ES2711558T3

ES2711558T3 - Método de prevención y/o tratamiento de cánceres ErbB2-positivos

Info

Publication number: ES2711558T3
Application number: ES14839306T
Authority: ES
Inventors: Yuesheng Zhang; Lu Yang; Yun Li
Original assignee: Health Research Inc
Current assignee: Health Research Inc
Priority date: 2013-08-26
Filing date: 2014-08-20
Publication date: 2019-05-06
Anticipated expiration: 2034-08-20
Also published as: JP6353052B2; US10155028B2; CN105682678B; CA2922570A1; US11103563B2; EP3038645B1; US20160199462A1; CN105682678A; EP3038645A1; US20190111117A1; JP2016529295A; US20210369820A1; EP3038645A4; CN111000988A; WO2015031119A1

Abstract

Una preparación farmacéutica para usar en la terapia del cáncer ErbB2-positivo, donde la preparación comprende una peptidasa D (PEPD) aislada o producida de forma recombinante y al menos un portador farmacéuticamente aceptable.

Description

DESCRIPCION

Metodo de prevencion y/o tratamiento de canceres ErbB2-positivos

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS.

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud U.S. N.° 61/870.054 presentada el 26 agosto de 2013. DECLARACION RELACIONADA CON LA INVESTIGACION PATROCINADA POR EL GOBIERNO FEDERAL

La presente invencion fue realizada con respaldo gubernamental bajo los contratos N.° R01CA120533, R01CA124627 y R01CA164574 otorgados por el National Cancer Institute. El Gobierno tiene determinados derechos sobre la invencion.

CAMPO DE LA DIVULGACION

La presente invencion se refiere en general al campo de la salud humana, y en particular a metodos para la prevencion y el tratamiento de canceres y/o de otras afecciones que estan correlacionadas positivamente con la expresion de ErbB2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El ErbB2, tambien conocido como homologo 2 del oncogen viral de la leucemia eritroblastica aviar v-erb-b2 aviar, Her2, Neu, CD340, protooncogen C-ErbB2, es un miembro de la familia ampliamente investigada de las tirosina quinasas receptoras unidas a membrana plasmatica que tambien incluye ErbB1, ErbB3 y ErbB4 (tambien conocidos como EGFR/Her1, Her3 y Her4, respectivamente). Se ha demostrado que estos receptores desempenan papeles cnticos en el desarrollo embrionario, la fisiologfa normal y en el desarrollo de varias enfermedades. Los cuatro receptores ErbB contienen un dominio extracelular (ECD, extracellular domain), un dominio transmembrana y un dominio intracelular que interactua con las moleculas de senalizacion. La union del ligando a los ECD de estos receptores conduce a una homo- o heterodimerizacion, seguida de la activacion de la protema tirosina quinasa intrmseca y la autofosforilacion de tirosina en el dominio intracelular, y el reclutamiento y la activacion de protemas de senalizacion en estos sitios. En particular, el ErbB3 presenta un deterioro de quinasa y requiere una heterodimerizacion para su activacion. Hasta la fecha, aunque se han identificado multiples ligandos para ErbB1, ErbB3 y ErbB4, no se ha encontrado ningun ligando para ErbB2 desde su descubrimiento hace casi 30 anos (Coussens et al. Science 1985; 230: 1132-1139; Schechter et al., Science 1985; 229: 976-978). Sin embargo, el ErbB2 es un companero de dimerizacion preferido para otros ErbB unidos a ligandos.

El ErbB2 es mejor conocido por su participacion en el cancer de mama humano. La amplificacion del gen ErbB2 ocurre en el 20-30% de los canceres de mama y esta significativamente correlacionada con la expresion de la protema ErbB2 en los tejidos cancerosos. La amplificacion del gen ErbB2 o la sobreexpresion de protemas es un fuerte predictor del mal pronostico de la enfermedad. Las terapias dirigidas a ErbB2, particularmente el anticuerpo monoclonal humanizado trastuzumab, en combinacion con la quimioterapia, muestran una considerable eficacia clmica. Sin embargo, muchos canceres ErbB2-positivos muestran una resistencia de novo o una resistencia adquirida a dicha terapia. Por lo tanto, existe una necesidad continua e insatisfecha de identificar un ligando de ErbB2 y de desarrollar enfoques terapeuticos basados, al menos en parte, en un ligando tal. La presente divulgacion satisface esas necesidades.

RESUMEN DE LA DIVULGACION

La presente divulgacion proporciona composiciones y metodos utiles para la prevencion y/o la terapia de canceres ErbB2-positivos. Las composiciones y los metodos se refieren al presente descubrimiento de que la prolidasa es un ligando del receptor de ErbB2. Ademas, se cree que esta divulgacion es la primera descripcion de cualquier ligando de ErbB2.

La prolidasa, tambien conocida como peptidasa D (PEPD), dipeptidasa Xaa-Pro o prolina dipeptidasa o imidodipeptidasa, es una proteasa que hidroliza los dipeptidos con prolina o hidroxiprolina en el terminal carboxi. La PEPD es una protema citosolica expresada de forma ubicua y existe como un homodfmero (peso molecular monomerico de la PEPD humana: 54 kD; 493 aminoacidos, como se muestra en la SEQ ID NO: 1, que proporciona la secuencia de aminoacidos de la prolidasa humana). En realizaciones, la PEPD que se usa para las composiciones y metodos de la presente divulgacion es una PEPD de mairnfero. En una realizacion, la PEP^des PEPD humana. En realizaciones, la PEPD puede ser enzimaticamente activa o tener una actividad enzimatica reducida o no detectable. Las composiciones comprenden preparaciones farmaceuticas que contienen una PEPD aislada y/o purificada o PEPD recombinante y/o modificada, y pueden comprender ademas agentes adicionales, tales como un inhibidor de la coagulacion. En realizaciones, la PEPD esta modificada. En realizaciones, la PEPD es un componente de una protema de fusion. En realizaciones, la protema de fusion comprende la PEPD y una secuencia de aminoacidos util para la purificacion de PEPD producida de forma recombinante.

Aunque no es el objeto de la invencion reivindicada, los metodos comprenden administrar a un individuo que necesita prevencion y/o terapia de un cancer ErbB2-positivo una composicion que comprende una PEPD de esta divulgacion, y pueden comprender ademas administrar al individuo un inhibidor de la coagulacion. Tambien se describen metodos para identificar individuos que necesiten un tratamiento con formulaciones de PEPD y metodos para generar un protocolo de tratamiento para dichos individuos.

La divulgacion proporciona, ademas, productos que comprenden preparaciones farmaceuticas que contienen una PEPD aislada y/o purificada o una PEPD recombinante, y que tambien pueden contener material impreso que describe el uso de las preparaciones para la prevencion y/o la terapia de los canceres ErbB2-positivos. En realizaciones, los productos tambien contienen un inhibidor de la coagulacion. En realizaciones no limitantes, los canceres ErbB2-positivos son canceres de mama, de ovario, de estomago o formas agresivas de cancer uterino, como el carcinoma de endometrio seroso uterino. En realizaciones, las celulas cancerosas ErbB2-positivas son celulas cancerosas que sobreexpresan ErbB2 o portan un numero de copias mas elevado del gen ErbB2 en relacion con una celula no cancerosa. En realizaciones, las celulas cancerosas ErbB2-positivas son celulas que expresan mas ErbB2 que una referencia, como una celula del mismo tipo que no es cancerosa.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Datos que demuestran que la PEPD se une al subdominio 3 de ErbB2 ECD y promueve rapidamente la dimerizacion de ErbB2, (a) PEPD a 0,04 |^jM (+), 0,2 |^jM (++) o 1 |^jM (+++) se incubo con ErbB2/ECD-Fc (0,04 |^jM), ErbB3/ECD-Fc (0,04 jiM), ErbB4/ECD-Fc (0,04 jiM) o Fc (0,04 jiM), se redujo con la protema G-sefarosa, se separo mediante SDS-Pa GE, y se tino con plata. (b) Unas celulas CHO-K1 fueron transfectadas con pCMV6-XL5-ERBB2 o con el vector vado; 24 horas despues, se prepararon lisatos celulares y se analizaron por electrotransferencia. En este caso, se utilizo gliceraldeddo 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y, en otra parte, como un control de carga, (c) union de PEPD a ErbB2, medida mediante ELISA (n=3), utilizandose lisatos celulares de b; la misma cantidad de lisatos para todas las muestras (25 jig de protema por muestra). Las barras de error indican DE. (d) ErbB2 y sus mutantes; todas las transfecciones de genes utilizaron la misma cantidad de ADN y duraron 24 h. Los lisatos celulares fueron analizados por electrotransferencia. (e) Union de PEPD a ErbB2 y sus mutantes, medida mediante ELISA (n=3), utilizando lisatos celulares de d y una cantidad igual de ErbB2 o sus mutantes. Las barras de error indican DE. (f) Las celulas CHO-K1 que de manera estable sobreexpresan ErbB2 (celulas CHO-K1/ErbB2) fueron tratadas con PEPD. Las celulas tratadas con PEPD y las celulas de control fueron tratadas seguidamente con el reticulante bis(sulfosuccimidil)suberato (BS3) (2 mM, 30 min). Los lisatos celulares fueron analizados por electrotransferencia utilizando un anticuerpo de ErbB2.

Figura 2. Datos que muestran la activacion y el agotamiento de ErbB2 mediante PEPD. (a-c) Las celulas fueron tratadas con PEPD o vedculo; los lisatos celulares fueron analizados por electrotransferencia. (d) Las celulas fueron tratadas con o sin PEPD (270 nM), utilizando acido 4-aminofenilmercurico (APMA) (1 mM) con control positivo. Los lisatos celulares y los medios fueron analizados por electrotransferencia. (e) Las celulas fueron tratadas con o sin PEPD (2,7 nM, 6 h), de las que se aislo el ARN para la RT-PCR. Se utilizo GAPDH como control. (f) Las celulas fueron tratadas con o sin PEPD (270 nM), seguido por tincion de inmunofluorescencia de ErbB2 y PEPD y microscopia confocal. Barra de la escala: 10 ^jM. (g) Las celulas fueron transfectadas con ubiquitina (pMT107-His-Ub) y 24 horas despues se trataron con o sin Pe p D (2,7 nM, 0,5 h). Los lisatos celulares fueron sometidos a incubacion con un anticuerpo de ErbB2, reducidos con protema G-agarosa y analizados por electrotransferencia.

Figura 3. Datos que demuestran que la PEPD activa directamente el ErbB2, que su funcion de dipeptidasa no esta implicada. (a) Las celulas CHO-K1 fueron transfectadas con ErbB2 o con una mutante (todas ellas llevadas por pCMV6-XL5) y 24 horas despues, tratadas con vedculo o con PEPD. Los lisatos celulares fueron analizados por electrotransferencia. (b) Las celulas CHO-K1 fueron transfectadas con ErbB2 y 24 horas despues, tratadas con vedculo, PEPD o sus mutantes. Mayor informacion acerca de las mutantes se proporciona en la Figura 10. Los lisatos celulares fueron analizados por electrotransferencia.

Figura 4. Datos que muestran la falta de efecto de PEPD intracelular sobre ErbB2, pero se libera PEPD de la celula.

(a) Las celulas fueron transfectadas con un plasmido que expresa PEPD humana (pCMV6-XL5-PEPD) o con el vector vado durante 24 h. Los lisatos celulares fueron analizadas por electrotransferencia. (b) Unas celulas fueron transfectadas con PEPD humana o con el vector vado; 24 horas despues, las celulas fueron lavadas y cultivadas en medio fresco (~1x106 celulas/2 ml de medio) durante otras 24 h, seguido por la recoleccion tanto de celulas como del medio. Los niveles de PEPD en los lisatos celulares fueron medidos por electrotransferencia, y la concentracion de PEPD en el medio se midio mediante ELISA (n=3). Las barras de error indican DE.

Figura 5. Datos que muestran que la PEPD silencia la senalizacion de ErbB2-Src. (a, b) Unas celulas fueron tratadas con solvente o PEPD (2,7 nM). Los lisatos celulares fueron analizados por electrotransferencia. (c) Unas celulas fueron tratadas con o sin PEPD (2,7 nM, 0,5 h). Los lisatos celulares fueron sometidos a incubacion con un anticuerpo de ErbB2, reducidos con protema G-agarosa, y analizados por electrotransferencia. (d) Unas celulas fueron tratadas con o sin PEPD (2,7 nM) y seguidamente se midio la actividad de la Src quinasa y la actividad de la PI3K en los lisatos celulares (n=3). Las barras de error indican DE. (e) Unas celulas fueron tratadas con o sin PEPD (2,7 nM). Los lisatos celulares fueron analizadas por electrotransferencia. (f) Unas celulas fueron tratadas con pervanadato (30 pM, 10 min) y a continuacion con o sin PEPD (2,7 nM, 0,5 h). Los lisatos celulares fueron sometidos a incubacion mediante un anticuerpo de PTEN, reducidos con protema G-agarosa, y analizados por electrotransferencia. (g) Unas celulas fueron tratadas con solvente o con PEPD (2,7 nM, 1 h); se prepararon la fraccion citosolica y la fraccion de membrana y se las analizo por electrotransferencia. Tanto el GAPDH como el pro-TGFa se utilizaron como controles de carga.

Figura 6. Grafico que muestra el paradigma de la modulacion de ErbB2 por PEPD, y datos que muestran la inhibicion selectiva de celulas que sobreexpresan ErbB2 mediante PEPD. (a) Tanto los monomeros como los dfmeros fosforilados con tirosina existen en celulas que sobreexpresan ErbB2. La PEPD se une a ErbB2 como un homodfmero; cada subunidad de PEPD se une a un ErbB2 ECD subdominio 3. La PEPD se une rapidamente a los dfmeros ErbB2, silenciando la senalizacion de ErbB2 por el hecho de causar la disociacion de Src respecto de ErbB2. La PEPD se une a los monomeros de ErbB2 un tanto lentamente, pero causa la dimerizacion y fosforilacion de ErbB2, lo que conduce a la activacion de la senalizacion corriente abajo. La PEPD tambien ocasiona un agotamiento fuerte y persistente de ErbB2 resultante de la internalizacion y degradacion del ErbB2 inducidas por PEPD. (b) Unas celulas que credan en placas de 6 cavidades fueron tratadas con vedculo o PEPD durante 48 h y a continuacion se midio la smtesis de ADN mediante la incorporacion de BrdU. (c) Unas celulas que credan en agar blando en placas de 6 cavidades fueron tratadas con vedculo o con PEPD durante 21 dfas (con un cambio de medio cada 3-4 dfas) y seguidamente se examinaron para establecer la formacion de colonias. (d) Unas celulas que credan en camaras de invasion fueron tratadas con vedculo o con PEPD durante 48 horas; se contaron las celulas que hadan invadido a traves de una membrana de Matrigel. Las barras de error en b-d indican DE (n=3).

Figura 7. Datos que muestran la union de la neurregulina-1 (NRG-1) a los ECD de ErbB3 y ErbB4. NRG-1 a 0,2 pM se incubo con Fc (0,04 pM), ErbB3/ECD-Fc (0,04 pM) o ErbB4/ECD-Fc (0,04 pM), se redujo con protema G-sefarosa, se separo mediante SDS-PAGE (15%) y se tino con plata. Esto demuestra que tanto ErbB3/ECD-Fc como ErbB4/ECD-Fc eran biologicamente funcionales con respecto a los resultados mostrados en la Figura 1.

Figura 8. Datos que muestran la validacion de una lmea celular utilizada en la presente divulgacion, y la falta de union de PEPD con las regiones transmembrana e intracelular de ErbB2 humano. (a) Unas celulas CHO-K1 fueron transfectadas transitoriamente con un plasmido que expresaba ErbB2 (pCMV6-XL5-ERBB2) o con el plasmido vado durante 24 horas. Unas celulas de cancer humano RT-4 y unas celulas de cancer de mama humano MCF-7 quedaron sin tratar y fueron utilizadas como controles positivos para ErbB1, ErbB3 y ErbB4. Los lisatos celulares fueron analizados por electrotransferencia. GAPDH es un control de carga. (b) Unas celulas de CHO-K1 que expresaban establemente ErbB2 (celulas CHO-K1/ErbB2) fueron tratadas con Ap MA 1 mM durante 0,25 h. Los lisatos celulares fueron seguidamente preparados y analizados por electrotransferencia (el primer carril a la derecha). Los mismos lisatos celulares fueron mezclados con 1 pM de PEPD, que fueron sometidos luego a incubacion junto con un anticuerpo de PEPD o con una IgG de isotipo concordante, reducidos con protema G-agarosa, y analizados por electrotransferencia. El resultado muestra que APMA causa la escision de ErbB2 ECD, como se prevefa, generandose el fragmento p95 (menos ECD), pero la PEPD solamente se coprecipita con el ErbB2 intacto, no el fragmento de p95, lo que indica que la PEPD no se une a las regiones transmembrana o intracelular de ErbB2.

Figura 9. No se observan efectos del factor de crecimiento epidermico (EGF, epidermal growth factor) y del NRG-1 sobre el ErbB2. (a, b) Unas celulas CHO-K1 que de manera estable sobreexpresaban ErbB2 humano (celulas CHO-K1/ErbB2) fueron tratadas con EGF recombinante o NRG-1 recombinante. Los lisatos celulares se prepararon seguidamente y se analizaron por electrotransferencia. (c, d) Con el fin de garantizar que tanto el EGF (ligando de ErbB1) como el NRG-1 (ligando de ErbB3 y ErbB4) que se utilizaron en nuestros experimentos fueran bioactivos, se los evaluo en celulas BT-474, que expresaban niveles relativamente bajos de ErbB1 y ErbB3. Como se prevefa, el EGF estimulo significativamente la fosforilacion de ErbB1, y el NRG-1 estimulo significativamente la fosforilacion de ErbB3.

Figura 10. Datos que muestran la configuracion de PEPD humana y de sus mutantes, (a) PEPD humana de tipo salvaje y cambios de aminoacidos (aa) en sus mutantes. (b) PEPD humana recombinante de tipo salvaje y sus mutantes se generaron en bacterias, se purificaron utilizando cromatograffa por afinidad de mquel y se analizaron mediante SDS-PAGE no reductor y tincion con plata. Observacion: la carga de protemas vana a lo largo de los carriles. En el carril indicado por "WT-PEPD pME", la PEPD de tipo salvaje se incubo con p-mercaptoetanol al 10% en PBS antes de la electroforesis no reductora en gel.

