CN105682678A - 用于预防和/或治疗ErbB2阳性癌症的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于预防和/或治疗ErbB2-阳性癌症的组合物和方法。该组合物包含含有分离的或重组的或经过修饰的肽酶D(PEPD)蛋白的药物制剂。该方法包含通过向患有ErbB2-阳性癌症或具有发展成ErbB2-阳性癌症的风险的个体给药PEPD来预防和/或治疗ErbB2-阳性癌症。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年8月23日提交的申请号为61/870,054的美国申请的权益，其公开通过引用合并于此。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在美国国家癌症研究所颁发的合约号为R01CA120533、R01CA124627和R01CA164574的政府支持下进行的。政府具有本发明中的某些权利。
技术领域
本发明大体上涉及人类健康领域，且特别是涉及用于预防和治疗与ErbB2表达呈正相关的癌症和/或其它症状的方法。
背景技术
ErbB2，也称为v-erb-b2禽类成红细胞白血病病毒致癌基因同源物2、Her2、Neu、CD340、原癌基因C-ErbB2，是广泛研究的浆膜结合受体络氨酸激酶的ErbB家族的一员，ErbB家族还包含ErbB1、ErbB3和ErbB4(还分别称为EGFR/Her1、Her3和Her4)。已经证明这些受体在胚胎发育、正常生理与各种疾病的发展中发挥关键的作用。所有四种ErbB受体含有与胞外域(ECD)、跨膜域和与信号转导分子相互作用的胞内域。结合到这些受体的ECD的配体导致了同源或异源二聚化，随后激活胞内域中内在蛋白酪氨酸激酶和酪氨酸自磷酸化，并募集和激活对这些位点的信号转导蛋白。值得注意的是，ErbB3是损伤的激酶且需要进行异源二聚化而被激活。到目前为止，虽然已经鉴定出多种ErbB1、ErbB3和ErbB4的配体，但是自将近30年前发现ErbB2以来还没有找到ErbB2的配体，(Coussens等人.Science1985；230：1132-1139；Schechter等人.Science1985；229：976-978)。然而，对于其它配体结合的ErbB，ErbB2是优选的二聚化配偶体。
ErbB2因其参与人类乳腺癌而最为出名。20％-30％的乳腺癌中发生ErbB2基因扩增且其与癌组织中的ErbB2蛋白表达显著相关。ErbB2基因扩增或蛋白过度表达是不良疾病预后的强烈预测。ErbB2-靶向治疗，特别是人源化单克隆抗体曲妥珠单抗与化疗相结合，表现出相当的临床疗效。然而，许多ErbB2-阳性癌症显示出新的耐药性或对该治疗的获得性耐药。因此，存在识别ErbB2的配体并开发至少部分基于该配体的治疗方法这一正在进行且未满足的需求。本公开满足了这些需求。
发明内容
本公开提供了对预防和/或治疗ErbB2-阳性癌症有效的组合物和方法。该组合物和方法涉及氨酰基脯氨酸二肽酶是ErbB2受体的配体这一本发现。此外，本公开被认为是对任何ErbB2配体进行的第一次描述。
氨酰基脯氨酸二肽酶，也称为肽酶D(PEPD)、Xaa-脯氨酸二肽酶、脯氨酸肽酶或亚胺二肽酶，是使羧基端具有脯氨酸或羟基脯氨酸的二肽水解的蛋白酶。PEPD是广泛表达的胞浆蛋白且作为同源二聚体存在(人类PEPD的单体分子量：54kD；如在提供人类氨酰基脯氨酸二肽酶的氨基酸序列的SEQIDNO：1中所示的493氨基酸)。在一些实施方式中，用于本公开的组合物和方法的PEPD是哺乳动物的PEPD。在一个实施方式中，PEPD是人类PEPD。在一些实施方式中，PEPD可以为酶促活性的或具有降低的酶促活性或检测不到的酶活性。
组合物包括含有分离的和/或纯净的PEPD或重组的和/或经过修饰的PEPD的药物制剂，且还可以包括其它试剂，如凝血抑制剂。在一些实施方式中，PEPD是经过修饰的。在一些实施方式中，PEPD是融合蛋白的组分。在一些实施方式中，融合蛋白包括PEPD和对重组产生的PEPD进行纯化有效的氨基酸序列。
该方法包括向需要预防和/治疗ErbB2-阳性癌症的个体给药包括本公开的PEPD的组合物，且还可以包括向该个体给药凝血抑制剂。还提供了用于识别需要用PEPD制剂进行治疗的个体的方法，和用于形成对该个体的治疗方案的方法。
在一些实施方式中，本公开还提供了包括含有分离的和/或纯净的PEPD或重组PEPD的药物制剂的产品，且该产品还可以含有对该制剂用于预防和/或治疗ErbB2-阳性癌症的用途进行描述的印刷材料。在一些实施方式中，该产品还含有凝血抑制剂。在一些非限制性实施方式中，ErbB2-阳性癌症为乳腺癌、卵巢癌、胃癌或侵染性子宫癌，如子宫浆液性子宫内膜癌。在一些实施方式中，ErbB2-阳性癌细胞为过度表达ErbB2的癌细胞或比非癌细胞携带更多拷贝数目的ERBB2基因的癌细胞。在一些实施方式中，ErbB2-阳性癌细胞为比参考(如非癌性的同类型细胞)表达更多ErbB2的细胞。
附图说明
图1.数据显示PEPD结合到ErbB2ECD的亚域3并快速促进ErbB2二聚化。(a)将0.04μM(+)、0.2μM(++)或1μM(+++)的PEPD与ErbB2/ECD-Fc(0.04μM)、ErbB3/ECD-Fc(0.04μM)、ErbB4/ECD-Fc(0.04μM)或Fc(0.04μM)一起孵育，用蛋白G-琼脂糖将其从中沉淀下来，用SDS-PAGE对其进行分离并用进行银染色。(b)用pCMV6-XL5-ERBB2或空白载体对CHO-K1细胞进行转染；24小时后，制备细胞裂解物并通过蛋白质免疫印迹对其进行分析。此处和其它地方将甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作上样对照。(c)采用来自b的裂解物通过ELISA(n＝3)对结合至ErbB2的PEPD进行测量；所有的样品使用等量的裂解物(每个样品25g蛋白)。误差线表示SD。(d)ErbB2及其突变体，所有基因转染采用等量的DNA并持续24小时。通过蛋白质免疫印迹对细胞裂解物进行分析。(e)采用来自d的细胞裂解物和等量的ErbB2或其突变体，通过ELISA(n＝3)对结合至ErbB2及其突变体的PEPD进行测量。误差线表示SD。(f)用PEPD对稳定地过度表达ErbB2的CHO-K1细胞(CHO-K1/ErbB2细胞)进行处理。然后用交联剂双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)(2mM，30min)对PEPD处理过的细胞和对照细胞进行处理。利用ErbB2抗体通过蛋白质免疫印迹对细胞裂解物进行分析。
图2.数据显示由PEPD引发的ErbB2激活和贫化。(a-c)用PEPD或溶剂对细胞进行处理；通过蛋白质免疫印迹对细胞裂解物进行分析。(d)用PEPD(270nM)或没有用PEPD对细胞进行处理，采用4-氨基苯汞酸(APMA)(1mM)作为阳性对照。采用蛋白质免疫印迹对细胞裂解物和培养基进行分析。(e)用PEPD或没有用PEPD对细胞进行处理(2.7nM，6h)，从中分离总RNA用于RT-PCR。将GAPDH用作对照。(f)用PEPD(270nM)或没有用PEPD对细胞进行处理，随后对ErbB2和PEPD进行免疫荧光染色以及共焦显微检查。比例尺：10μm。(g)用泛素(pMT107-His-Ub)对细胞进行转染并在24小时后用PEPD或没有用PEPD对细胞进行处理(2.7nM，0.5h)。将细胞裂解物与ErbB2抗体一起孵育，用蛋白G-琼脂糖将其沉淀下来，并通过蛋白质免疫印迹对其进行分析。
图3.数据显示PEPD直接激活ErbB2，但没有涉及其二肽酶的功能。(a)用ErbB2或突变体(全部由pCMV6-XL5携带)对CHO-K1细胞进行转染并在24小时后用溶剂或PEPD进行处理。通过蛋白质免疫印迹对细胞裂解物进行分析。(b)用ErbB2对CHO-K1细胞进行转染并在24小时后用溶剂、PEPD或其突变体进行处理。图10中提供了有关突变体的其它信息。通过蛋白质免疫印迹对细胞裂解物进行分析。
图4.数据显示缺乏胞内PEPD对ErbB2的影响，但从细胞中释放出了PEPD。(a)用表达人类PEPD(pCMV6-XL5-PEPD)的质粒或空白载体对细胞转染24小时。通过蛋白质免疫印迹对细胞裂解物进行分析。(b)用人类PEPD或空白载体对细胞进行转染；24小时后，对细胞进行洗涤并在新鲜介质(～1×106个细胞/2ml培养基)中在培养24小时，随后收集细胞和培养基。通过蛋白质免疫印迹对细胞裂解物中的PEPD水平进行测量，并通过ELISA(n＝3)对培养基中的PEPD浓度进行测量。误差线表示SD。
图5.数据显示PEPD使ErbB2-Src信号转导沉默。(a、b)用溶剂或PEPD(2.7nM)对细胞进行处理。通过蛋白质免疫印迹对细胞裂解物进行分析。(c)用PEPD(2.7nM，0.5h)或没有用PEPD对细胞进行处理。将细胞裂解物与ErbB2抗体一起孵育，用蛋白G-琼脂糖降其沉淀下来，并通过蛋白质免疫印迹对其进行分析。(d)用PEPD(2.7nM)或没有用PEPD对细胞进行处理且然后对其测量细胞裂解物(n＝3)中的Src激酶活性和PI3K活性。误差线表示SD。(e)用PEPD(2.7nM)或没有用PEPD对细胞进行处理。通过蛋白质免疫印迹对细胞裂解物进行分析。(f)用过钒酸钠对细胞进行处理(30μM，10min)且然后用PEPD(2.7nM，0.5h)或没有用PEPD进行处理。将细胞裂解物与PTEN抗体一起孵育，用蛋白G-琼脂糖将其沉淀下来，并通过蛋白质免疫印迹对其进行分析。(g)用溶剂或PEPD(2.7nM，1h)对细胞进行处理；制备出细胞质部分和细胞膜部分并通过蛋白质免疫印迹对其进行分析。GAPDH和pro-TGFα均用作上样对照。
图6.图表显示了PEPD调节ErbB2的范例，且数据显示了PEPD对过度表达ErbB2的细胞的选择性抑制。(a)单体和酪氨酸-磷酸化二聚体聚均存在于过度表达ErbB2的细胞中。PEPD结合到作为同源二聚体的ErbB2；各个PEPD亚单元结合到一个ErbB2ECD亚域3。PEPD快速地结合到ErbB2二聚体，从而通过引起Src从ErbB2分离而使ErbB2-Src信号转导沉默。PEPD略微缓慢地结合到ErbB2单体但引起ErbB2二聚化和磷酸化，从而导致下游信号转导的激活。PEPD还引起强烈且持久的由PEPD-诱导的ErbB2内化和降解导致的ErbB2贫化。(b)用溶剂或PEPD对生长在6-孔板中的细胞处理48小时且然后通过BrdU掺入对其DNA合成进行测量。(c)用溶剂或PEPD对生长在6-孔板的软琼脂中的细胞处理21天(每3-4天更换培养基)且然后对其菌落形成进行测量。(d)用溶剂或PEPD对生长在侵袭室中的细胞处理48小时；对通过基质胶膜侵入的细胞进行计数。b-d中的误差线表示SD(n＝3)。
图7.数据显示将神经调节蛋白-1(NRG-1)结合到ErbB3和ErbB4的ECD。将0.2μM的NRG-1与Fc(0.04μM)、ErbB3/ECD-Fc(0.04μM)或ErbB4/ECD-Fc(0.04μM)一起孵育，用G-琼脂糖将其沉淀下来，通过SDS-PAGE(15％)将其分离并用进行银染。这表明ErbB3/ECD-Fc和ErbB4/ECD-Fc相对于图1中所示的结果均为生物功能的。
图8.数据显示出对本公开中所使用的细胞株进行的验证，并显示出缺乏PEPD与人类ErbB2的跨膜域和胞内域的结合。(a)用ErbB2-过度表达的质粒(pCMV6-XL5-ERBB2)或空白质粒对CHO-K1细胞瞬时转染24小时。不对人类膀胱癌RT-4细胞和人类乳腺癌MCF-7细胞进行处理并将其用作ErbB1、ErbB3和ErbB4的阳性对照。通过蛋白质免疫印迹对细胞裂解物进行分析。GAPDH为上样对照。(b)用1mMAPMA对稳定表达ErbB2的CHO-K1细胞(HO-K1/ErbB2细胞)处理0.25小时。然后制备出细胞裂解物并通过蛋白质免疫印迹对细胞裂解物进行分析(右边第一泳道)。将相同的细胞裂解物与1μMPEPD混合，然后将其与PEPD抗体或同型-匹配的IgG一起孵育，用蛋白G-琼脂糖将其沉淀下来，并通过蛋白质免疫印迹对其进行分析。结果显示出APMA不出所料地引起ErbB2ECD裂解，从而产生p95片段(负型ECD)，但是PEPD仅与完整的ErbB2共沉淀，而不与p95片段共同沉淀，这表明PEPD没有结合到ErbB2的跨膜域或胞内域。
图9.表皮生长因子和NRG-1对ErbB2没有影响。(a、b)用重组EGF或重组NRG-1对稳定过度表达人类ErbB2的CHO-K1细胞(CHO-K1/ErbB2细胞)进行处理。然后制备出细胞裂解物并通过蛋白质免疫印迹对其进行分析。(c、d)为了确保我们的实验中所使用的EGF(ErbB1的配体)和NRG-1(ErbB3和ErbB4的配体)均为生物活性的，在表达相对低水平的ErbB1和ErbB3的BT-474细胞中对它们进行评估。不出所料，EGF显著刺激了ErbB1的磷酸化，且NRG-1显著刺激了ErbB3的磷酸化。
图10.数据显示人类PEPD及其突变体的构型。(a)野生型人类PEPD和氨基酸(aa)变成其突变体。(b)在细菌中产生重组野生型人类PEPD及其突变体，采用镍亲和层析对其进行纯化并通过非还原SDS-PAGE和银染对其进行分析。注意：在各泳道间上样不同的蛋白。在由“WT-PEPD+βME”指示的泳道中，在进行非还原凝胶电泳之前将野生型PEPD与PBS中10％的β-巯基乙醇进行孵育。
