配体-粒子复合物，其中的归巢配体或者通过离子的、静电的、疏水或其他非共价键的方式吸附至纳米粒子表面(如酰化的-抗体或之间互补的核酸序列杂交)或经化学连接至通过共价键接至脂质表面的成分或本质地整合到作为膜的成分的脂质膜的表面(如脂质衍生为拟肽剂)。
间接共轭结合指的是以两步或更多步骤在体内在纳米粒子和归巢配体之间形成复合物。间接共轭结合利用化学键合系统以产生粒子至标靶的细胞或组织表面的紧密和特异的融合。间接归巢系统(homingsystem)的非限制性实例是抗生物素蛋白-生物素。
抗生物素蛋白-生物素相互作用是有用的非共价的归巢系统，其已经被整合到许多生物学和分析系统并被选择体内应用。抗生物素蛋白对生物素(10-15M)具有高的亲和力，利于在生理条件下快速和稳定的结合。依据制剂不同分两步或三步给予利用该途径的归巢系统。典型地，首先给予生物素化的配体，诸如单克隆抗体，并“预归巢(pre-homed)”至独特的分子表位(epitope)。其次，给予抗生物素蛋白，其结合至“预归巢的”配体的生物素部分。最后，加入生物素化的粒子并结合至保留在抗生物素蛋白上的未占领的生物素-结合位点，由此完成生物素化的配体-抗生物素蛋白-粒子“三明治”。抗生物素蛋白-生物素手段可避免继发于表面抗体的呈现的、通过单核巨噬细胞系统(MPS)对归巢的粒子的加速的、过早的清除。此外，具有四个独立的生物素-结合位点的抗生物素蛋白提供信号放大作用和改善探测敏感性。
归巢配体可通过各种方法经化学附着至粒子的表面，所述方法取决于归巢配体的性质和粒子表面的组成。归巢配体与蛋白质粒子的直接的化学共轭结合经常利用固有存在于表面之中的多种氨基-基团(如赖氨酸)。或者，在形成粒子后，可将活性化学官能团，诸如吡啶基二硫代丙酸酯、马来酰亚胺或醛结合到作为归巢配体共轭结合的化学“钩”的表面。另一个常用的加工后手段是在添加归巢配体之前用碳二亚胺激活表面羧酸酯。
通过归巢配体的化学性质，主要决定选择的共价键合策略。例如，单克隆抗体和其他大的蛋白质可在严苛的加工条件下变质，而碳水化合物、短肽、适配子、药物或拟肽的生物活性常常可在这些条件下得到保护。
为了确保高的归巢配体结合完整性和最大的纳米粒子亲合力，可将柔性间隔体臂(flexible spacer arms)，如聚乙二醇、氨基酸、长或短链烃、糖(如葡聚糖(polydextrose))、核酸、适配子或简单的己酸酯桥(simple caproate bridges)插入活化的表面官能团和归巢配体之间。这些延伸可为2nm或更长。
通过使用“引物材料”，该归巢配体在脂质物质中可为固定不动的。“引物材料”是任何掺入粒子的表面活性剂适配的化合物，以经化学手段连接或或吸附特异性结合或归巢配体，即结合到脂质膜的、可经化学手段利用以在粒子和归巢配体之间形成共价键的任何成分或衍生成分，或归巢配体的成分(如果其具有亚单位的话)。可采用本领域已知的方法，用偶合剂将归巢配经共价偶合至“引物材料”。偶合剂的一种类型可使用碳二亚胺，诸如盐酸1-乙基-3-(3-N，N二甲基氨基丙基)碳二亚胺或1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基-对-甲苯磺酸酯。引物材料可为胺-PEG2000-磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、N-己酰基胺磷脂酰乙醇胺、N-十二烷基胺磷脂酰乙醇胺、磷脂酰硫代乙醇(phosphotidylthioethanol)、1，2-二酰基-sn-丙三醇-3-磷脂酰乙醇胺-N-[4-对-马来酰亚胺苯基)-丁酰胺、N-丁二酰基-磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基-磷脂酰乙醇胺、N-十二烷基-磷脂酰乙醇胺、N-生物素基-磷脂酰乙醇胺、N-生物素基己酰基-磷脂酰乙醇胺和磷脂酰乙二醇。其他适宜的偶合剂可包括具有或者乙烯未饱和的醛偶合剂，诸如丙烯醛、异丁烯醛或2-丁烯醛，或者具有多数醛基的醛偶合剂，诸如戊二醛、丙二醛或丁二醛。其他偶合剂可包括2-亚氨基硫杂戊环盐酸盐和双功能N-羟基琥珀酰亚胺酯，诸如二琥珀酰亚胺基底物(subsrate)、二琥珀酰亚氨基酒石酸盐(酯)、二[2-(琥珀酰亚酰胺氧基羰基氧基)乙基]砜、二琥珀酰亚氨基丙酸盐(酯)和乙二醇二(琥珀酰亚氨基琥珀酸盐(酯))。异型双功能试剂的非限制性实例可包括N-(5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基氧基)琥珀酰亚胺、对-叠氮基苯基溴、对-叠氮基苯基乙二醛、4-氟-3-硝基苯基叠氮化物、N-羟基琥珀酰亚氨基-4-叠氮基苯甲酸盐、间-马来酰亚胺苯甲酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯、甲基-4-叠氮基苯基乙二醛、4-氟-3-硝基苯基叠氮化物、N-羟基琥珀酰亚氨基-4-叠氮基苯甲酸酯盐酸盐、2-二偶氮基-3，3，3-三氟代丙酸对-硝基苯酯、N-琥珀酰亚氨基-6-(4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸盐(酯)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚氨基酯、4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚氨基酯、(4-叠氮基苯基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚氨基酯、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚氨基酯和N-(4-叠氮基苯基硫代)酞酰胺。同型双功能试剂的非限制性实例可包括1，5-二氟-2，4-二硝基苯、4，4′-二氟-3，3′-二硝基二苯基砜、4，4′-二异硫氰基-2，2′-二磺酸茋、对-亚苯基二异硫氰酸盐(酯)、羰基二(L-蛋氨酸对-硝基苯基酯)、4，4′-二硫代二苯基叠氮化物、赤藓糖醇二碳酸酯和双功能亚胺酸酯类，诸如己二亚胺酸二甲酯(dimethyl adipimidate)盐酸盐、辛二亚氨酸二甲酯(dimethylsuberimidate)、3，3′-二硫代二双丙亚氨酸二甲基酯盐酸盐等。可通过常规的熟知的反应，例如，在中性pH的水性溶液中，在小于25℃的温度下，用以上的试剂反应1小时至过夜，实施特异性结合物质至“引物材料”的共价键合。
