ES2945008T3 - Proteína que comprende NC-1 para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis - Google Patents

Proteína que comprende NC-1 para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis Download PDF

Info

Publication number
ES2945008T3
ES2945008T3 ES12753465T ES12753465T ES2945008T3 ES 2945008 T3 ES2945008 T3 ES 2945008T3 ES 12753465 T ES12753465 T ES 12753465T ES 12753465 T ES12753465 T ES 12753465T ES 2945008 T3 ES2945008 T3 ES 2945008T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
domain
endostatin
protein
fusion protein
oligomer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12753465T
Other languages
English (en)
Inventor
Tong-Young Lee
Amir Abdollahi
Kashi Javaherian
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Application granted granted Critical
Publication of ES2945008T3 publication Critical patent/ES2945008T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/02—Local antiseptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Abstract

La presente invención se refiere a un oligómero proteico que comprende al menos dos monómeros NC-1 de colágeno 18 humano o fragmentos de un monómero NC-1 de colágeno 18 humano para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad relacionada con la angiogénesis. La invención se refiere además a una proteína de fusión que comprende un monómero NC-1 de colágeno 18 humano y un dominio Fc de una inmunoglobulina. La invención también se refiere a una proteína de fusión que comprende: a) un péptido de endostatina o un péptido derivado de endostatina yb) el motivo RGD y/o el motivo PHSRN de fibronectina. La invención se refiere además a un kit que comprende el oligómero de proteína o las proteínas de fusión de la invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Proteína que comprende NC-1 para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis
La presente invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
La endostatina, un fragmento de escisión proteolítica de 183 aminoácidos correspondiente al C-terminal del colágeno 18 (o colágeno XVIII), ha sido objeto de investigación por parte de varios laboratorios debido a su actividad antitumoral y a su potencial aplicación como terapéutica antiangiogénica del cáncer (O'Reilly et al., 1997, Cell 88, 277; Folkman et al., 2006, Exp Cell Res 312, 594; Bergers et al., 1999, Science 284, 808). La actividad antitumoral de la endostatina está bien establecida. Aunque se han propuesto varios mecanismos distintos para la acción de la endostatina, aún no existe un consenso general sobre su mecanismo.
Los ensayos clínicos de endostatina humana en fase I y II utilizaron una molécula recombinante expresada en levadura. Esta formulación de endostatina presentaba dos desventajas importantes. La semivida de la proteína en circulación era muy corta y el 50% de la endostatina humana recombinante inyectada utilizada en los ensayos clínicos originales carecía de cuatro aminoácidos en el N-terminal, incluidas dos histidinas cruciales para la unión del zinc, por lo que se trataba de una molécula inactiva (Lee et al., 2008, Clin Cancer Res 14, 1487; Boehm et al., 1998, Biochem Biophys Res Commun 252, 190; Tjin et al., 2005, Cancer Res 65, 3656; Sim et al., 1999, Angiogenesis 3, 41). Para superar estas deficiencias, el SDFa aprobó en 2005 una nueva endostatina humana recombinante expresada y purificada en Escherichia coli con una secuencia adicional de nueve aminoácidos y que forma otra estructura de etiqueta his, denominada Endostar, para el tratamiento del cáncer de pulmón no microcítico. Endostar suprimió la proliferación estimulada por VEGF, la migración y la formación de tubos de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) in vitro y bloqueó el brote de microvasos de anillos aórticos de rata in vitro. Además, podría inhibir la formación de nuevos capilares a partir de vasos preexistentes en el ensayo de la membrana corioalantoidea de pollo (CAM) y afectar al crecimiento de los vasos en el tumor. Se ha encontrado además que los efectos antiangiogénicos de endostar estaban correlacionados con la señalización desencadenada por VEGF (Ling et al. Biochem Biophys Res Com 361, 79). En otro estudio, se construyó una endostatina fusionada al dominio Fc de un anticuerpo IgG (Lee et al., 2008, Clin Cancer Res 14, 1487). La presencia de Fc aumentó la semivida a más de una semana, de forma análoga a los dos inhibidores de la angiogénesis bevacizumab (Avastin) y VEGF-Trap (Gordon et al., 2001, J Clin Oncol 19, 843; Holash et al., 2002, Proc NatlAcad Sci USA 99, 11393).
Aunque numerosos ensayos clínicos demostraron que la endostatina es un fármaco muy seguro en una variedad de esquemas de dosis, los resultados no demostraron una actividad antitumoral sustancial de la endostatina. La dosis y los esquemas pueden haber sido subóptimos, y/o la enfermedad voluminosa en pacientes en fase avanzada puede no responder de forma óptima a la endostatina humana recombinante. Por lo tanto, en los ensayos clínicos actuales en China, la endostatina se utiliza principalmente en combinación con quimioterapéuticos con el fin de mejorar la actividad antitumoral de la endostatina. Por ejemplo, en un estudio participaron 45 pacientes con tumores sólidos. Todos recibieron Endostar a una dosis de 7,5 mg/m2 /día en infusión intravenosa durante más de 7 días, en combinación con quimioterapia, entre 2006 y 2008. En este estudio no se produjo ninguna muerte relacionada con el tratamiento. Las principales toxicidades notificadas incluyeron mielosupresión, deterioro hepático, anorexia, náuseas, vómitos, diarrea, febrícula y fatiga. No se observó ninguna respuesta completa. Dos de los 42 pacientes tuvieron una respuesta parcial, veintiuno permanecieron estables y diecinueve presentaron enfermedad progresiva. La mediana de tiempo hasta la progresión tumoral fue de 3,0 meses. La mediana de supervivencia global fue de 30,0 meses y la tasa de supervivencia al año fue del 81,0%. Estos datos demostraron que la toxicidad de Endostar combinado con quimioterapia en el tratamiento de tumores sólidos era tolerable con una eficacia moderada (Li et al. 2010, Asian Pac J Cancer Prev. Biol., 11, 1119-23).
La terapia génica antiangiogénica se ha propuesto como una forma alternativa de proporcionar continuamente altas concentraciones de los factores antiangiogénicos. La transfección génica de agentes antiangiogénicos mediante un vector viral puede inhibir el crecimiento de tumores en varios modelos de ratón. Sin embargo, los vectores virales pueden causar inflamación y respuesta inmunológica en inyecciones repetidas, y las consideraciones de toxicidad/seguridad pueden impedir su uso en humanos en un futuro próximo. Además, el uso de células madre hematopoyéticas transducidas genéticamente ha resultado ineficaz en un modelo animal, a pesar de la producción sostenida de endostatina. Además, la dosificación de productos biológicos mediante vectores genéticos es muy difícil de estandarizar debido a la variación en el título del vector, la eficacia de la transducción y los niveles de expresión.
Existe, por tanto, una necesidad en la técnica de mejorar las terapias de las enfermedades relacionadas con la angiogénesis.
El problema técnico subyacente a la presente invención podría considerarse como la provisión de medios y procedimientos que satisfagan las necesidades antes mencionadas. Este problema técnico se ha resuelto mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y en el presente documento.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un oligómero proteico que comprende al menos dos monómeros NC-1 de colágeno 18 humano para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad relacionada con la angiogénesis,
en el que el monómero NC-1 del colágeno 18 humano comprende un dominio de oligomerización, una región bisagra y un dominio de endostatina o fragmentos de dicho dominio de endostatina que comprenden el sitio de unión al zinc de la endostatina y, opcionalmente, un sitio de escisión de proteasa recombinante dentro de la región bisagra,
en el que el dominio de oligomerización comprende un dominio de trimerización no helicoidal triple del colágeno 18 humano y un dominio Fc de una inmunoglobulina o un dominio de trimerización no helicoidal triple del colágeno 18 humano y un dominio de oligomerización artificial que comprende una única mutación en la posición 7 del dominio de endostatina en la que la glutamina se sustituye por cisteína,
y en el que la enfermedad relacionada con la angiogénesis se selecciona del grupo que consiste en cáncer dependiente de la angiogénesis incluyendo tumores sólidos, melanomas, metástasis tumorales, tumores nacidos en la sangre como leucemias, tumores benignos como hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, granulomas piógenos: artritis reumatoide; psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares como retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasias retrolentales, rubeosis; síndrome de Osler-Webber: angiogénesis miocárdica: neovascularización de placas: telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; granulación de heridas; enfermedades de estimulación excesiva o anormal de las células endoteliales, como adherencias intestinales, aterosclerosis, esclerodermia, cicatrices hipertróficas (queloides); enfermedad por arañazo de gato (Rochele minalia quintosa) y úlceras (Helicobacter pylori).
Los términos "colágeno 18" y "colágeno XVIII" utilizados en el presente documento son intercambiables y se refieren a la misma proteína. La clonación de las proteínas colágeno 18 humana y de ratón ha sido descrita por Oh et al. (PNAS 1994, 91, 4229; Genómica 1994, 19, 494). El colágeno de tipo XVIII pertenece a una subclase única y novedosa de la superfamilia del colágeno para la que se ha propuesto el nombre de "familia MULTIPLEXINA". Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del colágeno 18 de ratón se muestran en el número de acceso NM_001109991.1, mientras que las secuencias humanas correspondientes se muestran en NM_030582.3. Además, las secuencias de aminoácidos del colágeno 18 de ratón y humano se muestran en la SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente. Más concretamente, el colágeno 18 consta de un dominio central triple helicoidal interrumpido flanqueado en el N-terminal (dominio NC-11) y en el C terminal (dominio NC-1) por estructuras globulares no triple helicoidales de mayor tamaño (Oh et al., loc. cit.; Abe et al. 1993, Biochem Biophys Res Commun 196, 576).
El dominio NC-1 C-terminal (o brevemente NC-1) del colágeno 18 incluye una región de asociación N-terminal (de aproximadamente 50 residuos de aminoácidos), una región bisagra central sensible a la proteasa (de aproximadamente 70 residuos de aminoácidos) y un dominio de endostatina estable C-terminal (de aproximadamente 180 residuos de aminoácidos) (Sasaki et al., 1998, EMBO J 17, 4249). El dominio de la endostatina comprende un sitio de unión al zinc que media la unión al zinc y está situado en el N terminal de la endostatina (Ding et al., 1998, PNAS 95, 10443; US 7,524,811). Curiosamente, se ha demostrado que este sitio de unión del zinc es responsable de la actividad antitumoral/antiangiogénica de la endostatina (Boehm et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 190). La secuencia de aminoácidos del dominio NC-1 del colágeno 18 de ratón se representa en la SEQ ID NO: 3, mientras que la secuencia correspondiente del dominio NC-1 de la secuencia del colágeno 18 humano se muestra en la SEQ ID NO: 4.- El dominio de asociación del dominio NC-1 humano que comprende residuos de aminoácidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 es responsable de la trimerización no covalente del monómero NC-1 para formar un trímero globular. La región bisagra sensible a la escisión proteolítica comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente 61 hasta aproximadamente 129 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4.- El dominio compacto de endostatina comprende residuos de aminoácidos de aproximadamente 130 a aproximadamente 308 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4; véase, por ejemplo, Sasaki, loc. cit; Kuo 2001, JCB 152, 1233; Tjin et al. 2005, Cancer Res 65, 3656. La región de asociación y el dominio de endostatina en el dominio NC-1 están conectados por la región bisagra (véase Sasaki et al., loc. cit.). Se ha encontrado que la región bisagra es escindida, por ejemplo, por metaloproteinasas de matriz (MMP), como MMP-3, -7, -9, -13 y -20 (Heliasvaara et al., Exp Cell Res 2005, 307, 192). La estructura de dominio de NC-1 arriba indicada se basa en datos estructurales. El término "aproximadamente" utilizado para el posicionamiento de los dominios dentro de NC-1 refleja el hecho de que los límites exactos entre los dominios mencionados pueden diferir de las posiciones indicadas en uno, dos, tres o incluso más residuos de aminoácidos. El límite exacto entre, por ejemplo, el dominio de asociación y la región bisagra puede determinarse, por ejemplo, generando un dominio de asociación que comprenda residuos de aminoácidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 de la SEQ ID NO: 4 como punto de partida y producir fragmentos más cortos de los mismos, por ejemplo, con una longitud de 49, 48, 47, 46, 45, etc., residuos de aminoácidos. A continuación, dichos fragmentos más cortos pueden analizarse en función de sus propiedades de oligomerización, es decir, si siguen siendo capaces de formar oligómeros, como trímeros, al igual que el dominio de asociación completo. Alternativamente, el dominio de endostatina puede servir como punto de partida para abordar las propiedades de oligomerización de los dominios de NC-1. Como se indica en otra parte del presente documento, la divulgación que no se reivindica proporciona un procedimiento adicional para identificar los límites exactos de las transiciones de monómero, dímero y/o trímero en el dominio NC-1 como se define en el presente documento. Sin embargo, el modelo de dominio antes mencionado se ajusta notablemente bien a la estructura del gen, con los exones 38 y 39 codificando el dominio de asociación, el exón 40 la región bisagra y tres exones más el dominio de endostatina (Sasaki et al., loc. cit.).
El término "proteína" o "polipéptido" o "péptido", tal como se utiliza en el presente documento, engloba los (poli)péptidos aislados o esencialmente purificados que están esencialmente libres de otros polipéptidos de la célula huésped. El término "péptido", tal como se utiliza aquí, comprende al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40 o incluso más residuos de aminoácidos en los que el grupo alfa carboxilo de uno está unido al grupo alfa amino de otro. El término "péptido", tal y como se utiliza en el presente documento, engloba los peptidomiméticos. Como se sabe en la técnica, los peptidomiméticos son compuestos cuyos elementos esenciales (farmacóforo) imitan a un péptido o proteína natural en el espacio tridimensional y que conservan la capacidad de interactuar con la diana biológica y producir el mismo efecto biológico; véase, por ejemplo, la revisión de Vagner et al. 2008, Current Opinion in Chemical Biology 12, Páginas 292-296. Los peptidomiméticos están diseñados para sortear algunos de los problemas asociados aun péptido natural: por ejemplo, la estabilidad frente a la proteólisis (duración de la actividad) y la escasa biodisponibilidad. Otras propiedades, como la selectividad del receptor o la potencia, a menudo pueden mejorarse sustancialmente. Según la presente invención, la proteína o el péptido es en un aspecto un oligómero. En otro aspecto, la proteína o el péptido es una proteína de fusión, como se define más adelante. Un "oligómero", tal y como se utiliza aquí, significa una molécula que comprende unas pocas unidades de monómero, en contraste con un polímero que, al menos en principio, comprende un número ilimitado de monómeros. Preferentemente, el oligómero es un oligómero proteico, es decir, el oligómero comprende dos, tres, cuatro, cinco o incluso más monómeros proteicos, es decir, el oligómero puede ser, por ejemplo, un dímero, un trímero, un tetrámero, un pentámero, etc. Un dímero es, por definición, un complejo macromolecular formado por dos moléculas, normalmente unidas deforma no covalente, como proteínas o péptidos. Un complejo de este tipo también puede estar formado por dominios proteicos, que son partes de secuencias y estructuras proteicas que pueden evolucionar, funcionar y existir independientemente del resto de las cadenas proteicas. Un homodímero está formado por dos moléculas idénticas, el proceso subyacente se denomina homodimerización. Un heterodímero está constituido por dos macromoléculas diferentes que se forman por heterodimerización. Como se sabe en la técnica, la mayoría de los dímeros en bioquímica no están conectados por enlaces covalentes, con la excepción de los puentes disulfuro. Algunas proteínas contienen dominios especializados para asegurar la dimerización (u oligomerización), los denominados dominios de dimerización (u oligomerización), tal como se definen más adelante y son bien conocidos en la técnica. Un trímero es un complejo macromolecular formado por tres proteínas o dominios proteicos, normalmente unidos de forma no covalente. Un homotrímero está formado por tres moléculas idénticas, mientras que un heterotrímero está construido por tres moléculas diferentes. Por ejemplo, el colágeno 18 es una proteína homo-trimérica. Un tetrámero consta de cuatro moléculas, un pentámero de cinco moléculas, y así sucesivamente. En estos casos, la formación de complejos suele estar mediada por dominios de oligomerización, como se ha expuesto anteriormente. Por ejemplo, la dimerización puede estar mediada por un dominio Fc de una inmunoglobulina o por puentes disulfuro como se describe en otro lugar del presente documento, mientras que para latrimerización de NC-1 del colágeno 18, puede utilizarse la región de asociación dentro del dominio NC-1.
El oligómero proteico o peptídico para su uso de la presente invención comprende al menos dos monómeros NC-1 de colágeno 18, como se define en el presente documento. Sin embargo, el oligómero proteico puede comprender también tres, cuatro, cinco, seis o incluso más de dichos monómeros NC-1 de colágeno 18, preferentemente, de colágeno 18 humano. También se incluye en el ámbito de la presente invención en algunos aspectos que los oligómeros proteicos o proteínas de fusión a los que se hace referencia en el presente documento pueden oligomerizarse mediante uno o más enlaces disulfuro. Se prevé además que los monómeros NC-1 definidos en el presente documento se unan covalentemente, por ejemplo, mediante reticulación química u otros procedimientos conocidos en la técnica.
El término "proteína" o "péptido" tal como se utiliza aquí incluye también preparaciones proteicas que comprenden el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la presente invención, o la proteína de fusión de la presente invención y otras proteínas además. Además, el término incluye, en un aspecto, oligómeros de proteínas o péptidos modificados químicamente, o proteínas de fusión. Estas modificaciones pueden ser artificiales o naturales.
El oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la presente invención, o la proteína de fusión de la presente invención tendrá las propiedades biológicas aquí mencionadas, preferentemente actividades antiangiogénicas. Dichas actividades antiangiogénicas incluyen, por ejemplo, cualquier actividad biológica que inhiba el crecimiento o la migración de células endoteliales y/o pericitos, la formación de tubos o endotelio, el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos capilares en el cuerpo, la ralentización o inhibición del crecimiento de tumores benignos o malignos cortando su suministro sanguíneo, la reducción de los efectos secundarios/toxicidad de otros agentes antitumorales o antiangiogénicos, por ejemplo, Inhibidores del VEGF, por interferencia con su mecanismo de acción, es decir, reducir la presión sanguínea, modular la respuesta inflamatoria en enfermedades malignas y benignas, o mejorar los parámetros fisiopatológicos, como la perfusión o la hipoxia dentro de una ventana temporal terapéutica tras el tratamiento que, a su vez, puede facilitar la eficacia de terapias adicionales (, por ejemplo, radioterapia, quimioterapia o terapia antiapoptótica). La actividad antiangiogénica puede comprobarse mediante ensayos in vitro o in vivo mediante modelos animales conocidos en la técnica (Abdollahi et al., Cancer Res. 2003, 63, 8890; Mol. Cell 2004, 13, 649; PNAS 2007, 104, 12890; Drug Resist. Actualización 2005, 8, 59; Bergers et al., Science 1999, 284, 808; Javaherian et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 45211; Lee et al. Cancer Res. 2008). Por ejemplo, la actividad antiangiogénica puede comprobarse in vitro mediante la inhibición de la proliferación y/o migración de células endoteliales estimuladas por un factor de crecimiento, por ejemplo, por VEGF. In vivo, la actividad antiangiogénica puede analizarse, por ejemplo, mediante un ensayo con membrana corioalantoidea de pollo (CAM), mientras que la actividad antitumoral puede probarse en modelos tumorales animales que incluyan, por ejemplo, Carcinoma pulmonar de células no pequeñas A549, LLC o H460, carcinoma de colon HT29, carcinoma pancreático BxPC3, linfoma Karpas 299, LMA MOLM-13 (leucemia mieloide aguda), línea celular 786-0, A2058 (melanoma) o carcinoma de células renales RENCA (CCR) y muchos otros (Abdollahi et al., Drug Resist. Update 2005, loc. cit.).
El oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la presente invención, o la proteína de fusión de la invención, en un aspecto, puede fabricarse mediante síntesis química o técnicas de biología molecular recombinante bien conocidas por el experto en la materia; véase, por ejemplo, Sambrook et al. 2001, Molecular cloning : a laboratory manual / Sambrook, Joseph; Russell, David W. --. 3a ed. -- Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001. En un aspecto, dicho procedimiento de fabricación del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la presente invención, o la proteína de fusión de la presente invención comprende (a) cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la presente invención, o la proteína de fusión de la invención y (b) obtener a partir de la célula huésped del paso (a) el oligómero proteico u oligómero peptídico o proteína de fusión y, opcionalmente, almacenar el oligómero proteico u oligómero peptídico o proteína de fusión. Preferentemente, dicho procedimiento se lleva a cabo en condiciones libres de suero, ya que los presentes inventores han encontrado que los oligómeros proteicos que comprenden dos o más monómeros NC-1 tal como se definen en el presente documento son susceptibles de degradación en suero o en un medio de cultivo celular que comprenda suero. En un aspecto de este procedimiento, el oligómero proteico u oligómero peptídico o proteína de fusión puede obtenerse mediante técnicas de purificación convencionales a partir de, por ejemplo, un lisado de célula huésped, incluyendo, pero sin limitarse a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño y/o electroforesis en gel preparativa.
En una realización del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención, el "monómero NC-1", "monómero NC-1 de colágeno 18" o "monómero NC-1 de colágeno 18 humano" como se usa aquí en el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención comprende al menos una parte, es decir, al menos un dominio, región o fragmento, del dominio NC-1 no colágeno del colágeno 18 humano, tal como se define en el presente documento. Se prefiere que el monómero NC-1 sea humano. El monómero NC-1 tal como se utiliza en el presente documento comprende, en un aspecto del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o de la proteína de fusión de la invención, al menos un péptido derivado de endostatina o péptido de endostatina, que comprende el sitio/dominio de unión al zinc del dominio de endostatina. El sitio de unión al zinc de la endostatina humana está formado por las histidinas 1, 3 y 11 y el ácido aspártico 76 (Ding et al., loc. cit.). Se ha informado de que la unión al zinc de la endostatina es esencial para su actividad antiangiogénica (Boehm et al., loc. cit.). Además, Tjin et al. (loc. cit.) descubrieron que un péptido sintético de 27 aminoácidos correspondiente al dominio N-terminal de unión al zinc de la endostatina es responsable de su actividad antitumoral. El término "péptido de endostatina", tal como se utiliza aquí, significa que la secuencia de aminoácidos de este péptido puede encontrarse en el dominio de endostatina de NC-1. El término "péptido derivado de la endostatina" significa que dicho péptido puede diferir del correspondiente péptido de endostatina en el dominio de endostatina de NC-1, en uno, dos, tres, cuatro o incluso más residuos de aminoácidos, manteniendo al menos (o incluso superando) la actividad biológica (como se describe en otra parte del presente documento) del correspondiente péptido de endostatina en el dominio de endostatina de NC-1. Se han descrito ejemplos de péptidos de endostatina que comprenden dicho sitio/dominio de unión a zinc del dominio de endostatina y que presentan actividad antiangiogénica y/o antitumoral, por ejemplo, en Tjin et al., loc. cit., o en US 7.524.811. Preferentemente, el péptido derivado de la endostatina o el péptido de la endostatina tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 residuos de aminoácidos, preferentemente de 23 a 35, más preferentemente 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 residuos de aminoácidos. por lo tanto, SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia murina correspondiente del motivo activo del dominio NC-1-endostatina (ED) (es decir, el dominio aminoterminal de unión al zinc que media la actividad antiangiogénica y/o antitumoral) con una longitud de 26 residuos de aminoácidos, mientras que la SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia humana correspondiente con una longitud de 25 residuos de aminoácidos. Las Histidinas en estas secuencias son particularmente importantes ya que los presentes inventores han encontrado en un estudio previo que la sustitución de dichas Histidinas por residuos de Alanina abolía la actividad antitumoral y antiangiogénica; véase el Ejemplo 2.10. Está dentro del alcance de la presente invención que dicho monómero NC-1 comprenda más de un péptido derivado de la endostatina o péptido de la endostatina, por ejemplo, dos, tres, cuatro o incluso más péptidos.
En realizaciones preferidas del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención, el monómero NC-1 comprende o consiste en el dominio de endostatina, como se define en otra parte del presente documento. Preferentemente, el mencionado péptido derivado de la endostatina, el péptido de la endostatina o el dominio de la endostatina llevan una única mutación de glutamina a cisteína en la posición 7 del dominio de la endostatina. Tales mutantes son capaces de formar puentes disulfuro y, por tanto, de formar dímeros; véase, por ejemplo, Kuo 2001, JCB 152, 1233; Tjin et al. 2005, Cancer Res 65, 3656.
En otra realización, el monómero NC-1 comprende, además del sitio/dominio de unión de zinc del dominio de endostatina, el péptido derivado de endostatina, el péptido de endostatina o el dominio de endostatina, una región bisagra. Tal constructo probablemente formará un monómero, posiblemente un dímero. No puede excluirse la formación de un dímero, ya que parece que la región bisagra también puede contribuir a la asociación dimérica de tales constructos. Opcionalmente, dicho monómero NC-1 comprende, además de los constituyentes de dominio mencionados, un dominio de asociación, es decir, el dominio de trimerización no triple helicoidal del colágeno 18 humano, u otro dominio de oligomerización como se menciona en el presente documento. Es evidente para los expertos en la materia que la presencia del dominio de asociación da lugar a la formación de un trímero. En otro aspecto, el monómero NC-1 comprende un dominio de endostatina y un dominio de asociación del dominio NC-1 anteriormente definido y, en un aspecto aún más lejano, un dominio de asociación, una región bisagra y un dominio de endostatina, cada uno de dicho dominio NC-1. En este último aspecto, el monómero NC-1 comprende el dominio NC-1 completo del colágeno 18 humano o es, es decir, consiste en el dominio NC-1 del colágeno 18 humano (de aproximadamente 38 kDa). El dominio NC-1 del colágeno 18 humano y la estructura de dicho dominio NC-1 han sido definidos, por ejemplo, por Sasaki et al. (loc. cit.). El dominio NC-1 del colágeno 18 consiste en una secuencia no triple helicoidal de 315 (ratón) o 312 (humano) residuos de aminoácidos. Como se ha expuesto anteriormente, se ha encontrado que el dominio NC-1 se asocia de forma no covalente para formar un trímero a través del dominio de asociación antes mencionado.
La oligomerización de NC-1 está mediada por al menos dos dominios de esta proteína: uno formado por aproximadamente 50 aminoácidos en el N-terminal de la proteína que define una estructura de triple hélice, es decir, el dominio de asociación. El segundo dominio que participa en la oligomerización está situado en el N-terminal de la endostatina y es capaz de unirse al zinc. El sitio de zinc de la endostatina humana está formado por las histidinas 1, 3 y 11 y el ácido aspártico 76. Se ha demostrado que dicho dominio forma un dímero a altas concentraciones de endostatina (Ding et al., loc. cit.). También es posible que la región bisagra sensible a las proteasas desempeñe un papel en la oligomerización de NC-1, como ya se ha indicado anteriormente. En consecuencia, en algunos aspectos de la invención, el monómero NC-1 puede comprender además una región bisagra del dominio NC-1.
Preferentemente, el monómero NC-1 tiene una longitud superior a 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 o 310 residuos de aminoácidos. En caso de que el monómero NC-1 comprenda el dominio de asociación, la región bisagra y el sitio/dominio de unión a zinc del dominio de endostatina o el dominio de endostatina completo, se prefiere que el monómero NC-1 sea más largo que 312 residuos de aminoácidos y comprenda aún más preferentemente al menos 315, 320, 330, 340, 350, 400, 500 o incluso más residuos de aminoácidos.
El término "dominio de oligomerización", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere en general a un dominio proteico que media en el ensamblaje de subunidades de los dos o más monómeros NC-1, tal como se define en el presente documento. Como se ha indicado anteriormente, el dominio de oligomerización media la dimerización, trimerización y/o tetramerización, etc., de los monómeros NC-1. Dicha oligomerización conduce, por ejemplo, a ventajas funcionales de multivalencia y alta fuerza de unión, mayor estabilización de la estructura y funciones combinadas de diferentes dominios, lo que resulta en una actividad biológica mejorada, como una actividad antiangiogénica y/o antitumoral mejorada o aumentada. En un aspecto, el dominio de oligomerización comprende el dominio de asociación del dominio NC-1 mencionado anteriormente, es decir, el dominio de trimerización no triple helicoidal del colágeno 18 que es responsable de la oligomerización no covalente de los monómeros NC-1 o de las hélices del colágeno 18. En otro aspecto, el dominio de oligomerización puede comprender otros constructos dominios de andamiaje que proporcionen oligomerización y vida media más larga, bien conocidos en la técnica; véase, p. ej. Ali e Imperial 2005, Bioorganic and Medicinal Chemistry 13, 5013. Dicho dominio de oligomerización sustituye estructural y funcionalmente al dominio de asociación tal y como se encuentra en el dominio NC-1 humano natural mencionado anteriormente, o se utiliza, además, de dicho dominio de asociación. En otra realización del oligómero proteico para su uso de la invención o de la proteína de fusión de la invención, la oligomerización está mediada por un dominio Fc de una inmunoglobulina, es decir, el dominio de oligomerización del monómero NC-1 tal como se define en el presente documento comprende o es un dominio Fc de una inmunoglobulina. Se sabe que la fusión de un dominio Fc con, por ejemplo, un péptido o una proteína, prolonga la vida media en circulación. Debe entenderse que el dominio Fc puede utilizarse en dicho monómero NC-1, además, del dominio de asociación del dominio NC-1 mencionado anteriormente (como se muestra, por ejemplo, en los ejemplos siguientes) o puede sustituir al dominio de asociación. El dominio Fc confiere una estructura dimérica al monómero NC-1 tal como se define en el presente documento, ya que el propio Fc es un dímero. En otra realización, la oligomerización puede estar mediada por la introducción de una modificación estructural, por ejemplo, una mutación en el monómero NC-1 que da lugar a la formación de enlaces disulfuro, como se expone con más detalle a continuación. Se prevé además que los oligómeros proteicos u oligómeros peptídicos divulgados, o las proteínas de fusión de la invención puedan formarse covalentemente.
La invención divulga además pero no reivindica un procedimiento para identificar los límites exactos de las transiciones monómero, dímero y/o trímero en el dominio NC-1 como se define en el presente documento, comprendiendo el procedimiento: a) generar una serie de péptidos recombinantes a partir o derivados del dominio NC-1, comenzando con un péptido que consiste en el dominio de endostatina, seguido por el aumento del tamaño de dicho péptido que consiste en el dominio de endostatina en pasos de aproximadamente 10 a 20 residuos de aminoácidos, y b) probar los péptidos recombinantes del paso a) para sus propiedades de oligomerización, es decir, si dichos péptidos son capaces de formar dímeros o trímeros e identificar los péptidos que son capaces de formar oligómeros, y c) determinar los límites exactos de las transiciones monómero, dímero y/o trímero en el dominio NC-1. El procedimiento puede comprender un paso adicional d) de construcción de un oligómero para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención utilizando los péptidos recombinantes identificados en el paso b) que son capaces de formar dímeros o trímeros. Para generar una serie de péptidos recombinantes a partir del dominio NC-1 o derivados del mismo, puede utilizarse la síntesis de péptidos o proteínas conocida en la técnica. El término "derivado de" se ha definido en otro lugar del presente documento y se aplica mutatis mutandis a los péptidos derivados del dominio NC-1. Para comprobar las propiedades de oligomerización de dichos fragmentos, pueden utilizarse análisis de transferencia Western, inmunoprecipitación, SDS-PAGE, procedimientos cromatográficos u otros procedimientos bien conocidos en la técnica. Los péptidos recombinantes generados por el procedimiento arriba indicado pueden utilizarse para producir los oligómeros para su uso de la invención, o proteínas de fusión, tales como proteínas de fusión Fc, de la invención que pueden ensayarse posteriormente para su actividad antiangiogénica. La divulgación no reivindicada se refiere además a los péptidos recombinantes del dominio NC-1 o derivados del mismo identificados por dicho procedimiento que muestran la actividad biológica definida en el presente documento, preferentemente actividad antiangiogénica y/o antitumoral. Un oligómero para su uso de la invención o proteína de fusión de la invención que comprende tales péptidos es particularmente útil como composición farmacéutica, como se establece en otra parte del presente documento. La especificación también divulga pero no reivindica péptidos recombinantes del dominio NC-1 o derivados del mismo que se generan aumentando el tamaño del dominio de endostatina en pasos de aproximadamente 10 a 20 residuos de aminoácidos. Cada uno de estos péptidos es un candidato para explorar su actividad antiangiogénica y/o antitumoral mediante ensayos in vitro y/o in vivo descritos en el presente documento.
El "monómero NC-1" de colágeno 18 humano tal como se define en el presente documento puede comprender dominios o subunidades proteicas adicionales, por ejemplo, los dominios Fc de inmunoglobulinas antes mencionados, o etiquetas proteicas, por ejemplo, etiquetas His o similares, que pueden utilizarse, por ejemplo, para purificación y/o detección. Como es bien sabido, las etiquetas proteínicas son secuencias peptídicas injertadas genéticamente en una proteína recombinante. En un aspecto, estas etiquetas pueden eliminarse mediante agentes químicos o por medios enzimáticos, como la proteólisis o el empalme de inteínas. Dichas etiquetas se unen al monómero NC-1 tal como se menciona en el presente documento. Las etiquetas de afinidad se añaden a las proteínas para que puedan purificarse a partir de su fuente biológica bruta, como un lisado celular, mediante una técnica de afinidad bien conocida en la técnica. Se trata, por ejemplo, de la proteína de unión a la quitina (CBP), la proteína de unión a la maltosa (MBP), los dominios Fc de las inmunoglobulinas o la glutatión-S-transferasa (GST). La etiqueta poli(His) es una etiqueta proteínica muy utilizada; se une a matrices metálicas. Las etiquetas de solubilización se utilizan, especialmente para las proteínas recombinantes expresadas en especies deficientes en chaperonas, como E. coli, para ayudar al correcto plegamiento de las proteínas y evitar que precipiten. Entre ellos se encuentran, por ejemplo, la tiorredoxina (TRX) y el poli-(NANP). Algunas etiquetas de afinidad tienen una doble función como agente de solubilización, como la MBP y la GST Las etiquetas cromatográficas se utilizan para alterar las propiedades cromatográficas del monómero NC-1 con el fin de obtener una resolución diferente con una técnica de separación determinada. A menudo se trata de aminoácidos polianiónicos, como la etiqueta FLAG. Las etiquetas epitópicas son secuencias peptídicas cortas que se eligen porque los anticuerpos de alta afinidad pueden producirse de forma fiable en muchas especies diferentes. Suelen derivar de genes víricos, lo que explica su elevada inmunorreactividad. Las etiquetas epítopo incluyen, por ejemplo, la etiqueta V5, la etiqueta c-myc y la etiqueta HA. Estas etiquetas son útiles, por ejemplo, para experimentos de transferencia western e inmunoprecipitación, aunque también se utilizan en la purificación de proteínas. Las etiquetas de fluorescencia se utilizan para obtener una lectura visual de una proteína. La GFP y sus variantes son las etiquetas fluorescentes más utilizadas. Entre las aplicaciones más avanzadas de la GFP se incluye su uso como reportero de plegamiento (fluorescente si está plegada, incolora si no lo está). Las etiquetas proteínicas tienen muchos otros usos, como la modificación enzimática específica (como las etiquetas biotina ligasa) y la modificación química (etiqueta Flash). Las distintas etiquetas también pueden combinarse para producir modificaciones multifuncionales del monómero NC-1. El monómero NC-1 del colágeno 18 humano, tal como se define en el presente documento, también puede comprender radioisótopos, por ejemplo 124I, 125I, 131I, Cu-64, Cu-67, Y-86, Zr-89, Y-90, Re-188, Ga-68; o radionucleidos que se unen a quelatos como DTPA; toxinas, por ejemplo toxina diftérica o agentes inductores de apoptosis; o sustancias químicas, por ejemplo quimioterapias como taxoles o gemcitabina, que pueden ser útiles para mejorar y/o detectar la acción antitumoral. Toxina diftérica, o agentes inductores de apoptosis; o sustancias químicas, por ejemplo quimioterapias como taxoles, o gemcitabina, que pueden ser útiles para mejorar y/o detectar la actividad antiangiogénica del oligómero proteico para su uso de la invención o proteína de fusión de la invención. En otras realizaciones, el oligómero proteico para su uso de la invención o la proteína de fusión de la invención está pegilado. La pegilación es el proceso de unión covalente de cadenas poliméricas de polietilenglicol (PEG) a otra molécula, normalmente un fármaco o una proteína terapéutica. La pegilación se consigue habitualmente mediante la incubación de un derivado reactivo del PEG con la macromolécula diana. La unión covalente de PEG a un fármaco o proteína terapéutica puede "enmascarar" el agente frente al sistema inmunitario del huésped (inmunogenicidad y antigenicidad reducidas), aumentar el tamaño hidrodinámico (tamaño en solución) del agente, lo que prolonga su tiempo circulatorio al reducir el aclaramiento renal. La pegilación también puede proporcionar solubilidad en agua a fármacos y proteínas hidrófobos. La pegilación de compuestos es bien conocida en la técnica; véase, p. ej, Damodaran and Fee 2010, European Pharmaceutical Review 15, 18.
El término "región Fc" o "dominio Fc", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la región cristalizable del fragmento que es la región de cola de un anticuerpo o inmunoblobulina que interactúa con los receptores de la superficie celular, es decir, los receptores Fc, y algunas proteínas del sistema del complemento. Esta propiedad permite a los anticuerpos activar el sistema inmunitario. En los isotipos de anticuerpos IgG, IgAe IgD, el dominio Fc se compone de dos fragmentos proteicos idénticos, derivados del segundo y tercer dominios constantes de las dos cadenas pesadas del anticuerpo; los dominios Fc de IgM e IgE contienen tres dominios constantes de cadena pesada (dominios CH 2-4) en cada cadena polipeptídica. Los dominios Fc de las IgG presentan un sitio de N-glicosilación muy conservado. La glicosilación del fragmento Fc es esencial para la actividad mediada por el receptor Fc. Los N-glicanos unidos a este sitio son predominantemente estructuras diantenarias núcleo-fucosiladas del tipo complejo. Además, pequeñas cantidades de estos N-glicanos también llevan residuos de ácido siálico enlazado a-2,6 y GlcNAc bisecante. Se ha comprobado que la fusión del dominio Fc de las inmunoglobulinas con proteínas aumenta la producción y secreción de las proteínas de fusión en células de mamíferos (Lo et al., 1998, Protein Eng 11, 495, Capon et al., 1989, Nature 337, 525). Además, se ha demostrado que la unión de inhibidores de la angiogénesis a un dominio Fc de inmunoglobulina aumenta la vida media de dichos inhibidores (Capon et al. 1989, Nature 337, 525; Gordon et al., 2001, J Clin Oncol 19, 843; Holash et al., 2002, Proc Natl Acad Sci USA 99, 11393). Sin embargo, el dominio Fc no sólo puede utilizarse para fines de purificación, solubilización y/o detección, sino que altera ventajosamente las propiedades biológicas del oligómero proteico para su uso de la invención o de la proteína de fusión de la invención, como se expone a continuación y en los ejemplos siguientes. En una realización, los uno o más dominios Fc pueden escindirse mediante tratamiento con proteasas, como enteroquinasa o trombina, si se desea. Preferentemente, el dominio Fc al que se hace referencia aquí es de IgG humana (Bergers y Javaherian Science 1999; Lee et al Clin Canc Res 2008). Como es evidente para los expertos en la materia, en principio, puede utilizarse cualquier isoforma de IgG para generar el oligómero para su uso de la invención o la proteína de fusión de la invención. Pueden utilizarse incluso subfragmentos o cadenas únicas del dominio Fc de la IgG para prolongar la vida media o la oligomerización del oligómero para su uso de la invención o de la proteína de fusión de la invención. Las secuencias de aminoácidos de un dominio Fc de ratón y humano que pueden utilizarse para la generación de un oligómero para su uso de la invención o una proteína de fusión de la invención, por ejemplo, una proteína de fusión Fc-NC-1 o NC-1-Fc, se muestran en las SEQ ID NOs: 5 y 6, respectivamente.