图11.数据显示细胞中的ErbB2分布。由稳定过度表达ErbB2的CHO-K1细胞(CHO-K1/ErbB2细胞)或用ErbB2(pCMV6-XL5-ERBB2)瞬时转染24小时的CHO-K1细胞制备出细胞膜部分和裂解负膜，并通过蛋白质免疫印迹对其进行分析。将GAPDH和pro-TGF-α用作上样对照。值得注意的是，在上述实验中(参见图3)，PEPD或其G278D突变体并没有引起ErbB2蛋白水平的降低，而PEPD引起稳定或组成性过度表达ErbB2的细胞(参见图2a和2c)中显著的ErbB2贫化。我们发现，如本文所示在瞬时过度表达ErbB2的CHO-K1细胞中大多数ErbB2分子存在于细胞内，而在稳定过度表达ErbB2的CHO-K1细胞中大多数ErbB2分子在细胞表面表达，。这解释了为什么PEPD处理3小时没有在瞬时过度表达ErbB2的细胞中引起明显的ErbB2蛋白减少(参见图3)。
图12.数据显示出CHO-K1细胞中由PEPD诱导的ERK磷酸化取决于ErbB2。用野生型人类ErbB2或激酶失活突变体(ErbB2/K753M)对CHO-K1细胞瞬时转染24小时且然后用PEPD或溶剂进行处理，随后进行蛋白质免疫印迹。
图13.数据显示了PEPD、G278D-PEPD和曲妥珠单抗对具有或不具有ErbB2过度表达的细胞的生长抑制作用。使细胞在96-孔板(每孔500个CHO-K1细胞或CHO-K1/ErbB2细胞，或者每孔2,000个BT-474细胞；每孔150μl培养基)中过夜生长，然后每孔用200μl培养基溶剂、溶解在200μl培养基中的PEPD、G278D-PEPD或曲妥珠单抗处理72小时，随后在37℃下用甲基噻唑二苯基-四唑溴盐(MTT)(溶解在培养基中9.2mM)孵育3小时。除去培养基后，用二甲基亚砜(每孔150μl)对细胞进行处理，并通过在570nm对由MTT形成的甲瓒进行分光光度测量(n＝3)来确定细胞密度。误差线表示SD。
图14.数据显示凝血抑制剂对PEPD的血浆水平的影响。(a)通过以0.2mg/kg体重或10mg/kg腹腔内注射的方式对小鼠给药重组人类PEPD；给药PEPD后1、6或24小时将小鼠处死，并通过ELISA测量PEPD的血浆水平以及对照小鼠中的PEPD的血浆水平。(b)通过以2.5mg/kg每天一次腹腔内注射的方式对小鼠给药伊诺肝素(EP，一种凝血抑制剂)；在第四次EP给药后1小时，通过以0.2mg/kg腹腔内注射的方式对小鼠给药PEPD；给药PEPD后1或24小时将小鼠处死，并通过ELISA测量血浆PEPD的水平以及对照小鼠中血浆PEPD的水平。各个值为平均值+SD。结果显示EP有助于使血浆PEPD水平升高至少50倍。
图15.数据显示PEPD和凝血抑制剂EP在体内的作用。将CHO-K1/ErbB2细胞以每个位点少量PBS：基质胶混合物中的1×106个细胞皮下接种至雌性无朐腺裸鼠(6-7周龄)的胁腹。细胞接种后的4天起始，以腹腔内注射的方式每天给予小鼠2.5mg/kg的溶剂或伊诺肝素(EP)一次。EP处理3天后(细胞接种后第7天)，当肿瘤体积达到约41mm3时，以腹腔内注射的方式用0.02mg/kg或0.2mg/kg的PEPD对EP处理过的小鼠的小组进行处理，每周对该小组给药三次(星期一、星期三、星期五)。在均给予EP和PEPD的日子里，在给予EP后1小时给予PEPD。每周对肿瘤体积测量三次(星期一、星期三、星期五)。在最后一次处理后24小时(细胞接种后第24天，且一共8次PEPD处理)将小鼠处死，并收集小鼠的血液样品用于通过ELISA试验对PEPD的血浆水平进行测量。(a)各个值为平均值±SEM(n＝8至11)。(b)各个值为平均值±SD(n＝3)。PEPD强烈地抑制了肿瘤生长但是EP对其没有影响。
图16.数据显示PEPD和凝血抑制剂EP在体内的作用。将CHO-K1细胞以每个位点少量PBS：基质胶混合物中的1×106个细胞皮下接种至雌性无朐腺裸鼠(6-7周龄)的胁腹。细胞接种后的4天起始，以腹腔内注射的方式每天给予小鼠2.5mg/kg的EP一次。3天后(细胞接种后第7天)，当肿瘤体积达到约26mm3时，以腹腔内注射的方式用溶剂或0.2mg/kgPEPD对小鼠进行处理，每周对小鼠给药三次(星期一、星期三、星期五)。在均给予EP和PEPD/溶剂的日子里，在给予EP后1小时给予PEPD/溶剂。每周对肿瘤体积测量三次(星期一、星期三、星期五)。在细胞接种后第21天给予最后一次处理后24小时将小鼠处死(一共7次PEPD处理)，并收集小鼠的血液样品用于测量PEPD的血浆水平。(a)各个值为平均值±SEM(n＝8至11)。(b)各个值为平均值+SD(n＝3)。这表明PEPD不靶向没有ErbB2过度表达的肿瘤。值得注意的是，如图8a所示这些肿瘤细胞不表达ErbB1、ErbB3或ErbB4。
图17.数据显示原位乳腺肿瘤被PEPD强烈抑制但是该肿瘤被酶促失活的PEPD(PEPDG278D)更加强烈地抑制。在将乳腺癌BT-474细胞原位接种到乳腺脂肪垫中之前(每个位点少量PBS：基质胶混合物中的1x106个细胞)，将60天释放的17β-雌二醇片(1.7mg的雌二醇)皮下(背部)植入每只雌性无朐腺裸鼠(6-7周龄)。(a)绘制肿瘤大小相对于生长天数的曲线。每天通过腹腔内注射给予EP(0.5mg/kg)。值得注意的是，这种剂量的EP在提高PEPD的血浆水平方面与2.5mg/kg同样有效。EP给药通常比PEPD或PEPDG278D早四天开始。每周给药PEPD或PEPDG278D三次(星期一、星期三、星期五)，每次以2mg/kg通过腹腔内注射进行。各个值为平均值±SEM。(b)图表显示在组a中所示的图表的第58天就EP、PEPD和PEPDG278D处理的血浆PEPD；各个值为平均值+SD。
图18.为了对PEPD-Fc与PEPD对ErbB2和下游信号转导的影响进行比较，用溶剂、PEPD-Fc(27nM)或PEPD(27nM)对CHO-K1/ErbB2细胞处理3或6小时，随后进行蛋白质免疫印迹分析。我们采用标准的重组技术制备出人类PEPD-人类Fc杂合体(Fc框连接到PEPD的羧基端)。
图19.数据汇总了通过rhPEPD或rhPEPDG278D处理的肿瘤中的肿瘤抑制和分子变化。rhPEPD或rhPEPDG278D与上述PEPD或PEPDG278D或G278D-PEPD是一样的。图17中所示的多个实验组中的肿瘤对于分子分析来说太小了。(a)当用溶剂、EP、EP加上rhPEPD或EP加上rhPEPDG278D进行处理时，来源于乳腺脂肪垫BT-474细胞异种移植的肿瘤的大小。EP：在给药rhPDPD或rhPEPDG278D之前4天起始，每天按照每千克体重0.5mg进行腹腔内给药。rhPEPD或rhPEPDG278D：每千克体重2mg进行腹膜内给药，只是两次给药中间间隔两天。误差线为s.e.m.(n＝3至6)。(b)对如a中所述最后一次给药后24小时获得的肿瘤试样中的主要的细胞信号转导变化进行免疫印迹比较。每个样品代表一种肿瘤。(c、d)如a中所述最后一次给药后24小时获得的肿瘤试样中的SRC激酶活性和PI3K活性。误差线为s.d.(n＝3)。(e)对如a中所述最后一次给药后24小时获得的肿瘤试样中的HIF-1α信号转导变化进行免疫印迹比较。每个样品代表一种肿瘤。由于HIF-1α和相关因子(血管内皮生长因子[VEGF]和葡萄糖转运蛋白1[GLUT-1])为促存活因子，结果至少部分地解释了为什么rhPEPDG278D是比rhPEPD更强大的抗肿瘤剂。认为rhPEPD对这些促存活因子的刺激性影响取决于其二肽酶活性。rhPEPD和rhPEPDG278D均被肿瘤细胞显然地通过ErbB2而内化(通过它们的His标签进行测量，图19e)。
具体实施方式
本公开至少部分基于我们发现的PEPD是ErbB2受体的配体以及其可以用于抑制ErbB2-阳性癌症的生长。特别地，且不希望受任何特定理论的约束，我们在本公开中证明了PEPD为结合到ErbB2胞外域的亚域3的ErbB2配体。PEPD结合到作为同源二聚体的ErbB2，其中各个亚单元明显地结合到一个ErbB2单体。当PEPD结合到已有的ErbB2二聚体时，其使ErbB2-Src/CK2-PTEN-AKT信号传导体系迅速沉默。PEPD还结合到ErbB2单体，从而引起ErbB2二聚化和酪氨酸磷酸化。然而，由PEPD激活ErbB2显然是微不足道的，因为PEPD快速引起归因于ErbB2内化和降解的ErbB2极大贫化，且PEPD选择性地抑制了过度表达ErbB2的细胞的生长。从本文中呈现的数据，还认为只有当PEPD存在于胞外空间时侵袭ErbB2且并不涉及其酶促活性。因此，本公开包含但不限于PEPD为ErbB2受体的配体但抑制ErbB2信号转导这一启示；PEPD的酶活性不参与ErbB2靶向；只有当PEPD存在于胞外空间时才作用于ErbB2；且PEPD选择性抑制了过度表达ErbB2的细胞。本文中呈现的数据表明PEPD及其酶促失活的衍生物在临床相关的动物模型中具有有效的抗Erb2阳性癌症效果。特别地，本文中呈现的数据表明PEPD及其酶促失活的变异体特异性地靶向过度表达ErbB2的肿瘤，且对Erb2阳性肿瘤的抑制在原位乳腺肿瘤模型得以证实。此外，本文中呈现的数据表明本公开的组合物和方法在停止用PEPD制剂进行治疗后在防止至少某些Erb2阳性肿瘤复发方面是有效的。
基因库中登记号NM_004448.2提供了ErbB2的氨基酸序列。而ErbB2的变异体在本领域中是已知的，预计本公开的方法可以以任何ErbB2变异体发挥功能，因为erbB2变异体具有胞外域。胞外域在本领域中是已知的且包括上面提到的基因库登记号中的氨基酸一级结构中的氨基酸号码23-652。
更详细地，从本公开及本文中呈现的实施例来看，显然PEPD对ErbB2信号转导的影响代表新型的配体-诱导的ErbB2信号转导以及新的PEPD功能。图6描述了这种关系的非限制性图形说明，不希望受理论的约束，其证明了PEPD对过度表达ErbB2的细胞的选择性抑制如何呈现出PEPD对人类的ErbB2-阳性乳腺癌和其它癌症的治疗效用。
PEPD是相对高亲和性的配体(Kd＝7.3nM，图1c)，并对ErbB2信号转导显示出强大的影响。PEPD结合到ErbB2ECD中的亚域3，尽管参与结合的确切残基仍然是不明确的。虽然先前表明ErbB2ECD采用类似于配体激活状态的固定构象，从而使其在没有直接配体结合时做好同源或异源二聚体化的准备(CHOHS等人，Nature2003，421(6924)：756-760)，本公开表明这种模型是不完善的。PEPD导致两步ErbB2信令转导停止。在PEPD处理的几分钟内，ErbB2-Src-CK2的预组装信号转导复合物被破坏。Src和CK2均从ErbB2脱离并失活，从而导致下游信号改变：PTEN去磷酸化并迁移到细胞膜，以及AKT去磷酸化(可能是由于PIP3通过PTEN去磷酸化)。然而，PEPD对显然通过ErbB3与ErbB2关联的PI3K没有影响。然而，体内肿瘤组织中，PEPD以及PEPDc278D显然通过破坏ErbB2-ErbB3结合体而使ErbB3和PI3K沉默(图19)，由于较短的PEPD处理时间在我们的体外研究中没有检测到ErbB2-ErbB3结合体。由于PEPD在没有明显ErbB2贫化的情况下对Src和CK2的产生影响，结合到ErbB2二聚体的PEPD可能引起ErbB2二聚体的构象改变，使它不能保持Src。PEPD还结合至ErbB2单体，从而导致稍微缓慢发生的ErbB2二聚化和激活，因为PEPD处理3h后检测到ErbB2和ERK的最高磷酸化水平。然而，PEPD-诱导的ErbB2激活可能在功能上不重要，因为PEPD还引起ErbB2的极大且持续的贫化，其在PEPD处理1至3小时后变得明显并在6小时处达到最大贫化，其持续至少72小时。PEPD能够引起几乎完全的ErbB2贫化(图2c)。PEPD-诱导的ErbB2贫化似乎完全由ErbB2内化和降解引起，因为PEPD对ErbB2ECD裂解没有影响，其也不调节ErbB2基因表达。因此，本公开揭示了PEPD的一个完全不同且新的功能。PEPD一直被称为胞浆二肽酶。我们现在认识到，PEPD不仅是ErbB2的配体，而且丧失其99.4％的二肽酶活性的PEPD突变体和野生型蛋白一样有效。此外，在体内，PEPD突变体在防治ErbB2-驱动的肿瘤方面比PEPD自身更有效(图17)。胞内PEPD对ErbB2没有影响，但是如在本公开中所揭示的PEPD是从细胞中释放的，且更多的PEPD是从受损的组织和细胞中释放的。
预期包括PEPD的组合物对预防和/或治疗人类ErbB2-阳性乳腺癌和其它癌症是有用的。与其使得在ErbB2-驱动的乳腺癌方面发挥重要作用的ErbB2-Src/CK2-PTEN-AKT信号转导通路迅速沉默并引起ErbB2极大且持续贫化的能力相一致，我们表明PEPD显著抑制了过度表达ErbB2的细胞的增殖、锚定非依赖性菌落形成和侵袭/迁移，而对具有最低ErbB2表达的细胞的影响不大，且如以上和以下更详细地描述，我们采用具有ERB2阳性肿瘤的临床相关的动物模型证明了PEPD及其酶促失活衍生物的抗癌效果。PEPD对ErbB2的抑制性影响与已知的其它ErbB配体对它们的受体的刺激性影响形成了鲜明对比。PEPD对ErbB2信号转导和过度表达ErbB2的细胞的影响让人想起了曲妥珠单抗。鉴于曲妥珠单抗在临床上使用的高成本(目前的成本是每剂量＞1,000美元，且全部疗程约70,000美元)，PEPD具有如下文进一步描述的可以以相对低的成本对其进行大规模生产这一优点，且因此在某些实施方式中预计PEPD会成为重要且更便宜的曲妥珠单抗的替代物。在体内，曲妥珠单抗在癌组织中既不下调ErbB2的表达也不抑制ErbB2酪氨酸的磷酸化(Gennari等人，ClinCancerRes，10，5650-5655，2004；Giisen等人，PLoSBiol，8，e1000563，2010)；更确切地说，其抗肿瘤活性主要取决于通过其Fc域的抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)(Barok等人，MolCancerTher，6，2065-2072，2007；Clynes等人，NatureMed，6，443-446，2000)。因此，PEPD或其突变体可以对曲妥珠单抗进行补充并在一定程度上克服患者体内对曲妥珠单抗的耐药性。