粒子膜一般可包含介于0％和约3％之间的归巢配体。例如，在一个实施方案中，该膜可包含最高至1％的归巢配体，最高至2％的归巢配体或最高至3％的归巢配体。
(e)被动归巢(passive homing)
作为本发明的包含归巢配体的纳米粒子的备选项，纳米粒子可使用“被动归巢”。如在本文使用的，“被动归巢”指的是纳米粒子在某些组织的靶细胞膜中积聚并因此与靶细胞膜融合的天然趋向。例如，被动归巢可指的是纳米粒子的脂质膜和靶细胞的脂质膜之间的电荷相互作用。或者，在其他实施方案中，被动归巢可指的是在肿瘤组织中的增强的渗透性作用。
(f)纳米粒子核
本发明的纳米粒子的核可并将变化而且不对脂质膜所必需的特性产生影响。一般而言，然而，所述核应该允许适当的脂质在纳米粒子和靶细胞膜之间转移。
(g)成像/示踪剂
本发明的纳米粒子也可包括其他成像/示踪剂。例如，纳米粒子可包括成像/示踪剂，其可用于显微镜，如荧光显微镜、共焦显微镜或电子显微镜、磁共振成像、X线断层摄影术、伽马(SPECT/CT、平面)和正电子放射X线断层摄影术(PET/CT)、X射线摄影术、计算机X线断层摄影术(CT)、光谱CT、光声X线断层摄影术(PAT)或超声。成像/示踪剂可为在原位、体内、离体和体外是可探测的。显微成像/示踪剂为本领域熟知的，并且可包括荧光分子，诸如FITC、若丹明和Alexafluor青靛色染料(Alexafluor cyan dyes)。类似地，磁共振成像分子，诸如顺磁性剂和超顺磁性剂、X射线摄影成像分子、近红外线(NIR)光学剂和超声分子为本领域熟知的，且可在考虑粒子的组成和粒子的意欲的用途之后由本领域技术人员选择适当的成像分子。在某些实施方案中，外层也可包含对将被核成像法，诸如PET、SPECT和相关的方法探测的放射金属的螯合剂。
(h)药用组合物
本发明还包括包含本发明的一种纳米粒子或多种纳米粒子的药用组合物。药用组合物可为纳米粒子的溶液、混合物或混悬液。在一个实施方案中，药用组合物可为溶液。在另一个实施方案中，药用组合物可为混合物。在另一个实施方案中，药用组合物可为混悬液。混悬液的非限制性实例是胶体。
在一些实施方案中，药用组合物可为胶体。一般而言胶体是不易于在混悬液中沉淀下来的细微粒子的混悬液。可经微射流(microfluidization)形成胶体。
可将本发明的粒子的药用组合物给予受试者以使生物组织能够成像和/或接受治疗。适宜的受试者可包括，但不限于哺乳动物、两栖动物、爬行动物、鸟类、鱼和昆虫。哺乳动物的非限制性实例包括人类、非人灵长类动物和啮齿动物。
可配制药用组合物并通过几种将传递有效治疗和/或成像剂量的不同方式给予受试者。一般可经胃肠外、腹膜内、血管内或肺内给予剂量单位制剂的这样的组合物，所述制剂，如需要，含常规无毒性的药学上可接受的载体、辅助剂、赋形剂和媒介物。如本文所用的，术语胃肠外包括局部、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、囊内、子宫内、心房内、鼻内、眼、眼内、肺内、口腔、咽内、经直肠、尿道内或经尿道、子宫内、阴道内或胸骨内注射或输注。此外，术语胃肠外包括喷雾或气雾剂给药技术。在一个实施方案中，可以团注形式(bolus)给予组合物。在优选的实施方案中，可静脉给予组合物。药用组合物的制剂在例如，Hoover，John E.，Remington′s药物科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1975)和Liberman，H.A.和Lachman，L.，Eds.，药物剂型(Pharmaceutical DosageForms)，Marcel Decker，New York，N.Y.(1980)中讨论。
可依据已知的技艺，使用适宜的分散或润湿剂和助悬剂，配制可注射的制剂，例如，灭菌可注射的水性或油质混悬剂。灭菌可注射的制剂也可为在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的灭菌可注射的溶液剂或混悬剂。在可应用的可接受的媒介物和溶剂中，有水、林格氏(Ringer′s)溶液和等张的氯化钠溶液。此外，无菌、不挥发油常规用作溶剂或悬浮媒介物。为了此目的，可使用任何温和的不挥发油，包合成单-或二甘油酯类。此外，脂肪酸，诸如油酸在制备可注射的制剂中是有用的。可使用二甲基乙酰胺、包括离子的和非-离子的去垢剂的表面活性剂和聚乙二醇类。溶剂和润湿剂的混合物，诸如在以上讨论的那些也是有用的。为了成像的目的，胃肠外给药制剂可呈现为生物相容的溶液剂或混悬剂的形式。其他辅助剂和给药模式为制药领域广为熟知的。
本领域技术人员将会认识到，为了治疗和/或成像而给予受试者的药用组合物的量和浓度，将部分取决于将被治疗和/或要成像的受试者和组织。确定最佳量的方法为本领域已知的，而更详细的内容可在实施例中找到。
本发明药用组合物还可包含本领域已知的额外的药用活性化合物。
III.方法
本发明的另一个方面包括使用前药或本发明的纳米粒子的方法。一般可在体外、在体或离体使用本发明的方法。
在一个实施方案中，本发明提供向细胞传递化合物的方法。该方法包括给予细胞本发明的前药。在示例性实施方案中，该方法包括细胞以包含本发明的前药的纳米粒子。在另一个示例性实施方案中，该方法包括给予细胞包含本发明的前药的标靶的纳米粒子。一般而言，适宜的细胞是任何的真核细胞，其中细胞膜的外层能够与粒子的膜形成半融合结构。