Figura 11. Datos que muestran la distribucion de ErbB2 en las celulas. La fraccion de membrana y los lisatos menos la membrana se prepararon a partir de celulas CHO-K1 que sobreexpresaban establemente ErbB2 humano (celulas CHO-K1/ErbB2) o se transfectaron de forma transitoria con ErbB2 (pCMV6-XL5-ERBB2) durante 24 h, y se analizaron por electrotransferencia. GAPDH y pro-TGF-a se utilizaron como controles de carga. Notablemente, en los experimentos descritos anteriormente (ver Figura 3), la PEPD o su mutante G278D no causaron una disminucion en el nivel de protema ErbB2, mientras que la PEPD causo un pronunciado agotamiento de ErbB2 en las celulas que de manera estable o constitutivamente sobreexpresan ErbB2 (ver las Figuras 2a y 2c). Encontramos que, en las celulas CHO-K1 que sobreexpresaban transitoriamente ErbB2, la mayona de las moleculas de ErbB2 residen intracelularmente, mientras que en las celulas CHO-K1 que sobreexpresan ErbB2 de forma estable, la mayona de las moleculas de ErbB2 se expresaban en la superficie celular, como se muestra aqrn. Esto explica por que el tratamiento con PEPD durante 3 h no causo una disminucion clara de la protema ErbB2 en las celulas que sobreexpresaban transitoriamente ErbB2 (ver la Figura 3).

Figura 12. Datos que muestran que la induccion de la fosforilacion de ERK por PEPD en celulas CHO-K1 depende de ErbB2. Unas celulas CHO-K1 se transfectaron de forma transitoria con ErbB2 humano de tipo salvaje o con un mutante muerto en quinasa (ErbB2/K753M) durante 24 horas y luego se trataron con PEPD o vehmulo, seguido de electrotransferencia.

Figura 13. Datos que muestran los efectos inhibidores del crecimiento de la PEPD, G278D-PEPD y trastuzumab sobre celulas con o sin sobreexpresion de ErbB2. Unas celulas se cultivaron en placas de 96 cavidades (a razon de 500 celulas CHO-K1 o de celulas CHO-K1/ErbB2 por pocillo o 2.000 celulas BT-474 por pocillo; 150 pL de medio por pocillo) durante la noche y luego se trataron con vehmulo, PEPD, G278D-PEPD o trastuzumab en 200 pL de medio por pocillo durante 72 h, seguido de incubacion con bromuro de metiltiazolildifenil-tetrazolio (MTT) (9,2 mM en medio) a 37 °C durante 3 h. Despues de remover el medio, las celulas fueron tratadas con dimetilsulfoxido (150 pL por pocillo), y la densidad celular se determino midiendo el formazano formado a partir de MTT espectroscopicamente a 570 nm (n = 3). Las barras de error indican DE.

Figura 14. Datos que muestran el impacto de un inhibidor de la coagulacion de la sangre sobre los niveles plasmaticos de PEPD. (a) Se administro PEPD humana recombinante a ratones mediante inyeccion intraperitoneal a razon de 0,2 mg/kg de peso corporal o a razon de 10 mg/kg; los ratones fueron sacrificados a las 1, 6 o 24 h despues de la dosificacion de PEPd , y el nivel plasmatico de PEPD se midio por ELISA junto con el de los ratones de control. (b) Enoxaparina (EP), un inhibidor de la coagulacion de la sangre, se administro a ratones mediante inyeccion intraperitoneal a razon de 2,5 mg/kg una vez por dfa; 1 h despues de la cuarta dosis de EP, se administro PEPD a los ratones mediante inyeccion intraperitoneal a razon de 0,2 mg/kg; los ratones fueron sacrificados 1 o 24 h despues de la dosificacion de PEPD, y el nivel de PEPD en plasma se midio por ELISA junto con el de los ratones de control. Cada valor es un valor medio ± DE. El resultado muestra que la EP ayuda a elevar el nivel de PEPD en por lo menos 50 veces.

Figura 15. Datos que muestran los efectos de la PEPD y del inhibidor de coagulacion EP in vivo. Unas celulas CHO-K1/ErbB2 fueron inoculadas por via subcutanea en los flancos de ratones atfmicos hembras (de 6-7 semanas de edad) a razon de 1 x 106 celulas por sitio en un pequeno volumen de mezcla de PBS:Matrigel. Comenzando 4 dfas despues de la inoculacion celular, se administro a los ratones un vehmulo o una enoxaparina (EP) a razon de 2,5 mg/kg mediante inyeccion intraperitoneal una vez por dfa. Despues de 3 dfas de tratamiento con EP (dfa 7 despues de la inoculacion celular), cuando el volumen del tumor llego a aproximadamente 41 mm3, un subconjunto de ratones tratados con EP tambien se trato con PEPD a razon de 0,02 mg/kg o de 0,2 mg/kg por inyeccion intraperitoneal, que se administro tres veces por semana (lunes, miercoles y viernes). En los dfas en que se administraron tanto EP como PEPD, se administro PEPD 1 h despues de EP. El volumen de los tumores se midio tres veces por semana (lunes, miercoles y viernes). Los ratones fueron sacrificados 24 h despues del ultimo tratamiento (en el dfa 24 despues de la inoculacion celular, un total de 8 tratamientos con PEPD), y se tomaron muestras de sangre de los ratones para medir el nivel plasmatico de PEPD mediante un ensayo ELISA. (a) Cada valor es una media ± SEM (n = 8-11). (b) Cada valor es una media ± DE (n = 3). La PEPD inhibio fuertemente el crecimiento de los tumores, pero la EP no tuvo efecto.

Figura 16. Datos que muestran los efectos de la PEPD y del inhibidor de la coagulacion EP in vivo. Unas celulas CHO-K1 se inocularon por via subcutanea en los flancos de ratones atfmicos hembras desnudos (de 6-7 semanas de edad) a razon de 1 x 106 celulas por sitio en un pequeno volumen de mezcla de PBS:Matrigel. Comenzando 4 dfas despues de la inoculacion celular, los ratones fueron tratados con EP a razon de 2,5 mg/kg por inyeccion intraperitoneal una vez por dfa. Tres dfas despues ^ a 7 despues de la inoculacion celular), cuando el volumen de los tumores alcanzo aproximadamente 26 mm3, los ratones tambien fueron tratados con vetnculo o con PEPD a razon de 0,2 mg/kg por inyeccion intraperitoneal, que se administro tres veces por semana (lunes, miercoles, viernes). En los dfas en que se administraron tanto EP como PEPD/vetnculo, se administro PEPD/vetnculo 1 h despues de EP. El volumen del tumor se midio tres veces por semana (lunes, miercoles y viernes). Los ratones fueron sacrificados 24 h despues del ultimo tratamiento que se administro en el dfa 21 despues de la inoculacion celular (un total de 7 tratamientos con PEPD), y se recogieron muestras de sangre de los ratones para medir el nivel plasmatico de PEPD. (a) Cada valor es una media ± SEM (n = 8-11). (b) Cada valor es la media ± DE (n = 3). Esto muestra que la PEPD no se dirige a tumores sin sobreexpresion de ErbB2. Notablemente, estas celulas tumorales no expresan ErbB1, ErbB3 o ErbB4, como se muestra en la Figura 8a.

Figura 17. Datos que muestran una fuerte inhibicion de los tumores mamarios ortotopicos por PEPD, pero una inhibicion mas fuerte de los tumores por PEPD enzimaticamente inactiva (PEPDG278D). A unos ratones desnudos atfmicos hembras (de 6-7 semanas de edad) se les implanto a cada uno por via subcutanea (en la espalda) un pellet de liberacion de 60 dfas de 17p-estrodiol (1,7 mg de estradiol), antes de la inoculacion ortotopica de celulas de cancer de mama BT-474 en las almohadillas de grasa mamarias (a razon de 2 x 106 celulas por sitio en un pequeno volumen de mezcla de PBS:Matrigel). (a) Grafico del tamano del tumor a lo largo de dfas de crecimiento. Se administro EP (a razon de 0,5 mg/kg) diariamente mediante inyeccion intraperitoneal. En particular, EP a esta dosis fue tan efectiva como 2,5 mg/kg para elevar el nivel plasmatico de PEPD. La dosis de EP siempre se inicio 4 dfas antes que PEPD o p epdG278D. PEPD y p e p d G278D se administraron tres veces por semana (lunes, miercoles y viernes), cada una a razon de 2 mg/kg por inyeccion intraperitoneal. Cada valor es una media ± SEM. (b) Grafico que muestra la PEPD plasmatica en vista de los tratamientos con EP, PEPD y ^{p e p d}G278D en el dfa 58 del grafico que se muestra en el panel a; cada valor es una media ± DE.

Figura 18. Para la comparacion de PEPD-Fc con PEPD para establecer el impacto sobre las senales en sentido descendente de ErbB2, unas celulas CHO-K1/ErbB2 tratadas con vetnculo, PEPD-Fc (27 nM) o PEPD (27 nM) durante 3 o 6 h, seguido de un analisis de western blot. El tnbrido humano PEPD Fc humano (Fc unido en el marco al extremo carboxilo de PEPD) fue preparado por nosotros utilizando tecnologfa recombinante estandar.

Figura 19. Datos que resumen la inhibicion del tumor y los cambios moleculares en tumores tratados con rhPEPD o rhPEPDG278D. rhPEPD o rhPEPDG278D son las mismas que PEPD o PEPDG278D o G278D-PEPD descritas anteriormente. Los tumores en varios grupos experimentales mostrados en la Figura 17 eran demasiado pequenos para el analisis molecular. (a) Tamanos de tumores derivados de xenoinjertos de celulas BT-474 en la almohadilla de grasa mamaria en el tratamiento con vetnculo, EP, EP mas rhPEPD o EP mas rhPEPDG278D. EP: diariamente a razon de 0,5 mg por kg de peso corporal por via intraperitoneal, iniciado 4 dfas antes de rhPDPD o rhPEPDG278D. rhPEPD o rhPEPDG278D: a razon de 2 mg por kg de peso corporal por via intraperitoneal, solo dos dosis se separaron durante 2 dfas. Las barras de error son s.e.m. (n = 3-6). (b) Inmunotransferencias que comparan los principales cambios en la senalizacion celular en muestras de tumores obtenidas 24 h despues de la dosis final como se indica en a. Cada muestra representa un tumor. (c, d) Actividad de SRC quinasa y actividad de PI3K en muestras tumorales obtenidas 24 h despues de la dosis final como se indica en a. Las barras de error son DE (n = 3). (e) Inmunotransferencias que comparan los cambios de senalizacion de HIF-1a en muestras de tumores obtenidas 24 h despues de la dosis final como se indica en a. Cada muestra representa un tumor. Como el HIF-1a y los factores relacionados (factor de crecimiento endotelial vascular [VEGF] y transportador de glucosa 1 [GLUT-1]) son factores prosupervivencia, el resultado explica al menos en parte por que rhPEpDG278D es un agente antitumoral mas potente que rhPEPD. Se cree que el efecto estimulador de la rhPEPD sobre estos factores prosupervivencia depende de su actividad de dipeptidasa. Tanto rhPEPD como rhPEPDG278D estan internalizadas por celulas tumorales (medida mediante su marca His, Figura 19e) aparentemente a traves de ErbB2.

DESCRIPCION DE LA DIVULGACION

La presente divulgacion se basa, al menos en parte, en nuestros descubrimientos de que la PEPD es un ligando del receptor de ErbB2 y que se la puede usar para inhibir el crecimiento de canceres ErbB2-positivos. En particular, y sin pretender estar restringido por ninguna teona en particular, demostramos en la presente divulgacion que la PEPD es un ligando de ErbB2 que se encuentra en el subdominio 3 del dominio extracelular de ErbB2. La PEPD se une a ErbB2 como un homodfmero, estando cada subunidad aparentemente unida a un monomero de ErbB2. Cuando la PEPD se une a los dfmeros de ErbB2 preexistentes, silencia rapidamente el sistema de senalizacion de ErbB2-Src/CK2-PTEN-AKT. La PEPD tambien se une a los monomeros de ErbB2, causando la dimerizacion de ErbB2 y la fosforilacion de tirosina. Sin embargo, la activacion de ErbB2 por PEPD es aparentemente insignificante, porque la PEPD pronto causa un profundo agotamiento de ErbB2 debido a la internalizacion y degradacion de ErbB2 y la PEPD inhibe selectivamente el crecimiento de las celulas que sobreexpresan ErbB2. Tambien se cree a partir de los datos presentados en la presente que la PEPD afecta a ErbB2 solamente cuando se halla presente en el espacio extracelular y no implica su actividad enzimatica. Por lo tanto, la presente divulgacion incluye sin limitacion las revelaciones de que la PEPD es un ligando del receptor de ErbB2, pero suprime la senalizacion de ErbB2; la actividad enzimatica de la PEPD no esta involucrada en el direccionamiento a ErbB2; la PEPD actua sobre ErbB2 solamente cuando se halla presente en el espacio extracelular; y la PEPD inhibe selectivamente las celulas que sobreexpresan ErbB2. Los datos presentados en la presente demuestran que la PEPD y un derivado enzimaticamente inactivo de ella tienen efectos efectivos contra el cancer anti-Erb2+ en modos de animales clmicamente relevantes. En particular, los datos presentados en la presente demuestran que la PEPD y una variante enzimaticamente inactiva de ella se dirige espedficamente a los tumores que sobreexpresan ErbB2, y la supresion de los tumores Erb2+ se confirma en un modelo de tumor de mama ortotopico. Ademas, los datos presentados en la presente demuestran que las composiciones y los metodos de esta divulgacion son eficaces para prevenir la recurrencia de al menos algunos tumores de Erb2+ despues del cese del tratamiento con las formulaciones de PEPD.

La secuencia de aminoacidos de ErbB2 se proporciona en el numero de acceso de GenBank NM_004448.2. Si bien las variantes en ErbB2 son conocidas en la tecnica, se preve que el presente metodo funcionara con cualquier variante de ErbB2, con la condicion de que la variante erbB2 tenga un dominio extracelular. El dominio extracelular es conocido en la tecnica y comprende el numero de aminoacido 23-652 en la secuencia de aminoacidos primaria en el numero de acceso GenBank arriba mencionado.

Dicho con mas detalle, sera evidente a partir de la presente divulgacion y de los ejemplos presentados en la presente que el efecto de la PEPD en la senalizacion de ErbB2 representa una novedosa senalizacion de ErbB2 inducida por ligando, asf como tambien una novedosa funcion de la PEPD. Una ilustracion grafica no limitativa de esta relacion se muestra en la Figura 6 que, sin pretender estar restringida por la teona, demuestra como la inhibicion selectiva de las celulas que sobreexpresan ErbB2 por la PEPD podna mostrar una utilidad terapeutica de la PEPD contra los canceres de mama ErbB2-positivos y otros canceres en humanos.

La PEPD es un ligando de afinidad relativamente elevada (Kd = 7,3 nM, Figura 1c) y ejerce un potente impacto en la senalizacion de ErbB2. La PEPD se une al subdominio 3 en ErbB2 ECD, aunque los residuos exactos involucrados en la union permanecen indefinidos. Si bien anteriormente se indico que ErbB2 ECD adopta una conformacion fija que se asemeja a un estado activado por ligando, lo que lo deja listo para la homo- o heterodimerizacion en ausencia de union directa al ligando (Cho FIS, et al. Nature 2003, 421(6924): 756-760), la presente divulgacion indica que este modelo esta incompleto. La PEPD provoca un apagado de senalizacion de ErbB2 de dos pasos. A los pocos minutos del tratamiento con PEPD, se desintegra el complejo de senalizacion preensamblado de ErbB2-Src-CK2. Tanto Src como CK2 se disocian de ErbB2 y se desactivan, lo que lleva a cambios en las senales corriente abajo; la desfosforilacion de PTEN y su reubicacion en la membrana celular, y la desfosforilacion de AKT (probablemente debida a la desfosforilacion de PIP3 por PTEN). Sin embargo, la PEPD no tiene efecto sobre PI3K lo que aparentemente se asocia con ErbB2 a traves de ErbB3. Sin embargo, in vivo en los tejidos tumorales, la PEPD, asf como tambien la PEPDG278D silenciaron tanto ErbB3 como PI3K (Figura 19), aparentemente al interrumpir la asociacion ErbB2-ErbB3, lo que no se detecto en nuestros estudios in vitro debido a los tiempos de tratamiento de PEPD relativamente cortos. Debido a que el impacto de PEPD sobre Src y CK2 se produce en ausencia de aparente agotamiento de ErbB2, la union de PEPD al dfmero ErbB2 probablemente cause un cambio de conformacion de este ultimo, haciendolo incapaz de contener Src. La PEPD tambien se une al monomero ErbB2, causando la dimerizacion y activacion de ErbB2, lo que se produce con cierta lentitud, ya que los niveles de fosforilacion pico de ErbB2 y ERK se detectaron despues de 3 horas de tratamiento con PEPD. Sin embargo, la activacion de ErbB2 inducida por PEPD es probablemente insignificante en un sentido funcional, ya que la PEPD tambien causa un agotamiento profundo y sostenido de ErbB2, lo que se hizo evidente despues de 1-3 h de tratamiento con PEPD y alcanzo el agotamiento maximo a las 6 h, que se mantuvo durante al menos 72 h. La PEPD fue capaz de causar un agotamiento casi completo de ErbB2 (Figura 2c). El agotamiento de ErbB2 inducido por PEPD parece ser el resultado total de la internalizacion y degradacion de ErbB2, ya que la PEPD no tiene ningun efecto sobre la escision de ErbB2 ECD, ni modula la expresion del gen de ErbB2. Por lo tanto, la presente divulgacion revela una funcion fundamentalmente diferente y nueva de la PEPD. La PEPD era conocida como una dipeptidasa citosolica. Hemos aprendido ahora que no solamente la PEPD es un ligando de ErbB2, sino tambien una mutante de PEPD que pierde el 99,4% de su actividad de dipeptidasa es tan eficaz como la protema de tipo salvaje. Ademas, in vivo, la mutante PEPD es mas eficaz que la misma PEPD para combatir los tumores impulsados por ErbB2 (Figura 17). La PEPD intracelular no tiene efecto sobre ErbB2, pero la PEPD se libera de las celulas como se revela en la presente divulgacion, y se libera mas PEPD de los tejidos y celulas danados.