El término "enfermedad relacionada con la angiogénesis", tal como se utiliza en el presente documento, denota cualquier trastorno asociado con un crecimiento anormal de los vasos sanguíneos, ya sea excesivo o insuficiente. El término "enfermedad relacionada con la angiogénesis" se selecciona preferentemente del grupo que consiste en cáncer dependiente de la angiogénesis, incluidos tumores sólidos, tumores de origen sanguíneo como leucemias, melanomas, metástasis tumorales, tumores benignos como hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, granulomas piógenos; artritis reumatoide; psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares como reintopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rejectiop de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasias retrolentales, rubeosis; Síndrome de Osler-Webber; angiogénesis miocárdica; neovascularización de placas; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; granulación de heridas; enfermedades de estimulación excesiva o anormal de las células endoteliales, como adherencias intersticiales, aterosclerosis, esclerodermia, cicatrices hipertróficas (queloides); enfermedades que tienen la angiogénesis como consecuencia patológica, como la enfermedad por arañazo de gato (Rochele minalia quintosa) y las úlceras (Helicobacter pylori). Preferentemente, la enfermedad relacionada con la angiogénesis a la que se hace referencia aquí es un melanoma.
El término "tratamiento", tal como se utiliza en el presente documento, denota la mejora o incluso la eliminación de uno o más síntomas asociados con la enfermedad relacionada con la angiogénesis a la que se hace referencia en el presente documento, mediante la administración de un oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención. Una mejora también puede considerarse como una ralentización o detención de la progresión de la enfermedad relacionada con la angiogénesis, tal como se expone en el presente documento.
El término "prevención", tal como se utiliza en el presente documento, significa evitar la aparición o reaparición de una enfermedad relacionada con la angiogénesis, tal como se especifica en el presente documento, mediante la administración de un oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención.
Los presentes inventores han encontrado inesperadamente que la NC-1 trimérica (con la NC-1 que comprende el dominio de asociación, la región bisagra y el dominio de endostatina) derivada del colágeno 18 humano se une a la fibronectina, mientras que el monómero de endostatina carece de unión a la fibronectina. La fibronectina es reconocida como una importante proteína de la matriz extracelular, que une reactivos angiogénicos y antiangiogénicos. La endostatina es un monómero en condiciones fisiológicas. El principal precursor de la endostatina es la NC-1, una molécula trimérica formada por tres cadenas entrelazadas, cada una con aproximadamente 330 aminoácidos. Esto demuestra que el trímero NC-1 tiene propiedades distintas en comparación con la endostatina. Además, un Fcendostatina que forma dímeros, así como un dímero artificial de endostatina con una única mutación en la posición aminoácida 7 (de glutamina a cisteína) de la endostatina, mantiene la unión a la fibronectina, lo que indica la importancia de la oligomerización para la unión a la fibronectina. Tras una búsqueda de moléculas del tamaño de la endostatina en sueros humanos, los inventores no lograron identificar la endostatina de tamaño convencional (de aproximadamente 20 kDa). La aparición de moléculas del tamaño de la endostatina en la circulación sanguínea humana podría deberse a la degradación del trímero NC-1 por proteasas tras la recogida de sueros humanos. El trímero NC-1 parece ser el principal producto fisiológico de la degradación del colágeno 18, presente en los tejidos y en la circulación, con propiedades biológicas distintas que no comparte la endostatina (monomérica). Los inventores demostraron además la unión de alta afinidad de la fibronectina con el VEGF y el trímero NC-1, así como la coinmunoprecipitación de estos tres socios de interacción candidatos a partir de lisados de proteínas de plaquetas de sangre periférica. Además, se pudo demostrar la co-localización in-vivo de NC-1 trímero, fibronectina, VEGf e integrina alfa 5 beta 1 (a5p1), lo que sugiere un modelo en el que un conjunto de VEGF, NC-1 trímero, integrina a5p1 con fibronectina preludian el inicio del proceso anti-angiogénico. Y lo que es más importante, los estudios antitumorales del trímero NC-1 frente a la endostatina demostraron que el trímero NC-1 es una proteína antiangiogénica más potente que la endostatina. Los datos anteriores se especifican con más detalle en los siguientes ejemplos.
En una realización del oligómero proteico para su uso de la invención, el monómero NC-1 de colágeno 18 humano comprende un (i) dominio de oligomerización, (ii) una región bisagra y/o (iii) un dominio de endostatina o un fragmento de dicho dominio de endostatina y, opcionalmente, un sitio de escisión de proteasa recombinante dentro de la región bisagra. Preferentemente, dicho fragmento del dominio de endostatina es un péptido que comprende el sitio/dominio de unión al zinc de la endostatina.
En otra realización preferida del oligómero proteico para su uso de la invención, la región bisagra se interpone entre el dominio de oligomerización y el dominio de endostatina. Preferentemente, la región bisagra se localiza entre el dominio de oligomerización y el sitio/dominio de unión a zinc de la endostatina o dominio de endostatina en el monómero NC-1 como se menciona en el presente documento. La disposición de los dominios dentro del monómero NC-1 del colágeno 18 humano es preferentemente dominio de oligomerización-región bisagra-dominio de endostatina, o dominio de endostatina-región bisagra-dominio de oligomerización.
Opcionalmente, la región bisagra dentro del monómero NC-1 del colágeno 18 humano puede comprender uno o más sitios de escisión de proteasas recombinantes, además de los sitios de escisión de proteasas endógenas de la región bisagra. Dicho sitio de escisión de la proteasa recombinante puede ser, por ejemplo, una escisión de enteroquinasa o trombina (Bergers y Javaherian; Lee et al.; loc. cit.). La escisión por la proteasa respectiva permite, por ejemplo, la liberación del dominio o dominios de endostatina del oligómero proteico para su uso de la invención o de la proteína de fusión de la invención.
En una realización preferida del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención, el dominio de oligomerización comprende un dominio de trimerización no triple helicoidal del colágeno 18 humano (, es decir, el dominio de asociación), un dominio Fc y/o un dominio de oligomerización artificial. El dominio de oligomerización comprende en un aspecto un dominio de trimerización no triple helicoidal del colágeno 18 humano que es responsable de la trimerización de las tres cadenas del dominio NC-1. En otro aspecto, comprende un dominio Fc. El dominio Fc confiere una estructura dimérica al monómero NC-1 tal como se define en el presente documento, ya que el propio dominio Fc es un dímero. En un tercer aspecto, comprende un dominio de oligomerización artificial, por ejemplo, cisteínas que dan lugar a puentes disulfuro entre dos monómeros, que sustituye estructural y funcionalmente al dominio de asociación tal como se encuentra en la NC-1 humana natural antes mencionada, o se utiliza además de dicho dominio de asociación. También queda comprendido en el alcance de la invención, que el dominio de oligomerización del oligómero proteico para su uso de la invención o proteína de fusión de la invención comprenda un dominio de trimerización no triple helicoidal de colágeno 18 humano y un dominio Fc. Además, puede comprender un dominio de oligomerización artificial y un dominio Fc.
Preferentemente, el dominio Fc es de IgG u otras isoformas de inmunoglobulina, así como otros constructos de andamiaje que proporcionan oligomerización y vida media más larga descritas en la técnica; véase, por ejemplo, Lo et al., Protein Engineering 1998, 11, 495. Un dominio Fc murino se muestra, por ejemplo, en la SEQ ID NO: 5.- Más preferentemente, el dominio Fc es de una IgG humana, aún más preferentemente de una IgG1 humana. Particularmente preferido, el dominio Fc humano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en la s Eq ID NO: 6.-
El dominio de oligomerización del monómero NC-1 puede ser un dominio Fc de una inmunoglobulina, preferentemente un dominio Fc de IgG1, como se ha expuesto anteriormente. El oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención también pueden contener dos, tres o incluso más dominios Fc. En un aspecto, el o los dominios Fc pueden escindirse del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o de la proteína de fusión de la invención, si se desea. Por ejemplo, entre el monómero NC-1 y el(los) dominio(s) Fc, en el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, puede interponerse un sitio de escisión artificial de proteasa, como una enteroquinasa o un sitio de escisión de trombina, por ejemplo, a través de un enlazador (poli)peptídico correspondiente. Tras la escisión por la proteasa respectiva, el oligómero se libera del (de los) dominio(s) Fc. El o los dominios Fc pueden utilizarse para la purificación y/o la detección. Además, el dominio Fc altera las propiedades biológicas del oligómero proteico para su uso de la invención o de la proteína de fusión de la invención, como la prolongación de la semivida en cirulación y la mejora de la actividad biológica, preferentemente la mejora de la actividad antiangiogénica. Por ejemplo, se ha encontrado que una proteína de fusión Fc-endostatina es capaz de unirse a la fibronectina como dímero, mientras que el monómero de endostatina no lo hace. Además, la Fcendostatina presenta una semivida más larga que la endostatina.
En otra realización preferida del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención, el dominio de oligomerización artificial comprende una única mutación en la posición 7 del dominio de endostatina en la que la glutamina se sustituye por cisteína. Preferentemente, el monómero como se define en el presente documento comprende en algunos aspectos una única mutación de glutamina a cisteína en la posición 7 del dominio de endostatina. Por ejemplo, se ha encontrado que un sitio de escisión de enteroquinasa introducido recombinantemente entre el dominio Fc y el dominio de endostatina en una proteína de fusión da lugar a la formación de un dímero tras la escisión de enteroquinasa debido a la formación de enlaces disulfuro entre residuos C7 adyacentes en los dominios de endostatina; véase Kuo2001, JCB 152, 1233. Como se ha expuesto anteriormente, el trímero NC-1 y los dímeros de endostatina tienen propiedades distintas, en comparación con el monómero de endostatina. La mutación anterior en la posición 7 (de glutamina a cisteína) también puede introducirse en el péptido N-terminal de la endostatina, que se ha demostrado que representa el dominio antitumoral de la endostatina (Tjin et al. 2005, Cancer Res 65, 3656). La oligomerización del péptido puede lograrse mediante dimerización artificial como se ha descrito anteriormente o simplemente mediante fusión recombinante a la fracción Fc sin mutación en la posición 7. Un ejemplo para una proteína de fusión de la invención que comprende dicha mutación en la posición 7 que media la dimerización se muestra en la SEQ ID NO: 15; véase el ejemplo 2.10.
En otra realización preferida del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, el sitio de escisión de la proteasa recombinante dentro de la región bisagra es un sitio de escisión de enteroquinasa otrombina. La escisión del oligómero proteico u oligómero peptídico con la enteroquinasa o la trombina da lugar a la liberación de los dominios de endostatina del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención.
En otra realización preferida del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, el monómero NC-1 tal como se define en el presente documento contiene únicamente sitios de escisión de proteasa que se producen de forma natural dentro de la región bisagra, es decir, no comprende un sitio de escisión de proteasa recombinante. En este caso, la región bisagra puede ser escindida, por ejemplo, por MMPs, como se establece en otra parte del presente documento, con el fin de liberar, por ejemplo, el dominio(s) de endostatina. En otro aspecto, estos sitios de escisión de proteasas naturales en la región bisagra del monómero NC-1 pueden mutarse de modo que el monómero NC-1 ya no sea escindido por dichas proteasas. De este modo, la actividad antiangiogénica del oligómero proteico para su uso de la invención puede seguir mejorándose.
En otra realización del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, la enfermedad relacionada con la angiogénesis a tratar se selecciona del grupo que consiste en cáncer dependiente de la angiogénesis incluyendo tumores sólidos, melanomas, metástasis tumorales, tumores nacidos en la sangre como leucemias, tumores benignos como hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, granulomas piógenos; artritis reumatoide; psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares como retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasias retrolentales, rubeosis; síndrome de Osler-Webber; angiogénesis miocárdica; neovascularización de placa; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; granulación de heridas; enfermedades de estimulación excesiva o anormal de las células endoteliales, como adherencias intestinales, aterosclerosis, esclerodermia, cicatrices hipertróficas (queloides); enfermedad por arañazo de gato (Rochele minalia quintosa) y úlceras (Helicobacter pylori). Preferentemente, las enfermedades relacionadas con la angiogénesis son el carcinoma de células renales, el cáncer colorrectal, de próstata, de mama o de pulmón.
El oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención se formula preferentemente como una composición farmacéutica que puede administrarse por vías estándar. Generalmente, la composición farmacéutica puede administrarse por vía tópica, transdérmica, intraperitoneal, intracraneal, intracerebroventricular, intracerebral, intravaginal, intrauterina, oral, rectal o parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraespinal, subcutánea o intramuscular).
Una composición farmacéutica que comprende el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención, como compuesto activo farmacéutico puede utilizarse para la terapia preferentemente humana de diversas enfermedades o trastornos relacionados con la angiogénesis, como se especifica en otra parte del presente documento, en una dosis terapéuticamente eficaz. En un aspecto, el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención pueden estar presentes en forma líquida o liofilizada. En un aspecto, el oligómero proteico u oligómero peptídico o proteína de fusión puede estar presente junto con glicerol, estabilizadores proteicos (por ejemplo, albúmina sérica humana [HSA]) o estabilizadores no proteicos.
El compuesto (es decir, el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención) es el ingrediente activo de la composición farmacéutica y, en un aspecto, se administra en formas de dosificación convencionales preparadas combinando el fármaco con portadores farmacéuticos estándar según procedimientos convencionales. Estos procedimientos pueden consistir en mezclar, granular y comprimir, o disolver los ingredientes según convenga a la preparación deseada. Se apreciará que la forma y el carácter del portador o diluyente farmacéutico aceptable vienen dictados por la cantidad de principio activo con el que se va a combinar, la vía de administración y otras variables bien conocidas.
El portador o portadores deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la formulación y no ser nocivos para el receptor de la misma. El portador farmacéutico empleado puede incluir un sólido, un gel o un líquido. Ejemplos de portadores sólidos son lactosa, terra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio, ácido esteárico y similares. Ejemplos de portadores líquidos son la solución salina tamponada con fosfato, el jarabe, el aceite, el agua, las emulsiones, diversos tipos de agentes humectantes y similares. Del mismo modo, el portador o diluyente puede incluir material de retardo bien conocido en la técnica, como el monoestearato de glicerilo o el diestearato de glicerilo solos o con una cera. Dichos portadores adecuados comprenden los mencionados anteriormente y otros bien conocidos en la técnica, véase, p. ej, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
El diluyente o diluyentes se seleccionan de forma que no afecten a la actividad biológica, preferentemente, a la actividad antiangiogénica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son el agua destilada, la solución salina fisiológica, las soluciones de Ringer, la solución de dextrosa y la solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros portadores, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.
Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención que se utilizará en una composición farmacéutica que previene, mejora o trata los síntomas que acompañan a una enfermedad o afección relacionada con la angiogénesis a la que se hace referencia en esta especificación. La eficacia terapéutica y la toxicidad del compuesto pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) y LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación, LD50/ED50.
El régimen de dosificación será determinado por el médico tratante y otros factores clínicos. Como es bien sabido en las artes médicas, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, como el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto concreto que se va a administrar, el sexo, el momento y la vía de administración, el estado general de salud y otros fármacos que se administren simultáneamente. Los progresos pueden controlarse mediante evaluaciones periódicas.
El medicamento al que se hace referencia en el presente documento se administra al menos una vez para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección mencionada en esta especificación. No obstante, dicho medicamento puede administrarse más de una vez.
Las composiciones farmacéuticas específicas se preparan de una manera bien conocida en el arte farmacéutico y comprenden al menos un compuesto activo mencionado anteriormente en mezcla o asociado de otro modo con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Para elaborar estas composiciones farmacéuticas específicas, el compuesto o compuestos activos se mezclarán normalmente con un portador o diluyente. Las formulaciones resultantes deben adaptarse al modo de administración. Las recomendaciones de dosificación se indicarán en las instrucciones del prescriptor o del usuario para anticipar los ajustes de dosis en función del receptor considerado.
En otro aspecto, la composición farmacéutica puede comprender fármacos además del oligómero proteico para su uso de la invención que se añaden al medicamento durante su formulación. Por último, debe entenderse que la formulación de una composición farmacéutica tiene lugar en condiciones estandarizadas GMP o similares para garantizar la calidad, la seguridad farmacéutica y la eficacia del medicamento.
En otra realización preferida del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, el oligómero es un dímero o un trímero. Sin embargo, el oligómero proteico para su uso de la invención también incluye tetrámeros o pentámeros u oligómeros con incluso más monómeros NC-1 como se define en el presente documento.
Se divulga pero no se reivindica un procedimiento para producir el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención, que comprende (a) cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión de la invención, preferentemente en condiciones libres de suero, (b) obtener a partir de la célula huésped del paso (a) el oligómero proteico u oligómero peptídico o proteína de fusión, y, opcionalmente, (c) almacenar el oligómero proteico u oligómero peptídico o proteína de fusión, preferentemente en condiciones libres de suero. Como se muestra en los siguientes ejemplos, los presentes inventores han encontrado que el NC-1 oligomérico, tal como el trímero NC-1, es susceptible a la degradación si se mantiene en suero o en medios de cultivo celular durante periodos de tiempo más largos, incluso a 4°C. Por lo tanto, es ventajoso producir y mantener el oligómero proteico o el oligómero peptídico para el uso de la invención en condiciones libres de suero. Por lo tanto, es ventajoso producir y mantener el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención en condiciones libres de suero.
Además, se divulga pero no se reivindica un procedimiento para la identificación de un agente antiangiogénico, que comprende (a) poner en contacto el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención con fibronectina y/o VEGF en condiciones que permitan la unión del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención a fibronectina y/o VEGF para formar un complejo, (b) poner en contacto el complejo del paso (a) con un panel de agentes, (c) identificar y aislar aquellos agentes que son capaces de unirse al complejo del paso (a), y (d) probar la actividad antiangiogénica del agente identificado en el paso (c) en un ensayo in vitro .
El procedimiento de la presente divulgación puede ser asistido por la automatización. Específicamente, en un aspecto, el paso a) y/o b) y/o c) puede ser asistido por dispositivos robóticos y sistemas lectores automatizados para mezclar compuestos y medir la formación del complejo. Los sistemas adecuados son conocidos en la técnica y dependen del tipo de respuesta que se desee determinar.
Además, el procedimiento puede comprender etapas adicionales relativas a la generación del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la presente invención.
La expresión "poner en contacto", tal como se utiliza aquí, se refiere a poner al menos dos compuestos diferentes en proximidad física para permitir la interacción física y/o química de dichos compuestos. En el procedimiento mencionado, el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso según la presente invención se pone primero en contacto con fibronectina y/o VEGF para formar un complejo. A continuación, dicho complejo se pone en contacto con un panel de agentes, por ejemplo, una biblioteca de proteínas, péptidos, sustancias químicas o aptámeros de los que se sospecha que contienen un polipéptido biológicamente activo. El oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención se pondrá en contacto con los compuestos mencionados durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos. La puesta en contacto como se utiliza en el presente documento, en un aspecto, se produce en una célula huésped que contiene el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la presente invención. Dicho tiempo y condiciones dependerán de la cantidad de oligómero proteico u oligómero peptídico. El experto en la materia sabe perfectamente qué condiciones deben aplicarse en función de la célula huésped y del tipo de oligómero proteico u oligómero peptídico. En otro aspecto, el contacto se produce en un sistema libre de células que comprende el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención. El sistema libre de células deberá permitir la formación de complejos entre el oligómero proteico u oligómero peptídico y los compuestos antes mencionados. Los ensayos in vitro para probar la actividad antiangiogénica se han expuesto en otros apartados del presente documento.
Además, la divulgación se refiere a un kit que comprende el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención.