[0100]在另一个实施方案中，本发明提供增加化合物在受试者的血液中的半衰期的方法。该方法包括给药受试者以本发明的前药。在示例性实施方案中，该方法包括给予包含本发明的前药的纳米粒子。一般而言，适宜的受试者是哺乳动物。在一个实施方案中，适宜的受试者可为啮齿动物。在另一个实施方案中，适宜的受试者可为农业动物，如马、牛、猪、鸡等。在还一个实施方案中，适宜的受试者是非-人灵长类动物。还在另一个实施方案中，适宜的受试者是人。
在又一个实施方案中，本发明提供减少受试者中化合物的有效剂量的方法。该方法包括给予受试者以本发明的前药。在示例性实施方案中，该方法包括给予受试者包含本发明的前药的纳米粒子。适宜的受试者如上定义。
在还一个实施方案中，本发明提供控制细胞中化合物的释放的方法。该方法包括给予细胞以本发明的前药。在示例性实施方案中，该方法包括给予细胞包含本发明的前药的纳米粒子。适宜的细胞如上定义。
在又一个实施方案中，本发明提供在受试者中抑制血管新生方法，该方法包括给予受试者以本发明的前药，其中的前药包括抗血管新生化合物。在示例性实施方案中，该方法包括给予受试者包含含有抗血管新生化合物的前药的纳米粒子。
在示例性实施方案中，本发明包括给予细胞式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII或XIX前药的方法。该方法包括给予细胞含式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII或XIX前药的纳米粒子。
包括以下的实施例以证明本发明的优选的实施方案。本领域技术人员应该认识到，按照本发明人公开的代表性技术的实施例中公开的技术，在实施本发明中功能良好。然而，根据本公开，本领域技术人员应该认识到，在公开的且依然获得相似的或类似结果的具体实施方案中可作出改变，而不背离本发明的精神和范畴，因此在附属的图表中的所有列出和显示的事项均被解释为阐述性的而无限制性含义。
实施例
下列实施例阐述本发明的各种相互影响的操作(iterations)。
实施例1.多柔比星前药的标靶和效能
合成使用与5-碳sn-2酰基间隔体(spacer)偶合至磷脂酰胆碱主链的紫杉醇或多柔比星的前药候选者两个实例(参见以下的实施例)。由1H NMR(400MHz)波谱描述所产生的化合物的结构特点。在诱导表达整联蛋白的2F2B小鼠内皮细胞中测试αvβ3整联蛋白-标靶的多柔比星前药的作用。采用光学显微镜证实多柔比星前药转移至标细胞的和细胞内分布(图1)。标靶的多柔比星前药分布在脂质膜中、遍及细胞膜和在核中，而游离的多柔比星药物仅见于核中。分布在细胞膜中的多柔比星起着储库的作用，用于多柔比星转移至核，为更有效的治疗。酶促释放的药物也以高于由游离多柔比星引起的抑制的水平引起对内皮细胞增殖显著的抑制(图2)。
实施例2.多柔比星和紫杉醇前药的体内活性
采用大鼠体内基质胶塞(Matrigel plug)模型证明用整联蛋白-标靶的多柔比星前药和紫杉醇前药PFC纳米粒子的抗-血管新生治疗作用。采用于3T的αvβ3整联蛋白-标靶的顺磁性的PFC纳米粒子的MRI新生血管作图(mapping)评估治疗响应(图3)。治疗制剂相对于对照组两者均减少血管新生。在兔体内Vx2肿瘤模型中，使用紫杉醇前药得到类似的结果(图4)。因此，在与之前的显示在体外溶解期间紫杉醇或多柔比星的丢失的研究对比的不同，磷脂前药形式保留在循环中，传递至靶细胞，酶促释放和展示想要的抗增殖效应。
实施例3.Sn-2多柔比星前药的合成
可利用超过三个位点用于多柔比星的功能修饰(图5)：糖部分中的侧链羰基(位点1)、侧链醇基(位点2)和胺官能团(位点3)。在该实施例中，位点-3用于以下描述的修饰。
通过在TFA的存在下，使多柔比星与16:0-09:0 ALDO(PC)(1-棕榈酰基-2-(9′-氧代-壬酰基)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)在甲醇(无水的)中反应，合成PC-多柔比星(PC-DXR)共轭结合体1。通过氰基硼氢化钠，减少亚胺的随后的的形成，以产生终产物。经1H NMR(400MHz)波谱描述化合物的结构的特征(图7)。通过细胞内分布的多柔比星和通过以上实施例1中描述的酶促释放的药物产生的内皮细胞增殖的显著抑制，经显微镜证明该前药通路的概念上的证据(conceptual proof)。
实施例4.紫杉醇前药的合成。
按照五步合成法合成紫杉醇前药，并经柱色谱法纯化(图8)。简言之，在吡啶的存在下用琥珀酸酐处理商业上可获得的紫杉醇(AvachemScientific，Inc.)，得到2‘-琥珀酰基紫杉醇。可通过与二苯基磷酸N-琥珀酰亚氨基(succinimidyl)酯(SDPP)反应，获得该中间体的NHS酯(6)。在低温下，用过量的单-Boc-乙二胺处理该酯，随后使叔-Boc去保护。选择柔性的、线性二胺(1，3-二氨基丙烷)以减少位阻(现象)。最后，用ALDO PC(或PE)使紫杉醇胺经历还原性胺化，以产生紫杉醇前药(7)。
实施例5.sn-2紫杉醇前药的测试。
将2F2B小鼠内皮细胞(ATCC，Manassas，VA，USA)在培养基中孵育2天，用10nM烟碱或10μM血管紧张素II上调以表达αvβ3整联蛋白。然后，可将细胞暴露于用变化的药物负荷(0.5-5摩尔％)处理的整联蛋白-标靶的对无标靶的紫杉醇-GNB纳米粒子。也将细胞暴露于等价量的游离药物中30分钟作为对照。从孔中洗下未结合的纳米粒子或未吸附的药物，并使培养物生长6天，且计数附着的存活细胞数。当用紫杉醇-PC前药纳米粒子(PC-PTXL)处理，对比等价量游离的单独的紫杉酚(Taxol)、αvβ3整联蛋白-标靶的纳米粒子或盐水，细胞数显著减少(图9)。
实施例6.顺铂前药的合成。
为了合成铂基抗癌前药，可遵循两种方法。第一种方法(图10)可包括制备以胺为末端的顺铂(9)，随后与氧化的脂质共轭结合。在HATU/DIPEA的存在下，从化合物8与单Boc-乙二胺的酰胺化反应产生的偶合的中间体，可经历去保护，以产生化合物9。化合物9可经历用ALDO PC在甲醇中的还原性胺化，生成顺铂前药-1(10)。