预计任何PEPD均适合用于本公开的组合物和方法。在一些实施方式中，该PEPD是由原核生物或真核生物产生的PEPD。在一些实施方式中，该PEPD起源于原核生物。在非限制性实施方式中，该PEPD由假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)(即包括基因库登记号AAA99824.1的氨基酸序列的PEPD)或激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)(即包括基因库登记号WP_011011876.1的氨基酸序列的PEPD)产生。许多真核PEPD氨基酸序列在本领域中也是已知的，包含许多哺乳动物的PEPD氨基酸序列。在一些实施方式中，PEPD具有啮齿类动物(即小鼠或大鼠)的PEPD序列或非人类灵长类动物(如黑猩猩和猕猴)的PEPD序列。基因库登记号NP_032846.2提供了小鼠的氨酰基脯氨酸二肽酶的氨基酸序列；NP_001009641.1提供了大鼠的氨酰基脯氨酸二肽酶的氨基酸序列；AFJ71215.1提供了猕猴的氨酰基脯氨酸二肽酶的氨基酸序列；NP_001267459.1提供了黑猩猩的氨酰基脯氨酸二肽酶的氨基酸序列。SEQIDNO：1中的人类的氨酰基脯氨酸二肽酶(PEPD)的氨基酸序列在本领域中是已知的。通过基因库登记号J04605.1可以获得SEQIDNO：1和cDNA编码序列；基因库登记号AAA60064也提供了氨基酸序列。在一个说明性但非限制性实施方式中，酶促激活人类PEPD具有SEQIDNO：1的序列：
MAAATGPSFWLGNETLKVPLALFALNRQRLCERLRKNPAVQAGSIVVLQGGEETQRYCTDTGVLFLQESFFHWAFGVTEPGCYGVIDVDTGKSTLFVPRLPASHATWMGKIHSKEHFKEKYAVDDVQYVDEIASVLTSQKPSVLLTLRGVNTDSGSVCREASFDGISKFEVNNTILHPEIVESRVFKTDMELEVLRYTNKISSEAHREVMKAVKVGMKEYGLESLFEHYCYSRGGMRHSSYTCICGSGENSAVLHYGHAGAPNDRTIQNGDMCLFDMGGEYYSVASDITCSFPRNGKFTADQKAVYEAVLLSSRAVMGAMKPGDWWPDIDRLADRIHLEELAHMGILSGSVDAMVQAHLGAVFMPHGLGHFLGIDVHDVGGYPEGVERIDEPGLRSLRTARHLQPGMVLTVEPGIYFIDHLLDEALADPARASFLNREVLQRFRGFGGVRIEEDVVVIDSGIELLTCVPRTVEEIEACMAGCDKAFTPFSGPK(SEQIDNO：1)
在SEQIDNO：1中，278位点处的G是阴影的，粗体的和斜体的并代表使PEPD酶促失活的G278D突变体的位置。在一些实施方式中，突变是278位点处的甘氨酸向除天冬氨酸以外的氨基酸的变化。
本公开中所引用的基因库登记号所提供的所有的氨基酸和多核苷酸序列通过引用并入本文，因为在本申请的申请日通过基因库可以获得这些序列。本公开还包含本文中所描述的所有编码PEPD的多核苷酸及其所有变异体或鉴于本公开的权益对技术人员来说将是已知的那些。
啮齿类动物(小鼠和大鼠)的PEPD氨基酸序列的86％以上与人类的序列相似，而非人类的灵长类动物(如猕猴)的PPED氨基酸序列超过95％与人类的PEPD氨基酸序列类似。在一些实施方式中，PEPD包括人类氨基酸序列或由人类氨基酸序列组成。在一些实施方式中，本公开的组合物/或方法中所用的PEPD介于至少85.0％和99.9％之间(包含85.0％和99.9％，并包含其间至小数点后第一位的所有数字)与SEQIDNO：1的序列相似。在一个实施方式中，PEPD包括与SEQIDNO：1的序列至少95％相似的氨基酸序列。
在多个实施方式中，本公开包含包括野生型PEPD(诸如SEQIDNO：1的PEPD)或经过修饰的PEPD或其组合的组合物。一般来说，鉴于本说明的权益，本领域技术人员采用普通技术可以确定适合用于本发明的对PEPD的修饰。在一些实施方式中，经过修饰的PEPD包括SEQIDNO：1的修饰。本公开包含SEQIDNO：1的所有修饰，只要PEPD保持结合至ErbB2并引起从细胞表面贫化ErbB2的能力。在一些实施方式中，经过修饰的PEPD保留了形成同源二聚体的能力。在一些实施方式中，使ErbB2-阳性细胞与本公开的经过修饰的(或野生型)PEPD接触，随后结合ErbB2并内吞ErbB2，从而导致ErbB2贫化。保持一些或所有这些功能属性的经过修饰的PEPD可以包括氨基酸的插入、缺失和替换。例如，本公开包含通常基于R-基团取代基的相对相似性而已经被保守氨基酸取代基修饰的PEPD。这些取代基的非限制性示例包括：取代丙氨酸的甘氨酸或丝氨酸；取代精氨酸的赖氨酸；取代天冬氨酸的谷氨酰胺或组氨酸；取代丙氨酸的甘氨酸或丝氨酸；取代精氨酸的赖氨酸；取代天冬酰胺的谷氨酰胺或组氨酸；取代天冬氨酸的谷氨酸；取代半胱氨酸的丝氨酸；取代谷氨酰胺的天冬酰胺；取代谷氨酸的天冬氨酸；取代甘氨酸的丙氨酸；取代组氨酸的天冬酰胺或谷氨酰胺；取代异亮氨酸的亮氨酸或缬氨酸；取代亮氨酸的异亮氨酸或缬氨酸；取代赖氨酸的精氨酸；取代蛋氨酸的亮氨酸或酪氨酸；取代丝氨酸的苏氨酸；取代色氨酸的酪氨酸；取代酪氨酸的苯丙氨酸；以及取代缬氨酸的异亮氨酸或亮氨酸。因此，包括任何单一保守氨基酸取代基或任何保守氨基酸取代基的组合的PEPD包含于本公开中，只要它们能够至少保留结合至ErbB2并且随后从细胞表面贫化ErbB2的能力。本领域技术人员应当理解的是如何确定任何特定经过修饰的PEPD是否能够结合至ErbB2。在一些实施方式中，如采用ELISA试验所确定的，经过修饰的PEPD能够结合预计Kd值为7.3nM的ErbB2胞外域。
野生型PEPD为酶促激活态的。经过修饰的PEPD为包含SEQIDNO：1中的变化且可以为酶促激活态或酶促失活态的PEPD。在这点上，本领域已知的是，PEPD的亚氨基二肽酶活性方面的缺陷与脯氨酸肽酶缺乏症有关，脯氨酸肽酶缺乏症为与胶原代谢有关的非常罕见的常染色体隐性遗传病且影响结蹄组织。因此，已知的是PEPD的酶促活性很重要。然而，在一些实施方式中，将酶促失活态的PEPD用于本公开的组合物和方法中。酶促失活态的PEPD被认为是呈现出比包含SEQIDNO：1的序列或由SEQIDNO：1的序列组成的参考蛋白所呈现的水解作用的量要少的羧基端具有脯氨酸或羟基脯氨酸的底物二肽的水解作用的PEPD。在一些实施方式中，酶促失活的PEPD可以具有比参考PEPD少至少介于0.0％至99.9％之间(包含0.0％和99.9％，并包含其间至小数点后第一位的所有数字)的二肽水解活性。在一个实施方式中，酶促失活态的PEPD具有不超过0.6％的参考PEPD的二肽水解活性。在一个实施方式中，参考PEPD包含SEQIDNO：1的序列或由SEQIDNO：1的序列组成。可以将一个单位的氨酰基脯氨酸二肽酶活性定义为在标准试验条件下1小时释放1μmol脯氨酸的酶的量。在一个实施方式中，酶促失活态的PEPD具有可不检测的PEPD二肽水解活性。在一个实施方式中，酶促失活态的PEPD包含G278D突变体。在一些实施方式中，本公开包含本文所公开的PEPD突变体的任何一种或任意组合，并因此包含可以排除在发明外的这些突变体的任何单个或任何组合的条件。
本公开的实施方式中所使用的PEPD可以包含增强其所需特性(如结合至或进入肿瘤细胞或肿瘤微环境的能力，或提高循环时间、生物利用度、稳定性的能力，或与ErbB2-阳性细胞的靶向杀伤相关的用途，或ErbB2-阳性细胞成像)的修饰。可以用于本公开的PEPD蛋白包含包括SEQIDNO：1或其修饰的多肽，且在一些实施方式中，还包含具有较高级多肽的这些PEPD多肽。对SEQIDNO：1的修饰包括废除或降低酶活性的修饰，和/或不影响经过修饰的PEPD结合至ErbB2的能力的改变。因此，可以通过通常基于R-基团取代基的相对相似性的保守氨基酸取代基对SEQIDNO：1的PEPD进行修饰。这些预期的取代基的非限制性示例包括但不限于：取代丙氨酸的甘氨酸或丝氨酸；取代精氨酸的赖氨酸；取代天冬酰胺的谷氨酰胺或组氨酸；取代天冬氨酸的谷氨酸；取代半胱氨酸的丝氨酸；取代谷氨酰胺的天冬酰胺；取代谷氨酸的天冬氨酸；取代甘氨酸的丙氨酸；取代组氨酸的天冬酰胺或谷氨酰胺；取代异亮氨酸的亮氨酸或缬氨酸；取代亮氨酸的异亮氨酸或缬氨酸；取代赖氨酸的精氨酸；取代蛋氨酸的亮氨酸或酪氨酸；取代丝氨酸的苏氨酸；取代色氨酸的酪氨酸；取代酪氨酸的苯丙氨酸；以及取代缬氨酸的异亮氨酸或亮氨酸。因此，本公开包含包括任何单一保守氨基酸取代基或保守氨基酸取代基的任何组合的PEPD，只要它们保留了它们的ErbB2-结合性质，并能够抑制ErbB2-阳性细胞的生长。因此，本公开包含包括SEQIDNO：1或其修饰的多肽序列，并可以包含其它修饰，该其它修饰包含但不必限于其它的氨基酸，和/或与物质的其它组合物的复合物的一部分的形式提供的修饰。因此，PEPD多肽可以为较大蛋白质(如融合蛋白)的一部分，或者它们可以连接到其它部分。因此，PEPD蛋白可以与预计会提高它们的与预防和/或治疗ErbB2-阳性癌症有关的功能性能力的任何需要的部分共价或非共价地联合。
通常，采用常规技术可以制备PEPD蛋白(如果需要多肽序列，将PEPD蛋白与该多肽序列制成单一融合蛋白)。例如，在一些实施方式中，采用原核或真核表达体系可以制备PEPD蛋白/融合蛋白。因此，本公开提供了超过其他ErbB2结合配偶体(如制备针对ErbB2的mAbs是昂贵且费时的)的制造优势。对于包含如本文中所述PEPD或由如本文中所述PEPD组成的蛋白的重组产物，通常在表达载体中可以提供任何编码PEPD的多核苷酸。“表达载体”是指包括有效连接至PEPD编码序列的蛋白表达对照序列的载体。根据所选的表达体系，表达载体可以包含用于表达的顺式作用元件，顺式作用元件包含但不限于启动子元件、增强子元件、复制起点、选择性标记、转录起始位点、编码转录起始位点的序列，和对于蛋白表达来说所需的任何其它序列。可以设计用于表达编码PEPD的任何多核苷酸序列(其中各个PEPD-编码序列包含于本公开中)的合适的蛋白表达载体包含所有本领域已知的那些，其示例包含但不限于粘粒、质粒和掺入了编码PEPD的重组多核苷酸的基于病毒的体系。用于表达本发明的重组PEPD蛋白的体系可以为任何合适的有机体且包含但不限于哺乳动物细胞表达体系、昆虫细胞表达体系(诸如基于杆状病毒的体系)、酵母表达体系、植物细胞表达体系和原核生物表达体系。在一个实施方式中，将大肠杆菌用于PEPD表达。在一个实施方式中，采用哺乳动物表达体系重组表达PEPD嵌合蛋白以使嵌合蛋白包含人类特异性糖基化。
在一个实施方式中，可以将PEPD蛋白结合至免疫球蛋白(Ig)或其片段以提供嵌合的PEPD/Ig分子。预计这样的构建体在涉及个体的免疫反应的各个方面是有效的以促进ErbB2阳性细胞的靶向杀伤。免疫球蛋白或其片段可以为任何Ig类型或亚型。在这一点上，以前的研究已经表明，抗体依赖性细胞毒性(通过Fc受体介导的)在曲妥珠单抗靶向的ErbB2-阳性乳腺癌中发挥着至关重要的作用(Clynes等人，NatureMed，6，443-446，2000；Spiridon等人，ClinCancerRes，10，3542-3551，2004)。本公开同样包含PEPD-Fc嵌合蛋白和包含它们的药物组合物。用于制备Fc嵌合蛋白的方法在本领域中是已知的。例如，从InvivoGene市售可得的pFUSE-Fc载体可以用于产生PEPD-Fc融合杂合体。因此，在一个实施方式中，本公开包含包括融合蛋白的组合物，其中PEPD是该融合蛋白的组分，且其中该融合蛋白包含人类Ig的Fc区域。在多个实施方式中，Fc区域为来自IgA、IgG或IgE抗体的Fc区域或其片段，还可以使用尽管来自其它抗体类型的Fc区域，或合成的/人造的Fc区域。在一些实施方式中，Fc区域为人类IgG2a或人类IgG1或这些Fc区域的片段。Fc区域可以包含与由哺乳动物(如人类)产生的Fc区域相同的氨基酸序列或由与由哺乳动物(如人类)产生的Fc区域相同的氨基酸序列组成。在多个实施方式中，Fc区域可以具有在80％至100％(包含其间的所有整数)之间相似于由小鼠和/或人类产生的Fc区域的氨基酸序列。Fc区域可以为完整的Fc区域，意思是整个Fc区域，或可以为Fc区域的片段。本领域技术人员可以认识到的是，抗体的“Fc区域”是指抗体的“可结晶的片段”区域，其包含根据抗体的种类贡献两个或三个恒定域(CD)的两条重链。编码Fc区域的核苷酸序列以及针对小鼠或人类免疫球蛋白的Fc区域的氨基酸序列在本领域中是公知的。在一个实施方式中，融合蛋白的Fc部分仅包含抗体重链。本领域技术人员可以认识到的是，为了说明本发明，采用鼠科动物模型，融合蛋白的Fc部分可以为IgG2a或IgG2bFc鼠科动物Ig部分，而对于治疗和/或预防人类中的疾病，Fc部分优选地为IgG1或IgG3Fc部分。在某些实施方式中，本文中提供的融合蛋白的Fc部分不包含抗原识别部分(即融合蛋白的抗体部分不含有抗体可变区域)。因此，融合蛋白不同于确实含有抗原结合部分的抗体。采用本领域技术人员所公知的任何常规技术可以制备编码Fc-融合PEPD蛋白的DNA构建体。例如，采用市售可得的试剂可以制备Fc-融合编码构建体。比如，INVIVOGEN提供了通过将编码给定蛋白的序列融合到免疫球蛋白(Ig)的Fc区域而开发的用以有助于构建Fc-融合蛋白的pFUSE-Fc家族的质粒。在这种构建体中，Fc区域包含IgG重链的CH2域和CH3域以及铰链区。铰链被用作Fc-融合蛋白的两个部分之间的柔性间隔基，如果需要其允许融合蛋白的各个部分独立地发挥作用。