El término "kit", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una colección de medios que comprenden el oligómero proteico o el oligómero peptídico para su uso de la presente invención que se proporcionan en viales separados o comunes de forma lista para su uso para llevar a cabo el tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogénesis tal como se define en el presente documento. En un aspecto, el kit comprende medios adicionales para llevar a cabo el tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogénesis, en un aspecto, agentes antiangiogénicos adicionales que pueden usarse en combinación con el oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, tales como anticuerpos contra o pequeños inhibidores moleculares de cinasas para, en particular, IGF1R, c-Met, Pi3K, VEGFR, Braf, ALK-EMI,4, PDGFR, anticuerpos antagonistas contra citoquinas clave tales como CCL2, GM-CSHCSF, Bv8, SDF1, y tratamientos estándar contra el cáncer tales como radioterapia y quimioterapias. Además, en un aspecto, el kit comprende instrucciones para llevar a cabo el tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogénesis. Estas instrucciones pueden proporcionarse en forma de manual o en forma de algoritmo implementable por ordenador en un medio de almacenamiento de datos que, una vez implementado, sea capaz de gobernar uno o más pasos del tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogénesis. Las instrucciones comprenden información con respecto a la dosificación del oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, tiempo y modo de administración y similares. En un aspecto, el kit debe utilizarse para llevar a cabo el tratamiento de una enfermedad específica relacionada con la angiogénesis enumerada anteriormente, por ejemplo, cáncer relacionado con la angiogénesis.
La presente invención se refiere además a una proteína de fusión que comprende un monómero NC-1 de colágeno 18 humano y un dominio Fc de una inmunoglobulina, en la que el monómero NC-1 comprende un dominio de oligomerización, una región bisagra y un dominio de endostatina, o fragmentos de dicho dominio de endostatina, que comprende el sitio de unión a zinc de la endostatina, y, opcionalmente, un sitio de corte de proteasa recombinante dentro de la región bisagra, y en el que el dominio de oligomerización comprende un dominio de trimerización no helicoidal triple del colágeno 18 humano y/o un dominio de oligomerización artificial que comprende una única mutación en la posición 7 del dominio de endostatina en la que la glutamina se sustituye por cisteína.
Los términos "proteína", "péptido", "monómero NC-1" (de colágeno 18 humano), y "dominio Fc o región Fc" (de una inmunoglobulina) se han definido en otras partes del presente documento. Dichas definiciones y las formas de realización del monómero NC-1 expuestas en otras partes del presente documento se aplican mutatis mutandis a las proteínas de fusión de la invención.
El término "proteína de fusión", tal como se utiliza en el presente documento, denota un polipéptido que comprende al menos un monómero NC-1, tal como se define en el presente documento, unido a al menos un dominio Fc derivado de una inmunoglobulina. Preferentemente, la proteína de fusión es humana. El dominio Fc puede fusionarse al N-terminal o al C-terminal del monómero NC-1, preferentemente al N-terminal.
En una realización preferida de la proteína de fusión de la invención, la proteína de fusión comprende un dominio de oligomerización, una región bisagra y un dominio de endostatina y, opcionalmente, un sitio de escisión de proteasa recombinante dentro de la región bisagra. La generación y expresión de dicha proteína de fusión Fc-NC-1 se muestra en los siguientes ejemplos. En caso de que la proteína de fusión de la invención comprenda un dominio de asociación como se define en el presente documento y un dominio Fc, puede ser beneficioso utilizar un dominio Fc que carezca del puente disulfuro único. La eliminación del puente disulfuro puede ser beneficiosa por la siguiente razón: Fc es un dímero, mientras que NC-1 es un trímero, lo que significa que un dímero necesita unirse a un trímero. Por lo tanto, puede ser útil construir una proteína de fusión NC-1-Fc a la que le falte el único disulfuro presente en la Fc para evitar la formación de dímeros de la Fc con el fin de evitar, por ejemplo, una expresión deficiente de la proteína. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mutando las cisteínas del N terminal en el dominio Fc (por ejemplo, los residuos de aminoácidos cisteína 11 y 14 del dominio Fc humano mostrado en la SEQ ID NO: 6) a alanina. Se espera que este enfoque proporcione un cobstructo trimérico Fc-trímero NC-1, como resultado de la trimerización NC-1 mediada por el dominio de trimerización no triple helicoidal.
En otra realización preferida de la proteína de fusión de la invención, el dominio de oligomerización comprende un dominio de trimerización no triple helicoidal del colágeno 18 humano y/o un dominio de oligomerización artificial y/o otros mecanismos mencionados anteriormente para la oligomerización del monómero.
Preferentemente, el dominio Fc (como se muestra, por ejemplo, en la SEQ ID NO: 5 o 6) es de IgG. En un aspecto, el monómero NC-1 como se define en el presente documento se fusiona a uno o más dominios Fc a través de un enlazador (poli)peptídico. Por ejemplo, un monómero NC-1 puede fusionarse a la porción Fc de la IgG humana a través de un enlazador de poliglicina (poli Gly).
En otra realización preferida de la proteína de fusión de la invención, el dominio de oligomerización artificial comprende una única mutación en la posición 7 del dominio de endostatina en la que la glutamina se sustituye por cisteína.
En una realización, la región bisagra se interpone entre el dominio Fc y el dominio de endostatina en el monómero NC-1 como se menciona en el presente documento. Dicha región bisagra puede comprender un sitio de corte de proteasa recombinante, como un sitio de corte de enteroquinasa o trombina. Opcionalmente, la región bisagra dentro del monómero NC-1 del colágeno 18 puede comprender uno o más sitios de escisión de proteasas recombinantes, además de los sitios de escisión de proteasas endógenas, por ejemplo para MMPs, de la región bisagra.
En otra realización preferida de la proteína de fusión de la invención, la disposición de dominios de la proteína de fusión es dominio Fc - dominio de oligomerización - región bisagra - dominio de endostatina o dominio de oligomerización - región bisagra - dominio de endostatina - dominio Fc o dominio Fc - dominio de endostatina - región bisagra - dominio de oligomerización o dominio de endostatina - región bisagra - dominio de oligomerización - dominio Fc. Se prefiere que la disposición de dominios de la proteína de fusión medie la oligomerización del monómero de endostatina sobre la unión disulfuro entre los dos fragmentos Fc.
En una realización de la proteína de fusión, dicha proteína de fusión es un oligómero proteico, preferentemente un dímero, trímero o tetrámero. El término "oligómero proteico" se ha definido en otro lugar del presente documento. Las definiciones y realizaciones del oligómero proteico para su uso de la invención se aplican mutatis mutandis a la proteína de fusión de la invención, que comprende dicho monómero NC-1 tal como se define en el presente documento y un dominio Fc de una inmunoglobulina. Se engloba dentro del alcance de la invención que dicha proteína de fusión pueda comprender más de un monómero NC-1 como se define en el presente documento, por ejemplo, dos, tres, cuatro o incluso más monómeros. En tales realizaciones, la proteína de fusión de la invención se utiliza como un oligómero. Además, dicha proteína de fusión puede comprender más de un dominio Fc, por ejemplo, dos, tres, cuatro o incluso más dominios Fc.
En una realización preferida de la proteína de fusión de la invención, la región bisagra en la proteína de fusión de la invención comprende una modificación estructural, por ejemplo una o más mutación(es), en un sitio de escisión de proteasa MMP que confiere escisión disminuida por dicha proteasa MMP.
Divulgada pero no reivindicada es también a una proteína de fusión que comprende:
a) un péptido de endostatina o un péptido derivado de la endostatina; y
b) el motivo RGD y/o el motivo PHSRN de la fibronectina.
Las definiciones y realizaciones con respecto al oligómero proteico u oligómero peptídico para su uso de la invención, o la proteína de fusión (que comprende un monómero NC-1 y un dominio Fc) de la invención se aplican mutatis mutandis a una proteína de fusión de la divulgación que comprende las características a) y b) expuestas anteriormente.
El "péptido de endostatina" o "péptido derivado de endostatina" como el dominio N-terminal de unión a zinc de endostatina o un péptido sintético correspondiente al dominio N-terminal de unión a zinc de endostatina se han descrito en otras partes del presente documento y se muestran en detalle en los siguientes Ejemplos; véanse, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NOs. 9 (isoforma 10). Queda comprendido en la presente divulgación que las variantes de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs. 9 y 10, por ejemplo, secuencias de aminoácidos más cortas de las SEQ ID NOs. 9 y 10 también pueden utilizarse. Por ejemplo, los presentes inventores han encontrado que un péptido correspondiente a las posiciones 1 a 13 de la SEQ ID NO: 9 o las posiciones 1 a 12 de la SEQ ID NO: 10 puede utilizarse como péptido de endostatina en la proteína de fusión arriba indicada de la invención divulgada. Además, dicho péptido puede diferir del correspondiente péptido de endostatina o péptido derivado de endostatina en uno, dos, tres, cuatro o incluso más residuos de aminoácidos, manteniendo al menos (o incluso superando) la actividad biológica (como se describe en otro lugar del presente documento) del correspondiente péptido de endostatina en el dominio de endostatina de NC-1. A la luz de esto, es importante mantener los residuos de aminoácido Histidina correspondientes a las posiciones 1, 3 y/u 11 de las SEQ ID NOs. 9 o 10 por las razones expuestas en el presente documento. Ejemplos de péptidos de endostatina que muestran actividad antiangiogénica y/o antitumoral que pueden usarse en las proteínas de fusión u oligómeros de la presente solicitud se han descrito con más detalle, por ejemplo, en Tjin et al., loc. cit., o en US 7,524,811.
De forma similar, el motivo RGD y/o el motivo PHSRN dentro de la Fibronectina (FN) se han mencionado en otras partes del presente documento y se caracterizan con más detalle en los siguientes Ejemplos. Por ejemplo, las SEQ ID NOs. 11 y 12 proporcionan secuencias de aminoácidos que comprenden el motivo RGD y los residuos de aminoácidos circundantes importantes para la unión de la Fibronectina a las integrinas. En resumen, la fibronectina es reconocida por las integrinas alfa 5 beta 1 y alfa V beta 3. El principal motivo de secuencia de la fibronectina para la unión a la integrina es un tripéptido, Arg-Gly-Asp (RGD), situado en el bucle que conecta las hebras G y F de FN-IM10. El motivo Pro-His-Ser-Arg-Asn (PHSRN), que reside en el noveno dominio de la fibronectina de tipo III, interviene también en la unión de la fibronectina a la integrina. Las correspondientes secuencias de aminoácidos de la Fibronectina (FN) murina y humana se muestran, por ejemplo, en los números de acceso NP_034363.1 y NP_997647.1, respectivamente. La estructura de dominio de la FN humana puede deducirse, por ejemplo, de la publicación de Wijelath et al. 2006, Circ. Res. Biol., 99, 853-860). Preferentemente, el motivo RGD de la Fibronectina comprende o consiste en la SEQ ID NO. <11> 12
Preferentemente, el péptido de endostatina o el péptido derivado de endostatina se localiza en el extremo aminoterminal de la proteína de fusión y el motivo RGD y/o el motivo PHSRN de Fibronectina se localiza en el extremo carboxi-terminal de la proteína de fusión de la invención de la divulgación.
Preferentemente, esta proteína de fusión de la invención comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: <7> 13
En otra realización preferida de esta proteína de fusión de la divulgación, la proteína de fusión comprende además un dominio Fc o un dominio de oligomerización artificial como se define en el presente documento. Preferentemente, la proteína de fusión con un dominio de oligomerización artificial comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 15.-
Basándose en los datos experimentales mostrados en los siguientes Ejemplos, los presentes inventores plantearon la hipótesis de que la NC-1 oligomérica puede elicitar sus efectos a través de la unión de fibronectina (FN) mediante la interferencia con al menos dos vías de angiogénesis fundamentales, es decir, VEGF y señalización de integrina alfa 5 beta 1 (ITGA5B1). Además, descubrieron que el FN está significativamente regulado a la baja en los tumores que se vuelven resistentes al NC-1 oligomérico (Fc-Endostatina) tras una exposición prolongada, es decir, cuatro pases seriados in vivo . Por lo tanto, postularon que la pérdida de FN podría constituir un mecanismo clave de la resistencia inherente y adquirida a la NC-1 oligomérica. Para probar este concepto, se ha diseñado una secuencia peptídica mínima que imita los efectos clave del complejo endostatina (ED) - fibronectina. Para ello, los inventores seleccionaron en primer lugar el motivo más activo de todo el dominio ED, consistente en una región de 27 aminoácidos-NH2-terminal (Tjin Tham Sjin et al. 2005, Cancer Res. 65, 3656-63). Los datos preliminares de los presentes inventores indican que esta región en sí puede ser capaz de unirse al VEGF y que las dos histidinas (dominio de unión al Zinc) en esta secuencia peptídica pueden ser críticas para la unión al VEGF. Esto es concebible, porque un péptido mutado en el que las histidinas se sustituyeron por residuos de alanina no pudo competir con la unión del dímero VEGF-ED (Fc-Endostatina). Por otra parte, la fibronectina contiene dos motivos activos que son críticos para su unión a ITGA5B1, es decir, un motivo dependiente de PHSRN y otro dependiente de RGD. La Figura 10 muestra una visión esquemática de los motivos críticos dentro del dominio e D y el FN. Para imitar el complejo fisiológico de NC-1 oligomérica y FN que media la señalización de la integrina y otras propiedades de la NC-1-ED, los inventores fusionaron estos dos motivos críticos, es decir, el motivo más activo antes mencionado del dominio NC-1-ED y el motivo de unión a la integrina de la fibronectina que comprende "RGD" y los residuos de aminoácidos circundantes importantes para la unión, y generaron proteínas de fusión híbridas denominadas "Superestatinas". Para cada proteína de fusión se diseñó un equivalente humano y uno de ratón, como se describe con más detalle a continuación y en el Ejemplo 2.10. Utilizando el modelo murino (C57BL6) de cáncer de pulmón LLC (carcinoma pulmonar de Lewis), los inventores pudieron demostrar la eficacia del péptido murino Superstatina para inhibir potentemente el crecimiento tumoral; véase la Figura 11. Además, la Superstatina prolongó significativamente la supervivencia en comparación con el control. En cambio, el FN-Motif solo no mostró ninguna mejora significativa en la prevención del crecimiento tumoral.
La secuencia de aminoácidos correspondiente para la Superstatina murina (m) se muestra en la SEQ ID NO: 7, mientras que la secuencia de aminoácidos correspondiente para la Superstatina (h) humana se muestra en la SEQ ID NO: 13.- Las superestatinas son probablemente monómeros. La SEQ ID NO: 15 muestra una variante de la secuencia de aminoácidos de la Superstatina humana que es capaz de dimerizarse, debido a la sustitución de Glutamina en la posición 7 en la SEQ ID NO: 13 por Cisteína. Esta proteína de fusión de la divulgación permitirá analizar el impacto de la dimerización en la actividad antitumoral. Otros constructos que contienen el PHSRn en lugar del motivo RGD del FN, así como constructos que facilitan la dimerización de la Superestatina a través de enlaces disulfuro o regiones Fc están actualmente en preparación o ya se están evaluando in vivo. El péptido humano Superstatina (SEQ ID NO: 13) se conjuga con el agente complejante ácido 1,4,7,10-tetraaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (también conocido como DOTA), lo que permite conjugar el péptido con, por ejemplo, radionucleidos como el galio (68Ga) para la obtención de imágenes no invasivas (tomografía por emisión de positrones, PET). Los inventores comprueban actualmente si la conjugación DOTA afecta a la eficacia del péptido Superstatina humano in vivo en un modelo de cáncer de páncreas humano BxPC3. En caso de que este experimento confirme la actividad de los constructos Superstatina-DOTA, se prevé la obtención de imágenes PET in vivo para evaluar el potencial de Superstatina-DOTA como agente de diagnóstico; véase el Ejemplo 2.10.
Por consiguiente, la divulgación que no se reivindica se refiere además a una proteína de fusión que comprende a) un péptido de endostatina o un péptido derivado de endostatina y b) el motivo RGD y/o el motivo PHSRN de Fibronectina para su uso como composición de diagnóstico. Preferentemente, el péptido Superstatina humano (SEQ ID NO: 13) se conjuga con el agente complejante ácido 1,4,7,10-tetraaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (también conocido como DOTA).
En otra realización preferida de esta proteína de fusión de la divulgación, la proteína de fusión puede utilizarse para identificar y/o caracterizar la región de fibronectina que se une a la endostatina. Tales procedimientos son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, BiaCore.
Otras realizaciones de las proteínas de fusión de la divulgación pueden derivarse de los siguientes Ejemplos.
La divulgación que no se reivindica se refiere además a un polinucleótido que codifica las proteínas de fusión de la invención.
El término "polinucleótido", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a moléculas de ADN de cadena simple o doble, así como a moléculas de ARN. Dicho término engloba el ADN genómico, el ADNc, el ARNhn, el ARNm, así como todos los derivados naturales o modificados artificialmente de dichas especies moleculares. El polinucleótido puede ser en un aspecto una molécula lineal o circular. Por otra parte, además de las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína de fusión de la presente invención, un polinucleótido de la presente divulgación puede comprender secuencias adicionales necesarias para la transcripción y/o traducción adecuadas, tales como secuencias 5'- o 3'-UTR. Las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína de fusión de la presente invención pueden derivarse de la secuencia de aminoácidos prevista para la proteína de fusión de la invención por un artesano experto sin más. A la luz de la degeneración del código genético, pueden utilizarse codones optimizados en las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína de fusión en el polinucleótido de la presente invención de divulgación. De este modo, se puede lograr una expresión óptima en, por ejemplo, una célula huésped de la presente divulgación.
Se entenderá que la presente divulgación también abarca variantes de tales secuencias de aminoácidos específicas de la proteína de fusión de la invención o secuencias de ácido nucleico que las codifican siempre que estas secuencias variantes también permitan la formación de una proteína de fusión de la invención. Dichas variantes tienen preferentemente actividad antiangiogénica según se define en el presente documento. En un aspecto, una variante de secuencia tal como se utiliza en el presente documento difiere de la secuencia específica de aminoácidos o de una secuencia específica de ácidos nucleicos tal como se ha especificado anteriormente por una o más sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácidos o nucleótidos. En otro aspecto, dicha secuencia variante es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia específica de la proteína de fusión de la invención en toda su longitud o en al menos un tramo de la mitad de la longitud de la secuencia específica. El término "idéntico", tal y como se utiliza aquí, se refiere a la identidad de secuencia caracterizada por la determinación del número de aminoácidos idénticos entre secuencias en las que las secuencias se alinean de forma que se obtenga la coincidencia de mayor orden. Puede calcularse utilizando técnicas publicadas o procedimientos codificados en programas informáticos como, por ejemplo, BLASTP o FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). Los valores porcentuales de identidad se calculan, en un aspecto, sobre toda la secuencia de aminoácidos o sobre un tramo de secuencia de al menos el 50% de la secuencia de consulta. El trabajador cualificado dispone de una serie de programas basados en diversos algoritmos para comparar distintas secuencias. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman ofrecen resultados especialmente fiables. Para realizar los alineamientos de secuencias se utilizó el programa PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) o los programas Gap y BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482), que forman parte del paquete de programas GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Los valores de identidad de secuencia citados anteriormente en porcentaje (%) deben determinarse, en otro aspecto de la divulgación, utilizando el programa GAP sobre toda la región de secuencia con los siguientes ajustes: Gap Weight: 50, Longitud Peso: 3, Partido Promedio: 10.000 y Desajuste medio: 0.000, que, a menos que se especifique lo contrario, se utilizarán siempre como ajustes estándar para las alineaciones de secuencias.
La divulgación no reivindicada se refiere además a un vector que comprende el polinucleótido divulgado .
Preferentemente, el vector es un vector de expresión.
El término "vector" abarca preferentemente vectores fágicos, plasmídicos, víricos o retrovirales, así como cromosomas artificiales, como cromosomas artificiales bacterianos o de levadura. Además, el término también se refiere a los constructos diana que permiten la integración aleatoria o dirigida del constructo diana en el ADN genómico. Dichos constructos diana, en un aspecto, comprenden ADN de longitud suficiente para recombinación homóloga o heteróloga como se describe en detalle más adelante. El vector que abarca los polinucleótidos de la presente divulgación, que no se reivindica en un aspecto, comprende además marcadores seleccionables para la propagación y/o selección en una célula huésped. El vector puede incorporarse a una célula huésped mediante diversas técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un vector plasmídico puede introducirse en un precipitado, como un precipitado de fosfato cálcico o de cloruro de rubidio, o en un complejo con un lípido cargado o en agrupaciones basadas en carbono, como los fullerenos. Alternativamente, puede introducirse un vector plasmídico mediante técnicas de choque térmico o electroporación. Si el vector es un virus, puede empaquetarse in vitro utilizando una línea celular de empaquetado adecuada antes de su aplicación a las células huésped. Los vectores retrovirales pueden ser de replicación competente o de replicación defectuosa. En este último caso, la propagación viral se producirá generalmente sólo en huéspedes/células complementarias.