第二种方法(图11)可包括合成带有经疏水修饰的螯合的二胺的类似物。可用三步从化合物13获得顺铂中间体16。通过维持得到的溶液的pH于pH 6-7，可使中间体16经历与K2PtCl4的络合。最后，可用ALDO(PC)或(PE)使化合物13经历还原性胺化，以产生顺铂前药-2(18)。
实施例7.甲氨蝶呤前药的合成。
在(图12)中描述甲氨蝶呤共轭结合体的合成。可将短的乙二胺间隔体引入甲氨蝶呤和氧化的脂质之间。6-溴代甲基-蝶啶-2，4-二胺三氢溴酸盐(BPT·HBr，23)可从Ube Industries购买，并且与中间体24偶合，以产生25。可使化合物25脱去叔-Boc去保护，随后酯水解，得到以胺为末端的甲氨蝶呤(26)。可如较早描述的实施，用ALDO(PE)或(PC)使26还原性胺化，得到甲氨蝶呤前药(27)。
实施例8.硼替佐米前药的合成。
硼替佐米-前药的不对称的合成(图13)可包括通过按照发表的方法制备中间体-1(N-亚硫酰基α-氨基硼酸频哪醇酯(N-sulfinyl α-aminoboron pinacolato)复合物)。在温和的酸性条件下选择性去除N-亚硫酰基，可产生胺盐酸盐(中间体2)，然后可通过TBTU/DIPEA介导的反应方案与N-Boc-L-苯丙氨酸偶合。然后，中间体-3(胺盐酸盐)可经历与商业上可获得的3-氨基吡嗪-2-羧酸的偶合，得到硼替佐米的硼酸频哪醇酯。此随后可在双相条件下经利用异丁基硼酸作为频哪醇掩蔽剂(sequestering agent)水解。最后，在催化量的TFA的存在下，中间体-4可经历氰基硼氢化钠介导的用ALDO(PC)进行的还原性胺化，得到硼替佐米前药。
实施例9.MYC-抑制剂前药的合成。
可通过在室温下，在碳酸钾溶液中，在催化量的吐温-80(Tween-80)的存在下，使4-乙基苯甲醛与罗丹宁反应，合成Myc-抑制剂-1(图14)。可用5％HCl中和该混合物，且可用饱和NaHSO3处理沉淀物和用乙醇水溶液再结晶。可使该罗丹宁衍生物与哌啶-单-叔Boc和甲醛反应。在TFA的存在下使叔Boc去保护可产生Myc-抑制剂-1。最后，在催化量的TFA的存在下，Myc-抑制剂-1可经历氰基硼氢化钠介导的用ALDO(PC)进行的还原性胺化，得到Myc-罗丹宁前药。
实施例10：在再狭窄中的myc-抑制剂前药
Myc编码在50-80％的人癌症中上调的螺旋-环-螺旋转录因子并且与每年100,000例美国癌症死亡相关联。Myc与其伴侣Max成异二聚物以控制靶基因转录和深深地被整合到管理细胞生存能力和增殖的调节和控制机制中。近期的评估提示Myc结合至人基因组的约25,000个区域。Myc蛋白质的丢失抑制细胞增殖和生长，加速分化、增加细胞粘附和使对DNA损害的反应增强。
[0110]本发明人相信Myc是抗-癌治疗的理想的靶标，特别是MM，其由选择性破坏性干扰的Myc-Max二聚化高度过表达，同时允许Myc-Mad相互作用。
图27阐明，含myc前药的αvβ3标靶的粒子减少SMC增殖。将人冠脉平滑肌细胞铺陈于盖玻片上(2500个细胞)和孵育2小时。每个处理复制6次。含myc前药的αvβ3标靶的粒子的壁间(intramural)传递，单独或与支架一起，提供对再狭窄处理的吸引人的新方法。
实施例11.来那度胺前药的合成
在ALDO(PE)或(PC)的存在下，在甲醇(无水的)中，在催化量的TFA存在下，来那度胺经历还原性胺化，随后经与NaCNBH3的一釜法(one-pot)反应，得到来那度胺-前药(Fig 15)。
实施例12.烟曲霉素前药合成。
以直接的方式，通过使烟曲霉素皂化为烟曲霉醇(fumagillol)二环己基胺盐，然后采用DCC/DMAP介导碳二亚胺偶合方案激活和然后用氧化的脂质衍生化，完成最初的前药(烟曲霉素前药1)的合成。
Figure BDA00002599181800361
(3R，4S，5S，6R)-5-甲氧基-4-((2R，3R)-2-甲基-3-(3-甲基丁-2-烯基)环氧乙烷-2-基)-1-氧杂螺[2.5]辛-6-醇，(烟曲霉醇，2)。
将烟曲霉素二环己基胺盐(0.2g、0.31mmol)悬浮于2mL的1∶1甲醇∶水中并用0.07mL的35％NaOH溶液(0.62mmol)处理。将深褐色混合物于冰浴中搅拌2h，然后温热至室温并用另一份等量的NaOH溶液处理。搅拌该混合物直至经TLC(4h)探测不到起始原料；蒸发甲醇且将残余物提取入乙酸乙酯中。然后用5％柠檬酸、盐水、碳酸氢盐提取混合物，并再用盐水提取，然后经MgSO4干燥和真空浓缩。用乙腈中的活性炭处理以进一步纯化粗产物和经硅藻土垫过滤。浓缩得到无色固体，59mg(70％)。HRMS实测值：MH+(283.3)。
烟曲霉素前药1制备的一般方法：
将C16-09:0(COOH)PC 1-十六烷基-2-壬二酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(3.2mmol)溶液，随后将DMAP(44mg，3.2mmol)和DCC(46mg，3.2mmol)加至在无水二氯甲烷(1ml)中的烟曲霉醇(11mg，0.4mmol)的溶液中。于室温搅拌反应混合物过夜，然后使用EtOAc/正-己烷(1∶2，v/v)使混合物通过短硅胶柱和真空去除过滤的溶剂，留下油残余物，经SiO2柱色谱法用EtOAc/正-己烷(1∶4，v/v)作为洗提溶剂纯化，得到浅黄固体样烟曲霉素前药1化合物。HR-MS实测值：991.5475(M+2K-2H)。
其他策略和具体实施例：
该步骤的挑战将是开发具有改良的膜保留(membrane retention)特性的烟曲霉素和其相关候选者的光和化学稳固的类似物。其中的一个策略将遵循从它们的结构去除不稳定和药理学无活性(和不相关的)官能团并将疏水类似部分引入全系统。在本发明中，本发明人设计用光稳定的、非-共轭结合不饱和链取代所有的反式-十四烯二酸酯(trans-decatetraenedioate)。本发明人将合成烟曲霉素类似物，其中各个有效的反应性环氧基将个别地或组合地被取代。酯键将被稳定的共价键的结合所替代。平行策略将允许提供给这些类似物以膜粘附特性的所述部分的结合。十四烯二酸的尾端(decatetraenedioic tail)将被疏水的相应部分所取代。多个团体已经探究并且在文献中公开制备烟曲霉素类似物的合成方法。本发明人将开发被提议的类似物的有效合成方法，为对其具有显著治疗效能的生物活性的详细检验的进一步研究做好准备(参见图34)。