如上所述，本公开包含作为融合蛋白的组分的任意PEPD蛋白，该融合蛋白可以包含与PEPD蛋白相同的开放阅读框中表达所需要的任何其它氨基酸序列，且可以包含但不限于参与促进蛋白分离和/或纯化的氨基酸序列、以用于溶解度、分泌或任何其它功能。可以将PEPD多肽配置成N-末端或C-末端至融合的开放阅读框，这取决于要生产的特定融合蛋白。例如，PEPD蛋白可以具有组氨酸标记，如合适的多组氨酸标记。在一些实施方式中，组氨酸标记包括序列中至少6个组氨酸。在一个实施方式中，组氨酸标记为六-组氨酸肽序列。在一个实施方式中，如果需要，可以对PEPD表达体系进行配置以可以除去组氨酸标记，如通过包含烟草蚀纹病毒(TEV)-可裂解的、N-末端六-组氨酸标记。
在非限制性实施方式中，可以将PEPD多肽与化疗剂或具有细胞毒性的任何其它试剂或对于ErbB2-阳性细胞/组织的探测和成像有用的试剂结合，或者可以将PEPD多肽连接至化疗剂或具有细胞毒性的任何其它试剂或对于ErbB2-阳性细胞/组织的探测和成像有用的试剂。例如，PEPD结合物可以包含酶促激活态毒素及其片段或小分子。合适的酶促激活态毒素和小分子包含但不限于多西紫杉醇、米托蒽醌、紫杉烷类、白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、香石竹素蛋白、商陆美洲蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯类、微管靶向剂或任何抗血管生成剂。
可以采用任何合适的技术制备PEPD蛋白和化疗剂(或其它试剂，如显像剂)的结合物或组合物。在多个实施方式中，可以与化疗剂分开单独生产PEPD蛋白，然后将PEPD蛋白以化学方法连接至化疗剂分，或者在蛋白剂的情况下，可以将PEPD蛋白生产为PEPD/蛋白融合物以产生新的嵌合蛋白。对于化学耦合，可以使用多种双功能蛋白偶联剂以共价地连接PEPD和化疗剂或其它试剂(如显像剂)，双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如二甲基己二酰亚胺HCL)、活性酯(如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物类(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2，6-甲苯二异氰酸酯)和双活性氟化合物类(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。
在另一个实施方式中，可以将PEPD结合至放射性试剂。多种放射性同位素可用于结合至蛋白质以使PEPD结合至的ErbB2-阳性细胞或组织可以被成像或被选择性地破坏。对于选择性破坏的细胞，可以将肽类结合至高度放射性原子，如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。为了识别ErbB2-阳性细胞，PEPD结合物可以包含用于核素研究的放射性原子(例如Tc99m(亚稳锝-99)、I123)或用于核磁共振和/或核磁成像的自旋标记，如I123、I131、In111、F19、C13、N15、O17或钆(III)或锰(II)。可以以已知的方法将放射标签合并到PEPD蛋白中。
通过将PEPD蛋白与任何合适的药学可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂结合可以在用于给药的药物组合物中提供PEPD蛋白。Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy(2005)第21版，Philadelphia，PA.LippincottWilliams&Wilkins中可以发现一些合适的药学可接受的载体、赋形剂和稳定剂的示例。此外，本公开中可以使用任何合适的输送载体，如在一段时间内将PEPD释放的控释递送载体。如果需要，药物组合物可以既包含PEPD又包含凝血抑制剂。
可以采用任何合适的给药路径给药如本文中所述的包含PEPD的制剂，给药路径包含但不限于肠胃外、腹腔内、肺内、口服、和肿瘤内。肠胃外输注包括肌内给药、静脉内给药、动脉内给药、腹腔内给药、和皮下给药。
鉴于本公开的权益，本领域技术人员可以确定包含于组合物中和/或用于方法中的PEPD和任何其它活性剂的量。因此，在一个实施方式中，给药有效量的本发明的组合物。有效量可以为抑制个体中表达ErbB2的细胞的生长的组合物的量，或延长个体存活的量，或减轻与个体中ErbB2的表达有关的疾病症状的量，或抑制过度表达ErbB2的细胞的恶性表型的量。在一些实施方式中，给药本发明的组合物的个体患有ErbB2-阳性癌症，被怀疑患有ErbB2-阳性癌症，或具有发展为ErbB2-阳性癌症或ErbB2-阳性癌症复发的危险。在一些实施方式中，ErbB2-阳性癌症为乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、或侵袭形式的子宫癌(如子宫浆液性子宫内膜癌)、或过度表达ErbB2的其它癌症、或其干细胞过度表达ErbB2的癌症或过度表达ErbB2的转移性癌症。
本领域技术人员可以确定用于治疗或预防目的的合适剂量并至少部分地基于对个体的年龄、性别、大小和健康状况，所用输送系统的类型，疾病的阶段，和对技术人员来说明显的其它因素的考虑。在一些实施方式中，用于人类受试者的PEPD剂量可以与用于曲妥珠单抗的剂量类似或相同，其通常为每周2-4mg/kg。
可以将本公开的组合物与任何传统治疗方案结合给药，传统治疗方案包含相继或同时给药化疗剂、被动免疫疗法、疫苗、佐剂等。在特定的实施方式中，可以将本方法与旨在治疗与ErbB2-阳性细胞有关的疾病或病症的常规疗法结合进行。例如，给药本文中所描述的组合物可以与包含但不限于化疗、外科手术和放射治疗的治疗方式相结合，其可以在PEPD给药前、与PEPD给药同时或继PEPD给药之后进行。在一些实施方式中，本公开包含包括PEPD和西妥昔单抗(临床使用的抗ErbB1的单克隆抗体)的组合物。在一些实施方式中，本公开包含包括PEPD与临床使用的双重ErbB1/ErbB2激酶抑制剂拉帕替尼的组合物。在一些实施方式中，本公开包含包括PEPD和曲妥珠单抗的组合物。在一些实施方式中，本公开包含包括PEPD和帕妥珠单抗(另一种临床使用的抗-ErbB2的单克隆抗体)的组合物。
在一些实施方式中，本公开包含组合物和用于使用该组合物的方法，其中，除了PEPD蛋白之外，组合物还包含血液凝血抑制剂。在一个实施方式中，凝血抑制剂为抑制PEPD体内降解以降低患者所需的PEPD剂量的试剂。在一个实施方式中，凝血抑制剂抑制了凝血酶原向凝血酶的转化，或抑制凝血酶参与凝块形成。在一个实施方式中，凝血抑制剂干涉已知为X因子和II因子的凝结促进蛋白的凝结相关功能。在一些实施方式中，凝血抑制剂结合至并激活抗凝血酶III，结果抑制了Xa和IIa凝血因子。在一个实施方式中，凝血抑制剂为肝素，如普通肝素制剂，或低分子量形式的肝素。低分子量形式的肝素在本领域中是已知的(即WeitzJI；Weitz，JeffreyI.(1997)“Low-molecular-weightheparins”.NEnglJMed337(10)：688-98)。在一个实施方式中，低分子量肝素为依诺肝素或其药学可接受的盐，如依诺肝素钠。在一个实施方式中，抑制剂为直接的Xa抑制剂，该直接的Xa抑制剂为口服的或非口服的，包含但不限于以商品名称RIVAROXABAN、APIXABAN或EDOXABAN出售的药物。在一个实施方式中，凝血抑制剂可以为其它血液凝血因子的抑制剂，包含但不限于XII、XI和VII因子。在一些实施方式中，采用任何合适的溶剂和给药路径将低分子量肝素或其它凝血抑制剂给药。在一些实施方式中，通过皮下注射给药凝血抑制剂。在一个实施方式中，口服给药凝血抑制剂。凝血抑制剂的剂量可以基于个体接受者的体重和由本领域技术人员鉴于本公开的权益而可以认识到的其它参数。在一些实施方式中，可以在给药PEPD组合物之前、与给药PEPD组合物同时或继给药PEPD组合物之后给予凝血抑制剂，且可以给药与PEPD给药相同数量和时长的凝血抑制剂，或可以按照与PEPD给药不同的计划给药凝血抑制剂。
在另一个实施方式中，本公开提供了用于识别个体是否是用包含PEPD的组合物进行治疗的候选人的方法。该方法包含从个体获得生物样品并确定该样品是否包含ErbB2-阳性癌细胞，其中确定生物样品包含ErbB2-阳性癌细胞表明个体是用来治疗的候选人，且其中确定生物样品不包含ErbB2-阳性癌细胞表明个体不是用来治疗的候选人。因此，在一些实施方式中，本公开提供了用于辅助诊断或用于对需要以包含PEPD的组合物进行治疗的个体进行诊断。在一些实施方式中，该方法包含将生物样品中存在或不存在ErbB2-阳性癌细胞的测定传达给医疗服务人员以使医疗服务人员可以，在一个实施方式中，推荐用包含PEPD的组合物进行治疗。在一些实施方式中，该方法还包含向个体给药包含PEPD的组合物。测定存在ErbB2-阳性癌细胞包含在个体或从过度表达ErbB2的个体癌细胞中获得的生物样品中进行检测。
在一个实施方式中，识别个体是否是用来以包含PEPD的组合物进行治疗的候选者的方法包含从个体获得生物样品并通过将样品与可检测的标记的PEPD接触以确定该样品是否包含ErbB2-阳性癌细胞和/或过度表达ErbB2。检测的ErbB2+和可检测的标记的PEPD的复合物表明个体是用来以如本文中所述的包括PEPD的组合物进行治疗的候选者。在一个实施方式中，在被怀疑含有ErbB2-阳性细胞的肿瘤的活检中检测到了ErbB2+和可检测的标记的PEPD的复合物。在可选择的实施方式中，通过采用可检测的标记的PEPD结合配偶体可以检测结合至ErbB2-阳性细胞的PEPD。在一些实施方式中，ErbB2-阳性癌细胞表达比参照多的ErbB2。参照可以为任何合适的参照，如匹配对照、标准化值(即曲线下的面积)和/或样品中相同组织类型的细胞所表达的ErbB2的量的值，其中ErbB2细胞不是癌细胞。通常，在某些实施方式中，采用与用于识别个体为用来以曲妥珠单抗进行治疗的候选者相同或类似的标准来进行识别人类受试者为用来以PEPD制剂进行治疗的候选者，其是基于临床确定的参数且对技术人员来说是已知的。例如，经常采用免疫组织化学(IHC)来测量存在于肿瘤活检样品中的ErbB2的量，或可选地采用荧光原位杂交(FISH)来测量基因拷贝数(参见，例如，CarlsonRW等人，JNatlComprCancNetw2006，Suppl4，S1-22；Her2testinginbreastcancer：NCCNTaskForcereportandrecommendations)。在一些实施方式中，认为IHC分数为0或1+，平均ErbB2基因/染色体17的比小于1.8，或如通过FISH确定的平均每个细胞中ErbB2基因拷贝数为4以下的肿瘤为ErbB2阴性。在采用靶向ErbB2的试剂对为用于癌症治疗的候选者的个体进行识别的背景下，IHC分数为3，FISH确定的平均ErbB2基因/染色体17的比大于2.2，或平均每个细胞中ErbB2基因拷贝数为6以上的肿瘤样品被认为是ErbB2阳性。
在一些实施方式中，本公开还提供了产品，诸如制造的制品，其包含PEPD药物制剂。产品包含分离的和/或纯化的PEPD。PEPD可以为酶促激活态或酶促失活态形式的PEPD。制造的制品包含包装材料和/或印刷材料。在一个实施方式中，本公开包含含有PEPD制剂的封闭或密闭的包装。在某些实施方式中，包装可以包含一个或多个封闭或密闭的小瓶、瓶子、泡罩(泡沫)包装、或任何其它合适的包装以用于出售、分配或使用PEPD药物制剂。印刷材料可以包含印刷信息。可以在标签或在插入的纸张上提供印刷信息，或者可以将印刷信息印刷在包装材料自身上。印刷信息包含识别包装中的PEPD试剂、其它激活态成分和/或失活态成分的数量和类型，和服用组合物的说明，如在给定时间期限内服用的剂量数的信息，和/或针对药剂师和/或其他医疗服务人员(如医师)或患者的信息。试剂盒可以包含其它试剂且印刷信息可以识别其它试剂，如单独提供或与PEPD试剂组合提供的凝血抑制剂。印刷材料可以包含与试剂盒一起提供的PEPD药物组合物和/或其它试剂是用于治疗ErbB2-阳性癌症这一说明。可以将产品提供为包装在容器中的、包含治疗有效量的PEPD组合物的试剂盒，该试剂盒还包含贴在容器上或与容器一起包装的标签，标签描述了容器的内容物并提供了关于使用容器的内容物治疗ErbB2-阳性癌症的说明和/或指示。
以下实施例旨在说明但不限制本发明。
实施例1
本实施例说明人类PEPD结合至人类ErbB2ECD的亚域3并引起ErbB2二聚化。