Además, en un aspecto de la divulgación, que no se reivindica, el polinucleótido está unido operativamente a secuencias de control de expresión que permiten la expresión en células huésped procariotas o eucariotas o fracciones aisladas de las mismas en dicho vector. Así, en un aspecto, el vector es un vector de expresión. La expresión del polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que garantizan la expresión en las células huésped son bien conocidos en la técnica. En un aspecto, comprenden secuencias reguladoras que aseguran la iniciación de la transcripción y/o señales poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales y translacionales. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped procariotas comprenden, por ejemplo, el promotor lac-, trp- o tac- en E. coli, y ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucariotas son el promotor AOX1- o GAL1- en levaduras o el promotor CMV-, SV40-, RSV (virus del sarcoma de Rous), potenciador de CMV, potenciador de SV40 o un intrón de globina en células de mamíferos y otros animales. Además, pueden utilizarse secuencias de control de expresión inducibles en un vector de expresión comprendido en la presente divulgación. que no se reivindica Tales vectores inducibles pueden comprender secuencias operadoras tet o lac o secuencias inducibles por choque térmico u otros factores ambientales. Las secuencias de control de expresión adecuadas son bien conocidas en la técnica. Además de los elementos responsables del inicio de la transcripción, dichos elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, como el sitio SV40-poly-A o el sitio tk-poly-A, corriente abajo del polinucleótido. En este contexto, los vectores de expresión adecuados son conocidos en la técnica, como el vector de expresión de ADNc Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pBluescript (Stratagene), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) o pSPORT1 (Invitrogen). Preferentemente, dicho vector es un vector de expresión y un vector de transferencia de genes o de diana. Los vectores de expresión derivados de virus como retrovirus, virus vaccinia, virus adenoasociados, virus del herpes o virus del papiloma bovino, pueden utilizarse para la administración del polinucleótido o vector de la divulgación a una población celular diana. Para construir vectores virales recombinantes pueden utilizarse procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia; véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y 1994.-
La divulgación no reivindicada se refiere además a una célula huésped que comprende el polinucleótido o vector divulgado.
El término "célula huésped", tal como se utiliza en el presente documento, abarca células huéspedes procariotas y eucariotas. En un aspecto, la célula huésped es una célula bacteriana. En un aspecto, dicha célula huésped bacteriana es una célula huésped E. coli. Dicha célula huésped bacteriana puede utilizarse, por ejemplo, para la reproducción del polinucleótido o del vector de la presente divulgación.
Una célula huésped eucariota, en un aspecto, es una célula que comprende la proteína de fusión y el polinucleótido o el vector de la presente divulgación, en la que dicho polinucleótido o vector se expresan en la célula huésped para generar la proteína de fusión. El polinucleótido puede introducirse en una célula huésped de forma transitoria o estable. En un aspecto, la célula huésped eucariota puede ser una célula de una línea celular huésped eucariota que expresa de forma estable el polinucleótido de la invención de la divulgación. En otro aspecto, la célula huésped es una célula huésped eucariota que ha sido transfectada transitoriamente con el polinucleótido o vector de la divulgación y que expresa el polinucleótido divulgado. En otro aspecto, dicha célula es una célula que ha sido modificada genéticamente para producir la proteína de fusión de la invención. El experto conoce bien cómo se pueden manipular genéticamente dichas células mediante técnicas de biología molecular.
La divulgación que no se reivindica se refiere además a un procedimiento para producir las proteínas de fusión de la invención, que comprende:
a) Cultivo de una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la invención, preferentemente en condiciones libres de suero,
b) obtención a partir de la célula huésped del paso a) de la proteína de fusión de la invención.
La invención se refiere además a un medicamento, preferentemente una composición farmacéutica, que comprende el polinucleótido divulgado que codifica las proteínas de fusión de la invención, el vector divulgado, la célula huésped divulgada, o las proteínas de fusión de la invención.
El término "medicamento" tal como se utiliza en el presente documento se refiere, en un aspecto, a una composición farmacéutica que contiene el polinucleótido divulgado que codifica la proteína de fusión de la invención, el vector divulgado, la célula huésped divulgada, o la proteína de fusión de la invención, como compuesto activo farmacéutico, en el que la composición farmacéutica puede utilizarse para la terapia preferentemente humana de diversas enfermedades o trastornos relacionados con la angiogénesis tal como se especifica en otra parte del presente documento en una dosis terapéuticamente eficaz. Las posibles vías de administración se han expuesto en otros apartados del presente documento. En un aspecto, el polinucleótido divulgado que codifica la proteína de fusión de la invención, el vector divulgado, la célula huésped divulgada, o la proteína de fusión de la invención, puede estar presente en forma líquida o liofilizada. En un aspecto, dicho compuesto puede estar presente junto con glicerol, estabilizadores proteicos (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA)) o estabilizadores no proteicos. En otro aspecto, dicho compuesto puede estar pegilado.
El compuesto (es decir, el polinucleótido divulgado que codifica la proteína de fusión de la invención, el vector divulgado, la célula huésped divulgada o la proteína de fusión de la invención) es el ingrediente activo de la composición y, en un aspecto, se administra en formas de dosificación convencionales preparadas combinando el fármaco con portadores farmacéuticos estándar según procedimientos convencionales. Estos procedimientos pueden consistir en mezclar, granular y comprimir, o disolver los ingredientes según convenga a la preparación deseada. Se apreciará que la forma y el carácter del portador o diluyente farmacéutico aceptable vienen dictados por la cantidad de principio activo con el que se va a combinar, la vía de administración y otras variables bien conocidas.
El portador o portadores deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la formulación y no ser nocivos para el receptor de la misma. El portador farmacéutico empleado puede incluir un sólido, un gel o un líquido. Ejemplos de portadores sólidos son lactosa, terra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio, ácido esteárico y similares. Ejemplos de portadores líquidos son la solución salina tamponada con fosfato, el jarabe, el aceite, el agua, las emulsiones, diversos tipos de agentes humectantes y similares. Del mismo modo, el portador o diluyente puede incluir material de retardo bien conocido en la técnica, como el monoestearato de glicerilo o el diestearato de glicerilo solos o con una cera. Dichos portadores adecuados comprenden los mencionados anteriormente y otros bien conocidos en la técnica, véase, p. ej, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
El diluyente o diluyentes se seleccionan de forma que no afecten a la actividad biológica, preferentemente, a la actividad antiangiogénica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son el agua destilada, la solución salina fisiológica, las soluciones de Ringer, la solución de dextrosa y la solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros portadores, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.
Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad del compuesto que se utilizará en el medicamento de la presente invención que previene, mejora o trata los síntomas que acompañan a una enfermedad o afección relacionada con la angiogénesis a la que se hace referencia en esta especificación. La eficacia terapéutica y la toxicidad del compuesto pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) y LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación, LD50/ED50.
El régimen de dosificación será determinado por el médico tratante y otros factores clínicos. Como es bien sabido en las artes médicas, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, como el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto concreto que se va a administrar, el sexo, el momento y la vía de administración, el estado general de salud y otros fármacos que se administren simultáneamente. Los progresos pueden controlarse mediante evaluaciones periódicas.
El medicamento al que se hace referencia en el presente documento se administra al menos una vez para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección mencionada en esta especificación. No obstante, dicho medicamento puede administrarse más de una vez.
Los medicamentos específicos se preparan de una manera bien conocida en el arte farmacéutico y comprenden al menos un compuesto activo mencionado anteriormente en mezcla o asociado de otro modo con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Para elaborar estas composiciones farmacéuticas específicas, el compuesto o compuestos activos se mezclarán normalmente con un portador o diluyente. Las formulaciones resultantes deben adaptarse al modo de administración. Las recomendaciones de dosificación se indicarán en las instrucciones del prescriptor o del usuario para anticipar los ajustes de dosis en función del receptor considerado.
En un aspecto adicional de la invención, el medicamento según la presente invención puede comprender fármacos además del polinucleótido divulgado que codifica la proteína de fusión, el vector divulgado, la célula huésped divulgada o la proteína de fusión de la invención que se añaden al medicamento durante su formulación. Por último, debe entenderse que la formulación de un medicamento tiene lugar en condiciones estandarizadas GMP o similares para garantizar la calidad, la seguridad farmacéutica y la eficacia del medicamento.
En otra realización preferida de la proteína de fusión de la invención, el medicamento o composición farmacéutica que comprende el polinucleótido divulgado que codifica la proteína de fusión de la invención, el vector divulgado, la célula huésped divulgada, o la proteína de fusión de la invención es para el tratamiento o prevención de una enfermedad relacionada con la angiogénesis seleccionada del grupo que consiste en cáncer dependiente de angiogénesis incluyendo tumores sólidos, melanomas, metástasis tumorales, tumores nacidos de la sangre tales como leucemias, tumores benignos tales como hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, granulomas piógenos; artritis reumatoide; psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares como retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasias retrolentales, rubeosis; síndrome de Osler-Webber; angiogénesis miocárdica; neovascularización de placa; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; granulación de heridas; enfermedades de estimulación excesiva o anormal de las células endoteliales, como adherencias intestinales, aterosclerosis, esclerodermia, cicatrices hipertróficas (queloides); enfermedades que tienen la angiogénesis como consecuencia patológica, como la enfermedad por arañazo de gato (Rochele minalia quintosa) y las úlceras (Helicobacter pylori).
La invención se refiere además a una composición de diagnóstico que comprende el polinucleótido divulgado, el vector divulgado, la célula huésped divulgada o la proteína de fusión de la invención.
La divulgación que no se reivindica se refiere además al uso que comprende el polinucleótido divulgado, el vector divulgado, la célula huésped divulgada o la proteína de fusión de la invención para determinar una actividad antiangiogénica en una muestra in vitro o in vivo.
La invención se refiere además a un kit que comprende la proteína de fusión de la invención y una hoja de instrucciones para el tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogénesis.
El término "kit", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una colección de medios que comprenden la proteína de fusión de la invención que se suministran en viales separados o comunes de forma lista para su uso para llevar a cabo el tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogénesis. En un aspecto, el kit comprende medios adicionales para llevar a cabo el tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogénesis, en un aspecto, agentes antiangiogénicos adicionales que pueden utilizarse en combinación con el oligómero proteico para su uso de la invención o la proteína de fusión de la invención, como los mencionados en el presente documento. Además, en un aspecto, el kit comprende instrucciones para llevar a cabo el tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogénesis. Estas instrucciones pueden proporcionarse en forma de manual o en forma de algoritmo implementable por ordenador en un medio de almacenamiento de datos que, una vez implementado, sea capaz de gobernar uno o más pasos del tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogénesis. Las instrucciones comprenden información con respecto a la dosis de la proteína de fusión de la invención, tiempo y modo de administración y similares. En un aspecto, el kit debe utilizarse para llevar a cabo el tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogénesis especificada anteriormente.
La divulgación no reivindicada se refiere además a un(n) procedimiento^) (in vitro) para la identificación de un agente antiangiogénico, que comprende
a) Poner en contacto el oligómero para su uso de la invención o la proteína de fusión de la invención con fibronectina y/o VEGF en condiciones que permitan la unión del oligómero o la proteína de fusión a la fibronectina y/o VEGF para formar un complejo,
b) Poner en contacto el complejo del paso a) con un panel de agentes,
c) identificar y aislar los agentes capaces de unirse al complejo del paso a), y
d) comprobación de la actividad antiangiogénica de los agentes identificados en el paso c) en un ensayo in vitro .
El panel de agentes utilizado en el paso b) puede ser, por ejemplo, una biblioteca de proteínas o anticuerpos, una biblioteca de visualización de fagos, pequeños compuestos orgánicos o similares. El procedimiento puede comprender además un paso (e), en la que pueden identificarse las regiones de fibronectina responsables de la unión al oligómero o a la proteína de fusión de la invención. Esta información puede utilizarse para el diseño molecular de terapias antiangiogénicas y/o antitumorales.
Las definiciones y realizaciones del procedimiento que utiliza el oligómero proteico para el uso de la invención se aplican mutatis mutandis.
La invención también se refiere a un procedimiento para producir una proteína de fusión NC-1-Fc o Fc-NC-1 mutada de la invención, que comprende:
a) introducir una única mutación en la posición aminoacídica 7 del dominio de endostatina en la proteína de fusión NC-1-Fc o Fc-NC-1 sustituyendo la glutamina por cisteína, y
b) aislar la proteína de fusión NC-1-Fc o Fc-NC-1 mutada del paso a).
Dicha mutación ha sido descrita en otra parte del presente documento.
Finalmente, en contraste con informes anteriores, los inventores fueron capaces de generar tumores en ratones que eran resistentes a la Fc-endostatina. La Fc-endostatina forma oligómeros y, por lo tanto, imita el efecto oligomérico NC-1 descrito en el presente documento, por ejemplo, en el sentido de que se une a la fibronectina, mientras que el monómero de endostatina no lo hace. Estos tumores se generaron por implantación y tratamiento secuencial de tumores, en cáncer de pulmón murino (LLC) y adenocarcinoma pancreático humano (BxPC3) hasta 4 pasajes. Los perfiles de expresión de todo el genoma revelaron que la subregulación de la fibronectina es un mecanismo importante para que los tumores sean resistentes al tratamiento con Fc-endostatina. Esto concuerda con la observación del inventor de la unión selectiva de la Fc-Endostatina oligomérica y la NC-1 oligomérica a la fibronectina.
Por consiguiente, la invención se refiere a un procedimiento para predecir la respuesta de un paciente con cáncer a una terapia oncológica aplicada, que comprende los pasos de: a) medir el nivel de fibronectina en una muestra del paciente utilizando el oligómero n C-1 para su uso de la invención o la proteína de fusión de la invención, y b) predecir la respuesta de dicho paciente a dicha terapia oncológica, en la que los niveles bajos de fibronectina comparados con un nivel de referencia (de un sujeto sano) son indicativos de una falta de respuesta del paciente a la terapia oncológica aplicada.
Además, la divulgación abarca un kit que comprende el oligómero NC-1 para su uso de la invención o la proteína de fusión de la invención para predecir la respuesta tumoral al tratamiento con el NC-1 oligomérico para su uso de la invención o la proteína de fusión de la invención. Como se ha expuesto anteriormente, dichos compuestos pueden utilizarse para detectar el nivel de fibronectina o fragmentos de la misma en una muestra de un paciente con cáncer.
Los inventores han encontrado sorprendentemente que el análisis de los niveles de fibronectina mediante el uso de los oligómeros NC-1 para su uso de la invención o las proteínas de fusión de la invención puede ser predictivo de la respuesta a la terapia del cáncer. La capacidad de los oligómeros NC-1 para su uso de la invención o de las proteínas de fusión de la invención para unirse a la fibronectina puede utilizarse, por ejemplo, para la determinación de los niveles de fibronectina en muestras de pacientes con cáncer. Los niveles bajos de fibronectina detectados por los oligómeros NC-1 para su uso de la invención o las proteínas de fusión de la invención son indicativos de mal pronóstico y pueden, por tanto, utilizarse como predictor de terapia molecular para identificar a los pacientes con cáncer que responden al tratamiento frente a los que no responden. Más concretamente, las concentraciones bajas de fibronectina en el tumor, el entorno tumoral, el suero, el plasma o la orina de pacientes con cáncer sometidos a una terapia antitumoral, como -pero sin limitarse a- el tratamiento con los oligómeros NC-1 para su uso de la invención o las proteínas de fusión Fc de la invención, la quimioterapia o la terapia con anticuerpos, es pronóstico de una respuesta deficiente o nula del paciente a la terapia aplicada.
Curiosamente, los inventores identificaron una serie de vías compensatorias que se activan y hacen que los tumores sean resistentes al tratamiento con Fc-endostatina. En particular, el tratamiento secuencial con inhibidores de IGF1R parece prometedor y CCL2 parece constituir otra diana candidata prometedora, como se muestra en los siguientes ejemplos. Dado que la Fc-endostatina imita los efectos de los oligómeros NC-1 para su uso de la invención o las proteínas de fusión de la invención, este hallazgo también es relevante para pacientes resistentes a la terapia por dichos oligómeros NC-1 o proteínas de fusión. Para eludir la farmacorresistencia adquirida a la NC-1 oligomérica para su uso de la invención o a las proteínas de fusión de la invención, se puede utilizar una terapia concurrente o secuencial con agentes dirigidos anti-IGF1R, -CCL2 o -PI3K. Para ello, pueden aplicarse inhibidores de las dianas mencionadas, como anticuerpos o inhibidores de PI3K descritos en la técnica.
A la luz de lo anterior, la divulgación se refiere además a la terapia concurrente o secuencial con agentes dirigidos anti-IGF1R y/o -CCL2, tales como - pero no limitados a - anticuerpos, para eludir la resistencia farmacológica adquirida a NC-1 oligomérico.
En las siguientes Figuras y Ejemplos, el término "hNC-1" corresponde al dominio NC-1 humano y el término "mNC-1" al dominio NC-1 murino. El dominio NC-1 es el NC-1 trimérico natural del colágeno 18 que comprende un dominio de asociación, una región bisagra y un dominio de endostatina (incluido el sitio de unión al zinc), si no se indica lo contrario.
FIGURAS
Figura 1 (A): Inmunoprecipitación de Plaquetas humanas.
Las plaquetas de 15 ml de plasma recién recogido se lisaron empleando 25 mM Tris, 0,15 M NaCl, 1% NP-40, pH 7,5 y un cóctel de inhibidores de proteasas (el volumen total se hizo de 3 ml). El lisado se centrifugó y se filtró. Las proteínas Fc, Fc-VEGF y Fc-endostatina (10 |jg de cada una) se añadieron individualmente a 1 ml de lisado. Se empleó la proteína A. El tiempo de incubación fue de 18 h a 4 °C. Tras tres lavados, las muestras eluidas se aplicaron a PAGE y se tiñeron con tinción de Coomassie. Los carriles de control se refieren a las muestras desprovistas de lisado. Las proteínas candidatas se cortaron del gel y se enviaron para su análisis por espectrometría de masas.
Figura 1 (B): Elisa.
El recubrimiento de las proteínas se realizó en PBS a una concentración de 10 jg/ml. La fibronectina sirvió de ligando a la misma concentración. Todos los tampones contenían un 2 % de BSAy un 0,1 % de Tween-20.
Figura 1 (C): Mediciones Biacore de las constantes de equilibrio para la unión del monómero de endostatina, el dímero y el trímero NC-1 a la fibronectina.
Las muestras de fibronectina se prepararon mediante dilución en serie en Hepes 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, tensioactivo 0,05 % que contenía 1 mg/ml de BSAen el intervalo 0,78 nM-100 nM y se hicieron fluir sobre las superficies de control y derivatizadas durante tres minutos a un caudal de 60 μl/min. Las fases de disociación se controlaron durante 5 minutos. Se incluyeron ciclos de tampón blanco de concentración cero como muestras de control negativo. Las superficies de los sensores se regeneraron mediante una inyección de 1 minuto de etanolamina 1 M, pH 8,5 después de cada ciclo de análisis de interacción. No se observaron efectos de unión no específicos a la superficie del sensor CM4. Se muestran los valores calculados de ka, kd y KD. Las diferentes curvas corresponden a diferentes concentraciones de fibronectina.
Figura 2: Actividad de unión de la endostatina y co-localización con la fibronectina en los vasos sanguíneos.
