JP5124062B2 - フィブロネクチン結合タンパク質組成物および使用法 - Google Patents

フィブロネクチン結合タンパク質組成物および使用法 Download PDF

Info

Publication number
JP5124062B2
JP5124062B2 JP53338298A JP53338298A JP5124062B2 JP 5124062 B2 JP5124062 B2 JP 5124062B2 JP 53338298 A JP53338298 A JP 53338298A JP 53338298 A JP53338298 A JP 53338298A JP 5124062 B2 JP5124062 B2 JP 5124062B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
fibronectin
peptide
antibody
fibronectin binding
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP53338298A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2002513398A (ja
Inventor
ヘーク，マグナス
パツテイー，ジヨージフ・エム
ハウス−ポンペオ，カレン・エル
スペツイアーレ，ペトロ
ジヨー，ダニー
マツガビン，マーテイン・ジエイ
Original Assignee
ザ・テキサス・エイ・アンド・エム・ユニバーシテイ・システム
ユニバーシテイ・オブ・パビア
ユニバーシテイ・オブ・マニトバ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ザ・テキサス・エイ・アンド・エム・ユニバーシテイ・システム, ユニバーシテイ・オブ・パビア, ユニバーシテイ・オブ・マニトバ filed Critical ザ・テキサス・エイ・アンド・エム・ユニバーシテイ・システム
Publication of JP2002513398A publication Critical patent/JP2002513398A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5124062B2 publication Critical patent/JP5124062B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1275—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Streptococcus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/305—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • G01N2333/31—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/315—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