如下进一步所述，细菌中产生重组人类PEPD并以0.04、0.2或1μM与0.04μM的ErbB2/ECD-Fc[人类ErbB2ECD(Thr23-Thr652)和人类IgG1的Fc片段的重组嵌合体]或作为对照的0.04μM的Fc一起孵育。PEPD特异结合至ECD，且各个PEPD亚单元最大地结合至ECD的一个拷贝(图1a)。鉴于PEPD和ErbB2/ECD-Fc(由于Fc)在溶液中均形成同源二聚体，上述结果表明一个PEPD二聚体结合至一个ECD二聚体。再将1μM的PEPD与0.04μM的ErbB3/ECD-Fc[人类ErbB3的ECD(Ser20-Thr643)和Fc的嵌合体]或0.04μM的ErbB4/ECD-Fc[人类ErbB4的ECD(Gln26-Arg649)和Fc的嵌合体]一起孵育，但是没有检测到结合(图1a)。不出所料，神经调节蛋白(NRG-1)结合至ErbB3和ErbB4的ECD(图7)。因此，PEPD不是ErbB3或ErbB4的配体。我们还利用表达低水平的ErbB2但不表达其它ErbB的中国仓鼠卵巢CHO-K1细胞对结合至ErbB2的PEPD进行了研究(图8a)。通过基因转染容易实现人类ErbB2在CHO-K1细胞中的过度表达(图1b)。在采用ErbB2-过度表达的细胞的裂解物的酶联免疫吸附试验(ELISA)中，PEPD以估计的7.3nM的Kd值结合至ErbB2，而很少有PEPD结合至对照CHO-K1细胞的裂解物(图1c)。PEPD没有结合至ErbB2的跨膜域和胞内域(图8b)。接下来，我们采用表达ErbB2的质粒pCMV6-XL5-ERBB2作为模版一次一个移除人类ErbB2的四个ECD亚域(图1d)。在用质粒瞬时转染的CHO-K1细胞中检测到了ErbB2及其突变体的相似蛋白表达水平(图1d)。在上述相同的ELISA中使用基于蛋白质免疫印迹定量的等量的ErbB2及其突变体。亚域D1缺失对PEPD-ErbB2结合几乎没有影响；移除D2和D4亚域后的结合亲和力分别下降了3.5倍和51.0倍，但是通过升高PEPD的浓度实现了完全PEPD结合；移除D3亚域彻底废除了PEPD结合(图1e)。因此，PEPD结合至D3，但是D2和D4(特别是D4)可以促进PEPD结合至ErbB2。
已知在细胞中ErbB2的过度表达引起自发性二聚化。不出所料，ErbB2的单体和二聚体均存在于稳定地过度表达ErbB2的CHO-K1细胞中(图1f)。在收集和蛋白质免疫印迹分析之前用交联剂双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(BS3)对细胞进行处理。PEPD明显地经过了两个阶段的ErbB2结合：PEPD同源二聚体快速结合至预先存在的ErbB2同源二聚体(ErbB2单体水平没有改变，ErbB2二聚体水平下降并在PEPD处理的10分钟时形成2个ErbB2和2个PEPD的异源四聚体)，随后PEPD同源二聚体结合至ErbB2同源二聚体，其在PEPD处理的10分钟时时明显的(ErbB2单体水平下降，形成1个ErbB2和2个PEPD的异源三聚体，形成新的ErbB2同源二聚体，且2个ErbB2和2个PEPD的异源四聚体进一步增加)(图1f)。值得注意的是，在PEPD处理后存在的没有连接至PEPD的ErbB2同源二聚体可能是由两个蛋白通过BS3的不完全交联引起的。
实施例2
本实施例表明PEPD诱导缓慢且短暂的ErbB2磷酸化，但是引起极大且持续的ErbB2贫化。在稳定过度表达人类ErbB2的CHO-K1/ErbB2细胞中和组成性过度表达ErbB2的人类乳腺癌BT-474细胞中，对ErbB2上的两个关键的酪氨酸磷酸化位点(pY1221/1222和pY1196)进行了测量。在以2.7nM的PEPD处理0.5至1小时后两个位点处的ErbB2酪氨酸磷酸化均显著增加，在3小时处达到峰值，并在24小时处极大地回到基础水平(图2a和2b)。在更高的PEPD浓度时(27和270nM)，这些位点处的酪氨酸磷酸化进一步增加且持续更久(图2c)。由PEPD诱导的相对缓慢的ErbB2酪氨酸磷酸化与相对缓慢的PEPD结合至ErbB2单体及随后的二聚化相一致(图1f)。PEPD快速结合至预先存在的ErbB2二聚体(图1f)，但是已知的是这些二聚体为自酪氨酸磷酸化的。不出所料，表皮生长因子(EGF)和NRG-1(其它ErbB的配体)均不激活CHO-K1/ErbB2细胞中的ErbB2(图9)。在用2.7nM的PEPD处理的细胞中，ErbB2蛋白水平在1小时处开始下降，在6小时处达到其最低水平，最低水平持续至少72小时(图2a)，而溶剂处理的细胞中ErbB2水平没有变化(图2b)。PEPD对ErbB2蛋白水平的影响是剂量依赖性的，且在270nM，PEPD使几乎全部的ErbB2消失(图2c)。为了理解PEPD如何引起ErbB2贫化，在用PEPD对CHO-K1/ErbB2细胞进行处理后，我们测量了培养基中的ErbB2ECD和细胞裂解物中的ErbB2-p95(减去ECD)，因为ErbB2可以接受ECD脱落。已知4-氨基苯汞酸(APMA)引起ErbB2ECD裂解且不出所料在细胞裂解物中产生p95片段(减去ECD)和在培养基中产生ECD(图2d)。然而，即使当用270nM的PEPD对细胞处理高达6小时，不发生ErbB2ECD脱落(图2d)。因此，PEPD不引起ErbB2ECD裂解。而且，PEPD处理6小时后，CHO-K1/ErbB2细胞或BT-474细胞中的ErbB2mRNA水平不发生改变(图2e)，这表明PEPD-诱导的ErbB2贫化也不是由于抑制了ERBB2基因表达。接下来，用溶剂或PEPD对CHO-K1细胞和CHO-K1/ErbB2细胞均进行了处理，随后对ErbB2和PEPD进行免疫荧光染色并通过共聚焦显微镜进行检测。以高浓度(270nM)的PEPD处理细胞以增强检测。在CHO-K1细胞中，ErbB2染色可以忽略不计且没有PEPD染色(图2f)，与这些细胞中非常低的ErbB2表达一致。在CHO-K1/ErbB2细胞中，ErbB2在质膜中被严重染色，且用PEPD孵育0.25小时后，还检测到质膜中的严重PEPD染色，其与ErbB2共定位用(图2f)，与结合至ErbB2的PEPD相一致。然而，在用PEPD处理2小时的CHO-K1/ErbB2细胞中，质膜中的两种蛋白的染色强度均降低，同时细胞质中的染色增加(图2f)，这表明ErbB2和PEPD被内化。之前已经显示出ErbB2进行了网格蛋白-非依赖性内吞作用、泛素化和降解。的确，当用2.7nM的PEPD对细胞处理0.5小时，泛素化的ErbB2的水平显著增加(图2g)。
实施例3
本实施例表明ErbB2磷酸化由直接的PEPD结合引起，但是不涉及PEPD的二肽酶功能。我们分析了由PEPD刺激的ErbB2磷酸化是否是由两种蛋白之间的直接相互作用引起的。用激酶失活ErbB2突变体(K753M)对CHO-K1细胞转染24小时之后用270nM的PEPD处理3小时，这一条件显示出引起野生型ErbB2的最大磷酸化。基因转染后细胞中过度表达ErbB2突变体，但是PEPD未能刺激其磷酸化，然而在相同的实验条件下，PEPD刺激了野生型ErbB2的磷酸化(图3a)。接下来，用缺乏ECD亚域的ErbB2突变体(K753M)对CHO-K1细胞转染(图1d)24小时，然后用270nM的PEPD处理3小时。pY1221/1222和pY1196处的PEPD-诱导的ErbB2磷酸化在ErbB2/de1D1和ErbB2/de1D2中与在WT-ErbB2中均是可比的，在ErbB2/de1D3中是不存在的，且在ErbB2/de1D4中是衰减的(图3a)，其与结合至这些突变体的PEPD非常相关(图1e)。这些结果表明ErbB2被细胞中的PEPD激活完全是由PEPD直接结合至ErbB2引起的。
产生了四种人类PEPD的突变体并对其进行评估以更好地理解作为ErbB2配体的PEPD，PEPD包含R184X-PEPD(从C-末端敲除309氨基酸)、R265X-PEPD(从C-末端敲除228氨基酸)、G278D-PEPD(在氨基酸#278处的G→D)和X265R-PEPD(从N-末端敲除228氨基酸)(图10a)。用野生型人类ErbB2对CHO-K1细胞转染24小时，然后用270nM的野生型PEPD及其各个突变体处理3小时。PEPD的突变体未能诱导ErbB2磷酸化，除了在激活ErbB2方面与WT-PEPD相同的G278D-PEPD(图3b)。然而，G278D-PEPD是酶促失活态的(参见，诸如，LedouxP等人.Expressionandmolecularanalysisofmutationsinprolidasedeficiency.AmJHumGenet1996；59：1035-1039.)。有趣的是，只有WT-PEPD和G278D-PEPD可以形成同源二聚体(图10b)。因此，PEPD的二肽酶活性不参与ErbB2激活，但是PEPD结合并激活ErbB2可能需要PEPD的同源二聚化。
值得注意的是，在上述实验中，PEPD或其G278D突变体没有引起ErbB2蛋白水平降低，而PEPD引起稳定或组成性过度表达ErbB2的细胞中极大的ErbB2贫化(图2a和2c)。我们发现在瞬时过度表达ErbB2的CHO-K1细胞中，大部分的ErbB2分子存在于细胞内，而在稳定过度表达ErbB2的CHO-K1细胞中，大部分的ErbB2分子在细胞表面表达(图11)。这可以解释为什么PEPD处理3小时没有在瞬时过度表达ErbB2的细胞中引起明显的ErbB2蛋白下降。
实施例4
本实施例表明细胞内的PEPD不调节ErbB2。PEPD是主要的胞浆蛋白。CHO-K1/ErbB2细胞和BT-474细胞中的内源性PEPD水平相对较低，但是通过基因转染这些细胞中的PEPD水平可以轻易地升高。在对表达人类PEPD的质粒进行转染后24小时检测到适中或强烈的PEPD过度表达，但是ErbB2酪氨酸磷酸化和ErbB2蛋白表达均没有随着PEPD过度表达而改变(图4a)。为了查明细胞是否释放了PEPD，将PEPD-过度表达的细胞和对照细胞在培养基中培养24小时，随后通过蛋白质免疫印迹测量细胞裂解物中的PEPD水平并通过ELISA测量培养基中的PEPD水平。PEPD-过度表达的细胞的培养基中的PEPD浓度比对照细胞的培养基中的PEPD浓度高5.9倍(CHO-K1/ErbB2细胞)和10.3倍(BT-474细胞)(图4b)。因为所有的细胞形态学上表现出正常和健康，上述结果表明细胞可以主动释放PEPD。然而，由于被培养基明显地过度稀释，细胞外的PEPD浓度太低(＜0.3nM)以至于不能影响ErbB2(图4b)。
实施例5
本实施例表明PEPD使ErbB2-Src信号转导迅速沉默。ERK位于ErbB2的下游。不出所料，PEPD处理(2.7nM)导致ERK在时间框内激活，其与ErbB2磷酸化同时发生(对比图5a和图2a)，这表明从激活的ErbB2至ERK的快速信号传输。的确，在表达激酶失活ErbB2突变体K753M的CHO-K1细胞中，PEPD既不引起ErbB2磷酸化(图3a)也不引起ERK磷酸化(图12)。AKT也位于ErbB2的下游，但是PEPD(2.7nM)以时间依赖性的方式降低了CHO-K1/ErbB2细胞和BT-474细胞中的对AKT功能至关重要的S473磷酸化(图5a)，而溶剂处理对AKT磷酸化没有影响(图5b)。这表明PEPD通过其它机制调节ErbB2信号转导。如上所述，ErbB2过度表达引起自发性二聚化和自-酪氨酸磷酸化。还已知的是，当结合至酪氨酸-磷酸化的ErbB2同源二聚体或异源二聚体时Src和PI3K被激活，其导致激活AKT。在CHO-K1/ErbB2细胞中，ErbB2与Src以及CK2(Src底物和多效性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)相关联，但是没有检测到PI3K，而在BT-474细胞中，ErbB2与Src、CK2和PI3K相关联(图5c)。用PEPD(2.7nM)对这些细胞仅处理0.5小时导致Src和CK2与ErbB2显著解离，但是PI3K仍然与ErbB2相关联(图5c)。因此，PEPD显著降低了CHO-K1/ErbB2细胞和BT-474细胞中的Src激酶活性，而PI3K活性保持不变(图5d)。然而，在CHO-K1细胞中，PEPD既没有显著调节Src也没有显著调节PI3K(图5d)。进一步的实验显示，在用PEPD(2.7nM)处理仅10分钟后，对Src激酶功能至关重要的Y419处的Src磷酸化在CHO-K1/ErbB2细胞和BT-474细胞中均显著降低(图5e)，这表明PEPD快速结合至ErbB2二聚体并快速破坏ErbB2-Src信号转导单元。鉴于PEPD对Src的影响发生在ErbB2磷酸化和表达明显变化之前，特别是在CHO-K1/ErbB2细胞中(图2a)，PEPD可能改变了预先存在的ErbB2二聚体的构型，从而导致Src从ErbB2解离。
相比于溶剂处理的对照组(图5b)，PEPD-诱导的对Src和CK2的抑制伴随着在S380位点PTEN磷酸化的丧失(图5a)。已知由CK2在该位点引起的PTEN磷酸化有助于抑制PTEN的活性。还已知PTEN使膜结合的PIP3脱磷酸化，由此抑制AKT磷酸化，以及Src通过直接使PTEN对酪氨酸残基磷酸化来阻止PTEN向质膜易位。的确，PEPD(2.7nM，0.5h)抑制了CHO-K1/ErbB2细胞和BT-474细胞中的PTEN酪氨酸磷酸化(图5f)，且在PEPD处理(2.7nM，1h)后从细胞质到质膜的PTEN易位增加(图5g)。
实施例6
本实施例表明PEPD靶向过度表达ErbB2的细胞。将我们的发现(PEPD结合至ErbB2以及随后的变化)概括在图6A中。在ErbB2癌形成中发挥主要作用的对Src的快速抑制以及强烈的ErbB2贫化表明PEPD可以抑制过度表达ErbB2的细胞。采用如下所述的三种试验对PEPD对CHO-K1细胞、CHO-K1/ErbB2细胞和BT-474细胞的潜在抑制作用进行了评估。