Se preve que las composiciones que comprenden PEPD sean utiles para la prevencion y/o la terapia del cancer de mama ErbB2-positivo y de otros canceres en seres humanos. De manera compatible con su capacidad de silenciar rapidamente la v^a de serialization de ErbB2-Src/CK2-PTEN-AKT, que desempena un papel importante en el cancer de mama impulsado por ErbB2, y para causar una disminucion pronunciada y persistente de ErbB2, demostramos que la PEPD inhibe significativamente la proliferation, la formation de colonias independientes del anclaje y la invasion/migracion de celulas que sobreexpresan ErbB2, ejerciendose al mismo tiempo poco impacto sobre las celulas que tienen una expresion mmima de ErbB2 y, como se describio anteriormente y con mas detalles a continuation, demostramos los efectos anticancerigenos de la PEPD y de un derivado enzimaticamente inactivo de la misma, mediante la utilization de modelos animales clinicamente relevantes portadores de tumores de Erb2+. El impacto inhibidor de la PEPD sobre ErbB2 contrasta con el conocido efecto estimulador de otros ligandos de ErbB sobre sus receptores. El impacto de la PEPD sobre la senalizacion de ErbB2 y sobre las celulas que sobreexpresan ErbB2 recuerda el del trastuzumab. Dado el elevado costo del uso del trastuzumab en la clinica (el costo actual es superior a los $ 1.000 por dosis y de alrededor de $ 70.000 para un curso completo de tratamiento). La PEPD tiene la ventaja de que puede producirse en masa como se describe con mas detalle a continuacion a un costo relativamente bajo y, por lo tanto, se preve que en determinadas realizaciones sea una alternativa significativa y menos costosa al trastuzumab. In vivo, el trastuzumab ni regula hacia abajo la expresion de ErbB2 ni inhibe la fosforilacion de la tirosina de ErbB2 en tejidos cancerosos (Gennari et al., Clin Cancer Res, 10, 5650-5655, 2004; Gijsen et al., PLoS Biol, 8, e1000563, 2010); en cambio, su actividad antitumoral depende principalmente de la citotoxicidad mediada por las celulas dependiente del anticuerpo (ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytoxicity) por intermedio de dominio Fc (Barok et al., Mol Cancer Ther, 6, 2065-2072, 2007; Clynes et al., Nature Med, 6, 443-446, 2000). Por lo tanto, la PEPD o su mutante pueden complementar el trastuzumab y superar hasta cierto punto la resistencia al trastuzumab en pacientes.

Se preve que la PEPD sea adecuada para uso en las composiciones y metodos de la presente divulgation. En realizaciones, la PEPD es una PEPD producida por un procariota o un eucariota. En realizaciones, la PEPD es de origen procariota. En realizaciones no limitantes, la PEPD es producida por Pseudoalteromonas haloplanktis (es decir, una PEPD que comprende la secuencia de aminoacidos de GenBank no. AAA99824.1), o Pyrococcus furiosus (es decir, una PEPD que comprende la secuencia de aminoacidos de GenBank n.° WP_011011876.1). En la tecnica tambien se conocen varias secuencias de aminoacidos de PEPD eucarioticas, lo que incluye varias secuencias de aminoacidos de PEPD de mamiferos. En realizaciones, la PEPD tiene la secuencia de la PEPD de un roedor, es decir, de un raton o rata, o de la PEPD de un primate no humano, tal como el chimpance o un macaco Rhesus. La secuencia de aminoacidos de la prolidasa de raton se proporciona bajo el numero de acceso de GenBank. NP_032846.2; la prolidasa de rata se proporciona bajo NP_001009641.1; la prolidasa de Rhesus macaco se proporciona bajo AFJ71215.1; la prolidasa de chimpance se proporciona bajo el N^p_001267459.1. La secuencia de aminoacidos de la prolidasa humana (PEPD) en la SEQ ID NO: 1 es conocida en la tecnica. La SEQ ID NO: 1 y la secuencia de cADN que lo codifica es accesible bajo el numero de acceso de GenBank. J04605.1; la secuencia de aminoacidos tambien se proporciona bajo el numero de acceso AAA60064 de GenBank. En una realization ilustrativa pero no limitativa, la PEPD humana enzimaticamente activa tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1:

MAAATGPSFWLGNETLKVPLALFALNRQRLCERLRKNPAVQAGSIWLQGGEETQ

RYCTDTGVLFLQESFFHWAFGVTEPGCYGVIDVDTGKSTLFVPRLPASHATWMGKI

HSKEHFKEKYAVDDVQYVDEIASVLTSQKPSVLLTLRGVNTDSGSVCREASFDGIS

KFEVNNTILHPEIVESRVFKTDMELEVLRYTNKISSEAHREVMKAVKVGMKEYGLES

LFEHYCYSRGGMRHSSYTCICGSGENSAVLHYGHAGAPNDRTIQNGDMCLFDMG

GEYYSVASDITCSFPRNGKFTADQKAVYEAVLLSSRAVMGAMKPGDWWPDIDRLA

DRIHLEELAHMGILSGSVDAMVQAHLGAVFMPHGLGHFLGIDVHDVGGYPEGVERI

DEPGLRSLRTARHLQPGMVLTVEPGIYFIDHLLDEALADPARASFLNREVLQRFRGF

GGVRIEEDWVIDSGIELLTCVPRTVEEIEACMAGCDKAFTPFSGPK (SEQ ID NO:1)

En la SEQ ID NO: 1, la G en la position 278 esta sombreada, en negrita y en cursiva y representa la ubicacion de una mutation G278D que hace que la PEPD quede inactiva enzimaticamente. En realizaciones, la mutation es un cambio de glicina en la posicion 278 a un aminoacido distinto del acido aspartico.

Todas las secuencias de aminoacidos y de polinucleotidos proporcionadas bajo los numeros de acceso de GenBank a los que se hace referencia en esta divulgacion son aquellas secuencias disponibles por intermedio de GenBank en la fecha de presentation de esta solicitud. Esta description tambien incluye todos los polinucleotidos que codifican la PEPD y todas las variantes de la misma que se describen en la presente o que de otra manera serian conocidas por el experto en la tecnica dado el beneficio de la presente divulgacion.

Las secuencias de aminoacidos de PEPD en roedores (raton y rata) tienen una similitud de mas del 86% con la secuencia humana, mientras que las secuencias de aminoacidos de PPED de primates no humanos, tales la del macaco Rhesus, son mas del 95% similares a la secuencia de aminoacidos PEPD humana. En realizaciones, la PEPD comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos de PEPD humana. En realizaciones, la PEPD usada en las composiciones y/o metodos de la presente divulgacion tiene una similitud de entre al menos el 85,0% y el 99,9%, inclusive, e incluye todos los numeros hasta el primer lugar decimal entre ellos, con respecto a la secuencia de la SEQ ID NO: 1. En una realizacion, la PEPD comprende una secuencia de aminoacidos que tiene una similitud de al menos el 95% con respecto a la secuencia de la SEQ ID NO: 1.

En diversas realizaciones, la presente divulgacion incluye composiciones que comprenden PEPD de tipo salvaje (por ejemplo, PEPD de la SEQ ID NO: 1), o PEPD modificada, o una combinacion de ellas. En general, los expertos en la tecnica pueden determinar las modificaciones a la PEPD adecuadas para su uso con la presente invencion, utilizando tecnicas comunes, dado el beneficio de la presente divulgacion. En realizaciones, la PEPD modificada comprende modificaciones de la SEQ ID NO: 1. La divulgacion incluye todas las modificaciones de la SEQ ID NO: 1 con la condicion de que la PEPD conserve su capacidad de unirse y causar el agotamiento de ErbB2 de la superficie celular. En realizaciones, la PEPD modificada conserva la capacidad de formar un homodfmero. En realizaciones, la puesta en contacto de una celula ErbB2-positiva con una PEP^dmodificada (o de tipo salvaje) de esta divulgacion es seguida por la union de ErbB2 y la endocitosis de ErbB2, dando como resultado el agotamiento de ErbB2. La PEPD modificada que conserva algunos de estos atributos funcionales, o todos ellos, puede comprender inserciones, deleciones y sustituciones de aminoacidos. Por ejemplo, la divulgacion incluye PEPD que ha sido modificada por sustituciones de aminoacidos conservadoras que en terminos generales se basan en la similitud relativa entre los sustituyentes del grupo R. Los ejemplos no limitantes de tales sustituciones incluyen gly o ser en lugar de ala; lys en lugar de arg; gln o his en lugar de asn; glu en lugar de asp; ser en lugar de cys; asn en lugar de gln; asp en lugar de glu; ala en lugar de gly; asn en lugar de his; leu o val en lugar de ile; ile o val en lugar de leu; arg en lugar de lys; leu o tyr en lugar de met; thr en lugar de ser; tyr en lugar de trp; phe en lugar de tyr; e ile o leu en lugar de val. Por lo tanto, se incluye en la descripcion una PEPD que comprende cualquier sustitucion de aminoacido conservadora unica, o cualquier combinacion de sustituciones de aminoacido conservadoras, con la condicion de que puedan al menos conservar la capacidad de unirse a ErbB2, con el subsiguiente agotamiento de ErbB2 de la superficie celular. Sera evidente para los expertos en la tecnica como determinar si una PEPD modificada particular puede unirse o no a ErbB2. En realizaciones, la PEPD modificada puede unirse al dominio extracelular de ErbB2 con un valor Kd estimado de 7,3 nM, determinado mediante un ensayo ELISA.

La PEPD de tipo salvaje es enzimaticamente activa. La PEPD modificada es una PEPD que comprende un cambio en la SEQ ID NO: 1 y puede ser enzimaticamente activa o enzimaticamente inactiva. En este sentido, se sabe en la tecnica que los defectos en la actividad de iminodipeptidasa de la PEPD estan asociados con la deficiencia de polidasa, que es una enfermedad autosomica recesiva muy rara asociada con el metabolismo del colageno y que afecta a los tejidos conectivos. Por lo tanto, se sabe que la actividad enzimatica de la PEPD es importante. Sin embargo, en realizaciones, se usa PEPD enzimaticamente inactiva en las composiciones y metodos de esta descripcion. Se considera que la PEPD enzimaticamente inactiva es una PEPD que presenta menos hidrolisis de un sustrato dipeptido que tiene prolina o hidroxiprolina en su terminal carboxi que la cantidad de dicha hidrolisis presentada por una protema de referencia que comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1 . En realizaciones, la PEPD enzimaticamente inactiva puede tener al menos entre el 0,0% y el 99,9%, inclusive, incluyendose todos los dfgitos allf entre el primer punto decimal, menos actividad de hidrolisis dipeptfdica en comparacion con una PEPD de referencia. En una realizacion, una PEPD inactiva enzimaticamente no tiene mas del 0,6% de actividad de hidrolisis dipeptfdica de una PEPD de referencia. En una realizacion, la PEPD de referencia comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1. Una unidad de actividad de la prolidasa puede definirse como la cantidad de enzima que libera 1 pmol de prolina/h en condiciones de ensayo estandar. En una realizacion, una PEPD inactiva enzimaticamente no tiene actividad de hidrolisis dipeptfdica de PEPD detectable. En una realizacion, una PEPD inactiva enzimaticamente comprende una mutacion G278D. En realizaciones, la divulgacion incluye una mutacion cualquiera, o cualquier combinacion de mutaciones de PEPD descritas en la presente, y en consecuencia incluye la condicion de que cualquier combinacion unica o cualquiera de tales mutantes puede ser excluida de la invencion.

La PEPD utilizada en las realizaciones de esta divulgacion puede incluir modificaciones que mejoren sus caractensticas deseables, tales como la capacidad de unirse o ingresar en una celula tumoral o entorno tumoral, o para mejorar su tiempo de circulacion, biodisponibilidad, estabilidad o los usos relacionados con la destruccion dirigida a celulas ErbB2-positivas, la formacion de imagenes de celulas ErbB2-positivas. Las protemas PEPD que pueden usarse con la presente divulgacion incluyen un polipeptido que comprende la SEQ ID NO: 1 o una modificacion de la misma, y en realizaciones tambien incluyen tales polipeptidos PEPD dentro del contexto de un polipeptido mas grande. Las modificaciones a la SEQ ID NO: 1 incluyen modificaciones que anulan o disminuyen la actividad enzimatica y/o cambios que no afectan la capacidad de la PEPD modificada para unirse a ErbB2. Por lo tanto, la PEPD de la SEQ ID NO: 1 puede modificarse mediante sustituciones de aminoacidos conservadoras que se basan generalmente en la similitud relativa entre los sustituyentes del grupo R. Los ejemplos no limitativos de tales sustituciones contempladas incluyen sin limitacion: gly o ser en lugar de ala; lys en lugar de arg; gln o his en lugar de asn; glu en lugar de asp; ser en lugar de cys; asn en lugar de gln; asp en lugar de glu; ala en lugar de gly; asn o gln en lugar de his; leu o val en lugar de ile; ile o val en lugar de ala; arg en lugar de lys; leu o tyr en lugar de met; thr en lugar de ser; tyr en lugar de tyr; e ile or leu en lugar de val. Por lo tanto, las PEPD que comprenden cualquier sustitucion de aminoacidos conservadora unica, o cualquier combinacion de sustituciones de aminoacidos conservadoras, se incluyen en esta divulgacion, siempre que conserven sus propiedades de union a ErbB2 y puedan inhibir el crecimiento de celulas ErbB2-positivas. Por lo tanto, la presente divulgacion incluye secuencias polipeptfdicas que comprenden la SEQ ID NO: 1 o modificaciones de la misma, y pueden incluir modificaciones adicionales, que incluyen sin limitacion aminoacidos adicionales, y/o que se proporcionan como parte de un complejo con otras composiciones de material. Por lo tanto, los polipeptidos PEPD podnan ser parte de protemas mas grandes, tales como las protemas de fusion, o podnan estar conectados a otros restos. Por consiguiente, las protemas PEPD podnan asociarse covalente o no covalentemente con cualquier resto deseable del que se prevena que mejorara sus capacidades funcionales de acuerdo con la prevencion y/o terapia de los canceres ErbB2-positivos.

En general, la protema PEPD (y, si se desea, una secuencia polipeptfdica con el que se hace como una protema de fusion unica) puede hacerse utilizando tecnicas convencionales. Por ejemplo, en realizaciones, la protema PEPD/protema de fusion puede prepararse usando sistemas de expresion procariotas o eucariotas. Por lo tanto, la divulgacion proporciona ventajas de fabricacion sobre otros socios de union de ErbB2, tales como los mAbs dirigidos a ErbB2, que son costosos y requieren mucho tiempo para su preparacion. En general, para la produccion recombinante de protemas que comprenden o consisten en una PEPD como se describe en la presente, cualquier polinucleotido que codifica la PEPD se puede proporcionar en un vector de expresion. La expresion “vector de expresion" se refiere a un vector que comprende secuencias de control de expresion protemicas operativamente vinculadas a la secuencia de codificacion de la PEPD. El vector de expresion puede comprender elementos que actuan en cis para la expresion, incluidos sin limitacion, los elementos promotores, elementos potenciadores, ongenes de replicacion, marcadores seleccionables, sitios de inicio de la transcripcion, secuencias que codifican sitios de inicio de la traduccion y cualquier otra secuencia que sea deseable para la expresion de protemas, en funcion del sistema de expresion elegido. Los vectores de expresion de protemas adecuados que pueden disenarse para expresar cualquier secuencia polinucleotfdica que codifica una PEPD (cada una de las cuales secuencias codificadoras de PEPD estan incluidas en esta divulgacion) incluyen todos los conocidos en la tecnica, ejemplos de los cuales incluyen sin limitacion, los cosmidos, plasmidos y sistemas basados en virus que incorporan el polinucleotido recombinante que codifica la PEPD. El sistema utilizado para expresar las protemas PEPD recombinantes de la invencion puede ser cualquier organismo adecuado e incluye sin limitacion, los sistemas de expresion de celulas de mairnferos, sistemas de expresion de celulas de insectos (por ejemplo, sistemas basados en baculovirus), sistemas de expresion de levaduras, sistemas de expresion de celulas vegetales, y sistemas de expresion procariotas. En una realizacion, se usa E. coli para la expresion de la PEPD. En una realizacion, una protema quimerica PEPD se expresa de forma recombinante utilizando un sistema de expresion de mamfferos, de modo que la protema quimerica comprende glicosilacion espedfica para humanos.