Se utilizó inmunohistoquímica para verificar la distribución de Fc-endostatina en ratones xenoinjertados ASPC-1 tras los tratamientos. (A) La endostatina exógena se detectó mediante un anticuerpo marcado con Alexa 488 (verde) y se utilizó el marcador de vasos CD31, que se detectó mediante un anticuerpo marcado con Alexa 594 (rojo) en el tumor, el corazón y el riñón. (B) Se utilizó a-SMA, marcador de pericitos (rojo), para confirmar la unión de la endostatina a los vasos tumorales. (C) La distribución de la endostatina exógena (verde) es similar a la de la fibronectina (rojo) en el tumor. El control Fc humano (hFc) no muestra unión. (D) El colágeno 18 endógeno (verde) y la fibronectina (rojo) se detectaron mediante anticuerpos policlonales contra la endostatina y la fibronectina en el tumor animal no tratado. (E) Tinción de Fc-endostatina e integrina a5p1. (F) Tinción de vW e integrina a5p1. (G) Se utilizaron secciones embrionarias de cerebro de ratón E14.5 para verificar la distribución de fibronectina, VEGF y Fc-endostatina (Barra, 100 μm).
Figura 3 (A): Unión de Fc-endostatina y colágeno hNC-1 a células endoteliales.
Las HUVEC se incubaron con Fc-endostatina y se detectaron con IgG Alexa 488 o con el trímero NC-1 humano (hNC-1) y se detectaron con el anticuerpo monoclonal de etiqueta anti-His. La tinción de fibronectina se muestra en color rojo (barra, 20 μm).
Figura 3 (B): hNC-1 inhibe la migración de células endoteliales.
Las HUVEC se sembraron por duplicado en insertos de 24 pocillos de placas transwell. La cámara inferior se llenó con medio libre de suero que contenía 100 ng/ml de VEGf rhesus (rhVEGF) más diferentes concentraciones de hNC-1. Tras incubarlas durante 16 h a 37 °C, se fijaron y tiñeron las células. Las células endoteliales muestran una menor migración bajo tratamiento con 100 y 200 ng/ml de hNC-1 (a). El efecto de hNC-1 en la inhibición de la migración de células endoteliales muestra una curva en forma de U (b). Para la comparación se utilizaron monómero de endostatina , dímera y NC-1 (c).
Figura 4: Inmunoprecipitación de Sueros y Plaquetas humanas seguida de análisis Western.
(A) M1 y M2 se refieren a la endostatina recombinante (187 aminoácidos) y NC-1, respectivamente. 1) suero preinmune y humano. 2) anticuerpo contra la endostatina y suero humano. (B) M contiene marcadores de hNC1 y endostatina. Los carriles 1 y 2 son los mismos que en (A). Los carriles 3 (suero preinmune) y 4 (anticuerpo antiendostatina) corresponden al suero de un individuo no representado en (A). (C) Purificación por afinidad de suero humano obtenido de una muestra de PRP diferente a la empleada en (A) seguida de análisis Western sin paso IP (D) Inmunoprecipitación de plaquetas humanas. Los marcadores hNC-1 y endostatina están en el carril M. 1) suero preinmune y lisado de plaquetas. 2) anticuerpo anti-endostatina y lisado de plaquetas. Las IP se llevaron a cabo en presencia de proteína A. Tras someter las muestras a PAGE y transferencia, las membranas se trataron con el anticuerpo monoclonal anti-endostatina PDM.
Figura 5: Tratamiento de ratones portadores de células cancerosas de melanoma humano (A2058) con hNC-1.
4-6 ratones lampiños portadores de tumores en cada grupo fueron tratados por vía subcutánea (s.c.) con hNC-1 (100 μg/ratón una vez al día), endostatina de grado clínico (100 y 500 μg/ratón una vez al día) o PBS. El tratamiento se interrumpió antes del desarrollo de necrosis. Los puntos de inyección estaban alejados de los tumores. Se muestran los tamaños de los tumores y la proporción de tratados/control (T/C). El grupo tratado con hNC-1 muestra un 67% de inhibición del crecimiento tumoral al final del experimento, mientras que el grupo tratado con endostatina sólo muestra un 48% de inhibición.
Figura 6: Modelo esquemático de las interacciones entre fibronectina, integrina a5pi, VEGF-A y hNC-1.
Figura 7: Gel SDS de una proteína de fusión Fc-NC-1 murina en función de la cantidad de plásmido utilizado en la transfección de células renales 293 en condiciones reducidas y no reducidas.
En condiciones reducidas, el producto es una cadena única formada por Fc y NC-1. En condiciones no reducidas, el producto es un dímero porque Fc está unido por disulfuro. La banda única en el centro del gel se debe al marcador endostatina, que tiene un peso molecular de 20 Kd.
Figura 8: Generación de tumores resistentes de cáncer de pulmón de Lewis in vivo tras la exposición prolongada a Fc-angiostatina y Fc-endostatina de ratón.
La dimerización de los dominios de endostatina NC-1 se consiguió utilizando IgG-Fc. Tras una fuerte inhibición inicial del crecimiento tumoral (p1), los tumores se expusieron durante un periodo prolongado a la terapia antiangiogénica con Fc-endostatina (hasta cuatro pases consecutivos, p1-4) reimplantando los tumores en nuevos animales una vez que alcanzaron un tamaño tumoral > 1000-1500 mm3 Se realizó un pasaje tumoral secuencial in vivo para lograr una exposición prolongada y continua a la terapia antiangiogénica con el fin de enriquecer la población de células tumorales resistentes. Los tumores P4, panel inferior, crecían incluso más rápido que los tumores p4 de control no tratados a pesar de la exposición continuada al fragmento NC-1 oligomérico (Fc-endostatina). Estos datos muestran claramente que los tumores podrían desarrollar resistencia farmacológica adquirida a los fragmentos oligoméricos de NC-1.
Figura 9: Perfil de expresión de todo el genoma de fragmentos oligoméricos-NC-1 (mFc-Endostatina) resistentes a tumores de cáncer de pulmón de Lewis (LLC).
El perfil de expresión reveló que la fibronectina (FN1) está marcadamente regulada a la baja en los tumores murinos resistentes a (m)Fc-Endostatina (FcEndo) (mapa de calor, recuadro verde). La regulación de los genes candidatos se confirmó mediante q-RT-PCR y se presentan los índices de expresión Fold en relación con los tumores de control p4 (diagramas). Este hallazgo apoya los datos del inventor que demuestran que los efectos antiangiogénicos de los fragmentos NC-1 oligoméricos se ejercen a través de la unión a FN1. Por lo tanto, la subregulación de FN1 en los tumores los hace resistentes al NC-1 oligomérico. Además, los inventores identificaron varias vías clave, como IGF1R y CCL2, que están sobrerreguladas en los tumores resistentes a la Fc-endostatina (recuadro rojo). Por lo tanto, la subregulación del socio de unión clave y la sobrerregulación compensatoria de vías angiogénicas alternativas constituyen un mecanismo coordinado por el que los tumores pueden evadir el tratamiento con fragmentos oligoméricos de NC-1. Por lo tanto, el nivel de FN1 así como la regulación IGF1R/CCL2 podrían ser decisivos para predecir la respuesta tumoral a terapias contra el cáncer consistentes en fragmentos oligoméricos de NC-1.
Figura 10: Esquema de los motivos críticos en el dominio de la endostatina (ED) y la fibronectina (FN).
El dominio de unión a la integrina dentro del FN consta de dos motivos, el motivo RGD y el motivo PHSRN. De forma análoga a NC1-ED, existen sitios de unión a heparina como Hep II que median la unión a otros factores de unión a heparina como VEGF. El motivo aminoterminal de unión al Zinc de NC1-ED contiene dos histidinas críticas (H) que una vez mutadas con alanina (A) anulan su actividad; adaptado de Tjin Tham Sjin et al. Cancer Res 2005, 65, 3656-63 y Wijelath et al. 2006, Circ. Res. Biol., 99, 853-860).
Figura 11: La superstatina inhibe potentemente el crecimiento tumoral.
Se implantaron tumores LLC de tipo salvaje (10.000 células) s.c. en ratones C57B16. Los tumores se trataron de forma simulada (PBS, control), con el péptido FN-mimético de referencia ("FN-Motif') que contenía únicamente la secuencia "LYAVTGRGDSPa Ss K" (SEQ ID NO: 8) o con Superstatina murina (s Eq ID NO: 7) a la dosis de 50 |jg de péptido en 100 j l de PBS cada 12h s.c. (n: 5 en cada grupo). El tratamiento se inició 4 días después de la implantación del tumor ("ensayo de prevención") y continuó durante 24 días. Cabe destacar que, durante el periodo de tratamiento, sólo creció un tumor en el grupo de Superstatina. Dos tumores adicionales aparecieron sólo tras el cese de la terapia con Superstatina, lo que indica que estos tumores difíciles de tratar fueron controlados por esta terapia. En el análisis de Kaplan-Meier, el tamaño del tumor que alcanzó los 1.000 mm2 se consideró un caso de muerte. La superstatina prolongó significativamente la supervivencia (p<0,03 mediante la prueba de rangos logarítmicos) en comparación con el control. En cambio, el FN-Motif solo (SEQ ID NO: 8) no mostraron ninguna mejora significativa en la prevención del crecimiento tumoral.
Figura 12: La eliminación de la fibronectina (FN) hace que los tumores sean resistentes a los sustratos NC1 oligoméricos, como ocurre con el dímero ED (Fc-Endostatina).
En cambio, el péptido Superstatina (SEQ ID NO: 7) ejerce una potente inhibición del crecimiento tumoral en tumores FN -/- LLC que crecen s.c. en ratones C57B16.
Figura 13: El tratamiento secuencial con inhibidores de IGF1R es eficaz en el tratamiento de tumores de LLC murinos resistentes a Fc-Endostatina (muFcEndo).
Se inyectaron por vía subcutánea a ratones C57B16 células LLC resistentes a Fc-Endostatina (Endo P4, como se describe en los ejemplos siguientes) de pasaje cuatro generadas previamente. En el pasaje 5, los tumores crecieron más rápidamente si se mantenía la presión de selección de la endostatina en comparación con los tumores tratados de forma simulada (Ctrl.). La inhibición secuencial de la señalización IGF1R (20mg/kg de picropodofilina ciclolignana, PPP, inyección IP) inhibió el crecimiento tumoral. Sin embargo, la administración simultánea sólo invirtió parcialmente la cinética de crecimiento mejorada inducida por la presión de selección mFc-Endo.
Figura 14: Expresión diferencial de proteínas en células tumorales LLC resistentes al paso 5 (P5) de Fc-Endostatina-(Endo). El análisis de proteínas mediante transferencia Western confirmó además una mayor expresión y fosforilación de IGFIR (p-IGF1R), una regulación a la baja de la fibronectina y una sobrerregulación de CCL2 como función de la terapia con Fc-Endostatina murina (Endo) en tumores LLC de pasaje 5. El tratamiento secuencial con un inhibidor de IGF1R revirtió parcialmente este fenotipo.
Ejemplos
La invención se ilustrará a continuación mediante ejemplos
Ejemplo 1: Materiales y procedimientos
1.1 Líneas celulares y cultivo celular. Las líneas celulares tumorales humanas A2058 (melanoma) y la línea celular de cáncer de páncreas humano ASPC-1 se cultivaron en DMEM con L-glutamina y suplementadas con un 10 % de FCS y antibióticos. Las HUVEC (Lonza, Suiza) se mantuvieron en medios de crecimiento endotelial EBM y EGM Bullet Kit (Lonza, Suiza) con antibióticos.
1.2 Expresión y purificación. La construcción, expresión y purificación de la Fc-endostatina humana (hFcendostatina), el dímero artificial de endostatina y NC-1 se han descrito previamente (Bergers et al., 1999, Science 284, 808, Loetal. 1998, Protein Eng 11,495; Kuoetal. 2001, J Cell Biol 152, 1233; Wen etal. 1999, CancerRes 59, 1233). Los constructos recombinantes se prepararon colocando los dominios Fc en el N-terminal de la endostatina. Se produjeron líneas celulares estables de estos constructos en células de mieloma murino NS/0. Las proteínas se expresaron y secretaron en el medio. Para la purificación de las proteínas recombinantes se utilizó proteína A (pureza mínima del 90 %). Se han obtenido aproximadamente 50 mg/litro de Fc-endostatina empleando fermentadores de 10­ 18 litros de capacidad. La preparación del colágeno 18 humano NC-1 se describió anteriormente (Wen et al., loc. cit.). La proteína se expresó y secretó en el medio y se purificó en Ni-Agarosa (Invitrogen).
1.3 Ensayos de unión por Resonancia de Plasmón Superficial (SPR). Este análisis proporciona un procedimiento único para medir las constantes de equilibrio entre dos socios de unión. Es capaz de evaluar la cinética de una interacción registrando las tasas de formación de complejos (ka) y de disociación (kd), seguido del empleo de un software que determina los valores de estos dos parámetros. La constante de equilibrio (KD) se obtiene calculando la relación kd/ka. El VEGF humano (I+D), la endostatina, el dímero de endostatina y el NC-1 humano (hNC-1) se diluyeron a 50 μg/ml en acetato sódico 10 mM, pH 5,5 y se inmovilizaron en chip(s) sensor CM4 de la serie S mediante un procedimiento estándar de acoplamiento de aminas N-etil-N'-(dimetil-aminopropil)carbodiimida/ N-hidroxisuccinimida (EDC/NHS). Las superficies de control se prepararon de forma similar sin derivación proteica y se utilizaron como superficie de referencia para los experimentos de unión de compuestos.
Las mediciones de unión se realizaron utilizando un instrumento Biacore™ T100 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) que emplea resonancia de plasmón superficial para detectar y monitorizar interacciones moleculares.
El análisis de los datos se llevó a cabo utilizando el software de evaluación Biacore T100 v 1.1.1. Los datos se prepararon por sustracción de los datos de la superficie de referencia y los datos de la muestra de tampón blanco, un procedimiento comúnmente denominado "doble referenciación", y se ajustaron a un modelo de unión langmuir 1:1.
1.4 Modelos animales y tumorales. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Hospital Infantil de Boston. Los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales. Se utilizaron ratones lampiño/lampiño machos (24-27 g) de ocho semanas de edad (Hospital General de Massachusetts, Boston, MA). Los ratones fueron aclimatados, enjaulados en grupos de cinco en una instalación de cuidado de barrera, y alimentados con comida para animales y agua ad libitum. Los animales fueron eutanasiados por inhalación de CO2 . Para los estudios con animales se utilizó la línea celular de melanoma humano A2058. Se inyectó una suspensión de 2*10® células tumorales en 0,1 ml de PBS por vía subcutánea (s.c.) en la dorsal de ratones en la línea media proximal. Los ratones se pesaron y los tumores se controlaron dos veces por semana en dos diámetros con calibradores digitales. Los volúmenes tumorales se determinaron utilizando a2 * b * 0,52 (donde a es el diámetro más corto y b el más largo). Se dejó que los tumores crecieran hasta alcanzar ~ 100 mm3 y se aleatorizaron los ratones. El tratamiento se realizó mediante inyecciones c.s. en bolo. Una vez finalizados los experimentos, se extirparon los tumores y los órganos y se fijaron en paraformaldehído al 4% o se congelaron instantáneamente. Se trataron de cuatro a seis ratones con cada grupo.
1.5 Inmunocitoquímica. Las HUVEC se sembraron y cultivaron en cubreobjetos. Las células se incubaron con 10 μg/ml de hFc-endostatina, hFc, hNC-1 o IgG de control durante 120 min a 37°C y luego se fijaron. Los portaobjetos se incubaron en el tampón de bloqueo (2% BSA PBS) durante 30 min. Para los grupos hFc-endostatina o hFc, los portaobjetos se incubaron con Alexa 488 antihuman IgG para la obtención de imágenes. Para los grupos hNC-1. o IgG, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo monoclonal de etiqueta anti-His de ratón y, a continuación, se sondaron con Alexa 488 anti-IgG de ratón. Para la tinción secundaria de todos los portaobjetos se utilizó el anticuerpo antifibronectina (I+D), que se sondeó con IgG anti-cabra Alexa 594 y se analizó mediante microscopía confocal. La contratinción con DAPI de los núcleos se muestra en azul.
1.6 Inmunohistoquímica. Las secciones tumorales se enjuagaron con PBS frío y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos antes de la tinción. La Fc-endostatina humana se detectó mediante IgG antihumana Alexa 488. Para la tinción se utilizaron anticuerpos contra el colágeno 18 (I+D), la fibronectina (I+D), la integrina a5 ( I+D) CD31 (BD Pharmingen, San Jose, CA) y el factor von Willebrand (Dako, Carpinteria, CA), a-SMA (Dako, Carpinteria, CA). Los anticuerpos primarios se detectaron mediante anticuerpos secundarios marcados con Alexa 488 o 594 (Molecular Probes, Eugene, OR). Las secciones se visualizaron mediante microscopía confocal (modelo DM IRE2; Leica).
1.7 Ensayo de migración de células endoteliales. Las HUVEC se lavaron con medio EBM sin suero dos veces, se resuspendieron a 5 *104 células/pocillo en 0,6 ml de medio y se sembraron en insertos de 24 pocillos (Coring, tamaño de poro de 8 μm) por duplicado. La cámara inferior se llenó con 0,6 ml de medio EBM sin suero que contenía 100 ng/ml de rhesus (rh)VEGF (I+D). Tras incubarlas durante 16 h a 37 °C, las células se fijaron con metanol y se tiñeron con eosina y hemotoxina. Las células de la cara superior de la membrana transwell se retiraron con un bastoncillo de algodón. Se contaron las células que migraban a la cara inferior de la membrana.
1.8 Análisis por citometría de flujo de la unión de Fc-endostatina humana (hFcES) a la superficie celular. Todas las operaciones se realizaron a 4 °C. Las HUVEC se tripsinizaron y resuspendieron en PBS (2% de BSA) durante 30 minutos, tras lo cual se incubaron durante 1 hora con 1 y 10 μg/ml de hFcES o hFc. Las células se centrifugaron y lavaron con PBS frío, y después se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con FITC (Sigma, St. Louis, MO) contra el fragmento Fc humano y se analizaron con el citómetro de flujo FACS Calibur de BD Biosciences.
1.9 Procedimientos estadísticos. Los datos se expresan como medias más o menos la DE. La significación estadística se evaluó mediante la prueba t de Student.
Ejemplo 2: Resultados
2.1 La Endostatina Dimérica y NC-1 se unen a la Fibronectina. Debido a los informes que demuestran la existencia de endostatina en las plaquetas, se ha procedido con un lisado de plaquetas para identificar las proteínas que se unen a la endostatina (Italiano et al. 2008, Blood 111, 1227). Una de las ventajas de la Fc-endostatina es que permite utilizar este constructo para la inmunoprecipitación (IP) sin introducir un anticuerpo adicional para formar un complejo. Se emplearon tres constructos proteínicos: Fc humano (control), Fc humano dimérico (h)-endostatina y hFc-VEGF. Los datos se muestran en la Fig. 1(A). Comparando los resultados de la IP para los tres reactivos mencionados, la principal diferencia entre los carriles de poliacrilamidegel teñidos con coomassie se encontraba en las proximidades de los 200 kDa. El análisis de espectros de masas de esta región llevó a la identificación de la fibronectina como proteína de unión candidata tanto para la endostatina como para el VEGF. Para confirmar la unión de la endostatina y el VEGF a la fibronectina, se realizó una prueba Elisa (Fig. 1B). El dímero de endostatina, el NC-1, el VEGF y la integrina a5p1 (un receptor natural de la fibronectina) se unieron a la fibronectina, mientras que el monómero de endostatina no lo hizo. El dímero artificial de endostatina se generó introduciendo una única mutación en la posición aminoacídica 7 de la endostatina (cambiando glutamina por cisteína) en la Fc-endostatina recombinante. Tras la digestión de esta proteína mutante por la enteroquinasa, se produce el dímero de endostatina, unido por un enlace disulfuro (Kuo et al., loc. cit.).
Para medir las constantes de unión en equilibrio de las proteínas mencionadas, se utilizó un sistema Biacore. Se obtuvieron constantes de afinidad elevadas para el dímero de endostatina, NC-1 y VEGF (Fig. 1C). No se detectó ninguna unión entre el monómero de endostatina y la fibronectina. En apoyo de estos datos, la unión del VEGF a la fibronectina ha sido descrita anteriormente por otros grupos (Wijelath et al. 2006, Circ Res 99, 853). La Fc-endostatina impone una estructura dimérica a las dos moléculas de endostatina en el C-terminal del dímero Fc. La constante de unión de la Fc-endostatina a la fibronectina es similar a la del dímero de endostatina (datos no mostrados).