通过流式细胞术引入溴脱氧尿苷(BrdU)对PEPD对DNA合成的影响进行了测量。用2.7和27nM的PEPD对细胞处理48小时。当PEPD在CHO-K1细胞中无效时，其分别减少了高达65％和50％数量的BrdU-阳性的CHO-K1/ErbB2细胞和BT-474细胞(图6b)。为了测量PEPD对锚定非依赖性生长的影响，使细胞在软琼脂中生长并用2.7和27nM的PEPD对细胞处理21天，其中每3至4天更换培养基。在CHO-K1细胞中PEPD没有显著影响菌落形成，但是在CHO-K1/ErbB2细胞和BT-474细胞中PEPD均显著抑制了菌落形成。PEPD减少的CHO-K1/ErbB2细胞和BT-474细胞中直径≥100μm的菌落数目分别高达50％和57％(图6c)。采用BDBioCoat基质胶侵袭室测量PEPD对细胞侵袭和迁移的影响。使细胞生长在上部腔室中并用溶剂或2.7和27nM的PEPD对细胞处理48小时，并对经由基质胶膜侵袭到上部腔室的底部的细胞进行计数。PEPD在CHO-K1中是无效的但是抑制了CHO-K1/ErbB2细胞和BT-474细胞的侵袭和迁移的分别高达50％和51％(图6d)。总体地，这些结果证实了PEPD对ErbB2的影响主要为抑制且还表明PEPD选择性靶向过度表达ErbB2的细胞。
从上述数据明显的是本公开打破了认为ErbB2是孤独受体这一长期魔咒，相比于ErbB受体的其它配体，人类PEPD的几个不寻常的特征是值得注意的：其不具有EGF基序；其显然作为同源二聚体结合至ErbB2；且其抑制ErbB2的致癌信号转导。PEPD既结合至ErbB2单体又结合至ErbB2二聚体，但是如图1f所示，PEPD结合至ErbB2同源二聚体比结合至ErbB2单体要快。这解释了为什么PEPD引起ErbB2-Src信号转导被非常快速地破坏(图5)但是引起稍微缓慢的ErbB2磷酸化(图2a)。
当评估其对细胞生长和增殖的影响时，PEPD在表达低水平ErbB2的CHO-K1细胞中是无效的但在ErbB2-过度表达的CHO-K1细胞(CHO-K1/ErbB2细胞)和BT-474细胞中显示出强烈的抑制活性，包括抑制DNA合成、锚定-非依赖性生长，和侵袭和迁移(图6b-6d)。这表明PEPD靶向ErbB2致癌基因依赖，如CHO-K1/ErbB2细胞来源于CHO-K1细胞；可能涉及至少两种机制：PEPD通过诱导ErbB2内化和降解引起ErbB2贫化，和PEPD通过破坏ErbB2-Src的联合抑制了ErbB2-Src信号转导(图5)。PEPD对ErbB2的影响类似于曲妥珠单抗对ErbB2的影响，曲妥珠单抗为结合至ErbB2ECD的亚域4且目前用于治疗ErbB2-阳性乳腺癌的ErbB2-靶向的单克隆抗体。上述实施例中呈现的数据表明，在等摩尔浓度时，PEPD或其G278D突变体对CHO-K1/ErbB2细胞和BT-474细胞的增殖的抑制如果不及则与曲妥珠单抗对CHO-K1/ErbB2细胞和BT-474细胞的增殖的抑制类似，而没有试剂在CHO-K1细胞中显示出抑制活性(图14)。在细菌中产生的重组人类PEPD或其突变体潜在地可能是非常昂贵的必须在哺乳动物细胞中生产的曲妥珠单抗的廉价替代品。此外，如上所述，在体内，曲妥珠单抗既不下调ErbB2的表达也不抑制癌组织中ErbB2酪氨酸的磷酸化；更确切地说，其抗肿瘤活性主要取决于通过其Fc域的抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)。因此，PEPD或其突变体可以与曲妥珠单抗协同作用或在一定程度上克服患者体内对曲妥珠单抗的耐药性。PEPD没有结合至ErbB3和ErbB4(如1a)，但是总所周知ErbB2是这些ErbB优选的异源二聚化配偶体。这就提出了是否通过PEPD阻断ErbB2致癌信号转导还可以包含抑制ErbB2异源二聚体信号转导单元这一问题。值得注意的是，在人类乳腺癌中，ErbB2的致癌活性主要取决于ErbB3。对本领域技术人员来说明显的是，本公开揭示了人类PEPD根本上的新功能：不依赖于其二肽酶活性的ErbB2配体。来自许多物种的PEPD与人类PEPD具有高度序列同源性且也可以结合并调节ErbB2。
鉴于实施例1-6中所述的体外结果，其强烈支持将PEPD作为用于治疗Erb2阳性癌症的试剂，我们在体内对PEPD及其酶促失活态版本进行了测试以确定其在临床相关动物模型中对ErbB2阳性癌症的疗效，如在以下实施例中所述。
实施例7
本实施例表明在体内采用重组人类PEPD及其突变体作为抗癌剂。如在实施例1-6中所示的体外实验的情况下，利用具有标记至羧基端的6xHis的重组PEPD及其突变体PEPDG278D获得本实施例中所呈现的数据，具有标记至羧基端的6xHis的重组PEPD及其突变体PEPDG278D是在大肠杆菌(E.coli)中产生并利用设计进这些蛋白中的组氨酸(HIS)标记通过亲和色谱法进行纯化的。在以下实验中使用这些产品。
首先，我们进行剂量-探索实验。在体外，浓度低至2.7nM的PEPD对ErbB2-过度表达的细胞是有效的。对成年C57BL/6小鼠给予一次性腹腔内的PEPD剂量，并在给药1、6或24小时后处死小鼠以收集血液。当以10mg/kg给予PEPD时，相比于对照小鼠中的0.9nM，给药后1小时血浆PEPD升高至16.5nM且给药后24小时血浆PEPD升高至13.6nM，以0.2mg/kg给予PEPD意想不到地导致血浆PEPD水平降低51-61％(图14a)。然而，我们发现将PEPD试剂与伊诺肝素(EP)(其为临床使用的小分子量肝素且已知抑制Xa因子和其它凝血因子)进行组合导致持久的PEPD，因为以0.2mg/kg给药PEPD后，经过EP-预处理的小鼠中的PEPD的血浆水平高达至比没有进行EP处理的小鼠中的PEPD的血浆水平高64倍(图14b)。不希望受任何特定理论的约束，认为EP可以减少PEPD的降解。合理的是，其它凝血抑制因子在维持体内血浆浓度方面也是有效的。接下来，我们分析了PEPD是否抑制体内ErbB2-过度表达的肿瘤的生长。将稳定过度表达人类ErbB2但不表达任何其它ErbB家族受体的、悬浮于少量PBS：基质胶混合物中的CHO-K1/ErbB2细胞以每个位点1×106个细胞皮下接种至雌性无朐腺裸鼠(6-7周龄)的胁腹。细胞接种后4天起始，每天一次通过腹腔内注射以2.5mg/kg对小鼠给予溶剂或EP。当开始EP处理后3天(在细胞接种后第7天)，当肿瘤体积达到约41mm3时，用溶剂或PEPD通过腹腔内注射以0.02mg/kg或0.2mg/kg对EP处理过的小鼠进行处理，每周对其给药三次(星期一、星期三、星期五)。值得注意的是，在EP和溶剂/PEPD均被给予的日子里，通常在给药EP后1小时给予溶剂或PEPD。按照长×宽2/2每周对肿瘤体积测量三次(星期一、星期三、星期五)。在细胞接种后第24天给予最后一次处理后24小时将小鼠处死(一共8次PEPD处理)，并收集来自小鼠的血液样品用于通过ELISA试验对PEPD的血浆水平进行测量。虽然EP对肿瘤生长没有影响，0.02和0.2mg/kg的EP加PEPD分别抑制了27％(统计学不显著)和65％(高度统计学显著)的肿瘤生长(图15a)。实验结束时总PEPD(内源性小鼠PEPD加上人类PEPD)的血浆水平在仅有EP的组中为1.9nM，在EP加上低剂量的PEPD的组中为5.5nM，且在EP加上高剂量的PEPD的组中为33.0nM，比对照小鼠中高1.4倍，4.2倍，24.8倍(图15b)。
我们接下来分析了PEPD是否特异性靶向体内ErbB2-过度表达的肿瘤。将表达可忽略不计的ErbB2且不表达其它ErbB的、悬浮于少量PBS：基质胶混合物中的CHO-K1细胞以每个位点1×106个细胞皮下接种至雌性无朐腺裸鼠(6-7周龄)的胁腹。细胞接种后4天起始，每天一次用EP以2.5mg/kg通过腹腔内注射对小鼠进行处理。3天后(细胞接种后第7天)，当肿瘤体积达到约26mm3时，用溶剂或PEPD以0.2mg/kg通过腹腔内注射对小鼠进行处理，每周对小鼠给药三次(星期一、星期三、星期五)。在EP和PEPD/溶剂均被给予的日子里，通常在EP给药后1小时给予PEPD/溶剂。每周对肿瘤体积测量三次(星期一、星期三、星期五)。在细胞接种后第21天给予最后一次处理后24小时将小鼠处死(一共7次PEPD处理)，并收集小鼠的血液样品用于测量PEPD的血浆水平。PEPD处理对肿瘤生长没有影响(图16a)，尽管正如所料血浆水平升高(图16b)。因此，我们这里所呈现的数据表明PEPD特异性靶向包括过度表达ErbB2的细胞的肿瘤。
接下来，在原位乳腺瘤模型中对PEPD的作用进行了评估。人类乳腺癌BT-474细胞组成性过度表达ErbB2且被广泛用于产生用于评估抗-ErbB2治疗的原位乳腺瘤。在将BT-474细胞原位接种到乳腺脂肪垫中(悬浮于少量PBS：基质胶混合物中的、每个位点2×106个细胞)之前，将60天释放的17β-雌二醇片(1.7mg的雌二醇，购自美国的创新研究)皮下植入每只雌性无朐腺裸鼠(6-7周龄)。癌细胞接种后23天，开始每天用EP以每天0.5mg/kg通过腹腔内注射对所有的小鼠进行处理。值得注意的是，剂量-探索实验表明，在维持血液中的PEPD浓度方面，0.5mg/kg的EP与2.5mg/kg同样有效。此外，将植入17β-雌二醇且然后接种BT-474细胞的另一组小鼠保留作为未治疗对照以证实EP自身对肿瘤生长没有任何影响。癌细胞接种后将未经治疗处理的小鼠保留58天(图17a)。将EP-处理过的小鼠随机分为3组以接收溶剂、PEPD和PEPDG278D，在基于我们CHO-K1/ErbB2肿瘤模型中PEPD的实验继续每天进行EP处理的同时，我们决定用PEPD或其突变体以2mg/kg对小鼠进行处理。在EP处理开始后4天(癌细胞接种后第27天)开始用溶剂、PEPD或其突变体进行处理，且每只小鼠每周通过腹腔内注射给药3次(星期一、星期三、星期五)。当在同一天还给药EP时，通常在早于其它试剂1小时给药EP。每周在星期一、星期三、星期五对肿瘤体积进行测量。如图17a所示，EP对肿瘤生长没有影响，但是PEPD和PEPDG278D均快速引起肿瘤萎缩。PEPDG278D比PEPD有效(两组之间在肿瘤体积方面的差异具有统计学显著性)。考虑到试剂的强烈抗肿瘤效果，1个月以后停止所有的处理(在癌细胞接种后第58天进行最后给药)，并保留小鼠用于观察。最后给药之后24小时还从小鼠获得少量的血液以测量血浆PEPD水平。仅用EP进行处理的小鼠的中的血浆PEPD水平为1.9nM，比没有进行处理的小鼠中的血浆PEPD水平高1.4倍(图17b)，再次表明EP显著促进了内源性小鼠PEPD的持久性。此外，用EP加上PEPD和EP加上PEPDG278D进行处理的小鼠的中的血浆PEPD水平分别为154.3nM和128.6nM，其比没有进行处理的小鼠中的血浆PEPD水平高111.0-倍和92.5倍(图10b)。在癌细胞接种后第59天将第二个17β-雌二醇片植入各个小鼠。处理停止后三周(癌细胞接种后第80天)，先前用PEPD或其突变体进行处理的一些小鼠中的肿瘤继续生长。然而，50％的用PEPDG278D进行处理的小鼠仍然没有肿瘤，以及27％的用PEPD进行处理的小鼠仍然没有肿瘤(图17a)，这是另一个PEPDG278D比PEPD有效的指示。用EP加上PEPDG278D对所有具有再生肿瘤的小鼠进行再次处理：在癌细胞接种后第89天开始每天通过腹腔内注射以0.5mg/kg给药EP，且每隔一天通过腹腔内注射以2mg/kg给药PEPDG278D共4次。如上所述，在EP和PEPDG278D均被给予的日子里，提前1小时给予EP。在最后一次PEPDG278D给药后24小时终止实验。如图17a所示，所有的肿瘤对PEPDG278D仍然非常敏感，表明肿瘤再生不是由于存在对PEPD或PEPDG278D耐药的癌细胞，而是由于最初没有完全根除癌细胞。另外，每天一次用EP以0.5mg/kg对先前仅用EP进行处理的小鼠进行再处理，其于癌细胞接种后第82天开始进行，且4天后，将小鼠分成2组：溶剂处理或用PEPDG278D以2mg/kg进行处理，每周通过腹腔内注射给予三次(星期一、星期三、星期五)共5次。最后一次给药之后24小时终止实验。如图17a所示，PEPDG278D引起肿瘤体积快速萎缩，即使在处理开始时肿瘤非常大。同样重要需要注意的是，PEPD和PEPDG278D的显著抗癌疗效与任何的毒性无关：对小鼠体重增长或器官(如结肠、心脏、肾、肝、肺和胃)的重量没有影响。这表明治疗有效剂量的试剂是无毒的。
实施例8
本实施例提供了制备PEPD-Fc杂交(融合)蛋白的说明。
结合至ErbB2胞外域的亚域4的曲妥珠单抗是乳腺癌中最成功且最广泛使用抗-ErbB2试剂。然而，对曲妥珠单抗的整体响应速率保持适中，且初级和次级耐药仍然是临床挑战。曲妥珠单抗的Fc域通过接合免疫效应细胞上的Fc受体并诱发抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性而对其抗肿瘤活性是至关重要的。事实上，临床研究发现用于治疗ErbB2-阳性乳腺癌的剂量水平的曲妥珠单抗不能下调癌组织中的ErbB2蛋白(GennariR等人.ClinicalCancerResearch2004，10(17)：5650-5655)。还已知Fc促进抗体的血液持久性。然而，PEPD没有Fc域。