En una realizacion, una protema PEPD puede conjugarse con una inmunoglobulina (Ig) o con un fragmento de la misma para proporcionar una molecula de PEPD/lg quimerica. Se preve que un constructo de este tipo sea util para involucrar diversos aspectos de la respuesta inmune del individuo para facilitar la destruccion selectiva de las celulas ErbB2+. La inmunoglobulina, o fragmento de la misma, puede ser de cualquier tipo o subtipo de Ig. En este sentido, estudios previos han indicado que la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (mediada a traves de los receptores Fc) desempena un papel fundamental en el direccionamiento del trastuzumab en el cancer de mama ErbB2-positivo (Clynes et al., Nature Med, 6, 443-446, 2000; Spiridon et al., Clin Cancer Res, 10, 3542- 3551, 2004). La presente divulgacion tambien abarca protemas quimericas PEPD-Fc y composiciones farmaceuticas que las comprenden. Los metodos para preparar protemas quimericas Fc son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los vectores pFUSE-Fc, disponibles comercialmente en InvivoGene, se pueden usar para generar tubridos de fusion PEPD-Fc. Por lo tanto, en una realizacion, la divulgacion incluye una composicion que comprende una protema de fusion, en donde la PEPD en un componente de la protema de fusion, y en donde la protema de fusion comprende una region Fc de una Ig humana. En diversas realizaciones, la region Fc es una region Fc o sus fragmentos son de un anticuerpo IgA, IgG o IgE, aunque tambien se pueden usar regiones Fc de otros tipos de anticuerpos o regiones Fc sinteticas/artificiales. En realizaciones, la region Fc es una lgG2a humana o lgG1 humana o un fragmento de tales regiones Fc. La region Fc puede comprender o consistir en una secuencia de aminoacidos que es identica a una region Fc producida por un mam^era, tal como un ser humano. En diversas realizaciones, la region Fc puede tener entre el 80% y el 100% (incluyendo todos los numeros enteros entre ellos) de similitud de secuencia de aminoacidos con una region Fc producida por un raton y/o un humano. La region Fc puede ser una region Fc intacta, lo que significa una region Fc completa, o puede ser un fragmento de la region Fc. Los expertos en la materia reconoceran que la expresion "region Fc" de un anticuerpo significa la region de "fragmento cristalizable" del anticuerpo, que comprende dos cadenas pesadas que contribuyen con dos o tres dominios constantes (CD, constant domain), segun la clase del anticuerpo. Las secuencias de nucleotidos que codifican las regiones Fc, asf como las secuencias de aminoacidos de las regiones Fc para inmunoglobulinas humanas y de raton son bien conocidas en la tecnica. En una realizacion, la porcion Fc de las protemas de fusion comprende solo una o mas cadenas pesadas de anticuerpo. Los expertos en la tecnica reconoceran que para la demostracion de la invencion usando modelos animales murinos, la porcion Fc de la protema de fusion puede ser una porcion de Ig murina lgG2a o lgG2b Fc, mientras que para la terapia y/o prevencion de la enfermedad en humanos, es preferible que la porcion Fc sea una porcion de lgG1 o de lgG3 Fc. En ciertas realizaciones, la porcion Fc de las protemas de fusion proporcionadas en la presente no incluye porciones de reconocimiento de antfgeno (es decir, la porcion de anticuerpo de las protemas de fusion no contiene regiones variables de anticuerpo). Por lo tanto, las protemas de fusion son distintas de los anticuerpos que contienen porciones de union a antigeno. Los constructos de ADN que codifican las protemas PEPD de fusion Fc se pueden hacer usando cualquier tecnica convencional bien conocida por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, los constructos de codificacion de fusion Fc-30 pueden hacerse utilizando reactivos disponibles comercialmente. Por ejemplo, INVIVOGEN ofrece la familia de plasmidos pFUSE-Fc desarrollada para facilitar la construccion de protemas Fc-Fusion mediante la fusion de una secuencia que codifica una protema dada a la region Fc de una inmunoglobulina (Ig). En este constructo, la region Fc comprende los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG y la region bisagra. La bisagra actua como un espaciador flexible entre las dos partes de la protema de fusion Fc, lo que permite que cada parte de la protema de fusion funcione independientemente si asf se desea.

Como se describio anteriormente, la divulgacion incluye cualquier protema PEPD como un componente de una protema de fusion que puede incluir cualquier otra secuencia de aminoacidos que sena deseable para expresarse en el mismo marco de lectura abierto que la protema PEPD, y puede incluir, sin limitacion, secuencias de aminoacidos que intervienen en facilitar el aislamiento y/o purificacion de protemas, para solubilidad, secrecion o cualquier otra funcion. El polipeptido PEPD puede configurarse N-terminal o C-terminalmente al marco de lectura abierto fusionado, en funcion de la protema de fusion particular que se produzca. Por ejemplo, las protemas PEPD se pueden proporcionar con una marca de histidina, como una marca de polihistidina adecuada. En realizaciones, la marca de histidina comprende al menos seis histidinas en secuencia. En una realizacion, la marca his es una secuencia peptfdica de hexa-histidina. En una realizacion, si se desea, se puede configurar un sistema de expresion de PEPD para que se pueda eliminar la marca de histidina, por ejemplo, mediante la inclusion de una marca de hexa-histidina N-terminal escindible por el virus del tabaco (TEV, Tobacco etch virus).

En realizaciones no limitantes, los polipeptidos PEPD pueden combinarse o acoplarse con un agente quimioterapeutico, u otro agente que tenga una actividad citotoxica, o con agentes que sean utiles para la deteccion y/o formacion de imagenes de celulas/tejidos ErbB2-positivos. Por ejemplo, los conjugados de PEPd pueden incluir toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas o moleculas pequenas. Las toxinas enzimaticamente activas adecuadas y las moleculas pequenas incluyen sin limitacion, docetaxel, mitoxantrona, taxanos, la cadena A de la difteria, fragmentos no vinculantes activos de toxina difterica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa sarcina, protemas de Aleurites fordii, protemas diantina, protemas Phytolaca (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogellina, restrictocina, fenomicina enomicina y los tricotecenos, agentes dirigidos a los microtubulos, o cualesquier uno o mas agentes antiangiogenicos.

Los conjugados y las combinaciones de la protema PEPD y los agentes quimioterapeuticos (u otros agentes, como los agentes de imagen) pueden prepararse utilizando cualquier tecnica adecuada. En diversas realizaciones, la protema PEPD puede producirse por separado del agente quimioterapeutico, y luego acoplarse qmmicamente a el, o en el caso de agentes proteicos, la protema PEPD puede producirse como una PEPD/protema de fusion para producir una nueva protema quimerica. Para el acoplamiento qmmico, se dispone de una variedad de protemas bifuncionales. agentes de acoplamiento tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tales como dimetiladipimidato HCL)), esteres activos (tales como el suberato de disuccinimidilo), aldehfdos (como el glutaraldehfdo), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil)hexandiamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen-2,6-diisocianato) y los compuestos bisactivos de fluor (tales como el 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno), para unir covalentemente una PEPD y un agente quimioterapeutico u otro agente, tal como un agente de imagen.

En otra realizacion, la PEPD puede conjugarse con un agente radioactivo. Se dispone de una variedad de isotopos radiactivos para conjugar con protemas, de manera tal que las celulas o tejidos ErbB2-positivos a los que se une la PEPD, pueden ser puestos en imagen o destruidos. Para la destruccion selectiva de celulas, los peptidos pueden conjugarse con un atomo altamente radioactivo, como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isotopos radiactivos de Lu. Para identificar celulas ErbB2-positivas, los conjugados de PEPD pueden incluir un atomo radiactivo para estudios centellograficos, por ejemplo, Tc99m (tecnecio-99 metaestable), I123, o una marca de giro para resonancia magnetica nuclear y/o imagenes de resonancia magnetica, tales como I123, I131, In111, F19, C13, N15, O17 o gadolinio (III) o manganeso (II). Las radiomarcaciones pueden incorporarse en las protemas PEPD de maneras conocidas.

Las protemas PEPD pueden proporcionarse en composiciones farmaceuticas para su administracion combinandolas con cualquier vehmulo, excipiente y/o estabilizante farmaceuticamente aceptable. Algunos ejemplos adecuados de portadores, excipientes y estabilizadores farmaceuticamente aceptables se pueden encontrar en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2005), 21.a edicion, Filadelfia, PA, Lippincott Williams & Wilkins. Ademas, se puede usar cualquier vehmulo de administracion adecuado en la invencion, tal como una formulacion de administracion de liberacion controlada en la que la PEPD se libera durante un penodo de tiempo. Si se desea, la composicion farmaceutica puede comprender tanto PEPD como un inhibidor de la coagulacion.

La administracion de formulaciones que comprenden PEPD descritas en la presente puede llevarse a cabo utilizando cualquier via de administracion adecuada, lo que incluye, entre otras, la parenteral, intraperitoneal, intrapulmonar, oral e intratumoral. Las infusiones parenterales incluyen la administracion intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal y subcutanea.

Los expertos en la tecnica pueden determinar la cantidad de PEPD y de cualquier otro agente activo que se incluira en una composicion y/o que se usara en el metodo, dado el beneficio de la presente divulgacion. Por lo tanto, en una realizacion, se administra una cantidad eficaz de una composicion de la invencion. Una cantidad efectiva puede ser una cantidad de la composicion que inhibe el crecimiento de celulas en el individuo que expresa ErbB2, o una cantidad que prolongue la supervivencia del individuo, o que alivie los smtomas de la enfermedad asociados con la expresion del ErbB2 en el individuo, o que suprima un fenotipo maligno de celulas que sobreexpresan ErbB2. En realizaciones, en cuanto al individuo al que se va a administrar una composicion de la invencion tiene, se sospecha que tiene, o esta en riesgo de desarrollar y/o de recaer en un cancer ErbB2-positivo. En realizaciones, el cancer ErbB2-positivo es un cancer de mama, cancer de vejiga, cancer de ovario, cancer de estomago o formas agresivas de cancer uterino, tales como el carcinoma endometrial seroso uterino u otros canceres que sobreexpresan ErbB2, o canceres cuyas celulas madre sobreexpresan ErbB2, o canceres metastasicos que sobreexpresan ErbB2.

Las dosis adecuadas para fines terapeuticos o preventivos pueden ser determinadas por los expertos en la tecnica y se basaran, al menos en parte, en la consideracion de la edad, el sexo, el tamano y la salud del individuo, el tipo de sistema de administracion utilizado, la etapa de la enfermedad, y otros factores que seran evidentes para el experto en la tecnica. En realizaciones, la dosificacion de PEPD para sujetos humanos puede ser similar o igual a la dosificacion para trastusumab, que es tfpicamente de 2-4 mg/kg por semana.

Las composiciones de la divulgacion pueden administrarse junto con cualquier regimen de tratamiento convencional, lo que incluye la administracion secuencial o simultanea de agentes quimioterapeuticos, inmunoterapias pasivas, vacunas, adyuvantes y similares. El metodo puede realizarse junto con terapias convencionales que estan destinadas a tratar una enfermedad o trastorno asociado con celulas ErbB2-positivas. Por ejemplo, la administracion de las composiciones descritas en la presente puede combinarse con modalidades de tratamiento que incluyen, sin limitacion, quimioterapias, intervenciones quirurgicas y radioterapia, que pueden realizarse antes, simultaneamente o despues de, las administraciones de PEPD. En realizaciones, la divulgacion incluye una composicion que comprende PEPD y cetoximab, un anticuerpo monoclonal utilizado clmicamente contra ErbB1. En realizaciones, la divulgacion incluye una composicion que comprende PEPD con el inhibidor de quinasa de ErbB1/ErbB2 dual utilizado clmicamente, el lapatinib. En realizaciones, la divulgacion incluye composiciones que comprenden PEPD y trastuzumab. En realizaciones, la divulgacion incluye composiciones que comprenden PEPD y pertusumab, otro anticuerpo monoclonal anti-ErbB2 utilizado clmicamente.

En realizaciones, la divulgacion incluye composiciones y composiciones para uso en metodos, en donde ademas de una protema PEPD, las composiciones comprenden un inhibidor de la coagulacion sangumea. En una forma de realizacion, el inhibidor de la coagulacion es un agente que inhibe la degradacion de PEPD in vivo, para reducir la dosis de PEPD requerida por los pacientes. En una forma de realizacion, el inhibidor de la coagulacion inhibe la conversion de protrombina en trombina, o inhibe la participacion de la trombina en la formacion de coagulos. En una forma de realizacion, el inhibidor de la coagulacion interfiere en la funcion relacionada con la coagulacion de las protemas promotoras de coagulos conocidas como factor X y factor II. En realizaciones, el inhibidor de la coagulacion se une y activa la antitrombina III, y como consecuencia, se inhiben los factores de coagulacion Xa y lla. En una forma de realizacion, el inhibidor de la coagulacion es heparina, tal como una preparacion de heparina no fraccionada, o un una forma de heparina de peso molecular bajo. Las formas de heparina de peso molecular bajo son conocidas en la tecnica (es decir, Weitz Jl; Weitz, Jeffrey I. (1997). "Low-molecular-weight heparins", N Engl J Med 337 (10): 688-98). En una forma de realizacion, la heparina de bajo peso molecular es enoxaparina o una sal farmaceuticamente aceptable de esta, tal como enoxaparina sodica. En una forma de realizacion, el inhibidor es un inhibidor directo de Xa, ya sea oral o no oral, que incluye, pero sin limitacion, los farmacos vendidos con las marcas RIVAROXABAN, APIXABAN o EDOXABAN. En una forma de realizacion, el inhibidor de la coagulacion puede ser un inhibidor de otros factores de coagulacion de la sangre, que incluye, pero sin limitacion, los Factores XII, XI y VII. En realizaciones, la heparina de bajo peso molecular u otro inhibidor de la coagulacion se administra usando cualquier vefuculo y via de administracion adecuados. En realizaciones, el inhibidor de la coagulacion se administra por inyeccion subcutanea. En una forma de realizacion, el inhibidor de la coagulacion se administra por via oral. La dosis del inhibidor de la coagulacion se puede basar en el peso del receptor individual y otros parametros que seran reconocidos por los expertos en la tecnica dado el beneficio de esta divulgacion. En realizaciones, el inhibidor de la coagulacion se puede administrar antes, de forma concurrente con o despues de la composicion de PEPD, y se puede administrar con el mismo numero y tiempo de administracion de PEpD, o se puede administrar de acuerdo con un esquema que es diferente de la administracion de PEPD.

La presente divulgacion proporciona un metodo para identificar si un individuo es candidato para el tratamiento con una composicion que comprende una PEPD. El metodo comprende obtener una muestra biologica del individuo y determinar si la muestra comprende celulas cancerosas ErbB2-positivas, en donde la determinacion de que la muestra biologica comprende celulas cancerosas ErbB2-positivas es indicativo de que el individuo es un candidato para el tratamiento, y en donde la determinacion de que la muestra biologica no comprende celulas cancerosas ErbB2-positivas es indicativo de que el individuo no es candidato para el tratamiento. Por lo tanto, la presente divulgacion puede proporcionar ayuda en el diagnostico, o para diagnosticar a un individuo que necesita un tratamiento con una composicion que comprende una PEPD. El metodo puede comprender comunicar una determinacion de la presencia o ausencia de celulas cancerosas ErbB2-positivas en la muestra biologica a un proveedor de atencion medica, de modo que el proveedor de atencion medica pueda recomendar el tratamiento con una composicion que comprende una PEPD. El metodo puede comprender, ademas, administrar al individuo una composicion que comprende una PEPD. Una determinacion de la presencia de celulas cancerosas ErbB2-positivas comprende detectar en un individuo o una muestra biologica obtenida del individuo, las celulas cancerosas que sobreexpresan ErbB2.

El metodo para identificar si un individuo es candidato para el tratamiento con una composicion que comprende una PEPD puede comprender obtener una muestra biologica del individuo y determinar si la muestra comprende celulas cancerosas ErbB2-positivas y/o sobreexpresa ErbB2 mediante el contacto de la muestra con una PEPD marcada de forma detectable. La deteccion de un complejo de ErbB2+ y una PEPD marcada de forma detectable es indicativa de que el individuo es un candidato para el tratamiento con una composicion que comprende PEPD como se describe en la presente. El complejo de ErbB2+ y PEPD marcada de manera detectable se puede detectar en una biopsia de un tumor que se sospecha de que comprende celulas ErbB2-positivas. Alternativamente, la PEPD unida a una celula ErbB2-positiva se puede detectar utilizando un companero de union de PEPD marcada de forma detectable. Las celulas cancerosas ErbB2-positivas pueden expresar mas ErbB2 que una celula de referencia. La referencia puede ser cualquier referencia adecuada, tal como un control apareado, un valor estandarizado (es decir, un area por debajo de una curva) y/o valores para las cantidades de ErbB2 expresadas por una celula del mismo tipo de tejido en una muestra, en donde las celulas ErbB2 no son celulas cancerosas. En general, la identificacion de un sujeto humano como candidato para el tratamiento con una formulacion de PEPD se realiza utilizando el mismo criterio o similar al de identificar a un individuo como candidato para el tratamiento con trastuzumab, que se basa en parametros clmicamente establecidos y conocidos por el profesional experto. Por ejemplo, la inmunohistoqmmica (IHC) se usa con frecuencia para medir la cantidad de ErbB2 presente en una muestra de biopsia tumoral o, alternativamente, la hibridacion con fluorescencia in situ (FISH) se usa para medir el numero de copias del gen (ver, por ejemplo, Carlson RW et al., J Natl Compr Cane Netw 2006, Suppl 4, S1-22; Her2 testing in breast cancer: NCCN Task Force report and recommendations). Un tumor con una puntuacion de IHC de 0 o 1+, una relacion promedio de gen ErbB2/cromosoma 17 menor de 1,8, o un numero promedio de copias del gen/celula de ErbB2 de 4 o menor segun lo determinado por FISH se considera negativo para ErbB2. Una muestra de tumor con una puntuacion IHC de 3+, una relacion promedio de gen ErbB2/cromosoma 17 superior a 2,2 por FISH, o un numero promedio de copias del gen/celula de ErbB2/6 o mas se considera ErbB2-positiva en el contexto de la identificacion individuos que son candidatos para terapia del cancer usando agentes que se dirigen a ErbB2.

La divulgacion proporciona ademas productos, por ejemplo, artfculos de fabricacion, que comprenden preparaciones farmaceuticas de PEPD. Los productos comprenden PEPD aislada y/o purificada. La PEPD puede ser una forma enzimaticamente activa o inactiva de PEPD. Los artfculos de fabricacion incluyen envases y/o material impreso. La presente divulgacion incluye un paquete cerrado o sellado que contiene una preparacion de PEPD. El paquete puede comprender uno o mas viales cerrados o sellados, frascos, envases de blister (burbuja), o cualquier otro envase adecuado para la venta, distribucion o uso de los agentes farmaceuticos PEPD. El material impreso puede incluir informacion impresa. La informacion impresa se puede proporcionar en una etiqueta o en un prospecto de papel o puede estar impresa en el material de envasado mismo. La informacion impresa puede incluir informacion que identifique al agente de PEPD en el envase, las cantidades y tipos de otros ingredientes activos y/o inactivos, e instrucciones para tomar la composicion, tal como el numero de dosis a tomar en un penodo de tiempo determinado. y/o informacion dirigida a un farmaceutico y/u otro proveedor de atencion medica, tal como un medico o un paciente. El kit puede comprender y la informacion impresa puede identificar un agente adicional, tal como un inhibidor de la coagulacion, que se proporciona por separado o en combinacion con el agente de PEPD. El material impreso puede incluir una indicacion de que la composicion farmaceutica de PEPD y/o cualquier otro agente provisto con el kit es para el tratamiento de un cancer ErbB2-positivo. El producto se puede proporcionar como un kit que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion de PEPD, envasada en un envase, el kit que comprende ademas una etiqueta unida o envasada con el envase, la etiqueta que describe el contenido del envase y que proporciona indicaciones y/o o instrucciones sobre el uso del contenido del envase para tratar el cancer ErbB2-positivo.