2.2 Los estudios de inmunohistoquímica demuestran que la Endostatina dimérica se dirige a las células endoteliales a través de la fibronectina. Se utilizó el análisis de inmunofluorescencia (IF) para verificar la distribución sistémica de la hFc-endostatina en un modelo animal de xenoinjerto ASPC-1. Se detectó la distribución de endostatina oligomérica exógena, utilizando anticuerpos contra Fc, y se muestra en la Fig. 2A. Los resultados de las imágenes mostraron que la endostatina oligomérica inyectada se encontraba no sólo en el tumor, sino también en las células endoteliales del corazón y el riñón. Además de la tinción con CD31 (célula endotelial), se utilizó el marcador de pericitos a-SMA para confirmar la interacción de la endostatina con los vasos sanguíneos (Fig. 2B). Para examinar la unión de la endostatina a la fibronectina, se prepararon secciones tumorales tratadas con hFc-endostatina de modelos de xenoinjerto. La hFc-endostatina dimérica exógena (hFcES) muestra co-localización con la fibronección endógena (Fig. 2C). También se ha detectado la co-localización de colágeno 18 endógeno y fibronectina endógena (Fig. 2D). La integrina a5p1 es un receptor de la fibronectina (Hynes 1992, Cell 69, 11). Los datos de imagen mostraron que la hFcES también estaba co-localizada con la integrina a5p1 (Fig. 2E). Finalmente, detectamos co-localización de VWF, integrina a5p1 en secciones tumorales (Fig. 2F). Estos datos demuestran la estrecha proximidad de la hFcES dimérica, la fibronectina, la integrina a5p1 y los vasos sanguíneos. Además, se utilizaron secciones embrionarias ex vivo de cerebro de ratón E14,5 para confirmar este fenómeno. La fibronectina, el VEGF y el hFcES muestran un patrón de unión similar en el cerebro embrionario de ratón (Fig. 2G), lo que confirma que el VEGF es un componente de este ensamblaje.
2.3 Unión de hFc-endostatina oligomérica y hNC-1 a HUVECs. Se empleó la técnica de inmunofluorescencia para detectar la unión a la superficie celular endotelial de la endostatina oligomérica y la NC-1. La Fc-endostatina y la NC-1 mostraron una escasa unión a HUVECS cuando las células se cultivaron sólo durante 24 horas (datos no mostrados). Prolongando el tiempo de incubación a 72 horas se produjo una unión significativa, posiblemente, como consecuencia de la sobrerregulación de la fibronectina (Fig. 3A panel superior). Estos datos sugieren un papel crítico de la fibronectina como mediador de la unión de la endostatina dimérica a las células endoteliales. la imagen en 3D mostró las distribuciones de endostatina y fibronectina en las células endoteliales.
2.4 hNC-1 inhibe la migración de las células endoteliales. La migración de las células endoteliales es un paso importante en la formación de nuevos vasos sanguíneos y en la angiogénesis tumoral. Para evaluar el efecto de hNC-1 sobre la migración de células endoteliales, se ha utilizado rhVEGF para inducir la migración de HUVECs en un ensayo transwell. Se ha controlado y cuantificado la migración de las células. Las células que migraban a través de la membrana se teñían con la tinción azul-púrpura (Fig. 3B(a)) y se contaban. El hNC-1. inhibió la migración de células endoteliales inducida por VEGF en función de la concentración y el efecto de la dosis siguió una curva en forma de U (Fig. 3B(b)) (Lee et al., loc. cit.). NC-1 fue el agente antimigratorio más potente entre las diferentes moléculas de endostatina ensayadas (Fig. 3B(c)).
2.5 Ausencia de Endostatina en la circulación humana. La endostatina se aisló inicialmente a partir de los medios de cultivo de una línea celular tumoral de ratón (EOMA). La purificación de las proteínas implicó una serie de pasos. La identificación de su secuencia N-terminal dio como resultado una molécula de endostatina que comienza en la secuencia N-terminal "HTH". Tanto las endostatinas recombinantes de ratón como las humanas se construyeron sobre la base de esta secuencia N-terminal (O'Reilly et al. 1997, Cell 88, 277).
Se ha investigado el tamaño de la endostatina en el suero de varios individuos. Para ello, se obtuvo una bolsa de medio litro de PRP (plasma rico en plaquetas) recogido 4 días antes de 1-4 individuos. Tras una centrifugación a bajas RPM para eliminar las plaquetas, se aplicaron altas RPM para obtener el suero. El suero se pasó por Proteína A para eliminar las IgG. Acontinuación, se sometió a inmunoprecipitación mediante un anticuerpo policlonal de la endostatina, seguido de un análisis Western. Se utilizó un anticuerpo monoclonal dirigido a la endostatina para tratar la membrana (Fig. 4). Los marcadores proteínicos son NC-1 y endostatina. El tamaño de la proteína identificada se encuentra entre los dos marcadores con varias bandas de proteína presentes (Fig. 4A). Se aplicó un procedimiento idéntico al suero de otro individuo (Fig. 4B). Para confirmar estos datos, tras el paso de la proteína A, la purificación por afinidad de una muestra de PRP anterior (diferente de la bolsa de PRP referida) produjo moléculas de tamaño similar (Fig. 4C). Finalmente, la inmunoprecipitación de las plaquetas por el mismo anticuerpo policlonal mostró que la proteína identificada es una molécula de mayor tamaño que la endostatina (Fig. 4D).
Estos resultados llevaron a los inventores a reanalizar los datos anteriores con endostatina (O' Reilly et al., loc. cit.). Los medios en condiciones más tempranas empleados para el aislamiento de la endostatina se mantuvieron continuamente a 4 °C durante un largo periodo de tiempo (al menos un mes) antes del paso final de purificación. La presencia de suero fetal de ternera en el medio puede causar la degradación de NC-1. La confirmación de esta hipótesis fue establecida por otro grupo del laboratorio del inventor un año después, empleando la misma línea celular tumoral de ratón (Wen et al., loc. cit.). Al acortar la duración del aislamiento de proteínas y emplear un solo paso de purificación, se descubrió que las principales proteínas eran mNC-1 y endostatina (Wen et al., loc. cit.). Por consiguiente, la observación anterior de que una proteína del tamaño de la endostatina era el único producto tras la purificación por HPLC, apoya firmemente la hipótesis del inventor de que la NC-1 fue completamente digerida a una molécula del tamaño de la endostatina tras la incubación prolongada a 4 °C. Pruebas adicionales de esta hipótesis proceden de datos publicados por otro grupo de investigadores (Sasaki et al. 1998, EMBO J 17, 4249).
Lo más probable es que la primera endostatina de la que se informó fuera el resultado de una degradación que tuvo lugar en el laboratorio. NC-1 es el precursor de la endostatina. Los datos de los inventores sobre sueros humanos se basaron en los experimentos realizados días después de la recogida y purificación y los inventores no pudieron evitar la digestión de NC-1 a fragmentos más pequeños. Los inventores concluyen a partir de estos datos que, en contraste con la EOMA de ratón, la endostatina de 187 aminoácidos está ausente en el suero y las plaquetas humanas. Algunos de estos productos de degradación de NC-1 más grandes que la endostatina pueden corresponder a dímeros que son posibles candidatos a estar presentes en la circulación humana o resultados de la degradación de NC-1 tras la recolección. En consecuencia, los datos actuales sugieren claramente que la NC-1 es la molécula fisiológicamente más relevante en la circulación humana.
2.6 hNC-1 suprime el crecimiento tumoral in vivo. Para comparar las actividades antitumorales de NC-1 y endostatina, se emplearon ratones lampiños portadores de la línea celular de melanoma humano A2058. Los datos se muestran en la Fig. 5. Se utilizaron dos dosis de endostatina de grado clínico que diferían en 5 veces la concentración de proteína (dosis baja y alta). Una dosis baja correspondiente de NC-1 mostró una actividad antitumoral similar a la dosis alta de endostatina. Los resultados demuestran una mayor eficacia antitumoral de NC-1 en comparación con la endostatina. No se puede descartar la posibilidad de que la NC-1 inyectada se degrade al entrar en la circulación.
2.7 Generación y expresión de una proteína de fusión mFc-NC-1.
Un constructo de fusión Fc-NC-1 murina que comprende el dominio de trimerización no triple helicoidal (dominio de asociación), la región bisagra y el dominio de endostatina (que comprende el sitio de unión de zinc) del dominio NC-1 del colágeno 18 de ratón mostrado en la SEQ ID NO: 3 se ha generado y expresado en células renales 293. En esta constructo, el dominio Fc mostrado en la SEQ ID NO: 5 está situado en el N-terminal y el dominio NC-1 murino (mostrado en la SEQ ID NO: 3) en el C-terminal de dicha proteína de fusión. Además, entre el Fc y el NC-1 se ha interpuesto un enlazador que contiene un sitio de escisión de la enteroquinasa, con el fin de permitir la escisión del constructo de fusión. Es evidente para los expertos en la materia que un producto terapéutico correspondiente para administrar en pacientes no tendrá dicho sitio de escisión. La figura 7 muestra la imagen de un gel SDS de dicho constructo de fusión Fc-NC-1 murina en función de la cantidad de plásmido utilizado en la transfección de células renales 293 en condiciones reducidas y no reducidas. En condiciones reducidas, el producto es una cadena única formada por Fc y NC-1. En condiciones no reducidas, el producto es un dímero porque Fc está unido por disulfuro. El Fc dimérico sólo puede alojar dos cadenas de NC-1 por enlace covalente. Por lo tanto, se supone que la tercera cadena de NC-1 que está asociada de forma no covalente se disocia en presencia de SDS y, por lo tanto, se encuentra en la muestra de carga y en el propio gel. La banda única en el centro del gel se debe al marcador de endostatina, que tiene un peso molecular de 20 Kd. Posteriormente, se ensayará dicho constructo para comprobar la actividad antitumoral y la mayor vida media de esta proteína.
2.8 Resistencia farmacológica adquirida a los inhibidores endógenos de la angiogénesis: Endostatina
Se implantaron tumores de carcinoma pulmonar de Lewis murino (LLC) s.c. en ratones. Los tumores se trataron con un fragmento oligomérico-NC1 murino, mFc-endostatina, a las dosis indicadas. Los tumores de LLC se expusieron in vivo durante un periodo prolongado a la mFc-endostatina mediante el trasplante secuencial de tumores (hasta cuatro pasajes, p4) una vez que evadieron la terapia y alcanzaron un tamaño aproximado de 1000-2000 mm3. Los tumores de control también se trasplantaron secuencialmente a nuevos ratones sin tratamiento con mFc-endostatina. El volumen tumoral se midió con un calibre (Fig. 8). Después de cuatro pasajes, tanto los tumores resistentes a la mFcendostatina como los de control fueron extirpados, se aisló el ARN total y, tras un control de calidad, se hibridó en micromatrices de genoma completo para el análisis transcripcional. Los datos de micromatrices se analizaron utilizando el paquete de software SUMO. Se realizó una RT-PCR cuantitativa en tiempo real utilizando la tecnología Taqman para confirmar la expresión de los genes candidatos identificados mediante el análisis de micromatrices.
Como resultado, estos datos muestran que, en contraste con informes anteriores, los inventores fueron capaces de generar tumores resistentes a la mFc-endostatina que imita el efecto NC-1 descrito en otra parte del presente documento. Estos tumores se generaron por implantación y tratamiento secuencial de tumores, en cáncer de pulmón murino (LLC) y adenocarcinoma pancreático humano (BxPC3) hasta 4 pasajes. Los perfiles de expresión de todo el genoma revelaron una subregulación de la fibronectina que hacía a los tumores resistentes al tratamiento con mFcendostatina (Fig. 9). Esto concuerda con la observación del inventor de la unión selectiva de la mFc-endostatina oligomérica y la NC-1 oligomérica a la fibronectina. Por lo tanto, el análisis de los niveles de fibronectina puede utilizarse como marcador pronóstico de la respuesta al tratamiento del cáncer. Además, los inventores identificaron una serie de vías compensatorias que se activan y que hacen que los tumores sean resistentes al tratamiento con Fcendostatina; en particular, el tratamiento secuencial con inhibidores de IGF1R parece prometedor, según los datos preliminares obtenidos en animales, y CCL2 parece constituir otra diana candidata prometedora.
2.9 Novedosos péptidos híbridos "Superestatinas" con actividad antitumoral
En los ejemplos anteriores, los inventores hipotetizaron y proporcionaron pruebas de que el sustrato fisiológico del colágeno 18 en la circulación humana consiste en oligómeros del dominio de endostatina (ED) de la región no colagenosa NC-1 del colágeno 18. Además, confirmaron que el dímero ED sintético construido a partir de la fusión de la endostatina con la región Fc de la inmunoglobina humana (Fc-Endostatina) se une a la fibronectina (FN), mientras que el monómero no lo hace. Además, se confirmó la alta afinidad de la unión del FN al VEGF. En conjunto, los inventores propusieron que la NC-1 oligomérica puede provocar sus efectos a través de la unión al FN mediante la interferencia con al menos dos vías fundamentales de la angiogénesis, es decir, el VEGF y la señalización de la integrina alfa 5 beta 1 (ITGA5B 1). Además, descubrieron que el FN está significativamente subregulado en los tumores que se vuelven resistentes al NC-1 oligomérico (Fc-Endostatina) tras una exposición prolongada, es decir, cuatro pases seriados in vivo . Por lo tanto, postularon que la pérdida de FN podría constituir un mecanismo clave de resistencia inherente y adquirida a los sustratos NC-1 oligoméricos.
Los inventores siguieron dos estrategias para proporcionar una prueba definitiva de este concepto.
El primer enfoque consistió en diseñar una secuencia peptídica mínima que imitara los efectos clave del complejo ED-FN. Con este objetivo, los inventores seleccionaron el motivo más activo de todo el dominio ED, consistente en una región aminoácido-NH2-terminal de 27 aminoácidos que fue identificada originalmente por el Dr. Javaherian, uno de los actuales inventores (Tjin Tham Sjin et al. 2005, Cancer Res. 65, 3656-63). Los datos preliminares de los presentes inventores indican que esta región en sí puede ser capaz de unirse al VEGF y que las dos histidinas (dominio de unión al Zinc) en esta secuencia peptídica pueden ser críticas para la unión al VEGf. Esto es concebible, porque un péptido mutado en el que las histidinas se sustituyeron por residuos de alanina no pudo competir con la unión del dímero VEGF-ED (Fc-Endostatina). Por otra parte, la fibronectina contiene dos motivos activos que son críticos para su unión a ITGA5B1, es decir, un motivo dependiente de PHSRN y otro dependiente de RGD. La Figura 10 muestra una visión esquemática de los motivos críticos dentro del dominio ED y el f N.
Para imitar el complejo fisiológico de NC-1 oligomérico y FN que mediaba la señalización de integrina y otras propiedades del NC-1-ED, los inventores intentaron fusionar estos dos motivos críticos, es decir, el motivo más activo antes mencionado en el dominio NC-1-ED y el motivo de unión a integrina de la fibronectina que comprende "RGD" y aminoácidos circundantes, y generaron un péptido híbrido llamado Superstatina. Para cada secuencia peptídica, se diseñó un equivalente humano y de ratón, como se describe con más detalle en el Ejemplo 2.10.
A continuación, se presentan datos en un modelo murino de cáncer de pulmón singénico (LLC) utilizando la secuencia murina de Superstatina:
SEQ ID NO: 7) NC1-ED Motivo- FN-motivo híbrido
Para probar que los efectos no están mediados por el FN-Motif per se, se empleó un péptido de referencia que carecía del motivo mimético NC1-ED, es decir, que consistía únicamente en el FN-Motif:
SEQ ID NO: 8.-
Constructos adicionales que contienen el PHSRN en lugar del motivo RGD del FN, así como constructos que facilitan la dimerización del péptido Superstatina a través de enlaces disulfuro o regiones Fc están actualmente en preparación o ya en evaluación in vivo; véase el Ejemplo 2.10.
Utilizando el modelo de cáncer de pulmón murino protipico LLC (C57BL6), los inventores pudieron demostrar la eficacia del péptido murino Superstatina para inhibir potentemente el crecimiento tumoral.
Como se muestra en la Figura 11, se implantaron tumores LLC de tipo salvaje (10.000 células) s.c. en ratones C57B16. Los tumores se trataron de forma simulada (PBS), con el péptido FN-mimético de referencia que contenía únicamente la secuencia "LYAVTGRGDSPASSK" (SEQ ID n O: 8; motivo FN) o con Superstatina murino (Se Q ID NO: 7) a la dosis de 50 |jg de péptido en 100 j l de PBS cada 12h s.c. (n: 5 en cada grupo). El tratamiento se inició 4 días después de la implantación del tumor ("ensayo de prevención") y continuó durante 24 días. Cabe destacar que, durante el periodo de tratamiento, sólo creció un tumor en el grupo de Superstatina. Dos tumores adicionales aparecieron sólo tras el cese de la terapia con Superstatina, lo que indica que estos tumores difíciles de tratar fueron controlados por esta terapia. En el análisis de Kaplan-Meier, el tamaño del tumor que alcanzó los 1.000 mm2 se consideró un caso de muerte. La superstatina prolongó significativamente la supervivencia (p<0,03 mediante la prueba de rangos logarítmicos) en comparación con el control. En cambio, el FN-Motivo solo (SEQ ID NO: 8) no mostraron ninguna mejora significativa en la prevención del crecimiento tumoral.
Una vez que la eficacia del péptido Superstatina (SEQ ID NO: 7) se confirmó, los inventores pasaron a la segunda estrategia para validar el concepto propuesto de que la señalización del FN es crítica para que el NC-1 oligomérico ejerza sus efectos antiangiogénicos y antitumorales. Utilizando un constructo lentiviral de ARNhc contra la fibronectina murina, redujeron la regulación de FN en las LLC imitando el fenotipo natural de los tumores resistentes a Fc-Endostatina p4 generados previamente. Se implantaron células tumorales LLC FN -/-(100.000) en ratones C57B16 y se inició el tratamiento con Fc-Endostatina murina dimérica frente a Superstatina el día 4 tras la implantación. La supresión de FN hizo que los tumores de LLC fueran resistentes al NC-1 oligomérico (Fc-Endostatina). Además, en analogía con los datos comunicados originalmente sobre células tumorales LLC resistentes a p4 seleccionadas de forma natural, el tumor LLC FN-/- mostró una tendencia hacia un crecimiento más rápido, en comparación con el control. En cambio, el péptido Superstatina que contiene tanto el motivo ED como el motivo FN (SEQ ID NO: 7) inhibieron significativamente el crecimiento tumoral, en comparación con los tumores de control o tratados con Fc-Endostatina (p<0,01); véase la Fig. 12. Estos datos demuestran que la actividad de la Superstatina es independiente de la disponibilidad de FN en los tumores, eludiendo así el mecanismo de resistencia que hace que los tumores sean resistentes al NC-1 oligomérico.
Basándose en los hallazgos de los ejemplos anteriores, los inventores propusieron que la regulación compensatoria de las vías pro-tumorigénicas y pro-angiogénicas identificadas podría constituir un objetivo prometedor para eludir la resistencia tumoral adquirida a los agentes derivados de ED o NC-1 oligomérico. La inhibición de dos vías concretas, a saber, la señalización IGF1R y CCL2, se propuso como la más prometedora debido a la disponibilidad de agentes farmacológicos que ya se encuentran en fases avanzadas de ensayo clínico. Aquí, los inventores demuestran que la administración secuencial pero no concurrente de un inhibidor de IGF1R impedía el crecimiento de tumores resistentes a la Fc-Endostatina murina (NC-1-ED-Dimer); véase la Figura 13.
El análisis de proteínas por transferencia Western confirmó además el aumento de la expresión y fosforilación de IGF1R, la subregulación de Fibronectina y la sobrerregulación de CCL2 como función de la terapia con Fc-Endostatina murina (Endo) en tumores LLC de pasaje 5; ver Fig. 14. El tratamiento secuencial con un inhibidor de IGF1R revirtió parcialmente este fenotipo.