我们进行的旨在实施和确定将Fc加入PEPD是否增强其抗癌活性的试验可能是合理的。还可以将PEPD-Fc杂交分子在血液中保持至比PEPD高的水平且比PEPD长的时间。我们已经产生了PEPD-Fc(单体分子量：80.9kD)。简言之，将人类PEPD的所有编码序列亚克隆至pFUSE-hIgG1-Fc载体(InvivoGen)，该载体在其C末端在框内连接至人类IgG1的Fc序列。通过测序对产生的构建体进行验证并将其转染至CHO-K1细胞，并利用蛋白A-琼脂糖对细胞裂解物中表达的杂交蛋白进行纯化。用SDS-PAGE对高纯度的PEPD-Fc进行确认。将PEPD-Fc的生物活性与PEPD的生物活性进行对比。用溶剂、PEPD-Fc或PEPD(均为27nM)对CHO-K1/ErbB2细胞处理3小时或6小时。PEPD-Fc引起时间依赖性且显著的ErbB2蛋白贫化，但是稍微不如PEPD有效(图18)。可能的是，在引起rbB2贫化方面PEPD-Fc可能仅略微比PEPD慢，且增加处理时间可以使PEPD-Fc实现与PEPD相同的对ErbB2的影响。然而，如图18所示，两种试剂对ErbB2磷酸化和ERK磷酸化，以及使ErbB2-Src信号转导(降低Src、PTEN和AKT的磷酸化)沉默显示出非常相似的影响。我们的结果表明PEPD-Fc如果没有完全则较大地保留了PEPD的ErbB2-调节活性。鉴于预计PEPD-Fc会在体内与免疫细胞结合，其可能在防治ErbB2-阳性癌症方面比PEPD或PEPDG278D更显著有力。
鉴于本公开的权益，在动物模型中可以轻易地对PEPD-Fc杂合体和PEPDG278D-Fc进行评估。在一些实施方式中，哺乳类动物细胞(如CHO-K1细胞)中会产生这些杂合体以确保Fc的N297处的糖基化，其对Fc功能来说是必不可少的。有趣的是，具有某些突变体的糖基化Fc(包含但不限于FcT299A和FcE382V/M428I)保持其生物活性。因此，鉴于本公开的权益，如在E.coli中可以产生对Fc序列具有特异性突变体的其它杂合体且采用常规技术可以对其进行评估。
实施例9
从图17a和对通过体内测量用rhPEPD或rhPEPDG278D处理的肿瘤的变化而获得的数据进行了概括的图19(a)-(e)可知，就降低体内肿瘤体积而言，rhPEPDG278D优于rhPEPD(图17a和图19(a))。不希望受到任何特定理论的约束，我们认为这与rhPEPDG278D不刺激HIF-1α信号转导，而PEPD刺激HIF-1α信号转导这一新发现有关(图19(e))。就这一点而言，本领域公知的是，VEGF和GLUT-1是HIF-1α的下游靶标，且对这些标记物的不同作用与对HIF-1α的作用相似。所有这三种是公知的促存活因子。然而，我们还观察到PEPD和PEPDG278D均阻塞ErbB2信号转导，从而使ErbB3失活并激活肿瘤组织中的细胞凋亡。两种试剂均引起ErbB-2贫化，ErbB2脱磷酸化(失活)，SRC、AKT、ERK和ErbB3的脱磷酸化(失活)，下调抗凋亡Bc1-2、促凋亡Bc1-2，并且激活肿瘤组织中的多个半胱天冬酶(图19b)。两种试剂还均降低了肿瘤组织中的SRC激酶活性和PI3K活性(图19c)。我们还发现如通过它们的His标签所测量的肿瘤细胞将PEPD和PEPDG278内化至相似的程度(图19e)。该发现支撑了可以将PEPD或PEPDG278D连接至毒素或癌症化疗剂以增强抗癌效果这一观点，如前面所述。
值得注意的是，在体内曲妥珠单抗/赫赛汀(herceptin)既不下调癌组织中的ErbB2表达也不抑制癌组织中ErbB2酪氨酸磷酸化(Gennari等人，ClinicalCancerResearch，10，5650-5655，2004；Gijsen等人.，PLoSBiology，8，e1000563，2010)。当然，赫赛汀主要依靠抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)。因此，基于本文中所呈现的数据，合理的是rhPEPDG278D可以对赫赛汀进行补充或克服某些赫赛汀耐药性。
实施例10
本实施例提供了对用于获得实施例1至9中所描述的数据的材料和方法的说明。
试剂
包括人类ErbB2/ECD-Fc(1129-ER-050)、人类ErbB3/ECD-Fc(348-RB-050)和人类ErbB4/ECD-Fc(1131-ER-050)以及人类IgG1(110-HG-100)的重组Fc的重组嵌合体来自R&DSystem公司。重组人类EGF(236-EG-200)和人类NRG-1(5218)分别购自R&DSystem公司和CellSignaling公司。曲妥珠单抗(Genentech)从罗斯威尔帕克癌症研究所药店(RoswellParkCancerInstitutePharmacy)获得。4-氨基苯汞酸(APMA)、结晶紫、甲基噻唑二苯基-四唑溴盐(MTT)和钒酸盐购自Sigma-Aldrich公司。采用以下抗体：抗PEPD(Abcam公司，ab86507)、抗PTEN(SantaCruz公司，sc-7974)、抗p-PTEN(SantaCruz公司，sc-101789)、抗p-Tyr(PY99)(SantaCruz公司，sc-7020)、抗CK2α(SantaCruz公司，sc-12738)、抗ErbB2的ECD(SantaCruz公司，sc-134481)、抗ErbB3(SantaCruz公司，sc-285)、抗TGFα(SantaCruz公司，sc-9043)、抗ErbB2(CellSignaling公司，2165)、抗p-ErbB2(Y1196)(CellSignaling公司，6942)、抗p-ErbB2(Y1221/1222)(CellSignaling公司，2243)、抗ErbB1(CellSignaling公司，2232)、抗ErbB4(CellSignaling公司，4795)、抗PI3Kp85(CellSignaling公司，4257)、抗p-Src(CellSignaling公司，6943)、抗Src(CellSignaling公司，2123)、抗AKT(CellSignaling公司，4691)、抗p-AKT(CellSignaling公司，4060)、抗ERK(CellSignaling公司，9102)、抗p-ERK(CellSignaling公司，9101)、抗泛素(SantaCruz公司，sc-8017)，抗GAPDH(Millipore公司，MAB374)，用于检测Fc的抗人类IgG1(SantaCruz公司，sc-2453)、FITC结合的抗His-标签(Abcam公司，ab1206)、生物素结合的抗His-标签(Bethyl，A190-113B)和TRITC结合的山羊-抗-兔(Jackson公司，111-025-003)。HRP结合的链霉亲和素(N100)来自ThermoScientific。
重组人类PEPD及其突变体(标记至羧基末端的6×His)在细菌中产生，并使用镍亲和层析(Qiagen公司)进行纯化。各个蛋白的纯度通过凝胶电泳和银染(图10b)进行确认。制备PEPD及其突变体以及其它试剂的详细内容如下。
利用细菌的pBAD/TOPOThioFusion表达体系(Invitrogen公司)生产并纯化PEPD和PEPD突变体。简言之，将pCMV6-XL5-PEPD(Origene公司)作为模板通过PCR利用正向-5′-AATACGACTCACTATAGGGCG-3′(SEQIDNO：2)引物和反向-5′-CTTGGGGCCAGAGAAGG-3′(SEQIDNO：3)引物来扩增全长人类PEPD，将该引物设计成表达作为具有标记至羧基末端(但没有N-末端Thio)的6×His的天然蛋白的PEPD。通过TA克隆将所形成的PCR片段亚克隆进pBAD/Thio-TOPO表达载体中。对该构建体进行测序以确保整个编码序列的完整性。按照生产商所指示的进行表达和纯化。包含N-末端184氨基酸的片段、N-末端265氨基酸的片段和C-末端265氨基酸的片段的PEPDG278D突变体以及其它突变体通过采用快速闪电多重定点突变试剂盒(QuikChangeLightningMultiSite-DirectedMutagenesiskit(AgilentTechnologies公司)并采用上述PEPD表达载体作为模板由定向诱变而产生。对该构建体进行测序以确保正确的突变。野生型PEPD和突变型PEPD均通过Ni-NTA琼脂糖层析(Qiagen公司)进行纯化。利用UltracelYM-30Centricon(Millipore公司)对蛋白进行进一步纯化。在变性和还原条件下在8％至10％的丙烯酰胺凝胶中进行SDS-PAGE，并用银染对该凝胶进行染色以检测蛋白纯度。按照制造商的指示，利用E-TOXATE试剂盒(Sigma公司)还对制剂就潜在的脂多糖污染进行了检查，但没有检测到脂多糖(检测限：每0.1ml样品0.005内毒素单位)。
细胞株和细胞培养
BT-474细胞和CHO-K1细胞来自ATCC。通过用pcDNA3-ERBB2对CHO-K1细胞进行转染而产生CHO-K1/ErbB2细胞并在G418下对其进行选择。将CHO-K1细胞和CHO-K1/ErbB2细胞在补充有10％FBS(Gibco公司)的F-12K培养基(Gibco公司)中进行培养。将BT-474细胞在补充有10％FBS的50％高葡萄糖DMEM(Mediatech公司)/50％F-12K培养基中进行培养。本研究中还采用了来自ATCC的人类乳腺癌MCF-7细胞和人类膀胱癌RT-4细胞。将MCF-7细胞和RT-4细胞分别在高葡萄糖DMEM加10％FBS和McCoy′5A培养基加10％FBS中进行培养。将所有细胞培养在37℃的具有5％CO2的湿润的培养箱中。
基因转染和质粒
使细胞生长在6孔板中，并以采用FuGENEHD(Promega公司)或Lipofectamine2000(Invitrogen公司)的质粒对细胞进行转染。表达野生型人类PEPD的pCMV6-XL5-PEPD来自Origene公司。使用pMT107-His-Ub来表达泛素。通过将全长人类ERBB2编码序列克隆至哺乳动物表达载体pCMV6-XL5(Origene公司)而产生表达人类ErbB2的pCMV6-XL5-ERBB2。为了构建表达人类ErbB2的pCMV6-XL5-ERBB2，利用NotI-正向引物(5’-ATAAGAATGCGGCCGCAGCTGAGATTCCCCTCCATT-3’)(SEQIDNO：4)和NotI-反向引物(5’-ATAGTTTAGCGGCCGCCTTGATGCCAGCAGAAGTCA-3’)(SEQIDNO：5)通过对LNCaPcDNA进行PCR而对全长度的人类ERBB2编码序列进行扩增。
被利用NotI(新英格兰生物实验室，NewEnglandBiolabs)对经过扩增的PCR产物进行酶切，随后连接至以相同的限制性酶预先酶切的pCMV6-XL5(Origene公司)。通过采用正向引物5’-CAAATGGGCGGTAGGCGTGTA-3’(SEQIDNO：6)(定位于质粒)和反向引物5’-ATTGGTGGGCAGGTAGGTGAGTTC-3’(SEQIDNO：7)(对插入物的前端退火)的菌落PCR确定插入物的取向。对该构建体进行测序以证实整个编码序列的完整性。利用快速闪电定点突变试剂盒(QuikChangeLightningSite-DirectedMutagenesisKit)，对pCMV6-XL5-ERBB2进行所有定点突变和ERBB2基因中的敲除。这些构建体包括携带K753M突变(pCMV6-XL5-ERBB2/K753M)、敲除ErbB2ECD亚域1(pCMV6-XL5-ERBB2/delD1，敲除氨基酸1-195)、敲除ErbB2ECD亚域2(pCMV6-XL5-ERBB2/delD2，敲除氨基酸196-320)、敲除ErbB2ECD亚域3(pCMV6-XL5-ERBB2/delD3，敲除氨基酸321-488)和敲除ErbB2ECD亚域4(pCMV6-XL5-ERBB2/delD4，敲除氨基酸489-560)的ErbB2。对所有构建体进行测序以确保正确的突变/敲除。
蛋白质免疫印迹分析
采用标准技术制备细胞裂解物、测量蛋白浓度并进行蛋白质免疫印迹。利用Mem-PER真核生物膜蛋白提取试剂盒(ThermoScientific公司)制备细胞膜、细胞质部分或除去细胞膜的细胞裂解物。在分析前利用Centricon(Millipore公司)将细胞培养基浓缩20倍。在测量PEPD或NRG-1结合至ErbB2ECD、ErbB3ECD或ErbB4ECD的实验中，在凝胶电泳后，采用银染试剂盒(Invitrogen公司)展示蛋白质。为了检测ErbB2受体的二聚化，用冰冷的PBS对经过PEPD处理的细胞和对照细胞进行洗涤并在室温下与2mM的交联剂BS3(Pierce公司)孵育30分钟。通过加入50mM的Tris(终浓度，pH7.5)终止交联反应，随后在室温下孵育15分钟。通过蛋白质免疫印迹对细胞裂解物(3.5％SDS-PAGE)进行分析。采用非还原凝胶电泳以确定除野生型人类PEPD外是否存在作为同源二聚体的其任意突变体，其突变体包括G278D-PEPD、R184X-PEPD、R265X-PEPD和X265R-PEPD。简言之，在银染色之前，将各个蛋白样品与非还原性样品缓冲液(没有β-巯基乙醇的上样缓冲液)混合，然后用10％SDS-PAGE溶解。利用二辛可宁酸测定(BCA)试剂盒(Pierce公司)对所有试样的蛋白浓度进行测量。
免疫沉淀
将PEPD在37℃下与结合缓冲液中的ErbB2/ECD-Fc、ErbB3/ECD-Fc、ErbB4/ECD-Fc或Fc对PEPD孵育2小时，随后用蛋白质G-琼脂糖珠将其沉淀下来。免疫沉淀物用IP洗涤缓冲液进行洗涤并通过蛋白质免疫印迹进行分析。为了检测PEPD或NRG-1直接且特异性地结合至ErbB2、ErbB3或ErbB4，将重组人类PEPD或NRG-1与0.4ml的结合缓冲液中的重组人类ErbB2/ECD-Fc、重组人类ErbB3/ECD-Fc、重组人类ErbB4/ECD-Fc或重组人类Fc一起孵育。将所有溶液在37℃下孵育2小时，随后在室温下用蛋白质G-琼脂糖珠孵育1小时。用IP洗涤缓冲液对免疫沉淀物进行洗涤，然后进行蛋白质免疫印迹分析。在采用全细胞裂解物的实验中，将细胞裂解在补充有蛋白酶抑制剂混合物(RocheAppliedScience公司)的M-PER缓冲液中，并将该裂解物与特定抗体在4℃下孵育过夜，随后用蛋白G-琼脂糖将其沉淀下来。用IP洗涤缓冲液对免疫沉淀物进行洗涤并通过蛋白质免疫印迹进行分析。为了测量PEPD对PTEN酪氨酸磷酸化的影响，将细胞用30μM的过钒酸盐预处理10分钟以抑制相关的酪氨酸磷酸酶，然后用PEPD或溶剂进行处理，随后制备细胞裂解物用于分析。通过将10mM钒酸盐在室温下与10mM的过氧化氢孵育15分钟而新鲜制备过钒酸盐，随后加入终浓度为0.2mg/ml的过氧化氢酶(Sigma公司)以除去残留的过氧化氢。