Figure BDA00002599181800381
稳定的烟曲霉素前药的合成
烟曲霉素前药1：通过使烟曲霉素水解和经历DCC介导的与商业上可获得的PAzPC(16:0-9:0 COOH PC)的偶合，产生烟曲霉醇(1)。回收该产物并立即在乙酸的存在下经历与LiCl的反应，用氯代甲基官能团打开螺环氧化物环(spiro epoxide)。
烟曲霉素前药2：通过用双(4-硝基苯基)碳酸酯激活烟曲霉醇，随后与单boc-乙二胺反应，得到6。在典型的实验方法中，在N2气氛下，将在无水CH2Cl2中的烟曲霉醇、双(4-硝基苯基)碳酸酯和DMAP的混合物搅拌7h。反应混合物用CH2Cl2稀释和用H2O洗涤。干燥(Na2SO4)有机层和浓缩。使用快速色谱法(EtOAc-己烷)得到活化的烟曲霉醇。然后偶合单boc-保护的乙二胺以制备中间体-6。回收该产物并立即在乙酸的存在下立即与LiCl反应，以用氯代甲基官能团打开打开螺环氧化物环。用TFA使boc去保护，和在ALDO PC的存在下使该产物经历氰基硼氢化钠介导的还原性胺化。
前体化合物的合成：按照Takahashi等40a的文献方法合成卵假散囊菌素(Ovalicin)(4)。商业上可获得的2，3:5，6-二-O-异亚丙基-R-D甘露呋喃糖(mannofuranose)被用作起始原料，得到光学纯的卵假散囊菌素，总得率10％。烟曲霉醇将购自Sinova，Inc.并按收到的原样使用。
采用氯铬酸吡啶(PCC)/吡啶使烟曲霉醇经历氧化，得到烟曲霉酮(Fumaginone)(3)。在典型的实验方法中，于室温下，使无水CH2Cl2中的烟曲霉醇(1equiv.)、氯铬酸吡啶(PCC，8equiv.)和吡啶(5equiv.)的混合物搅动10h，由薄层色谱法监测反应的完成。经硅胶柱色谱法(EtOAc-CH2Cl2)纯化反应混合物，得到清亮油样烟曲霉酮。
流程1.从卵假散囊菌素和烟曲霉酮前体合成类似物1-2。
合成类似物1-2：如以上简要讨论的，在本发明中，发明人设计用光稳定的、非-共轭结合的不饱和链(类似物1-2)取代所有反式-十四烯二酸酯。因此，用或者氢(烟曲霉素系列)或者羟基(卵假散囊菌素系列)制备在疏水尾带有多种非-共轭结合的取代基的类似物1-2。简要地，前体化合物将经历用各自取代烯丙基溴的铟介导的有机金属烯丙基化反应。
Figure BDA00002599181800401
流程2.从卵假散囊菌素和烟曲霉酮前体合成类似物3-6。
类似物3-6：可从卵假散囊菌素-腙合成类似物-3。简要地，在乙酸的存在下用LiCl处理卵假散囊菌素(或烟曲霉酮)，以用氯代甲基官能团打开螺环氧化物。与LiCl和乙酸搅拌卵假散囊菌素的THF溶液36h和通过去除THF进行后处理，随后加入氯仿。有机层经用H2O、碳酸氢钠洗涤，干燥和经硅胶色谱法纯化(30％EtOAc-己烷)。
接下来，在温和的酸性条件(乙酸)下用肼处理该中间体，以获得相应的腙。然后将腙经历用氰基硼氢化钠进行的选择性还原，随后在各自的酸(E-异香叶酸)40e(流程2)的存在下经DCC/DMAP介导的酰胺化。在最后步骤，任选改造(reformed)螺环氧化物官能团。在0℃下用KOtBu在THF中处理类似物3，得到含改造的螺环氧化物部分的类似物-4。
在分开的路径中，在温和的酸的存在下用羟基胺处理中间体-1，得到相应的肟衍生物。使肟衍生物还原，随后经用E-异香叶酸进行DCC-介导的酯化，得到类似物5。2，6-辛二烯酸氯化物也可用于使肟(类似物6)酯化。
按照Eustache和coworkers40e的文献报告从E-异香叶醇合成E-异香叶酸。在硫磺酸的存在下，在水和丙酮混合物中，使E-异香叶醇经历三氧化铬介导的氧化，得到想要的E-异香叶酸。获得以纯的对映选择性E-形式呈现的该酸并通过硅胶柱从副产物分离该酸。以直接的方式，通过用PCl5处理使2，6-辛二烯酸，(2E，6E)-转化为酰氯。41
Figure BDA00002599181800411
流程3：从卵假散囊菌素和烟曲霉酮前体合成类似物7-9、
类似物7-9：基于先前Liu等，42的报告，带有在C4侧链上的介于C10和C20个碳的可旋转的单键的化合物，与具有刚性的环氧化物和二烯侧链的类似物比较，表现出对抗MetAP-2的减少的活性。晶体学数据也指出在用于进一步优化口袋中有显著空间。42统而言之，发明人决定用二烯部分置换酸不稳定侧链环氧化物。
在典型的实验方法中，在-BuLi的存在下，于-78℃用WCl6处理类似物-5，随后于0℃用KOtBu在THF中处理，得到类似物7(流程3)。在氩气氛下，于-78℃将-BuLi逐滴加至WCl6的THF溶液中，随后搅拌1/2h。加入类似物-5的溶液并使其反应2h。将NaOH加至反应混合物中和用乙醚提取该产物。用NaOH和水洗涤提取物。残余物经柱色谱法(乙酸乙酯-己烷)纯化，得到类似物-7。按照以上描述的合成类似物-7的途径分别从类似物-4和6合成类似物8-9。
Figure BDA00002599181800421
流程4.从卵假散囊菌素和烟曲霉酮前体合成类似物10-11。
类似物10-11：发明人也用可提供想要的几何学和取代模式的肟官能团置换环外侧链环氧化物。由Pyun等40m之前的报告显示，带有苄基肟的类似物展示出极佳的活性(～1nM，在MetAP-2分析中。40m合成和评估C4肟类似物。如之前Fardis等报告的，可易于从烟曲霉醇合成中间体3。40b将于-78℃使中间体-3经历臭氧分解，随后用甲硫醚处理，得到相应的酮衍生物。在TsOH和分子筛
Figure BDA00002599181800422
的存在下，用氨基苄基肟(H2N-OBn)处理酮衍生物，得到E和Z苄基肟(中间体4)的混合物。然后使中间体-4氧化为相应的酮衍生物。用肼或羟基胺处理中间体-4，生成相应的肟衍生物，然后将其还原和用DCC/DMAP活化，与E-异香叶酸反应，得到类似物10-11。