Los siguientes ejemplos estan destinados a ilustrar pero no limitar la invencion.

EJEMPLO 1

Este ejemplo demuestra que la PEPD humana se une al subdominio 3 en el ECD de ErbB2 humano y causa la dimerizacion de ErbB2.

Se genero PEPD humana recombinante en bacterias como se describe mas adelante y se incubo a 0,04, 0,2 o 1 pM con 0,04 pM de ErbB2/ECD-Fc [una quimera recombinante de ECD ErbB2 humano (Thr23-Thr652) y el fragmento Fc de IgGi humano] o 0,04 pM de Fc como control. PEPD se unio espedficamente al ECD, y cada subunidad de PEPD se unio maximamente a una copia del ECD (Figura 1a). Dado que tanto PEPD como ErbB2/ECD-Fc (debido a Fc) forman homodfmeros en solucion, el resultado anterior indica que un dfmero PEPD se une a un dfmero ECD. PEPD tambien se incubo a 1 pM con 0,04 pM de ErbB3/ECD-Fc [una quimera del ECD (Ser20-Thr643) de ErbB3 y Fc humano] o 0,04 pM de ErbB4/ECD-Fc [una quimera del ECD (Gln26-Arg649) de ErbB4 humano y Fc], pero no se pudo detectar la union (Figura 1a). Como se esperaba, la neurregulina-1 (NRG-1) se unio a los ^eC^dde ErbB3 y ErbB4 (Figura 7). Por lo tanto, PEPD no es un ligando de ErbB3 o ErbB4. Ademas, los autores estudiaron la union de PEPD a ErbB2 usando celulas CHO-K1 de ovario de hamster chino, que expresaban un nivel bajo de ErbB2, pero ninguno de los otros ErbB (Figura 8a). La sobreexpresion de ErbB2 humano en celulas CHO-K1 se logro facilmente mediante la transfeccion del gen (Figura 1b). En un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) usando lisados de celulas que sobreexpresan ErbB2, la PEPD se unio a ErbB2 con un valor de Kd estimado de 7,3 nM, mientras que hubo poca union de PEPD a los lisados de las celulas CHO-K1 de control (Figura 1c). PEPD no se unio a las regiones de transmembrana e intracelulares de ErbB2 (Figura 8b). A continuacion, se eliminaron los cuatro subdominios ECD de ErbB2 humano uno a la vez (Figura 1 d), usando el plasmido pCMV6-XL5-ERBB2 que expresa ErbB2 como moldea. Se detectaron niveles similares de expresion de protemas de ErbB2 y sus mutantes en celulas CHO-K1 transfectadas transitoriamente con los plasmidos (Figura 1d). Se utilizo una cantidad igual de ErbB2 y sus mutantes, sobre la base de la cuantificacion de la electrotransferencia, en el mismo ELISA mencionado anteriormente. La eliminacion del subdominio D1 tuvo poco impacto en la union de PEPD-ErbB2; la afinidad de union despues de eliminar los subdominios D2 y D4 se redujo 3,5 veces y 51,0 veces, respectivamente, pero la union completa a PEPD se logro mediante la elevacion de la concentracion de PEPD; la eliminacion del subdominio D3, anulo completamente la union de PEPD (Figura 1e). Por lo tanto, la PEPD unida a D3, pero D2 y D4, esta ultima en particular, puede facilitar la union de PEPD a ErbB2.

Se sabe que la sobreexpresion de ErbB2 en celulas causa dimerizacion espontanea. Como se esperaba, tanto los monomeros como los dfmeros de ErbB2 existfan en celulas CHO-K1 que sobreexpresan de forma estable ErbB2 (Figura 1f). Las celulas se trataron con el agente de reticulacion bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3) antes de la recoleccion y el analisis de electrotransferencia. La PEPD aparentemente experimento dos fases de union a ErbB2: union rapida de homodfmeros de PEPD a homodfmeros de ErbB2 preexistentes (sin cambio en el nivel de monomero de ErbB2, disminucion en el nivel de dfmero de ErbB2 y formacion de heterotetramero de 2 ErbB2 y 2 PEPD a 10 min de tratamiento con PEPD), seguido por la union del homodfmero PEPD al monomero ErbB2, que fue evidente a los 30 minutos del tratamiento con PEPD (disminucion en el nivel de monomero ErbB2, formacion de heterotnmero de 1 ErbB2 y 2 PEPD, formacion de nuevo homodfmero de ErbB2 y aumento adicional en el heteroteramero de 2 ErbB2 y 2 PEPD (Figura 1f). Notablemente, la presencia de homodfmeros de ErbB2 no ligados a PEPD despues del tratamiento con PEPD probablemente se debio a una reticulacion incompleta de las dos protemas por BS3.

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra que la PEPD induce la fosforilacion de ErbB2 de forma lenta y transitoria, pero causa un agotamiento pronunciado y persistente de ErbB2. En las celulas CHO-K1/ErbB2 que sobreexpresan de forma estable ErbB2 humano y las celulas BT-474 de cancer de mama humano que sobreexpresan constitutivamente ErbB2, se midieron dos sitios clave de fosforilacion de tirosina en ErbB2, pY1221/1222 y pY1196. La fosforilacion de tirosina de ErbB2 en ambos sitios se incremento evidentemente despues de 0,5-1 h de tratamiento con PEPD a 2,7 nM, alcanzo el pico a las 3 h, y retorno en gran medida al nivel basal a las 24 h (Figuras 2a y 2b). A las concentraciones de PEPD mas altas (27 y 270 nM), la fosforilacion de tirosina de ErbB2 en estos sitios aumento adicionalmente y duro mas tiempo (Figura 2c). La fosforilacion de tirosina de ErbB2 relativamente lenta inducida por PEPD es compatible con la union de PEPD relativamente lenta al monomero de ErbB2 y la subsiguiente dimerizacion (Figura 1f). La PEPD se une rapidamente al dfmero de ErbB2 preexistente (Figura 1f), pero se sabe que tales dfmeros presentan autofosforilacion de tirosina. Como se esperaba, ni el factor de crecimiento epidermico (EGF) ni NRG-1 (ligandos de otros ErbB) activaron ErbB2 en celulas CHO-K1/ErbB2 (Figura 9). En las celulas tratadas con PEPD a 2,7 nM, el nivel de protema ErbB2 comenzo a disminuir a la 1 h, alcanzo su nivel mas bajo a las 6 h, que se mantuvo durante al menos 72 h (Figura 2a), mientras que no hubo cambios en el nivel de ErbB2 en las celulas tratadas con vehmulo (Figura 2b). El impacto de la PEPD en el nivel de protema ErbB2 fue dependiente de la dosis y, a 270 nM, la PEPD produjo la eliminacion casi total de ErbB2 (Figura 2c). Para comprender como PEPD produjo el agotamiento de ErbB2, se midio el ECD de ErbB2 en el medio de cultivo y ErbB2-p95 (menos ECD) en los lisados celulares despues de que las celulas CHO-K1/ErbB2 se trataron con PEPD, ya que ErbB2 puede experimentar la liberacion del ECD. Se sabe que el acido 4-aminofenilmercurico (APMA) causa la escision del ECD ErbB2, y como se esperaba, genero el fragmento p95 (menos ECD) en los lisados celulares y el ECD en el medio (Figura 2d). Sin embargo, incluso cuando las celulas se trataron con PEPD a 270 nM durante hasta 6 h, no se produjo la liberacion del ECD de ErbB2 (Figura 2d). Por lo tanto, la PEPD no causa la escision del ECD ErbB2. Ademas, no hubo cambios en el nivel de ARNm de ErbB2 en las celulas CHO-K1/ErbB2 ni en las celulas BT-474 despues del tratamiento con PEPD durante 6 h (Figura 2e), lo que indica que el agotamiento de ErbB2 inducido por PEPD tampoco se debio a la inhibicion de la expresion del gen ERBB2. A continuacion, tanto las celulas CHO-K1 como las celulas CHO-K1/ErbB2 se trataron con vehmulo o PEPD, seguido de tincion por inmunofluorescencia de ErbB2 y PEPD y la deteccion por microscopfa confocal. Las celulas se trataron con PEPD a una alta concentracion (270 nM) para mejorar la deteccion. En las celulas CHO-K1, la tincion con ErbB2 fue despreciable y no hubo tincion con PEPD (Figura 2f), compatible con una expresion muy baja de ErbB2 en estas celulas. En las celulas CHO-K1/ErbB2, ErbB2 se tino fuertemente en la membrana plasmatica y, despues de la incubacion con PEPD durante 0,25 h, tambien se detecto una fuerte tincion de PEPD en la membrana plasmatica, que se colocalizo con ErbB2 (Figura 2f), compatible con la union de PEPD a ErbB2. Sin embargo, en las celulas CHO-K1/ErbB2 tratadas con PEPD durante 2 h, la intensidad de la tincion de ambas protemas en la membrana plasmatica disminuyo, con un aumento concurrente de la tincion en el citoplasma (Figura 2f), lo que sugiere que ErbB2 y PEPD se internalizaron. Se demostro previamente que ErbB2 experimento endocitosis, ubiquitinacion y degradacion independientes de clatrina. En efecto, cuando las celulas se trataron con PEPD a 2,7 nM durante 0,5 h, el nivel de ErbB2 ubiquitinado aumento significativamente (Figura 2g).

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra que la fosforilacion de ErbB2 resulta de la union directa a PEPD, pero la funcion dipeptidasa de PEPD no esta involucrada. Se analizo si la estimulacion de la fosforilacion de ErbB2 por PEPD resulta de la interaccion directa entre las dos protemas. Primero, las celulas CHO-K1 se transfectaron con una mutante de ErbB2 muerta por quinasa (K753M) durante 24 h y luego se trataron con PEPD a 270 nM durante 3 h, una condicion que demostro que causa la fosforilacion maxima de ErbB2 de tipo salvaje. La mutante ErbB2 se sobreexpreso en las celulas despues de la transfeccion genica, pero la PEPD no logro estimular su fosforilacion, mientras que, en la misma condicion experimental, la PEPD estimulo la fosforilacion de ErbB2 tipo salvaje (Figura 3a). A continuacion, las celulas CHO-K1 se transfectaron con las mutantes de ErbB2 que caredan de un subdominio ECD (Figura 1d) durante 24 h y luego se trataron con PEPD a 270 nM durante 3 h. La fosforilacion de ErbB2 inducida por PEPD tanto en pY1221/1222 como en pY1196 tanto en ErbB2/delD1 y ErbB2/delD2 fue comparable a la de WT-ErbB2, ausente en ErbB2/delD3 y atenuada en ErbB2/delD4 (Figura 3a), que se correlaciono bien con la union de PEPD a estas mutantes (Figura 1e). Estos resultados sugieren que la activacion de ErbB2 por PEPD en celulas se debe completamente a la union directa de PEPD a ErbB2.

Se generaron y evaluaron cuatro mutantes de la PEPD humana para comprender mejor la PEPD como un ligando de ErbB2, que incluye R184X-PEPD (supresion de 309 aminoacidos del extremo C-terminal), R265X-PEPD (supresion de 228 aminoacidos del extremo C-terminal), G278D-PEPD (G-> D en el aminoacido #278) y X265R-PEPD (supresion de 228 aminoacidos del extremo N-terminal) (Figura 10a). Las celulas CHO-K1 se transfectaron con ErbB2 humano de tipo salvaje durante 24 h y luego se trataron con PEPD de tipo salvaje y cada uno de sus mutantes a 270 nM durante 3 h. Las mutantes de PEPD no pudieron inducir la fosforilacion de ErbB2, excepto G278D-PEPD, que era identica a la WT-PEPD en la activacion de ErbB2 (Figura 3b). Sin embargo, G278D-PEPD es enzimaticamente inactiva (ver, por ejemplo, Ledoux P, et al. Expression and molecular analysis of mutations in prolidase deficiency. Am J Flum Genet 1996; 59:1035-1039.) Curiosamente, solo WT-PEPD y G278D-PEPD pudieron formar homod^eros (Figura 10b). Por lo tanto, la actividad dipeptidasa de la PEPD no esta involucrada en la activacion de ErbB2, pero es probable que se requiera la homodimerizacion de PEPD para que la PEPD se una y active a ErbB2.

Notablemente, en los experimented descritos anteriormente, PEPD o su mutante G278D no causo una disminucion en el nivel de protema de ErbB2, mientras que PEPD causo un agotamiento pronunciado de ErbB2 en celulas que sobreexpresan ErbB2 de forma estable o constitutiva (Figuras 2a y 2c). Se hallo que en las celulas CHO-K1 que sobreexpresan de forma transitoria ErbB2, la mayona de las moleculas de ErbB2 residfan intracelularmente, mientras que en las celulas CHO-K1 que sobreexpresan ErbB2 de forma estable, la mayona de las moleculas de ErbB2 se expresaron en la superficie celular (Figura 11). Esto puede explicar por que el tratamiento con PEPD durante 3 h no causo una disminucion clara de la protema ErbB2 en las celulas que sobreexpresan transitoriamente ErbB2.

Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra que la PEPD intracelular no modula ErbB2. PEPD es principalmente una protema citosolica. Los niveles de PEPD endogenos en las celulas CHO-K1/ErbB2 y las celulas bT-474 fueron relativamente bajos, pero el nivel de PEPD se podna elevar facilmente en estas celulas mediante la transfeccion genica. Se detecto una sobreexpresion moderada o fuerte de PEPD a las 24 h despues de la transfeccion de un plasmido que expresa PEPD humana, pero ni la fosforilacion de tirosina de ErbB2 ni la expresion de la protema ErbB2 cambiaron despues de la sobreexpresion de PEPD (Figura 4a). Para averiguar si las celulas liberan PEPD, las celulas que sobreexpresan PEPD y las celulas de control se cultivaron en un medio durante 24 h, seguido de la medicion del nivel de PEPD en los lisados celulares por transferencia de Western y en el medio por ELISA. Las concentraciones de PEPD en los medios de las celulas que sobreexpresan PEPD fueron 5,9 veces (celulas CHO-K1/ErbB2) y 10,3 veces (celulas BT-474) mas altas que en los medios de las celulas de control (Figura 4b). Debido a que todas las celulas paredan morfologicamente normales y saludables, el resultado anterior sugiere que las celulas pueden liberar activamente la PEPD. Sin embargo, debido a la aparentemente excesiva dilucion por el medio de cultivo, la concentracion de PEPD extracelular fue demasiado baja (<0,3 nM) para afectar a ErbB2 (Figura 4b).

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra que PEPD silencia rapidamente la senalizacion ErbB2-Src. ERK se halla corriente abajo de ErbB2. Como se esperaba, el tratamiento con PEPD (2,7 nM) llevo a la activacion de ERK en un marco de tiempo que coincidio con el de la fosforilacion de ErbB2 (comparar la Figura 5a con la Figura 2a), lo que sugiere una transmision de senal rapida desde ErbB2 activado a ERK. En efecto, en las celulas CHO-K1 que expresan la mutante K753M de ErbB2 muerta por quinasa, la PEPD no causo ni la fosforilacion de ErbB2 (Figura 3a) ni la fosforilacion de ERK (Figura 12). AKT tambien se halla corriente abajo de ErbB2, pero su fosforilacion S473, que es cntica para su funcion, se redujo con PEPD (2,7 nM) en las celulas CHO-K1/ErbB2 y las celulas BT-474 de una manera dependiente del tiempo (Figura 5a), mientras que el tratamiento con vehteulo no tuvo impacto en la fosforilacion de AKT (Figura 5b). Esto sugirio que PEPD modulo la senalizacion de ErbB2 a traves de mecanismos adicionales. Como se menciono anteriormente, la sobreexpresion de ErbB2 causa dimerizacion espontanea y autofosforilacion de tirosina. Tambien se sabe que Src y PI3K se activan cuando se unen a homodfmeros o heterodfmeros de ErbB2 con fosforilacion de tirosina, lo que lleva a la activacion de AKT. En las celulas CHO-K1/ErbB2, ErbB2 se asocio con Src junto con CK2, un sustrato de Src y una serina/treonina protema quinasa pleiotropica, pero no se detecto PI3K, mientras que en las celulas BT-474, ErbB2 se asocio cno Src, CK2 y PI3K (Figura 5c). El tratamiento de estas celulas con p Ep D (2,7 nM) durante solo 0,5 h llevo a una disociacion marcada de Src y CK2 de ErbB2, pero PI3K permanecio asociada con ErbB2 (Figura 5c). Por consiguiente, la actividad de la quinasa Src se atenuo significativamente mediante PEPD tanto en las celulas CHO-K1/ErbB2 como en las celulas BT-474, mientras que la actividad de PI3K permanecio sin cambios (Figura 5d). Sin embargo, ni Src ni PI3K se modularon significativamente con PEPD en las celulas CHO-K1 (Figura 5d). Otros experimentos demostraron que la fosforilacion de Src en Y419, cntica para su funcion de quinasa, disminuyo significativamente tanto en las celulas CHO-K1/ErbB2 como en las celulas BT-474 despues del tratamiento con PEPD (2,7 nM) durante solo 10 minutos (Figura 5e), lo que indica una union de PEPD rapida a los dfmeros de ErbB2 y rapida alteracion de la unidad de senalizacion de ErbB2-Src. Debido a que el impacto de la PEPD en la Src se produjo antes de un cambio claro en la fosforilacion y expresion de ErbB2, particularmente en las celulas CHO-K1/ErbB2 (Figura 2a), la PEPD probablemente altero la conformacion de los dfmeros de ErbB2 preexistentes, lo que causa la disociacion de SrcB2 de ErbB2.