基于ELISA测量PEPD和结合至ErbB2的PEPD
为了测量结合至人类ErbB2或其敲除突变体的PEPD，在4℃下用100μl/孔的10μg/ml的ErbB2抗体(结合至ErbB2的细胞质末端)对ELISA板进行包覆过夜。用PBST对孔洗涤三次后，通过在室温下用300μl/孔的PBS中的1％BSA孵育2h将孔中的剩余蛋白结合位点封闭。将60μl连续稀释的重组人类PEPD加入至各孔后，将每个样品含有25μg总蛋白(注意：采用用每个样品高达250μg总蛋白的初步试验显示了PEPD结合至ErbB2的相似结果)的60μl细胞裂解物(由用空白载体转染24h的CHO-K1细胞和用野生型ErbB2转染24小时的CHO-K1细胞制得)加入到每个孔中，并在37℃下培养2小时。用PBST洗涤三次后，将100μl生物素结合的抗His抗体(1∶10000稀释；需注意的是PEPD是His-标记的)加入到各个孔中，并在室温下培养2小时。在用PBST进行另一轮洗涤后，将100μl链霉亲和素-结合的HRP(1∶10000稀释)加入到各个孔中，并在室温下培养45分钟。在用PBST进行另一轮洗涤后，加入100μl/孔的1×底物溶液(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)，并且在充分显色后，加入100μl/孔的终止溶液(1NH2SO4)并记录450nm的吸光度读数。在对结合至野生型ErbB2的PEPD和其敲除突变体(敲除ErbB2ECD中的亚域1、2、3或4)进行比较的实验中，采用等量的野生型ErbB2蛋白及其突变体。首先对转染有表达各个蛋白的质粒(24h)的细胞裂解物进行蛋白质免疫印迹分析，然后对归一化至上样对照的特定蛋白谱带进行光密度测量，以计算传递等量的各蛋白的裂解物的量(对携带野生型ErbB2的裂解物，每个样品采用25μg的总蛋白)。
通过ELISA测量PEPD浓度
为了测量PEPD的浓度，用100μl/孔的稀释的抗PEPD小鼠单克隆抗体(2.5μg/m1)对96孔ELISA板在4℃下进行包覆过夜。然后用具有Tween20(PBST)的磷酸缓冲盐水对板洗涤三次，并用200μl/孔的封闭缓冲液进行封闭(在室温下孵育至少2小时)。用PBST对板进行洗涤，然后在室温下用适当稀释的100μl/孔的PEPD标准品或样品孵育2小时。用PBST对板洗涤三次，然后将各个孔与100μl的检测抗体(抗PEPD兔多克隆抗体)在室温下孵育2小时。在用PBST对板洗涤三次后，向各个孔中加入100μl二级试剂(山羊-抗-兔IgG-HRP)，然后在室温下培养1小时。再用PBST对板洗涤三次，然后将各个孔与100μl的HRP底物溶液(来自CellSignaling公司的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，#7004)进行培养。充分显色后，向各个孔中加入100μl的终止溶液(CellSignaling公司，#7002)，并通过微量滴定板读数器记录450nm处的吸光度。采用纯PEPD作为标准品。
免疫荧光染色和共聚焦显微镜检测
使细胞在室玻片(chamberslides，1.5×104细胞/孔)中生长过夜，随后用PEPD或溶剂进行处理。然后用冰冷的PBS对细胞进行洗涤，用4％多聚甲醛在室温下固定15分钟，再用冰冷的PBS洗涤，并在PBS中用1％的BSA在室温下封闭45分钟。然后将细胞与ErbB2抗体在室温下孵育1小时，用PBS进行洗涤，用FITC结合的His-标记抗体(用于检测PEPD)和TRITC结合的二抗(用于检测ErbB2)在室温下孵育1小时，并再次用PBS洗涤。然后用ZeissLSM510共焦显微镜对细胞进行检查。
RT-PCR
利用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen公司)分离总RNA，并在用TURBODNase进行处理以除去潜在的基因组DNA污染后，采用TaqMan反转录试剂(Invitrogen公司)将各个样品的500ngRNA在25μl反应中反转录成cDNA。RT反应在25℃进行10分钟，随后在48℃下加热30分钟，然后在95℃下加热5分钟。各PCR扩增在含有10μlGoTaqMasterMix(2×)(Promega公司)、0.5至1μl反转录混合物(cDNA)、各0.25μM的特异性正向和反向引物对的20μl的体积中进行。该引物对如下：人类ERBB2，正向，5’-CTGTTTGCCGTGCCACCCTGAGT-3’(SEQIDNO：8)，反向，5’-CTTCTGCTGCCGTCGCTTGATGAG-3’(SEQIDNO：9)；人类GAPDH，正向，5’-CCAGGGCTGCTTTTAACTC-3’(SEQIDNO：10)，反向，5’-GCTCCCCCCTGCAAATGA-3’(SEQIDNO：11)；中国仓鼠GAPDH，正向，5’-TGGAATCTACTGGCGTCTTC-3’(SEQIDNO：12)，反向，5’-CACCACCTTCTTGATGTCCT-3’(SEQIDNO：13)。用于所有反应的PCR条件如下：94℃下进行3分钟；28个循环(人类ERBB2)/25个循环(GAPDH)的在94℃(变性)进行30秒，63℃(人类ERBB2)/60℃(人类GAPDH)/56℃(中国仓鼠GAPDH)(退火)进行30秒，以及72℃下进行30秒(延长)；最终延长在72℃进行5分钟。PCR产物用1％琼脂糖凝胶的电泳进行分析，用溴化乙锭进行染色，且在UV光下是可视化的。
BrdU试验
利用FITCBrdU流动试剂盒(BDPharmingen公司)对BrdU掺入进DNA进行测定。简言之，使细胞在6孔板中过夜生长(对于CHO-K1细胞和CHO-K1/ErbB2细胞为0.15×106个细胞/孔，对BT-474细胞为0.4×106个细胞/孔；2ml培养基/孔)，用溶剂或PEPD处理48小时，然后与培养基中的10μMBrdU孵育30分钟(CHO-K1细胞和CHO-K1/ErbB2细胞)或18小时(BT-474细胞)。然后将细胞收集、固定和渗透在固定/透化缓冲液、，在37℃下用NDase处理1小时，并在室温下用BrdU抗体孵育20分钟，然后用7-氨基-放线菌素D进行DNA染色。将经过染色的细胞重悬浮于每个样品0.5至1ml的染色缓冲液中，并通过流式细胞仪(BDFACSCalibur，BDBiosciences公司)进行分析，每个样品计数10000个细胞。使用WinMDI2.8软件对BrdU掺入进行建模。
软琼脂菌落形成试验
在培养基中1ml的0.8％超纯诺布尔琼脂(USB，目录#10907)在6孔板的各个孔固化后，在37℃下将1ml悬浮于培养基中的0.4％琼脂中的细胞(2×104个BT-474细胞，1×103个CHO-K1细胞或1×103个CHO-K1/ErbB2细胞)加入各个孔中，其随后也固化。然后将2ml培养基中的PEPD或载体加入各个孔，总共21天中每3-4天进行更换。在该处理结束时，通过ImageJ的辅助，在解剖显微镜(Axiovert40CFL，CarlZeiss公司)下对每个孔的10个不同区域(放大10倍)中直径≥100μm的细胞菌落进行计数。
细胞侵袭和迁移试验
使用BDBioCoat基质胶侵袭室(BDBiosciences公司)对细胞侵袭和迁移进行测定。简言之，下腔室填充有具有10％FBS的0.75ml培养基，且上腔室中放置有悬浮于0.5ml的含有溶剂或PEPD的无血清培养基中的4×104个细胞。在37℃下将该腔室放置在细胞培养箱中48小时。在培养结束时，用100％甲醇对侵入包覆在放置于侵入室底部的滤器芯上的基质胶基体层的细胞进行固定，用0.5％结晶紫染色，并通过ImageJ的辅助，在显微镜(Eclipse50i)下，对每个过滤器的10个不同区域(放大20倍)中的细胞进行计数。
PI3激酶试验
采用PI3激酶活性ELISA试剂盒(Echelon，K-1000)。简言之，使用PI3K抗体(抗PI3Kp85)将PI3K从全细胞裂解物(每个样品由约1×106个细胞制备)中沉淀出来，并将免疫沉淀物与30μl的KBZ反应缓冲液混合，然后将其与30μl的10μM的PI(4，5)P2底物进行混合，随后在37℃下孵育2小时。通过向各个反应溶液加入90μl的激酶终止溶液而终止激酶反应，并将60μl的各终止的激酶反应溶液与60μl的PIP3探测物一起转移至培养板中的各个孔。在室温孵育60分钟后，将各样品中的100μl从培养板转移至检测板的相应孔中，并在室温下孵育60分钟。用TBST对板进行洗涤，然后用HRP结合的二级检测物孵育30分钟，随后用TBST洗涤，并且采用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺作为底物通过标准比色测定法对固定化的HRP进行测量。
Src激酶试验
利用通用的酪氨酸激酶测定试剂盒(TaKaRa，#MK410)对细胞裂解物中的Src活性进行测量。简言之，在用Src抗体进行IP之前，用蛋白A琼脂糖珠对裂解物(每个样品由约1×106个细胞制备)进行预清理。对免疫沉淀物进行洗涤并与150μl激酶反应溶液中的10mMβ-巯基乙醇进行孵育。将各个样品(40μl)与10μl的40mMATP-2Na溶液进行混合，将其转移至包覆有PTK底物的微量滴定板的孔中，随后在37℃下孵育30分钟。在用TBST进行洗涤后，向各孔中加入HRP结合的抗磷酸酪氨酸(PY20)溶液，并在37℃下孵育30分钟。在用TBST进行的另一轮洗涤之后，采用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺作为底物通过标准比色测定法对固定化的HRP进行测量。
MTT细胞增殖试验
使细胞在96孔板中过夜生长(每孔500个CHO-K1细胞或CHO-K1/ErbB2细胞，每孔2000个BT-474细胞；每孔150μl培养基)，然后每孔用200μl培养基中的溶剂、PEPD、G278D-PEPD或曲妥珠单抗处理72小时，随后在37℃下与MTT(培养基中9.2mM)孵育3小时。然后用PBS对细胞进行洗涤并与二甲基亚砜(每孔150μl)混合，并通过分光镜测量570nm处MTT还原为甲瓒来确定细胞密度。
统计分析
学生t检验和ANOVA分别用于两组对比和多组对比。所有检验都是双侧的，并以0.05的名义显著性水平进行，即认为0.05或更低的P值是统计学显著性的。
虽然已经通过示例性实施例对本发明进行了描述，而常规修改对本领域技术人员而言是明显的，这些修改都应处于本发明的范围之内。
Claims (16)
1.一种用于预防和/或治疗ErbB2-阳性癌症的药物制剂，包括分离的或重组产生的肽酶D(PEPD)和至少一种药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述PEPD为融合蛋白的组分。
3.根据权利要求2所述的药物制剂，其中所述融合蛋白包括所述PEPD和多组氨酸标签。
4.根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述PEPD与化疗剂结合。
5.根据权利要求2所述的药物制剂，其中所述融合蛋白包括所述PEPD和免疫球蛋白的Fc区域。
6.根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述PEPD具有比包括SEQIDNO:1序列的PEPD低的二肽水解活性。
7.根据权利要求6所述的药物制剂，其中所述PEPD包括在SEQIDNO:1的278位点上甘氨酸的突变。
8.根据权利要求1所述的药物制剂，还包括凝血抑制剂。
9.一种用于预防和/或治疗个体中ErbB2-阳性癌症的方法，包括向所述个体给药有效量的包括肽酶D(PEPD)的组合物以抑制所述ErbB2-阳性癌症的生长。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述PEPD具有比包括SEQIDNO:1序列的PEPD低的二肽水解活性。
11.根据权利要求9所述的方法，还包括向所述个体给药凝血抑制剂。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述PEPD为融合蛋白的组分。
13.根据权利要求10所述的方法，其中将所述PEPD与化疗剂结合。
14.一种用于预防和/或治疗ErbB2-阳性癌症的产品，包括至少一种含有包括肽酶D(PEPD)的药物制剂的密闭容器，其中所述产品包括提供所述药物制剂是用于预防和/或治疗个体中ErbB2-阳性癌症的指示的印刷材料。
15.根据权利要求14所述的产品，其中所述PEPD具有比包括SEQIDNO:1序列的PEPD低的二肽水解活性。
16.根据权利要求14所述的产品，还包括凝血抑制剂，和/或所述药物制剂是用于和凝血抑制剂一起使用的指示。
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