Figure BDA00002599181800431
图表4.从卵假散囊菌素和烟曲霉酮前体合成类似物12-15。
类似物12-15：福玛拉诺(Fumarranol)是新的烟曲霉素的合成类似物，已经显示其选择性地抑制MetAP2和内皮细胞增殖，而不共价结合MetAP-240g。福玛拉诺由具有打开的螺旋环氧基部分的双环结构构成。发明人决定沿着以上讨论的策略探究相关的福玛拉诺类似物。使类似物-10与KOH反应以在6-酮基的R-位形成负碳离子，其经历分子内SN2类型反应以打开螺旋环氧化物基团(图表4)，得到双环结构(类似物12)。类似地，分别从类似物7和8合成类似物13-15。
Figure BDA00002599181800432
图表5.从卵假散囊菌素和烟曲霉酮前体合成类似物16-19
类似物16-19：本发明人也承担其中螺(C-3)环氧化物将被硫代甲醇盐(流程5)官能团打开的类似物的合成。简要地，于室温，向搅拌的类似物-7的无水的DMF溶液中加入硫代甲氧基。搅拌反应混合物2h，然后用乙酸乙酯稀释和用饱和NaHCO3水溶液和水洗涤。干燥(无水的Na2SO4)有机相和残余物经硅胶柱色谱法(乙酸乙酯∶己烷)纯化，得到类似物-16。遵循类似的方法，分别从类似物8-9和4起始合成类似物17-19。
Figure BDA00002599181800441
流程5.从卵假散囊菌素和烟曲霉酮前体合成类似物-20。
Figure BDA00002599181800442
流程6.从烟曲霉醇合成类似物21。
合成类似物20-25(烟曲霉素-PAF类似物)：如之前所描述的，该步骤的挑战之一将是开发新的具有改善的膜粘附特性的烟曲霉素类似物。针对该目标，将合成也在注重理解MetAP2对在C4和C6取代的可容忍性的一系列烟曲霉素-PAF类似物。起先，将维持C4侧链不变和修饰C6。期望在C6放置血小板活化因子(PAF)-脂质(16:0)以改善这些化合物的膜粘附特性。本发明人计划使用短的(甘氨酸)和中等的间隔体(ε-氨基已酸)作为类似物的柔性部分，提供在碳环与疏水尾之间的连接(流程5和6)。键合剂分子可在驱动酶促水解PAF共轭结合的烟曲霉素候选者中重要起作用。先前由Dahan等28f研究了键合剂长度对磷脂-前药的降解的影响。发现更短的键合剂(2-碳)产生的前药的释放，与5-碳键合剂比较，少20-倍28f。简要地，将在存在温和的酸性条件(乙酸)下，用ε-氨基已酸处理卵假散囊菌素(或烟曲霉醇)，得到相应的腙。用氰基硼氢化钠选择性地还原该腙，随后在PAF(16:0)存在下进行DCC/DMAP介导的酰胺化，得到类似物-20。
Figure BDA00002599181800451
图表6.被提议的烟曲霉素类似物22-27的结构。
或者，用双(4-硝基苯基)碳酸酯活化烟曲霉醇，随后与甘氨酸反应。在典型的实验方法中，在N2气氛下，将烟曲霉醇、双(4-硝基苯基)碳酸酯和DMAP在无水CH2Cl2中的混合物搅拌7h(流程6)。反应混合物用CH2Cl2稀释和用H2O洗涤。干燥(Na2SO4)和浓缩有机层。经快速色谱法(EtOAc-己烷)得到活化的烟曲霉醇。然后将甘氨酸偶合，以制备中间体-6。简要地，在N2气氛下，使于无水CH2Cl2中的活化的烟曲霉醇、甘氨酸和DMAP的溶液搅拌2h。经薄层色谱法监测反应的完成。用CH2Cl2稀释和用H2O洗涤有机层对反应混合物进行后处理。去除溶剂，随后进行快速色谱法(MeOH-EtOAc)，得到中间体-6。最后用PAF(16:0)剂对中间体-6进行碳二亚胺介导的酯化(DCC/DMAP)，得到类似物21。
在用PAF剂置于C6之后，将实施烟曲霉素的C4侧链修饰以开发具有的合意的药理特性的MetAP-2抑制剂。用硫代甲醇盐打开类似物18和19的螺环氧化物环，得到类似物23和25。继续进行由苄基肟和二烯侧链对C4侧链的置换，得到类似物22、24、26-27(图表6)。
合成的烟曲霉素类似物的特征：通过NMR、FT-IR、质谱和元素分析了解合成的烟曲霉素类似物的详细的特征。1H和13C信号赋值和质子的空间接近性将基于COSY、NOE实验。将基于COSY、NOESY和选择性1DTOCSY13检测获取1H和13C信号赋值。将通过自在分辨率增强的高斯切趾法(Gaussian apodization)之后的1H NMR频谱的一阶(first-order)近似值，确定分子的脂族部分的质子-质子偶合常数。以类似的方式进行对环己基环和C-4侧链的研究。
实施例13：烟曲霉素前药效能
如在图19中所示，溶解于脂质膜的烟曲霉素在体内迅速释放，使得其在体内实际上失效。然而，图20显示了以本发明的纳米粒子给予的烟曲霉素前药的体内效力。实际上，该图显示用标靶的烟曲霉素纳米粒子(a-b)和对照(无药物，c-d)治疗后的体内MR信号增强；在大鼠中，用含有2.28摩尔％烟曲霉素-PD的αvβ3-整联蛋白-标靶的纳米粒子处理相对于用含有2.28％烟曲霉素的αvβ3-整联蛋白-标靶的纳米粒子处理、用没有药物的αvβ3-整联蛋白-标靶的纳米粒子处理、用含有2.28摩尔％烟曲霉素-PD的非标靶的纳米粒子处理，减少的基质胶植入物(Matrigel implant)体积(％)。
图21显示烟曲霉素前药在体外细胞增殖分析中的作用。左侧小图显示结合到纳米粒子的烟曲霉素前药和对照纳米粒子(标靶的无药物、未标靶的和标靶的烟曲霉素)，对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的经CyQuant NF分析的细胞增殖的作用，而右侧小图显示经阿尔玛蓝(Alamar Blue)分析的细胞代谢活性。
实施例14：多西他赛前药
在阿尔玛蓝分析中，将如在图18A或B中所示合成的多西他赛前药给予2F2B细胞，以检测代谢活性。图22显示没有多西他赛的αvβ3标靶的粒子、含有多西他赛的αvβ3标靶的粒子和含有多西他赛前药的αvβ3标靶的粒子之间的对比。如分析所进行的，当与没有多西他赛的标靶的对照物比较时，包含前药的粒子证明持续抑制细胞代谢活性。
实施例15：光动力学疗法(PDT)前药的合成.