１．発明の背景
本出願は、同時係属中の１９９７年１月２１日付け出願の米国特許仮出願通し番号第６０／０３６，１３９号の優先権を主張するものであり、かかる仮出願は、その開示内容全体が放棄されることなく引用によりここに援用する。米国政府は、国立衛生研究所からの補助金ＡＩ２０６２４に関連して本発明に権利を有する。
１．１ 発明の分野
本発明は全般的に分子生物学の分野に関する。特に、ある実施形態は細菌種から誘導されるＤＮＡセグメントおよびタンパク質を含む方法と組成に関する。特に、本発明は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からのｆｎｂＡ核酸とＦｎＢＰＡアミノ酸組成物を提供する。また、部位特異的に修飾したあるいはトランケートしたフィブロネクチン（Ｆｎ）結合部位領域を含むペプチドエピトープおよびタンパク質配列、ならびにこれらのペプチドエピトープと結合部位領域で動物を免疫することから誘導される抗体も開示する。これらの抗体、ペプチドおよびＤＮＡセグメント、修飾されたリガンド結合部位領域をコードするペプチドと核酸セグメント、ならびに天然および合成タンパク質を作製し、使用するための様々な方法、たとえば診断プローブやタンパク質生成のためのテンプレートとしての抗体および／あるいはＤＮＡセグメントの使用、様々な薬理学的および免疫学的適用における抗体、タンパク質、融合タンパク質担体、ペプチドおよび核酸セグメントの使用などを開示する。
１．２ 関連技術の説明
１．２．１ ＭＳＣＲＡＭＭ
宿主組織への細菌の付着には、特異的微生物表面付着因子が関わっていて、ＭＳＣＲＡＭＭと称されるそのサブファミリーは細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分を特異的に認識する。多くの病原細菌が、宿主組織でのコロニー形成機序を表すと思われる相互作用において、細胞外マトリクスの種々の成分を特異的に認識し結合することが示されてきた。この付着はＭＳＣＲＡＭＭ（接着性マトリクス分子を認識する微生物表面成分）と称される細菌タンパク質群に関わっている（Ｐａｔｔｉら、１９９４年；Ｐａｔｔｉ及びＨｏｏｋ、１９９４年）。
いくつかのＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭが異なるグラム陽性細菌から分離され、特性付けられている。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓｉｇｎａｓら、１９８９年）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｔａｌａｙら、１９９４年；Ｈａｎｓｋｙら、１９９２年）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｌｉｎｄｇｒｅｎら、１９９３年）からのＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭをコードする遺伝子がクローニングされ、配列決定された。演繹したアミノ酸配列は、非常に類似した構造組織を有する６０−１００ｋＤａのタンパク質を明らかにした。Ｎ末端のシグナル配列のあとに長く伸びるユニーク配列が続き、これはある場合には約３０個のアミノ酸の長さのセグメントの２つのコピーによって中断されている。リガンド結合部位はプロリンに富む領域のちょうどＮ末端に位置し、これがタンパク質を細胞壁に固定すると考えられる。この領域のあとには、細胞壁標的シグナルである配列ＬＰＸＴＧＸ（配列番号：１）、膜貫通ユニットを示す一続きの疎水性残基、およびひとかたまりの正に荷電した残基を含む短いＣ末端細胞質内領域が続く。これらのＭＳＣＲＡＭＭ上の主要なＦｎ結合部位は、３−４回反復される３０−４２個のアミノ酸の長さのモチーフからなり、反復単位の大部分がコンセンサス配列を含む（Ｌｉｎｄｇｒｅｎら、１９９３年；ＭｃＧａｖｉｎら、１９９３年）。この領域は３回または４回繰り返される３７−４０個のアミノ酸の単位から成る（図１）。
種々のＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭからの反復領域に対応する組換えタンパク質はすべて、黄色ブドウ球菌、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓを含めた種々のグラム陽性菌へのＦｎの結合を阻害することができる（Ｊｏｈら、１９９４年）。さらに、個々の合成ペプチドを用いた試験は、多くの反復単位がＦｎ結合活性を保持しており、検討したすべてのグラム陽性種によるＦｎの結合を阻害することを明らかにした。これらのデータは、異なるＭＳＣＲＡＭＭについてのＦｎの結合部位がマトリクスタンパク質上で重複しているかあるいは近接して位置していることを示唆している。
反復領域は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において、ｒＦｎＢＤタンパク質のアフィニティ精製に使用される一続きのヒスチジン残基に組換えＦｎ結合領域（ｒＦｎＢＤ）が連結されている組換え融合タンパク質として過剰発現された。これらのタンパク質はそれぞれｒＦｎＢＤ−Ｄ、ｒＦｎＢＤ−Ａ、ｒＦｎＢＤ−Ｂ、およびｒＦｎＢＤ−Ｆと命名された（図１）。これらのｒＦｎＢＤは類似した結合動態と解離定数を示すことが認められた。たとえば、ブタＦｎに結合する４つの組換えタンパク質の解離定数がバイオセンサー分析によって測定されているが、低いｎＭ範囲にあって、主要な解離率は１×１０-4から６×１０-4／秒の範囲であった。さらに、組換えタンパク質は交叉的な種特異性を持ち、多くの異なる細菌細胞へのＦｎの結合を阻害することが示された（Ｊｏｈら、１９９４年）。
異なるＭＣＲＡＭＭのＦｎ結合領域の反復単位は著しく類似しており、コンセンサス配列を含むと思われる（ＭｃＧａｖｉｎら、１９９１年；Ｈｏｕｓｅ−Ｐｏｍｐｅｏら、１９９６年）。反復単位は高い数の酸性残基を有しており、いくつかの位置に保存された疎水性の酸性残基が存在する。全体として、特定のＭＳＣＲＡＭＭにおける反復単位間、ならびに異なる種からのＭＳＣＲＡＭＭ間には高度の配列類似性が存在する。反復単位に類似した合成ペプチドもＦｎに結合し、これらのペプチドにおけるアミノ酸置換により、すべての保存残基がＦｎ結合に必要なわけではないと判定された（ＭｃＧａｖｉｎら、１９９１年）。
Ｆｎは体液中に可溶性形態で、また細胞外マトリクス中では原線維形態で認められるジスルフィド結合の二量体糖タンパク質である。Ｆｎの主要な生物学的機能は、動物細胞の接着のための基質として働くその能力に関連すると思われる。この接着は、Ｆｎの中心部の特定の部位を認識し、これに結合する二量体受容体ファミリーによって媒介される。グラム陽性菌からのＭＳＣＲＡＭＭへのＦｎ中主要結合部位はＮＨ2末端領域（Ｎ２９）に位置していた（ＭｏｓｈｅｒとＰｒｏｃｔｏｒ、１９８０；Ｓｐｅｚｉａｌｅら、１９８４年）。この領域は約４５個のアミノ酸の長さの５つの１型モジュールから成る。Ｎ２９の構造は、配列中に規則正しい間隔を置いて位置するいくつかのジスルフィド結合によって安定化された一連のアンチパラレルβシートである（ＰｏｔｔｓおよびＣａｍｐｂｅｌｌ、１９９４年；Ｖｅｎｙａｍｉｎｏｖら、１９８３年）。Ｆｎに結合する能力はもっぱらそれぞれのＤモチーフのＣ末端の２０個のアミノ酸内に位置する（Ｈｕｆｆら、１９９４年；ＭｃＧａｖｉｎら、１９９３年；ＭｃＧａｖｉｎら、１９９１年）。これらのアミノ酸には、他のＦｎ結合付着因子の反復モチーフ内に存在する配列ＧＧ（Ｘ３，４）（Ｉ／Ｖ）ＤＦを含み、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ ＦｎＢＡのＦｎ結合Ａ２モチーフ内では、ＧＧあるいはＩＤＦ配列のいずれかに変化することによりＦｎ結合の消失が生じた（ＭｃＧａｖｉｎら、１９９３年）。
黄色ブドウ球菌のＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭは、Ｄｕと命名された約３０アミノ酸の長さのセグメントである追加リガンド結合部位を有しており、このＤｕはコンセンサス配列を含み、反復領域のＮ末端に位置する。このセグメントもＦｎおよびそのＮ末端領域（Ｎ２９と称される）と相互作用することができる（Ｊｏｎｓｓｏｎ、１９９２年）。
黄色ブドウ球菌は、Ｆｎ結合タンパク質ＦｎＢＰＡとＦｎＢＰＢをコードする２個の縦列ｆｎｂ遺伝子を有しており（Ｊｏｎｓｓｏｎら、１９９１年；Ｓｉｇｎａｓら、１９８９年）、そのそれぞれがＤ１、Ｄ２およびＤ３と称される３つの連続する３７個あるいは３８個のアミノ酸のＤモチーフを持つ。縦列として、これらのモチーフは高いアフィニティのＦｎ結合領域Ｄ１−３を含む。それぞれのモチーフを表す合成ペプチドは個々に低いアフィニティでＦｎ結合することができ、黄色ブドウ球菌へのＦｎ結合を競合的に阻害することができる（Ｈｕｆｆら、１９９４年；Ｓｉｇｎａｓら、１９８９年）。
１．２．２ Ｆｎ結合をブロックする抗体を作製する試みは失敗に終わった
これまでに同定されたすべてのＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭにおいて、主要なリガンド結合部位は３−５回反復される３７−４２個のアミノ酸モチーフから成る領域に位置していた（ＭｃＧａｖｉｎら、１９９３年）。残念ながら、合成ペプチドおよび種々の形態のＤ１−３免疫原を用いて阻止抗体を作製するという試みは大部分が不成功に終わっている（Ｃｉｂｏｒｏｗｓｋｉら、１９９２年；Ｒｏｚａｌｓｋａら、１９９４年；Ｓｐｅｚｉａｌｅら、１９９６年）。黄色ブドウ球菌のＦｎへの結合をブロックすることができるアフィニティの高い抗体を生成するというこれまでの試みはほとんど成功していない。たとえば、組換え形態の黄色ブドウ球菌 Ｆｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭ ｒＦｎＢＤ−ＤとＦｎ結合合成ペプチドＤ２の両方に対してウサギのポリクローナル抗体を作製したとき、これらの抗血清の力価と特異性は良好であり、両方の免疫血清から分離したＩｇＧはウエスタンブロット分析においてそれぞれの抗原を認識したにもかかわらず、免疫血清から分離したＩｇＧは黄色ブドウ球菌のＦｎへの結合を阻害しなかった。
興味深いことに、β−Ｄ−ガラクトシダーゼとＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭとの融合タンパク質で免疫したマウスから精製した抗体は、黄色ブドウ球菌の125Ｉ−Ｆｎへの結合をブロックしなかった（Ｃｉｂｏｒｏｗｓｋｉら、１９９２年）。しかし、あらかじめホルマリンで処理しておいたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭ融合タンパク質に対して惹起した抗体はある程度のブロッキング活性を有していた。これらの所見は、抗原のタンパク質構造の修飾が阻止抗体を生成する能力を決定する上で極めて重要な因子であったことを示唆している。
黄色ブドウ球菌のＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭは「誘発適合（ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｔ）」結合機序を通してＦｎと相互作用することは可能性がある。Ｆｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭによるＦｎ結合の「誘発適合」機序の概念を裏付けるデータが、最近、免疫学的手法（Ｓｐｅｚｉａｌｅら、１９９６年）と物理生化学的手法（Ｈｏｕｓｅ−Ｐｏｍｐｅｏら、１９９６年）の両方で得られた。
Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅのＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭ ＦｎＢＡを注入したマウスから分離したモノクローナル抗体３Ａ１０が最近同定され、特性付けられた。３Ａ１０についてのエピトープは、ＦｎＢＡ上の主要リガンド結合部位の反復領域のすぐ上流にある新たに同定されたＦｎ結合モチーフ（Ａｕと称される）に位置していた。３Ａ１０抗体は、ＦｎのＡｕへの結合を阻害するのではなくむしろ結合を増強した。この作用は２つの異なるアッセイ系で明らかにされた。まず最初に３Ａ１０は、Ａｕ含有タンパク質と合成ペプチドがＦｎへの結合に関して細菌細胞と競合する能力を上昇させた。第二に、３Ａ１０は、ビオチンで標識した形態のＡｕ含有タンパク質がブロット膜に固定したリガンドに結合するのを劇的に上昇させた。精製３Ａ１０ ＩｇＧはそれだけでは抗原を認識せず、抗体とエピトープ間の免疫学的相互作用のためにはＦｎが必要であった。ウエスタンブロット分析とＥＬＩＳＡ分析の両方でＦｎのこの誘発作用が示された。ＥＬＩＳＡ分析では、固定したＡｕ含有分子を種々の濃度のＦｎと共に３Ａ１０でプローブした。これらのデータとその後の生物物理学的試験は、ＦｎＢＡのリガンド結合部位がほとんどあるいは全く二次構造を持たないことを示唆している。しかしＦｎが存在するときには、リガンド誘発結合部位（ＬＩＢＳ）の発現をもたらす構造の再配列を受けると思われる。３Ａ１０はＦｎとＦｎＢＡ間の複合体形成によって生じるＬＩＢＳを特異的に認識することがデータで明らかにされた。
１．３ 先行技術の欠陥
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓや様々なブドウ球菌および連鎖球菌種を含めた多くの細菌種における抗生物質耐性の出現は人類にとって潜在的な脅威と考えられている（Ｂｅｇｌｅｙ、１９９４年）。特に心配されるのは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの多剤耐性である。今日、院内感染を引き起こす連鎖球菌株のほぼ半数がバンコマイシンを除くすべての抗生物質に耐性であり、バンコマイシンが無効となるのは時間の問題であると思われる（Ｂｅｇｌｅｙ、１９９４年）。感染を予防し、治療するという試みに新しい戦略を考慮しなければならないのはまさにこのシナリオにおいてである。ブドウ球菌や連鎖球菌によって引き起こされる感染の分子学的病因についての詳細な知識が、これらの戦略のデザインにおいて重要な基礎を提供するであろう。ＭＳＣＲＡＭＭが媒介する宿主組織への微生物付着は、大部分の感染の病原性過程における重要な第一ステップであると思われることから、新しい抗菌薬の開発における魅力的なターゲットである。
細菌性疾患の治療への様々なアプローチはある程度の成功を収めてきたが、抗生物質耐性、種間での抗原の変動性、また一部の種では抗原の突然変異を通しての抗原の変動性、さらには若齢小児や高齢者および他の免疫無防備状態の患者における非能率的な免疫系といった増大しつつある問題すべてが、克服する必要のある困難を提示していることは明白である。それ故、ヒトと動物の両方で様々な感染に使用することができる、連鎖球菌およびブドウ球菌病原体に対する有効な治療が、現在さしあたって必要とされている。
Ｂｕｒｎｈａｍとその協力者たちは、天然Ｄ１−Ｄ４エピトープタンパク質配列に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を惹起したことを報告したが（特許願第ＷＯ９４／１８３２７号）、これらのｍＡｂの生物学的活性あるいは阻害活性は示されなかった。
興味深いことに、β−ガラクトシダーゼのＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭ融合タンパク質で免疫したマウスから精製した抗体は、黄色ブドウ球菌の125Ｉ−Ｆｎへの結合をブロックしなかった（Ｃｉｂｏｒｏｗｓｋｉら、１９９２年）。しかし、あらかじめホルマリンで処理しておいたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭ融合タンパク質に対して惹起した抗体は、ある程度のブロッキング活性を有していた。これらの所見は、抗原のタンパク質構造の修飾が阻止抗体を生成する能力を決定する１つの因子であったことを示唆している。ホルマリン処理は、リシン残基においてシッフ塩基を誘発することによりタンパク質を不活性化する一般的な方法である。しかしその反応は可逆的であって、分子は潜在的に機能性を回復することができ、それ故、そのようなホルマリン処理の有益な作用を無効にしてしまうことがある。
これらの結果にはいくつかの考えられる理由がある。たとえば活性Ｆｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭを動物に注入したとき、細菌タンパク質が直ちにＦｎと複合体を形成すると仮定する。そのような複合体では、結合部位であるＭＳＣＲＡＭＭの表面はふさがっていて、免疫認識には使用できない。この論拠が正しければ、宿主の防御機序を避けるために微生物が使用する、これまで未知であった巧妙な戦略を示すことになるであろう。
天然Ｆｎ結合タンパク質に対する阻止抗体を作製することが不可能であるという事実は、細菌感染を予防することを目指した能動および受動免疫法においてそれを使用することをあらかじめ排除してきた。それ故、アフィニティの高い阻止抗体を生成する抗原の創造を導くであろう、Ｆｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭ中の部位特異的に修飾されたエピトープの作製は、感染性疾患の分野における重要な突破口であり、特にブドウ球菌および連鎖球菌疾患を治療する方法を革命的に変化させ、それによって細菌感染を治療するための抗生物質療法の必要性を回避することになるであろう。同様に、１つのＦｎＢＰからの多数のＦｎ結合エピトープを認識するｍＡｂ群を開発することは、モノクローナル抗体を使用してＦｎＢＰへのＦｎの結合を阻害する方法を容易にするであろう。ペプチドエピトープをコードするＤＮＡ配列を変化させる方法は、ペプチド配列に変更を組み込むための安定で再現可能な手段を提供し、従って現在のホルマリンによる天然タンパク質の変性に比べて大きな進歩となるであろう。ＥＣＭ成分と細菌細胞表面タンパク質との相互作用を阻害することによって宿主細胞への細菌付着を抑制する方法の開発は、そのような感染の治療にとって技術水準の著しい改善をもたらすであろう。
２．発明の要旨
本発明は、たとえば抗生物質以外の戦略を用いた細菌感染の治療と細菌付着の予防において使用するための新規組成物と方法を提供することにより、先行技術に固有のこれらおよびその他の１つ以上の欠点を克服する。本発明は、初めて、フィブロネクチン結合タンパク質へのフィブロネクチンの結合をブロックする抗体を提供する。これらの抗体は、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域からのエピトープに基づくものでありながら、フィブロネクチンには結合しないペプチドに対して誘発される。従って、動物に導入したとき、これらのペプチドエピトープはフィブロネクチンと複合体を形成しない。これによって複合体化されていないペプチドエピトープに対する抗体を作製することができ、かかる抗体はフィブロネクチンがフィブロネクチン結合タンパク質に結合するのを阻害あるいはブロックする。
フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチンへの結合を阻害あるいはブロックする抗体、ならびに選択した動物に免疫したときそのような抗体を生成するペプチド組成物を開示する。また、宿主細胞のＥＣＭ成分であるＦｎへの微生物結合の阻害を介した微生物感染の治療における新規ペプチドおよび抗体組成物の使用のための方法も開示する。また、選択したフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域からのペプチドエピトープを使用して例示される、連鎖球菌およびブドウ球菌病原体のような微生物病原体に対する能動および受動免疫のための方法も開示する。本発明の特定の局面は、これらのエピトープをコードする新規核酸セグメント、ならびに様々な診断および治療処方においてそのような核酸セグメントを使用するための方法に関する。
本発明は最初に、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合して、フィブロネクチン結合タンパク質がフィブロネクチンに結合するのを阻害する抗体を含む組成物を提供する。それ故、特定の実施形態においては、これらの抗体を阻止抗体と称する。本発明の好ましい局面では、当該抗体は、そのペプチドがフィブロネクチン結合領域の構成部分でないときにはフィブロネクチンに特異的に結合しない、フィブロネクチン結合領域のペプチドあるいはエピトープに結合する。すなわち、一部の好ましい局面では、ペプチド自体が孤立してフィブロネクチンに結合することはない。
特定の実施形態では、抗体は微生物のフィブロネクチン結合タンパク質、好ましくは連鎖球菌あるいはブドウ球菌のフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合する。他の好ましい局面では、抗体は連鎖球菌のＳｆｂ、ＦｎＢＡまたはＦｎＢＢ、あるいはブドウ球菌のＦｎＢＰＡまたはＦｎＢＰＢフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合する。さらに他の好ましい局面では、抗体はブドウ球菌のｆｎｂＡ遺伝子、特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのｆｎｂＡ遺伝子から発現されるフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合する。
フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチンへの結合を阻害するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を本文中で提供する。モノクローナル抗体９Ｃ３（ＡＴＣＣ ＨＢ ｘｘｘｘｘ）あるいは１１Ａ５（ＡＴＣＣ ＨＢ ｙｙｙｙｙ）自体を含めて、モノクローナル抗体９Ｃ３（ＡＴＣＣ ＨＢ ｘｘｘｘｘ）あるいは１１Ａ５（ＡＴＣＣ ＨＢ ｙｙｙｙｙ）と同じエピトープに結合する抗体が好ましい。
ある実施形態では、放射標識、蛍光標識、核磁気スピン共鳴標識、ビオチン、アビジン、あるいはアルカリホスファターゼ、水素ペルオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼ酵素を含むがこれらに限定されない、色素産生基質と接触して着色産物を生じる酵素などの、ただしこれらに限定されない、検出可能な標識に抗体を連結する。
本発明の一部の局面では、抗体組成物を製薬学的に許容しうる賦形剤あるいは媒質に分散させる。
本発明はさらに、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域の分離したペプチドを含む組成物を提供するが、かかるペプチドはフィブロネクチンには結合しない。かかる分離したペプチド組成物に関して本文中で使用するとき、「フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域」という用語は、分離したペプチドが、分離ペプチドとフィブロネクチン結合領域の両方に結合する抗体を生成することができる、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域の野生型配列の部分と十分に類似していることを意味すると理解される。分離ペプチドの配列が突然変異を生じているかまたは生じたことがある、あるいは分離ペプチドがフィブロネクチンに結合するのを妨げるほどに異なる分離ペプチドもこの説明に包含される。
従って、野生型あるいは天然に生じる変異体から分離したペプチド断片、ならびに野生型、天然に生じる変異体あるいフィブロネクチン結合タンパク質の天然に生じるフィブロネクチン結合領域に対応しない導入された突然変異に相当する合成あるいは組換えペプチドは本発明に包含される。好ましい局面では、分離ペプチドは、野生型フィブロネクチン結合領域からの対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも１つの第一突然変異を含む。さらに他の実施形態では、分離ペプチドは突然変異を含むように設計されている。「設計される」という用語には、たとえばペプチド合成あるいは部位特異的変異誘発を通してペプチドに導入される突然変異が含まれる。
分離ペプチドは、分離ペプチドとフィブロネクチン結合領域の両方に結合し、フィブロネクチン結合タンパク質がフィブロネクチンに結合するのをブロックする抗体を生成するのに十分な長さであることだけを必要とする。一部の局面では、少なくとも約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２２、約２４、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５あるいは約５０個の連続するアミノ酸を含むペプチドが好ましい。本発明の他の好ましい局面では、分離ペプチドはフィブロネクチン結合領域の野生型配列からの少なくとも約６個の連続アミノ酸を含む。より好ましい実施形態では、分離ペプチドは配列番号：６０あるいは配列番号：６１からの少なくとも約８個のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含む。さらに一層好ましい局面では、分離ペプチドは配列番号：６０あるいは配列番号：６１の連続アミノ酸配列を含む。
本発明の局面では、動物において免疫応答を生じさせるための分離ペプチド組成物を使用する。これらの局面では、組成物は好ましくはさらにアジュバントを含む。さらに、本発明のこれらの局面では、分離ペプチド組成物は好ましくは製薬学的に許容しうる賦形剤中に分散される。
本発明の特定の実施形態においては、単離されたペプチドを選択されたアミノ酸配列に作動可能に連結させる。したがって、本発明は、選択されたアミノ酸配列に作動可能に連結するフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域の第１ペプチドを少なくとも含む融合タンパク質を含み、この第１ペプチドはフィブロネクチンに特異的に結合することはない。好ましい局面において、この第１ペプチドは選択された担体アミノ酸配列に作動可能に連結し、この担体アミノ酸配列にはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が含まれるがそれらに限定されるものではない。
フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域のペプチドをコードする、単離された核酸セグメントを含む組成物であって、このペプチドがフィブロネクチンに特異的に結合することがない組成物がさらに提供される。
また、本発明は、製薬学的に許容しうる担体中に、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合し、かつフィブロネクチン、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域の単離されたペプチドへのフィブロネクチン結合タンパク質の結合を阻害する有効量の抗体を含む製薬組成物であって、このペプチドがフィブロネクチン、又はフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域のペプチドをコードする単離された核酸セグメントに特異的に結合することがなく、このペプチドがフィブロネクチンに特異的に結合することがない製薬組成物をも提供する。
本発明の組成物は免疫処方の調製において用いることが意図されている。したがって、本発明は、免疫処方の調製において本発明の組成物の使用を提供する。
また、本発明では、動物における感染を予防もしくは治療するための医薬の調製又はフィブロネクチンへの微生物の結合を阻害する処方の調製におけるここで提供される組成物の使用が意図されている。したがって、本発明は、感染を予防もしくは治療するための医薬の調製又はフィブロネクチンへの微生物の結合を阻害する処方の調製において本発明の組成物の使用を提供する。
本発明は、さらに、フィブロネクチンに結合するフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域のペプチドを同定する方法であって、候補ペプチドをフィブロネクチンと、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域へのフィブロネクチンの結合を可能とするのに有効な条件下で接触させ、かつフィブロネクチンに結合しない陽性候補ペプチドを同定することを包含する方法を提供する。
フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合し、かつフィブロネクチンへのフィブロネクチン結合タンパク質の結合を阻害する抗体を産生する方法であって、免疫学的に有効な量の、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域の単離されたペプチドを含み、このペプチドがフィブロネクチンに特異的に結合することがない製薬組成物を動物に投与することを包含する方法も提供される。
本発明の特定の局面においては、製薬組成物は、候補ペプチドをフィブロネクチンと有効結合条件下で接触させ、フィブロネクチンと結合しない陽性候補ペプチドを同定し、かつその陽性候補ペプチドを製薬学的に許容しうる希釈剤中に分散させることにより調製する。好ましい局面においては、複数の候補ペプチドをフィブロネクチンと有効結合条件下で接触させ、フィブロネクチンに結合しない１つ以上の陽性候補ペプチドを同定する。複数の候補ペプチドは複数のペプチドに突然変異を誘発することにより生成させることができ、これは選択されたペプチドの各残基をプロリン残基で置換することにより、又は、他の実施形態においては、フィブロネクチン結合タンパク質の本来の、もしくは天然のフィブロネクチン結合領域を、例えば選択されたプロテアーゼでそのフィブロネクチン結合領域を消化することにより、分割もしくは断片化することにより例示されるが、これらに限定されるものではない。このようにして同定された陽性候補ペプチドは、本発明の特定の局面においては、担体タンパク質に連結させ、及び／又はアジュバントと混合し、又は製薬学的に許容しうる媒体もしくは賦形剤中に分散させることができる。
さらに別の局面においては、この製薬組成物は免疫学的に有効な量の、配列番号６０又は配列番号６１のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。特定の好ましい実施形態においては、この製薬組成物は、微生物感染を患い、それを患っていることが疑われ、又はそれを発症する危険がある動物に投与するように設計される。
本発明は、さらに、サンプル中のフィブロネクチン結合タンパク質の検出方法であって、フィブロネクチン結合タンパク質を含むことが疑われるサンプルを、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合し、かつそのフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチンへの結合を阻害する抗体と、免疫複合体の形成を可能とするのに有効な条件下で接触させ、その結果形成される免疫複合体を検出することを包含する方法を提供する。
本発明の特定の実施形態においては、フィブロネクチン結合タンパク質は連鎖球菌又はブドウ球菌によって例示されるがこれらに限定されるものではない微生物によって発現され、そのサンプルはその微生物を含むことが疑われる。特定の好ましい局面においては、フィブロネクチン結合タンパク質は黄色ブドウ球菌によって発現される。微生物によって発現されるフィブロネクチン結合タンパク質は細胞表面に局在するため、好ましい局面においては、フィブロネクチン結合タンパク質は微生物細胞の表面上で検出される。
適切な容器手段内に、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合し、かつそのフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチンへの結合を阻害する抗体、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域の単離されたペプチドであってフィブロネクチンに特異的には結合しないペプチド、又はフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域のペプチドをコードする単離された核酸セグメントであって、そのペプチドがフィブロネクチンに特異的には結合しない核酸セグメントを具備するキットも提供される。
本発明の特定の実施形態においては、このキットは、適切な容器手段内に、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合し、かつそのフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチンへの結合を阻害する第１抗体を具備する。したがって、特定の局面において、本発明は免疫検出キットを提供する。特定の局面において、この免疫検出キットは免疫検出試薬、例えば、第１抗体に連結される検出可能な標識をさらに具備する。他の好ましい局面において、この免疫検出キットは第１抗体に結合する第２抗体をさらに具備する。
適切な容器手段内に、製薬学的に許容しうる処方中に含まれる治療上有効な量の抗体、単離されたペプチド又は単離された核酸セグメントを具備する治療キットも提供される。この治療キットの好ましい実施形態においては、抗体は連鎖球菌又はブドウ球菌のフィブロネクチンへの結合を阻害する。さらに別の好ましい局面においては、製薬学的に許容しうる処方は局所、非経口又は経口投与に適するものである。
本発明は、さらに、動物における微生物感染を予防又は治療する方法であって、この動物に治療上有効な量の製薬組成物を投与することを包含し、この製薬組成物がフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合し、かつそのフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチンへの結合を阻害する抗体、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域の単離されたペプチドであってフィブロネクチンに特異的に結合しないペプチド、又はフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域のペプチドをコードする単離された核酸セグメントであって、そのペプチドがフィブロネクチンに特異的に結合しない核酸セグメントを含み、この製薬組成物が動物における微生物感染を予防又は阻害する方法を提供する。ここで用いられる場合、“治療上有効な量”という用語は、動物のフィブロネクチンへの微生物のフィブロネクチン結合タンパク質の結合を阻害するのに有効な量として理解される。本発明の好ましい局面においては、この方法は、動物又はヒト被験体における連鎖球菌又はブドウ球菌の感染又はコロニー化を予防し、阻害し、又は治療する。
【図面の簡単な説明】
これらの図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。これらの図面の１つ以上をここに示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することにより、本発明をよりよく理解することができる。
図１．黄色ブドウ球菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ及び化膿連鎖球菌に由来するＦｎ受容体の領域構成。Ｆｎ結合反復はＡ、Ｂ、Ｄ及びＰで表される。Ｓ、シグナル配列；Ｕ、Ｆｎ受容体に独自の配列；Ｗ、細胞壁スパンニング領域；Ｍ、膜スパンニング領域；Ｃ、細胞内配列。組換えタンパク質はｒＦＮＢＤ−Ｄ、ｒＦＮＢＤ−Ａ、ＰＡＱ８、ｒＦＮＢＤ−Ｂ及びｒＦＮＢＤ−Ｐで示される領域に対応する。Ａｕ及びＤＵ領域は本発明者らによって同定された新規リガンド結合部位を表す。
図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃ．野生型及び突然変異体Ｄ３ペプチド１ないし２１（表３）による、固定化されたフィブロネクチンへの黄色ブドウ球菌の結合の阻害。ＮＰは阻害剤が存在しない状態での付着細菌の量を示す。図２Ａ．５μｇ／ウェルで試験したペプチド。図２Ｂ．５０μｇ／ウェルで試験したペプチド。図２Ｃ．２５０μｇ／ウェルで試験したペプチド。
図３Ａ及び図３Ｂ．図３Ａ．野生型ペプチドＤ１及びＤ２並びに突然変異体誘導体による、固定化されたフィブロネクチンへの黄色ブドウ球菌の結合の阻害。ＮＰは阻害剤が存在しない状態での付着細菌の量を示す。全てのペプチドは１０μｇ／ウェルで試験した。図３Ｂ．野生型ペプチドＤ１、Ｄ２及びＤＵ並びに変異体誘導体による、固定化されたフィブロネクチンへの黄色ブドウ球菌の阻害。ＮＰは阻害剤が存在しない状態での付着細菌の量を示す。全てのペプチドは２５０μｇ／ウェルで試験した。
図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃ．図４Ａ．黄色ブドウ球菌ＦｎＢＰＡのセグメントを含むグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質。図４Ｂ．抗Ｄ３ｐｅｐ抗体のエピトープの局在化。図４Ｃ．抗Ｆｎ−ｐｅｐｓ抗体のエピトープの局在化。
図５Ａ及び図５Ｂ．抗Ｄ３ｐｅｐ（□）及び抗Ｆｎ−ｐｅｐｓ（■）の阻害活性対前免疫ＩｇＧ（○）の阻害活性。図５Ａ．固定化されたＦｎへのＧＳＴ−Ｄ３の結合が示される。図５Ｂ．ＦｎへのＧＳＴ−Ｄ１２３（ＧＳＴＤ１−３）の結合が示される。
図６．Ｄ１−３（●）又はＧＳＴＤ１−３（■）で免疫することにより得られたアフィニティ精製抗体の力価。マイクロタイタープレートを１μｇ／ｍｌのＤ１−３でコートし、指示される濃度のアフィニティ精製抗体と共にインキュベートした。
図７．前免疫抗体（□）、又はＧＳＴＤ１−３（■）もしくはＤ１−３（●）で免疫することにより得られたアフィニティ精製抗体による、黄色ブドウ球菌Ｌ８５７細胞への125Ｉ−Ｆｎの結合の阻害。結果は、抗体が添加されていない状態で結合した125Ｉ−Ｆｎのパーセンテージとして表される。各点は２回の測定の平均を表す。
図８Ａ及び図８Ｂ．Ｄ１−３（図８Ａ）又はＧＳＴＤ１−３（図８Ｂ）で免疫することにより得られたアフィニティ精製抗体のエピトープマッピング。ペプチド配列は表９に、Ｄ１のＮ−末端から降順にＥＥＤＴＥＫＤＫＰＫ（ペプチド＃２４；配列番号：２）を最後にして記載されており、ここでＣ−末端はＤ２モチーフの残基１８を表す。表９におけるＤ１又はＤ２の命名は、１つ以上のアミノ酸にＤ１又はＤ２モチーフのいずれかが寄与するペプチドのスパンを示す。ビオチン化ペプチドをストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートのウェル内で捕捉し、５０ｎｇ／ｍｌアフィニティ精製抗体の１００μｌアリコートと共に６０分間インキュベートした。各々の値は３回の測定の平均を表す。
図９Ａ及び図９Ｂ．Ｄ１−３（図９Ａ）又はＧＳＴＤ１−３（図９Ｂ）を免疫源として用いて産生させたアフィニティ精製抗体による、Ｄ３モチーフ全体にわたるデカペプチドの認識。ペプチド配列は表１０に記載されている。陰付きのバーはＤ１モチーフの対照ペプチドＤ１13-20及びＤ１23-32に向かう応答を表す。このアッセイは上記図９について説明される通りに行った。
図１０．黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎ株から精製したＦｎＢＰへの結合に対する、可溶性Ｆｎ及び抗Ｄ１21-34（●）又は抗Ｄ３20-33（■）Ｆ（ａｂ’）2断片の間の競合。これらのＦ（ａｂ’）2断片は指示される濃度の可溶性Ｆｎを含む抗体バッファ中に１００μｇ／ｍｌに希釈し、５μｇ／ｍｌのＦｎＢＰでコートしたＣｏｒｎｉｎｇマイクロタイタープレートのウェルに添加した。二次抗体はＦ（ａｂ’）2特異的ヤギ抗ウサギＩｇＧのアルカリホスファターゼ結合Ｆ（ａｂ’）2断片であった。
図１１．抗Ｄ１21-34（●）又は抗Ｄ３２０−３３（■）Ｆ（ａｂ’）2断片による、黄色ブドウ球菌への125Ｉ−フィブロネクチンの結合の阻害。各点は３回の測定の平均を表し、破線はＦ（ａｂ’）2断片が添加されていない状態での結合の量を示す。前免疫Ｆ（ａｂ’）２はアッセイした濃度のいずれでもＦｎ結合を阻害しなかった。
図１２．１００μｇ／ｍｌの抗Ｄ１21-34（バー３）又はＤ３20-33（バー４）Ｆ（ａｂ’）2単独による阻害と比較した、１００μｇ／ｍｌ（バー１）及び２００μｇ／ｍｌ（バー２）の濃度の抗Ｄ１21-34及びＤ３20-33Ｆ（ａｂ’）2断片の混合物によるＦｎ結合の相加的又は相乗的阻害のアッセイ。バー５はＦ（ａｂ’）2断片を添加しない状態での結合を表し、各欄は３回の測定の平均を表す。
図１３Ａ、図１３Ｂ及び図１３Ｃ．抗ＬＩＢＳ抗体の単離。患者Ｉ．Ｚ．から得られたＩｇＧをＧＳＴ−Ｄｕ１２３４−セファロースにかけ、分画した。マイクロタイターウェル上に固定化されたＧＳＴ−Ｄｕ１２３４タンパク質（１００μｌ中１μｇ）を、Ｎ２９が存在しない状態（□）又は存在下（●）において、１００μｌの２０μｇ／ｍｌ非分画ＩｇＧ（図１３Ａ）、カラムの貫流物中に溶出した物質（図１３Ｂ）、又はアフィニティマトリクスに結合し、もしくはそこから溶出した抗体（図１３Ｃ）を用いてアッセイした。
図１４Ａ及び図１４Ｂ．ＦｎＢＰＡに対する抗体は黄色ブドウ球菌へのフィブロネクチンの結合を阻害しない。図１４Ａ．ＧＳＴ−Ｄｕ１２３４をマイクロタイターウェル上に固定化し（１μｇ／ウェル）、患者の血清に由来する２μｇの精製ＩｇＧの存在下において、８×１０4ｃｐｍの125Ｉ標識Ｎ２９で探索した。０．１％ツィーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で念入りに洗浄した後、プレートを２００μｌの２％ＳＤＳと共に３７℃で３０分間インキュベートし、ウェルに会合した放射能をγカウンターで定量した。図１４Ｂ．黄色ブドウ球菌Ｃｏｗａｎ１の細胞（１×１０8）を125Ｉ−Ｎ２９（５×１０4ｃｐｍ）と共に、患者の血清から単離した５０μｇのＩｇＧの存在下においてインキュベートした。抗体が存在しない状態での細菌の結合を１００に設定した。
図１５．黄色ブドウ球菌ｆｎｂＡがコードするタンパク質へのＦｎの125Ｉ−Ｎ２９断片の結合のｍＡｂ ９Ｃ３による阻害。ＣｏｒｎｉｎｇポリスチレンＥＬＩＳＡウェルストリップを１μｇ／ｍｌの組換えタンパク質Ｄ１−３（○）、Ｄ２−３（●）、ＧＳＴＤ３（△）又は１×１０8ＣＦＵの黄色ブドウ球菌細胞（▲）、次いで様々な濃度のｍＡｂ ９Ｃ３でコートした。次に、Ｆｎの125Ｉ−Ｎ２９断片（５０，０００ｃｐｍ）を添加し、結合した125Ｉ−Ｎ２９断片の量を定量した。結合した125Ｉ−Ｎ２９のパーセンテージを縦軸に示し、９Ｃ３ ｍＡｂの濃度を横軸に示す。
図１６．９Ｃ３及び１１Ａ５モノクローナル抗体の阻害活性。ＣｏｒｎｉｎｇポリスチレンＥＬＩＳＡウェルストリップを１μｇ／ｍｌの組換えタンパク質ＧＳＴＤ３、次いで様々な濃度のｍＡｂ ９Ｃ３（●）又はｍＡｂ １１Ａ５（○）でコートした。次に、Ｆｎの125Ｉ−Ｎ２９断片（５０，０００ｃｐｍ）を添加し、結合した125Ｉ−Ｎ２９断片の量を定量した。結合した125Ｉ−Ｎ２９のｃｐｍ（×１０3）を縦軸に示し、９Ｃ３及び１１Ａ５ ｍＡｂの濃度を横軸に示す。
４．好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、フィブロネクチン結合タンパク質へのフィブロネクチンの結合を遮断する抗体を初めて提供することにより、従来技術に固有の欠点を克服する。これらの抗体は、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に由来するエピトープをベースとしながらもフィブロネクチンに結合しないペプチドに対して生じる。このような阻止抗体を産生しようとする従来の試みは失敗に終わっている。本発明者らは、この失敗が、部分的には、動物体内に導入された際のフィブロネクチンとフィブロネクチン結合タンパク質及びそれらの断片との急速な複合体形成によるものであると結論付けた。したがって、本発明者らは、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域をベースとしながらもフィブロネクチンに結合しないペプチドエピトープがインビボでフィブロネクチンと複合体を形成しないものと結論付けた。これにより、複合体を形成しないペプチドエピトープに対して抗体を作製することが可能となり、この抗体はフィブロネクチン結合タンパク質に対するフィブロネクチンの結合を阻害又は遮断する。
本発明は、フィブロネクチンへのフィブロネクチン結合タンパク質の結合を阻害又は遮断する抗体を含む組成物及び方法、選択された動物に対して免疫化することによりそのような抗体を産生するペプチド、そのようなペプチドを同定するための方法、並びにそのようなペプチドをコードする核酸セグメントを提供する。本発明の組成物は広範な実施形態において有用であり、これらの実施形態には、宿主細胞のフィブロネクチンへの微生物の結合の阻害が介在する微生物感染の診断及び／又は治療、並びに選択されたフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に由来するペプチドエピトープを用いることで例示される、連鎖球菌及びブドウ球菌のような微生物病原体に対する能動及び受動免疫のための方法が含まれるがこれらに限定されるものではない。本発明の組成物には様々な診断用及び治療用キットが含まれる。
ここに記載される技術は、細菌の付着及び引き続く宿主組織でのコロニー化を特異的に妨げ、その結果感染を予防する方法及び組成物の開発に用いられる。開示される方法及び組成物は広範に適用可能であり、多くの状況において抗生物質治療の有効性を増加させる潜在能力を有し、かつ他の用途の幾つかにおいては抗生物質治療に置き換わる。この技術は、ＥＣＭ基質への細菌の付着の防止に基づく対費用効果の高い予防的治療方法を提供することにより、細菌病原体の通常の抗生物質治療に対する必要かつ望ましい代用法を体現する。
ＭＳＣＲＡＭＭ（細菌細胞表面上の）及びリガンド（宿主組織内）は錠前と鍵の様式で相互作用し、宿主に細菌を付着させる分子である。微生物の付着の完全な遮断は感染の防止に必須のものではない。細菌接種を臨界量未満に保つことのみが必要である。幾つかの策略が開発されており、それらを以下にまとめる：
（１）ＭＳＣＲＡＭＭ特異的抗体組成物
ＭＳＣＲＡＭＭに対して産生させた高アフィニティ抗体が細菌に結合し、宿主組織への付着を妨げる。加えて、抗体コート細菌は免疫系によってより容易に認識され、その結果その細菌がより効率的に殺される。
（２）リガンド類似体
病原性細菌が攻撃する宿主組織内の特定の構造を模倣する分子を用いて細菌表面上のＭＳＣＲＡＭＭを飽和させ、それにより付着を妨げる。
（３）ＭＳＣＲＡＭＭ類似体
細菌のＭＳＣＲＡＭＭを模倣する分子は、宿主組織内の結合部位を飽和させ、その結果細菌の付着を阻害するのに用いられる。
このアプローチの期待される効力は、汚染の直後の期間または血液中を循環する間であって、宿主細胞に結合する前に、宿主の防御及び抗生物質に対する微生物の感受性が増加するという報文（Ｃｈｕａｒｄら、１９９３年）に基づく。逆に、ひとたび細菌のコロニーが付着して宿主にてコロニーを形成すると、しばしば細菌を取りまくバイオフィルムが現れる。その結果、その細菌は多くの宿主防御機構及び抗生物質の攻撃に対して耐性となる。
４．１ 略語
ＥＣＭ、細胞外マトリクス；Ｆｎ、フィブロネクチン；Ｎ２９、フィブロネクチンＮ−末端断片；Ｎ３１、ＦｎのＮ−末端トリプシン消化断片；ｒＦｎＢＤ、組換えフィブロネクチン結合領域；ＦＩ、フィブロネクチンＩ型反復；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＣＤ、円二色性；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ＧｕＨＣｌ、塩酸グアニジン；ＡＡＡ、アミノ酸解析；ＡＮＳ、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸；ＬＩＢＳ、リガンド誘発結合部位；ａａ、アミノ酸；ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム；ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム；ＰＡＧＥ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着アッセイ；９Ｃ３又は１１Ａ５腹水、モノクローナル抗体９Ｃ３又は１１Ａ５を発現するクローン化ハイブリドーマ細胞を注射したマウスから得られた腹水；９Ｃ３又は１１Ａ５腹水ＩｇＧ、９Ｃ３又は１１Ａ５腹水から精製したＩｇＧ；９Ｃ３又は１１Ａ５ ＩｇＧ、９Ｃ３又は１１Ａ５を発現する培養クローン化ハイブリドーマ細胞から精製したＩｇＧ。
４．２ 細胞外マトリクス
ＥＣＭは非常に多くの糖タンパク質及びプロテオグリカンを含み、これらは、分子間及び分子内相互作用により、不溶性マトリクスを形成する。ＥＣＭは組織内で構造的な機能を有するが、その生物の細胞生理にも影響を及ぼす。おそらく、最も特徴付けられているＥＣＭの生物学的機能は、宿主組織細胞の接着の基質としての役割を果たすその能力に関係している。このプロセスにはインテグリン、多くのＥＣＭタンパク質における特定の構造を認識するヘテロ二量体（α／β）細胞表面受容体の一集団が関与している（Ｈｙｎｅｓ、１９９２年）。多くの細菌がＥＣＭを付着の基質として利用していることが明らかである。大部分の真核生物組織細胞と同様に、多くの細菌は幾つかの併行する付着機構を発達させており、この見かけの重複性は細菌の繁殖にとっての宿主細胞付着の重要性を反映していよう。
４．２．１ フィブロネクチン
Ｆｎは、真核生物組織細胞の基質接着を媒介することが示された最初のＥＣＭタンパク質であった。Ｆｎは、プレｍＲＮＡの選択的スプライシング及び翻訳後修飾の程度に応じて４１０−４６０ｋＤａの分子量を有する二量体糖タンパク質である。Ｆｎは大部分の細胞の表面上、多くの組織のＥＣＭ内に加えて、血漿のような体液中に蓄積されていることが見出されている（Ｈｙｎｅｓ、１９８９年）。ブドウ球菌及び連鎖球菌に由来するＭＳＣＲＡＭＭによって認識される宿主リガンドタンパク質Ｆｎにおける構造は部分的に決定されている。ＦｎのＮ−末端領域は黄色ブドウ球菌によって認識される主要部位である（Ｍｏｓｈｅｒ及びＰｒｏｃｔｏｒ、１９８０年）。この領域は５つのいわゆるＩ型単位を含んでなる。異なるＩ型単位が欠失しているこの領域の組換えバージョンは細菌細胞に結合することができず（Ｓｃｏｔｔｉｌｅら、１９９１年）、これは、これらの５つのＩ型単位がＭＳＣＲＡＭＭによって認識される構造単位を形成するのに必須であることを示唆している。しかしながら、Ｉｎｇｈａｍらによる最近の研究では、主要結合部位が４及び５と番号が振られているＩ型モジュールに位置していることが示唆されている。加えて、黄色ブドウ球菌及び化膿連鎖球菌はＦｎのＮ−末端領域の外側の部位に、おそらくはＭＳＣＲＡＭＭを介して、従来記載されているＥＣＭタンパク質（Ｊｏｎｓｓｏｎら、１９９５年）に対する広範な特異性をもって、結合するように思われる（Ｓｐｅｚｉａｌｅら、１９８４年；Ｂｏｚｚｉｎｉら、１９９２年）。
４．２．２ フィブリノーゲン
フィブリノーゲン（Ｆｉｂ）は肝細胞によって産生されるもので、血漿中での主要タンパク質である。凝血の過程でフィブリノーゲンはフィブリンに変換され、このフィブリンが凝集して血餅の核を形成する。Ｆｉｂ結合部位を有するＦｎはこの血餅に取り込まれ、これらの相互作用している分子が次にトランスグルタミナーゼ（第ＸＩＩＩ因子）の作用により互いに結合する。ＥＣＭ中のＦｎは血餅中のＦｉｂと共に微生物の付着の基質としての役割を果たし得る。さらに、体内に置かれた物質はＦｉｂ及びＦｎのような血漿タンパク質で迅速にコートされ、その後、これらの表面に、吸着した宿主のタンパク質に特異的に結合する細菌がコロニーを形成する（Ｂｉｓｎｏ及びＷａｌｄｖｏｇｅｌ、１９８９年）。Ｆｉｂにおいては、ブドウ球菌細胞の推定結合部位がγ鎖のＣ−末端領域に位置しており、この領域に相当する合成ペプチドが、ブドウ球菌が誘発するＦｉｂの“クランピング（ｃｌｕｍｐｉｎｇ）”を阻害する（Ｓｔｒｏｎｇら、１９８２年）。このＦｉｂ内の領域は血小板ｇｐＩＩｂＩＩＩａインテグリンによっても認識され、Ｆｉｂが生体材料の表面上に吸着されたときに露出して血小板の凝集を誘発する（Ｆａｒｒｅｌｌら、１９９４年）ものの、可溶性Ｆｉｂにおいてはおそらくは潜在性であって露出しないものと思われる。
４．２．３ コラーゲン
コラーゲンタンパク質はＥＣＭの主要構成要素である（Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ及びＳａｇｅ、１９８０年）。大部分のコラーゲンは細胞内で前駆体分子として合成され、分泌されてＥＣＭもしくは他のコラーゲンに富む組織、例えば、軟骨に取り込まれる前に、広範な翻訳後処理を受ける（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ及びＲｅｄｄｉ、１９７６）。現在までに１８種類を上回る異なる型のコラーゲンが決定されており、それらは大まかに５つの群に分類される（Ｖａｎｄｅｒｒｅｓｔ及びＧａｒｒｏｎｅ、１９９１年）。これらの群は以下の通りである：
（１）１／４ねじれ型フィブリルに関与するコラーゲン、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、及びＸＩ型；
（２）分断された三個のらせん体を有するフィブリル、コラーゲンＸＩＩ、ＸＩＶ、及びＩＸ型；
（３）シートを形成するコラーゲン、コラーゲンＩＶ、ＶＩＩＩ、及びＸ型；
（４）玉状フィラメントを形成するコラーゲン、コラーゲンＶＩ型；並びに
（５）固着フィブリルを形成するコラーゲン、コラーゲンＶＩＩ型。
４．２．４ Ｆｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭ
黄色ブドウ球菌に由来するＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭは特徴付けようとされた最初のＭＳＣＲＡＭＭであった。これらの研究は、天然型ブドウ球菌タンパク質の精製（Ｆｒｏｍａｎら、１９８７年）、続く対応する遺伝子のクローニング及び配列決定（Ｆｌｏｃｋら、１９８７年）を含んでいた。主要リガンド結合部位は、３８アミノ酸長のモチーフを含んでなり、このモチーフが３回繰り返される領域に局在していた（Ｓｉｇｎａｓら、１９８９年）。続いて、黄色ブドウ球菌に由来する高度に相同性のＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭをコードする第２の遺伝子が特徴付けられた（Ｊｏｎｓｓｏｎら、１９９１年）。また、２種類のＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭがＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅからも単離され（Ｌｉｎｄｇｒｅｎら、１９９２年）、対応する遺伝子の配列解析から黄色ブドウ球菌から単離されたタンパク質に類似するタンパク質組織が明らかになった（Ｌｉｎｄｇｒｅｎら、１９９３年）。これらのタンパク質も、約４０アミノ酸長のモチーフを含んでなり、このモチーフが３−４回繰り返されるものであり、かつ主要リガンド結合部位に相当することが見出された領域を含んでいた。化膿連鎖球菌に由来するＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭも特徴付けられている（Ｋｒｅｉｋｅｍｅｙｅｒら、１９９５年；Ｓｅｌａら、１９９３年；Ｔａｌａｙら、１９９２年）。これらのタンパク質をコードする遺伝子が配列決定されており、これらのタンパク質における主要リガンド結合部位も３−４回繰り返される約４０アミノ酸長のモチーフを含んでなる領域に位置することが示されている（Ｊｏｈら、１９９４年）。異なるＭＳＣＲＡＭＭにおける反復モチーフの配列の比較から、コンセンサス配列が明らかになった（Ｊｏｈら、１９９４年；ＭｃＧａｖｉｎら、１９９３年）。他の多くの細菌種がＦｎに結合することが示されており、この相互作用の原因である微生物タンパク質の幾つかが同定されている。
４．２．５ フィブリノーゲン結合ＭＳＣＲＡＭＭ
３種類のブドウ球菌タンパク質がＦｉｂと結合するものと思われる（Ｂｏｄｏｎ及びＦｌｏｃｋ、１９９４）。これらのタンパク質のうちの１つは、主として細菌により分泌される凝固酵素が細胞に会合した形態である。黄色ブドウ球菌が発現する主要Ｆｉｂ結合ＭＳＣＲＡＭＭであるものと思われる“クランピング因子”をコードする遺伝子が近年クローン化され、配列決定されている（ＭｃＤｅｖｉｔｔら、１９９４年；１９９２年）。第３のＦｉｂ結合タンパク質は、Ｆｎ及びＦｉｂを含む多数のＥＣＭタンパク質と結合する（Ｈｏｍｏｎｙｌｏ−ＭｃＧａｖｉｎら、１９９３年；Ｊｏｎｓｓｏｎら、１９９５年）。このタンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び配列決定から、主として６回繰り返される１００アミノ酸長のモチーフを含んでなるタンパク質が明らかとなった。この反復単位中の３０アミノ酸のサブセグメントは、哺乳動物ＭＨＣ ＩＩ分子のペプチド結合領域と非常に高い程度の配列類似性を有する。
機能的に、このブドウ球菌タンパク質はＭＨＣ ＩＩ分子との類似性も示し、非グリコシル化タンパク質及び合成ペプチドと結合することが可能である（Ｊｏｎｓｓｏｎら、１９９５年）。このタンパク質は観察される幾つかのＥＣＭ分子（例えば、ビトロネクチン、骨シアロタンパク質及びトロンボスポンジン）の結合の原因であり、ブドウ球菌細胞上のＭＳＣＲＡＭＭのレパートリーが１リガンド１付着因子パラダイムが関与するものほど複雑ではない可能性がある。
４．２．６ コラーゲン結合ＭＳＣＲＡＭＭ
Ｆｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭおよびＦｉｂ結合ＭＳＣＲＡＭＭの発現に加えて、黄色ブドウ球菌は、コラーゲン結合ＭＳＣＲＡＭＭを発現し得る（Ｓｐｅｚｉａｌｅら、１９８６年）。黄色ブドウ球菌のコラーゲン結合ＭＳＣＲＡＭＭをコードするｃｎａと名付けられた遺伝子のクローニング、配列決定および発現が報告されている（Ｐａｔｔｉら、１９９２年）。ｃｎａ遺伝子は、長さが１１８３アミノ酸で、グラム陽性細菌から得られる表面タンパク質の特徴を有するポリペプチドをコードしている。シグナル配列（Ｓ）の後に、大きな非反復領域（Ａ）が続く。１８７アミノ酸のモチーフ（Ｂ）はその直後に存在する。異なる臨床単離体から得られたｃｎａ遺伝子のＰＣＲTM分析によって、ＭＳＣＲＡＭＭは、１個、２個、３個または４個のＢ反復を含有する少なくとも４つの形態で存在し得ることがわかっている（Ｓｗｉｔａｌｓｋｉら、１９９３年）。Ｂ領域の後には、推定される細胞壁会合領域（Ｗ）、疎水性の膜貫通セグメント（Ｍ）、および正に荷電したアミノ酸に富む短い細胞質内テール（Ｃ）が続く。多数の異なる臨床単離体の分析によって、コラーゲン結合活性を発現する黄色ブドウ球菌のみがｃｎａ遺伝子を含有することが明らかにされた。
コラーゲン結合性領域（ＣＢＤ）は、１３５ｋＤａの黄色ブドウ球菌のコラーゲンアドヘジン（付着体）の内部に存在していた（Ｐａｔｔｉら、１９９３年）。ウェスタンリガンドブロットおよび直接的な結合アッセイと組み合わせた欠失変異導入を用いて、ＣＢＤが、アドヘジンの約５５ｋＤａのＡ領域（ＣＢＤ３０−５２９）内に位置することが最初に見出された。その後の研究によって、ＣＢＤ（３０−５２９）内の長さが１６８アミノ酸のセグメント（ＣＢＤ１５１−３１８）に対するＣＢＤが局在化された。さらに最近、アミノ酸Ｄ209とアミノ酸Ｙ233との間の領域内に位置する別のコラーゲン結合部位が、黄色ブドウ球菌のコラーゲンアドヘジンの内部に見出された。さらに、Ｎ232およびＹ233の２つの残基が、完全なコラーゲン結合活性に必要であることが示された（Ｐａｔｔｉら、１９９５年）。
コラーゲン結合ＭＳＣＲＡＭＭは、コラーゲン被覆基質に対する細菌の接着だけでなく、軟骨（複雑なコラーゲン含有組織）に対する接着にも必要とされることが明らかにされた。コラーゲン結合ＭＳＣＲＡＭＭを発現する試験した菌株のすべてが軟骨に接着することができたが、コラーゲン結合ＭＳＣＲＡＭＭを欠失する菌株は接着しなかった。さらに、コラーゲン結合ＭＳＣＲＡＭＭと天然ＭＳＣＲＡＭＭに対するポリクローナル抗体とを一緒にプレインキュベーションするか、または基質のリガンド結合部位を可溶性受容体タンパク質でブロックすることによって、細菌の結合が効果的に阻害された。コラーゲンアドヘジンは、軟骨への接着を媒介するために必要であって十分である。なぜならば、生成されたコラーゲン結合ＭＳＣＲＡＭＭタンパク質で被覆されたポリスチレンビーズは軟骨ディスクに付着したが、黄色ブドウ球菌のＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭで被覆されたビーズは付着しなかったからである（Ｓｗｉｔａｌｓｋｉら、１９９３年）。
４．３ ＭＳＣＲＡＭＭの生物学的重要性
異なるＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭおよびＦｉｂ結合ＭＳＣＲＡＭＭのアドヘジンとしての重要性が、今や明確にされている。これらの細菌の表面アドヘジンは、単離されたＦｎまたはＦｉｂで被覆された異なる支持材料、および血漿で調整された生体物質に対する細菌の接着を媒介する。埋め込まれた生体物質での細菌のコロニー形成は、多くの場合、命を脅かす感染の原因である。血清で調整したポリマー生体物質に対して接着する黄色ブドウ球菌のＭＳＣＲＡＭＭ同質遺伝子変異体の能力を、イヌの動静脈シャントモデルにおいて調べた。黄色ブドウ球菌のＦｉｂ結合ＭＳＣＲＡＭＭ変異体（ｃｌｆ）は、その親株と比較して、血漿で調整したシャントに対する結合能力において８０％を超える低下が見られた。無傷のｃｌｆ遺伝子コピーを有する同質遺伝子株の補足により、そのようなシャントに対して付着するその能力は完全に回復した（Ｖａｕｄａｕｘら、１９９５年）。
一連のｃｏａ−黄色ブドウ球菌変異体およびｃｌｆ−黄色ブドウ球菌変異体のビルレンスを、カテーテル誘導の心内膜炎（ＥＥ）のラットモデルにおいて分析した（Ｍｏｒｅｉｌｌｉｏｎら、１９９５年）。コアグラーゼをコードする遺伝子の不活性化は、黄色ブドウ球菌変異体のＥＥ誘導能に影響しなかった。しかし、ＥＥ誘導能は、クランプ因子のみを欠失する変異体、またはクランプ因子およびコアグラーゼの両方を欠失する変異体において著しく減少した。さらなる研究では、このモデルにおけるＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭおよびＦｉｂ結合ＭＳＣＲＡＭＭの二重欠失変異体のビルレンスを調査した。
敗血症性関節炎の病原におけるコラーゲン結合性アドヘジンの生物学的重要性が、動物モデルにおける２組の黄色ブドウ球菌変異体のビルレンスを比較することによって調べられている（Ｐａｔｔｉら、１９９４年）。コラーゲンアドヘジン陰性の同質遺伝子変異体ＰＨ１００を、臨床株Ｐｈｉｌｌｉｐｓの染色体コラーゲンアドヘジン遺伝子（ｃｎａ）をその不活性化コピーと置換することによって構築した。コラーゲンアドヘジン陽性の変異体黄色ブドウ球菌 ＣＹＬ５７４を、ｃｎａ遺伝子をＣＹＬ３１６（ｃｎａ遺伝子が通常欠失している株）に導入することによって作製した。ＣＮＡ+株を注射した７０％を超えるマウスは関節炎の臨床的兆候が見られたが、ＣＮＡ-株を注射した動物の２７％未満が疾患症状を示した。さらに、ＣＮＡ+株のｐｈｉｌｌｉｐｓ株を注射したマウスは、ＣＮＡ+変異体ＰＨ１００を注射したマウスと比較した場合、ＩｇＧ１およびＩＬ−６のレベルが著しく上昇した。まとめると、これらの結果により、コラーゲンアドヘジンは、黄色ブドウ球菌によって誘導される敗血症性関節炎の病原性の重要な役割を果たしていることが明らかにされる。
４．４Ｆｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭにおけるＬＩＢＳの特徴づけ
Ｆｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭの「誘導適合」リガンド結合機構（ＬＩＢＳ：リガンド誘導結合部位）は、高いアフィニティの阻止抗体を生成しないことの免疫学的な原因である。さらに、Ｆｎ結合配列は、いくつかの類似する（しかし、同一ではない）配列を含有し、そのそれぞれがリガンド結合し得る。従って、配列特異的な抗体は、１つのＦｎ結合配列のエピトープを認識し、そのリガンド結合を妨害し得るが、それ以外の結合配列のいくつかまたはすべては影響を受けないままである。このことは、宿主の防御機構を回避する微生物が使用するこれまでに知られていない巧妙な戦略を表していると考えられる。従って、結合活性を欠失するＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭだけが、阻止抗体を産生するための抗原として役に立つことが予想される。
ＦｎＢＰＡ内の酸性残基がＦｎ結合に寄与していることが、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）介在によるカルボキシル基でのグリシンメチルエステルの縮合を使用する化学的修飾によって以前に決定されている（ＭｃＧａｖｉｎら、１９９１年）。このような修飾による研究によって、ＣＯＯＨ基が、ＭＳＣＲＡＭＭのＦｎ結合能における重要な役割を果たしていることが示された。逆に、リジン残基のジヒドロキシプロピル化還元およびテトラニトロメタンの添加によるチロシン残基の酸化は、Ｆｎ結合に何ら影響しなかった。
このような観測に基づいて、本発明者らは、結合活性を欠失しているＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭは阻止抗体を導くという仮説を立てた。Ｆｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭ組換え体、ｒＦｎＢＤ−Ｄを、以前に記載された（ＭｃＧａｖｉｎら、１９９１年）ようにＥＤＣで化学的に修飾し、黄色ブドウ球菌に対するＦｎ結合を阻害するその能力を試験した。修飾ｒＦｎＢＤ−Ｄは何ら阻害活性を示さなかったが、無傷のｒＦｎＢＤ−Ｄは、用量依存的形式で黄色ブドウ球菌に対するＦｎ結合を阻害した。次いで、化学的に修飾したｒＦｎＢＤ−Ｄを使用して、ウサギを免疫化した。免疫血清および免疫化ウサギから精製したＩｇＧを用いたその後の研究によって、生成した抗体は抗原に対して強く反応するが、天然ｒＦｎＢＤ−Ｄに対してはほとんど反応性を示さないことが示された。さらに、精製された免疫ＩｇＧは、黄色ブドウ球菌に対するＦｎの結合を阻害しなかった。約９８％の効率で、化学修飾は、全クラスのアミノ酸をプローブするための迅速で効率的な方法を提供する利点を有した。しかし、この全体的な方法での固有の欠点は、個々のアミノ酸の結合に対する寄与が検出されなかったことである。
４．４．１ 組換えＦｎＢＰＳの分析
グラム陽性細菌のいくつかの異なる種に由来する組換えＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭの生物物理学的特徴づけにより、「誘導適合」結合相互作用が示唆されている。中性ｐＨのリン酸緩衝化生理食塩水中でのリガンド結合領域の組換え体の遠紫外ＣＤスペクトル（１９０〜２５０ｎｍ）は、規則的な二次構造をほとんど含有しないタンパク質に特徴的であった。この領域の固有粘度は、６Ｍ塩酸グアニジンの存在下または非存在下で同じであることが見出された。このことは、天然コンフォメーションおよび変性コンフォメーションは区別できないことを示す。ＦｎのＮ末端を組換えアドヘジンに対するリガンドとして添加すると、得られる遠紫外ＣＤスペクトルの差スペクトルにおいて大きな変化が生じた。Ｎ末端が４．９モル過剰な場合、示差スペクトルは、モデル遠紫外ＣＤスペクトルとの比較によって判断されるように、βシートのコンフォメーションが主である示差スペクトルに変化した。ＦｎのＮ末端領域により、その内部トリプトファンの蛍光の微小ではあるが再現性のある青方シフトが、トリプトファン残基を含有しないｒＦｎＢＤ−Ａを添加した際に得られる。この結果は結合時におけるＮ末端のトリプトファン残基の環境が大きく変化していないことを示すので、ＣＤ分析によって測定された二次構造の大きな変化は、ＦｎのＮ末端に対する結合時におけるアドヘジンにおいて、主としてβシートの二次構造が誘導されたことによる。