La supresion de Src y CK2 inducida por PEPD estuvo acompanada por la perdida de la fosforilacion de PTEN en S380 (Figura 5a), en comparacion con los controles tratados con vehteulo (Figura 5b). Se sabe que la fosforilacion de PTEN en este sitio por ^cK2 contribuye a la inhibicion de la actividad de PTEN. Tambien se sabe que la PTEN desfosforila PIP3 unido a la membrana, de este modo inhibe la fosforilacion de AKT y que Src tambien evita la translocacion de la PTEN a la membrana plasmatica al fosforilar directamente la PTEN en los residuos de tirosina. En efecto, la PEPD (2,7 nM, 0,5 h) inhibio la fosforilacion de la tirosina de PTEN en las celulas CHO-K1/ErbB2 y las celulas BT-474 (Figura 5f), y la translocacion de PTEN del citoplasma a la membrana plasmatica aumento despues del tratamiento con PEPD (2,7 nM, 1 h) (Figura 5g).

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra que PEPD se dirige a las celulas que sobreexpresan ErbB2. Los hallazgos de los autores de la union de PEPD a ErbB2 y los cambios subsiguientes se resumen en la Figura 6a. La rapida inhibicion de la Src, que desempena un papel importante en la oncogenesis de ErbB2 junto con un fuerte agotamiento de ErbB2, sugirio que la PEPD podna inhibir las celulas que sobreexpresan ErbB2. Los potenciales efectos inhibidores de la PEPD en las celulas CHO-K1, celulas CHO-K1/ErbB2 y celulas BT-474 se evaluaron utilizando tres ensayos como se describe a continuacion.

El efecto de la PEPD en la smtesis de ADN se midio mediante la incorporacion de BrdU por citometna de flujo. Las celulas se trataron con PEPD a 2,7 y 27 nM durante 48 h. Si bien la PEPD no fue efectiva en las celulas c HO-K1, redujo el numero de celulas CHO-Kl/ErbB2 positivas para BrdU y las celulas BT-474 en hasta un 65% y 50%, respectivamente (Figura 6b). Para medir el efecto de la PEPD en el crecimiento independiente del anclaje, las celulas se cultivaron en agar blando y se trataron con PEPD a 2,7 y 27 nM durante 21 dfas con un cambio de medio cada 3 4 dfas. La formacion de colonias no fue afectada significativamente por la PEPD en las celulas CHO-K1, pero fue inhibida marcadamente por la PEPD tanto en las celulas CHO-K1/ErbB2 como en las celulas BT-474. PEPD redujo el numero de colonias con un diametro de > 100 |jM en celulas CHO-K1/ErbB2 y celulas BT-474 hasta en un 50% y 57%, respectivamente (Figura 6c). El efecto de la PEPD en la invasion y migracion celular se midio utilizando las camaras de BioCoat Matrigel Invasion. Las celulas se cultivaron en la camara superior y se trataron con solvente o PEPD a 2,7 y 27 nM durante 48 h, y se contaron las celulas que invadieron a traves de la membrana de Matrigel en la parte inferior de la camara superior. La PEPD no fue efectiva en CHO-K1, pero inhibio la invasion y migracion de las celulas CHO-K1/ErbB2 y las celulas BT-474 en hasta un 50% y un 51%, respectivamente (Figura 6d). En conjunto, estos resultados confirman que el impacto de la PEPD sobre ErbB2 es predominantemente inhibitorio y tambien muestran que la PEPD se dirige selectivamente a las celulas que sobreexpresan ErbB2.

Sera evidente a partir de los datos anteriores que la presente divulgacion rompe el largo penodo en el que ErbB2 se considera un receptor huerfano. En comparacion con otros ligandos de receptores ErbB, son notables varias caractensticas inusuales de la PEPD humana: no tiene un motivo EGF; aparentemente se une a ErbB2 como un homodfmero; y suprime la senalizacion oncogenica de ErbB2. PEPD se une tanto al monomero de ErbB2 como al dfmero de ErbB2, pero como se muestra en la Figura 1f, PEPD se une a los homodfmeros de ErbB2 mas rapidamente que a los monomeros de ErbB2. Esto explica por que la PEPD causa una variabilidad rapida de la senalizacion de ErbB2-Src (Figura 5), pero un poco mas lenta de la fosforilacion de ErbB2 (Figura 2a).

Cuando se evaluo su efecto sobre el crecimiento y la proliferacion celular, la PEPD no fue efectiva en las celulas CHO-K1 que expresaban un bajo nivel de ErbB2, pero mostraron fuertes actividades inhibitorias en las celulas CHO-K1 que sobreexpresan ErbB2 (celulas CHO-K1/ErbB2) y las celulas BT-474, que incluyen la inhibicion de la smtesis de ADN, el crecimiento independiente del anclaje y la invasion y migracion (Figuras 6b-6d). Esto demuestra que la PEPD se dirige a la adiccion al oncogen ErbB2, ya que las celulas CHO-K1/ErbB2 se derivaron de las celulas CHO-K1; al menos dos mecanismos pueden estar involucrados: la PEPD causa el agotamiento de ErbB2 al inducir la internalizacion y degradacion de ErbB2, y la PEPD inhibe la senalizacion de ErbB2-Src al interrumpir su asociacion (Figura 5). Los efectos de la PEPD en ErbB2 se parecen a los del trastuzumab, un anticuerpo monoclonal dirigido a ErbB2 que se une al subdominio 4 de ECD ErbB2 y se usa actualmente para tratar los canceres de mama ErbB2-positivos. Los datos presentados en los ejemplos anteriores muestran que a concentraciones equimolares, la inhibicion de la proliferacion de las celulas CHO-K1/ErbB2 y celulas BT-474 por parte de PEPD o su mutante G278D fue similar a, si no mejor que la de trastuzumab, mientras que ninguno de los agentes mostro actividad inhibitoria en las celulas CHO-K1 (Figura 14). La PEPD humana recombinante o su mutante, producida en bacterias, potencialmente puede ser una alternativa de bajo costo al trastuzumab altamente costoso que se debe producirse en celulas de mairnferos. Ademas, como se menciono anteriormente, in vivo, el trastuzumab no regula por disminucion la expresion de ErbB2 ni inhibe la fosforilacion de la tirosina de ErbB2 en los tejidos cancerosos; mas bien, su actividad antitumoral depende principalmente de la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC) a traves de su dominio Fc. Por lo tanto, la PEPD o su mutante se pueden sinergizar con trastuzumab o superar en cierta medida la resistencia a trastuzumab de los pacientes. La PEPD no se une a ErbB3 y ErbB4 (Figura 1a), pero es bien sabido que ErbB2 es un companero de heterodimerizacion preferido con estos ErbB. Esto plantea la cuestion de si el bloqueo de la senalizacion oncogenica de ErbB2 por PEPD tambien puede incluir la inhibicion de las unidades de senalizacion del heterodfmero de ErbB2. De forma notable, en el cancer de mama humano, la actividad oncogenica de ErbB2 depende fundamentalmente de ErbB3. Sera evidente para los expertos en la tecnica que la presente divulgacion revela fundamentalmente una funcion nueva de la PEPD humana: un ligando de ErbB2 independiente de su actividad dipeptidasa. Las PEPD de muchas especies comparten una alta homologfa de secuencia con la PEPD humana y tambien se pueden unir y modular a ErbB2.

En vista de los resultados in vitro descritos en los ejemplos 1-6, que apoyan firmemente el uso de PEPD como agente para tratar los canceres positivos para Erb2, se analizaron PEPD y la version enzimaticamente inactiva in vivo para determinar su eficacia contra los canceres ErbB2-positivos en modelos animales clmicamente relevantes, como se describe en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 7

Este ejemplo demuestra el uso de PEPD humana recombinante y su p e p d G278D mutante in vivo como agente anticancengeno. Como fue el caso en los experimentos in vitro mostrados en los ejemplos 1-6, los datos presentados en este ejemplo se obtuvieron usando PEPD humana recombinante y su ^{p e p d}G278D mutante con 6xH marcada en el extremo terminal carboxi que se genero en E. coli y se purifico por cromatograffa de afinidad usando una marca HIS manipulada geneticamente en estas protemas. Estos productos se utilizaron en los siguientes experimentos.

Primero, se realizaron experimentos para buscar la dosis. In vitro, la PEPD a concentraciones tan bajas como 2,7 nM fue efectiva contra las celulas que sobreexpresan ErbB2. A los ratones C57BL/6 se les administro una dosis intraperitoneal unica de PEPD, y los ratones se sacrificaron para la recoleccion de sangre a las 1,6 o 24 h despues de la dosificacion. Mientras se administra PEPD a 10 mg/kg la PEPD plasmatica se elevo a 16,5 nM a 1 h y 13,6 nM a las 24 h pos-dosis, en comparacion con 0,9 nM en los ratones de control, la administracion de PEPD a 0,2 mg/kg produjo inesperadamente una disminucion de 51-61% en el nivel de PEPD en plasma (Figura 14a). Sin embargo, se descubrio que la combinacion de los agentes de PEPD con la enoxaparina (EP), que es una heparina de peso molecular bajo usada clmicamente y se sabe que inhibe el factor Xa y otros factores de coagulacion, produce la persistencia de la PEPD, ya que el nivel plasmatico de PEPD despues de la administracion de PEPD a 0,2 mg/kg fue hasta 64 veces mayor en ratones tratados previamente con EP que en ratones sin tratamiento con EP (Figura 14b). Sin pretender estar restringido por ninguna teona particular, se considera que la EP puede estar reduciendo la degradacion de la PEPD. Es plausible que otros inhibidores de la coagulacion tambien sean efectivos para mantener la concentracion plasmatica de PEPD in vivo. A continuacion, se analizo si la PEPD inhibe el crecimiento de los tumores que sobreexpresan ErbB2 in vivo. Las celulas CHO-K1/ErbB2, que sobreexpresan de forma estable ErbB2 humana, pero expresan cualquier otro receptor de la familia ErbB, se inocularon por via subcutanea en los flancos de ratones atfmicos hembras (6-7 semanas de edad) a 1 x 106 celulas por sitio en volumen pequeno de mezcla de PBS:Matrigel. A partir de 4 dfas despues de la inoculacion celular, los ratones recibieron un vehmulo o EP a 2,5 mg/kg por inyeccion intraperitoneal una vez por dfa. T res dfas despues de comenzar el tratamiento con EP (el dfa 7 despues de la inoculacion celular), cuando el volumen del tumor alcanzo aproximadamente 41 mm3, los ratones tratados con EP tambien se trataron con vehmulo o PEPD a 0,02 mg/kg o 0,2 mg/kg por inyeccion intraperitoneal, que se administro tres veces por semana (lunes, miercoles, viernes). De forma notable, en los dfas en que se administraron EP y vehmulo/PEPD, el vehmulo o PEPD siempre se administro 1 h despues de la dosificacion de EP. El volumen del tumor se midio tres veces por semana (lunes, miercoles y viernes) por largo x ancho2/2. Los ratones se sacrificaron 24 h despues del ultimo tratamiento que se administro el dfa 24 despues de la inoculacion celular (un total de 8 tratamientos con PEPD), y se recogieron muestras de sangre de los ratones para medir los niveles plasmaticos de PEPD mediante ELISA. Si bien la EP no tuvo efecto sobre el crecimiento del tumor, EP mas PEPD a 0,02 y 0,2 mg/kg inhibio el crecimiento del tumor en 27% (estadfsticamente insignificante) y un 65% (estadfsticamente muy significativo), respectivamente (Figura 15a). Los niveles plasmaticos de PEPD total (PEPD de raton endogena mas PEPD humana) al final del experimento fueron de 1,9 nM en el grupo de EP solo, 5,5 nM en el grupo de EP mas PEPD de dosis mas baja y 33,0 nM en el grupo de EP mas PEPD de dosis alta, que son 1,4-, 4,2-, 24,8 veces mas que en los ratones de control (Figura 15b).

A continuacion, se analizo si PEPD se dirige espedficamente a los tumores que sobreexpresan ErbB2 in vivo. Las celulas CHO-K1 que expresan ErbB2 despreciable y que no expresan otros ErbBs se inocularon por via subcutanea en los flancos de ratones desnudos atfmicos hembra (6-7 semanas de edad) a 1 x 106 celulas por sitio en un volumen pequeno de mezcla de PBS;Matrigel. A partir de 4 dfas despues de la inoculacion celular, los ratones se trataron con EP a 2,5 mg/kg por inyeccion intraperitoneal una vez por dfa. Tres dfas despues (el dfa 7 despues de la inoculacion celular), cuando el volumen del tumor alcanzo aproximadamente 26 mm3, los ratones tambien se trataron con vehmulo o PEPD a 0,2 mg/kg por inyeccion intraperitoneal, que se administro tres veces por semana (lunes, miercoles y viernes). En los dfas en que se administraron EP y PEpD/vehnculo, PEPD/vehmulo siempre se administro 1 h despues de la administracion de EP. El volumen del tumor se midio tres veces por semana (lunes, miercoles y viernes). Los ratones se sacrificaron 24 h despues del ultimo tratamiento que se administro el dfa 21 despues de la inoculacion celular (un total de 7 tratamientos con PEPD), y se recogieron muestras de sangre de los ratones para medir el nivel plasmatico de PEPD. El tratamiento con PEPD no tuvo efecto sobre el crecimiento del tumor (Figura 16a), aunque los niveles plasmaticos se elevaron como se esperaba (Figura 16b). Por lo tanto, nuestros datos presentados en la presente demuestran que la PEPD se dirige espedficamente a tumores que comprenden celulas que sobreexpresan ErbB2.

A continuacion, se evaluo el efecto de la PEPD en un modelo de tumor de mama ortotopico. Las celulas BT-474 del cancer de mama humano sobreexpresan constitutivamente ErbB2 y se han utilizado ampliamente para generar tumores de mama ortotopicos para la evaluacion de terapias anti-ErbB2. Se implantaron subcutaneamente ratones desnudos atfmicos hembra (6-7 semanas de edad) con una liberacion de 60 dfas de pellet de 17p-estradiol (1,7 mg de estradiol, adquirido en Innovative Research of American) antes de la inoculacion ortotopica de celulas BT-474 en las almohadillas de grasa mamarias (2 x 106 celulas por sitio en un volumen pequeno de mezcla de PBS:Matrigel). Veintitres dfas despues de la inoculacion de las celulas cancerosas, todos los ratones comenzaron el tratamiento diario de EP a 0,5 mg/kg diarios mediante inyeccion intraperitoneal. De forma notable, un experimento de busqueda de dosis mostro que la EP a 0,5 mg/kg fue tan efectiva como 2,5 mg/kg en el mantenimiento de la concentracion de PEPD en la sangre. Ademas, otro grupo de ratones a los que se implanto 17-p-estradiol y luego se inocularon con celulas BT-474 se mantuvieron como un control sin tratamiento, para confirmar que la PE misma no tema ningun efecto sobre el crecimiento del tumor. Los ratones sin tratamiento se mantuvieron durante 58 dfas despues de la inoculacion de celulas cancerosas (Figura 17a). Los ratones tratados con EP se aleatorizaron en tres grupos para recibir el vedculo, PEPD y ^{p e p d}G278D, mientras que el tratamiento diario con EP continuo. Sobre la base de su experiencia con PEPD en el modelo de tumor CHO-K1/ErbB2, los autores decidieron tratar a los ratones con PEPD o su mutante a 2 mg/kg. El tratamiento con vedculo, PEPD o su mutante se inicio 4 dfas despues del comienzo del tratamiento con EP (el dfa 27 despues de la inoculacion de las celulas cancerosas), y cada uno se administro mediante inyeccion intraperitoneal tres veces por semana (lunes, miercoles y viernes). Cuando la EP tambien se administro el mismo dfa, siempre se administro 1 h antes que el otro agente. El volumen del tumor se midio los lunes, miercoles y viernes cada semana. Como se muestra en la Figura 17a, el EP no tuvo efecto sobre el crecimiento del tumor, pero tanto la PEPD como la PEPDG278D causaron rapidamente la contraccion del tumor. p e p d G278D fue mas efectiva que PEPD (la diferencia en el volumen del tumor entre los dos grupos es estadfsticamente significativa). En vista de la fuerte eficacia antitumoral de los agentes, todos los tratamientos se detuvieron un mes despues (la ultima dosis se administro el dfa 58 despues de la inoculacion de las celulas cancerosas) y los ratones se mantuvieron en observacion. Tambien se obtuvo un pequeno volumen de sangre de los ratones 24 h despues de la ultima dosis para medir el nivel de PEPD en plasma. El nivel de PEPD plasmatico en ratones tratados con EP solo fue 1,9 nM, 1,4 veces mas alto que en ratones sin tratamiento (Figura 17b), lo que demuestra nuevamente que la EP facilita significativamente la persistencia de PEPD de raton endogena. Ademas, los niveles plasmaticos de PEPD en los ratones tratados con EP mas PEPD y EP mas ^{p e p d}G278D fueron 154,3 nM y 128,6 nM, respectivamente, que son 111,0 y 92,5 veces mas altos que en los ratones sin tratamiento (Figura 10b). Se implanto un segundo pellet de 17p-estradiol a cada raton el dfa 59 despues de la inoculacion de las celulas cancerosas. Tres semanas despues de la detencion del tratamiento (en el dfa 80 despues de la inoculacion del cancer), los tumores en algunos ratones que se trataron previamente con PEPD o su mutacion volvieron a crecer. Sin embargo, el 50% de los ratones tratados con ^{p epd}G278D permanecieron libres de tumores y el 27% de los ratones tratados con PEPD permanecieron libres de tumores (Figura 17a), otra indicacion de que p e p d G278D es mas efectivo que PEPD. Todos los ratones con recrecimiento tumoral se volvieron a tratar con EP mas ^{p e p d}G278D: la EP diaria a 0,5 mg/kg por inyeccion intraperitoneal se inicio el dfa 89 despues de la inoculacion de las celulas cancerosas, y se administro p e p d G278D a 2 mg/kg por inyeccion intraperitoneal cada dos dfas por un total de 4 dosis. Como se describio anteriormente, los dfas en que se administraron E^py ^{p e p d}G278D, EP se administro 1 h antes. El experimento se termino 24 h despues de la ultima dosis de p e p d G278D. Como se muestra en la Figura 17a, todos los tumores todavfa eran exquisitamente sensibles a ^{p e p d}G278D, lo que indica que el recrecimiento tumoral no se debio a la presencia de celulas cancerosas que eran resistentes a PEPD o ^{p e p d}G278D, sino que se debio a una erradicacion inicial incompleta de las celulas cancerosas. Ademas, los ratones tratados previamente con EP solo se volvieron a tratar con EP a 0,5 mg/kg una vez por dfa, lo que comenzo el dfa 82 despues de la inoculacion de las celulas cancerosas, y 4 dfas despues, los ratones se dividieron en dos grupos: tratamiento con vedculo o tratamiento con ^{p e p d}G278D a 2 mg/kg, se trataron tres veces por semana (lunes, miercoles y viernes) mediante inyeccion intraperitoneal por un total de 5 dosis. El experimento finalizo 24 h despues de la ultima dosis. Como se muestra en la Figura 17a, la P^{e p d}G278D causo una rapida contraccion del volumen del tumor, aun cuando los tumores eran extremadamente grandes al comienzo del tratamiento. Tambien es importante tener en cuenta que la significativa eficacia antitumoral de la PEPD y la PEPDG278D no se asocio con ninguna toxicidad: ningun efecto sobre el aumento de peso corporal del raton o el peso de los organos tales como colon, corazon, rinon, dgado, pulmon y estomago. Esto indica que los agentes a las dosis terapeuticamente efectivas no son toxicos.