在典型的方法中，将以直线前进的方式合成锌螯合的卟啉基PDT前药。然后在NaBH4和催化量的三氟乙酸的存在下，使胺作为末端的锌-卟啉PDT前药经历使用ALDO PC的还原性胺化。
实施例16：聚山梨醇酯胶束
本申请包括用于治疗诊断应用(theranostic application)和基因传递系统的新的纳米微粒系统的设计、合成、物理-化学特征和应用。多功能的纳米粒子在癌症药物传递中起非常重要的作用。经持续不变地探究新颖的新应用，纳米粒子在癌症药物传递中的潜力是极大的。癌症具有生理障碍如血管内皮毛孔、多种异源性(heterogeneous)血供、异构结构等。为使一种疗法得到成功，非常重要的是克服这些生理障碍。对于采用标靶的分子成像和药物传递探测和治疗癌症，纳米微粒药物为医学领域最新的成就并形成纳米医学研究的基础。已经探索多种纳米装置，包括纳米孔(Nanopores)、纳米管(Nanotubes)、量子点(QuantumDots)(QDs)、纳米壳(Nanoshells)、树枝形分子(Dendrimers)和壳交联的纳米粒子、PFC纳米粒子、生物可降解的水凝胶等。
纳米级装置比人细胞小100倍，但是在尺寸上小于大的生物分子，诸如酶和受体。在尺寸和形状方面，小于50nm的纳米粒子可易于进入大多数细胞，而那些小于20nm的纳米粒子当其在身体中循环时可离开血管。设计纳米粒子为载体，以携带在体内有效探测的高有效载荷的造影剂，并且也适宜作为定制的、标靶的药物传递媒介物，以携带大剂量的化疗剂或治疗用基因进入恶性细胞中，同时防护健康细胞。在该方法中，纳米粒子大大地减少或消除伴随许多现行的癌症疗法的经常不可接受的副作用。纳米粒子的类型也是非常重要的并可分类为两个主要的种类-无机的和有机的。脂质体、树枝形分子、碳纳米管、乳剂和其他聚合性纳米粒子为有机粒子的广泛研究组的实例。大多数无机纳米粒子共享限定粒子的荧光性、光学性、磁性和电子性质的中心核的相同的基础结构，其表面上有保护性的有机包衣。该外层保护核心免于在生理具侵犯性环境中的降解，并可与荷正电剂和具有碱性官能团的生物分子，诸如胺和硫醇形成静电键或共价键或两者。在尺寸方面，可产生非常小尺寸的、范围在2-50nm之间(金至氧化铁粒子)的无机纳米粒子，然而具有挑战性的是用有机的前体达到这样的小尺寸范围。在癌症中更大的纳米粒子可使其难以规避器官，诸如肝、脾和肺，这些器官时常将外来物质清除出身体。此外，它们必须能利用细胞中的微妙的差异以区别正常和癌性组织。确实，仅在最近，研究者已经开始成功地通过基因工程方法制备可有效规避免疫系统和积极地靶向肿瘤的纳米粒子。
所以，不论在开发标靶的治疗性成像的纳米粒子的新进展如何，仍然存在本领域对血管外粒子(＜20nm)水溶性的、稳定系统的长久的需求。必需的性质包括生物相容性、可易于生物代谢的、治疗剂内在的隐蔽作用(internal sequestration)、具有可调整的释放特征和耐受不利的体内环境。基于这些需求，本发明人开发治疗应用的超小型“软”nanocelle纳米粒子。通过共轭结合至对靶细胞或组织有特异性的配体(整联蛋白αvβ3、α5β1、ICAM-1、VCAM-1、VLA-4等)，制备对靶细胞或组织有特异性的纳米粒子。纳米粒子还可包括应用于其成像和疗法的生物活性剂、前药(烟曲霉素、myc-max抑制剂、喜树碱、顺铂、类固醇、甲氨蝶呤、紫杉醇/多西他赛等)放射性核素等。将粒子与MR、CT、光学、光声的、PET、SPECT和US的造影剂结合。
制备Nanocelle纳米粒子
本发明人已经制备具有介于16-20nm之间的名义上的液体动力学直径的水溶性的nanocelle纳米粒子。这些粒子的核包含与包被在其周围的磷脂在生物学上相关的表面活性剂(即吐温80(Tween 80)、司盘80(span 80)、失水山梨醇倍半油酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯)。通过物理-化学方式充分描述粒子的特征。
制备avb3-标靶的Myc-max抑制剂荷载的nanocelle粒子的典型方法：
在典型的实验方法中，表面活性剂共-混物包括高纯度蛋黄磷脂酰胆碱(99摩尔％，395.5mg)、v3-拟肽拮抗剂共轭结合至PEG2000-磷脂酰乙醇胺(0.1摩尔％，Kereos，Inc，St.Louis，MO，USA).(1摩尔％，6.0mg)和2摩尔％的myc-max前药。将表面活性剂共-混物溶解于无水氯仿中，减压下蒸发以形成薄膜，于50℃真空炉中干燥过夜，和通过探针超声波分散入水(5mL)中。将该混悬液与聚山梨醇酯混合物(20％v/v，4ml)合并，稀释，去离子水(77.3％w/v，总15.23ml)和丙三醇(1.7％，w/v，0.37ml)。其后于0℃以20,000PSI用S110微流体乳剂(微流体)继续加工混合物4分钟。采用20,000Da MWCO纤维素膜，纳米技术超纯(nanopure)(0.2μm)水透析nanocelle粒子一段延长的时期，然后通过0.45μm Acrodisc注射器过滤器。于氩气氛下，典型地于4℃，存储纳米粒子以防止任何细菌生长。通过于90°激光实施的Brookhaven动态光散射实验，测量粒子的水合状态水动力学直径(16±4nm)。分别采用TEM(用1％乙酸铀酰负性染色和在镍表面上干燥)和AFM(图xx)(轻敲模式(tapping mode)、滴状沉积(drop deposited)和在盖玻片上干燥)测量脱-水合状态直径和粒子高度。
前药体外测试：细胞毒性分析
将人B16黑色素瘤细胞接种于96孔板上(5000个细胞/孔)。24小时后，用avb3-整联蛋白标靶的nanocelle myc前药(～0.5uM myc-PD)、游离myc、标靶的无药物或未标靶的myc前药nanocelles孵育细胞一小时(每板每个样品6个重复件)。用PBS洗孔三遍，并将板返回孵育器。暴露药物后二至四天，采用阿尔玛蓝(Invitrogen)检测细胞代谢活性。该分析是基于在代谢活性细胞中非荧光染料还原为荧光底物。此还原典型地归因于不同的氧化还原酶系统，该系统使用NAD(P)H作为主要的电子供体。采用荧光读板仪(Ex 570nm，Em 587nm)监测此氧化还原反应，得到的信号与存在的存活细胞数成比例。使每个样品的信号强度归一于来自阳性对照的信号(αvβ3-整联蛋白标靶的无药物纳米粒子)(每个时间点n＝3-6块板)(图28)。
实施例17：包含PNA的前药