インビボにおいて、これらの結果を説明する理由がいくつか考えられる。例えば、我々は、活性なＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭ（組換え体または細菌細胞表面に局在しているもの）が動物の体内に進入すると、このタンパク質が血清中に存在するＦｎを迅速に認識し、それと結合すると推測している。阻止抗体が既に存在していないか、または極端に低い濃度で存在している場合、ＭＳＣＲＡＭＭ上のＦｎ結合部位はＦｎと結合し、重要なエピトープは免疫グロブリンによる抗原認識のためにはもはや利用されない。
この考えが正しいとすれば、それは、宿主の防御機構を回避する微生物が使用するこれまで知られていない巧妙な戦略を表しているであろう。本発明者らの最近の研究は、これが、まさに、黄色ブドウ球菌に感染した患者において起こっていることであることを示唆している。臨床的に診断された黄色ブドウ球菌感染症の患者から得られた抗体を分析した（実施例１０、ならびに図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１４Ａおよび図１４Ｂを参照のこと）。このような子供の血清から得られた精製ＩｇＧは、ＥＬＩＳＡによってＩｇＧがＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭを認識したとしても、黄色ブドウ球菌のＦｎに対する結合を有意に阻害しなかった。最も興味深い発見は、ＥＬＩＳＡにおいて、ＩｇＧが、Ｆｎと複合体化したＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭに対して最も強く反応することであった。まとめると、これらのデータは、Ｆｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭに対する阻止抗体の欠如は、実験室的現象でもなく、実験計画の人為的なものでもないことを示している。むしろ、黄色ブドウ球菌は、重要なアドヘジンを宿主の防御機構から保護する方法を見出している。さらに、Ｆｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭにおける部位特異的な改変が、高いアフィニティの阻止抗体を生成する抗原を得るために必要であることを示している。
４．５ フィブロネクチン結合タンパク質由来ペプチドおよびエピトープ
組織接着が病原プロセスにおいて極めて重要な役割を果しているので、細菌接着が、感染の予防および治療に対する新しい戦略における目標として認められている。本発明は、従来の宿主の防御機構を助け、組織の接着を阻止するためのワクチン開発および抗体産生において、アドヘジン、特にＭＳＣＲＡＭＭの使用が可能であること明らかにする。
４．５．１ エピトープのコア配列
本発明はまた、全細胞および他のペプチドを含まないタンパク質またはペプチドの組成物に関する。この組成物は、本発明の１つ以上の抗体と免疫学的に交差反応し得るエピトープを取り込んでいる精製されたタンパク質またはペプチドを含む。
本明細書中で使用される用語「１つ以上の抗ＦｎＢＰ抗体と免疫学的に交差反応し得るエピトープを取り込んでいる」は、ＦｎＢＰポリペプチド内に位置するエピトープに類似する一次構造、二次構造または三次構造を含むペプチド抗原またはタンパク質抗原を示すことを意味する。類似性の程度は、一般的には、ＦｎＢＰポリペプチドに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体もまた、交差反応性のペプチド抗原またはタンパク質抗原に結合するか、そうでなければ、そのような抗原を認識するような程度である。様々な免疫アッセイ法が、そのような抗体と一緒に用いられ得る：例えば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなど。これらはすべて、当業者に知られている。
ワクチンにおける使用に適切なＭＳＣＲＡＭＭエピトープ、特にＦｎ結合エピトープ（ｓｆｂ、ｆｎｂＡ遺伝子、ｆｎｂＢ遺伝子、ｆｎＡ遺伝子またはｆｎＢ遺伝子の産物および／またはそれらの機能的等価物から得られるエピトープ）の同定は、比較的直接的な事項である。例えば、米国特許第４，５５４，１０１号（これは引用により本明細書中に援用される）において教示されるように、Ｈｏｐｐの方法を用いることができる。米国特許第４，５５４，１０１号は、親水性に基づく、アミノ酸配列から得られるエピトープの同定および調製を教示する。いくつかの他の論文に記載される方法、およびそれに基づくソフトウエアプログラムもまた、エピトープのコア配列を同定するために使用できる（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ ａｎｄ Ｗｏｌｆ、１９８８年；Ｗｏｌｆら、１９８８年；米国特許第４，５５４，１０１号を参照のこと）。次いで、これらの「エピトープのコア配列」のアミノ酸配列は、ペプチド合成の適用または組換え技術のいずれかによって、ペプチドの内部に容易に取り込むことができる。
本発明に従って使用するのに好ましいペプチドは、一般に、長さが約５個〜約２５個のアミノ酸、より好ましくは長さが約８個〜約２０個のアミノ酸の大きさである。それよりも短い抗原性のペプチド配列は、特定の環境（例えば、ワクチン調製または免疫学的検出アッセイ）において好都合であると考えられる。代表的な利点として、調製および精製が容易なこと、比較的低コストで再現性が改善された製造、および好都合な生体分布が挙げられる。
本発明の特定の利点が、合成ペプチドを調製することによって実現し得ると考えられる。そのようなペプチドは、修飾および／または伸長したエピトープ／免疫原性コア配列を含み、この配列により、ＭＳＣＲＡＭＭ関連配列、特に、ＥＣＭ成分のＦｎと結合するそれらのＦｎＢＰ領域に対する「普遍的」エピトープペプチドが得られる。これらの領域は、動物におけるＴ細胞またはＢ細胞の刺激を促進し、従ってそのような動物における特異的抗体の産生を高めることが最も確実な領域であると考えられる。
本明細書中で使用されるエピトープコア配列は、ＭＳＣＲＡＭＭエピトープに特異的な抗体の抗原結合部位に「相補的」であり、従ってそれと結合する比較的短い範囲のアミノ酸である。さらにあるいはその代わりに、エピトープコア配列は、本発明のペプチド組成物に対する抗体と交差反応し得る配列である。本発明の開示の文脈において、用語「相補的」は、互いに親和力を示すアミノ酸またはペプチドを示すことが理解される。従って、本発明のいくつかのエピトープコア配列は、所望のタンパク質抗原の結合が、対応するタンパク質に対する抗血清によって競合するか、あるいはおそらくはそのような結合がそのような抗血清と置き換わるそれらの能力によって機能的に定義することができる。
一般に、ポリペプチド抗原の大きさは、同定されたコア配列を１つまたはそれ以上有するのに少なくとも十分である限り、特に重要ではないと考えられる。本発明の開示によって予想される最小のコア配列は、一般に、長さが約５個のアミノ酸の程度である。８個および２５個程度の配列がより好ましい。従って、この大きさは、一般に、本発明に従って調製される最小のペプチド抗原に対応する。しかし、抗原の大きさは、基本的なエピトープコア配列が含まれる限り、所望する場合にはより長くすることができる。
エピトープコア配列の同定は、例えば、米国特許第４，５５４，１０１号（これは参考によりここに援用される）に記載されているように、当業者には知られている。米国特許第４，５５４，１０１号は、親水性に基づいて、アミノ酸配列から得られるエピトープの同定および調製を教示する。さらに、多数のコンピュータープログラムが、タンパク質の抗原性部分を予測する際に使用するために入手できる（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ ａｎｄ Ｗｏｌｆ、１９８８年；Ｗｏｌｆら、１９８８年を参照のこと）。コンピューター化されたペプチド配列分析プログラム（例えば、ＤＮＡＳｔａｒ７ソフトウエア、ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）もまた、合成ＦｎＢＰ、およびＦｎＢＰ由来エピトープ、ならびに本発明の開示によるエピトープアナログを設計するのに有用であり得る。
本発明によって提供されるペプチドは、様々なブドウ球菌またはブドウ球菌関連の疾患を処置するためのワクチンまたは免疫薬剤としての使用に理想的な目標である。そのような疾患は、特に、Ｆｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭ遺伝子を含有する種、従ってｓｆｂ遺伝子、ｆｎｂＡ遺伝子、ｆｎｂＢ遺伝子、ｆｎＡ遺伝子またはｆｎＢ遺伝子の産物を細胞表面で発現し、次いでＥＣＭ成分（宿主細胞に対する細菌接着を促進するＦｎなど）と相互作用する種によって引き起こされる。この点に関して、特定の利点が、エピトープ／免疫原性のコア配列を含む合成ペプチドを調製することによって実現し得る。これらのエピトープコア配列は、ポリペプチドの親水性領域および／または可動領域、あるいはＴ細胞モチーフを含む配列として同定することができる。そのような領域は、Ｂ細胞またはＴ細胞の刺激を促進する、従って特異抗体の産生を高めることが最も確実であることが当該分野では知られている。細菌の接着を予防する場合、Ｆｎに特異的なＭＳＣＲＡＭＭ遺伝子産物の相互作用を阻害する抗体を産生するエピトープの調製が特に望ましい。
タンパク質またはペプチドが、開示されたペプチドの１つ以上のエピトープと免疫学的に交差反応し得るか、またはそれらの生物学的な機能等価物であることを確認することもまた、直接的な事項である。これは、例えば、１つの提唱されるエピトープ配列の特異的なアッセイを使用して、あるいは例えば、無作為に作製した合成ペプチドフラグメントまたはタンパク質フラグメントの集団のより一般的なスクリーニングによって容易に決定することができる。スクリーニングアッセイを用いて、等価な抗原または交差反応性抗体のいずれかを同定することができる。いずれの場合においても、原理は同じである：すなわち、結合部位の抗体と抗原との競合に基づく。
用いることができる適切な競合アッセイは、免疫組織学的アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロッティングまたはドットブロッティングなどに基づくプロトコルを含む。いずれかの競合アッセイにおいても、結合成分の１つ、一般的に、既知の要素（ＦｎＢＰ由来ペプチドまたは既知の抗体）を、検出可能な標識で標識する。試験成分（これは、一般的には、標識されないままである）を、対応する反応性の抗体または抗原に結合する標識の量を減少させるそれらの能力について試験する。
代表的な実施形態として、ＭＳＣＲＡＭＭと任意の試験抗原との間の競合研究を行うために、最初にＦｎＢＰＡを検出可能な標識（例えば、ビオチンあるいは酵素的、放射能的または蛍光性の標識）で標識し、その後の同定を可能にする。次いで、標識した抗原を、様々な比（例えば、１：１、１：１０および１：１００）で試験される試験抗原と一緒にインキュベーションする。混合した後、次いで、混合物を既知の抗体（例えば、９Ｃ３または１１Ａ５）に加える。既知の抗体は、好ましくは、例えば、ＥＬＩＳＡプレートに結合させるなどによって固定化される。混合物の抗体に対する結合能を、特異的に結合した標識の存在を検出することによって求める。この値を、競合し得る（試験）抗原をインキュベーションにおいて含まない対照の値と比較する。
アッセイは、ハイブリダイゼーションに基づく様々な免疫学的なアッセイのいずれかである。反応性の抗原を、その標識を検出することによって、例えば、ビオチン化された抗原の場合にはストレプトアビジンを使用して、または酵素的な標識と組み合わせて発色性基質を使用することによって、あるいは放射能標識または蛍光標識を単に検出することによって検出する。
任意の試験抗原の非存在下における標識された抗原（例えば、ＦｎＢＰ由来ペプチド）の反応性は、対照の高い値である。対照の低い値は、標識抗原と過剰の非標識ＦｎＢＰ抗原とのインキュベーション（このとき、競合が起こり、結合が減少する）によって得られる。試験抗原の存在下における標識抗原の有意な減少は、「交差反応し得る」、すなわち同じ抗体に対する結合アフィニティを有する試験抗原を示し得る。本発明に関して、「有意な減少」は、結合における再現性のある（すなわち、安定して測定される）減少として定義することができる。
本明細書中に記載されるペプチド性化合物に加えて、本発明はさらに、他の立体的に類似する化合物が、ペプチド構造の中心部分を模倣するように処方され得ることを意図する。そのような化合物（これは、ペプチドミメティックスと呼ぶことができる）は、本発明のペプチドとして同様に使用することができ、従って機能的等価物でもある。構造的かつ機能的な等価物は、当業者に知られているモデリングおよび化学的設計の技術によって作製することができる。そのような立体的に類似する構造体はすべて、本発明の範囲内であることが理解される。
エピトープ配列、またはそれらの配列内の抗原性エピトープを含むペプチドの合成は、固相法などの従来の合成技術を使用して（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａ型ペプチドシンセサイザーなどの市販のペプチド合成機の使用により）容易に行うことができる。このようにして合成されるペプチド抗原は、次いで、所定量に小分けして、通常の方法（例えば、水溶液で、またはさらにより好ましくは、使用するまで粉末または凍結乾燥状態）で保存することができる。
一般に、ペプチドの相対的な安定性のために、ペプチドは、所望すれば、例えば、６ヶ月以上までのかなり長期間、水溶液（事実上、任意の水溶液）で、抗原活性の認められる分解または喪失を伴うことなく、容易に保存することができる。しかし、長い水性保存を意図する場合、一般には、約７．０〜約７．５のｐＨを維持するために緩衝液（トリス緩衝液またはリン酸緩衝液など）を含む薬剤を含むことが望ましい。さらに、微生物の増殖を阻害する薬剤（アジ化ナトリウムまたはメルチオレート（Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）など）を含むことは望ましいことであり得る。水性状態での長い保存に関して、溶液を４℃で、またはより好ましくは凍結して保存することが望ましい。もちろん、ペプチドを凍結乾燥状態または粉末状態で保存する場合、ペプチドは、使用前に例えば、所定量の水（好ましくは、蒸留水）または緩衝液で再水和して、その後使用できる計量された量で、実際上、無期限に保存することができる。
４．５．２ ペプチド組成物
本発明の重要な局面には、単離および精製されたＳｆｂ、ＦｎＢＡ、ＦｎＢＢ、ＦｎＢＰＡおよびＦｎＢＰＢに由来するペプチド、これらのエピトープペプチドの修飾物、そのようなペプチドをコードする部位特異的変異誘発核酸セグメントから得られるペプチド、ならびにそのようなペプチド由来抗体を含む新規な組成物が含まれる。当然、１つ以上のＭＳＣＲＡＭＭエピトープをコードする核酸セグメントは、本発明の方法および組成物で使用できることが理解される。従って、核酸送達法は、１つ以上のペプチドエピトープをコードするＭＳＣＲＡＭＭエピトープコードの核酸セグメントの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の投与を必然的に伴う。投与され得る核酸セグメントの最大数は、実施上の考慮すべき事項（多数の核酸セグメント構築物を同時に調製する際に生じる効果、または有害な細胞毒性効果を高める可能性など）によってのみ限定される。
核酸セグメントの特定の組合せは、１つ以上の種の連鎖球菌またはブドウ球菌から得られる２つ以上の別個の核酸セグメントであり得る。あるいは、それは、Ｆｎ結合タンパク質をコードする１つの遺伝子から得られる核酸セグメントは、別の核酸セグメントおよび／または別のペプチドまたはタンパク質（細胞骨格タンパク質など）、コファクターまたは他の生体分子と一緒にされる；ホルモンまたは成長因子の遺伝子さえも、最初の核酸セグメントのポリペプチド産物と相互作用し得る細胞表面受容体の一部またはすべてをコードする核酸セグメントまたは遺伝子と一緒にすることができるようなものであり得る。
複数の核酸セグメントを使用することにおいて、それらは、１つ以上のプロモーターの制御下にある１つの遺伝的構築物において組み合わせることができる。あるいは、それらは、同じタイプまたは異なるタイプの別個の構築物として調製することができる。従って、ほとんど無限の組合せの異なる核酸セグメントおよび遺伝的構築物を用いることができる。核酸セグメントのいくつかの組合せを設計し、あるいはそうでなければ、それらを使用して、Ｆｎ結合および／またはそのような核酸セグメントの翻訳から得られるペプチドに対する免疫応答の刺激に関する相乗効果を得ることができる。すべてのそのような組合せは、本発明の範囲内にあることが理解される。実際、多くの相乗効果が科学的な文献に記載されており、その結果、当業者は、核酸セグメントの確からしい相乗的な組合せまたは核酸セグメント−ペプチドの組合せさえも容易に同定するできる。
所望する場合、特定のＭＳＣＲＡＭＭ由来ペプチドをコードする核酸セグメントまたは遺伝子を、さらなる薬剤（例えば、タンパク質またはポリペプチドまたは様々な薬学的な活性薬剤など）と組み合わせて投与され得ることもまた理解される。組成物が、ＭＳＣＲＡＭＭポリペプチドのすべてまたは一部をコードする核酸セグメントを含む限り、さらなる薬剤が標的細胞または宿主組織との接触において、有意な有害作用を生じない限り、他の成分を同様に含み得る制限は、事実上存在しない。従って、核酸は、特定の場合に必要とされる様々な他の薬剤と一緒に送達することができる。薬学的に受容可能な賦形剤および担体溶液の処方は、経口、非経口、および／または静脈内の投与および処方において、本明細書中に記載される特定の組成物を使用するための適切な投薬および処置法の開発のように、当業者には広く知られている。
４．５．３ ＳＦＢ、ＦＮＢＡ、ＦＮＢＢ、ＦＮＢＰＡおよびＦＮＢＰＢ由来エピトープを発現する組換えベクター
本発明の特定の局面により、ｓｆｂ、ＦｎＢＡ、ＦｎＢＢ、ＦｎＢＰＡおよびＦｎＢＰＢ由来ペプチド、これらのペプチドをコードする核酸セグメント、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅのｆｎｂＡまたはｆｎｂＢ由来ＤＮＡセグメントを含む組換えベクターおよび形質転換宿主細胞、黄色ブドウ球菌のｆｎｂＡまたはｆｎｂＢ由来ＤＮＡセグメントを含む組換えベクターおよび形質転換宿主細胞、ならびに化膿連鎖球菌のｓｆｂ由来ＤＮＡセグメントを含む組換えベクターおよび形質転換宿主細胞を利用する新規な方法が提供される。当業者には広く知られているように、多くのそのようなベクターおよび宿主細胞は容易に入手することができる。哺乳動物細胞での発現に適切なベクターの１つの特に詳しい例は、米国特許第５，１６８，０５０号（これは参考によりここに援用される）に記載されるベクターである。しかし、用いられるコードセグメントが目的のタンパク質またはペプチド（例えば、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅから得られるＦｎＢＡまたはＦｎＢＢのエピトープ配列、黄色ブドウ球菌から得られるＦｎＢＰＡまたはＦｎＢＰＢのエピトープ配列、あるいは化膿連鎖球菌から得られるＳｆｂエピトープ配列）をコードし、細胞に悪影響を有するいかなるコードまたは調節配列も含まない限り、高度に精製されたベクターを使用する必要性はない。従って、有用な核酸配列は、コード領域の５’部分または３’部分のいずれかに隣接するさらなる非コード配列などのさらなる残基を含むか、または様々な調節配列を含むこともまた理解される。
適するエピトープをコードする核酸分子を同定した後、それは、当該分野で現在知られている多くのベクターのいずれか１つに挿入することができ、その結果、目的のタンパク質またはペプチドのエピトープ（例えば、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅから得られるＦｎＢＡまたはＦｎＢＢのエピトープ配列、あるいは黄色ブドウ球菌から得られるＦｎＢＰＡまたはＦｎＢＰＢのエピトープ配列）の発現および産生が、宿主細胞内に組み込まれたときに行われる。組換え発現ベクターにおいて、ＤＮＡセグメントのコード部分はプロモーターの制御下に置かれる。プロモーターは、ｆｎＡ遺伝子、ｆｎＢ遺伝子、ｆｎｂＡ遺伝子またはｆｎｂＢ遺伝子あるいは核酸セグメントと天然において結合しているプロモーターの形態であり得る。これは、本明細書中に開示される組成物に関連して、コードセグメントの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって、例えば、組換えクローニングおよび／またはＰＣＲTM技術を使用して得ることができる。米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号（これらは参照によりここに取込まれる）のＰＣＲTM技術を使用する核酸の直接的な増幅は、そのような方法論において有用であることが特に意図される。
いくつかの実施形態において、いくつかの利点が、ｓｆｂ、ＦｎＢＡ、ＦｎＢＢ、ＦｎＢＰＡまたはＦｎＢＰＢをコードするＤＮＡセグメントを組換えまたは異種のプロモーターの制御下に置くことによって得られることが意図される。本明細書中で使用されるように、組換えまたは異種のプロモーターは、ｓｆｂ、ＦｎＢＡ、ＦｎＢＢ、ＦｎＢＰＡまたはＦｎＢＰＢの遺伝子セグメントとその天然の環境下で通常結合していないプロモーターをいうことを意味する。そのようなプロモーターは、ＭＳＣＲＡＭＭをコードする遺伝子以外と通常結合しているプロモーター、および／または任意の他の細菌、ウイルス、真核生物、または哺乳動物の細胞から単離されたプロモーターを含み得る。当然なこととして、ｓｆｂ、ＦｎＢＡ、ＦｎＢＢ、ＦｎＢＰＡまたはＦｎＢＰＢをコードする核酸セグメントを含むベクターを維持する特定の細胞においてＤＮＡセグメントの効率的な発現を行うプロモーターを用いることが重要である。
タンパク質発現を達成するために組換えプロモーターを使用することは、一般に、分子生物学の当業者には知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）を参照のこと。用いられるプロモーターは、構成的または誘導的であり得る。このようなプロモーターを適切な条件下で使用し、導入したＤＮＡセグメントの高レベルまたは調節された発現を行うことができる。真核生物発現については、現在好ましいプロモーターは、ＣＭＶ、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター単独、およびＳＶ４０エンハンサーと組み合わせたＳＶ４０プロモーターなどのプロモーターである。本発明の核酸セグメントの原核生物発現は、当業者に知られている方法を使用して行うことができ、発現ベクターおよびプロモーター配列（ｔａｃ、ｔｒｐ、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５またはＴ７によって提供されるプロモーター配列など）を含み得る。
４．５．４ 組換えタンパク質の発現
ｓｆｂ、ｆｎｂａ、ｆｎｂｂ、ｆｎｂＰＡおよびＦｎＢＰＢ由来核酸セグメントを発現する組換えクローンを使用して、精製されたペプチド抗原ならびに変異型または変異型のタンパク質を著しい量で調製することができる。選択された抗原、およびその変異体は、ブドウ球菌および連鎖球菌の感染の診断および処置において有意義に利用されると考えられる。例えば、これらの抗原、またはペプチド変異体、またはそのような抗原に対する抗体は、ブドウ球菌または連鎖球菌を検出するための免疫アッセイにおいて、あるいはブドウ球菌および／または連鎖球菌の感染を処置するためのワクチンまたは免疫療法剤、およびＦｎなどのＥＣＭ成分に対する細菌の接着を防止するためのワクチンまたは免疫療法剤として使用することができる。
本発明のＭＳＣＲＡＭＭエピトープに対する抗体（モノクローナル抗体を含む）が本明細書中に記載されているので、これらのペプチド、またはそれらの免疫学的に交差反応し得る変異体を精製するために免疫吸着技術を使用することもまた意図される。この目的に有用な抗体は、本明細書中に開示される技術によって一般に調製することができ、あるいはモノクローナルの調製（例えば、米国特許第４，５１４，４９８号および同第４，７４０，４６７号を参照のこと）に関して当該分野で一般に知られており、所望のタンパク質またはペプチドと反応し得る抗体が選択されると考えられる。
従って、ＤＮＡ変異誘発などの技術の適用によって、本発明は、改変または単純化されたタンパク質構造を有する、いわゆる「第２世代」分子の容易な調製を可能にする。第２世代のタンパク質は、典型的には、全長の抗原と同じような特性の１つ以上（特定の抗原／免疫原性のエピトープコア配列）を有する。エピトープ配列は、ペプチドの知識またはコードＤＮＡ配列情報から調製される比較的短い分子に提供することができる。そのような変異型分子は、タンパク質構造の選択された免疫原性／抗原性の領域から誘導されるだけでなく、さらにあるいは代わりに、天然の配列に関する類似性または違いにさえ基づいて選択される機能的に等価なアミノ酸の１つ以上を含むことができる。これは、実施例３に記載されるように、Ｆｎに対する細菌の接着を防止する阻止抗体の調製において特に望ましい。
４．５．５ ＳＦＢ、ＦＮＢＡ、ＦＮＢＢ、ＦＮＢＰＡおよびＦＮＢＰＢ由来ＭＳＣＲＡＭＭエピトープの発現
ＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープの発現について、１つ以上の適切なクローンが、それらが天然の配列または遺伝的に改変されたかどうかによらず、一旦得られると、ＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープの組換え調製物の発現系を調製することができる。原核生物系または真核生物系での発現に必要なＤＮＡセグメントの操作を、組換え発現の当業者に一般に知られている技術によって行うことができる。実際には、任意の発現系を、ＭＳＣＲＡＭＭ由来ＭＳＣＲＡＭＭエピトープの発現において用いることができる。
ＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープは、真核生物系において首尾良く発現することができる。しかし、細菌発現系は、すべての目的のために必要なＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープの調製に好ましくあり得ることもまた考えられる。所望のＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープ（天然エピトープまたは変異誘発エピトープのいずれか）をコードするＤＮＡ配列は、細菌系において別個に発現することができる。コードされたタンパク質は、Ｄ−グルコシダーゼ、ユビキチン、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃａ）のグルタチンＳ−トランスフェラーゼ、黄色ブドウ球菌のプロテインＡおよびマルトース結合タンパク質などとの融合物として発現される。原核発現系、特に細菌発現系は、最終的には、それによって得られる物質の使用の容易さおよびその質の点で、真核生物発現系を上回る利点を有すると考えられる。
そのようなエピトープをコードするＤＮＡセグメントによる宿主細胞の形質転換は、ＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープペプチドを得るための簡便な方法を提供すると考えられる。ゲノム配列または染色体外の配列は、適する発現ベクター中に存在するとき、コードされたタンパク質の発現を可能にする適切な条件下での真核生物発現に適切である。なぜなら、宿主細胞は、当然、核酸を転写し、機能的なｍＲＮＡを産生し、その後タンパク質に翻訳されるからである。
ほとんどの任意の真核生物発現系を利用して、ＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープの発現を行うことができると同様に考えられる。例えば、バキュロウイルスに基づく系、グルタミンシンターゼに基づく系、またはジヒドロ葉酸レダクターゼに基づく系を用いることができる。しかし、好ましい実施形態において、複製起点および効率的な真核生物プロモーターを組み込むプラスミドベクターは、ｐＣＭＶ５などのｐＣＭＶ系列の真核生物ベクターにより例示されるように、最も有用であることが意図される。
このような発現に関して、コード配列は、プロモーターに隣接して、その制御下に置かれる。コード配列をそのようなプロモーターの制御下に置くために、タンパク質の転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を、約１ヌクレオチドと約５０ヌクレオチドの間で、選択プロモーターの「下流」（すなわち、３’）に置くことが理解される。
真核生物発現を意図する場合、典型的には、ＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープをコードするＤＮＡ配列を含む転写ユニットに、適するポリアデニル化部位（例えば、５’−ＡＡＴＡＡＡ−３’）を、最初にクローニングしたセグメント内に含まれていない場合には組み入れることはまた望ましい。典型的には、ポリＡ付加部位は、タンパク質の停止部位の約３０〜２０００ヌクレオチド「下流」で、転写終了前の位置に置かれる。
事実上、任意の一般的に用いられる宿主細胞を、本明細書によるＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープの発現に関連して使用できることが意図される。例として、真核発現に典型的に用いられる細胞株（２３９、ＡｔＴ−２０、ＨｅｐＧ２、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＷＩ ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＲＩＮおよびＭＤＣＫの細胞株など）が含まれる。
ＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープペプチドを「過剰発現」させ得ること、すなわち、ヒトの細胞においてその天然の発現と比較して、またはＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープをコードするＤＮＡセグメントを含有する組換え宿主細胞において他のタンパク質の発現に比較してさえも、増大したレベルで発現させ得ることが意図される。そのような過剰発現は、放射標識および／またはタンパク質精製を含む様々な方法によって評価することができる。しかし、単純で直接的な方法が好ましい。例えば、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびタンパク質染色またはウエスタンブロッティング、その後の定量分析（得られるゲルまたはブロットの密度走査分析など）が含まれる。天然のＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープを産生する動物細胞でのレベルと比較して、組換えタンパク質またはペプチドのレベルの特異的な増大が、過剰発現である。これは、宿主細胞によって産生された他のタンパク質に関連して特定のタンパク質の相対的な存在量であり、例えば、ゲル上で視認できる。
本明細書中で使用される用語「操作された」細胞または用語「組換え」細胞は、組換え遺伝子（ＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープペプチドをコードする遺伝子など）が導入された細胞をいうことを意味する。従って、操作された細胞は、組換え的に導入された遺伝子を含有しない天然に存在する細胞と区別することができる。従って、操作された細胞は、ヒトの手によって導入された１つ以上の遺伝子を有する細胞である。組換え的に導入された遺伝子は、ｃＤＮＡ遺伝子（すなわち、これはイントロンを含有しない）、ゲノム遺伝子のコピーのいずれかの形態であり、特定の導入遺伝子に天然では結合していないプロモーターに隣接した遺伝子を含む。
一般的には、組換え遺伝子として、ｃＤＮＡ体の遺伝子を用いることはより便利であり得る。ｃＤＮＡ体の使用は、遺伝子の大きさが、ｃＤＮＡ遺伝子よりも典型的には一桁までも大きいゲノム遺伝子よりも、一般に、かなり小さく、標的細胞をトランスフェクションするためにより容易に用いられる点で好都合であると考えられる。しかし、本発明者らは、所望する場合には、特定の遺伝子のゲノム体を用いる可能性を除外しない。
１つ以上の外来遺伝子の組換え体の導入が必要な場合、それが、操作のために選択された細胞タイプにおいて遺伝子を効率的に発現するプロモーターの制御下に存在するように、遺伝子を導入することが重要である。一般に、目的遺伝子の構成的な（定常的な）発現を可能にするプロモーターを用いることが所望される。一般に使用される構成的なプロモーターは、一般には、ウイルス起源であり、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列、およびＳＶ４０初期遺伝子プロモーターが含まれる。これらの構成的なプロモーターの使用は、導入された遺伝子の高い一定したレベルの発現を確実にする。本発明者らは、目的の導入遺伝子から得られる発現レベルは、おそらくは染色体ＤＮＡ内の組換え遺伝子の挿入部位の結果として、クローンによって変化し得ることに気付いた。従って、特定の組換え遺伝子の発現レベルは、各トランスフェクション実験から得られる異なるクローンを評価することによって選択することができる；そのレベルを一旦選択すると、構成的プロモーターは、発現の所望レベルを恒久的に確実に維持する。操作するために使用される細胞タイプに特異的なプロモーター（インスリノーマ細胞株におけるインスリンプロモーター、あるいは下垂体前葉細胞株におけるプロラクチンまたは成長ホルモンのプロモーターなど）を使用することもまた可能である。
４．５．６ ＤＮＡセグメント
他の実施形態において、いくつかの利点が、コードＤＮＡセグメントを、組換えまたは異種のプロモーターの制御下に置くことによって得られることが意図される。本明細書中で使用されるように、組換えまたは異種のプロモーターは、ＭＳＣＲＡＭＭ由来ペプチドをコードするＤＮＡセグメントと天然の環境下で通常結合していないプロモーターをいうことを意図する。そのようなプロモーターは、他の遺伝子と通常結合しているプロモーター、および／または任意のウイルス、原核細胞（例えば、細菌）、真核生物（例えば、真菌、酵母、植物または動物）の細胞から単離されたプロモーターを含み、特に哺乳動物細胞のプロモーターを含む。当然、発現のために選択される細胞タイプ、生物、または動物にさえおけるＤＮＡセグメントの効率的な発現を行うプロモーターを用いることは重要である。タンパク質発現のためにプロモーターおよび細胞タイプの組合せを使用することは、分子生物学の当業者に一般に知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年を参照のこと。用いられるプロモーターは、構成的または誘導的であり得るし、導入されたＤＮＡセグメントの高レベルの発現を行うために適する条件下で、組換えタンパク質またはペプチドの大規模な産生に好都合であるような条件下で使用することができる。高レベルの発現において使用することが意図される適するプロモーター／発現系は、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクター系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、昆虫細胞における発現用のバキュロウイルス系、あるいは任意の適切な酵母または細菌の発現系であるが、これらに限定されない。
ＭＳＣＲＡＭＭコード配列に特異的にハイブリダイズするプローブとして使用され得る核酸セグメントの能力は、それによって、所定のサンプルにおける相補的な配列の存在の検出に使用することを可能にすることである。しかし、他の遺伝的構築物を調製する際に使用されるプライマーまたは変異種プライマーを調製するための配列情報の使用を含む他の使用が考えられる。
本明細書中に開示されるＤＮＡ配列と同一であるか、またはそれに相補的な約１４ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１６ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２１ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２３ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約２７ヌクレオチド、約２８ヌクレオチド、約２９ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約３１ヌクレオチド、約３２ヌクレオチド、約３３ヌクレオチド、約３４ヌクレオチド、約３５ヌクレオチド、約３６ヌクレオチド、約３７ヌクレオチド、約３８ヌクレオチド、約３９ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約４１ヌクレオチド、約４２ヌクレオチド、約４３ヌクレオチド、約４４ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド、約４８ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約５１ヌクレオチド、約５４ヌクレオチド、約５７ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約６３ヌクレオチド、約６６ヌクレオチド、約６９ヌクレオチド、約７２ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、またはさらには約１００ヌクレオチドから約２００ヌクレオチドなどの連続したヌクレオチド部分からなる配列領域を有する核酸分子は、例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティングでの使用に必要なハイブリダイゼーションプローブとして特に意図される。それよりも小さいフラグメントが、ハイブリダイゼーション実施形態で使用される。この場合、連続した相補的な領域の長さは、例えば、約１０ヌクレオチドと約１４ヌクレオチド、またはさらには約２５ヌクレオチド、約５０ヌクレオチドまたは約１００ヌクレオチドまでの間で変化し得るが、より大きな連続した相補的な部分を、検出したい相補的な配列の長さに従って使用することができる。
約１４ヌクレオチドの長さのハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定であり、かつ選択的な二重鎖分子の形成を可能にする。１４塩基を超える長さの領域の連続した相補的な配列を有する分子が、一般に好ましいが、ハイブリッドの安定性および選択性を増大させるために、それによって、そのような分子は、得られる特異的なハイブリッド分子の質および程度を改善する。一般に、約１５個〜約２５個の連続したヌクレオチド、所望する場合にはさらにより長い遺伝子−相補的領域を有する核酸分子を設計することが好ましい。
当然なことには、フラグメントはまた、機械的な剪断、または制限酵素消化などによる他の技術によって得ることができる。小さい核酸セグメントまたは５個のフラグメントは、例えば、自動化されたオリゴヌクレオチド合成機を使用して広く行われているような化学的な手段にフラグメントを直接合成することによって容易に調製することができる。フラグメントはまた、ＰＣＲTM（米国特許第４，６８３，２０２号および同第４，６８３，１９５号で例示される）などの核酸の再産生技術の適用によって、選択された配列を組換え産生用の組換えベクターに導入することによって、および分子生物学の当業者に一般に知られている他の組換えＤＮＡ技術によって得ることができる。
従って、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡフラグメントの相補的な領域を有する二重鎖を選択的に形成するそれらの能力のために使用することができる。考えられる適用に依存して、標的配列に対するプローブの様々な程度の選択性を得るために様々なハイブリダイゼーション条件を用いることが望ましい。高い選択性を必要とする適用に関して、典型的には、比較的ストリンジェントな条件を用いてハイブリッドを形成させることが望ましい。例えば、約０．０２Ｍ〜約０．１５ＭのＮａＣｌで、約５０℃〜約７０℃の温度によって提供されるなどの比較的低い塩および／または高温の条件が選択される。そのような選択的な条件は、プローブとテンプレートまたは標的鎖とのミスマッチが存在するとしても、そのようなミスマッチはほとんど許容されず、ＭＳＣＲＡＭＭをコードするＤＮＡセグメントの単離に特に適切である。ハイブリダイゼーションによってＤＮＡセグメントを検出することは、当業者によく知られている。米国特許第４，９６５，１８８号および同第５，１７６，９９５号（これらはそれぞれ、参照によりここに取込まれる）の開示は、ハイブリダイゼーション分析法を例示する。Ｍａｌｏｙら、１９９４年；Ｓｅｇａｌ、１９７６年；Ｐｒｏｋｏｐ、１９９１年；およびＫｕｂｙ、１９９４年の書籍において見出される教示は特に関連する。これらは、分子生物学的方法、ハイブリダイゼーションおよび指示される酵素消化、プラスミド構築、ＤＮＡおよびＲＮＡの配列決定、変異体構築、および分析、ならびに他の関連する方法に対する詳細な方法およびプロトコルを提供する。
もちろん、いくつかの適用に関して、例えば、存在するテンプレートにハイブリダイズする変異プライマー鎖を用いる変異体を調製することが望ましい場合、あるいはＭＳＣＲＡＭＭをコードする配列を、関連する種または機能的等価物などから単離しようとする場合、あまりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件が、ヘテロ二重鎖の形成を可能にするために典型的に必要される。このような環境において、約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩、約２０℃〜約５５℃の温度などの条件を用いることが望ましいことであり得る。従って、交差ハイブリダイズする種を、対照のハイブリダイゼーションに関して、ハイブリダイズする陽性シグナルとして容易に同定することができる。いずれの場合においても、条件は、ハイブリッド二重鎖を高温と同じような様式で不安定化するように作用するホルムアミドの添加量を増大させることによって、よりストリンジェントになり得ることが一般に理解される。このように、ハイブリダイゼーション条件は容易に操作することができる。従って、ハイブリダイゼーション条件は、一般には、所望の結果に依存して選択される。
いくつかの実施形態において、本発明の核酸配列を、ハイブリダイゼーションを測定するために適する手段（標識など）と組み合わせて用いることが好都合である。広範囲の様々な適する指示手段が当該分野では知られており、これには、蛍光、放射能、酵素または他のリガンド（アビジン／ビオチンなど）が含まれ、これらによって検出可能なシグナルを得ることができる。好ましい実施形態において、蛍光標識または酵素標識（ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼなど）を、放射能または他の環境に望ましくない試薬の代わりに用いることが非常に望ましい。酵素標識の場合、発色性の指示基質が知られており、これを用いて、肉眼または分光光度計的に認められる手段が提供され、相補的な核酸を含有するサンプルとの特異的なハイブリダイゼーションを同定することができる。
一般に、本明細書中に記載されるハイブリダイゼーションプローブは、溶液でのハイブリダイゼーションおよび固相を用いる実施形態の両方における試薬として有用であることが考えられる。固相が関与する実施形態において、試験ＤＮＡ（またはＲＮＡ）は吸着するか、そうでない場合には、選択されたマトリクスまたは表面に添加される。この固定された単鎖の核酸は、次いで、選択されたプローブを用いて所望の条件下で特異的なハイブリダイゼーションに付される。選択される条件は、（例えば、Ｇ＋Ｃ含有量、標的核酸のタイプ、核酸の起源、ハイブリダイゼーションプローブの大きさなどに依存して）必要とされる特定の基準に基づく特定の環境に依存する。ハイブリダイズした表面を洗浄して、非特異的に結合したプローブ分子を除くようにした後、特異的なハイブリダイゼーションの検出、または標識レベルによる定量化さえも行われる。
４．５．７ 核酸配列の使用方法
上記のように、いくつかの面において、本開示によって提供されるＤＮＡ配列情報によって、ブドウ球菌（化膿連鎖球菌およびＳ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅなど）から得られるｓｆｂ遺伝子、ｆｎｂＡ遺伝子またはｆｎｂＢ遺伝子、あるいは黄色ブドウ球菌から得られるｆｎｂＡ遺伝子またはｆｎｂＢ遺伝子の部分をコードする核酸配列、特に、本発明者らによってＦｎと結合することが示されたＡ１〜Ａ３およびＤ１〜Ｄ４の結合部位の上流に、それぞれ、位置するＡｕエピトープおよびＤｕエピトープを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズする能力を有する比較的短いＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列を調製することができる。これらの局面において、適する長さの核酸プローブが、使用される特定のＤＮＡセグメントの天然配列および大きさを考慮することに基づいて調製される。そのようなＤＮＡセグメントは、天然のＳｆｂ、ＦｎＢＡ、ＦｎＢＢ、ＦｎＢＰＡ、またはＦｎＢＰＢのエピトープのＤＮＡセグメントであり、あるいは本明細書中に開示される新規なペプチドのいずれかを作製するために部位特異的な変異が行われたＤＮＡセグメントであり得る。そのような核酸プローブが、対応するｓｆｂ、ｆｎＡ、ｆｎＢ、ｆｎｂＡ、またはｆｎｂＢの核酸配列、特に、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅのｆｎＡのＡｕ部位およびＡ１〜Ａ３部位、または黄色ブドウ球菌遺伝子のＤＵ部位およびＤ１〜Ｄ４部位の核酸配列に特異的にハイブリダイズする能力によって、それらは様々な実施形態において特異的に利用される。重要なことに、プローブは、所定のサンプルにおける病原性生物（特に、連鎖球菌およびブドウ球菌）の存在を検出するための様々な診断アッセイにおいて使用することができる。しかし、他の使用が考えられ、これには、タンパク質産物の発現、他の遺伝的構築物を調製する際に使用される１つ以上の変異種プライマーを調製するための配列情報の使用が含まれる。そのようなプライマーはまた、関連する細菌（特に、関連する連鎖球菌およびブドウ球菌）から得られるエピトープをコードする核酸セグメントの単離および同定に必要な診断組成物として使用することができる。
本発明によるいくつかの利点を得るために、ハイブリダイゼーション研究またはアッセイのために用いられる好ましい核酸配列は、少なくとも約１４または１５〜約２０程度のヌクレオチドの長さを有するか、またはそれに相補的である配列を含む。しかし、約３０〜約５０程度のヌクレオチドの配列もまた有用であると考えられる。長さが少なくとも１４〜１５または２０ヌクレオチドの大きさは、そのフラグメントが、安定かつ選択的な二重鎖分子の形成に十分な長さであることを確実にし得る。長さが１４〜１５または２０塩基を超える領域の相補的な配列を有する分子が、ハイブリッドの安定性および選択性を増大させるために、そしてそれによって、得られた特異的なハイブリッド分子の質および程度を改善するために一般には好ましい。このように、ｓｆｂ遺伝子、ｆｎＡ遺伝子、ｆｎＢ遺伝子、ｆｎｂＡ遺伝子、またはｆｎｂＢ遺伝子に相補的な部分の１４〜１５から２０〜２５までのヌクレオチド、またはさらにはそれよりも長いヌクレオチド（約３０ヌクレオチド、または約５０ヌクレオチド、または約１００ヌクレオチド、または所望する場合には、約２００ヌクレオチドでさえ）を有する核酸分子を設計することが一般に好ましい。そのようなフラグメントは、例えば、フラグメントを化学的な手段によって直接合成することによって、米国特許第４，６８３，２０２号のＰＣＲTMなどの核酸再産生技術の適用によって、組換え産生用の組換えベクターに導入することによって、容易に調製することができる。
本発明者らは、そのようなＤＮＡセグメントが、本明細書中に記載されるＳｆｂ、ＦｎＢＡ、ＦｎＢＢ、ＦｎＢＰＡおよびＦｎＢＰＢ由来ペプチドエピトープの過剰発現、および特定のエピトープ領域（化膿連鎖球菌のｓｆｂ遺伝子から得られるＰ１〜Ｐ４領域；ｆｎＡをコードするＳ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅのＦｎ結合タンパク質から得られるＡＵ領域およびＡ１〜Ａ３領域、黄色ブドウ球菌のｆｎｂＡ遺伝子のＤＵエピトープ領域およびＤ１〜Ｄ４エピトープ領域、ならびに黄色ブドウ球菌のｆｎｂＢ遺伝子から得られるＢ１〜Ｂ３領域）を含む天然および部位特異的変異誘発のＤＮＡセグメントを含有する組換えベクターの調製において利用されることをさらに意図する。
ＭＳＣＲＡＭＭタンパク質が多くの連鎖球菌およびブドウ球菌の病原体（黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、およびＳ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅを含む）によって発現している点で、本発明は、臨床サンプルにおけるｓｆｂ、ｆｎＡ、ｆｎＢ、ｆｎｂＡ、およびｆｎｂＢに特異的なＲＮＡまたはＤＮＡを検出するための診断的ハイブリダイゼーションアッセイの基礎として特に利用される。従って、感染の診断において使用することができる代表的な臨床サンプルは、細菌の核酸を含み得る任意のサンプルであり、中耳液、唾液、気管支肺胞液などが含まれる。そのようなサンプルは、起源がヒト、マウス、ウマ、ウシ、ネコ、ブタ、またはイヌであり得るし、ヒトおよび様々な被験体の両方でのブドウ球菌または連鎖球菌の感染の診断において使用することができる。様々なハイブリダイゼーション技術および系が知られており、これらは、米国特許第４，３５８，５３５号（これは参照によりここに取込まれる）に記載されているアッセイなどの診断アッセイを含む、本発明のハイブリダイゼーション局面に関連して使用することができる。家畜などの経済的に重要な動物、特に連鎖球菌またはブドウ球菌の感染に敏感な動物を含む非ヒトの哺乳動物起源、から得られるサンプルはまた、臨床的標本の基準を提供し得る。本発明の面において特定の診断方法および処置方法が見出されるような診断の例には、ウシの乳房炎が含まれ、あるいはウマの腺疫、肺炎、子宮内膜炎、および流産などの疾患および症状が含まれる。
従って、本発明のヌクレオチド配列は、ＭＳＣＲＡＭＭエピトープをコードする核酸セグメントの相補的な領域と二重鎖分子を選択的に形成するそれらの能力のために重要である。考えられる適用に依存して、標的配列に対するプローブの様々な程度の選択性を得るために様々なハイブリダイゼーション条件を用いることが望ましい。高い選択性を必要とする適用に関して、典型的には、比較的ストリンジェントな条件を用いてハイブリッドを形成させることが望ましい。例えば、約０．０２Ｍ〜約０．１５ＭのＮａＣｌで、約５０℃〜約７０℃の温度によって提供されるなどの比較的低い塩および／または高温の条件が選択される。このような条件は、特に選択的であり、プローブとテンプレートまたは標的鎖とのミスマッチが存在しても、そのようなミスマッチはほとんど許容されない。
もちろん、いくつかの適用に関して、例えば、存在するテンプレートにハイブリダイズする変異プライマー鎖を用いる変異体を調製することが望ましい場合、あまりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件が、ヘテロ二重鎖の形成を可能にするためには必要とされる。このような環境において、約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩、約２０℃〜約５５℃の温度などの条件が使用される。いずれの場合においても、条件は、ハイブリッド二重鎖を高温と同じような様式で不安定化するように作用するホルムアミドの添加量を増大させることによって、よりストリンジェントになり得ることが、一般に理解される。このように、ハイブリダイゼーション条件は容易に操作することができる。従って、ハイブリダイゼーション条件は、一般には、所望の結果に依存して選択される方法である。
ある実施形態において、核酸プローブを、変異ＭＳＣＲＡＭＭをコードするクローンを含有するクローン集団から変異体を単離することに用いることが望ましい。ある特定の実施形態において、固体培地で増殖するＭＳＣＲＡＭＭをコードする遺伝子の変異体を含有する変異クローンのコロニーは、配列変異体を含有するプローブと特定のコロニーに含有される核酸配列変異体との間のハイブリダイゼーションのみを得るようなハイブリダイゼーション条件および方法（コロニーブロットアッセイで使用される条件および方法など）を使用する２連のフィルターで同定することができる。このように、これらの遺伝子の短い変異配列を含有する小さなハイブリダイゼーションプローブを利用して、固体培地で増殖する完全な遺伝子の配列変異を含有するコロニーを同定することができる。次いで、これらのクローンを増殖させ、所望量の変異核酸配列または対応する抗原を得ることができる。
臨床診断実施形態において、本発明の核酸配列は、ハイブリダイゼーションを検出するために適する手段（標識など）と組み合わせられる。広範囲の様々な適する指示手段が当該分野では知られており、これには、放射能、酵素または他のリガンド（アビジン／ビオチンなど）が含まれ、これらによって検出可能なシグナルを得ることができる。好ましい実施形態において、酵素標識（ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼなど）を、放射能または他の環境に望ましくない試薬の代わりに用いることが非常に望ましい。酵素標識の場合、発色性の指示基質が知られており、これを用いて、肉眼または分光光度計的に認められる手段が提供され、病原体の核酸を含有するサンプルとの特異的なハイブリダイゼーションを同定することができる。
他の実施形態において、ＭＳＣＲＡＭＭ由来ＤＮＡ配列、あるいはその天然または合成の変異体を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲTM）アッセイにおける試薬として使用する場合、連鎖球菌単離物またはブドウ球菌単離物の高い選択的で高感度の検出が得られると考えられる。一般に、例えば、米国特許第４．６８３．２０２号に示されるようなＰＣＲTM技術を適用することによって、本明細書中に開示される核酸配列を、特にＭＳＣＲＡＭＭをコードする遺伝子の定義される領域、特に、サンプル中のＦｎＢＰコードの核酸セグメントのＰＣＲTM増幅を行うためのオリゴヌクレオチドプローブとして利用することができる。次いで、配列の増幅部分を、相補的な配列を含有するハイブリダイゼーションプローブによるハイブリダイゼーションによって検出することができる。このように、かなり低い濃度の核酸を、サンプルにおいて、開示された核酸配列を利用して検出することができる。
４．５．８ 核酸送達およびＤＮＡトランスフェクションの方法
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される核酸セグメントを使用して、適する宿主細胞をトランスフェクションすることが意図される。ＤＮＡを細胞内に導入するための技術は、当業者にはよく知られている。核酸セグメントを細胞に送達するための４つの一般的な方法を記載する：（１）化学的方法（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３年）；（２）マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８０年）、エレクトロポレーション（Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｎｅｕｍａｎｎ、１９８２；Ｆｒｏｍｍら、１９８５年）および遺伝子銃（Ｙａｎｇら、１９９０年）などの物理的方法；（３）ウイルスベクター（Ｌｕら、１９９３年；Ｅｇｌｉｔｉｓ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓ、１９８８年）；および（４）受容体媒介機構（Ｃｕｒｉｅｌら、１９９１年；Ｗａｇｎｅｒら、１９９２年）。
４．５．９ リポソームおよびナノカプセル
いくつかの実施形態において、本発明者らは、リポソームおよび／またはナノカプセルを使用して、特定のペプチドまたは核酸セグメントを宿主細胞に導入することを意図する。そのような処方物は、本明細書中に開示される核酸、ペプチド、および／または抗体の薬学的に受容可能な処方物の導入に好ましくあり得る。リポソームの処方および使用は、当業者に一般的に知られている（例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９７７年を参照のこと：これは、細胞内細菌感染および疾患の標的化抗生物療法におけるリポソームおよびナノカプセルの使用を記載する）。最近、血清安定性および循環半減期が改善されたリポソームが開発された（Ｇａｂｉｚｏｎ ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、１９８８年；Ａｌｌｅｎ ａｎｄ Ｃｈｏｕｎ、１９８７）。
ナノカプセルは、一般に、化合物を安定で再現性のある方法で包むことができる（Ｈｅｎｒｙ−Ｍｉｃｈｅｌｌａｎｄら、１９８７年）。細胞内ポリマー過大負荷による副作用を避けるために、そのような極微細粒子（約０．１μｍの大きさ）を、インビボで分解し得るポリマーを使用して設計しなければならない。これらの条件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートのナノ粒子は、本発明における使用が意図される。そのような粒子は、記載（Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９７７年；１９８８年）に従って容易に作成することができる。
リポソームは、水性媒体に分散され、自発的に多重膜の同心状二重層ベシクル（多重膜ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理によって、水溶液をコアに含有する２００〜５００Ｃの範囲の直径を有する小さな単膜ベシクル（ＳＵＶ）を生成する。
Ｃｏｕｖｒｅｕｒら（１９８８年）の教示に加えて、下記の情報を、リポソーム処方物を作製する際に利用することができる。リン脂質は、脂質対水のモル比に依存して、水中に分散されたときのリポソーム以外の様々な構造を形成し得る。低い比において、リポソームは好ましい構造である。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、および２価イオンの存在に依存する。リポソームはまた、イオン性基質および極性基質に対する低い透過性を示し得るが、温度を上げると、その透過性が著しく変化する相転位が生じる。相転位は、十分に詰まった秩序性構造（ゲル状態として知られている）からゆるく詰まった秩序性がなくなった構造（流動状態として知られている）への変化を伴う。これは特徴的な相転位温度で生じ、その結果、イオン、糖、および薬剤に対する透過性が増大する。
リポソームは、４つの異なる機構を介して細胞と相互作用する。細網内皮細胞系の食作用細胞（マクロファージおよび好中球など）によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水結合または静電力によるか、または細胞表面成分との特異的な相互作用によるかのいずれかによる細胞表面への吸着；リポソーム内容物の細胞質内への放出を伴うリポソーム脂質二重層のプラスマ膜への挿入によるプラスマ細胞膜との融合；およびリポソーム内容物の解離を伴わない、リポソーム脂質の細胞膜または細胞間膜への移動あるいはその逆による。多くの場合、どの機構が作用しているか、そして１つ以上の機構が同時に作用し得るかを決定することは困難である。
４．５．１０ 組換え宿主細胞およびベクター
本発明の特定の局面は、組換えペプチド、および天然または部位特異的変異処理のいずれかのＭＳＣＲＡＭＭエピトープを取り込んでいる特定のペプチドのクローニングおよび発現を行うためのプラスミドベクターの使用に関する。組換えベクターの作製、宿主細胞の形質転換、および組換えタンパク質の発現は、当業者によく知られている。原核生物宿主は本発明のペプチド組成物の発現に好ましい。原核生物宿主のいくつかの例は、大腸菌のＪＭ１０１株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＲＲ１株、ＬＥ３９２株、Ｂ株、Ｘ１７７６株（ＡＴＣＣ番号第３１５３７号）およびＷ３１１０株（Ｆ−、λ−、原栄養性、ＡＴＣＣ番号第２７３３２５号）である。腸内細菌科の種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓなど）およびグラム陰性の宿主（様々なＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属の種など）もまた、本明細書中に開示される遺伝的構築物の組換え発現に利用することができる。
あるいは、グラム陽性の球菌（黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ、およびＳ．ｈｏｍｉｕｓなど）および桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなど）はまた、このような構築物の発現およびそれから得られる天然ペプチドまたは組換えペプチドの単離のために使用することができる。
一般に、宿主細胞と適合し得る種から得られるレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位、ならびに形質転換細胞における表現型選択を提供し得るマーカー配列を有する。例えば、大腸菌は、典型的に、ｐＢＲ３２２またはその任意の誘導体（Ｂｏｌｉｖａｒら、１９７７年）などのベクターを使用して形質転換することができる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、従って、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミド、あるいはバクテリオファージはまた、内在性タンパク質の発現のために微生物が使用し得るプロモーターを含有し得るか、または含有するように改変することができる。
さらに、宿主微生物と適合し得るレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターを、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭTM−１１などのバクテリファージは、大腸菌 ＬＥ３９２などの感受性の宿主細胞形質転換するために使用され得る組換えベクターを作製する際に利用することができる。
組換えＤＮＡ構築物において一般的に使用されるそのようなプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースのプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、１９７８年；Ｉｔａｋｕｒａら、１９７７年；Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９年）またはトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９８０年）を含む。組換えおよび天然のプロモーターの使用は、当業者によく知られている。それらのヌクレオチド配列および具体的な方法論に関する詳細は公開されており、当業者は、本発明の組成物を製造するために特定の組換えベクターおよび発現系を構築することは可能である。
原核生物における好ましい実施形態の発現に加えて、真核生物（酵母培養物など）はまた、本明細書中に開示される方法を関連して使用することができる。ビール酵母菌または一般的なパン酵母は、真核微生物の中で最も一般的に使用される。しかし、多数の他の種もまた、そのような真核生物発現系のために用いることができる。酵母菌属での発現に関して、例えば、プラスミドＹＲｐ７が一般的に使用される（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、１９７９；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、１９７９年；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、１９８０年）。このプラスミドは、既に、トリプトファン存在下での生育能力を欠失している変異株（例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、１９７７年））に対する選択マーカーを提供するｔｒｐＬ遺伝子を含有する。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの特性としてのｔｒｐＬ損傷の存在は、トリプトファン非存在下での生育による形質転換を検出するために効果的な環境を提供する。
酵母ベクターにおける適切なプロモーター配列は、３−ホスホグリセロリン酸キナーゼのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、１９８０年）、またはエノラーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどの他の糖分解酵素のプロモーター（Ｈｅｓｓら、１９６８年；Ｈｏｌｌａｎｄら、１９７８年）を含む。適切な発現プラスミドを構築する際、これらの遺伝子と結合する終了配列はまた、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終了を提供するために発現することが望ましい配列の発現ベクター３Ｎ内に連結される。転写が生育条件によって制御されるというさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２，イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および上記のグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用に関与する酵素に対するプロモーターである。酵母適合性プロモーター、複製起点および終了配列を含有する任意のプラスミドベクターは適切である。
微生物に加えて、多細胞生物から得られる細胞の培養物はまた、開示された方法の日常的な実施における宿主として使用することができる。原理的には、そのような細胞培養物はどれも、脊椎動物または無脊椎動物の培養物にかかわらず、使用することができる。しかし、脊椎動物細胞において、最大の利益が得られる。脊椎動物細胞の培養での増殖（組織培養）は、近年、日常的な手順になっている。そのような有用な宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ならびにＷ１３８細胞株、ＢＨＫ細胞株、ＣＯＳ−７細胞株、２９３細胞株、およびＭＤＣＫ細胞株である。そのような細胞に対する発現ベクターは、通常、（必要ならば）、複製起点、発現され得る遺伝子の前方に位置するプロモーターを、任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終了配列と一緒に含む。