Ejemplo 8

Este ejemplo proporciona una demostracion de preparacion de una protema (fusion) hnbrida PEPD-Fc.

El T rastuzumab, que se une al subdominio 4 en el dominio extracelular de ErbB2, es el agente anti-ErbB2 mas exitoso y mas ampliamente usado en el cancer de mama. Sin embargo, la tasa de respuesta global al trastuzumab aun es modesta, y la resistencia primaria y secundaria sigue siendo un desafm clmico. El dominio Fc del trastuzumab es cntico por su actividad antitumoral mediante el acoplamiento de los receptores Fc en las celulas efectoras inmunes y la provocacion de citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpo. En efecto, un estudio clmico encontro que el transtuzumab a los niveles de dosis utilizados para tratar los canceres de mama ErbB2-positivos no tema capacidad para regular por disminucion las protemas de ErbB2 en los tejidos cancerosos (Gennari R, et al. Clinical Cancer Research 2004, 10(17): 5650-5655). Tambien se sabe que Fc promueve la persistencia de anticuerpos en la sangre. Sin embargo, PEPD no tiene un dominio Fc.

Se realizaron pruebas con el objetivo de realizar y determinar si la adicion de Fc a PEPD para potenciar su actividad antitumoral sena plausible. La molecula Idbrida PEPD-Fc tambien se puede retener en la sangre a un nivel mas alto y durante un tiempo mas prolongado que la PEPD. Se ha generado PEPD-Fc (peso molecular del monomero: 80,9 kD). Brevemente, la secuencia codificadora completa de la PEPD humana se subclono en el vector pFUSE-hIgG1-Fc (InvivoGen), unida en el marco en su extremo C-terminal a la secuencia Fc de la IgG1 humana. El constructo resultante (pFUSE-PEPD-Fc) se verifico mediante secuenciacion y se transfecto a celulas CHO-K1, y la protema hfbrida expresada en los lisados celulares se purifico usando protema A-Sefarosa. La alta pureza de PEPD-Fc se confirmo mediante SDS-PAGE. La bioactividad de PEPD-Fc se comparo con la de PEPD. Las celulas CHO-K1/ErbB2 se trataron con vehmulo, PEPD-Fc o PEPD (ambas a 27 nM) durante 3 horas o 6 horas. La PEPD-Fc causo un agotamiento de la protema ErbB2 dependiente del tiempo y significativo, pero fue algo menos efectiva que la PEPD (Figura 18). Es posible que PEPD-Fc simplemente sea un poco mas lenta que la PEPD para causar el agotamiento de ErbB2, y el aumento del tiempo de tratamiento puede permitir que la PEPD-Fc logre el mismo impacto en ErbB2 que la PEPD. Sin embargo, como se muestra en la Figura 18, los dos agentes mostraron un impacto muy similar en la fosforilacion de ErbB2 y en la fosforilacion de ERK, y en el silenciamiento de la senalizacion de ErbB2-Src (disminucion de la fosforilacion de Src, PTEN y AKT). Los resultados indican que PEPD-Fc en gran parte, si no totalmente, retiene la actividad moduladora de ErbB2 de PEPD. Debido a que se espera que PEPD-Fc se acople con las celulas inmunes in vivo, puede ser significativamente mas potente que PEPD o ^pE^pdG278D para combatir los canceres ErbB2-positivos.

Dado el beneficio de la presente divulgacion, PEPD-Fc hnbrido y PEPDG278D-F^cse pueden evaluar facilmente en modelos animales. Estos hnbridos se pueden generar en celulas de mamfferos (por ejemplo, celulas CHO-K1) para asegurar la glicosilacion en N297 de Fc, que es esencial para la funcion de Fc. Curiosamente, la Fc aglicosilada con ciertas mutaciones mantiene su bioactividad, que incluye, pero sin limitacion FcT299A y fcE382V/M4281. Por lo tanto, se pueden generar hfbridos adicionales con mutaciones espedficas en la secuencia de Fc, tal como en E. coli y evaluar utilizando tecnicas convencionales, dado el beneficio de la presente invencion.

Ejemplo 9

Como se puede ver en la Figura 17a, y en las Figuras 19 (a)-(e) que resumen los datos obtenidos mediante la medicion de los cambios in vivo en tumores tratados con rhPEPD o rhPEPDG278D, rhPEPDG278D es superior a rhPEPD con respecto a la reduccion del volumen tumoral in vivo (Figura 17a y Figura 19(a)). Sin pretender estar limitados por ninguna teona en particular, los autores consideran que esto esta relacionado con el descubrimiento novedoso de que rhPEPDG278D no estimula la senalizacion de HIF-1a, mientras que PEPD sf (Figura 19(e)). A este respecto, es bien sabido en la tecnica que VEGF y GLUT-1 son blancos corriente debajo de HIF-1a, y los diferentes efectos sobre estos marcadores son similares al efecto sobre HIF-1a. Los tres son factores de prosupervivencia bien conocidos. Sin embargo, tambien se observo que tanto PEPD como ^{p e p d}G278D eliminaron la senalizacion de ErbB2, lo que inactiva ErbB3, asf como activa la apoptosis en los tejidos tumorales. Ambos agentes causaron agotamiento de ErbB-2, desfosforilacion de ErbB2 (inactivacion), desfosforilacion (inactivacion) de SRC, AKT, ERK, ErbB3, regulacion por disminucion de BcI-2 antiapoptotico, BAX proapoptotico y activacion de multiples caspasas en los tejidos tumorales (Figura 19b). Ambos agentes tambien redujeron la actividad quinasa SRC y la actividad PI3K en los tejidos tumorales (Figura 19c). Tambien se halo que tanto la PEPD como la p e p d G278D se internalizaron en las celulas tumorales en un grado similar, segun lo medido por su marca His (Figura 19e). Este hallazgo respalda el concepto de que la PEPD o PEPDG278D se puede conjugar con una toxina o un agente quimioterapeutico del cancer, como se explico anteriormente, para mejorar la eficacia contra el cancer.

Es notable que in vivo, trastuzumab/herceptina no regula por disminucion la expresion de ErbB2 ni inhibe la fosforilacion de la tirosina de ErbB2 en tejidos cancerosos (Gennari et al., Clinical Cancer Research, 10, 5650-5655, 2004; Gijsen et al., PLoS Biology, 8, e1000563, 2010). Mas bien, la herceptina se basa principalmente en la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpo (ADCC). Por lo tanto, sobre la base de los datos presentados en este documento, es plausible que rhPEPDG278D pueda complementar la herceptina o superar cierta resistencia a la herceptina.

Ejemplo 10

Este ejemplo proporciona una descripcion de los materiales y metodos que se utilizaron para obtener los datos descritos en los ejemplos 1-9.

Reactivos. Quimeras recombinantes, que incluyen ErbB2/ECD-Fc humano (1129-ER-050), ErbB3/ECD-Fc humano (348-RB-050) y ErbB4/ECD-Fc humano (1131-ER-050) as ^ como Fc recombinante de IgGi humana (110-HG-100) provinieron de R&D systems. El EGF humano recombinante (236-EG-200) y el NRG-1 humano (5218) se adquirieron en R&D Systems y Cell Signaling, respectivamente. Trastuzumab (Genentech) se obtuvo de Roswell Park Cancer Institute Pharmacy. El acido 4-aaminofenilmercurico (APMA), cristal violeta, bromuro de metiltiazolildifenil-tetrazolio (MTT) y vanadato provinieron de Sigma-Aldrich. Se utilizaron los siguientes anticuerpos:: anti-PEPD (Abeam, ab86507), anti-PTEN (Santa Cruz, sc-7974), anti-p-PTEN (Santa Cruz, sc-101789), anti-p-Tyr (PY99) (Santa Cruz, sc-7020), anti-CK2a (Santa Cruz, sc-12738), anti-ECD of ErbB2 (Santa Cruz, sc-134481), anti-ErbB3 (Santa Cruz, sc-285), anti-TGFa (Santa Cruz, sc-9043), anti-ErbB2 (Cell Signaling, 2165), anti-p-ErbB2 (Y1196) (Cell Signaling, 6942), anti-p-ErbB2 (Y1221/1222) (Cell Signaling, 2243), anti-ErbB1 (Cell Signaling, 2232), anti-ErbB4 (Cell Signaling, 4795), anti-PI3K p85 (Cell Signaling, 4257), anti-p-Src (Cell Signaling, 6943), anti-Src (Cell Signaling, 2123), anti-AKT (Cell Signaling, 4691), anti-p-AKT (Cell Signaling, 4060), anti-ERK (Cell Signaling, 9102), anti-p-ERK (Cell Signaling, 9101), anti-ubiquitina (Santa Cruz, sc-8017), anti-GAPDH (Millipore, MAB374), anti-human IgG1 for detection of Fc (Santa Cruz, sc-2453), anti-marca His conjugada con FITC (Abeam, ab1206), anti-marca His conjugada con biotina (Bethyl, A190-113B), y anti-cpnejo de cabra conjugado con TRITC (Jackson, 111-025-003). La estreptavidina conjugada con HRP (N100) provino de Thermo Scientific.

La PEPD humana recombinante y sus mutantes (6xHis marcada en el extremo carboxi-terminal) se generaron en bacterias y se purificaron utilizando cromatograffa de afinidad de mquel (Qiagen). La pureza de cada protema se confirmo mediante electroforesis en gel y tincion con plata (Figura 10b). Los detalles para la preparacion de PEPD y sus mutantes, asf como otros reactivos, se proporcionan a continuacion.

El sistema de expresion bacteriano pBAD/TOPO ThioFusion (Invitrogen) se utilizo para producir y purificar PEPD y las mutantes de PEPD. En resumen, se uso pCMV6-XL5-PEPD (Origene) como molde para amplificar la PEPD humana de longitud completa mediante PCR usando cebadores para 5'-AATACGACTCAC^tA^tAG^gG^cG-3'(SEQ ID NO: 2) y Rev-5'-CTTGGGGCCAGAGAAGG-3' (SEQ ID NO: 3), que se disenaron para expresar PEPD como una protema nativa con 6xHis marcada en el extremo carboxi-terminal (pero sin el Tio N-terminal). Los fragmentos de PCR resultantes se subclonaron en el vector de expresion pBAD/Tio-TOPO mediante clonacion de TA. El constructo se secuencio para asegurar la integridad de la secuencia codificadora entera. La expresion y la purificacion se realizaron segun lo indicado por el fabricante. La mutante PEPD G278D, asf como otros mutantes, que incluyen el fragmento de 184 aminoacidos N-terminal, el fragmento de 265 aminoacidos N-terminal y el fragmento de 265 aminoacidos C-terminal, se generaron por mutagenesis dirigida al sitio usando el kit de mutagenesis dirigida al sitio QuikChange Lightning Multi (Agilent Technologies) y usando el vector de expresion PEPD descrito anteriormente como molde. Los constructos se secuenciaron para asegurar la mutacion correcta. Tanto la PEPD de tipo salvaje como la PEPD mutante se purificaron mediante cromatograffa de agarosa Ni-NTA (Qiagen). Las protemas se purificaron adicionalmente usando Ultracel YM-30 Centricon (Millipore). La SDS-PAGE se realizo en geles de acrilamida 8-10% en condiciones desnaturalizantes y reductoras, y los geles se tineron con tincion con plata para examinar la pureza de la protema. Las preparaciones tambien se verificaron para determinar la posible contaminacion con lipopolisacaridos, usando el kit E-TOXATE (Sigma), siguiendo las instrucciones del fabricante, pero no se detectaron lipopolisacaridos (ffmite de deteccion: 0,005 unidades de endotoxinas por 0,1 ml de muestra).

Lineas celulares y cultivo celular. Las celulas BT-474 y las celulas CHO-K1 eran de ATCC. Las celulas CHO-K1/ErbB2 se generaron por transfeccion de celulas CHO-K1 con pcDNA3-ERBB2 y se seleccionaron bajo G418. Se cultivaron celulas CHO-K1 y celulas CHO-K1/ErbB2 en medio F-12K (Gibco) suplementado con FBS 10% (Gibco). Las celulas BT-474 se cultivaron en DMEM rico en glucosa 50% (Mediatech)/50% de medio F-12K suplementado con FBS 10%. En el estudio tambien se utilizaron celulas MCF-7 de cancer de mama humano y celulas RT-4 de cancer de vejiga humanas, de ATCC. Las celulas MCF-7 y las celulas RT-4 se cultivaron en DMEM rico en glucosa mas FBS 10% y medio de McCoy'5A mas FBS 10%, respectivamente. Todas las celulas se cultivaron en incubadoras humidificadas a 37 °C con CO25%.

Transfeccion genica y plasmidos. Las celulas se cultivaron en placas de 6 pocillos y se transfectaron con un plasmido usando FuGENE HD (Promega) o Lipofectamine 2000 (Invitrogen). pCMv6-XL5-PEPD que expresa PEPD humana de tipo salvaje era de Origene. Se utilizo pMT107-His-Ub para expresar la ubiquitina. pCMV6-XL5-ERBB2 que expresa ErbB2 humano se genero mediante la clonacion de la secuencia codificadora de ERBB2 humano de longitud completa en el vector de expresion de mairnferos pCMV6-XL5 (Origene). Para construir pCMV6-XL5-ERBB2 que expresa ErbB2 humano, la secuencia codificadora de ERBB2 humano de longitud completa se amplifico por PCR a partir del ADNc de LNCaP usando el cenador directo Notl (5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGCTGAGATTCCCCTCCATT-3') (SEQ ID NO: 4) y cebador inverso Notl (5'-ATAGTTTAGCGGCCGCCTTGATGCCAGCAGAAGTCA-3' (SEQ ID NO: 5). Los productos de la PCR amplificados se digirieron con Notl (New England BioLabs), seguido del ligamiento en pCMV6-XL5 (Origene) que se predigirio con la misma enzima de restriccion. La orientacion del inserto se determino mediante PCR de colonias usando el cebador directo 5'-CAAATGGGCGGTAGGCGTGTA-3' (SEQ ID NO: 6) (localizado en el plasmido) y el cebador inverso 5'-ATTGGTGGGCAGGTAGGGGTTC-3' (SEQ ID NO: 7) (apareado en el inicio del inserto). El constructo se secuencio para confirmar la integridad de la secuencia codificadora entera. Todas las mutaciones y supresiones dirigidas al sitio en el gen ERBB2 se realizaron en pCMV6-XL5-ERBB2, utilizando el kit de mutagenesis dirigida al sitio de rayos QuikChange Lightning. Estos constructos incluyen ErbB2 que lleva la mutacion K753M (pCMV6-XL5-ERBB2/K753M), supresion del subdominio 1 de ECD de ErbB2 (pCMV6-XL5-ERBB2/delD1, supresion de los aminoacidos 1-195), supresion del subdominio 2 de ECD ErbB2 (pCM)-XL5-ERBB2/delD2, supresion de los aminoacidos 196-320), supresion del subdominio 3 de ECD ErbB2 (pCMv6-XL5-ERBB2/delD3, supresion de los aminoacidos 321-488) y supresion del subdominio 4 de ECD ErbB2 (pCMV6-XL5-ERBB2/delD4, supresion de los aminoacidos 489-560). Todos los constructos se secuenciaron para asegurar la mutacion/supresion correcta.

Analisis de electrotransferencia. La preparacion de los lisados celulares, la medicion de la concentracion de protemas y la electrotransferencia se realizaron utilizando tecnicas estandares. La membrana celular, las fracciones de citosol o los lisados celulares menos la membrana celular se prepararon utilizando el kit de reactivo de extraccion de protema de membrana eucariotica Mem-PER (Thermo Scientific). El medio de cultivo celular se concentro 20 veces utilizando Centricon (Millipore) antes del analisis. En experimentos que miden la union de PEPD o NRG-1 a ECD ErbB2, ECD ErbB3 o ECD ErbB4 se uso un kit de tincion con plata (Invitrogen) para mostrar las protemas despues de la electroforesis en gel. Para detectar la dimerizacion del receptor ErbB2, las celulas tratadas con PEPD y las celulas de control se lavaron con PBS enfriado con hielo y se incubaron con el agente de reticulacion BS3 (Pierce) a 2 mM durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reaccion de reticulacion se termino mediante la adicion de Tris 50 mM (final, pH 7,5), seguido de una incubacion a temperatura ambiente durante 15 minutos. Los lisados celulares se analizaron mediante electrotransferencia (SDS-PAGe 3,5%). Se uso electroforesis en gel no reductor para determinar, ademas de la PEPD humana de tipo salvaje, si alguna de sus mutantes, que incluyen G278D-PEPD, R184X-PEPD, R265X-PEPD y X265R-PEPD, existfa como homodfmero. Brevemente, cada muestra de protema se mezclo con un tampon de muestra no reductor (tampon de carga de muestra sin p-mercaptoetanol) y luego se resolvio mediante SDS-PAGE 10%, antes de la tincion con plata. Las concentraciones de protema de todas las muestras se midieron con el kit de ensayo de acido bicinconmico (BCA) (Pierce).