Ejemplo 2.10: Péptidos diseñados
Datos previos de los presentes inventores han demostrado que el motivo activo de NC-1-ED reside en el N-terminal de la proteína y puede ser imitado por un péptido de 25 aminoácidos. SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia murina correspondiente, mientras que la s Eq ID NO: 10 muestra la secuencia humana correspondiente. Además, en vista del hecho de que las coordenadas de unión al zinc del ED están mediadas por tres histidinas en este péptido, los inventores han demostrado previamente que la sustitución de las histidinas por alaninas daba lugar a un péptido que era inactivo en la inhibición del crecimiento tumoral, la angiogénesis y la permeabilidad de los vasos (Tjin Tham Sjin et al., Cancer Res. Biol., 65, 3656-63).
SEQ ID NO: 11 (murino) y SEQ ID NO: 12 (humano) muestran las secuencias del motivo "RGD" y los aminoácidos circundantes en la fibronectina importantes para la unión a la integrina alfa 5 beta 1. Además, se ha encontrado que el motivo "PHSRN" en el dominio de unión a integrina de la Fibronectina es crítico para la unión de la Fibronectina a ITGA5B 1 (integrina alfa 5 beta 1).
Basándose en los datos preliminares de los inventores de que la endostatina oligomérica (NC-1) se une a la Fibronectina, han generado una serie de péptidos que combinan motivos del mencionado péptido N-terminal de la endostatina con un dominio de la Fibronectina que contiene RGD: SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de Superstatina murina correspondiente, mientras que la SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de Superstatina humana correspondiente, es decir, las secuencias peptídicas híbridas de la presente divulgación.
Para examinar la importancia de la región de unión al Zinc de la endostatina en relación con las propiedades antitumorales del péptido híbrido, los inventores han modificado la Superstatina humana (SEQ ID NO: 13) sustituyendo las histidinas críticas de las posiciones 1 y 3 por alaninas (SEQ ID NO: 14.-Para comprobar la relevancia de las propiedades de dimerización de los péptidos híbridos para la actividad antitumoral, los inventores han empleado un procedimiento de dimerización de endostatina anteriormente descrito (Kuo et al., 2001, JCB 152, 1233-46). Sustituyendo la glutamina en la posición 7 de la secuencia de Superstatina humana (SEQ ID NO: 13) por cisteína, el péptido híbrido debería formar un dímero y se puede probar su actividad en ratones portadores de tumores (SEQ ID NO: 15.-Como control de la unión RGD de la fibronectina a la integrina, "RGD" en la secuencia de Superstatina humana (SEQ ID NO: 13) se ha cambiado por "RAD", en un nuevo péptido híbrido (SEQ ID NO: 16) para evaluar su actividad antitumoral, en comparación con el péptido de tipo salvaje.
Se presentan las versiones humanas de estos péptidos modificados (denotados por "h"). Las versiones de ratón son secuencias similares (denotadas por "m") y pueden derivarse basándose en la información de secuencia proporcionada aquí.
Actualmente se están diseñando péptidos de control adicionales más grandes que contienen 25 aminoácidos de regiones de unión a integrina de fibronectina (SEQ ID NO: 17) para su evaluación en estudios antitumorales.
Por último, el péptido Superstatina humano (SEQ ID NO: 13) se conjuga con el agente complejante ácido 1,4,7,10-tetraaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (también conocido como DOTA), lo que permite conjugar el péptido con, por ejemplo, radionucleidos como el galio (68Ga) para la obtención de imágenes no invasivas (tomografía por emisión de positrones, PET). Los inventores comprueban actualmente si la conjugación DOTA afecta a la eficacia del péptido Superstatina humano in vivo en un modelo de cáncer de páncreas humano BxPC3. En caso de que este experimento confirme la actividad de los constructos Superstatina-DOTA, se prevé la obtención de imágenes PET in vivo para evaluar el potencial de Superstatina-DOTA como agente de diagnóstico.
Las secuencias correspondientes de los péptidos arriba indicados se muestran en la siguiente Tabla 1:
Figure imgf000027_0001
(continuación)
Figure imgf000028_0001
3.- Discusión
En estos ejemplos, los inventores han presentado una fuerte evidencia de que el tamaño molecular de la endostatina reportado en la literatura es probablemente un producto de la degradación de la proteasa después de la recolección de medios de cultivo de células de ratón o suero humano. Las pruebas presentadas por Sasaki y colaboradores (loc. cit) parecen apoyar esta hipótesis. Su análisis de un suero humano tras dos pasos de purificación dio como resultado una serie de moléculas similares a la endostatina en cuanto a su tamaño. Las tres moléculas notificadas tenían aminoácidos adicionales en el N-terminal, lo que apunta a la ausencia de una molécula de endostatina que comience con la histidina notificada en el N-terminal. No se informó del análisis de la secuencia de aminoácidos de las bandas de mayor peso molecular. Además, la investigación de los autores sobre la distribución del colágeno 18 en diferentes órganos de ratones indicó la ausencia de moléculas del tamaño de la endostatina en diferentes extractos de tejidos (Sasaki et al., loc. cit.). La proteína identificada más destacada correspondió a NC-1.
Los inventores han identificado la fibronectina como proteína de unión para la endostatina oligomérica (Fc-endostatina y dímero de endostatina artificial) y no para el monómero de endostatina. Se ha demostrado anteriormente que NC-1 y el dímero de endostatina se unen a varias proteínas ECM, una propiedad que no comparte el monómero de endostatina (Sasaki et al., loc. cit.; Javaherian et al. 2002, J Biol Chem 277, 45211). Sin embargo, la fibronectina tiene propiedades distintas que la hacen única entre las proteínas ECM. Los péptidos angiostáticos utilizan la fibronectina plasmática para dirigirse a la vasculatura angiogénica (Yi et al. 2003, p Na S 100, 11435). La fibronectina contiene la secuencia de aminoácidos RGD que permite a la proteína unirse a una serie de integrinas. La integrina a5p1 es un receptor de la superficie celular que se une a la fibronectina. Esta integrina es un importante mediador de la angiogénesis (Hynes, loc. cit.).
La unión de la endostatina a dos integrinas avp3y a5p1 se notificó por primera vez en 2001 (Rehn et al. 2001, PNAS 98, 1024). Presumiblemente, dicha unión inhibe las interacciones de la fibronectina con estas integrinas. Posteriormente, otro grupo de investigadores presentó datos que indicaban que la endostatina sólo se une a a5p1 (Wickstrom et al. 2002, Cancer Res 62, 5580). La endostatina carece de la secuencia RGD. Por consiguiente, dicha unión debe estar mediada por otros aminoácidos de la endostatina. Los presentes inventores han intentado demostrar la unión directa de la endostatina a a5p1 empleando ensayos Elisa, de inmunoprecipitación y de adhesión celular sin éxito.
Los datos de los inventores apuntan a la importancia de la endostatina oligomérica y la NC-1 (Lee et al., loc. cit.). Partiendo del precursor NC-1 trímero, NC-1 se convierte en dímero tras una reducción de tamaño como resultado de la degradación. Por último, se forma el monómero de endostatina al reducirse aún más el tamaño. Los datos de los inventores apoyan la hipótesis de que el hNC-1 y posiblemente los dímeros de moléculas mayores que la endostatina están presentes en la circulación. La existencia de monómero del tamaño de la endostatina en circulación es cuestionable. Se ha demostrado anteriormente que la terminación fisiológica del proceso de angiogénesis por la endostatina está bien coordinada (Abdollahi et al. 2004, Mol Cell 13, 649).
Para incorporar los datos aquí presentados, los inventores sugieren un modelo en el que la fibronectina sirve de plantilla (Fig. 6). Tanto el VEGF como la NC-1 se unen a la fibronectina. La presencia de VEGF y NC-1 modula la actividad biológica a través de interacciones con la integrina a5p1. La interacción de una proteína proangiogénica (VEGF) y una proteína antiangiogénica (NC-1) puede ser crucial para regular la angiogénesis en la superficie de la célula.
La utilización por el inventor de la Fc-endostatina (un dímero) ha demostrado claramente que es muy superior a la endostatina ordinaria (monómero) (Lee et al., loc. cit.). Se requiere una dosis mucho menor de Fc-endostatina para lograr la misma reducción tumoral en comparación con la endostatina sola (50-100 veces). En el pasado, los inventores han atribuido esta diferencia a una semivida más larga asociada a cualquier molécula conjugada con Fc. Los datos actuales de los inventores sugieren que el estado dimérico de la endostatina en la Fc-endostatina también puede contribuir a mostrar una mejor eficacia. Por otra parte, tras la inyección de NC-1 en ratones, puede sufrir una rápida degradación y esto puede explicar la falta de un aumento drástico de sus efectos antitumorales, en comparación con la endostatina. En ese caso, un constructo de fusión de NC-1 unido a un dominio Fc de una inmunoglobulina puede resultar un reactivo mejorado para el tratamiento anticanceroso entre los distintos tipos de endostatina. Actualmente se están realizando experimentos de este tipo; véase el ejemplo 2.7.
En conjunto, estos datos indican que el FN es crítico para la acción antiangiogénica y antitumoral de los fragmentos de colágeno 18. La superstatina, un péptido híbrido que contiene el motivo crítico FN y el motivo ED, fue capaz de inhibir/prevenir potentemente el crecimiento tumoral y de invertir el fenotipo resistente conferido por la subregulación de la fibronectina específica del tumor. Alternativamente, el diseño racional de terapias combinadas y el desarrollo de esquemas de programación innovadores dirigidos a las vías compensatorias activadas en los tumores resistentes a la Fc-Endostatina podrían constituir una estrategia prometedora para eludir o revertir la resistencia tumoral inherente o adquirida.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un oligómero proteico que comprende al menos dos monómeros NC-1 de colágeno 18 humano para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad relacionada con la angiogénesis,
en el que el monómero NC-1 del colágeno 18 humano comprende un dominio de oligomerización, una región bisagra y un dominio de endostatina o fragmentos de dicho dominio de endostatina que comprenden el sitio de unión al zinc de la endostatina y, opcionalmente, un sitio de escisión de proteasa recombinante dentro de la región bisagra,
en el que el dominio de oligomerización comprende un dominio de trimerización no helicoidal triple del colágeno 18 humano y un dominio Fc de una inmunoglobulina o un dominio de trimerización no helicoidal triple del colágeno 18 humano y un dominio de oligomerización artificial que comprende una única mutación en la posición 7 del dominio de endostatina en la que la glutamina se sustituye por cisteína,
y en el que la enfermedad relacionada con la angiogénesis se selecciona del grupo que consiste en cáncer dependiente de la angiogénesis incluyendo tumores sólidos, melanomas, metástasis tumorales, tumores nacidos en la sangre como leucemias, tumores benignos como hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, granulomas piógenos; artritis reumatoide; psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares como retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasias retrolentales, rubeosis; Síndrome de Osler-Webber; angiogénesis miocárdica; neovascularización de placas; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; granulación de heridas; enfermedades de estimulación excesiva o anormal de las células endoteliales, como adherencias intestinales, aterosclerosis, esclerodermia, cicatrices hipertróficas (queloides); enfermedad por arañazo de gato (Rochele minalia quintosa) y úlceras (Helicobacter pylori).
2. El oligómero proteico para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad relacionada con la angiogénesis de la reivindicación 1, en el que el dominio Fc es de IgG.
3. El oligómero proteico para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad relacionada con la angiogénesis de la reivindicación 1, en el que el sitio de escisión de la proteasa recombinante dentro de la región bisagra es un sitio de escisión de enteroquinasa o trombina.
4. El oligómero proteico para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad relacionada con la angiogénesis de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la disposición de dominios dentro del monómero NC-1 del colágeno 18 humano es dominio de oligomerización - región bisagra - dominio de endostatina o dominio de endostatina - región bisagra - dominio de oligomerización.
5. Una proteína de fusión que comprende un monómero NC-1 de colágeno 18 humano y un dominio Fc de una inmunoglobulina, en la que el monómero NC-1 comprende un dominio de oligomerización, una región bisagra y un dominio de endostatina, o fragmentos de dicho dominio de endostatina, que comprende el sitio de unión a zinc de la endostatina, y, opcionalmente, un sitio de corte de proteasa recombinante dentro de la región bisagra, y en el que el dominio de oligomerización comprende un dominio de trimerización no helicoidal triple del colágeno 18 humano y/o un dominio de oligomerización artificial que comprende una única mutación en la posición 7 del dominio de endostatina en la que la glutamina se sustituye por cisteína.
6. La proteína de fusión de la reivindicación 5, en la que el dominio Fc es de IgG.
7. La proteína de fusión de la reivindicación 5, en la que el sitio de escisión de la proteasa recombinante dentro de la región bisagra es un sitio de escisión de enteroquinasa o trombina.
8. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que la disposición de dominios de la proteína de fusión es dominio Fc - dominio de oligomerización - región bisagra - dominio de endostatina o dominio de oligomerización - región bisagra - dominio de endostatina - dominio Fc o dominio Fc - dominio de endostatina - región bisagra - dominio de oligomerización o dominio de endostatina - región bisagra - dominio de oligomerización - dominio Fc.
9. Proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 para su uso como medicamento o composición diagnóstica.
10. Un kit que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.
11. Un procedimiento para predecir la respuesta de un paciente con cáncer a una terapia oncológica aplicada, que comprende los pasos de:
a) medir el nivel de fibronectina en una muestra del paciente utilizando el oligómero NC-1 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, y
b) predecir la respuesta de dicho paciente a dicha terapia contra el cáncer, en la que niveles bajos de fibronectina comparados con un nivel de referencia de un sujeto sano son indicativos de que el paciente no responde a la terapia contra el cáncer aplicada.
ES12753465T 2011-08-23 2012-08-23 Proteína que comprende NC-1 para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis Active ES2945008T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161526535P 2011-08-23 2011-08-23
EP11178509A EP2561888A1 (en) 2011-08-23 2011-08-23 Protein comprising NC-1 for treating angiogenesis-related diseases
PCT/EP2012/066467 WO2013026913A2 (en) 2011-08-23 2012-08-23 Means and methods for treating angiogenesis-related diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2945008T3 true ES2945008T3 (es) 2023-06-27

Family

ID=44534002

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12753465T Active ES2945008T3 (es) 2011-08-23 2012-08-23 Proteína que comprende NC-1 para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20140302026A1 (es)
EP (3) EP2561888A1 (es)
JP (1) JP2014529605A (es)
CN (1) CN104271151B (es)
AU (1) AU2012298430A1 (es)
ES (1) ES2945008T3 (es)
WO (1) WO2013026913A2 (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104789585B (zh) * 2015-04-15 2018-03-30 南通大学 一种在大肠杆菌中生产抗血管剂rt‑x的方法及其应用
AU2016326718B2 (en) 2015-09-23 2022-12-15 Minerva Biotechnologies Corporation Method of screening for agents for differentiating stem cells
CN109069591B (zh) * 2015-12-03 2023-06-20 海德堡生物技术有限公司 治疗和诊断纤维化或纤维化相关疾病的手段和方法
WO2017172853A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 Ab Biosciences, Inc. Recombinant intravenous immunoglobulin (rivig) compositions and methods for their production and use
CN112236448A (zh) * 2018-04-17 2021-01-15 海德堡生物技术有限公司 用包含NC-1-Fc的蛋白寡聚体治疗血管发生、纤维化和癌症相关疾病的手段和方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5124062B2 (ja) * 1997-01-21 2013-01-23 ザ・テキサス・エイ・アンド・エム・ユニバーシテイ・システム フィブロネクチン結合タンパク質組成物および使用法
DE69931908T2 (de) * 1998-04-15 2007-01-11 Lexigen Pharmaceuticals Corp., Lexington Steigerung der antikörper-zytokin-fusionsproteinmediierten immunantwort durch mitverabreichung mit einem angiogeneseinhibitor
EP1071469A2 (en) * 1998-04-17 2001-01-31 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with prostaglandin inhibitor
WO1999062944A2 (en) * 1998-06-03 1999-12-09 The Children's Medical Center Corporation Protein oligomer compositions comprising endostatin protein and methods of using the same
CN100422332C (zh) * 1998-08-25 2008-10-01 默克专利股份公司 表达以及分泌制管张素和endostatin的免疫融合物
US6825167B1 (en) * 2000-04-03 2004-11-30 Regents Of The University Of Minnesota Genetic modification of endostatin
US20040009920A1 (en) * 2000-12-04 2004-01-15 Erkki Ruoslahti Methods and compositions for inhibiting tumor growth and angiogenesis
EP1501868A1 (en) * 2002-05-08 2005-02-02 Apoxis S.A. Hexamers of receptors, members of the tnf receptor family, their use in therapy and pharmaceutical compositions comprising the same
US7524811B2 (en) * 2003-08-29 2009-04-28 Children's Medical Center Corporation Anti-angiogenic peptides from the N-terminus of endostatin
ES2325344B1 (es) * 2004-11-02 2010-06-09 Univ Madrid Autonoma Inhibidores de angiogenesis multifuncionales y multivalentes.
US7662945B2 (en) * 2005-02-01 2010-02-16 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Neostatins
US7625564B2 (en) * 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
US20080269135A1 (en) * 2007-04-16 2008-10-30 Retsky Michael W Method of treatment for early stage cancer
CN101143894A (zh) * 2007-06-22 2008-03-19 中国药科大学 高效抑制血管生成多肽及其物理化学修饰方法和应用
US20110038865A1 (en) * 2007-06-26 2011-02-17 University Of Miami Antibody- endostatin fusion protein and its variants
TWI476001B (zh) * 2011-12-26 2015-03-11 Ind Tech Res Inst 三倍體Ｆｃ融合蛋白及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN104271151B (zh) 2019-01-08
EP2747775A2 (en) 2014-07-02
WO2013026913A2 (en) 2013-02-28
JP2014529605A (ja) 2014-11-13
US20230341406A1 (en) 2023-10-26
EP4215206A1 (en) 2023-07-26
CN104271151A (zh) 2015-01-07
US20140302026A1 (en) 2014-10-09
WO2013026913A3 (en) 2013-04-18
EP2561888A1 (en) 2013-02-27
EP2747775B1 (en) 2023-03-22
AU2012298430A1 (en) 2014-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230341406A1 (en) Means and methods for treating angiogenesis-related diseases
AU2006272759B2 (en) Compositions and methods of treating disease with FGFR fusion proteins
US20190345228A1 (en) Targeted therapeutic agents comprising multivalent protein-biopolymer fusions
ES2884095T3 (es) Antagonistas de activina-actrii y usos para el tratamiento de trastornos óseos y otros trastornos
AU2007341631B2 (en) Neutralization of CD95 activity blocks invasion of glioblastoma cells in vivo
JP2008502738A (ja) ヒトの癌を処置するための、ｖｅｇｆインヒビターの使用
WO2018199318A1 (ja) 抗ｇｐｃ－１抗体
PT2352508E (pt) Péptidos do domínio citoplasmático muc1 como inibidores de cancro
EP2665752B1 (en) Compositions for regulating iron homeostasis and methods of using same
KR20120137482A (ko) 인테그린 αⅤβ8 중화 항체
US20230382975A1 (en) Means and methods for treating and diagnosing fibrosis or fibrosis-associated diseases
Khan et al. Identification of novel CD44v6-binding peptides that block CD44v6 and deliver a pro-apoptotic peptide to tumors to inhibit tumor growth and metastasis in mice
ES2345329T3 (es) Nueva isoforma del inhibidor del crecimiento celular endotelial vascular (vegi).
Chang et al. Pseudomonas exotoxin A-based immunotherapy targeting CCK2R-expressing colorectal malignancies: an in vitro and in vivo evaluation
US9963495B2 (en) Polypeptides targeting vascular endothelial growth factor receptor and prostate specific membrane antigen
Huang et al. Targeting the vasculature of colorectal carcinoma with a fused protein of (RGD) 3-tTF
CA3111216A1 (en) Peptide therapeutics for the treatment of cancer and uses thereof
ES2543890T3 (es) Antagonistas de activina-ActRII para su uso en el tratamiento de la anemia
JP2008528023A (ja) ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体由来の治療ペプチド