哺乳動物細胞における使用に関して、発現ベクターの制御機能は、多くの場合、ウイルス物質によって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、および最も頻繁にはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）から誘導される。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは特に有用である。なぜなら、その両方は、ウイルスから、ＳＶ４０ウイルスの複製起点をもまた含有するフラグメントとして容易に得られるからである（Ｆｉｅｒｓら、１９７８年）。より小さなＳＶ４０フラグメントまたはより大きなＳＶ４０フラグメントはまた、ウイルスの複製起点内に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位に向かって拡がる約２５０ｂｐの配列を含むならば、使用することができる。さらに、所望の遺伝子配列と通常結合するプロモーターまたは制御配列を利用することもまた、そのような制御配列が宿主細胞系と適合し得るならば、可能であり、多くの場合、望ましい。
複製起点は、下記のいずれかのようにして、外来性の起点を含むようにベクターを構築して例えば、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）源から誘導し、または宿主細胞の染色体複製機構により得られる。ベクターが宿主細胞の染色体内に組み込まれるならば、後者は、多くの場合、十分である。
４．５．１１ ｐＱＥTM
ｐＱＥTM（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｃａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）は、１０個〜２５個の長さのアミノ酸担体が、６個の連続したヒスチジン残基を含有する融合タンパク質を産生する。このＨｉｓ6配列は、イミノ二酢酸で誘導体化され、Ｎｉ+イオンでキレート化されたセファロース６Ｂ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムでの迅速な精製を可能にする。本発明者らは、この系が、本発明のペプチド組成物を調製するための非常に有効な発現系であり、１Ｌの大腸菌培養物あたり５０ｍｇまでの純粋な組換えタンパク質が得られることを明らかにした。組換えｐＦｎＢＤプラスミドを有する大腸菌 ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）の一晩培養物を、５０ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１ＬのＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で１：５０に希釈する。大腸菌細胞を、培養物のＯＤ６００が０．５〜０．８に達するまで生育させる。次いで、ｒＦｎＢＤタンパク質の発現を、ＩＰＴＧを最終濃度が０．２ｍＭになるように添加することによって誘導する。３時間の誘導の後、細胞を遠心分離によって集め、１５ｍＬの緩衝液Ａ（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ Ｎａｃｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）に再懸濁し、２０，０００ｌｂ／ｉｎ2で２回フレンチプレスに通すことによって溶解する。細胞破片を５０，０００×ｇで１０分間遠心分離することによって除き、上清を０．４５μＭのフィルターに通す。組換えタンパク質を、Ｎｉ2+を負荷したイミノ二酢酸／セファロース６Ｂ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）カラムを使用する固定化金属キレートクロマトグラフィーによって精製する（Ｐｏｒａｔｈら、１９７５年；Ｈｏｃｈｕｌｉら、１９８８年）。ｒＦｎＢＤ−ＡまたはｒＦｎＢＤ−ＢおよびｒＦｎＢＤ−ＤまたはｒＦｎＢＤ−Ｐを産生する細胞から得られる上清を、それぞれ、１．５ｍＬおよび０．７ｍＬを負荷した樹脂と混合する。予備実験により、これらの量の樹脂は、上清中の組換えタンパク質の濃度に最適であることが明らかにされた。混合物を１５分間振盪しながらインキュベーションする。結合したタンパク質を有する樹脂を遠心分離（１０００×ｇ、５分間）し、１０ｍＬの緩衝液Ａで２回洗浄し、カラムに移す。引き続いて、カラムを１０ｍＬ〜２０ｍＬの緩衝液Ａでさらに洗浄する。タンパク質を、４０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．９で溶出する。溶出したタンパク質をＰＢＳに対して透析し、イミダゾールを除く。ｒＦｎＢＤタンパク質のポリヒスチジンリーダーは、本発明者らの実験室で製造された他のポリヒスチジン融合タンパク質と比較した場合、Ｎｉ2+−キレートカラムに対して比較的低いアフィニティを有する。過剰量の樹脂を使用すれば、組換えタンパク質には、樹脂に対するアフィニティを有し、１０ｍＭ〜５０ｍＭのイミダゾールで溶出される細胞性タンパク質が混入するようになる。使用する負荷樹脂の能力は、意図的に、上清中に存在するすべての組換えタンパク質を結合するのに必ずしも十分でないようにする。このような手順により、３０ｍｇのｒＦｎＢＤ−ＡおよびｒＦｎＢＤ−Ｂ、ならびに１５ｍｇのｒＦｎＢＤ−ＤおよびｒＦｎＢＤ−Ｐが純粋な物質で得られる。
４．５．１２ ｐＧＥＸ
ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｌｔｄ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）は、担体のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼによるグルタチン−セファロースカラムの１段階精製を可能にする組換えタンパク質をコードする（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９８８年）。この系は、ＥＬＩＳＡ型またはウエスタンブロット型のアッセイにおいて使用されるマイクロタイタープレートまたはニトロセルロースメンブレンに効果的に結合するペプチドの産生に好都合である。これらの場合、より長い担体タンパク質を有する融合タンパク質を生成するｐＧＥＸ系は、有用な代わりの発現系である。この系の別の利点は、担体のちょうどＣ末端に導入され、一旦合成された担体タンパク質からタンパク質をはずすことを可能にする選択的なタンパク質切断部位が利用できることである。
４．５．１３ ｐＭＡＬ
ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）は、マルトース結合タンパク質との融合タンパク質をコードし、再度ではあるが、これによって、下記の手順による迅速なアフィニティ精製を可能にする。目的の遺伝子を、ｐＭＡＬＪ−ｐ２ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に、ｍａｌＥシグナル配列および（マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする）遺伝子の下流に読み枠を合わせてクローン化する。組換えプラスミドを大腸菌に形質転換し、培養して、ＩＰＴＧを培養培地に添加することによって、ＭＢＰ融合タンパク質の過剰産生を誘導する。次いで、ＭＢＰ融合タンパク質を、Ｒｉｇｇｓら、１９９２年；Ｍａｉｎａら、１９８８年の記載に従って精製することができる。担体のために、発現した融合タンパク質は、ジスルフィド結合が生成し得るペリスラズマ空間に輸送される。この系は、ＦｎのＩ型領域の製造に特に有用であるが、これもまた、本発明の多くのペプチドを調製するために使用することができる。
４．５．１４ ｐＢＶＬ
ｐＢＶＬ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）は、昆虫細胞をトランスフェクションし、真核生物細胞において相当量（１〜３ｍｇ／ｌ）の組換えタンパク質を産生するＢａｃｕｌｏ ＧｏｌｄTM系と連携して使用することができる。この系は、組換え型の宿主−リガンドタンパク質の産生に特に好ましい。
そのように調製される組換えタンパク質は、本発明の様々な実施形態において利用され、免疫アッセイ試薬、感受性動物における免疫応答の生成に必要な抗原調製、ワクチン処方物、および能動的で活性な免疫化法における使用のための抗体産生に必要な基質が含まれる。組換えタンパク質の大規模調製に関しては、下記の手順を使用することができる。発現プラスミドを有する大腸菌 ＪＭ１０９（ｓｕｐＥ、ｅｎｄＡ、ｓｂｃＢ１５、ｈｓｄ Ｒ４、ｒｐｓＬ、ｔｈｉ）（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）（Ｆ’ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ+ ｌａｃＩqＺ）Ｍ１５）、大腸菌 ＪＭ１０５（ｓｕｐＥ、ｔｈｉ）（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）（Ｆ’ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ+ ｌａｃＩqＺ）Ｍ１５）、ＴＧ１（ｓｕｐＥ、ｈｓｄ）５、ｔｈｉ）（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）+（Ｆ’ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ ｌａｃＺ（Ｍ１５））（Ｃａｒｔｅｒら、１９８５年）、またはＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の一晩飽和培養物を、アンピシリンを補充したＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で１：５０に希釈し、培養物のＯＤ600が０．６〜０．７に達するまで生育させる。イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）（最終濃度０．２ｍＭ）を細胞に添加し、さらに２．５〜５時間３７℃で生育させる。細菌を遠心分離によって集め、細菌ペレットをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭリン酸、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で再懸濁する。細胞を、２０，０００ＬＢ／ｉｎで２回フレンチプレス（ＳＬＭ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｃ．、Ｕｒｂａｎａ、ＩＬ）に通すことによって溶解する。細菌溶解物を１０２，０００×ｇで１０分間遠心分離して、細菌破片を除く。可溶性タンパク質を含有する上清を、０．４５μＭメンブレン（Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）でろ過して、さらなる精製のために保存する。
４．５．１５ スクリーニングアッセイ
形質転換した宿主細胞を、天然および人工的に誘導した化合物または混合物のスクリーニングにおいて使用し、本発明のＦｎＢＰ類と複合体を形成し得るものを選択することができる。これは、微生物のＦｎ結合能を阻害するか、またはそうでなければ破壊するか、または増強さえする化合物の検索において有用であり得る。効果的な薬学的薬剤が、特定のＭＳＣＲＡＭＭエピトープと複合体を形成する化合物を同定することによって開発できることが意図される。そのような化合物には、例えば、天然起源（植物、動物および海洋起源など）から単離される化合物、および様々な合成化合物が含まれる。このように試験され得る天然または人工の化合物はまた、様々な無機質およびタンパク質、ペプチドまたは抗体を含む。
４．５．１６ 部位特異的変異誘発
部位特異的変異誘発は、個々のペプチドあるいは生物学的な機能等価物のタンパク質またはペプチドの、元になるＤＮＡの特異的な変異誘発による調製における有用な技術である。当業者に十分に知られているこの技術は、例えば、１つ以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡに導入することによって、１つ以上の前記の検討事項を取り入れている配列変異体の調製および試験を容易に行い得ることをさらに提供する。部位特異的変異誘発は、所望の変異、ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドのＤＮＡ配列をコードする特異的なオリゴヌクレオチド配列の使用による変異体の産生を可能にする。そのようなオリゴヌクレオチド配列は、交差する欠失接合部の両側で安定な二重鎖を形成するのに十分な大きさおよび配列多様性のプライマー配列を提供する。典型的には、長さが約１４ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドのプライマーが好ましく、接合部の両側での約５残基〜約１０残基の配列が変化する。
一般に、部位特異的変異誘発の技術は、様々な出版物により例示されるように、当該分野では十分に知られている。理解されるように、この技術は、典型的には、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを用いる。部位特異的変異誘発において有用な典型的なベクターは、Ｍ１３ファージなどのベクターを含む。これらのファージは市販されている。それらの使用は、一般に、当業者には十分に知られている。二本鎖プラスミドもまた、目的の遺伝子をプラスミドからファージに移す工程を省く部位特異的変異誘発において日常的に用いられる。
一般に、本明細書による部位特異的変異誘発は、最初に、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列内に含む一本鎖ベクターを得ること、またはそのような二本鎖ベクターの２つの鎖を融解して離すことによって行われる。所望の変異配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを、一般的には合成によって調製する。次いで、このプライマーを一本鎖ベクターとアニールし、変異を有する鎖の合成を完全に行うために、大腸菌のポリメラーゼＩクレノウフラグメントなどのＤＮＡ重合化酵素で処理する。このようにして、ヘテロ二重鎖が得られる。この場合、一方の鎖は、元の非変異配列をコードし、第２鎖は所望の変異を有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターを使用して、適する細胞（大腸菌細胞など）を形質転換する。変異配列配置を有する組換えベクターを含むクローンを選択する。
選択ペプチドをコードするＤＮＡセグメントの配列変異体の、部位特異的変異誘発を使用する調製は、潜在的に有用な種を産生する手段として提供され、それらが、ペプチドおよびそれをコードするＤＮＡ配列の配列変異体を得ることができる他の方法であると限定することを意味しない。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターを変異剤（ヒドロキシルアミンなど）で処理して、配列変異体を得ることができる。このような方法およびプロトコルに関する詳細な説明は、Ｍａｌｏｙら、１９９４年；Ｓｅｇａｌ、１９７６年；Ｐｒｏｋｏｐ ａｎｄ Ｂａｊａｉ、１９９１年；Ｋｕｂｙ、１９９４年；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２年の教示に見出される。これらのそれぞれは、その目的に関して、参照によりここに取込まれる。
４．５．１７ 生物学的機能等価物
改変および変化を、本発明のペプチドの構造において、そしてそれらをコードし、所望の特徴を有するタンパク質またはペプチドをコードする機能的な分子を依然として生成するＤＮＡセグメントの構造において行うことができる。以下は、等価物または改善された第２世代の分子さえも作製するために、タンパク質のアミノ酸を変化させることに基づく検討である。アミノ酸の変化は、表１に従って、ＤＮＡ配列のコドンを変えることによって達成することができる。
例えば、いくつかのアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子の結合部位などの構造体との相互的な結合能の認められるほどの喪失を伴うことなく、タンパク質において他のアミノ酸に置換することができる。タンパク質の相互作用的な能力および性質は、タンパク質の生物学的な機能活性を規定するため、いくつかのアミノ酸置換をタンパク質配列、および当然、その元となるＤＮＡのコード配列において行うことができ、それにもかかわらず、同様な特性を有するタンパク質を得ることができる。従って、開示された組成物のペプチド配列、またはそのようなペプチドをコードする対応ＤＮＡ配列において、それらの生物学的な利用性または活性の認められるほどの喪失を伴うことなく、様々な変化を行い得ることが本発明者らによって意図される。
Figure 0005124062
そのような変化を行う際、アミノ酸のハイドロパシー指数が考慮され得る。関する相互作用的な生物学的機能をタンパク質に付与する際のアミノ酸ハイドロパシー指数の重要性は、当該分野では一般に理解されている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年：これは参照によりここに取込まれる）。相対的アミノ酸ハイドロパシーは、得られるタンパク質の二次構造に寄与することが認められている。タンパク質の二次構造は、次いで、タンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。それぞれのアミノ酸は、下記のような、その疎水性および電荷の特性に基づいてハイドロパシー指数が与えられている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年）。イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
いくつかのアミノ酸は、類似のハイドロパシー指数またはスコアを有するタンパク質のアミノ酸によって置換することができ、その結果、それでも、類似の生物学的な活性を有するタンパク質を得ることができる：すなわち、依然として、生物学的な機能等価タンパク質を得ることができることが当該分野で知られている。そのような変化を行う際、ハイドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸が特に好ましく、±０．５以内であるアミノ酸がなお特により好ましい。同様なアミノ酸の置換を、親水性に基づいて効果的に行い得ることもまた、当該分野では理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（これは参照によりここに取込取まれる）は、隣接アミノ酸の親水性によって影響を受けるタンパク質の最大の局所的な平均的親水性は、タンパク質の生物学的特性と相関していることを述べている。
米国特許第４，５５４，１０１号に詳しく記載されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に与えられている。アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を、類似の疎水性値を有する他のアミノ酸に置換することができ、生物学的等価物、特に免疫学的等価タンパク質を得ることもできることが理解される。そのような変化において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±０．５以内であるアミノ酸がなお特により好ましい。
上記のように、従って、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖の置換基の相対的な類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさなど）に基づく。前記の様々な特徴を考慮した置換の例は、当業者は十分に知られており、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、セリンとトレオニン、グルタミンとアスパラギン；およびバリン、ロイシンとイソロイシンを含む。
４．６ 抗体組成物およびその製剤
抗血清から単離した抗体は、例えば、連鎖球菌またはブドウ球菌などの微生物、またはフィブリノーゲン結合タンパク質の特異的検出に、または研究手段として有用である。本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、サル化抗体、およびヒト化抗体並びにＦａｂフラグメント（Ｆａｂ免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含む）を含む。
抗体の製造および同定法は、当分野でよく知られている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、１９８８参照、引用によりここに援用する）。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の製造法は、一般的に、ポリクローナル抗体の製造法と同じ経路に沿って始まる。簡潔には、ポリクローナル抗体は、本発明に記載の免疫原性組成物で動物を免疫化し、免疫化した動物から抗血清を回収することにより製造される。広範囲の動物種を抗血清の製造に使用することができる。典型的には、抗―抗血清の製造に使用する動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはヤギである。ウサギは比較的に血液量が多いことから、ウサギがポリクローナル抗体の産生に好んで選択される。
当分野ではよく知られているように、得られた組成物はその免疫原性が異なり得る。それ故、しばしば宿主免疫系を高めることが必要であり、これはペプチドまたはポリペプチド免疫原を担体に結合させることにより行い得る。例示的および好ましい担体は、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。卵アルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンも担体として使用できる。ポリペプチドを担体タンパク質にコンジュゲートさせる方法は、当分野でよく知られており、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビスビアゾ化ベンジジンを含む。
当分野でもよく知られているように、特定の免疫原性組成物の免疫原性は、免疫応答の非特異的刺激物質（アジュバントとして知られる）の使用により高めることができる。例示的および好ましいアジュバントには、完全フロイントアジュバント（死菌結核菌を含む免疫応答の非特異的刺激物質）、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントを含む。
ポリクローナル抗体の産生に使用する免疫原性組成物の量は、免疫原の性質並びに免疫化に使用する動物により変化する。免疫原の投与に、種々の経路を使用することができる（皮下、筋肉内、皮内、静脈内および腹膜内）。ポリクローナル抗体の産生は、種々の時点で免疫化動物の血液をサンプリングし、免疫化することにより監視し得る。第二の追加抗原注入も行い得る。追加抗原刺激および抗体価測定のプロセスは、適当な抗体価が得られるまで反復する。所望のレベルの免疫原性が得られれば、免疫化動物から採血し、血清を単離および貯蔵することができ、および／または動物を使用してｍＡｂを産生することができる。
ｍＡｂは、米国特許第４，１９６，２６５号（引用によりここに援用する）に例示されているような、よく知られている技術の使用により容易に製造し得る。典型的には、この技術には、適当な動物を、選択した免疫原性組成物、例えば、精製または部分精製タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドで免疫化することを含む。免疫化組成物は、抗体産生細胞を刺激するのに効果的な方法で投与する。マウスおよびラットなどのネズミが好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジフロッグ細胞の使用もまた可能である。ラットの使用にはいくつかの利点があるが（Ｇｏｄｉｎｇ，１９８６）、マウスが好ましく、ＢＡＬＢ／ｃマウスが最も好ましいためこれが最も慣用的に使用され、一般的に高い割合で安定した融合が得られる。
免疫化後、抗体を産生できる体細胞、特にＢ―リンパ球（Ｂ細胞）を、ｍＡｂ産生プロトコールに使用するために選択する。これらの細胞は、生検脾臓、扁桃またはリンパ節から、または末梢血液サンプルから得られ得る。脾臓細胞および末梢血液細胞が好ましい。なぜなら、前者は分裂している形質芽細胞段階にある抗体産生細胞が豊富なソースであり、後者は末梢血液は容易に入手できるためである。しばしば、一群の動物を免疫化し、最も高い抗体価をもつ動物の脾臓を取り出し、シリンジで脾臓をホモジナイズすることにより脾臓リンパ球を得る。典型的には、免疫化マウスの脾臓は、約５×１０7から約２×１０8リンパ球を含む。
次いで、免疫化動物の抗体産生Ｂリンパ球を、不死化ミエローマ細胞、一般的には免疫化した動物と同種の１つの細胞と融合させる。ハイブリドーマ産生融合方法における使用に適したミエローマ細胞系は、好ましくは、抗体を産生せず、高い融合効率および、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの生育を支持する特定の選択培地における生育を不可能とする酵素欠損を有する。
どのミエローマ細胞の１つを使用してもよく、これは当業者には公知である（Ｇｏｄｉｎｇ，１９８６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８４）。例えば、免疫化動物がマウスである場合、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌを使用し得、ラットには、Ｒ２１０ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、および４Ｂ２１０を使用し得、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６は全てのヒト細胞融合と関連して有用である。
１つの好ましいネズミ・ミエローマ細胞は、ＮＳ−１ミエローマ細胞系（Ｐ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１とも呼ばれる）であり、これは細胞系貯蔵番号ＧＭ３５７３を要求することでＮＩＧＭＳ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから容易に入手できる。使用し得る別のマウス・ミエローマ細胞系は、８−アザグアニン−耐性マウスネズミミエローマＳＰ２／０非産生細胞系である。
抗体産生脾臓またはリンパ節細胞およびミエローマ細胞のハイブリッドの産生法は、通常、体細胞とミエローマ細胞をそれぞれ２：１比で（しかしこの比は約２０：１から約１：１まで変化し得る）、細胞膜の融合を促進する物質（化学的または電気的）の存在下で混合することからなる。センダイウイルスを用いる融合法が記載されており（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５；１９７６）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧを用いたものはＧｅｆｔｅｒら（１９７７）により記載されている。電気誘導融合法の使用もまた適当である（Ｇｏｄｉｎｇ，１９８６）。
融合法により、通常、約１×１０6から約１×１０-8の低頻度で生存可能なハイブリッドが産生され得る。しかし、生存可能な融合ハイブリッドは、選択培地で培養することにより、親の非融合細胞（特に、通常は際限なく分化し続ける非融合ミエローマ細胞）から識別されるので、このことは問題ではない。選択培地は、一般的に、組織培養培地におけるヌクレオチドのデノボ合成を阻害する物質を含むものである。例示的および好ましい物質はアミノプテリン、メトトレキセートおよびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキセートはプリンおよびピリミジンの両方のデノボ合成を阻害するが、アザセリンはプリン合成のみを阻害する。アミノプテリンまたはメトトレキセートを使用する場合、培地にヌクレオチド源としてヒポキサンチンおよびチミジンを追加する（ＨＡＴ培地）。アザセリンヌクレオチドを使用する場合、培地にヒポキサンチンを追加する。
好ましい選択培地はＨＡＴである。サルベージ経路を作動できる細胞のみがＨＡＴ培地で生存することが可能である。メラノーマ細胞は、サルベージ経路の鍵酵素、例えばヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）などが欠損しており、生存できない。Ｂ細胞はこの経路を作動できるが、培養中において限られた寿命しかなく、一般的に約２週間以内で死滅する。それ故、選択培地で生存できる細胞のみが、ミエローマおよびＢ細胞から形成されたハイブリッドである。
この培養により一群のハイブリドーマが得られ、この中から特異的ハイブリドーマを選択する。典型的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートに単一クローンを希釈して細胞を培養し、次いで、所望の反応性について個々のクローン上清を試験（約２から３週間後）することにより行う。アッセイは、高感度、簡易および迅速であるべきであり、例えばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドットイムノ結合アッセイ等がある。
次いで、選択したハイブリドーマを連続希釈し、個々の抗体産生細胞系にクローン化し、次いで、そのクローンを無限に増殖させてｍＡｂを得ることができる。細胞系は２つの基本的な方法でｍＡｂ産生に利用し得る。ハイブリドーマのサンプルを、原融合の体細胞およびミエローマ細胞を得るのに使用された組織適合性動物型に（しばしば腹膜腔に）注入することができる。注入された動物に、融合細胞ハイブリッドにより産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍が発生する。次いで、血清または腹水などの動物の体液を採ると、高濃度のｍＡｂを得ることができる。個々の細胞系はまたインビトロでも培養し得、ここでｍＡｂは自然に培養培地に分泌され、これからそれらを高濃度で容易に得ることができる。いずれの方法で産生されたｍＡｂも、所望であれば、濾過、遠心およびＨＰＬＣまたはアフィニティクロマトグラフィーなどの種々のクロマトグラフィー法を用いてさらに精製し得る。
それ故、本発明は、９Ｃ３および１１Ａ５と呼ばれるモノクローナル抗体と同じ抗原または同じエピトープ部位に結合する抗体コンジュゲートおよびイムノトキシンなどの、抗−フィブロネクチン結合タンパク質抗体および抗体−基礎組成物を包含する。かかる抗−フィブロネクチン結合タンパク質抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル型であり得、モノクローナルが一般的に好ましい。
モノクローナル抗体９Ｃ３または１１Ａ５と同じ抗原、または同じエピトープに結合する抗体の同定は、かなり簡単な事柄である。これは、抗体競合を測定できる種々の免疫学的スクリーニングアッセイのどれでも１つを用いて容易に決定できる。
例えば、試験する試験抗体が、９Ｃ３または１１Ａ５とは異なる源から、例えばウサギから得られるか、または異なるアイソタイプである場合、簡単な競合アッセイを行い得、すなわち、９Ｃ３または１１Ａ５および試験抗体を事前に混合し、次いで、抗原組成物に適用する。「抗原組成物」は、使用しやすい形の、黄色ブドウ球菌 ｆｎｂＡ由来のＤ３モチーフ（Ｄ３20-33；ＱＦＧＧＨＮＳＶＤＦＥＥＤＴ；配列番号６１）のアミノ酸２０−３３に対応するペプチドである９Ｃ３および１１Ａ５により認識される抗原を含む（これは組織サンプルおよび種々の形の精製または半精製抗原を含む）任意の組成物を意味する。従って、免疫組織化学的アッセイ、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットに基づくプロトコールは、かかる簡易な競合試験における使用に適している。
かかる実施形態において、９Ｃ３または１１Ａ５抗体と変化量の試験抗体（例えば１：１、１：１０および１：１００）を、例えば動物標本、ＥＬＩＳＡプレートの抗原被覆ウェルまたは膜に吸着させた抗原（例えばドットブロットおよびウエスタンブロット）などの抗原組成物に適用する前にしばらくの間、事前に混合する。いずれかに抗−ネズミ二次抗体を用いることにより、結合９Ｃ３または１１Ａ５抗体のみを検出することができ、その結合は、モノクローナル抗体９Ｃ３および／または１１Ａ５と同一のエピトープ／抗原を認識する試験抗体の存在により減少する。
９Ｃ３および／または１１Ａ５および任意の試験抗体との間の抗体競合研究を実施するために、始めに、例えばビオチンなどの検出可能な標識ラベルまたは酵素、放射活性または蛍光ラベルで９Ｃ３または１１Ａ５を標識して、続いて同定できるようにする。これらの場合、標識抗体を、種々の割合（例えば１：１、１：１０および１：１００）で、試験する抗体（試験抗体）と共にインキュベートし、適当な時間の経過後に、標識９Ｃ３または１１Ａ５抗体の反応性をアッセイし、これを競合する効力のある（試験）抗体がインキュベート中には全く含まれていなかった対照値と比較する。
アッセイは、抗体ハイブリダイゼーションに基づく一連の免疫学的アッセイのいずれでもよく、９Ｃ３または１１Ａ５抗体は、例えばビオチニル化抗体の場合にはストレプトアビジンを用いて、または酵素ラベルについては色素基質を用いて、または単純に放射活性または蛍光ラベルを検出することによるといったその標識を検出することにより検出される。実質的に９Ｃ３または１１Ａ５と同一のエピトープ／抗原に結合する抗体は、効果的に結合競合し、従って、標識抗体結合における減少により実証された通り、有意に９Ｃ３または１１Ａ５結合は減少する。この場合、標識９Ｃ３または１１Ａ５抗体の試験抗体との混合後における、残余活性を測定するに適当なアッセイは、例えば、黄色ブドウ球菌 ｆｎｂＡ由来のＤ３モチーフ（Ｄ３20-33；ＱＦＧＧＨＮＳＶＤＦＥＥＤＴ；配列番号６１）のアミノ酸２０−３３に対応するペプチドを用いた、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンまたはドットブロット、Ｄ20-33を含むタンパク質の免疫沈降；Ｄ３20-33を含むタンパク質を発現する組換え細胞のＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたは蛍光抗体染色；連鎖球菌またはブドウ球菌などの微生物の間接的蛍光抗体染色；ＦＡＣＳまたは間接的蛍光抗体法によるフィブロネクチン結合タンパク質細胞表面決定基との反応性を含む。
試験抗体の非存在下での、標識９Ｃ３または１１Ａ５抗体の反応性は対照高値である。対照低値は、標識抗体を同型の非標識抗体とインキュベートすることにより、この時に競合が生じ、標識抗体の結合が減少する場合に得られる。試験抗体の存在下における標識抗体反応性の有意な減少は、標識抗体と「交差反応」する同一エピトープを認識する試験抗体の指標となる。本出願における「有意な減少」は、９Ｃ３または１１Ａ５の再現可能（すなわち継続的に観察される）な結合減少が、少なくとも約１：１の比で１％、または約１：１００の比で約１０％、またはより好ましくは約１：１ないし１：１００の任意の比で約２０％ないし約５０％と定義し得る。
４．６．１ 阻止抗体
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドと免疫反応する抗体を含む。上記したように、本発明に記載のＭＳＣＲＡＭＭ由来ペプチドの用途の１つは、抗体を産生することである。本明細書を通して抗体の言及は、単独または他の要素とコンジュゲートした全てのポリクローナルおよびモノクローナル抗体、およびその一部を含む。抗体は、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）2フラグメントおよび単鎖抗体を含む。抗体は適当な実験動物でインビボで、または組換えＤＮＡ技術を用いてインビトロで製造され得る。抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。好ましい実施形態において、抗体はポリクローナル抗体である。抗体の製造および同定法は当分野でよく知られている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８参照）。
簡潔には、ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドを含む免疫原を動物に免疫化し、免疫化した動物から抗血清を回収することにより産生する。広範囲の動物種を抗血清の産生に使用することができる。典型的には、抗−抗血清の産生に使用される動物はウサギ、マウス、ラット、ハムスターまたはモルモットである。ウサギは比較的血液量が多いことから、ウサギがポリクローナル抗体の産生に好んで選択される。
Ｓｆｂ−、ＦｎＢＡ−、ＦｎＢＢ−、ＦｎＢＰＡおよびＦｎＢＰＢ−由来ＭＳＣＲＡＭＭエピトープに特異的なポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体は、一般的に当業者には公知であるように、慣用的な免疫化技術を用いて製造し得る。特定のＦｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭ（合成ペプチド、部位特異的変異、または短縮ペプチド）の抗原エピトープを含む組成物を、１つ以上の実験動物、例えばウサギまたはマウスに免疫化するために使用することができ、次いで、エピトープ含有ＭＳＣＲＡＭＭペプチドに対する特異的抗体が産生される。ポリクローナル抗血清が、抗体が産生される時間の経過後、動物から採血し、全血から血清サンプルを調製することにより簡易に得られ得る。
ポリクローナル抗体の産生に使用する免疫原組成物の量は、免疫原の性質、並びに免疫化に使用する動物により変化する。様々な経路を使用して免疫原を投与することができる（皮下、筋肉内、皮内、静脈内および腹膜内）。ポリクローナル抗体の産生は、免疫化後の種々の時点で免疫化動物の血液をサンプリングすることにより監視し得る。第二の追加抗原注入も行い得る。追加抗原刺激および抗体価測定のプロセスは、適当な抗体価が得られるまで反復する。所望のレベルの免疫原性が得られれば、免疫化動物から採血し、血清を単離および貯蔵することができ、および／または動物を使用してｍＡｂを産生することができる（下記）。
本発明によりもたらされる重要な特長の１つは、この抗体の特異性の点で、比較的等質性であるポリクローナル血清である。典型的には、ポリクローナル血清は種々の異なる「クローン」、すなわち、異なる系のＢ細胞から誘導される。対照的に、モノクローナル抗体は、共通のＢ−細胞祖先の抗体産生細胞から誘導され、従って「モノ」クローン性であると定義されている。
ポリクローナル血清を産生するために、ペプチドを抗原として使用する場合、全抗原を使用した場合より、血清のクローン性においてかなり多様性が低いと予測される。残念なことに、エピトープの不完全なフラグメントが提示されれば、ペプチドは多重（そしておそらく非天然）構造をとるのは最もである。結果として、短いペプチドでも、比較的複数の特異性を有するポリクローナル抗血清を産生し、および残念なことに天然分子とは反応しないか反応性の低い抗血清を産生し得る。
本発明に記載のポリクローナル抗血清は、全ての無傷なエピトープを含むと予測されるペプチドに対して産生される。これらのエピトープは、それ故、免疫学的にはより安定であり、従って、免疫系のより一貫した免疫学的標的を発現する。このモデルでは、このペプチドに反応する効力のあるＢ−細胞クローンの数はかなり少なく、従って、得られた血清の均質性はより高い。種々の実施形態において、本発明は、クローン性、すなわち同一分子決定基と反応するクローンの割合が少なくとも８０％であるポリクローナル抗血清を提供する。さらに高いクローン性−９０％、９５％またはそれ以上−が考えられる。
モノクローナル抗体を得るために、最初に実験動物、しばしば好ましくはマウスをＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープ含有組成物を用いて免疫化する。次いで、抗体産生が充分に行われる時間経過後、動物から一群の脾臓またはリンパ細胞を得る。次いで、脾臓またはリンパ細胞を、ヒトまたはマウスミエローマ株などの細胞系と融合し、抗体−分泌ハイブリドーマを産生する。これらのハイブリドーマは単離して、個々のクローンを得、これは所望のペプチドに対する抗体の産生のためにスクリーニングすることができる。
免疫化後、脾臓細胞を取り出し、標準的な融合プロトコールを用いて形質細胞腫細胞と融合し、ＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープも対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生する。選択した抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、標準的な技術、例えばＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット法を用いて同定する。次いで、ハイブリドーマクローンを液体培地で培養し、培養上清を精製すると、ＭＳＣＲＡＭＭ由来エピトープ特異的モノクローナル抗体を得ることができる。
本発明のモノクローナル抗体は、標準的な免疫化学法、例えばＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット法、並びにＭＳＣＲＡＭＭエピトープに特異的な抗体を使用し得る他の方法において有用性がある。
また、特定のＭＳＣＲＡＭＭ由来ペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体は他の有用な適用に使用し得ることが提案されている。例えば、免疫吸着法における使用は、天然または組換えペプチド種またはその合成または天然変化体を精製するのに有用であり得る。
一般的に、これらのペプチドに対するポリおよびモノクローナル抗体は、種々の実施形態で使用し得る。例えば、抗体クローニングプロトコールにおいて使用することで、本明細書で開示したペプチドまたは関連タンパク質をコードするｃＤＮＡまたは遺伝子が得られ得る。また、細胞または動物におけるＭＳＣＲＡＭＭ由来ペプチドの効果を解析するための阻害研究においても使用し得る。抗−ＭＳＣＲＡＭＭエピトープ抗体はまた、種々の細胞反応の間のＭＳＣＲＡＭＭの分布の解析、例えば、異なる生理学的条件下におけるＭＳＣＲＡＭＭペプチドの細胞または組織−特異的分布を決定するための免疫局在研究においても有用である。かかる抗体の特に有用な適用は、例えば、抗体アフィニティカラムを使用した、天然または組換えＭＳＣＲＡＭＭの精製においてである。かかる全ての免疫学的技術の操作は、本発明の開示に照らして当業者には公知である。
４．６．２ 二重特異性抗体組成物
一般的に、二重特異的抗体の製造も、Ｇｌｅｎｎｉｅら（１９８７）により例示されているように、当分野ではよく知られてる。二重特異的抗体は臨床的に、例えば、癌患者の治療（Ｂａｕｅｒら，１９９１）に使用されている。二重特異的抗体の製造法の１つは、１つ以上のフィブロネクチン結合領域の異なるエピトープに特異性を有する抗体を、１つ以上のフィブロネクチン結合タンパク質とは別々に製造することを含む。
二重特異的抗体の製造に関する数多くの方法が当分野で公知であるが、Ｇｌｅｎｎｉｅら（１９８７）法は、２つの選択した抗体からのペプチドＦ（ａｂ’γ）2フラグメントの製造、次いで、各々を還元して別々のＦａｂ’γSHフラグメントを得ることを含む。結合させる２つの対の一方上のＳＨ基を、次いで、ｏ−フェニレンジマレイミドなどの架橋剤でアルキル化し、対の一方に遊離マレイミド基を得る。この対は、次いで、チオエーテル結合により他方にコンジュゲートさせ、所望のＦ（ａｂ’γ）2ヘテロコンジュゲートが得られる。
製造が簡便であること、高収率および再現性から、Ｇｌｅｎｎｉｅら（１９８７）法は、しばしば、二重特異的抗体の製造に好まれるが、使用でき、発明者により構想される他の方法が数多くある。例えば、ＳＰＤＰまたはプロテインＡとの架橋を行う、または三重特異的構築物を製造する別の技術が知られている（Ｔｉｔｕｓら，１９８７；Ｔｕｔｔら，１９９１）。
二重特異的抗体の別の製造法は、２つのハイブリドーマによる融合によりクアドローマを形成する（Ｆｌａｖｅｌｌら，１９９１，１９９２；Ｐｉｍｍら，１９９２；Ｆｒｅｎｃｈら，１９９１；Ｅｍｂｌｅｔｏｎら，１９９１）。本明細書で使用する場合、「クアドローマ」という用語は、２つのＢ細胞ハイブリドーマの産生的融合を記載するために使用する。標準的な技術を用いて、２つの抗体産生ハイブリドーマを融合すると娘細胞が得られ、次いで、両方のセットのクローン型免疫グロブリン遺伝子の発現を維持する細胞を選択する。
クアドローマを産生する好ましい方法は、少なくとも１つの親ハイブリドーマの酵素欠損変異体の選択を含む。次いで、この最初の変異ハイブリドーマ細胞系は、例えばヨードアセトアミドなどに致死的にさらした、続く生存を不可能にする二番目のハイブリドーマの細胞に融合する。細胞融合は、致死的に処理したハイブリドーマから酵素欠損の遺伝子を獲得することにより最初のハイブリドーマの救済を可能にし、および、最初のハイブリドーマへの融合により二番目のハイブリドーマの救済を可能にする。必須ではないが、好ましいのは、同じアイソタイプであるが、異なるサブクラスの免疫グロブリンの融合である。混合サブクラス抗体により、好ましいクアドローマの単離における任意のアッセイの使用が可能になる。
より詳細には、クアドローマ形成およびスクリーニングの１つの方法は、最初に選択したｍＡｂを分泌するハイブリドーマ系を得、必須代謝酵素のヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）の欠損をつくることを含む。ハイブリドーマの欠損変異体を得るために、細胞を、８−アザグアニン（１×１０-7Ｍから１×１０-5Ｍ）の増加濃度の存在下で成育させる。変異体を希釈を限定することでサブクローニングし、ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）感受性について試験する。培養培地には、例えば、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１ｍＭペニシリン−ストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭからなり得る。
二番目の所望のＭＡｂを産生する相補ハイブリドーマ細胞系を使用して、標準的な細胞融合技術（Ｇａｌｆｒｅら，１９８１）による、またはＣｌａｒｋら（１９８８）により記載されたプロトコールを用いてクアドローマを形成する。簡潔には、４．５×１０7ＨＡＴ−感受性の最初の細胞を、致死量の不可逆的生化学的阻害剤のヨードアセトアミド（リン酸緩衝食塩水中５ｍＭ）で融合前、氷上で３０分間前処理した２．８×１０7ＨＡＴ−感受性第二細胞と混合する。細胞融合はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて誘導し、細胞を９６ウェルのマイクロタイタープレートに播く。クアドローマを、ＨＡＴ−含有培地を用いて選択する。二重特異的抗体含有培養物を、例えば、固相−特異的ＥＬＩＳＡおよびアイソタイプ特異的蛍光抗体染色を用いて同定する。
二重特異的抗体を同定する１つの同定実施形態において、マイクロタイタープレートのウェル（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）を、親ハイブリドーマ抗体の１つと特異的に反応し、両方の抗体との交差反応性を欠失している薬剤で覆う。プレートを洗浄し、ブロックし、試験する上清（ＳＮ）を各ウェルに加える。プレートを２時間、室温でインキュベートし、上清を捨て、プレートを洗浄し、希釈したアルカリリン酸抗−抗体コンジュゲートを室温で２時間加えた。プレートを洗浄し、リン酸基質、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を各ウェルに加える。プレートをインキュベートし、３Ｎ ＮａＯＨを各ウェルに加え、反応を停止し、ＯＤ410値をＥＬＩＳＡ解読機を用いて決定する。
別の同定実施形態において、ポリ−Ｌ−リジンで前処理したマイクロタイタープレートを使用して、標的細胞の１つを各ウェルに結合させ、次いで、例えば１％グルタルアルデヒドを用いて細胞を固定し、二重特異的抗体の無傷細胞への結合能について試験する。さらに、ＦＡＣＳ、免疫蛍光染色、イディオタイプ特異的抗体、抗原結合競合アッセイ、および抗体同定分野において一般的な他の方法を、本発明と関連して使用し、好ましいクアドローマを同定し得る。
クアドローマの同定後、二重特異的抗体を他の細胞産物から分けて精製する。これは免疫グロブリン精製の分野の当業者には公知の種々のタンパク質単離法によりなされ得る。抗体の製造および同定法は当分野でよく知られている（例えば、抗体：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８８）。
例えば、選択したクアドローマの上清を、プロテインＡまたはプロテインＧセファロースカラム上を通過させＩｇＧ（アイソタイプによる）を結合させる。結合した抗体を、次いで、例えばｐＨ５．０のクエン酸緩衝液で溶出する。ＢｓＡｂｓを含む溶出画分を、等張緩衝液に対して透析する。別に、溶出液をまた、免疫グロブリン−セファロースカラムに通過させる。ＢｓＡｂを次いで、３．５Ｍ塩化マグネシウムで溶出する。このように精製したＢｓＡｂｓを、次いで、例えば上記のように標的細胞のアイソタイプ−特異的ＥＬＩＳＡおよび蛍光抗体染色アッセイにより結合活性を試験する。
精製したＢｓＡｂｓおよび親抗体はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、次いで銀またはクーマシーで染色することにより同定および単離し得る。これは、親抗体の一方が他方よりも高い分子量を有する場合、可能である。ただし、ＢｓＡｂｓのバンドは２つの親抗体の間を移動する。サンプルの減少は、２つの異なる分子量をもつ重鎖の存在を確証する。
さらに、組換え技術は、一般的に抗体の製造に利用でき、所望の二重特異性を有する抗体をコードする組換え抗体遺伝子の製造を可能とする（Ｖａｎ Ｄｕｋら，１９８９）。従って、最も好ましい結合特性を有するモノクローナル抗体を選択した後、これらの抗体のそれぞれの遺伝子を、例えば、ファージ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニング（Ｏｉ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８６；Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９９１）により単離することができる。次いで、Ｆａｂコード領域の再編成を通して、適当なキメラ構築物を容易に得ることができる。
４．６．３ ヒト化抗体組成物
ヒト化モノクローナル抗体は、遺伝子工学技術を用いて修飾し、一定領域および／または可変領域枠組み配列をヒト配列で置換した、起源の抗原特異性は保持している動物起源の抗体である。かかる抗体は一般的にヒト抗原に対して特異性を有するネズミ抗体から誘導される。かかる抗体は、一般的に、インビボの治療用途に有用である。この方法は、外来の抗体に対する宿主の応答を減少させ、ヒトエフェクター機能の選択を可能にする。
ヒト化免疫グロブリンの技術は、当業者にはよく知られている。例えば、米国特許第５，６９３，７６２号は、１つ以上の相補決定領域（ＣＤＲ’ｓ）を有するヒト化免疫グロブリンの製造法および組成を開示している。無傷の抗体に結合されれば、ヒト化免疫グロブリンは実質的にヒトにおいて非免疫原性であり、実質的に抗原、例えばタンパク質またはエピトープを含む他の化合物に対してドナーの免疫グロブリンと同じアフィニティを保持する。
本発明に有用な抗体の産生を教示する他の米国特許（各々、引用によりここに援用する）は、米国特許第５，５６５，３３２号（組み合わせ法を用いたキメラ抗体の産生が記載されている）；第４，８１６，５６７号（組換え免疫グロブリン調製が記載されている）および第４，８６７，９７３号（抗体治療剤コンジュゲートが記載されている）を含む。
米国特許第５，５６５，３３２号は、親抗体と同じ結合特異性を有するが、ヒト特性が増加している、抗体、または抗体フラグンメントの産生法を記載している。ヒト化抗体は、鎖再編成により、おそらくファージ提示技術を用いて得られ、かかる方法は本発明においては有用であるので米国特許第５，５６５，３３２号の全内容を引用してここに援用する。
４．６．４ ペプチドおよび抗体組成物の検出
特定のポリペプチドは、通常、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルの解析に使用される、典型的な染色方法、例えばクーマシーブリリアントブルーまたは銀染色の検出限界以下の量で存在し得、その存在は類似のＭr不活性ポリペプチドにより覆われ得ることがさらに理解されるだろう。本発明の慣用的な実行には必ずしも必要ではないが、他の検出法を、目的の特定のポリペプチドの視覚化に有利に使用し得る。本明細書に記載の酵素−、放射活性−、または蛍光−タグ抗体を用いた、例えばウエスタンブロットなどの免疫学に基づいた技術は、この観点から特に有用である。別に、本発明のペプチドは、一次抗体にアフィニティを有する二次抗体と組み合わせて本発明の抗体を用いて検出し得る。この二次抗体は、酵素−、または放射活性−、または別に、蛍光−またはコロイド金タグであり得る。かかる２段階の二次抗体技術の標識および検出法は、当業者にはよく知られている。
４．６．５ イムノアッセイ
記載したように、天然および合成由来ペプチドおよび本発明のペプチドエピトープは、例えばワクチン開発に関連して免疫原として、または反応性抗体の検出におけるイムノアッセイの抗原として有用性がみられると提案されている。始めにイムノアッセイに戻ると、最も簡便で直接的な感覚において、本発明の好ましいイムノアッセイは、種々の型の、当業者には公知である酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む。しかし、ＭＳＣＲＡＭＭ由来タンパク質およびペプチドの有用性はかかるアッセイに限定されず、他の有用な実施形態はＲＩＡおよび他の非酵素結合抗体結合アッセイおよび方法を含むことが容易に理解されるだろう。
好ましいＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＭＳＣＲＡＭＭ由来タンパク質抗原配列を取り込んだタンパク質またはペプチドは、選択された表面に、好ましくはタンパク質アフィニティを示す表面、例えばポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルに固定する。不完全に吸着した物質を取り除くために洗浄した後、次いで、一般的には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはカゼインなどの試験抗血清に関して抗原性的に中性であることが知られている非特異的タンパク質を、ウェル上に結合または被覆することを望む。これにより、固定表面上の非特異的吸着部位のブロックが可能となり、抗血清の表面上への非特異的結合により引き起こされる基底値が減少する。
抗原性物質をウェルに結合させ、非反応性物質で被覆し基底値を減少させ、非結合物質を除去するために洗浄した後、固定表面を、試験する抗血清または臨床または生物学的抽出物と、免疫複合体（抗原／抗体）形成の助けとなるように接触させる。かかる条件は好ましくは、抗血清をＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ＴｗｅｅｎTMなどの希釈剤で希釈することを含む。これらの添加した薬剤はまた、非特異的基底値の減少を助けるものである。層をなした抗血清を、次いで、例えば、２から４時間、好ましくは約２５℃から約２７℃の程度の温度でインキュベートする。インキュベート後、抗血清−接触表面を洗浄して非免疫複合物質を除去する。好ましい洗浄方法は、ＰＢＳ／ＴｗｅｅｎTM、またはホウ酸緩衝液などの溶液を用いた洗浄を含む。
試験サンプルと結合抗原の間に特異的な免疫複合体が形成され、続けて洗浄した後、免疫複合体の頻度および量を、複合体を最初のものに特異性を有する第二の抗体にさらすことにより決定し得る。もちろん、試験サンプルは典型的にヒト起源のものであるという点において、第二の抗体は好ましくはヒト抗体に特異性を有する抗体である。検出法を提供するために、第二の抗体は好ましくは関連した検出可能な標識、例えば酵素標識を有し、適当な色素基質と共にインキュベートすることにより発色するなどの信号を発生する。従って、例えば、抗血清結合表面をウレアーゼまたはペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗ヒトＩｇＧと共に、一定時間、免疫複合体形成の発達に好ましい条件下（例えば、２時間室温で、例えばＰＢＳ−ＴｗｅｅｎTMなどのＰＢＳ−含有溶液中でインキュベート）接触およびインキュベートすることが望ましい。
二次標識または酵素−タグ抗体と共にインキュベートし、続いて非結合物質を除去するために洗浄した後、例えば、酵素標識としてペルオキシダーゼの場合には、尿素およびブロモクレゾールパープルまたは２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸［ＡＢＴＳ］およびＨ2Ｏ2などの発色基質と共にインキュベートすることにより標識量を定量化する。次いで、例えば可視スペクトル分光計を用いて、発色の度合いを測定することにより定量化する。
ＥＬＩＳＡを、本発明に関連して使用し得る。かかるＥＬＩＳＡアッセイにおいて、本発明の抗原性配列を取り込むタンパク質またはペプチドを、選択表面上に、好ましくはポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルなどのタンパク質アフィニティを示す表面に固定する。不完全に吸着した物質を除去するために洗浄した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは粉末ミルクなどの試験抗血清に関して抗原性的に中性であることが知られている非特異的タンパク質でアッセイプレートウェルを結合または被覆することが望ましい。これにより、固定表面上の非特異的吸着部位のブロックが可能となり、抗血清の表面上への非特異的結合により引き起こされる基底値を減少させる。
抗原性物質をウェルに結合させ、非反応性物質で被覆し基底値を減少させ、非結合物質を除去するために洗浄した後、固定表面を、試験した抗血清または臨床または生物学的抽出物と、免疫複合体（抗原／抗体）形成の助けとなるように接触させる。かかる条件は好ましくは、抗血清をＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ＴｗｅｅｎTMなどの希釈剤で希釈することを含む。これらの添加した薬剤はまた、非特異的基底値の減少を助けるものである。層をなした抗血清を、次いで、約２から約４時間、好ましくは約２５℃から約２７℃の程度の温度でインキュベートする。インキュベート後、抗血清−接触表面を洗浄して非免疫複合物質を除去する。好ましい洗浄方法は、ＰＢＳ／ＴｗｅｅｎTM、またはホウ酸緩衝液などの溶液を用いた洗浄を含む。
試験サンプルと結合物質の間に特異的な免疫複合体が形成され、続けて洗浄した後、形成された僅かな量の免疫複合体でも測定し得る。
検出方法を得るために、第二抗体は、好ましくは、適当な発色基質と共にインキュベートした場合に発色する関連酵素を有する。従って、例えば、抗血清結合表面をウレアーゼまたはペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗ヒトＩｇＧと共に、一定時間、免疫複合体形成の発達に好ましい条件下（例えば、２時間室温で、例えばＰＢＳ／ＴｗｅｅｎTMなどのＰＢＳ−含有溶液中でインキュベート）接触およびインキュベートすることを望む。
二次標識または酵素−タグ抗体と共にインキュベートし、続いて非結合物質を除去するために洗浄した後、例えば、酵素標識としてペリオキシダーゼの場合には、尿素およびブロモクレゾールパープルまたは２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸［ＡＢＴＳ］およびＨ2Ｏ2などの発色基質と共にインキュベートすることにより標識量を定量化する。次いで、例えば可視スペクトル分光計を用いて、発色の度合いを測定することにより定量化する。
４．６．６ 免疫沈降
本発明の抗−ＭＳＣＲＡＭＭ抗体は、免疫沈降によるＦｎ結合タンパク質の単離に特に有用である。免疫沈降は、複合混合物からの標的抗原成分の分離を含み、僅かな量のタンパク質を識別または単離するのに使用される。Ｓｆｂ、ＦｎＢＡ、ＦｎＢＢ、ＦｎＢＰＡ、およびＦｎＢＰＢなどの細胞表面局在タンパク質の単離のために、リソスタフィン（黄色ブドウ球菌）またはムタノリシン（連鎖球菌）で処理することによりペプチドを細菌細胞壁から可溶化するか、または別にデタージェントミセルにしなければならない。胆汁塩などの他の薬剤は酸性ｐＨまたは胆汁カチオンの存在下で沈降するため、非イオン性塩が好ましい。
別の実施形態において、本発明の抗体は、２つの抗原の近接並置に有用である。これは、例えば酵素基質対などの抗原の局在化濃度を上昇させるのに特に有用である。
４．６．７ ウエスタンブロット
本発明の組成物は、イムノブロットまたはウエスタンブロット解析において大いなる有用性が認められる。抗−ＭＳＣＲＡＭＭ−コードエピトープ）抗体を、固体支持マトリクス、例えば、ニトロセルロース、ナイロンまたはその組み合わせ上に固定したタンパク質の同定用の高アフィニティ一次試薬として使用し得る。免疫沈降、次いでゲル電気泳動に関連して、これらは抗原を検出する用途において一段階試薬として使用し得、一方、抗原検出に使用した二次試薬は負の基底値を示す。これは、研究した抗原が免疫グロブリンである場合（免疫グロブリン結合細菌細胞壁成分の使用を除く）特に有用であり、研究した抗原は検出剤と交差反応するか、または交差反応信号と同じ相対分子量に移動する。ウエスタンブロットと同時に使用する免疫学を基盤とした検出法は、酵素−、放射標識−、または蛍光−タグ二次抗体を含み、毒素部分はこの観点から特に有用であるあると考えられる。
４．７ 治療、診断、および免疫キット
本発明はまた、製薬学的に許容しうる賦形剤、担体、希釈剤、アジュバント、および追加のペプチド、抗原、細胞膜調製物などの他の成分、または特定のワクチン製剤に使用され得る弱毒化全細胞組成物と共に、ＭＳＣＲＡＭＭ−由来ペプチド抗原または抗体組成物を含む。
本明細書に記載のペプチドを用いて、本発明はまた、免疫応答を引き起こす方法を提供するものであって、この方法は一般的に動物に、免疫学的に有効量のＭＳＣＲＡＭＭ−由来ペプチド組成物を含む製薬学的に許容しうる組成物を投与することを含む。好ましい動物は、哺乳動物、および特にヒトを含む。他の好ましい動物は、ネズミ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコを含む。組成物は、天然または組換え源から得られた、部分または十分に精製されたＭＳＣＲＡＭＭ−由来ペプチドエピトープを含み得、タンパク質またはペプチドは天然からまたは化学的に合成されるか、または別にかかるエピトープをコードするＤＮＡセグメントを発現する組換え宿主細胞からインビトロで産生され得る。反応性エピトープを含む小さいペプチド、例えば、長さが約３０ないし約１００アミノ酸が、しばしば好ましい。抗原性タンパク質またはペプチドはまた、他の薬剤、例えば他のブドウ球菌または連鎖球菌ペプチドまたは核酸組成物などを所望であれば組み合わせ得る。
「免疫学的な有効量」は、受容体動物において免疫応答を発生することのできるペプチド組成物量を意味する。これは、抗体応答（Ｂ細胞応答）の発生および／または細胞毒性免疫応答（Ｔ細胞応答）の刺激を含む。かかる免疫応答の発生は、有益な生物学的薬剤、例えばＣＴＬ、およびより特定すると、反応性抗体の両方において、診断実施形態における使用に有用性を有し、また、種々の予防または治療実施形態においても有用性を有する。それ故、免疫応答の刺激に関するこれらの方法は、重症なブドウ球菌または連鎖球菌感染を予防または緩和することを指向したワクチン療法、任意の感染の深刻度または持続期間を和らげ得る治療法を含むが、これら最終結果のいずれかを達成することは、本発明のこれらの実施態様の遂行には必ずしも必要ではないことが理解されよう。かかる治療法は、特に、黄色ブドウ球菌などのコアグラーゼ陽性ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、化膿連鎖球菌および関連種などのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌といった病原体により引き起こされる感染の治療に使用され得る。
上記の治療組成物および方法に加えて、タンパク質、核酸分子または抗体は、感染に関与する病原体と哺乳動物の宿主細胞間の最初の物理的相互作用、例えば細菌、特にグラム陽性細菌の内在器官上の哺乳動物細胞外マトリクスタンパク質への、または創傷細胞外マトリクスタンパク質への干渉に；タンパク質仲介哺乳動物細胞侵入をブロックするために；組織障害を仲介する、哺乳動物細胞外マトリクスタンパク質ないし細菌タンパク質間の細菌吸着をブロックするために；および内在器官の内植または外科的手術以外から開始された感染における病原体の正常進行をブロックするため有用である。
発明者により考えられた動物において免疫応答を引き起こす別の方法は、動物、またはヒト被験体に、ペプチドエピトープをコードする免疫学的に有効量の核酸組成物、またはかかる核酸組成物を含み発現する免疫学的に有効量の弱毒化生物体を含む、製薬学的に許容しうる組成物を投与することを含む。「免疫学的有効量」はＢ細胞および／またはＴ細胞応答を刺激することのできる量である。
本発明の免疫製剤は、ワクチン、治療、またはブドウ球菌および連鎖球菌の検出に有用な抗体の産生、またはＦｎなどのＥＣＭ成分への細菌吸着の防止を意図したものであれ、部位−特異的な変異、短縮、またはこれらのタンパク質から合成的に誘導された抗原性ペプチドフラグメントを含み得る。それ自体、本明細書に記載のタンパク質およびペプチドの抗原性機能等価体も、本発明の範囲内に該当する。「抗原性機能等価体」タンパク質またはペプチドは、開示された特定のＭＳＣＲＡＭＭタンパク質（例えば、ＦｎＢＢ、ＦｎＢＡ、ＦｎＢＰＢおよびＦｎＢＰＡ）のいずれかから誘導した１つ以上のエピトープと免疫学的に交差反応するエピトープを取り込むものである。抗原性機能等価体、またはエピトープ配列は、始めに設計または予測し、次いで、試験し得るか、または簡便に交差反応性について直接試験し得る。
別の実施形態において、本発明の新規ペプチドおよびタンパク質は、血清、血液、または他の溶液などの臨床サンプルにおいてかかるペプチドと反応する抗体の検出に使用し得る。