依据标准自动化的Fmoc PNA合成程序，在自动化肽合成器上，于2μmol Fmo`c-PAL-PEG-PS，利用购买的单体(Panagene Inc.，Korea)，合成PNAs和共轭结合物。在自动化合成最后步骤之后，用无水DMF(2×3mL)和无水CH2Cl2(2×3mL)洗涤树脂，随后在N2气流下干燥。然后在室温下，在小瓶中，用三氟乙酸(300μL)和间甲酚(100μL)振摇树脂2h，以使PNA释放和去保护。从树脂过滤溶液，并加至冰冷的Et2O(5mL)中，且保持4℃计1h。通过离心收集得到的沉淀物和经反相HPLC纯化。在自动化肽合成器上，采用标准的Fmoc化学合成PNA-赖氨酸共轭结合体(2μmol)。将在DMSO(0.19μmol，由分光光度法测定的)中的PNA-赖氨酸共轭结合体加至PAzPC的溶液中，并使之搅拌30min，之后加入1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺甲碘化物。使得到的溶液搅拌16h和经反相HPLC技术纯化。
实施例18：喜树碱前药的合成
Figure BDA00002599181800511
图表7.喜树碱前药1(顶部)和前药2.(底部)的合成路径。
a.1)喜树碱前药1的合成：在DCC/DMAP介导的偶合方案的存在下，通过化合物与PAzPC(脂肪酸修饰的氧化的脂质16:0-9:0 COOHPC)的直接偶合，产生喜树碱前药(1)。
a.2)喜树碱前药2的合成：用双(4-硝基苯基)碳酸酯使喜树碱活化，随后与单boc-乙二胺反应，得到6。在典型的实验方法中，于N2气氛下，将于无水CH2Cl2中的喜树碱、双(4-硝基苯基)碳酸酯和DMAP的混合物搅拌7h。用CH2Cl2稀释反应混合物和用H2O洗涤之。干燥(Na2SO4)和浓缩有机层。采用快速色谱法(EtOAc-己烷)，得到活化的烟曲霉醇。然后将使单boc-保护的乙二胺偶合以制备中间体-6。回收该产物并立即经历DCC/DMAP介导的与PAzPC的偶合。两个类似物的化学特征将均由NMR和质谱分析所证实。
实施例19：甲基泼尼松龙前药
通过在DCC/DMAP介导的偶合方案的存在下，使化合物与PAzPC(脂肪酸修饰的氧化的脂质16:0-9:0 COOH PC)的直接偶合，产生甲泼尼龙前药。
Figure BDA00002599181800521
实施例20：使配体偶合至纳米粒子的方法
可通过遵循与粒子上的β-环糊精(β-CD)的包合物协议，独特地实现使配体偶合至纳米粒子，所述β-环糊精自发地与肽或小分子配体上的金刚烷相互作用，形成包合配合物。简要地，经由单-6-脱氧-6-氨基-β-环糊精合成环糊精-PEG-DSPE衍生物。使用对-甲苯磺酰氯使β-环糊精的七个伯羟基之一甲苯磺酸化。通过叠氮化物的甲苯磺酰基的取代和随后的用三苯基膦的还原将得到单-6-脱氧-6-氨基-β-环糊精。使羧基-激活的PEG-DSPE与单-6-脱氧-6-氨基-β-环糊精共轭结合，得到环糊精-PEG-DSPE。通过固相肽合成中的短的间隔体使金刚烷-胺直接共轭结合至肽的羧基末端，得到金刚烷-肽/配体。金刚烷-胺和具有纳米粒子的β-环糊精的简单的室温混合，将产生肽偶合的标靶的纳米粒子。

Claims (20)

1. 一种在体内将化合物传递至靶细胞的组合物，该组合物包含非脂质体粒子和至少一种前药，其中
(a) 粒子的外表面是包含至少一种前药的膜，并且还包含约100%至约60%磷脂，其中在体内粒子的外表面能够融合至靶细胞膜的外层，这样的融合导致前药从粒子转移至靶细胞的外层，
(b) 所述前药包括键接至磷酸甘油酯的酰基部分的、小于约3000 da的化合物，其中的化合物可经由酶裂解从磷酸甘油酯主链释放，
(c) 所述前药基本上保留在粒子的外表面膜中，直至将前药转移至靶细胞的外层，和
(d) 所述前药从靶细胞膜外层被进一步转移至内层，导致在细胞内经由酶可裂解的键合的裂解而释放化合物。
2. 权利要求1的组合物，其中粒子的外表面包含不超过3%的前药。
3. 权利要求1的组合物，其中的外表面可包含最高至约10%聚山梨醇酯。
4. 权利要求1的组合物，其中不少于约10%的外表面是交联的。
5. 权利要求1的组合物，其中的外表面还包含归巢配体。
6. 权利要求5的组合物，其中的外表面不是聚乙二醇化的，除了归巢配体之外。
7. 权利要求5的组合物，其中的归巢配体选自抗体、抗体片段、肽、无唾液酸糖蛋白、多糖、核酸、小分子和拟肽。
8. 权利要求1的组合物，其中的化合物键接至磷酸甘油酯的sn-2酰基部分。
9. 权利要求8的组合物，其中前药的酰基部分离丙三醇主链 sn-2酯键的长度为至少4个碳原子。
10. 权利要求1的组合物，其中的前药包括选自肽、肽拟似物或类似物、有机金属复合物、有机分子和核酸或其类似物的化合物。
11. 权利要求1的组合物，其中在体内酶可裂解的键合在细胞外基本上不裂解。
12. 权利要求1的组合物，其中的前药包括选自化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII和XIX的化合物。
13. 权利要求1的组合物，其中的前药包括选自多柔比星、多西他赛、甲泼尼龙、烟曲霉素或其类似物、喜树碱或其类似物，以及PDT药物的化合物。
14. 权利要求1的组合物，其中的前药包括选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸的磷酸甘油酯。
15. 权利要求1的组合物，其中的粒子在约10 nm和10微米之间。
16. 权利要求1的组合物，其中的化合物是前药。
17. 一种在体内将化合物传递至靶细胞的方法，该方法包括给予患者组合物，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的非脂质体粒子和至少一种前药，其中
(a) 粒子的外表面是包含至少一种前药的膜，其还包含约100%至约60%磷脂，其中粒子的外表面能够在体内融合至靶细胞膜的外层，这样的融合导致前药从粒子转移至靶细胞的外层，
(b) 所述前药包括键接至磷酸甘油酯的酰基部分的、小于约3000 da的化合物，其中的化合物可经由酶裂解从磷酸甘油酯主链释放，
(c) 所述前药基本上保留在粒子的外表面膜中，直至将前药转移至靶细胞的外层，和
(d) 所述前药还从靶细胞膜外层转移至内层，导致化合物经由酶可裂解的键合的裂解在细胞内释放。
18. 权利要求17的方法，其中组合物经静脉给予。
19. 权利要求17的方法，其中的组合物还包含另外的药用活性成分。
20. 权利要求17的方法，其中的组合物包含选自化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII和XIX的前药。
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