Inmunoprecipitacion. La PEPD se incubo con ErbB2/ECD-Fc, ErbB3/ECD-Fc, ErbB4/ECD-Fc o Fc en un tampon de union durante 2 horas a 37 °C, seguido de extraccion con perlas de protema G-sefarosa. Los inmunoprecipitados se lavaron con tampon de lavado de IP y se analizaron mediante electrotransferencia. Para la deteccion de la union directa y espedfica de PEPD o NRG-1 a ErbB2, ErbB3 o ErbB4, se incubo PEPD humana recombinante o NRG-1 con ErbB2/ECD-Fc humana recombinante, ErbB3/ECD-Fc humana recombinante, ErbB4 humana recombinante/ECD-Fc o Fc humana recombinante en 0,4 ml de tampon de union. Todas las soluciones se incubaron durante 2 horas a 37 °C, seguido de incubacion con perlas de protema G-sefarosa durante 1 hora a temperatura ambiente. Los inmunoprecipitados se lavaron con tampon de lavado IP y luego se sometieron a un analisis de electrotransferencia. En experimentos con lisados de celulas enteras, las celulas se lisaron en un tampon de M-PER suplementado con una mezcla de inhibidores de proteinasa (Roche Applied Science), y los lisados se incubaron con un anticuerpo espedfico durante la noche a 4 °C, seguido de extraccion por la protema G-agarosa. Los inmunoprecipitados se lavaron con tampon de lavado IP y se analizaron mediante electrotransferencia. Para medir el efecto de la PEPD sobre la fosforilacion de tirosina de PTEN, las celulas se pretrataron con pervanadato 30 pM durante 10 minutos para inhibir la tirosina fosfatasa relevante y luego se trataron con PEPD o vehmulo, seguido de la preparacion de lisados celulares para su analisis. Se preparo pervanadato fresco incubando vanadato 10 mM con peroxido de hidrogeno 10 mM durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adicion de catalasa (Sigma) a una concentracion final de 0,2 mg/ml para eliminar el peroxido de hidrogeno residual.

Medicion basada en ELISA de PEPD y union de PEPD a ErbB2. Para medir la union de PEPD a ErbB2 humano o sus mutantes de supresion, las placas de ELISA se recubrieron durante la noche a 4 °C con 100 pl/pocillo de un anticuerpo ErbB2 (union a la cola citoplasmica de ErbB2) a 10 pg/ml. Despues de lavar los pocillos tres veces con PBST, los sitios de union a protemas residuales en los pocillos se bloquearon mediante incubacion durante 2 horas a temperatura ambiente con 300 jl/pocillo de BSA 1% en PBS. Despues de la adicion de 60 j l de PEPD humana recombinante diluida en serie en cada pocillo, 60 j l de lisados celulares (preparados a partir de celulas CHO-K1 transfectadas con el vector vado durante 24 h y celulas CHO-K1 transfectadas con ErbB2 de tipo salvaje durante 24 h), que contiene 25 jg de protema total por muestra (nota: un experimento preliminar con hasta 250 jg de protema total por muestra mostro un resultado similar de union de PEPD a ErbB2), se anadieron a cada pocillo y se incubaron a 37 °C durante 2 h . Despues de tres lavados con PBST, se anadieron a cada pocillo 100 j l de un anticuerpo anti-His conjugado con biotina (dilucion 1: 10,000; cabe mencionar que la PEPD esta marcada con His) y se incubo durante 2 horas a temperatura ambiente. Despues de otra ronda de lavado con PBST, se anadieron 100 j l de HRP conjugada con estreptavidina (dilucion 1: 10,000) a cada pocillo y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. Despues de otra ronda de lavado con PBST, se anadieron 100 jl/pocillo de solucion de sustrato 1x (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) y, despues del desarrollo de color adecuado, se anadieron 100 jl/pocillo de solucion de detencion (H2SO41 N) y se registro la lectura de absorbancia a 450 nm. En experimentos que comparan la union de PEPD a ErbB2 de tipo salvaje y sus mutantes de supresion (supresion de los subdominios 1,2, 3 o 4 en el ECD de ErbB2), se utilizaron cantidades iguales de protema ErbB2 de tipo salvaje y sus mutantes. Los lisados de celulas transfectadas con el plasmido que expresa cada protema (durante 24 h) se sometieron primero a un analisis de electrotransferencia, seguido de una medicion de densitometna de las bandas de protemas espedficas normalizadas a un control de carga, para calcular la cantidad de lisados que liberan la misma cantidad de cada protema (se utilizaron 25 jg de protema total/muestra para los lisados que llevan el ErbB2 de tipo salvaje).

Medicion de la concentracion de PEPD por ELISA. Para medir las concentraciones de PEPD, se recubrieron placas ELISA de 96 pocillos con 100 jl/pocillo de anticuerpo monoclonal anti-PEPD diluido de raton (2,5 jg/ml) a 4 °C durante la noche. Las placas se lavaron veces tres veces con solucion salina tampon de fosfato con Tween 20 (PBST) y se bloquearon con 200 jl/pocillo de tampon de bloqueo (incubacion durante al menos 2 horas a temperatura ambiente). Las placas se lavaron con PBST y luego se incubaron con 100 jl/pocillo de estandar de PEPD o muestras, que se diluyeron adecuadamente, durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBST y cada pocillo se incubo luego con 100 j l de un anticuerpo de deteccion (un anticuerpo anti-PEPD policlonal de conejo) durante 2 horas a temperatura ambiente. Despues de lavar las placas tres veces con PBST, se anadieron 100 j l de reactivo secundario (IgG-HRP anti-conejo de cabra) a cada pocillo, seguido de 1 h de incubacion a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo con PBST tres veces y luego cada pocillo se incubo con 100 j l de una solucion de sustrato HRP (sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina de Cell Signaling, #7004). Despues de un desarrollo de color adecuado, se anadieron 100 j l de solucion de detencion (Cell Signaling, #7002) a cada pocillo y se registro la absorbancia a 450 nm mediante un lector de placas de microtitulacion. Se utilizo PEPD puro como estandar.

Tincion con inmunofluorescencia y microscopia confocal. Las celulas se cultivaron en portaobjetos de camara (1,5 x 104 celulas/pocillo) durante la noche, seguido de un tratamiento con PEPD o vedculo. Luego, las celulas se lavaron con PBS enfriado con hielo, se fijaron con paraformaldeddo 4% durante 15 min a temperatura ambiente, se lavaron nuevamente con PBS enfriado con hielo, y se bloquearon con BSA 1% en PBS durante 45 min a temperatura ambiente. Luego, las celulas se incubaron con un anticuerpo ErbB2 durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron con PBS, se incubaron con un anticuerpo marcado con His conjugado con FITC (para deteccion de PEPD) y un anticuerpo secundario conjugado con TRITC (para deteccion de ErbB2) durante 1 h a temperatura ambiente, y se lavaron nuevamente con PBS. Luego se examinaron las celulas con un microscopio confocal Zeiss LSM 510.

RT-PCR. Se aislo el ARN total usando el kit de RNeasy Mini (Qiagen), y despues del tratamiento con TURBO DNasa para eliminar la posible contaminacion del ADN genomico, se transcribieron de forma inversa 500 ng de ARN por muestra en ADNc en una reaccion de 25 j l usando los reactivos de transcripcion inversa TaqMan (Invitrogen). La reaccion RT se realizo a 25 °C durante 10 min, seguido de calentamiento a 48 °C durante 30 min, y luego a 95 °C durante 5 min. Cada amplificacion de PCR se llevo a cabo en un volumen de 20 jl, que contiene 10 j l de la mezcla maestra GoTaq (2x) (Promega), 0,5-1 j l de la mezcla de transcripcion inversa (ADNc), 0,25 jM de cada uno de los cebadores directos e inversos espedficos. Los cebadores son los siguientes: ERBB2 humano, directo, 5'-CTGTTTGCCGTGCCACCCTGAGT-3' (SEQ ID NO: 8), inverso, 5'-CTT CT GCTGCCGTCGCTTGATGAG-3' (SEQ ID NO: 9); GAPDH humano, directo, 5-CCAGGGCTGCTTTTAACT C-3'(SEQ ID NO: 10), inverso, 5'-GCTCCCCCCCCT GCAAATGA-3' (SEQ ID NO: 11); GAPDH de hamster chino, directo, 5'-TGGAAT CT ACT GGCGT CTT C-3' (SEQ ID NO: 12), inverso, 5'-CACCACCTT CTTGATGTCCT-3' (SEQ ID NO: 13). Las condiciones de PCR utilizadas para todas las reacciones son las siguientes: 94 °C durante 3 minutos, 28 ciclos (ERBB2 humano)/25 ciclos (GAPd H) a 94 °C (desnaturalizacion) durante 30 segundos, 63 °C (ERBB2 humano)/60 °C (GAPDH humano)/56 °C (GAPDH de hamster chino) durante 30 segundos (apareamiento) y 72 °C durante 30 segundos (extension); La extension final se realizo a 72 °C durante 5 min. Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis con gel de agarosa 1%, se tineron con bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV.

Ensayo de BrdU. La incorporacion de BrdU en el ADN se midio usando el kit de flujo FITC BrdU (BD Pharmingen). Brevemente, las celulas se cultivaron en placas de 6 pocillos (0,15 x 106 celulas/pocillo para celulas CHO-K1 y celulas CHO-K1/ErbB2, 0,4 x 106 celulas/pocillo para celulas BT-474; 2 ml de medio/pocillo) durante la noche, se trataron con vetnculo o PEPD durante 48 h, y luego se incubaron con BrdU a 10 pM en medio de cultivo durante 30 min (celulas CHO-K1 y CHO-K1/ErbB2) o 18 h (celulas BT-474). Las celulas luego se recogieron, se fijaron y se permeabilizaron en un tampon de fijacion/permeabilizacion, se trataron con NDasa durante 1 hora a 37 °C y se incubaron con un anticuerpo BrdU durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de tincion de ADN con 7-amino-actinomicina D Las celulas tenidas se resuspendieron en 0,5-1 ml de tampon de tincion por muestra y se analizaron mediante un citometro de flujo (BD FACS Calibur, BD Biosciences), contando 10,000 celulas por muestra. La incorporacion de BrdU se modelo utilizando el software WinMDI 2,8.

Ensayo de formacion de colonia en agar blando. Despues de que 1 ml de agar Noble ultrapuro 0,8% (USB, cat#10907) en medio de cultivo se solidifico en cada pocillo de placas de 6 pocillos, 1 ml de celulas (2x104 celulas BT-474, 1x103 celulas CHO-K1 o 1x103 celulas CHO-K1/ ErbB2) suspendidas en agar 0,4% en medio de cultivo a 37 °C se anadieron a cada pocillo, lo que tambien se solidifico despues. Luego se anadio PEPD o vetnculo en 2 ml de medio a cada pocillo, que se cambio cada 3-4 dfas durante un total de 21 dfas. Al final de este tratamiento, se contaron las colonias celulares de > 100 pm de diametro bajo un microscopio de diseccion (Axiovert 40 CFL, Carl Zeiss) en 10 campos diferentes (10 aumentos) por pocillo, con la ayuda de ImageJ.

Ensayo de invasion y migracion celular. La invasion y migracion celular se midieron utilizando las camaras BD BioCoat Matrigel Invasion (BD Biosciences). Brevemente, la camara inferior se lleno con 0,75 ml de medio con FBS 10%, y la camara superior se coloco con 4x104 celulas suspendidas en 0,5 ml de medio libre de suero que contiene vetnculo o PEPD. Las camaras se colocaron en una incubadora de cultivo celular a 37 °C durante 48 h. Al final de la incubacion, las celulas que invadieron a traves de una capa de matriz de Matrigel recubierta en el inserto de filtro que se coloco en el fondo de la camara de invasion se fijaron con metanol 100%, se tineron con violeta de cristal 0,5% y se contaron bajo una Microscopio (Eclipse 50i) en 10 campos diferentes (20 aumentos) por filtro, asistido por ImageJ.

Ensayo de PI3 quinasa. Se uso un kit ELISA de actividad de PI3-quinasa (Echelon, K-1000s). Brevemente, se extrajo PI3K de lisados celulares completos (preparados a partir de aproximadamente 1x106 celulas por muestra) usando un anticuerpo PI3K (anti-PI3K p85), y los inmunoprecipitados se mezclaron con 30 pl de tampon de reaccion KBZ, que luego se mezclo con 30 pl de sustrato PI(4,5) P210 pM, seguido de incubacion durante 2 horas a 37 °C. La reaccion de la quinasa se termino mediante la adicion de 90 pl de solucion de detencion de quinasa a cada solucion de reaccion, y se transfirieron 60 pl de cada solucion de reaccion de la quinasa detenida junto con 60 pl de detector de PIP3 a cada pocillo en la placa de incubacion. Despues de la incubacion a temperatura ambiente durante 60 min, se transfirieron 100 pl por muestra de la placa de incubacion a los pocillos correspondientes de la placa de deteccion y se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con TBST y luego se incubaron con el detector secundario conjugado con HRP durante 30 minutos, seguido de lavado con TBST, y se midio HRP inmovilizada mediante un ensayo colorimetrico estandar, utilizando 3,3',5,5'-tetrametilbencidina como sustrato.

Ensayo de Src quinasa. La actividad de Src en lisados celulares se midio utilizando el kit de ensayo de tirosina quinasa universal (TaKaRa, #MK410). Brevemente, los lisados (preparados a partir de aproximadamente 1x106 celulas por muestra) se clarificaron previamente con perlas de protema A-agarosa antes de I^pcon un anticuerpo Src. Los inmunoprecipitados se lavaron e incubaron con p-mercaptoetanol 10 mM en 150 pl de solucion de reaccion de quinasa. Cada muestra (40 pl) se mezclo con 10 pl de solucion de ATP-2Na 40 mM, que se transfirio a los pocillos de la placa de microtitulacion recubiertos con un sustrato de PTK, seguido de incubacion a 37 °C durante 30 minutos Despues del lavado con TBST, se anadio una solucion de anti-fosfotirosina conjugada (PY20) con HRP a cada pocillo y se incubo durante 30 minutos a 37 °C. Despues de otra ronda de lavando con TBST, la HRP inmovilizada se midio mediante un ensayo colorimetrico estandar, utilizando 3,3',5,5'-tetrametilbencidina como un sustrato.

Ensayo de proliferacion celular MTT. Las celulas se cultivaron en placas de 96 pocillos (500 celulas CHO-K1 o celulas CHO-K1/ErbB2 por pocillo, 2,000 celulas BT-474 por pocillo; 150 pl de medio por pocillo) durante la noche y luego se trataron con vetnculo, PEPD, G278D-PEPD o trastuzumab en 200 pl de medio por pocillo durante 72 h, seguido de incubacion con MTT (9,2 mM en medio) a 37 °C durante 3 h. Las celulas se lavaron luego con PBS y se mezclaron con dimetilsulfoxido (150 pl por pocillo), y se determino la densidad celular mediante la medicion de mTt a formazan espectroscopicamente a 570 nm.

Analisis estadistico. La prueba t de Student y ANOVA se utilizaron para la comparacion de dos grupos y la comparacion de multiples grupos, respectivamente. Todas las pruebas fueron de dos colas y se realizaron a un nivel de significacion nominal de 0,05, es decir, un valor de P de 0,05 o inferior se considero estadfsticamente significativo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una preparacion farmaceutica para usar en la terapia del cancer ErbB2-positivo, donde la preparacion comprende una peptidasa D (PEPD) aislada o producida de forma recombinante y al menos un portador farmaceuticamente aceptable.

2. La preparacion farmaceutica para usar en la terapia del cancer ErbB2-positivo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la PEPD es un componente de una protema de fusion.

3. La preparacion farmaceutica para usar en la terapia del cancer ErbB2-positivo de acuerdo con la reivindicacion 2, donde la protema de fusion comprende la PEPD y una marca de polihistidina.

4. La composicion farmaceutica para usar en la terapia del cancer ErbB2-positivo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la PEPD se acopla a un agente quimioterapeutico.

5. La preparacion farmaceutica para usar en la terapia del cancer ErbB2-positivo de acuerdo con la reivindicacion 2, donde la protema de fusion comprende la PEPD y una region Fc de una inmunoglobulina.

6. La preparacion farmaceutica para usar en la terapia del cancer ErbB2-positivo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la PEPD tiene menos actividad de hidrolisis dipeptfdica en comparacion con una PEPD que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 y donde la PEPD comprende una mutacion de glicina en la posicion 278 de la SEQ ID NO: 1

7. La preparacion farmaceutica para usar en la terapia del cancer ErbB2-positivo de acuerdo con la reivindicacion 1, la preparacion tambien comprende un inhibidor de la coagulacion.

8. Peptidasa D (PEPD) para usar en la terapia del cancer ErbB2-positivo en un individuo.

9. Peptidasa D para usar en un metodo para la terapia del cancer ErbB2-positivo de acuerdo con la reivindicacion 8, donde la PEPD tiene menos actividad de hidrolisis dipeptfdica en comparacion con una PEPD que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 y donde la PEPD comprende una mutacion de glicina en la posicion 278 de la SEQ ID NO: 1.

10. Peptidasa D para usar en un metodo para la terapia del cancer ErbB2-positivo de acuerdo con la reivindicacion 8, donde la peptidasa D esta comprendida en una composicion, donde tal composicion ademas comprende un inhibidor de la coagulacion.

11. Peptidasa D para usar en un metodo para la terapia del cancer ErbB2-positivo de acuerdo con la reivindicacion 8 o 9, donde la PEPD es un componente de una protema de fusion.

12. Peptidasa D para usar en un metodo para la terapia del cancer ErbB2-positivo de acuerdo con la reivindicacion 8 o 9, donde la PEPD esta conjugada con un agente quimioterapeutico.

13. Un producto para usar en la terapia del cancer ErbB2-positivo, donde el producto comprende al menos un recipiente sellado que contiene una preparacion farmaceutica que comprende peptidasa D (PEPD), donde la PEPD tiene menos actividad de hidrolisis dipeptfdica en comparacion con una PEPD que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 y donde la PEPD comprende una mutacion de glicina en la posicion 278 de la SEQ ID NO: 1.

14. El producto para usar en la terapia del cancer ErbB2-positivo de la reivindicacion 12, donde el producto ademas comprende un inhibidor de coagulacion.