免疫製剤、ワクチン、または単なる抗原（例えば、検出プロトコールにおける使用）としての使用に適した、適当なＭＳＣＲＡＭＭエピトープ、および／またはその機能等価体の同定または設計は、比較的平易な事柄である。例えば、親水性に基づくアミノ酸配列からのエピトープの同定および調製が教示されている、米国特許第４５５４１０１号（引用してここに援用する）で可能であるように、Ｈｏｐｐの方法を使用し得る。数種の他の論文で記載されている方法、およびこれに基づくソフトウエアプログラムを使用してもエピトープコア配列を同定することができ、例えば、Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｆａｓｍａｎ（１９７４ａ，ｂ；１９７８ａ，ｂ；１９７９）；Ｊａｍｅｓｏｎ ａｎｄ Ｗｏｌｆ（１９８８）；Ｗｏｌｆら（１９８８）；およびＫｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）がこの主題を記載している。これらの「エピトープコア配列」のアミノ酸配列は、次いで、ペプチド合成または組換え技術のいずれかを用いて、容易にペプチドに取り込まれ得る。
黄色ブドウ球菌由来のＦｎＢＰＡタンパク質のＤＵ、Ｄ１、Ｄ２またはＤ３エピトープを取り込む、より短い抗原性ペプチド、例えば約２５から約５０、または約１５から２５アミノ酸長の使用が、特定の条件下、例えばワクチンの調製または免疫学的検出アッセイにおいて有利であると提示されている。例示的利点は、製造および精製の簡便性、比較的低いコストおよび産生の再生産性が向上したこと、および有利な生体分布が含まれる。
さらに別の実施形態において、本発明は免疫検出法および関連キットに関する。本発明のタンパク質またはペプチドを使用して、それと反応性を示す抗体を検出し得るか、または別に、本発明に従って製造した抗体を使用してＦｎＢＰＡタンパク質またはペプチドを検出し得ることが意図される。どちらの型のキットも、ブドウ球菌および／または連鎖球菌感染の指標となる、臨床サンプル内に存在する化合物の免疫検出に使用し得る。このキットはまた、適宜、抗原または抗体精製に使用し得る。
一般的に、好ましい免疫検出法は、始めにＦｎＢＰＡ−反応性抗体を含有することが疑われるサンプル、例えば、該抗体を含むことが疑われる生物学的サンプル、または別に、血液、血清等などの臨床サンプルを患者から得て、サンプルを最初のＦｎＢＰＡタンパク質またはペプチドと、免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にする条件下で接触させることを含む。次いで、形成される任意の免疫複合体の存在を検出する。
選択したサンプルをＦｎＢＰＡ−由来タンパク質またはペプチドと、（一次）免疫複合体の形成が可能となる条件下で接触させることは、一般的に、単純にタンパク質またはペプチド組成物をサンプルに添加することである。次いで、添加した抗原が免疫複合体をを形成する、すなわち、サンプル中の抗体に結合することのできる時間の間、混合物をインキュベートする。この後、サンプル組成物、例えば組織画分（ｓｅｃｔｉｏｎ）、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロットまたはウエスタンブロットを、一般的には、洗浄して非特異的結合抗原種を除去し、免疫複合体中の特異的に結合した種のみを検出できるようにする。
免疫複合体形成の検出は当分野ではよく知られており、当業者に公知の数多くの方法を適用して達成され得、種々の文献、例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら（１９８７）（引用してここの援用する）に記載されている。一次免疫複合体の検出は、一般的に、例えば放射活性、蛍光、生物学的、または酵素タグ（酵素タグは、例えば、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼが好ましい）ラベルまたはマーカーなどの検出に基づいている。使用した特定の抗原はそれ自体で検出ラベルに結合し得、単純にこのラベルを検出し、それにより組成物に存在する結合抗原の量を測定することが可能となる。
別に、一次免疫複合体は、検出可能なラベルに結合しており、第一のタンパク質またはペプチドに結合アフィニティを有する二次結合リガンドにより検出され得る。二次結合リガンドは、それ自体、しばしば抗体であり、従って「二次」抗体と呼ばれ得る。一次免疫複合体を、二次免疫複合体の形成が可能な条件下および充分な時間、標識二次結合リガンドまたは抗体と接触させる。二次免疫複合体は、次いで、一般的に洗浄して、非特異的結合標識二次抗体を除去し、次いで、残余結合ラベルを検出する。
診断目的のために、目的の抗体またはペプチドのいずれかを含むことが疑われる実質上全てのサンプルを使用し得ることが提案されている。例示的サンプルは、患者から得られた臨床サンプル、例えば、血液または血清サンプル、気管支液、耳かき、啖サンプル、中耳液または尿サンプルも使用し得る。これにより、髄膜炎、中耳炎、肺炎、菌血症および分娩後敗血症の診断が可能となる。さらに、かかる実施形態は非臨床サンプル、例えば抗体サンプルの滴定、ハイブリドーマの選択等などの非臨床サンプルにも適用し得る。別に、臨床サンプルは、動物源からでもよく、ウシ、ヒツジおよびヤギなどの家畜動物も含み得る。ネコ、イヌおよびウマ源由来のサンプルもまた、本明細書に記載の方法に従って使用し得る。
本明細書に記載の方法は、微生物感染、例えば黄色ブドウ球菌感染および例えば上気道炎（例えば中耳炎、細菌性気管炎、急性喉頭蓋、甲状腺炎）、下気道炎（例えば気腫、肺膿瘍）、心臓（例えば心内膜炎）、胃腸（例えば分泌性下痢、膿瘍、後腹膜膿瘍）中枢神経系（例えば脳膿瘍）、眼（例えば眼角部、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前隔および眼か峰巣炎、ダークリオサイスティティス（ｄａｒｃｒｙｏｃｙｓｔｉｔｉｓ））、腎および尿管（例えば副睾丸、腎内および腎周囲膿瘍、毒素性ショック症候群）、皮膚（例えば膿痂症、毛嚢炎、皮膚膿瘍、峰巣炎、創感染、細菌性筋炎、骨および関節（例えば敗血症性関節炎、骨髄炎）の診断に有用である。
方法は、黄色ブドウ球菌などの微生物を含むことが疑われるサンプルを得る段階を含む。サンプルは、ヒトを含む動物から、例えば創傷、血液、唾液、組織、骨、筋肉、軟骨、または皮膚から得られる。
タンパク質、またはその活性フラグメント、およびタンパク質に対する抗体は、診断法に関して上記したように黄色ブドウ球菌などの細菌感染治療および診断に；能動または受動免疫の抗−黄色ブドウ球菌ワクチンの開発に有用であり；および製薬組成物として、創傷に投与するか、またはインビトロおよびインビボで医学装置またはポリマー生体物質を被覆するために使用する場合、タンパク質および抗体の両方共、創傷部位または生体物質への黄色ブドウ球菌の結合を防止または阻害するためのブロッキング剤として有用である。好ましくは、抗体を修飾して、投与する患者の免疫原性を低下させる。例えば、患者がヒトであるならば、抗体は、ハイブリドーマ由来抗体の相補決定領域を、記載したヒトモノクローナル抗体に移植することにより「ヒト化」し得る（Ｊｏｎｅｓら，１９８６；Ｔｅｍｐｅｓｔら１９９１）。
本明細書に記載の抗体、タンパク質および活性フラグメントで被覆する医学装置またはポリマー生体物質は、以下に限定されないが、ステープル、縫合針、置換心臓弁、心臓補助装置、ハードおよびソフトコンタクトレンズ、眼内レンズ移植（前房、後房または水晶体）、他の埋め込み、例えば角膜インレー、角膜−プロテーゼ、血管ステント、エピケラトファリア（ｅｐｉｋｅｒａｔｏｐｈａｌｉａ）装置、緑内障シャント、網膜ステープル、鞏膜バックル、歯プロテアーゼ、甲状腺形成装置、喉頭形成装置、血管移植片、軟および硬組織プロテーゼ（以下に制限されないが、ポンプ、刺激装置および記録器を含む電気装置を含む）、聴力ネフローゼ、ペースメーカー、人工喉頭、歯インプラント、乳房インプラント、陰茎インプラント、頭蓋骨／顔面腱、靭帯、半月および円盤、人工骨、人工器官（人工すい臓、人工心臓、義肢、および心臓弁を含む）；ステント、ワイヤー、ガイドワイヤー、静脈内および中心静脈カテーテル、レーザーおよびバルーン血管形成術装置、血管および心臓装置（チューブ、カテーテル、バルーン）、心室補助、血液透析成分、血液人工心肺、尿道／尿管／排尿装置（フォーリーカテーテル、ステント、チューブおよびバルーン）、気道カテーテル（気管内および気管切開チューブおよびカフ）、経管栄養法（経鼻的胃、胃内および空腸チューブ）、創傷排膿チューブ、胸膜、腹膜、頭骸、および心臓腔などの体腔を流すために使用するチューブ、血液バッグ、試験チューブ、血液回収チューブ、ワクチン器、シリンジ、針、ピペット、ピペットチップ、および血液チューブを含む。
本明細書で使用した「被覆した」または「被覆する」という用語は、タンパク質、抗体または活性フラグメントを、装置の表面、好ましくは黄色ブドウ球菌感染の間などの選択された微生物にさらされるであろう外表面に適用することを意味することは当業者により理解されるだろう。装置の表面は、完全にタンパク質、抗体または活性フラグメントにより覆われる必ずしも必要はない。
関連した実施形態において、本発明は、サンプル中のＭＳＣＲＡＭＭ−由来エピトープ−特異的抗体の存在を検出するのために使用し得るキットの調製に関する。一般的に言えば、本発明に記載のキットは、免疫検出試薬と共に適当なタンパク質またはペプチドを、およびタンパク質またはペプチドおよび試薬を含む方法を含む。
免疫検出試薬は、典型的には、ＭＳＣＲＡＭＭ−関連タンパク質またはペプチドに関連した、または二次結合リガンドに関連した標識を含む。例示的リガンドは、最初のＭＳＣＲＡＭＭ−関連タンパク質またはペプチドに対して指向した二次抗体、または関連したラベルを有するビオチンまたはアビジン（またはストレプトアビジン）を含む。ヒト抗体に結合アフィニティを有する抗体に結合した検出ラベルはまた、例えば、最初の試薬は、ヒトサンプル由来の反応性抗体を結合するために使用されるＭＳＣＲＡＭＭ−関連ペプチドである場合のプロトコールについて考えられる。もちろん、上記したように、数多くの例示的標識が当分野で公知であり、全てのこのような標識が本発明に関連して使用され得る。キットは、キットの使用者によりコンジュゲートされる、完全にコンジュゲートした形、中間体の形、または別々の部分のいずれかで抗原または抗体−標識コンジュゲートを含み得る。
容器は、一般的に、少なくとも１つのバイアル、試験チューブ、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器を含み、そこに抗原を静置し得、好ましくは適当に配置する。二次結合リガンドが提供されれば、キットはまた、一般的に、二次バイアルまたは他の容器を含み、そこにこのリガンドまたは抗体を静置し得る。本発明のキットはまた、典型的に、市販するために閉じた容器にバイアルを入れておく方法、例えば注入または吹き込み形成容器（これに所望のバイアルを保存する）を含む。
４．８ 製薬組成物
タンパク質、核酸分子、抗体、またはそのフラグメントを含む製薬組成物は、例えば食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、他の治療化合物、およびその組み合わせなどの医薬的担体と組み合わせて調剤し得る。製剤は、投与形態に適用でなければならない。組成物は、黄色ブドウ球菌宿主細胞のフィブロネクチンとの結合により例示されるように、フィブロネクチン結合タンパク質とフィブロネクチンの相互作用を干渉、調節、または阻害するのに有用である。
適当な投与法は、以下に限定されないが、局所、経口、肛門、膣、静脈内、腹膜内、筋肉内、皮下、鼻腔内、および皮内投与を含む。局所投与については、組成物を、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、液滴（例えば点眼液および点耳液）、または溶液（例えばうがい薬）の形で調剤する。創傷または手術包帯、縫合およびエアロゾルに化合物を染み込ませ得る。組成物は慣用的な賦形剤、例えば保存剤、浸透を促進する溶媒、および軟化剤を含む得る。局所製剤はまた、クリームまたは軟膏ベース、エタノール、オレイルアルコールなどの慣用的な担体を含み得る。
本明細書に開示された製薬組成物は、特定の適用に基づき種々の方法で送達され得る。経口投与については、組成物は、不活性希釈剤と共にまたは同化可能な食用の担体と共に調剤され得るか、またはそれらは直接硬または軟殻ゼラチンカプセルに封入し得るか、または圧縮して錠剤にし得るか、または直接、食事の食べ物と共に取り込まれ得る。経口治療投与についいては、活性化合物を、賦形剤と共に取り込み、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、水等の形で使用し得る。かかる組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含むべきである。組成物および調製物の比率は、もちろん、変化し得、簡便には単位重量が約２ないし約６０％であり得る。かかる治療的に有用な組成物における活性化合物の量は、適当な薬用量が得られるものである。
錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤等はまた、以下を含み得る：トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤；リン酸ジカルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、ステアリン酸等などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；およびスクロース、ラクトース、またはサッカリンなどの甘味剤を添加し得るか、またはペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリー香味剤などの香味剤。投与単位形態がカプセル剤である場合、上記の種類の物質に加えて液体担体を含み得る。種々の他の物質がコーティングとして、またはそうでなければ投与単位形態の物理的形を修飾するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、シェラック、糖またはその両方によりコーティングされ得る。エリキシルシロップは、活性化合物、甘味剤のスクロース、保存剤のメチルおよびプロピルパラベン、色素、およびチェリーまたはオレンジ香味などの香味剤を含み得る。もちろん、どの投与単位形態を調製するのに使用したどの物質も医薬的に純粋で、使用する量では実質的に無毒性でなければならない。さらに、活性化合物は、持続放出調製物および製剤に取り込まれ得る。
経口予防のために、ポリペプチドを、賦形剤と共に取り込み、摂取不可能なうがい薬および歯磨き剤の形で使用し得る。うがい薬は、必要量の有効成分を、ホウ酸ナトリウム溶液などの適当な溶媒に混ぜることにより調製し得る（ドベル溶液）。あるいは、有効成分を、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび二炭酸カリウムを含む防腐洗浄水に混ぜ得る。有効成分はまた、ゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含む歯磨き粉に分散し得る。有効成分は、水、結合剤、研磨剤、香味剤、発砲剤および湿潤剤を含み得るペースト状の歯磨き粉に、治療有効量を添加し得る。
あるいは、本明細書に開示した製薬組成物は、非経口、静脈内、筋肉内、または腹膜内に投与し得る。遊離塩基または製薬学的に許容しうる塩としての活性化合物の溶液は、水中でヒドロキシプロピルセルロースなどの表面活性剤と適当に混合することにより調製し得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物中、および油中で調製し得る。通常の貯蔵および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐために保存剤を含む。
注入用途に適当な医薬形態は、無菌注入溶液または分散液の即座の調製のための、無菌水溶液または分散液および無菌粉末を含む。全ての場合において、形は無菌でなければならず、容易にシリンジ操作ができるような程度の液体でなければならない。製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、溶媒または分散培地となることができ、これは例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、その適当な混合物、および／または植物油を含む。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散の場合に必要な粒子サイズを維持することにより、および表面活性剤の使用により、適度な流動性が維持され得る。微生物の作用の防御は、種々の抗菌およ抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらすことができる。多くの場合、例えば糖または塩化ナトリウムなどの等張化剤を含むことが好ましい。注入可能な組成物の吸収延長は、組成物において、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる試薬を使用することによりもたらすことができる。
水溶液の非経口投与では、例えば、溶液は必要であれば適当に緩衝し、液体希釈剤を始めに充分な食塩水またはグルコースで等張化する。これら特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下および腹膜内投与に適している。これに関連して、使用できる無菌水性媒体は、本開示に照らして当業者には公知である。例えば、１薬用量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶かし、１０００ｍｌの皮下液に添加するか、または還流の指定部位に注入し得る。（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、ｐ．１０３５−１０３８および１５７０−１５８０参照）。処置する被験体の状態により必然的に用量は変化する。投与責任者は、とにかく、個々の被験体について、適当な用量を決定する。さらに、ヒトの投与においては、調製物は、生物学基準のＦＤＡ事務局により要求される、無菌、発熱性物質、一般的安全性および純度基準を満たさなければならない。
無菌注入溶液は、必要量の活性化合物を、上記に掲げた種々の他の成分と共に、適当な溶媒中に混合することにより調製し、必要に応じて濾過滅菌する。一般的に、分散液は、種々の無菌有効成分を、基本的な分散培地および上記の中から必要な他の成分を含む無菌媒質に混ぜることにより調製される。無菌注入溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これによりその前記した滅菌濾過溶液から、粉末の有効成分および追加的な所望の成分が得られる。
本明細書に開示した組成物は、中性または塩の形で調剤し得る。製薬学的に許容しうる塩は酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）を含み、これは例えば塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成された塩も、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または鉄などの無塩基、および例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等などの有機塩基から誘導することができる。調剤時に、溶液を投与形態に合う方法で投与し、量は治療有効量である。製剤は、例えば注入溶液、薬剤放出カプセル等など種々の投与形で容易に投与される。
本明細書で使用しているように、「担体」はあらゆる全ての溶媒、分散培地、媒質、コーティング、希釈剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸着遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等を含む。かかる媒体および医薬的に活性な物質の薬剤の使用は当分野ではよく知られている。慣習的な媒体または薬剤が有効成分と融和性でないことを除いて、治療組成物におけるその使用が意図される。補足的な有効成分もまた、組成物中に取り込むことができる。
「医薬的に許容できる」という用語は、ヒトに投与した場合に、アレルギーまたは類似の不適当な反応を引き起こさない分子自体および組成物を意味する。有効成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当分野でよく理解されている。典型的には、かかる組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注入可能物質として、溶液または懸濁液に混ぜるのに適当な固体形態として調製され、注入前に液体も調製することができる。
４．９ ワクチン
本発明は、能動および受動免疫態様の両方において使用するワクチンに関する。ワクチンとして使用するのに適当であると提唱されている免疫原性組成物は、新規免疫原性タンパク質および／または直接的に本発明に記載のペプチドエピトープから最も容易に製造し得る。好ましくは、抗原性物質を充分に透析して所望でない小分子量分子を除去しおよび／または所望の媒体により容易に製剤化するために凍結乾燥する。
有効成分としてペプチド配列を含むワクチンの調製は、一般的に、米国特許第４，６０８，２５１号；４，６０１，９０３；４，５９９，２３１；４，５９９，２３０；４，５９６，７９２および４，５７８，７７０（これら全て引用してここに援用する）により例示されているように、当分野でよく理解されている。典型的には、かかるワクチンは、液体溶液または懸濁液として注入可能物質として、溶液または懸濁液に混ぜるのに適当な固体形態として調製され、注入前に液体も調製し得る。調製物はまた乳化してもよい。活性免疫原性物質は、しばしば、医薬的に許容され有効成分と融和性の賦形剤と混合する。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびその組み合わせである。さらに、所望であれば、ワクチンは、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはワクチンの効力を高めるアジュバントなどの補助物質を少量含み得る。
ＭＳＣＲＡＭＭ−由来タンパク質および／またはそれ由来の天然または修飾エピトープ性ペプチドを含む組成物はまた、エンドトキシン（ＬＰＳ）が減少、削除または脱毒性化する限り、ヒトおよび動物ワクチンの基礎であり得る。実質的にエンドトキシンが含まれないかかる組成物の調製は、刊行されている方法を実施することにより達成でき、例えば米国特許第４，２７１，１４７号（引用してここに援用する）は、ワクチンに使用する髄膜炎菌膜タンパク質の調製法を開示しており；非毒素タンパク質および実質的にＬＰＳが含まれない多糖組成物が記載されている。
ＭＳＣＲＡＭＭ−由来エピトープ基礎ワクチンは、慣習的には、例えば皮下または筋肉内などの注入により、非経口投与し得る。他の投与形態に適当な追加の製剤は、坐剤およびある場合には経口製剤を含む。坐剤では、伝統的な結合剤および担体は、例えば、ポリアルカングリコールまたはトリグリセライドを含み得；かかる坐剤は、有効成分を０．５％から１０％、好ましくは１−２％の範囲で含む混合物から形成し得る。経口製剤は、かかる通常使用される賦形剤を、例えば医薬的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等として含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤または粉末の形態をとり、１０−９５％、好ましくは２５−７０％の有効成分を含む。
本発明のペプチドおよび／またはタンパク質は、中性または塩の形としてワクチンに調剤され得る。製薬学的に許容しうる塩は酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基で形成される）を含み、これは例えば塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成された塩も、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または鉄などの無塩基、および例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等などの有機塩基から誘導し得る。
ワクチンは、薬剤形と融和する方法で、治療的に効果があり免疫原性のある量で投与し得る。投与する量は、例えば個々の免疫系の抗体産生能、および所望の保護度などを含む、治療する被験体に依存する。投与に必要な有効成分の正確な量は、当業者により容易に決定できる。しかし、適当な用量範囲は一回のワクチンに対して活性成分が数百マイクログラムという次元である。初回投与および促進注射の適当な方法は可変であるが、初回投与に続いて次の接種または他の投与が続くのは典型的である。
適用方法は大きく変化し得る。ワクチン投与に関するどの慣習的な方法も適用可能である。これらは、固体生理学的許容基剤上、または生理学的に許容できる分散液における経口適用、非経口、注入またはその他を含むと信じられている。ワクチンの用量は投与経路に依存し、宿主のサイズにより変化する。
ワクチンのアジュバント効果を得るための種々の方法は、水酸化アルミニウムまたはリン酸化（アルミニウム）などの試薬の使用、一般的に０．０５から０．１％リン酸緩衝食塩水が使用され、０．２５％溶液として使用する糖の合成ポリマー（カルボポール）を添加して、それぞれ７０℃ないし１０１℃の範囲の温度で３０秒から２分間の熱処理によるワクチン中タンパク質の凝集を含む。ペプシンでの再活性化による凝集は、アルブミンに対する（Ｆａｂ）抗体を処置し、Ｃ．ｐａｒｖｕｍまたはエンドトキシンなどの細菌細胞またはグラム陰性細菌のリポポリサッカリド成分、モノオレイン酸マンニド（アラセルＡ）などの生理学的に許容される油媒体中エマルション、またはブロッキング置換基として使用する２０％溶液ペルフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）のエマルションもまた使用し得る。
多くの場合、複数のワクチン投与が望ましく、通常６ワクチン接種以下、より通常的には４ワクチン接種以下、好ましくは１またはそれ以上、通常少なくとも約３ワクチン接種である。ワクチン接種は、通常、２から１２週間隔で、通常３から５週間隔である。定期的接種は１から５年間隔、通常３年が、抗体の防御レベルを維持するのに望ましい。免疫化の過程は、上清抗原に対する抗体アッセイにより追跡し得る。アッセイは、慣習的なラベル、例えば放射核、酵素、蛍光等で標識することにより行い得る。これらの技術はよく知られており、幅広い範囲の特許で、例えば米国特許第３，７９１，９３２；４，１７４，３８４および３，９４９，０６４で見られ、これらの型のアッセイが説明されている。
もちろん、ＤＮＡワクチン接種に関する新規な技術に照らして、実質的に全てのかかるワクチン接種療法が、ＤＮＡベクターおよび構築物での使用に適当であることが理解されよう（Ｕｌｍｅｒら（１９９３）、Ｔａｎｇら（１９９２）、Ｃｏｘら（１９９３）、Ｆｙｎａｎら（１９９３）、Ｗａｎｇら（１９９３）およびＷｈｉｔｔｏｎら（１９９３）により記載、これは引用によりここに援用する）。ＤＮＡ接種の非経口経路に加えて（筋肉内および静脈内注入を含む）、粘膜ワクチン接種も意図され、ＤＮＡ組成物液滴を鼻または気管に投与することにより達成され得る。遺伝子弾丸を使用してＤＮＡの免疫原性有効量を表皮に送達し得ることが特に考えられる（Ｆｙｎａｎら１９９３）。
４．１０ アフィニティクロマトグラフィー
アフィニティクロマトグラフィーは、一般的に、リガンドまたは抗体などの物質によるタンパク質の認識に基づいている。カラム物質は、活性化ダイなどの結合分子を、例えば不溶性マトリクスに共有結合することにより合成し得る。カラム物質は、次いで、溶液から所望の物質を吸着する。次に、結合がおこらない条件下で変化させ、基質を溶出する。アフィニティクロマトグラフィーが成功するに必要なことは：
（１）マトリクスが目的の分子に特異的に吸着しなければならない；
（２）他の汚染物質が吸着されないままであること；
（３）その結合活性を変化させることなくリガンドが結合していなければならない；
（４）リガンドはマトリクスに充分にしっかりと結合していなければならない；
（５）目的の分子を分解することなく溶出することが可能でなければならない。
本発明の好ましい実施形態は、溶液からの抗体精製におけるアフィニティクロマトグラフィー法であり、ここで、マトリクスは、セファロースＣＬ６ＢまたはＣＬ４Ｂに共有結合した、ＦｎＢＰＡ、ＦｎＢＰＢ、ＦｎＢＡ、ＦｎＢＢまたはＳｆｂから誘導したＭＳＣＲＡＭＭ−由来ペプチドエピトープを含む。このマトリクスは、直接本発明の抗体に結合し、塩、ＧｕＨＣｌ、ｐＨ、または尿素などの適当な勾配による溶出によりその分離を可能とする。
別の本発明の好ましい実施形態は、溶液からのペプチドおよびペプチドエピトープの精製におけるアフィニティクロマトグラフィー法である。この方法に好ましいマトリクスは、セファロースＣＬ４Ｂに共有結合した抗体９Ｃ３または１１Ａ５である。マトリクスは、直接本発明のアミノ酸組成物に結合し、上記の適当な緩衝液で溶出することにより、その分離を可能とする。
４．１１ 細菌病原体
発明者は、数多くの治療および予防処置において有用な本発明の方法および組成物を考える。いくつかの異なる生物体が、Ｆｎ結合ＭＳＣＲＡＭＭを発現するために記載されており、それ故、本発明には多くの可能性のある候補がある。可能性のある候補であると考えられるグラム陽性細菌には以下が含まれる：黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｍｉｎｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｒｎｅｒｉ、化膿連鎖球菌（グループＡ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ（グループＣ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ（グループＣ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ（グループＣ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（グループＢ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（グループＧ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉおよび関連種。
また特に重要であると考えられるグラム陰性種には以下が含まれる：大腸菌、緑膿菌、肺炎桿菌、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．、らい菌、結核菌、ウシ結核菌、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａおよび梅毒トレポネーマ。
５．実施例
以下の実施例は本発明の好ましい実施態様を示す。以下の実施例に開示した技術は発明者らによって本発明の実施に好適であると判断された技術であり、従って本発明の好ましい実施態様であると考えられることは当業者に容易に理解されよう。しかしながら当業者はまた、この開示に基づいて、記載された特定実施態様の種々の変更が可能であり、これらの変更が本発明の要旨及び範囲を逸脱することなく同様または類似の結果を与えることも理解されよう。
５．１ 実施例１−Ｆｎに対する接着を阻害する抗体組成物：Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ ＦｎｂＡ及びＦｎｂＢに由来のエピトープ類似体の合成
以下の方法を用いて、合成ペプチドのアミノ酸置換を行ってＦｎ結合活性を喪失したペプチドを産生する。組換えＦｎ結合性ＭＳＣＲＡＭＭタンパク質についてこのような活性喪失を評価する。Ｆｎ結合活性の喪失に導くように変異した合成ペプチドを模擬的に作製するために、部位特異的突然変異誘発を用いて適当なアミノ酸の系統的変異を惹起する。先行文献（Ｓｐｅｚｉａｌｅら，１９８４）に発表された手順を使用し、単離ｒＦｎＢＤ−Ｄの天然形態と突然変異形態とのＦｎ結合活性を比較する。次に、選択された組換えＦｎ結合性ＭＳＣＲＡＭＭと合成ペプチドとを抗体として使用して阻止抗体を産生させる。
５．１．１ ペプチドの合成及び精製
Ｆｍｏｃ（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，１９７８）またはＢｏｃ化学法（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９７６）を使用し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ ＭＰＳ ３９６ペプチドシンセサイザー（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）でペプチドを合成する。特に注釈がない限り、先行文献（Ｈａｎｃｏｃｋ，１９８４）に記載の方法を使用し、分取用スケールのＣ１８カラム（Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ５１０；Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐａｒｉａ，ＣＡ）及びＷａｔｅｒｓ ６２５ ＬＣ ＨＰＬＣシステム（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いた逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって粗調製物からペプチドを精製する。精製に使用した水性バッファ（バッファＡ）は、０．１１％（容量／容量）のリン酸と、０．２８％（容量／容量）のトリエチルアミンと、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ６．５とから構成されていた。有機バッファ（バッファＢ）は、アセトニトリル中の１５％（容量／容量）のバッファＡから構成されていた。逆相クロマトグラフィー後、ペプチドを含有する画分を５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムに十分に透析し凍結乾燥した。分析用Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４６）を用いた逆相クロマトグラフィーによってこれらの画分の純度を分析した。このために、バッファＣは０．１％（容量／容量）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液から構成され、バッファＤは９０％（容量／容量）アセトニトリル中の０．１％（容量／容量）のＴＦＡから構成されていた。８０％のバッファＥまでの勾配を使用してペプチドを溶出させ、溶出したペプチドを次に回転蒸発によって乾燥し、Ｎ末端配列解析またはアミノ酸組成分析を行った。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｆｎｂＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号＃Ｐ１４７３８）（Ｓｉｇｎａｓら，１９８９）のアミノ酸配列に基づいて、改変アミノ酸残基をもつペプチドを産生するために種々の突然変異を誘発し得る。太字残基はプロリン置換アミノ酸変異を示す。Ａｕの突然変異体の作製によって記載の改変アミノ酸配列が得られる。
Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅのｆｎｂＡ及びｆｎｂＢ遺伝子のＡＵ、Ａ１−Ａ３及びＢ１−Ｂ３ドメインに同様の突然変異を誘発し得る。また、突然変異したエピトープを作製し、次いでＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに対するＦｎ結合を阻害する阻止抗体を産生させるために、近縁細菌Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのｓｆｂ遺伝子のＰ１−Ｐ４ドメインにも同様の突然変異を誘発し得る。他の領域としては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｆｎｂＢ遺伝子中の反復（リピート）、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓのＥ１−Ｅ３反復及びＧストレプトコッカス群のＧ１−Ｇ４反復がある。
種々の微生物の保存されたリガンド結合領域には高度の相同性が見出されるので、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ及び近縁細菌に関して本発明で概説した原理は、これらの生物中で同様の突然変異を構築するために使用できる。このような結果はＪｏｈら（１９９４）によって証明されていた。彼らは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｄ１−Ｄ３に由来のペプチドがＳ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ及びＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに対するＦｎの結合を阻害することを証明した。同様に、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅに由来のペプチド（Ａ１−Ａ３）はＦｎに対するＳ．ａｕｒｅｕｓ及びＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの結合を阻害した。
５．２ 実施例２−Ｆｎに対する接着を阻害する抗体組成物：Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＦｎＢＰＡ由来のＤＵ及びＤ１−Ｄ４エピトープ類似体の合成
実施例１で発明者らは、種々のストレプトコッカス（連鎖球菌）及びスタフィロコッカス（ブドウ球菌）のフィブロネクチン結合性タンパク質の種々のドメインを認識する阻止抗体を産生するために使用されるエピトープ類似ペプチドの合成を報告した。この実施例では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｆｎｂＡ遺伝子のＦｎ結合性ドメインＤＵ及びＤ１−Ｄ４を用いた合成エピトープの作製を記載する（図１）。ＤＵ及びＤ１−Ｄ４の突然変異体の作製によって以下の表２に示す改変アミノ酸配列が得られる。
Figure 0005124062
更に、複数の突然変異アミノ酸残基を有するペプチドを作製するために、表２に示すコドンと同様の修飾コドンを用いて単一突然変異、二重突然変異、三重突然変異などの多数の組合せを作製し得る。
対応する合成ペプチドの各々に生じたアミノ酸置換によるＦｎ結合活性の喪失を評価した。次にこれらのペプチドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの双方で細菌細胞に対するＦｎ結合を阻止し得る抗体を産生させた。
５．３ 実施例３−Ｆｎに対するＳ．ａｕｒｅｕｓの接着を阻害する抗体組成物：部位特異的突然変異誘発またはｆｂｐＡ由来エピトープをコードするＤＮＡ
本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓ ｆｎｂＡ ＤＮＡセグメントは組換えペプチドの産生に特に有用である。これらのペプチドは天然型のＤＵもしくはＤ１−Ｄ４エピトープでもよくまたは部位特異的に修飾されたＤＵもしくはＤ１−Ｄ４に由来のペプチドでもよい。本文中に開示した部位特異的突然変異誘発の汎用技術は、改変ＤＮＡ配列を含む核酸セグメントの調製に使用できる。このような手順を以下に詳細に説明する。
本発明の核酸組成物の部位特異的突然変異を誘発するためには、ＰＣＲ（商標）に基づく鎖オーバーラップ伸長（ｓｔｒａｎｄ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｏｎｓｉｏｎ，ＳＯＥ）（Ｈｏら，１９８９）による部位特異的突然変異誘発が特に好ましい。ＰＣＲ（商標）の技術は前述したように当業者によく知られている。ＳＯＥ手順は、２段階ＰＣＲ（商標）プロトコルを含み、相補的な内部プライマー対（Ｂ及びＣ）を使用して野生型配列にヌクレオチド変異を適宜導入する。別々の２つの反応中に、フランキングＰＣＲ（商標）プライマーＡ（オリゴに組み込まれた制限部位）及びＤ（オリゴに組み込まれた制限部位）をプライマーＢ及びＣと共に使用して、それぞれにＰＣＲ（商標）産物ＡＢ及びＣＤを産生させる。ＰＣＲ（商標）産物をアガロースゲル電気泳動によって精製し、オーバーラップする２つのＰＣＲ（商標）フラグメントＡＢとＣＤとをフランキングプライマーＡ及びＤに組合せて、第二のＰＣＲ（商標）反応に使用する。増幅したＰＣＲ（商標）産物をアガロースゲルで精製し、適当な酵素で消化し、発現ベクターに結合し、大腸菌株ＪＭ１０１，ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ＪＭ１０５またはＴＧ１（Ｃａｒｔｅｒら，１９８５）細胞を形質転換させる。クローンを単離し、単離したプラスミドの配列決定によって突然変異を確認する。
次に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｆｎｂＡ遺伝子の部位特異的に修飾されたＤＮＡセグメントを以後の実施例に記載するように使用して、組換えペプチドを超発現させこれらのペプチドを大量に単離する。このように単離されたペプチドは、動物体内の免疫応答の誘発、産生されたペプチド特異的抗体の単離、のような本文中に記載のいくつかの方法に使用し得る。
プロテインＡアフィニティ精製したＩｇＧ調製物、抗Ｆｎ−ｐｅｐｓ及び抗Ｄ３ｐｅｐについて、それらのエピトープ特異性を試験し、且つ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのフィブロネクチン結合性ＭＳＣＲＡＭＭ，ＦｎＢＰＡのＤ反復に対するフィブロネクチンの結合を阻害する能力を試験した。ＥＬＩＳＡでは、抗Ｄ３ｐｅｐ抗体は主としてＤ３及びＤ４の配列と相互作用した。抗Ｆｎ−ｐｅｐｓ抗体はもっと広い特異性を示し、すべてのＤ反復と種々の親和性で相互作用した。
抗体の阻止活性を試験するために、表面固定化フィブロネクチンに対するＤ反復とグルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合物の結合の阻害を試験した。双方の抗体がフィブロネクチンに対するＧＳＴ−Ｄ３の結合を有効に阻害した。阻害アッセイでＧＳＴ−Ｄ１２３を使用したとき、抗Ｆｎ−ｐｅｐｓは強力な阻害活性を示したが、抗Ｄ３ｐｅｐの効果は境界的であった。抗Ｄ３ｐｅｐに強力な阻害活性が欠如していることは、エピトープ局在に観察されるような狭い特異性の表れであろう。
抗原の詳細：
抗Ｄ３ｐｅｐ ＩｇＧは、合成ペプチドＫＰＳＹＱＦＰＧＨＮＳＶＤＦＥＥＤＴＬＰＫＶ（配列１３）でウサギを免疫感作することによって産生した。ペプチドは７位に単一アミノ酸変異（グリシンをプロリンで置換）を含む。免疫感作に先立ってペプチドをキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させた。
抗Ｆｎ−ｐｅｐｓ ＩｇＧは、前出の表２に示した突然変異ペプチドＤＵ（配列４）、Ｄ１（配列６）、Ｄ２（配列８）及びＤ３（配列１０）の混合物でウサギを免疫感作することによって産生した。免疫感作に先立って４つのペプチド全部を個別にＫＬＨに結合させ、次いで等量ずつ混合した。対応する野生型ペプチド（ＤＵ（配列３）、Ｄ１（配列５）、Ｄ２（配列７）及びＤ３（配列９））も表２に示している。
５．３．１ 抗体エピトープ組成物及びその使用方法
抗Ｆｎ−ｐｅｐｓ ＩｇＧは全部のＤ反復と相互作用し、これは異種免疫原に対応し得る広い特異性を表す。抗Ｄ３ｐｅｐ ＩｇＧではもっと狭い特異性が観察され、その主要結合部位がＤ３及びＤ４だけに局在する。
抗Ｆｎ−ｐｅｐｓ及び抗Ｄ３ｐｅｐ抗体に対するエピトープの所在をＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法によって決定した。ＥＬＩＳＡでは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのフィブロネクチン結合タンパク質ＦｎＢＰＡ（図４Ａ）に由来のＤ反復を１つまたは複数個含むグルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質でマイクロタイターウェルを被覆した。次に、ウェルを抗体でプローブした。これらの試験では以下の標準ＥＬＩＳＡ手順を使用した。
（１）１μｇのＧＳＴ融合タンパク質を含む１００μｌのＰＢＳと共にＩｍｍｕｌｏｎ ２（登録商標）プレートのウェルを４℃で１６時間インキュベートする。
（２）ウェルを空にし、３％のＢＳＡを含む１００μｌのＰＢＳを加える。室温で１時間維持し、０．１％のトゥイーン８０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳでウェルを５回洗浄する。
（３）０．１μｇの抗体を含む１００μｌのＰＢＳＴＢ（ＰＢＳＴ中の０．１％ＢＳＡ）を加える。室温で１時間維持する。ＰＢＳＴＢでウェルを５回洗浄する。アルカリホスファターゼにコンジュゲートした０．０５％のヤギ抗ウサギＩｇＧを含む１００μｌのＰＢＳＴＢと共にウェルを室温で１時間インキュベートする。ウェルをＰＢＳＴＢで５回洗浄する。
（４）１Ｍのジエタノールアミン、０．５ｍＭのＭｇＣｌ2，ｐＨ９．８中に１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェートを含む１００μｌの溶液を添加し、室温で１０〜２０分間維持する。プレート読取り装置を使用して４０５ｎｍの色の強度を測定する。
結果（図４Ｂ及び図４Ｃ）は、抗Ｆｎ−ｐｅｐｓが全部のＤ反復を種々の反応性で認識することを示す。他方、抗Ｄ３ｐｅｐ抗体は比較的狭い特異性を示した。抗体は主としてＤ３及びＤ４と反応した。ＧＳＴ−Ｄ１２３に対する高い反応性の理由は、組換えタンパク質中のＤ３反復の存在にあると推測される。
５．３．２ Ｄ反復とフィブロネクチンとの結合に対する抗体の効果
抗Ｆｎ−ｐｅｐｓ抗体及び抗Ｄ３ｐｅｐ抗体はフィブロネクチンとＤ反復との間の相互作用を有効に阻害した。
抗Ｆｎ−ｐｅｐｓ抗体及び抗Ｄ３ｐｅｐ抗体について、マイクロタイタープレートウェルに固定したウシのフィブロネクチンに対するＧＳＴ−Ｄ３またはＧＳＴ−Ｄ１２３の結合を阻害する能力を試験した。使用したアッセイ手順の詳細を以下に示す。
（１）１μｇのウシのフィブロネクチンを含む１００μｌのＰＢＳでＩｍｍｕｌｏｎ２プレートのウェルを４℃で１６時間被覆する。
（２）ウェルを空にし、３％のＢＳＡを含む１００μｌのＰＢＳを加える。室温で１時間維持し、０．１％のトゥイーン８０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でウェルを５回洗浄する。
（３）種々の量の抗体を予め混合しておいた０．０５％のビオチニル化ＧＳＴ融合タンパク質を含む１００μｌのＰＢＳＴＢをウェルに加える。室温で１時間維持する。次いでＰＢＳＴでウェルを５回洗浄する。
（４）アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたストレプトアビジンを含む１００μｌのＰＢＳＴＢと共にウェルを室温で１時間インキュベートする。ＰＢＳＴＢでウェルを５回洗浄する。
（５）１Ｍのジエタノールアミン、０．５ｍＭのＭｇＣｌ2，ｐＨ９．８中に１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェートを含む１００μｌの溶液を添加し、室温で１０〜２０分間インキュベートする。ＥＬＩＳＡプレート読取り装置を使用して４０５ｎｍの色の強度を測定する。
双方の抗体は５ｍｇ／ｍｌの濃度でフィブロネクチンに対するＧＳＴ−Ｄ３の結合をほぼ完全に阻害した（図５Ａ及び図５Ｂ）。プレ免疫血清に由来の免疫グロブリンを対照として使用した。プレ免疫ＩｇＧが結合阻害能力を有していないことは、抗Ｆｎ−ｐｅｐｓ抗体及び抗Ｄ３ｐｅｐ抗体が特異的活性を有することを証明した。
フィブロネクチンに対するＧＳＴ−Ｄ１２３の結合を阻害する抗Ｄ３ｐｅｐの能力は境界的であった。しかしながら、ＧＳＴ−Ｄ１２３とフィブロネクチンとの相互作用は抗Ｆｎ−ｐｅｐｓによって有意に低下した。抗Ｄ３ｐｅｐ ＩｇＧの存在下ではＧＳＴ−Ｄ１２３はそのＤ１及びＤ２部分を介してフィブロネクチンに結合するが、この部分は抗Ｆｎ−ｐｅｐｓ抗体によって容易にブロックされると考えられる。
５．４ 実施例４−ｆｎｂＡ由来抗原の組換え体発現
ｆｎｂＡ由来のＭＳＣＲＡＭＭ及び先行実施例に記載の合成的に修飾されたそれらのペプチド誘導体を超発現させるために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｆｎｂＡ遺伝子の天然型エピトープ領域または遺伝的に修飾されたエピトープ領域をコードするＤＮＡフラグメントを適当な発現ベクターにクローニングする。このようなベクターは、問題の核酸セグメントの発現が誘導プロモーターによって調節されるように当該核酸セグメントを配置する多数の制限酵素クローニング部位を含み得る。挿入されたセグメントの向き、プロモーターの誘発、増殖条件の決定、及び、制限酵素分析、及び、産生されたタンパク質の回収、などに関する方法は当業者に周知である。ペプチドの発現及び定量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット分析、タンパク質定量アッセイ、のような標準方法で測定できる。
ｆｎｂＡ由来のＭＳＣＲＡＭＭ及び合成的に修飾されたそれらのペプチド誘導体を超発現させるために使用される方法はまた、本文中に後述するようなＳ．ａｕｒｅｕｓのｆｎｂＡ遺伝子またはｆｎｂＢ遺伝子に由来の他のペプチド、並びに、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅのｆｎｂＡ遺伝子及びｆｎｂＢ遺伝子に由来のペプチド、または、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのｓｆｂ遺伝子に由来のペプチドなどのような他の細菌のフィブロネクチン結合性タンパク質、ペプチド、及び、修飾ペプチド誘導体を超発現させるために使用できる。
本発明の１つの特徴は組換えタンパク質の量産である。このような方法は当業者に公知であり本文中でも詳細に前述した。総合的且つ普遍的な意味で、特定構築物及び組換えタンパク質産生用の種々の発現系の個々の利点に基づいて選択された種々の発現系を用いて、原核細胞中または真核細胞中で多数の組換えタンパク質が産生され得る。本発明の特徴は、本文中で詳細に前述したように、ｐＱＥ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ），ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｌｔｄ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）及びｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を使用することである。
５．５ 実施例５−エピトープの円二色性（ＣＤ）分析
円二色性（ＣＤ，Ｗｏｏｄｙ，１９７４）の使用は突然変異タンパク質の完全分析の重要な要素である。これらのデータは結合活性の変化が突然変異タンパク質中のコンホメーション変化の結果であるか否かを判定するために有用である。
本発明の重要な特徴によれば、Ｊａｓｃｏ Ｊ７２０分光旋光計を使用し、組換えタンパク質及び突然変異タンパク質の平均的な二次構造及び三次構造を遠−及び近−ＵＶ円二色性（ＣＤ）分光法によってモニターする。１９０〜２５０ｎｍのＣＤデータ（遠−ＵＶ ＣＤ）を表す少なくとも４つのスペクトルを０．２ｍｍ路長の水晶セル中で２５℃で記録し平均化する。同様に、２５０〜３２０ｎｍのＣＤデータ（近−ＵＶ ＣＤ）を表す少なくとも４つのスペクトルを１．０ｃｍ路長の水晶セル中で２５℃で記録し平均化する。結果をモル楕円率（ｄｅｇ−ｃｍ2／モル）として表す。ＣＢＤ（３０−５２９）から観察されたスペクトルを標準として使用する。
５．６ 実施例６−抗体組成物の調製
上述の合成ペプチド及び組換えペプチドを動物体内で免疫応答を誘発するため並びにこれらのエピトープに特異的な抗体を調製するために使用し得る。抗体の調製は本文中に前述したように当業者に公知である。簡単に説明すると、本発明の新規なペプチドを抗原として以下のように使用する。
各ペプチドをキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させ、皮下注射によってＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作する。初回注射で２５０μｇのタンパク質を投与し、７週後にブースター注射として２５０μｇのＫＬＨ−結合ペプチドの各々を投与し、その１週後に採血する。注射を受けたマウス体内で産生されたポリクローナル抗体について、天然型ＭＳＣＲＡＭＭ及び突然変異ＭＳＣＲＡＭＭを認識する能力をＥＬＩＳＡアッセイで試験する。また、単離ＭＳＣＲＡＭＭ及び完全形細菌に対するＦｎの結合を阻害する抗体の能力を、確立された阻害アッセイ（Ｊｏｈら，１９９４）を用いて試験する。阻止ポリクローナル抗体を産生するマウスからｍＡｂが産生されるであろう。
２ｍｇのＫＬＨを２００μｌの脱イオン水で復元する。２ｍｇのペプチドを０．５ｍｌのコンジュゲーションバッファ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に溶解する。５００μｌのペプチド溶液を２００μｌのキャリアタンパク質溶液に添加し、次いで５０μｌの水に入れた０．５ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を添加する。混合物をエンド−オーバー−エンドミキシングによって室温で２時間インキュベートする。１つの精製バッファ塩ボトルの中味を６０ｍｌの脱ガスした脱イオン水に溶解する。脱塩カラムを５ｍｌの精製バッファで洗浄し、ペプチドキャリアー混合物をカラムの頂部から直接注入する。洗浄バッファの０．５ｍｌのアリコートをカラムに添加し、各画分を個別の管に収集する。ＫＬＨにコンジュゲートしたペプチドがカラムの第一または第二の画分に存在する。
種々の組換えＳ．ａｕｒｅｕｓ ＭＳＣＲＡＭＭ、合成ペプチド及びそれらのリガンドの相互作用に関する動力学的パラメーターを試験するために、実時間の生物物質特異的相互作用分析（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用する。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）は、表面プラスモン共鳴を利用して分子間相互作用を検出する。リガンドは、慣用の結合化学法を用いてデキストラン被覆センサチップに共有結合的に固定化され得る。微量流動システムを用い、固定化したリガンド上に“分析液”を連続的に流す。生物物質の分子間相互作用が実時間で記録されるので、大抵の場合にはオンレート（Ｋon，μＭ-1ｓ-1）及びオフレート（Ｋoff，ｓ-1）のような動力学的データが得られる。更に、平衡結合定数（Ｋd）も計算できる。分析後、チップの表面を５ｍＭのＨＣｌで再生する。これは、すべての結合分子を有効に除去し、次のサンプル処理を可能にする。この技術によれば、幾つかのグラム陽性細菌のＭＳＣＲＡＭＭの解離定数、会合定数及び親和性定数の精密な値が得られる（Ｊｏｈら，１９９４；Ｐａｔｔｉら，１９９５）。
５．７ 実施例７−修飾ＭＳＣＲＡＭＭを用いた受動免疫方法
本文中に開示した抗体組成物は、ＦｎのようなＥＣＭ成分に対する細菌の接着を防止する動物の受動免疫に特に有用である。本文中に記載した部位特異的に修飾されたＦｎ結合性ＭＳＣＲＡＭＭは動物ドナー、特にヒトのような哺乳動物ドナーを免疫感作するための抗原として特に有用であると考えられる。ドナーの血漿に由来の免疫グロブリン画分（Ｉｇ）を精製し、標的集団に全身的に投与できる。ストレプトコッカス及びスタフィロコッカスの感染症が進行する危険性の高い個体の非限定例としては、関節または弁の交換手術を受けた患者、心内膜炎の患者、重傷を負った患者、集中治療室の患者、免疫低下患者、連続的な外来腹腔内透析（ＣＡＰＤ）に使用されるカテーテルを装用している患者、外科手術を受けた患者、血管移植、皮膚移植及び他の侵入性外科処置を受けた患者がある。
本発明のペプチドで免疫感作することによって産生された抗Ｆｎ結合性ＭＳＣＲＡＭＭ Ｉｇは複数の分野で特に有用である。
（１）Ｆｎで被覆された基質に対する細菌の接着を阻止する。
（２）免疫系のオプソニン作用によるクリアランスを支援する。
（３）従来の補体経路の活性化によって細菌を溶解する。
５．８ 実施例８−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌Ｃｏｗａｎ株のビオチン標識及び突然変異合成ペプチドによるＦｎ結合の阻害
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌Ｃｏｗａｎ株を脳−心インフュージョンブロス（ＢＨＩ；Ｄｉｆｃｏ）中で定速回転下に３７℃で１５時間培養した。遠心によって細菌を採集し、炭酸水素塩バッファ（５０ｍＭのＮａＨＣＯ3，ｐＨ８．５）に最終密度１０10細胞／ｍｌまで再浮遊させた。最終密度は、サンプルの６００ｎｍの吸光度を、Ｐｅｔｒｏｆｆ Ｈａｕｓｓｅｒチェンバーでカウントした細胞とＡ600との関係を表す予め作成した標準曲線に比較することによって決定した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の細菌浮遊液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に、１ｍｌあたり１００μｌの１％のＮＨＳ−ビオチンを添加することによって、細菌細胞をビオチン標識した。スタフィロコッカスの細胞をＮＨＳ−ビオチンと共に定速回転下に室温で２時間インキュベートした。細菌細胞の遠心後に上清を除去することによってビオチニル化反応を停止させた。次に細菌をＰＢＳ中で３回洗浄して取込まれなかったビオチンを除去した。次に、細菌細胞浮遊液を１×１０10細胞／ｍｌに調節し、細胞をＰＢＳ，ｐＨ７．４中で４℃で保存した。非ビオチニル化細菌の増殖を防ぎバックグラウンドを低減するために、ナトリウムアジド及び０．１％ＢＳＡを添加した。
５．８．１ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＦｎＢＰＡのＤ３野生型に基づく合成ペプチド
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＦｎＢＰＡのＤ３反復に基づく一連のペプチドを、全配列中の各位置にプロリン残基を含むように合成した（即ち、プロリンスキャン；表３）。突然変異ペプチドについて、固定化フィブロネクチンに対するビオチニル化Ｓ．ａｕｒｅｕｓ結合を阻害する能力を先ず試験した。精製Ｆｎを３０μｇ／ｍｌで含む１００ｍｌの溶液で、９６ウェルのＩｍｍｕｌｏｎ ＩＩプレートのウェルを室温で２時間または４℃で一夜被覆した。ウェルを１×リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）−０．０５％トゥイーン８０で３回洗浄し、０．０１％のトゥイーン８０及び１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１時間ブロックした。１時間後、０．０５％のトゥイーン８０を含むＰＢＳでウェルを再度洗浄した。合成ペプチドを１×ＰＢＳで５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５（図２Ａ）、５０（図２Ｂ）、または２５０μｇ／ウェル（図２Ｃ）の濃度で試験した。１５〜２５分後、５０ｍｌの量の合成ペプチドを各ウェルに添加し、次いで５０ｍｌのビオチニル化Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞を添加した。プレートをシェーカーで軽く撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。１時間後、ウェルをＰＢＳ−０．０５％トゥイーン８０で洗浄し、次いで１：５０００に希釈した第二抗体ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ中で３０分間インキュベートした。３０分後、ウェルを再度洗浄し、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ；１ｍｇ／ｍｌ）を含むジエタノールアミンと共に室温で３０分間展開した。反応を４０５ｎｍでモニターした。
Figure 0005124062
更に、多重突然変異アミノ酸残基を有するペプチドを産生するために、１−２１に示したコドンと同様の修飾コドンを用いて単一突然変異、二重突然変異及び三重突然変異などの多数の組合せを作製した。
同様にして、Ｄ１領域の改変アミノ酸配列を構築して表４に示す突然変異を作製し、また、表５に示すＤ２の突然変異、表６に示すＤＵの突然変異、表７に示すＤ４の突然変異を作製した。更に、ＡまたはＢに誘発したアミノ酸変異とペプチドＧまたはＨの変異とを同時に組合せてペプチドを作製し、ペプチドＶと命名した。この突然変異組合せ技術は、単一ドメインに１つ、２つ、３つまたはそれ以上の突然変異を有する一連の合成エピトープを作製するために、表３〜７に記載のすべての突然変異ペプチドに応用できる。また、各エピトープ中の単数または多数の酸残基も同様の方法で変異させ得る。このような突然変異をＤＵ及び／またはＤ１−Ｄ４中で誘発し得る。
Figure 0005124062
Figure 0005124062
Figure 0005124062
Figure 0005124062
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ ＭＰＳ３９６ペプチドシンセサイザーの使用によって与えられる特別な利点は９６のペプチドを同時に作製できることである。対応する合成ペプチドの各々に由来のアミノ酸置換について、それらのＦｎ結合活性の喪失を評価する。次にこのようなペプチドを使用して、ｉｎ ｖｉｔｏｒ及びｉｎ ｖｉｖｏの双方で細菌細胞に対するＦｎ結合を防止する抗体を産生させる。
５．８．２ 結果
Ｆｎ結合性ＭＳＣＲＡＭＭに対して高い親和性をもつ阻止抗体の開発は、その“誘発適合”結合モードが障害となっていた。Ｆｎに対する結合を不可能にするようなＦｎアドヘシン（付着因子）結合ドメインの部位特異的変異は、阻止抗体が産生されるような抗原を生じさせるであろう。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｄ３反復モチーフに基づいて２１アミノ酸の長さの一連のペプチドを合成した。Ｆｎに結合できないペプチドを作製する機会を最大にするために、２１ｍｅｒペプチド内部の各残基を順次にプロリンで置換した（表３）。タンパク質の折返し構造（ｔｕｒｎ）中にしばしば見出されるプロリンはポリペプチドの二次構造を破壊することも知られている。次に、固定化Ｆｎに対するＳ．ａｕｒｅｕｓの付着を阻害するペプチドの能力をＥＬＩＳＡによって試験した。
図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃに示すように、プロリン残基による置換は多少は予想外の結果を生じた。図２Ｃで最も明らかなように、突然変異ペプチドは概して、Ｆｎに対するＳ．ａｕｒｅｕの結合を阻害する能力が低下していた（表３のペプチド４、７）。しかしながら、幾つかの場合にはペプチドの阻害活性が増加しており（表３のペプチド１、２、３、８、１１）、幾つかの場合にはペプチドはＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｆｎ結合能力を実際に増進させた（表３のペプチド１６、１７、１８、１９、２１）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＦｎ結合性ＭＳＣＲＡＭＭは天然型のＦｎ結合性ＭＳＣＲＡＭＭを表す独立の３つの結合ドメインを有しているので、ワクチン候補のタンパク質は各ドメインに部位特異的変異を含んでいなければならない。
ＥＬＩＳＡ実験に基づいて、グリシン残基が他の結合ドメイン（ＤＵ、Ｄ１及びＤ２）内部の同じ位置に保存されているので、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＦｎ結合性ＭＳＣＲＡＭＭ中に見出される反復モチーフに基づく一連の追加ペプチドを、同じ位置にプロリン置換を含むように合成した（表８）。新しいペプチドについても、固定化Ｆｎに対するＳ．ａｕｒｅｕｓ結合を阻害するそれらの能力を試験した。低濃度（１０μｇ）のペプチド誘導体を対照サンプル（ペプチド非含有）と比較すると、Ｄ１及びＤ２の突然変異ペプチドは阻害活性を全く示さなかった（図３Ａ）。より高い濃度（２５０μｇ）の突然変異ペプチドを試験すると、Ｄ１−２Ｐ及びＤＵ−１４Ｐから阻害活性が検出されたが（図３Ｂ）、突然変異ペプチドＤ２−２２Ｐ及びＤＵ−１３Ｐは野生型ペプチドに比較して阻害活性を実質的に全く示さなかった。これらのデータは、プロリン置換がペプチドの総合的なＦｎ結合能力を妨害したことを示唆する。
Figure 0005124062
５．９ 実施例９−Ｆｎ結合の阻害には幾つかのエピトープに特異的な抗体が必要である。
この実施例は異なる２つの形態の組換えＤ１−３免疫原に対する免疫応答を分析し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＦｎ結合性ＭＳＣＲＡＭＭに対するＦｎ結合を阻害し得る抗体を産生するためには、抗体が保存配列を含む特異的エピトープに対する抗体でなければならないことを示す。更に、Ｄ３モチーフのＣ末端ハーフ中のこの保存配列に特異的な抗体を得る方法は、所望のエピトープを含む合成ペプチドによる免疫感作だけであった。
５．９．１ 材料及び方法
５．９．１．１ 細菌株、プラスミド及びタンパク質の精製
先行文献（Ｆｒｏｍａｎら，１９８７）に記載されたＳ．ａｕｒｅｕｓ菌Ｎｅｗｍａｎ株からＦｎＢＰを精製した。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴＤ１−３を大腸菌中で発現させるためのプラスミドｐＧＥＸＤ１−３は別の文献（Ｈｕｆｆら，１９９４）に記載されていた。ＧＳＴＤ１−３をトロンビンで処理し、次いでイオン交換クロマトグラフィーで処理することによって組換えＤ１−３を精製した（Ｈｕｆｆら，１９９４）。ＧＳＴＤ１−３及び組換えＤ１−３のモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍの吸光度１．０がそれぞれ０．９５及び３．６ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に相当することを確認した。また、Ｄ１−３をコードするＤＮＡをベクターｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）中でクローニングして、マルトース結合性融合タンパク質ＭＢＰＤ１−３を大腸菌ＴＢ１中で発現させるｐＭＡＬＤ１−３を作製した。ＭＢＰＤ１−３融合タンパク質を、細胞溶解物の選択的硫安沈殿、次いでＰｈａｒｍａｃｉａ Ｇｒａｄｉ−Ｆｒａｃクロマトグラフィーシステムを用いるＱ−セファロース及びフェニル−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィーによって精製した。抗体精製のためには、凍結乾燥した融合タンパク質を０．５Ｍの炭酸水素ナトリウム（２ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、等量のカルボニルジイミダゾール活性化（Ｂｅｔｈｅｌｌら，１９７９）セファロースＣＬ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を添加することによってアフィニティマトリックスを調製した。エンド−オーバー−エンドミキシングによって４℃で４８時間結合させた後、ビシンコニン酸プロトコル（Ｓｍｉｔｈら，１９８５）を用いた残留タンパク質のアッセイによって結合効率７０％を確認した。
５．９．１．２ 合成ペプチド抗原の調製
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４３１Ａペプチドシンセサイザーを使用し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｇａｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって、Ｄ１モチーフのアミノ酸２１−３４（Ｄ１21-34；ＱＧＧＮＩＶＤＩＤＦＤＳＶＰ：配列６０）及びＤ３モチーフのアミノ酸２０−３３（Ｄ３20-33；ＱＦＧＧＨＮＳＶＤＦＥＥＤＴ；配列６１）をＮ末端システインと共に合成した。Ｉｍｊｅｃｔ免疫原コンジュゲーションキット（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を備えたプロトコルに従って、ペプチドをＮ末端システインを介してマレイミド活性化キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合した。
５．９．１．３ 坑血清の産生及び抗体の精製
６匹の雄ニュージーランド白ウサギを、フロインド完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）中の１ｍｇのＧＳＴＤ１−３の皮下注射によって免疫感作した。３匹のウサギのグループにはブースターとして不完全アジュバント中の８０μｇのＧＳＴＤ１−３またはＤ１−３ペプチドの筋肉内注射を２週おきに投与した。各免疫感作の１０日後に動物から採血し、１２８日後に心臓穿刺によって最終的に採血した。抗体を精製するために、ゼラチンセファロース（Ｍｉｅｋｋａら，１９８２）上のクロマトグラフィーによって坑血清からＦｎを除去し、次いでセファロースＣＬ４Ｂに結合させたＭＢＰＤ１−３融合タンパク質から成るアフィニティマトリックスに通した。リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び０．５Ｍの塩化ナトリウム含有ＰＢＳで順次洗浄後、結合抗体を３．５ＭのＭｇＣｌ2に溶出させ、２０ｍＭの炭酸水素アンモニウムに透析し、凍結乾燥した。
抗ペプチド抗体の場合には、２匹の雄ニュージーランド白ウサギの各々を、フロインド完全アジュバントに乳濁させた１００μｇのＢＳＡ結合Ｄ１21-34（Ｄ１21-34ＢＳＡ）またはＫＬＨ結合Ｄ３20-33（Ｄ３20-33ＫＬＨ）の皮下注射によって免疫感作した。抗体価の平坦域が観察されるまで１００μｇのブースター用量を２週おきに投与した。免疫血清またはプレ免疫血清から得られたＩｇＧをプロテイン−Ａアガロース（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８７）で精製した。Ｆ（ａｂ′）2フラグメントを調製するために、２０ｍｇの凍結乾燥ＩｇＧを２ｍｌの７０ｍＭの酢酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ４．０に溶解し、ペプシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ１０８０５７）を１ｍｇのＩｇＧあたり３０μｇの割合で添加した。３７℃の水浴中で一夜インキュベーション後、トリスバッファ，ｐＨ８．０を０．１Ｍまで添加し、５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のナトリウムアジド，ｐＨ７．４中で平衡させた１．５×９０ｃｍのＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のクロマトグラフィーによって、ペプシン消化ＦｃフラグメントからＦ（ａｂ′）2フラグメントを分離した。
５．９．１．４ ＥＬＩＳＡ及びエピトープマッピング
Ｃｏｒｎｉｎｇの９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、０．０５％容量／容量のトゥイーン２０を含有するＰＢＳから成る洗浄バッファ、ＰＢＳ中の３％重量／容量ＢＳＡのブロッキング溶液、０．０５％のトゥイーン２０及び０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳから成る抗体希釈バッファを用いてＥＬＩＳＡを実施した。第一及び第二の抗体のインキュベーションはオービタルミキサー上で２０℃で６０分間実施した。第二抗体としては、アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ、または、Ｆ（ａｂ′）2特異的ヤギ抗ウサギＩｇＧのアルカリホスファターゼにコンジュゲートしたＦ（ａｂ′）2フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ ＰＡ）を、抗体バッファで５０００倍に希釈して用いた。ＥＬＩＳＡプレートを、０．１Ｍのジエタノールアミンバッファ，ｐＨ９．８中の１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）と共に２０℃で６０分間展開し、４０５ｎｍのフィルターを備えたＴｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｐｌｕｓ ＥＬＩＳＡプレート読取り装置で定量した。Ｔｉｔｔｅｒｓは、最大ＥＬＩＳＡ応答（Ａ405）の１／２を生じる坑血清の希釈度または抗体の濃度であると定義される。
エピトープマッピングのために、連続するペプチド配列の各々を先行する配列に２アミノ酸だけオフセットさせて、Ｄ１モチーフとＤ２のＮ末端の１８残基とにわたるオーバーラップデカペプチドを、Ｃｈｉｒｏｎ Ｍｉｍｉｔｏｐｅｓ（Ｃｌａｙｔｏｎ Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって合成した。Ｄ３モチーフにわたる１５のオーバーラップするデカペプチドから成る別のセットも合成した。各ペプチドは、Ｎ末端ビオチンと、ＳＧＳＧから成る４つのアミノ酸スペーサーとを含んでいた。Ｃｏｒｎｉｎｇマイクロタイタープレートのウェルを、蒸留した脱イオンＨ2Ｏ中に５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む１００μｌの溶液で被覆し、３７℃で一夜インキュベーション中にプレート上で乾燥させた。ブロッキング及び洗浄の手順は汎用ＥＬＩＳＡプロトコルに記載された手順を用いた。６Ｍのグアニジニウム塩酸塩中のビオチニル化ペプチド（２ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳで１０００倍に希釈し、１００μｌのアリコートを、ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイタープレート中で２０℃で６０分間インキュベートした。次に、プレートを洗浄し、ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ−０．０５％トゥイーン２０中に５０ｎｇ／ｍｌに希釈したアフィニティ精製抗体を含む１００μｌの溶液と共に６０分間インキュベートした。次に、プレートを汎用ＥＬＩＳＡプロトコルに記載の手順で展開した。
５．９．１．５ Ｆｎ結合の阻害アッセイ
種々の抗体調製物について、ＣｏｒｎｉｎｇポリスチレンＥＬＩＳＡウェルストリップに被覆したＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞に対するＦｎの結合を阻害する能力を検定した。ヒト血漿ＦｎをＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手し、クロラミンＴ手順（Ｈｕｎｔｅｒ，１９７８）を用いて比活性２７ＭＢｑ／ナノモルまで125Ｉで標識した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｎｉｔｏｂａ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得られたＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｌ８５７血液培養単離物をＢＨＩブロス（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中で３７℃で中期対数増殖期まで増殖させた。１×１０10／ｍｌの熱殺害細菌の浮遊液を先行文献（ＭｃＧａｖｉｎら，１９９１）に記載の手順で調製し、炭酸塩：炭酸水素塩バッファで１０倍希釈し、オービタルミキシングによって４℃で一夜インキュベーション中にＣｏｒｎｉｎｇポリスチレンＥＬＩＳＡウェルストリップを被覆した。０．０５％容量／容量のトゥイーン２０を含むＰＢＳでウェルを洗浄し、３％重量／容量のＢＳＡを含む２００μｌのＰＢＳと共に３７℃で６０分間のインキュベーションによってブロックした。ＰＢＳ−トゥイーン２０で洗浄後、５０μｌの抗体またはＦ（ａｂ′）2阻害物質を添加し、０．０５％のトゥイーン８０及び０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳに希釈した。細胞を阻害物質と共にオービタルミキサーで３０分間プレインキュベートし、次いで、同じバッファに希釈した５０μｌの125Ｉ−Ｆｎ（５０，０００ｃｐｍ）を添加した。更に６０分間インキュベーション後、ウェルをＰＢＳ−０．１％のトゥイーン８０でよく洗い、次いで、Ｓａｒｓｔｅｄｔの７５×１２ｍｍのポリスチレン遠心管に移した。結合した125Ｉ−Ｆｎの量をＬＫＢ Ｗａｌｌａｃモデル１２７２全自動ガンマカウンタで定量した。
５．９．２ 結果
５．９．２．１ 抗体のアフィニティ精製及びＦｎ結合の阻害
試験抗原としてＤ１−３を用いたＥＬＩＳＡによって測定すると、ＧＳＴＤ１−３または組換えＤ１−３によってブーストした動物からプールした坑血清は、１１０，０００及び７，０００〜９，０００の最大抗体価を示した。３００ｍｌのプール坑血清のアフィニティ精製では、ＧＳＴＤ１−３免疫原及びＤ１−３免疫原をそれぞれ用いて産生させた坑血清から３５ｍｇ及び７ｍｇの抗体が得られた。アフィニティ精製抗体はそれぞれ２０ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌの抗体価を示した（図６）。従って、ＧＳＴＤ１−３のほうが高い力価の坑血清を誘発する優れた免疫原であったが、アフィニティ精製された抗体の力価の劇的な差異はなかった。しかしながら、ＧＳＴＤ１−３融合タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対するＦｎ結合のより有効な阻害物質である抗体を産生した（図７）。１〜２０μｇ／ｍｌの抗体濃度で用量依存性阻害が観察され、２０μｇ／ｍｌに５０％阻害が生じた。しかしながら、より高い濃度でも５０％以上の阻害を促進しなかった。Ｄ１−３免疫原によって得られた抗体の場合には、５０％阻害を達成するために２００μｇ／ｍｌの濃度が必要であった。従って、Ｄ１−３免疫原によって産生された抗体は、融合タンパク質で免疫感作することによって得られた抗体に比べてＦｎ結合の阻害物質としての有効性が約１／１０であった。
５．９．２．２ エピトープ特異性
最初に、完全Ｄ１モチーフとＤ２のＮ末端の１８の個のアミノ酸にわたる２４のデカペプチドを合成した。連続するペプチドの各々は先行ペプチドに８個のアミノ酸だけオーバーラップしている（表９）。Ｄ１及びＤ２のモチーフは高度に相同性であり、３８個のアミノ酸のうちの５個だけが異なる（Ｓｉｇｎａｓら，１９８９）。従って、これらのデカペプチドは、Ｄ１モチーフ内部の優性エピトープをマップし、Ｄ１のＣ末端とＤ２のＮ末端とにわたるエピトープを同定するように設計された。Ｄ１−３免疫原は、広いスペクトルのエピトープ特異性を有する抗体を産生した（図８Ａ）。それぞれＤ１モチーフの残基７−２０（Ｄ１7-20）及びＤ２7-18にわたるＳＦＥＥＤＴＥＥＤＫＰＫＹＥ（配列１０５；ペプチド＃４−６；表９）及びＳＦＥＥＤＴＥＫＤＫＰＫ（配列６２；ペプチド＃２３及び２４；表９）によって定義された酸性アミノ酸のクラスターによるエピトープの認識が最も顕著であった。先行の研究は、合成ペプチドＤ１1-18及びＤ２1-18がＦｎのＮ末端フラグメントと相互作用しないことを示した（Ｈｕｆｆら，１９９４）。従って、この抗体調製物は、Ｆｎ結合に関与しないアミノ酸配列に特異的な抗体のかなり大きい集団を含む。また、配列Ｄ１17-38にわたる複数のデカペプチドのもっと変動し易い認識も存在していた。
対照的に、免疫原としてＧＳＴＤ１−３を用いて産生させた抗体は、制限された特異性を示し、アミノ酸配列Ｄ１21-34，ＱＧＧＮＩＶＤＩＤＦＤＳＶＰ（配列６０；ペプチド＃１１−１３；表９；図８Ｂ）にわたる連続する３つのデカペプチドを主として認識した。先行の研究では、アミノ酸Ｄ２18-38及びＤ３16-36を表す合成ペプチドは完全形のＤ２及びＤ３モチーフと同等の親和性でＦｎのＮ末端フラグメントに結合した（Ｈｕｆｆら，１９９４）。従って、この抗体調製物によって認識された主要エピトープは、Ｆｎ結合に必須のアミノ酸配列の内部に存在する。更に、この抗体調製物は、Ｄ１−３を免疫原として産生された抗体に対する主要エピトープである酸性アミノ酸のクラスターに対して反応性を殆ど示さなかった。どの抗体調製物もＤ１モチーフのＣ末端の８個のアミノ酸及びＤ２モチーフの最初の８個のアミノ酸にわたるアミノ酸配列の内部のエピトープを認識しなかった。従って、個別の２つのモチーフにわたるアミノ酸配列から成る有意なエピトープは存在しないと考えられる。
Figure 0005124062
Ｄ３モチーフにわたる１５のデカペプチドのシリーズで検定すると（表１０；図９Ａ及び図９Ｂ）、ＧＳＴＤ１−３免疫原によって得られた抗体はこれらのペプチドを明らかには認識しなかったが（図９Ｂ）、Ｄ１−３免疫原によって得られた抗体は、Ｄ３のＣ末端の１１個のアミノ酸を表すＶＤＦＥＥＤＴＬＰＫＶ（配列８６；ペプチド＃１４及び１５；表１０）を認識した。配列ＦＥＥＤＴ（配列８７）はこの１１個のアミノ酸配列の内部で観察され、またこの抗体調製物によって認識されるＤ１及びＤ２モチーフの内部の２つの主要エピトープ中でも観察される。従って、Ｄ１−３免疫原は、Ｆｎ結合に関与しないＤ１及びＤ２モチーフのＮ末端ハーフ中で最も顕著な酸性アミノ酸のクラスターに対して高い特異性をもつ抗体を産生したと考えられる。
Figure 0005124062
５．９．２．３ 定義された特異性の抗体を産生するための合成ペプチドの使用
ＧＳＴＤ１−３免疫原は、低濃度で有効な阻害物質であり且つアミノ酸配列Ｄ１21-34にわたるＱＧＧＮＩＶＤＩＤＦＤＳＶＰ（配列６０）に高い特異性を示す抗体を産生した。Ｄ２モチーフの配列Ｄ２21-34（ＨＧＧＮＩＩＤＩＤＦＤＳＶＰ；配列１０３）はほぼ同じであり、これは、これらのエピトープに特異的な抗体だけがＳ．ａｕｒｅｕｓに対するＦｎ結合を阻害し得ることを示唆する。しかしながら、Ｆｎ結合の阻害は不完全であり、これらの抗体は、Ｄ３モチーフのアミノ酸２０−３３（Ｄ３20-33）から成り且つＦｎ結合に必須であることが判っているアミノ酸を含む配列ＱＦＧＧＨＮＳＶＤＦＥＥＤＴ（配列６１）に対する反応性を全く示さなかった（ＭｃＧａｖｉｎら，１９９３；ＭｃＧａｖｉｎら，１９９１）。
この配列に特異的な抗体を得るために、マイレミド活性化ＫＬＨに結合するＮ末端システインをもつように合成した合成ペプチドＤ３20-33でウサギを免疫感作した。また、ＧＳＴＤ１−３免疫原によって産生される抗体によって認識される主要エピトープを表すマイレミド活性化ＢＳＡに結合したＤ１21-34でウサギを免疫感作した。双方の抗ペプチド抗体調製物は組換えＤ１−３ペプチドを認識した。Ｄ１21-34免疫原はＢＳＡに結合したが、抗体希釈バッファに０．１％のＢＳＡを含有させると、ＥＬＩＳＡアッセイに使用したＢＳＡブロッキング試薬の認識による妨害が十分に排除された。
次いで、プロテインＡを利用して免疫血清からＩｇＧを精製し、Ｆ（ａｂ′）2フラグメントに変換した。得られたＦ（ａｂ′）2フラグメントはＳ．ａｕｒｅｕｓ菌Ｎｅｗｍａｎ株から精製されたＦｎＢＰを認識し（図１０）、漸増濃度の可溶性競合Ｆｎの存在下では、５０μｇ／ｍｌの可溶性Ｆｎの存在下でＦｎＢＰの認識が実質的に消滅するようなＥＬＩＳＡ応答の低減が観察された。Ｆｎ結合に必須のアミノ酸配列を含むエピトープの認識に符合して、双方のＦ（ａｂ′）2調製物は５〜２０００μｇ／ｍｌの範囲でＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞に対するＦｎ結合の濃度依存性阻害を示した（図１１）。１ｍｇ／ｍｌの濃度で、Ｄ１21-34及びＤ３20-33で免疫感作することによって得られたＦ（ａｂ′）2調製物はそれぞれ、４８．５％及び４５．６％のＦｎ結合阻害を誘発した。しかしながら、２つのＦ（ａｂ′）2調製物の混合物を１００または２００μｇ／ｍｌで使用したときのＦｎ結合阻害を試験すると、阻害の程度は、同じ濃度のいずれか一方のＦ（ａｂ′）2を単独で使用した場合を上回っていなかった（図１２）。従って、Ｆ（ａｂ′）2フラグメントは、Ｆｎ結合に必須のＤ１及びＤ３モチーフの内部のエピトープに特異的であったが、組合せて試験したときに、相加効果または相乗効果は観察されなかった。
５．９．３ 理論的考察
発明者らは、Ｆｎ結合を阻害する抗体に対するエピトープを構成する特異的アミノ酸配列を同定した。組換えＤ１−３を免疫原として産生された抗体はＦｎ結合の比較的弱い阻害物質であり、これらの抗体のかなりの割合が、Ｆｎに親和性を全く示していなかった（Ｈｕｆｆら，１９９４）Ｄ１及びＤ２モチーフのＮ末端の１８個のアミノ酸中のエピトープに特異的であった。対照的に、ＧＳＴＤ１−３を免疫原として産生された抗体は、低濃度で用量依存性阻害を示し、主としてアミノ酸配列Ｄ１21-34の内部のエピトープに特異的であった。この配列は、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅのＡ２モチーフがＦｎに結合するために必須であり、スタフィロコッカス種及びストレプトコッカス種に由来の異なる複数のＦｎ結合アドヘシンの反復モチーフ中に存在する保存アミノ酸ＧＧ及びＩＤＦを含んでいる（ＭｃＧａｖｉｎら，１９９３；Ｐａｔｔｉら，１９９４；Ｐａｔｔｉ ａｎｄ Ｈｏｏｋ，１９９４）。
Ｄ２モチーフの対応する配列Ｄ２21-34はほぼ等しい。従って、これらのデータから、Ｆｎ結合の阻害とリガンド結合に必須のアミノ酸の保存パターンを含むエピトープの認識との間に相関関係が成立する。しかしながら、双方の免疫原の限界は、Ｄ３モチーフのＣ末端ハーフ中のＦｎ結合性配列に特異的な抗体を産生できなかったことである。
別の研究は、Ｄ１−３：β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質によって免疫感作したマウスの坑血清がＤ１及びＤ２モチーフを表す合成ペプチドを認識したがＤ３を認識しなかったことを報告した（Ｒｏｚａｌｓｋａら，１９９４）。従って、種々の動物及び３つの異なる形態のＤ１−３免疫原を使用する研究では同じような困難が報告されていた。
発明者らは、Ｄ１21-34がＧＳＴＤ１−３免疫原によって産生された抗体に対する主要エピトープであることを証明したが、これらの抗体はＤ３モチーフ中のＤ３20-33の明らかな認識を全く示さなかった。Ｄ１21-34とＤ３20-33との間の唯一の一致は、他のＦｎ結合アドヘシンの反復モチーフ中に保存されておりＦｎ結合に必須である保存ＧＧ及び（Ｉ／Ｖ）ＤＦ配列モチーフを含むことである。従って、これらの２つの配列は機能的に同一であるが、Ｄ１−３またはＧＳＴＤ１−３を用いた免疫感作によってＤ３20-33に特異的な抗体を得ることはできなかった。１つの解釈によればこの観察が抗原提示の関与によって説明される。Ｄ１−３ポリペプチドの１成分であるＤ３が免疫原として提示されるとき、Ｆｎに対して５〜１０倍の親和性を有しているＤ１及びＤ２とは異なるそのアミノ酸配列が（Ｈｕｆｆら，１９９４）、低い免疫原性の原因であると考えられる。
更に、Ｄ１−３及び他のグラム陽性アドヘシン由来のＦｎ結合性縦列反復モチーフは、溶液中では本質的に構造化されていないが、ＦｎのＮ末端フラグメントとの複合体を形成するときはかなりの転移を生じる。従って、Ｄ１−３とＦｎとのｉｎ ｖｉｖｏ相互作用は、リガンド結合に必須であるエピトープの遮蔽、抗原プロセシングの妨害、または、リガンド結合に必須でないアミノ酸配列に特異的な抗体の産生の促進、などを生じた。
Ｄ３20-33に特異的な抗体を得る方法は、この特異的配列に対応する合成ペプチドによる免疫感作だけであった。先行する研究では、Ｄ３20-33はＳ．ａｕｒｅｕｓに対するＦｎの結合を阻害できなかったが、Ｎ末端にトリペプチドＰＳＹ（Ｄ３17-33）またはＣ末端にＬＰＫ（Ｄ３20-36）が付加されるとＦｎ結合機能を回復することが知見されていた（ＭｃＧａｖｉｎら，１９９１）。従ってこの配列は、Ｆｎ結合に必須の保存ＧＧ及び（Ｉ／Ｖ）ＤＦアミノ酸を含んでいるが、単独ではＦｎに結合できない。即ち、Ｄ３20-33はＦｎ結合に必須のコア配列を表すが、Ｆｎ結合に有利な二次構造を生じるためには３個またはそれ以上のＮ末端またはＣ末端アミノ酸が必要であると考えられた。
あるいは、ペプチドがリガンドとの接触を維持するために必要なコンホメーション変化はＦｎとの初期接触によってトリガされ、Ｄ３20-33はこのコンホメーション変化を生じる能力がないのであろうという考え方も示唆された。この仮説は、Ｄ１−３がＦｎのＮ末端に接触すると構造転移が生じるという観察によって支持される。これは、多くのレセプター−リガンド相互作用に関係し、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅのＦｎ結合性ＦｎＢＡアドヘシンを免疫原として使用したときに示されたように、レセプター機能を阻害する抗体の産生にも影響を与えた。この結果として、リガンド誘発結合部位を認識するモノクローナル抗体が産生され、この抗体は、この配列を含むペプチドが有しているＳｔａｐｙｈｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ細胞とＦｎとの結合を阻害する能力を促進した（Ｓｐｅｚｉａｌｅら，１９９６）。Ｆｎ結合性部位のリガンド結合コンホメーションがモノクローナル抗体によって安定されると考えられた。
Ｄ１−３ポリペプチドは溶液中で構造化されていないので、種々のエピトープにポリクローナル抗体が結合する結果、多くの予測できない効果が生じる。これらは、ホスホリラーゼキナーゼの触媒性ｇ−サブユニットに特異的な抗体を産生するための合成ペプチドの使用から明らかである（Ｗａｎｇｓｇａｒｄら，１９９６）。アミノ酸３２２−３４６を免疫原として産生した抗体はホスホリラーゼ活性を阻害したが、部分的にオーバーラップする配列３４２−３６６に特異的な抗体は活性を促進した。
Ｆｎ結合性の反復モチーフを含む免疫原に対するポリクローナル抗体応答中に、Ｆｎ結合を促進する抗体がアドヘシン阻止抗体の効果を低下させ、その表れが、Ｆｎに対する接着の免疫学的干渉を回避するために細菌中で生じるプロセスであるという考え方もある（Ｓｐｅｚｉａｌｅら，１９９６）。この場合、エピトープ特異性の多様性を制限するのが有利であろう。これが、合成ペプチドＤ１21-34及びＤ３20-33によって免疫感作を行う理論的根拠であった。この戦略は、リガンド結合に関与するアミノ酸配列に特異的な抗体の産生に成功を与えた。このことは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓから精製されたＦｎＢＰに対する結合において可溶性Ｆｎが対応Ｆ（ａｂ′）2と競合する能力を有していることから明らかであり、また、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞に対するＦｎ結合の濃度依存性阻害から明らかである。しかしながら、２つのＦ（ａｂ′）2調製物の混合物が単独の調製物による阻害を上回る阻害を与えることができなかった理由は明らかでない。ペプチド配列Ｄ１21-34及びＤ２21-34はほぼ等しいので（表８）、２つのＦ（ａｂ′）2調製物の混合物は、３つのＤモチーフの各々の内部のＦｎ結合に必須であるエピトープを十分に認識しなければならない。相加効果または相乗効果が観察できなかった理由は、立体障害によって説明することもでき、あるいは、Ｄ３20-33に対する抗体の結合が、Ｄ１21-34エピトープに対する抗体の接近（またはその逆）を制限するようなコンホメーション変化をＤ１−３中で誘発したためであると説明することもできる。
５．１０ 実施例１０−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ感染症と診断された患者におけるフィブロネクチン結合性ＭＳＣＲＡＭＭに対する血清抗体応答
この実施例は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症と診断されたヒト患者の血清のＦｎ結合性ＭＳＣＲＡＭＭ ＦｎＢＰＡに対する免疫応答の分析を示す。ＦｎＢＰＡ中のＦｎ結合性ドメインの免疫優性が証明され、血清中の抗体の１つのクラスがＦｎ結合のときに形成されたエピトープを認識することが確認された（ＬＩＢＳ抗体）。更に、スタフィロコッカスに対するＦｎ結合を促進または阻害する抗体が存在しないことが観察された。
５．１０．１ 材料及び方法
５．１０．１．１ ヒト血清
スタフィロコッカス感染症（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染）の３４人の患者の血清標本をＯｓｐｅｄａｌｅ ｄｉ Ｃｉｒｃｏｌｏｄｉ Ｖａｒｅｓｅ，Ｖａｒｅｓｅ，Ｉｔａｌｙから入手した。ヒト血清はいずれも成人患者の血清である。対照ＩｇＧは健康な２歳の幼児のプール血清から得られた。血清に由来の抗体をプロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィーによって精製し、ヒトＩｇＧを標準として用いた２８０ｎｍの吸光度によって精製ＩｇＧの濃度を定量した。
５．１０．１．２ リガンドの単離及び標識
先行文献（Ｖｕｅｎｔｏ ａｎｄ Ｖａｈｅｒｉ，１９７９）に記載の手順でヒトＦｎを調製した。先行文献（Ｈｏｕｓｅ−Ｐｏｍｅｐｅｏら，１９９６）に記載の手順でＮ末端Ｆｎフラグメント（Ｎ２９）を単離した。ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳヨウ素化試薬を製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の指示通りに用いてＮ２９フラグメントを125Ｉ−標識した。
５．１０．１．３ 組換えタンパク質：ＥＬＩＳＡアッセイ
ヒト血清から単離した免疫グロブリンについて、ＦｎＢＰＡ組換えタンパク質に対する抗体の存在をＥＬＩＳＡで試験した。試験では、マイクロタイターウェル（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム，ｐＨ９．５中に１０μｇ／ｍｌのタンパク質を含む１００μｌの溶液と共に４℃で一夜インキュベートした。ウェル中の追加のタンパク質結合部位を、０．１３Ｍの塩化ナトリウム（ＰＢＳ）を含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム，ｐＨ７．４中に２％（重量／容量）のウシ血清アルブミンを含む２００μｌの溶液と共に１時間インキュベーションすることによってブロックした。次に、ウェルを、ＰＢＳＴ（１５０ｍＭのＮａＣｌ中の０．１％のトゥイーン２０）で５回洗浄し、２％ＢＳＡを含む１００μｌのＰＢＳに溶解した２μｇの抗体と共に２２℃でインキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで５回洗浄することによって未結合の抗体を除去した。結合した抗体は、１：２０００に希釈したペルオキシダーゼにコンジュゲートしたウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｄａｋｏ，Ｇｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と共にインキュベーション（３７℃で１時間）することによって検出した。洗浄後、コンジュゲートした酵素をｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）と反応させ、４９２ｎｍの吸光度をマイクロタイター読取り装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でモニターした。
５．１０．１．４ 組換えタンパク質：Ｆｎ結合アッセイ
マイクロタイタープレート中で表面固定化ＭＳＣＲＡＭＭに125Ｉ−Ｎ２９を結合させた。５０ｍＭの炭酸ナトリウム中にＧＳＴ−Ｄｕ１２３４（１０μｇ／ｍｌ）を含む１００μｌの溶液でウェルを被覆し、４℃で一夜インキュベートし、次いで２％（重量／容量）のウシ血清アルブミンを含む２００μｌのＰＢＳでブロッキング処理した。ウェルを次に、125Ｉ標識Ｎ２９（８×１０4ｃｐｍ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．１％トゥイーン含有ＰＢＳ）でよく洗い（×５）、ウェルに結合した放射能をγカウンタで定量した。スタフィロコッカスに対する125Ｉ標識Ｎ２９の結合を先行文献（Ｓｐｅｚｉａｌｅら，１９９６）に記載の手順で定量した。
５．１０．１．５ ＧＳＴＡ−ＤＵ１２３４−セファロース上のアフィニティクロマトグラフィーによる抗ＬＩＢＳ抗体の単離
患者（Ｉ．Ｚ．）から単離した８ｍｇのＩｇＧをゼラチン−セファロースに吸着させ、結合しなかった材料を、ＧＳＴ−ＤＵ１２３４組換えタンパク質で置換しＰＢＳ−アジドで平衡させたセファロース４Ｂのカラム（１×４ｃｍ）に通した。カラム流出液の２８０ｎｍの吸光度の安定な基底線が観察されるまでカラムを平衡バッファで洗浄し（フロースルー）、次にリン酸塩バッファ中の０．４ＭのＮａＣｌで洗浄した。カラムに特異的に結合した材料を、０．１Ｍのグリシン，ｐＨ２．８で溶出させ、画分を１Ｍのトリスで中和した。未吸着の材料及び結合してカラムから溶出した材料をＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット及びドットブロットで分析した。
５．１０．２．結果
５．１０．２．１．抗ＬＩＢＳ抗体の単離
ＬＩＢＳエピトープが特定クラスのＩｇＧによって認識されるか否かを判定するために、患者（Ｉ．Ｚ．）の血清から単離した免疫グロブリンを、ＰＢＳ−アジドで平衡させたＧＳＴ−Ｄｕ１２４−セファロースアフィニティマトリックスに充填した。０．４ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸塩バッファでカラムを洗浄し、カラムに吸着されたタンパク質を０．１Ｍのグリシン，ｐＨ２．８で溶出させ、１Ｍのトリスで中和し、ＰＢＳに透析した。ＥＬＩＳＡによる分析は、アフィニティマトリックスで精製したＩｇＧがＮ２９の存在に関わりなくＧＳＴ−Ｄｕ１２３４に反応性であるが（図１３Ｃ）、未結合材料（フロースルー）はＮ２９の存在下でのみＧＳＴ−Ｄｕ１２３４を優先的に認識する抗体を含む（図１３Ｂ）ことを示した。分画化されなかった材料は中間的効果を示した（図１３Ａ）。
５．１０．２．２ 細菌とＦｎとの結合に対する抗体の効果
上記のデータは、スタフィロコッカス感染症と診断されたすべての患者の血清がＦｎに誘発されたエピトープを認識する抗体を含むことを示す。全部の患者から単離されたＩｇＧの存在下でＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞を125Ｉ−Ｎ２９と共にインキュベートすることによって、血清中の阻止抗体の存在を分析した。細菌に対する125Ｉ−Ｎ２９の結合を阻害する抗体は存在しなかった（図１４Ｂ）。更に、ＩｇＧは、マイクロタイターウェルに吸着された組換えＧＳＴ−Ｄｕ１２３４に対するリガンドの結合に影響を及ぼさなかった（図１４Ａ）。従って、スタフィロコッカスのＦｎ結合性ＭＳＣＲＡＭＭによって誘発される免疫応答は阻止抗体を産生しない。
５．１１ 実施例１１−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＦｎＢＰＡペプチドに対するモノクローナル抗体
この実施例は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＦｎＢＰＡに由来のＤ３20-33ペプチドでマウスを免疫感作することによって産生された２つのモノクローナル抗体、即ち、ｍＡｂ ９Ｃ３及びｍＡｂ １１Ａ５の産生、スクリーニング及び阻害活性を記載する。
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４３１Ａペプチドシンセサイザーを使用し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｇａｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｆｎｂＡに由来のＤ３モチーフのアミノ酸２０−３３（Ｄ３20-33；ＱＦＧＧＨＮＳＶＤＦＥＥＤＴ；配列６１）に対応する合成ペプチドをＮ末端システインをもつように合成した。Ｎ末端システインを介してペプチドをマレイミド活性化キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させた。完全フロインドアジュバント中のエマルジョンの形態の１００μｇのＤ３20-33−ＫＬＨペプチドを後足の肉趾に皮下注射することによってＢａｌｂ／Ｃマウスを免疫感作した。生理食塩水中の１００μｇのＤ３20-33−ＫＬＨペプチドから成る３回の追加注射を４、８及び１５日目に行った。１６日目にマウスを殺し、膝窩リンパ節のリンパ球を採取し、マウスメラノーマ細胞系Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３に融合させた。１５％ウシ胎仔血清、ペニシリン−ストレプトマイシン、グルタミン及び２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ １６４０ ＨＡＴ培地で細胞を培養した。
融合の１４日後に、ＢＳＡに結合したＤ３20-33を認識するためにハイブリドーマをＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。次に、Ｄ３20-33−ＢＳＡに反応するクローンについて、野生型ペプチドＤ３20-33及び組換えペプチドＧＳＴ−Ｄ１−Ｄ３に対する反応性をＥＬＩＳＡで試験した。最終的にｍＡｂ ９Ｃ３及びｍＡｂ １１Ａ５と命名した２つのクローンを選択し、腹水産生に使用した。双方のｍＡｂがＤ３モチーフ中の配列ＳＶＤＦＥＥＤＴ（配列１０４）を認識した。Ｓ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、ＥまたはＤ位の１つのアラニン置換の結果としてｍＡｂ認識は完全に失われたが、ＦまたはＴ位の置換はｍＡｂの反応性に全く影響を与えなかった。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｆｎｂＡでコードされるタンパク質に対するＦｎの125Ｉ−Ｎ２９フラグメントの結合がｍＡｂ ９Ｃ３によって阻害されか否かを判断するために、ＣｏｒｎｉｎｇポリスチレンＥＬＩＳＡウェルストリップを、オービタルミキシングを伴う４℃で一夜のインキュベーションによって、１μｇ／ｍｌの組換えタンパク質Ｄ１−３、Ｄ２−３、ＧＳＴＤ３または１×１０8ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞で被覆した。０．０５％容量／容量のトゥイーン２０を含むＰＢＳでウェルを洗浄し、３％重量／容量のＢＳＡを含む２００μｌのＰＢＳと共に３７℃で６０分間のインキュベーションによってブロックした。ＰＢＳ−トゥイーン２０で洗浄後、５０μｌの抗体阻害物質を添加し、０．０５％のトゥイーン８０及び０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで希釈した。ウェルを阻害物質と共にオービタルミキサーで３０分間プレインキュベートし、次いで同じバッファに希釈した５０μｌのＦｎの125Ｉ−Ｎ２９フラグメント（５０，０００ｃｐｍ）を添加した。更に６０分間インキュベーション後、ウェルをＰＢＳ−０．１％トゥイーン８０でよく洗い、次いで、Ｓａｒｓｔｅｄｔの７５×１２ｍｍのポリスチレン遠心管に移した。次に、結合した125Ｉ−Ｎ２９フラグメントの量をＬＫＢＷａｌｌａｃモデル１２７２全自動ガンマカウンタで定量した。結果は、ｍＡｂ ９Ｃ３が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｆｎｂＡでコードされたタンパク質に対するＦｎのＮ２９フラグメントの結合を用量依存的に阻害することを示す（図１５）。
また、ＣｏｒｎｉｎｇポリスチレンＥＬＩＳＡウェルストリップをオービタルミキシングを伴う４℃で一夜のインキュベーション中に１μｇ／ｍｌの組換えタンパク質ＧＳＴＤ３で被覆することによって、９Ｃ３及び１１Ａ５モノクローナル抗体の阻害活性を証明した。サンプルを上述のように調製し、分析した。ｍＡｂ ９Ｃ３及びｍＡｂ １１Ａ５の双方がＳ．ａｕｒｅｕｓ ｆｎｂＡでコードされたタンパク質に対するＦｎのＮ２９フラグメントの結合を用量依存的に阻害することが証明された（図１６）。
５．１２ 実施例１２−心内膜炎、肺炎及び眼球内炎の動物モデルに対する受動免疫効果の検出方法
Ｍｏｒｅｉｌｌｏｎと共同研究者（Ｍｏｒｅｉｌｌｏｎら，１９９５）によって記載されたような心内膜炎のｉｎ ｖｉｖｏモデルを使用して本発明の抗体の防御効果を試験し得る。精製した抗Ｆｎ ＭＳＣＲＡＭＭ超免疫抗体（例えば、１ｋｇのＩｇＧあたり約１００ｍｇ〜約６００ｍｇの複数の用量を使用し得る）を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたは他のスタフィロコッカス種による感染に先立つ種々の時点（例えば、２１日、１４日、７日または１日前）に静脈内投与し得る。
簡単に説明すると、右頸動脈から動脈弁にポリエチレンカテーテルを挿入することによって雌のウィスターラットに不稔性の疣腫を発生させる。絹の結紮糸でカテーテルを固定し、２４時間静置する。カテーテル挿入の２４時間後、ラットの尾の静脈に、対数増殖期の培養物に由来の細菌細胞を含む０．５ｍｌの生理食塩水を接種する。１２時間後にラットを殺し、動脈弁と疣腫とを摘出し、計量し、１ｍｌの生理食塩水中で均質化し、ホモジェネートの希釈物を平板培養してコロニーをカウントする。
受動免疫の有効性を、先行文献（Ｒａｍｉｓｓｅら，１９９３）に記載されたような肺炎モデルを用いて測定する。Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌによれば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは下部呼吸器感染の原因となることが二番目に多い生物である（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ，１９８６）。免疫治療によって肺炎感染を予防または最小に抑制する能力は、スタフィロコッカス攻撃の前または後に、抗Ｆｎ結合性ＭＳＣＲＡＭＭ Ｉｇ（例えば１ｋｇのＩｇＧあたり１００ｍｇ〜６００ｍｇの範囲の複数の用量で使用できる）を静脈内または鼻孔内投与することによって試験し得る。３週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスをシクロホスファミド（２００ｍｇ／ｋｇの静注）で処理して一時的な激しい白血球減少を誘発する。白血球減少は、血球計で計数された白血球の総数の減少によって確認される。免疫抑制マウスを次に、シクロホスファミド注入の４日後にＳ．ａｕｒｅｕｓで攻撃する。５０μｌの細菌接種物（６×１０7ｃｆｕ／ｍｌ）をマウスに鼻孔内投与する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓを脳−心インフュージョンブロス（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中で定速回転を伴って３７℃で培養し、遠心によって採集し、無菌のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭリン酸塩，１５０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．４）に再浮遊させる。細胞数とＡ600との関係を表す標準曲線にサンプルのＡ600を比較することによって決定した最終密度が６×１０7ｃｆｕ／ｍｌになるように細菌を再浮遊させる。次に、上記のような細菌をマウスに鼻孔内接種する。接種後の選択時点でマウスを殺し、肺を摘出し、ＰＢＳ中で均質化し、血液寒天プレート上で１００μｌのアリコートを平板培養することによってホモジェネートを系列希釈する。３７℃で２４時間の増殖後に細菌のカウント数を測定する。
あるいは、スタフィロコッカス性眼球内炎の動物モデルを使用して受動免疫方法（Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈら，１９９５）の効果を判定してもよい。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは手術後の眼球内炎の進行の重要な病因物質である。更に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ性眼球内炎は無治療で放置されると、失明に進行するのが速い（Ｍａｏら，１９９３）。スタフィロコッカス性眼球内炎を防御する抗Ｆｎ ＭＳＣＲＡＭＭ Ｉｇの能力は上記のモデルを用いて測定できる。精製した抗Ｄ３20-33エピトープＭＳＣＲＡＭＭ超免疫抗体、または、９Ｃ３もしくは１１Ａ５モノクローナル抗体（例えば１ｋｇのＩｇＧあたり１００ｍｇ〜６００ｍｇの複数の用量を使用し得る）を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたは他のスタフィロコッカス種による感染に先立つ種々の時点（２１、１４、７または１日前）で静脈内投与する。
簡単に説明すると、スタフィロコッカスを脳−心インフュージョンブロス（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中で定速回転を伴って３７℃で培養し、遠心によって採取し、無菌のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭのリン酸塩，１５０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．４）に再浮遊させる。細胞数とＡ600との関係を表す標準曲線にサンプルのＡ600を比較することによって決定した最終密度が１．５×１０8ｃｆｕ／ｍｌになるように細菌を再浮遊させる。再遊液を次に生理食塩水で、硝子体内注入用の６５ｃｆｕ／５０μｌの濃度に系列希釈する。７〜８週齢の雌のルイスラットにＭｅｔａｆａｎｅ（商標）（メトキシフルラン；Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ）を含浸させた綿球を５分間吸入させることによって麻酔する。全身麻酔後、１滴の０．５％プロパラカイン溶液（Ａｌｃａｉｎｅ Ｒ；Ａｌｃｏｎ，Ｈｕｍａｎｃｏ ＰＲ）を点眼する。眼内圧の上昇を制限し細菌接種物の押出を最小に抑制するために、細菌の硝子体内注入の直前に、ツベルクリン注射器に取付けた３０Ｇａ針を用いて穿刺して角強膜縁から５μｌの水様液を採取する。次に、ラットの右眼の硝子体に５０μｌの細菌浮遊液を注入し、左眼は対照として維持する。数日後（３、７、１４、２１日、など）、ラットの結果を外的肉眼検査及び直像検眼法によって評価し、その後に殺す。ツベルクリン注射器に取付けた２０Ｇａ針を毛様体輪から挿入して両眼から硝子体液（２０〜２５μｌ）を採取する。サンプルを系列希釈し、血液寒天プレートで平板培養し、３７℃で２４時間インキュベートする。２４時間後の細菌増殖をｃｆｕ／ｍｌで表す。
５．１３ 実施例１３−修飾ＭＳＣＲＡＭＭを用いる能動免疫方法
本発明の部位特異的に修飾したＦｎ結合性ＭＳＣＲＡＭＭはまた、スタフィロコッカス感染症を防御するために動物、特にヒトのような哺乳動物を免疫感作するサブユニットワクチン中の抗原として有用であると考えられる。
部位特異的に修飾されたＦｎ結合性ＭＳＣＲＡＭＭは子宮内膜炎、乳腺炎、イヌの膿皮症、腺疫または耳炎に対して動物を免疫感作するために使用できるので、このような方法は獣医学にも有用である。
５．１４ 実施例１４−免疫効果の検出方法：乳腺炎の動物モデル
部位特異的に修飾されたＦｎ結合性ＭＳＣＲＡＭＭによる能動免疫の効果を、先行文献（Ｍａｍｏら，１９９４）に記載されたような乳腺炎のマウスモデルを用いて試験し得る。フロインド完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）中のエマルジョンにした１００μｇの抗原の皮下注射によって雌のマウスを免疫感作する。１４日後に、フロインド不完全アジュバント中のエマルジョンにした５０μｇの抗原をブースターとして投与する。最終ブースターの３週後に、左右の上部乳腺に０．１ｍｌの細菌浮遊液（１×１０6ｃｆｕ／ｍｌ）を乳内接種することによってマウスに抗原投与する。４８時間後にマウスを殺し、乳腺を無菌的に摘出して組織病理学検査及び細菌定量を行う。摘出した乳腺の各々を５ｍｌの無菌生理食塩水を収容したガラス管に入れ、均質化する。細菌をカウントするためにホモジェネートの系列希釈物を平板培養する。これらの動物試験から得られた結果は、家畜の乳腺炎の治療に使用するために有望であることを示す。
あるいは、子宮内膜炎の動物モデル（Ｗｉｄｄｅｒｓら，１９９５）及び腺疫の動物モデル（極めて伝染性のウマの呼吸器疾患）（Ｗａｌｌａｃｅら，１９９５）を使用して、免疫方法の有効性を判定してもよい。子宮内膜炎は不妊につながるウマの生殖器感染症であり、ウマの繁殖業に経済的な大打撃を与える。Ｓ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓがこの疾患の主因であり、５４％という高い感染率を示す。グループＣのストレプトコッカス及び主としてＳ．ｅｑｕｉは腺疫の主要な病因物質であり、世界中のウマ繁殖業者に甚大な被害を与える。
５．１５．実施例１５−ＦｎＢＰ ＭＳＣＲＡＭＭを発現する単離物の臨床的検出
考察される臨床的検出の１つでは、ＰＣＲ（商標）に基づく検出系でｆｎＡ、ｆｎＢ、ｆｎｂＡ、ｆｎｂＢ、ｆｓｅ及びｓｆｂ遺伝子を検出する分子プローブとして本発明の核酸配列を使用する。検出／増幅すべき配列の長さは、５０〜５００ｂｐの範囲であると考えられる。プライマーとして使用された特定遺伝子セグメントの領域からＤＮＡ配列を決定するためにサザンハイブリダイゼーション分析を容易に実施でき、検出されるＤＮＡ配列は、染色体またプラスミドにコードされたＤＮＡまたはＲＮＡ配列を特異的に検出する。また、選択された１セットまたは複数セットのプライマーは、種々の異なる単離物から特異的ＤＮＡフラグメントの合成を再現的にプライムするために使用され得る。従って、臨床サンプル及び非臨床サンプルの双方でスタフィロコッカス菌及びストレプトコッカス菌を同定するために複数セットのプライマーを使用し得る。
検出のためには、単離物の臨床サンプル（即ち、肺の喀痰、中耳または内耳の分泌物、脳脊髄液）を患者から採取する。単離物を遠心して細菌をペレット化する。あるいは、同定に先立って細菌サンプルを選択培地で培養することによって増殖させてもよい。細菌細胞を溶解し、ペレット化し、上清のサンプルを、本文中に開示されたＦｎＢＰ特異的核酸セグメントを用いてＰＣＲ（商標）反応に加える。増幅後、産生物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、バンド形成パターンを臭化エチジウムによって可視化する。このような遺伝子特異的プライマーを用いて増幅されたＤＮＡフラグメントの存在は、臨床単離物中のスタフィロコッカス菌またはストレプトコッカス菌の存在の指標となる。特定のＭＳＣＲＡＭＭコーディング遺伝子の種特異的配列である特定の核酸セグメントを使用することによって、この方法によって検出された特定細菌を更に同定し、種を類別することさえも可能である。本発明の新規なＤＮＡセグメントから成る組成物、このようなセグメントを含む診断用キット、ＦｎＢＰコーディング核酸の検出方法はすべての本発明の目的に包含される。
５．１６．実施例１６−組換えｆｎｂＡ由来のエピトープを用いるＦｎに対する細菌接着の予防方法
本発明の別の特徴は、ＥＣＭ成分Ｆｎに対する細菌接着を予防する治療用組成物にＳ．ａｕｒｅｕｓのｆｎｂＡ及び／またはｆｎｂＢ遺伝子に由来の天然型及び組換えペプチドを使用することである。動物のスタフィロコッカス感染及びストレプトコッカス感染の予防に有用な医薬組成物が考察されている。
簡単に説明すると、Ｆｎを認識し結合するペプチドエピトープを動物体内に導入すると、このペプチドエピトープは、空いたＥＣＭ Ｆｎを有効に飽和させることによって同一基質に対する細菌接着の競合的阻害物質として作用し、これによって表面にＦｎＢＰＡを発現する細菌がＦｎに接着することを防止する。
移植生物材料、カテーテルまたは移植血管のようなＦｎ被覆材料に対する細菌の接着を阻害するＦｎＢＰ由来のエピトープの能力の効果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ潅流連続流システムを用いて証明できる。このような方法は当業者に公知であり、他の文献（Ｓａｐａｔｎｅｋａｒら，１９９５）に詳細に記載されている。簡単に説明すると、ヒトの血液を一連の被験材料（例えば親水性ポリマー、疎水性ポリマー、など）に連続的にポンプ循環させる。次に、トリチウム標識細菌を血液に添加し、被験材料と相互作用させる。次に被験材料を洗浄して未接着の細菌を除去し、残留細菌を１３−カウンタで定量し得る。ＦｎＢＰ由来のタンパク質を添加すると、被験材料に対する細菌の結合が用量依存的に阻害される。
Ｖａｕｄａｕｘらも同様のモデルを開発した。このモデルでは、無菌チューブ（ポリ塩化ビニルまたはポリエチレン）断片をイヌの大腿動脈に縫合する。チューブを種々の時間接触させ、取出し、ＰＢＳで洗浄し、１．５ｃｍの切片に切断する。各切片で種々の量のトリチウム標識細菌をインキュベートする。ｆｎｂＡ由来のタンパク質を添加すると、被験材料に対する細菌の結合が用量依存的に阻害される。
別の可能な使用方法では、ｆｎｂＡ由来タンパク質をカテーテルまたは移植組織に共有結合させる。結合したｆｎｂＡ由来タンパク質は、通常は細菌が使用する部位と同じ部位でＦｎに結合し、これによって生物材料におけるコロニー形成が防止される。
特定のＦｎ類似体を調製するために、Ｆｎ（Ｎ２９）のアミノ末端ドメインをコードしているｃＤＮＡを酵母、ウイルスまたは細菌中で発現させる組換えＤＮＡ技術を使用し得る。発現したタンパク質は標準クロマトグラフィー技術を適正に使用することによって精製できる。例えば、Ｆｎ類似体を創傷包帯に共有結合させる。修飾した創傷包帯を皮膚感染部位（創傷）に当て、創傷部位に存在する細菌を創傷包帯に特異的に結合させる。
修飾した創傷包帯を頻繁に交換すると、創傷の細菌数が劇的に減少し、これによって感染が最小に抑制され、また創傷治癒も促進される。
５．１７ 実施例１７−Ｆｎに対する接着を阻害する抗体組成物：ＦｎＢＰエピトープをコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発
本発明のＳ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ ｆｎＡ及びｆｎＢ ＤＮＡセグメントの特に重要な用途は組換えペプチドの産生である。これらのペプチドは天然型ＡＵまたはＡ１−Ａ３エピトープでもよく、部位特異的に修飾されたＡｕ−またはＡ１−Ａ３−由来のペプチドでもよい。上記に開示された部位特異的突然変異誘発の汎用技術は、改変されたＤＮＡ配列を含む核酸セグメントを製造するために使用され得る。次に、このようなセグメントを使用して組換えペプチドを超発現させ、これらのペプチドを大量に単離し得る。このように単離されたペプチドを、本文中に記載の幾つかの方法に従って、動物体内の免疫応答の誘発、産生されたペプチドに特異的な抗体の単離、などに使用し得る。
実施例２に記載した手順と同様の手順で、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ ｆｎＡ及びｆｎＢ遺伝子のＡｕ、Ａ１−Ａ３及びＢ１−Ｂ３領域、並びに、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｓｆｂ遺伝子のＰ１−Ｐ４領域に対応するペプチドが合成される。これらのペプチドは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｆｎｂＡ及びｆｎＢペプチドに関して上述した本発明の用途と同じ用途に使用できると考えられる。
本文中及び請求の範囲に開示したすべての組成物及び方法は、本文中の開示に基づいて過大な実験を要することなく調製及び実施し得る。本発明の組成物及び方法を好ましい実施態様に基づいて説明したが、組成物、方法、及び本文中に記載の方法の段階または連続段階に、本発明の構想、要旨及び範囲に包含される種々の変更を加えてもよいことは当業者に理解されよう。より詳細には、本文中に記載の物質に置換して化学的及び生理学的に近縁のいくつかの物質を使用し、同一または類似の結果が得られることも理解されよう。当業者に明らかなこの種の類似の置換及び修飾はすべて、請求の範囲に定義された本発明の要旨、範囲及び構想に包含されると理解されたい。
６．参考文献目録
以下の引用文献及び本文中の引用文献は、これらの文献が本文中に引用されたことによって、本文中の関連する箇所に包含される。
Figure 0005124062
Figure 0005124062
Figure 0005124062
Figure 0005124062
Figure 0005124062
Figure 0005124062
Figure 0005124062
Figure 0005124062
Figure 0005124062
Figure 0005124062
Figure 0005124062
Figure 0005124062
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列の特徴
特徴を表す記号：修飾部位
存在位置：３．．６
他の情報：／注＝″Ｘ＝任意のアミノ酸″
配列
Figure 0005124062
配列番号：２
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：３
配列の長さ：３１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：４
配列の長さ：３１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：５
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：６
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：７
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：８
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：９
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１０
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１１
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１２
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１３
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１４
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１５
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１６
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１７
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１８
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１９
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：２０
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：２１
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：２２
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：２３
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：２４
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：２５
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：２６
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：２７
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：２８
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：２９
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：３０
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：３１
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：３２
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：３３
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：３４
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：３５
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：３６
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：３７
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：３８
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：３９
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：４０
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：４１
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：４２
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：４３
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：４４
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：４５
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：４６
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：４７
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：４８
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：４９
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：５０
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：５１
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：５２
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：５３
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：５４
配列の長さ：３１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：５５
配列の長さ：３１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：５６
配列の長さ：３９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：５７
配列の長さ：３９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：５８
配列の長さ：３６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：５９
配列の長さ：３６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：６０
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：６１
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：６２
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：６３
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：６４
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：６５
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：６６
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：６７
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：６８
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：６９
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：７０
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：７１
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：７２
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：７３
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：７４
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：７５
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：７６
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：７７
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：７８
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：７９
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：８０
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：８１
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：８２
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：８３
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：８４
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：８５
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：８６
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：８７
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：８８
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：８９
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：９０
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：９１
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：９２
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：９３
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：９４
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：９５
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：９６
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：９７
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：９８
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：９９
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１００
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１０１
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１０２
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１０３
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１０４
配列の長さ：８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062
配列番号：１０５
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列
Figure 0005124062

Claims (42)

  1. フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合し、かつ当該フィブロネクチン結合タンパク質がフィブロネクチンに結合することを阻害する抗体を含み、当該抗体が、フィブロネクチンに特異的に結合しない、上記のフィブロネクチン結合領域のペプチドに結合し、当該ペプチドが配列番号６０又は６１のアミノ酸配列からなる、組成物であって、当該組成物が製薬学的に許容しうる担体中に分散している、組成物。
  2. 当該抗体が微生物のフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合する請求項１の組成物。
  3. 当該抗体が連鎖球菌あるいはブドウ球菌のフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合する請求項２の組成物。
  4. 当該抗体が連鎖球菌のＳｆｂ、ＦｎＢＡまたはＦｎＢＢ、あるいはブドウ球菌のＦｎＢＰＡまたはＦｎＢＰＢフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合する請求項３の組成物。
  5. 当該抗体がブドウ球菌のＦｎＢＰＡフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合する請求項４の組成物。
  6. 当該抗体が黄色ブドウ球菌のＦｎＢＰＡフィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合する請求項５の組成物。
  7. 当該抗体がモノクローナル抗体である請求項１の組成物。
  8. 当該抗体が検出可能な標識に連結されている請求項１の組成物。
  9. 当該抗体が放射標識、蛍光標識、核磁気スピン共鳴標識、ビオチン、アビジンあるいは色素産生基質と接触して着色産物を生じる酵素に連結されている請求項８の組成物。
  10. 当該抗体がアルカリホスファターゼ、水素ペルオキシダーゼあるいはグルコースオキシダーゼ酵素に連結されている請求項９の組成物。
  11. フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域の分離されたペプチドを含む組成物であって、当該ペプチドが配列番号６０のアミノ酸配列からなり、当該組成物が製薬学的に許容しうる担体中に分散している、組成物。
  12. 当該分離ペプチドが、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）およびアルブミンからなる群より選択された担体分子に作動可能に連結されている請求項１１の組成物。
  13. フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域の分離されたペプチドおよびアジュバントを含む組成物であって、当該ペプチドが配列番号６０又は６１のアミノ酸配列からなり、当該組成物が製薬学的に許容しうる担体中に分散している組成物。
  14. ６個のヒスチジン残基（Ｈｉｓ 6 ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）からなる群より選択されたアミノ酸配列に作動可能に連結されている、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域のフィブロネクチンに特異的に結合しない第一ペプチドを少なくとも含む融合タンパク質を含む組成物であって、当該第一ペプチドが配列番号６０のアミノ酸配列からなり、当該組成物が製薬学的に許容しうる担体中に分散している、組成物。
  15. 当該第一ペプチドが、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）およびアルブミンからなる群より選択された担体のアミノ酸配列に作動可能に連結されている請求項１４の組成物。
  16. ６個のヒスチジン残基（Ｈｉｓ６）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）からなる群より選択されたアミノ酸配列に作動可能に連結されている、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域のフィブロネクチンに特異的に結合しない第一ペプチドを少なくとも含む融合タンパク質を含む組成物であって、当該第一ペプチドが配列番号６０又は６１のアミノ酸配列からなり、更にキーホールリンペットヘモシアニンに作動可能に連結されており、当該組成物が製薬学的に許容しうる担体中に分散している、前記組成物。
  17. フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域の、フィブロネクチンに特異的に結合しないペプチドをコードする分離された核酸セグメントを含む組成物であって、当該ペプチドが配列番号６０のアミノ酸配列からなり、当該組成物が製薬学的に許容しうる担体中に分散している、前記組成物。
  18. 製薬学的に許容しうる担体中に、
    ａ）フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合し、かつ当該フィブロネクチン結合タンパク質がフィブロネクチンに結合することを阻害する抗体（ただし当該抗体は、ペプチドが当該フィブロネクチン結合領域の構成部分でないときにはフィブロネクチンに特異的に結合しない、当該フィブロネクチン結合領域のペプチドであって、配列番号６０又は６１のアミノ酸配列からなる前記ペプチドに結合する）、
    ｂ）フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域の分離されたペプチドであって、配列番号６０のアミノ酸配列からなる前記ペプチド（ただし当該ペプチドはフィブロネクチンに特異的に結合しない）、または
    ｃ）フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域のペプチドをコードする分離された核酸セグメントであって、当該ペプチドが配列番号６０のアミノ酸配列からなる、前記核酸セグメント（ただし当該ペプチドはフィブロネクチンに特異的に結合しない）、
    の有効量を含む医薬組成物。
  19. フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合し、かつ当該フィブロネクチン結合タンパク質がフィブロネクチンに結合することを阻害する抗体を含む請求項１８の医薬組成物。
  20. フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域の分離された、フィブロネクチンに特異的に結合しないペプチドを含む請求項１８の医薬組成物。
  21. 免疫製剤の調製において使用するための請求項１−２０のいずれか一項の組成物。
  22. 免疫製剤の調製における、請求項１−２０のいずれか一項の組成物の使用。
  23. 動物における感染の予防あるいは治療のための薬剤の調製において使用するための請求項１−２０のいずれか一項の組成物。
  24. 感染を予防するあるいは治療するための薬剤の調製における、請求項１−２０のいずれか一項の組成物の使用。
  25. 微生物のフィブロネクチンへの結合を阻害する製剤の調製において使用するための請求項１−２０のいずれか一項の組成物。
  26. 微生物のフィブロネクチンへの結合を阻害する製剤の調製における、請求項１−２０のいずれか一項の組成物の使用。
  27. フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域の分離された、フィブロネクチンと特異的に結合しないペプチドの免疫学的に有効な量を含む医薬組成物を非ヒト動物に投与することを含む、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合し、かつ当該フィブロネクチン結合タンパク質がフィブロネクチンに結合することを阻害する抗体を生成する方法であって、当該ペプチドが配列番号６０又は６１のアミノ酸配列からなる、前記方法。
  28. 当該非ヒト動物が微生物感染を生じている、あるいは生じた疑いがある、あるいは微生物感染を発現する危険性があるものである請求項２７の方法。
  29. フィブロネクチン結合タンパク質を含有している疑いのするサンプルを、免疫複合体を形成することができる有効条件下で、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合し、かつ当該フィブロネクチン結合タンパク質がフィブロネクチンに結合することを阻害する抗体に接触させ、そのようにして形成された免疫複合体を検出することを含み、ただし当該抗体は、ペプチドが当該フィブロネクチン結合領域の構成部分でないときにはフィブロネクチンに特異的に結合しない、当該フィブロネクチン結合領域のペプチドに結合する、サンプル中のフィブロネクチン結合タンパク質を検出するための方法であって、当該ペプチドが配列番号６０又は６１のアミノ酸配列からなる、前記方法。
  30. 当該フィブロネクチン結合タンパク質が微生物によって発現され、当該サンプルが当該微生物を含有している疑いがある請求項２９の方法。
  31. 当該フィブロネクチン結合タンパク質が連鎖球菌あるいはブドウ球菌によって発現される請求項３０の方法。
  32. 当該フィブロネクチン結合タンパク質が黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）によって発現される請求項３１の方法。
  33. 適当な容器媒体中に、
    ａ）フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合し、かつ当該フィブロネクチン結合タンパク質がフィブロネクチンに結合することを阻害する抗体（ただし当該抗体は、ペプチドが当該フィブロネクチン結合領域の構成部分でないときにはフィブロネクチンに特異的に結合しない、当該フィブロネクチン結合領域のペプチドであって、配列番号６０又は６１のアミノ酸配列からなる前記ペプチドに結合する）、
    ｂ）フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域の分離されたペプチドであって、配列番号６０のアミノ酸配列からなる前記ペプチド（ただし当該ペプチドはフィブロネクチンに特異的に結合しない）、または
    ｃ）フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域のペプチドをコードする分離された核酸セグメントであって、当該ペプチドが配列番号６０のアミノ酸配列からなる、前記核酸セグメント（ただし当該ペプチドはフィブロネクチンに特異的に結合しない）、
    を含むキットであって、治療上有効な量の当該抗体、当該分離ペプチドあるいは当該分離核酸セグメントが製薬学的に許容しうる製剤中に含まれている前記キット。
  34. 適当な容器媒体中に、フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合し、かつ当該フィブロネクチン結合タンパク質がフィブロネクチンに結合することを阻害する第一抗体を含む請求項３３のキット。
  35. さらに免疫検出試薬を含む請求項３４のキット。
  36. 当該免疫検出試薬が当該第一抗体に連結された検出可能標識である請求項３５のキット。
  37. さらに当該第一抗体に結合する第二抗体を含む請求項３４のキット。
  38. 当該抗体が連鎖球菌あるいはブドウ球菌のフィブロネクチンへの結合を阻害する請求項３３のキット。
  39. 上記の製薬学的に許容しうる製剤が局所、非経口あるいは経口投与に適する請求項３３のキット。
  40. 上記の製薬学的に許容しうる製剤が局所投与に適する請求項３９のキット。
  41. ａ）フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域に結合し、かつ当該フィブロネクチン結合タンパク質がフィブロネクチンに結合することを阻害する抗体（ただし当該抗体は、ペプチドが当該フィブロネクチン結合領域の構成部分でないときにはフィブロネクチンに特異的に結合しない、当該フィブロネクチン結合領域のペプチドであって、配列番号６０又は６１のアミノ酸配列からなる前記ペプチドに結合する）、
    ｂ）フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域の分離されたペプチドであって、配列番号６０又は６１のアミノ酸配列からなる前記ペプチド（ただし当該ペプチドはフィブロネクチンに特異的に結合しない）、または
    ｃ）フィブロネクチン結合タンパク質のフィブロネクチン結合領域のペプチドをコードする分離された核酸セグメントであって、当該ペプチドが配列番号６０又は６１のアミノ酸配列からなる、前記核酸セグメント（ただし当該ペプチドはフィブロネクチンに特異的に結合しない）、
    を含む医薬組成物の治療上有効な量を非ヒト動物に投与することを含む、動物における微生物感染を予防あるいは治療する方法。
  42. 当該方法が当該非ヒト動物における連鎖球菌あるいはブドウ球菌感染を予防あるいは治療する請求項４１の方法。
JP53338298A 1997-01-21 1998-01-21 フィブロネクチン結合タンパク質組成物および使用法 Expired - Fee Related JP5124062B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3613997P 1997-01-21 1997-01-21
US60/036,139 1997-01-21
PCT/US1998/001222 WO1998031389A2 (en) 1997-01-21 1998-01-21 Fibronectin binding protein compositions, antibodies thereto, and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002513398A JP2002513398A (ja) 2002-05-08
JP5124062B2 true JP5124062B2 (ja) 2013-01-23

Family

ID=21886867

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP53338298A Expired - Fee Related JP5124062B2 (ja) 1997-01-21 1998-01-21 フィブロネクチン結合タンパク質組成物および使用法

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP0971740B1 (ja)
JP (1) JP5124062B2 (ja)
AT (1) ATE439862T1 (ja)
AU (1) AU744723B2 (ja)
CA (1) CA2277793A1 (ja)
DE (1) DE69841073D1 (ja)
NZ (1) NZ336781A (ja)
WO (1) WO1998031389A2 (ja)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6660842B1 (en) 1994-04-28 2003-12-09 Tripep Ab Ligand/receptor specificity exchangers that redirect antibodies to receptors on a pathogen
US6933366B2 (en) 1996-12-27 2005-08-23 Tripep Ab Specificity exchangers that redirect antibodies to bacterial adhesion receptors
EP1121149A4 (en) * 1998-08-31 2002-03-20 Inhibitex Inc IMMUNOTHERAPY METHOD FOR STAPHYLOCOCCAL INFECTIONS INCLUDING DONOR SELECTION AND DONOR STIMULATION
US6692739B1 (en) 1998-08-31 2004-02-17 Inhibitex, Inc. Staphylococcal immunotherapeutics via donor selection and donor stimulation
DE69940404D1 (de) * 1998-08-31 2009-03-26 Inhibitex Inc Multikomponenten Impfstoffe gegen Staphylococcus aureus
SE9804491D0 (sv) * 1998-12-22 1998-12-22 Bengt Guss Novel fibronectin-binding protein
US7115264B2 (en) 2001-11-05 2006-10-03 Inhibitex Monoclonal antibodies to the fibronectin binding protein and method of use in treating or preventing infections
US7335359B2 (en) 2003-02-06 2008-02-26 Tripep Ab Glycosylated specificity exchangers
JP2007516157A (ja) 2003-02-06 2007-06-21 トリペップ アクチ ボラゲット グリコシル化された抗原／抗体又はリガンド／受容体特異性交換体
CA2562037A1 (en) * 2004-05-21 2005-12-08 Wyeth Altered fibronectin-binding protein of staphylococcus aureus
TW200637907A (en) * 2004-12-20 2006-11-01 Scient Feed Lab Co Ltd Novel vaccine for fish diseases against strepcococcemia
FR2935002B1 (fr) * 2008-08-13 2014-09-05 Biomerieux Sa Milieu de culture permettant de differencier staphylococcus aureus des staphylococcus a coagulase negative
EP2561888A1 (en) * 2011-08-23 2013-02-27 Deutsches Krebsforschungszentrum Protein comprising NC-1 for treating angiogenesis-related diseases

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8901687D0 (sv) * 1989-05-11 1989-05-11 Alfa Laval Agri Int Fibronectin binding protein as well as its preparation
SE9002617D0 (sv) * 1990-08-10 1990-08-10 Alfa Laval Agri Int A fibronectin binding peptide
WO1994018327A1 (en) * 1993-02-05 1994-08-18 Smithkline Beecham Plc Fibronectin binding protein; monoclonal antibody and their use in preventing bacterial adhesion
GB9415900D0 (en) * 1994-08-05 1994-09-28 Smithkline Beecham Plc Novel compounds and treatment
GB9415901D0 (en) * 1994-08-05 1994-09-28 Smithkline Beecham Plc Novel compounds and treatment

Also Published As

Publication number Publication date
DE69841073D1 (de) 2009-10-01
WO1998031389A2 (en) 1998-07-23
JP2002513398A (ja) 2002-05-08
EP0971740A2 (en) 2000-01-19
AU6647998A (en) 1998-08-07
ATE439862T1 (de) 2009-09-15
CA2277793A1 (en) 1998-07-23
AU744723B2 (en) 2002-02-28
EP0971740B1 (en) 2009-08-19
WO1998031389A3 (en) 1999-01-21
NZ336781A (en) 2002-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8211432B2 (en) Treatment of Staphylococcus aureus infections utilizing antibodies that bind to fibronectin binding proteins
EP0950068B1 (en) Collagen binding protein compositions and methods of use
US11447543B2 (en) Antibodies to S. aureus surface determinants
US7045131B2 (en) Staphylococcal immunotherapeutics via donor selection and donor stimulation
JP4691225B2 (ja) グラム陽性細菌のリポテイコ酸に特異的なオプソニン的かつ防御的モノクローナルおよびキメラ抗体
AU762978B2 (en) Staphylococcal immunotherapeutics via donor selection and donor stimulation
JP2020537509A (ja) Ｔｉｇｉｔ抗体、その抗原結合断片及びその医療用途 本願は、２０１９年９月２９日に出願された出願番号ｃｎ２０１７１０９０８５６５．３に基づいたものであり、その優先権を主張する。その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
RU2529946C9 (ru) Моноклональное антитело человека против альфа-токсина из s. aureus и его применение в лечении или предотвращении образования абсцесса
JP5124062B2 (ja) フィブロネクチン結合タンパク質組成物および使用法
JPH05501399A (ja) 敗血症治療用組成物
WO2021052461A1 (zh) 抗α-溶血素的抗体及其应用
JP2010013454A (ja) グラム陽性細菌のペプチドグリカンに対する多機能性モノクローナル抗体
WO1998031389A9 (en) Fibronectin binding protein compositions, antibodies thereto, and methods of use
JP2005514053A6 (ja) グラム陽性細菌のリポタイコ酸に特異的なオプソニン性モノクローナルおよびキメラ抗体
JP2005514053A (ja) グラム陽性細菌のリポタイコ酸に特異的なオプソニン性モノクローナルおよびキメラ抗体
WO2016073860A1 (en) Binding molecules specific for staphylococcus protein a and uses thereof
JP4044733B2 (ja) ベロ毒素ｉｉを認識するヒト型化抗体、および該抗体を産生する細胞株
US20220080036A1 (en) Human monoclonal antibodies to staphylococcal aureus isd proteins and uses thereof
Corbeil Antibodies as effectors
HOOK et al. Patent 2255669 Summary
JPWO2014142356A1 (ja) 強皮症治療剤

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20041102

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080311

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080604

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080714

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080911

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20090310

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090624

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090624

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20090806

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20091001

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110520

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110531

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120802

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20121029

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151102

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees