CN104271151B - 用于治疗血管生成相关疾病的包含nc-1的蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于治疗或预防血管生成相关疾病的蛋白质寡聚物，其包含至少两个人胶原蛋白18的NC‑1单体或人胶原蛋白18的NC‑1单体的片段。本发明进一步涉及包含人胶原蛋白18的NC‑1单体和免疫球蛋白的Fc结构域的融合蛋白。本发明还涉及一种融合蛋白，其包含a）内皮抑素肽或内皮抑素衍生肽；和b）纤连蛋白的RGD基序和/或PHSRN基序。本发明进一步涉及包含本发明的蛋白质寡聚物或融合蛋白的药盒。

Description

用于治疗血管生成相关疾病的包含NC-1的蛋白质
发明领域
本发明涉及用于治疗或预防血管生成相关疾病的蛋白质寡聚物，其包含至少两个人胶原蛋白18的NC-1单体或人胶原蛋白18的NC-1单体的片段。本发明进一步涉及包含人胶原蛋白18的NC-1单体和免疫球蛋白的Fc结构域的融合蛋白。本发明还涉及一种融合蛋白，其包含：a）内皮抑素（endostatin）肽或内皮抑素衍生肽和b）纤连蛋白的RGD基序和/或PHSRN基序。本发明进一步涉及包含本发明的蛋白质寡聚物或融合蛋白的药盒。
背景技术
内皮抑素是对应于胶原蛋白18（或胶原蛋白XVIII）C-端的183-氨基酸的蛋白水解断裂片段，由于其抗肿瘤活性和作为抗血管生成的癌症治疗剂的潜在应用，一直是许多实验室的研究主题（O’Reilly等，1997,Cell88,277；Folkman等，2006,Exp Cell Res312,594；Bergers等，1999,Science284,80）。内皮抑素的抗肿瘤活性已经充分确立。尽管已经提出了多种不同的内皮抑素作用机制，但对其机制仍然缺乏一般的共识。
人内皮抑素的I期和II期临床试验使用了酵母中表达的重组分子。该内皮抑素制剂存在两个主要的缺陷。蛋白质的循环半衰期非常短，并且初始临床试验中使用的注射重组人内皮抑素的50%缺乏N-端四个氨基酸，包括对于锌结合关键的两个组氨酸，因此是没有活性的分子（Lee等，2008,Clin Cancer Res14,1487；Boehm等，1998,Biochem Biophys ResCommun252,190；Tjin等，2005,Cancer Res65,3656；Sim等，1999,Angiogenesis3,41）。为了克服这些缺陷，SDFA在2005年批准了一种新的重组人内皮抑素用于治疗非小细胞肺癌，该新的重组人内皮抑素在大肠杆菌中表达和纯化、具有额外的九个氨基酸序列、形成另一个his标签结构，被称为恩度（Endostar）。恩度在体外抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的VEGF-刺激的增殖、转移和管形成，并且在体外阻断了从大鼠主动脉环发出微血管。此外，其可以在鸡绒毛尿囊膜（CAM）试验中抑制从先已存在的血管形成新的毛细血管，并且影响肿瘤中血管的生长。进一步发现，恩度的抗血管生成作用与VEGF-引发的信号传导相关（Ling等，Biochem Biophys Res Com361,79）。在另一个研究中，已经构建了与IgG抗体的Fc结构域融合的内皮抑素（Lee等，2008,Clin Cancer Res14,1487）。Fc的存在将半衰期提高至长于一周，这与两种血管生成抑制剂bevacizumab（Avastin）和VEGF-Trap相似（Gordon等，2001,JClin Oncol19,843；Holash等，2002,Proc Natl Acad Sci USA99,11393）。
尽管各种临床试验证明了内皮抑素在各种剂量进度表中是非常安全的药物，但结果没有显示实质性的内皮抑素抗肿瘤活性。剂量和进度表可能是次佳的，和/或晚期患者的严重疾病可能不能最佳地应答重组人内皮抑素。因此，在中国目前的临床试验中，内皮抑素主要结合化疗来使用，以提高内皮抑素的抗肿瘤活性。例如，在一个研究中，入选了45名实体肿瘤患者。从2006年至2008年，全部患者接受了化疗和持续7天以上的7.5mg/m2/天剂量的恩度静脉输注。在该研究中没有治疗相关的死亡发生。主要报告的毒性包括骨髓抑制、肝损伤、厌食、恶心、呕吐、腹泻、发烧和疲劳。没有观察到完全应答。42名患者中的两名具有部分应答，二十一名保持稳定，而十九名具有进展性疾病。至肿瘤进展的中值时间为3.0个月。整体存活的中值为30.0个月，并且一年存活率为81.0%。该数据表明，恩度结合化疗在实体肿瘤治疗中的毒性是可耐受的，并且具有适度的功效（Li等，2010,Asian Pac J CancerPrev.11,1119-23）。
已经提出了抗-血管生成基因疗法作为持续提供高浓度的抗血管生成因子的一种可选方式。在几个小鼠模型中，使用病毒载体进行的抗血管生成剂的基因转染可以抑制肿瘤生长。然而，病毒载体可能在重复注射时引起炎症和免疫应答，并且毒性/安全性考虑可能妨碍其在不久的将来用于人类中。此外，尽管基因转导的造血干细胞持续产生内皮抑素，但在动物模型中该干细胞的使用一直没有效果。此外，由于在载体滴度、转导效率和表达水平上的变化，使用基因载体的生物产品的给药非常难以标准化。
因此，本领域需要改进的血管生成相关疾病疗法。
发明内容
本发明的技术问题可以看作是提供满足上述需求的手段和方法。通过权利要求书和以下内容中表征的实施方案，该技术问题已得以解决。
因此，本发明涉及用于治疗或预防血管生成相关疾病的蛋白质寡聚物，其包含至少两个人胶原蛋白18的NC-1单体或人胶原蛋白18的NC-1单体的片段。
如本文中所用的术语“胶原蛋白18”和“胶原蛋白XVIII”可以互换使用，并且是指相同的蛋白质。Oh等已经描述了小鼠和人胶原蛋白18蛋白质的克隆（PNAS1994,91,4229;Genomics1994,19,494）。XVIII型胶原蛋白属于一个独特的新胶原蛋白超家族亚类——提议的名称是“MULTIPLEXIN家族”。小鼠胶原蛋白18的核苷酸和氨基酸序列显示于登录号NM_001109991.1中，而相应的人序列显示于NM_030582.3中。此外，小鼠和人胶原蛋白18的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:1和2中。更具体地，胶原蛋白18由一个位于中央的、中断的三重螺旋结构域组成，该结构域的N-端（NC-11结构域）和C-端（NC-1结构域）侧为较大的非三重螺旋球状结构（Oh等，上述引文；Abe等，1993,Biochem Biophys Res Commun196,576）。
胶原蛋白18的C-端NC-1结构域（或简写为NC-1）包括N-端缔合区（约50个氨基酸残基）、中央蛋白酶敏感性铰链区（约70个氨基酸残基）和C-端稳定的内皮抑素结构域（约180个氨基酸残基）（Sasaki等，1998,EMBO J17,4249）。内皮抑素结构域包含锌结合位点，其介导与锌的结合，并且位于内皮抑素的N端（Ding等，1998,PNAS95,10443;US7,524,811）。令人感兴趣地，已经证实，该锌结合位点负责内皮抑素的抗肿瘤/抗血管生成活性（Boehm等，1998,Biochem.Biophys.Res.Commun.252,190）。小鼠胶原蛋白18的NC-1结构域的氨基酸序列描绘于SEQ ID NO:3中，而相应的人胶原蛋白18的NC-1结构域的序列显示于SEQ ID NO:4中。包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的氨基酸残基约10至约60的人NC-1结构域的缔合结构域负责NC-1单体的非共价三聚化，以形成球状三聚体。蛋白水解断裂敏感性铰链区包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的氨基酸残基约61至约129。致密的内皮抑素结构域包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的氨基酸残基约130至约308；参见，例如，Sasaki,上述引文；Kuo2001,JCB152,1233；Tjin等，2005,Cancer Res65,3656。NC-1结构域中的缔合区和内皮抑素结构域通过铰链区连接（参见Sasaki等,上述引文）。已经发现，铰链区可以被例如基质金属蛋白酶（MMP）如MMP-3、-7、-9、-13和-20断裂（Heliasvaara等，Exp Cell Res2005,307,192）。上述NC-1的结构域结构以结构数据为基础。针对NC-1内的结构域位置使用的术语“约”反映了事实——所提及的结构域之间的确切边界可能与所述位置相差一个、两个、三个或甚至更多个氨基酸残基。例如，通过如下方式，可以确定例如缔合结构域和铰链区之间的确切边界：产生包含SEQ ID NO:4的氨基酸残基约10至约60的缔合结构域作为起点、并产生其较短的片段，例如，具有49、48、47、46、45等氨基酸残基的长度。然后可以分析所述的较短片段的寡聚化特性，即，它们是否仍然能够如完整缔合结构域那样形成寡聚物，如三聚体。或者，内皮抑素结构域可以作为起点，以考察NC-1结构域的寡聚化特性。如本文中别处所示的，本发明提供了再一方法，用于鉴定如本文中定义的NC-1结构域中单体、二聚体和/或三聚体过渡的确切边界。然而，上述结构域模型与基因结构非常匹配，其中外显子38和39编码缔合结构域，外显子40编码铰链区，另外三个外显子编码内皮抑素结构域（Sasaki等，上述引文）。
如本文中使用的术语“蛋白质”或“多肽”或“肽”包括分离的或基本上纯化的（多）肽，其基本上不含其它宿主细胞多肽。如本文中所用的术语“肽”包括至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40或甚至更多个氨基酸残基，其中一个的α羧基结合另一个的α氨基。如本文中所用的术语“肽”包括模拟肽（peptidomimerics）。如本领域已知的，模拟肽是这样的化合物，其基本组分（药效团）在3D空间中模拟天然肽或蛋白质、并且保留与生物靶标相互作用且产生相同生物效应的能力；参见，例如，Vagner等，2008,Current Opinion inChemical Biology12,第292–296页的综述。模拟肽被设计成规避与天然肽相关的一些问题：例如，对抗蛋白水解的稳定性（活性的持续时间）和差的生物利用率。一些其他特性，如受体选择性或功效，常常可以得到实质性地提高。根据本发明，在一个方面中，蛋白质或肽是寡聚物。在另一个方面中，蛋白质或肽是融合蛋白，如以下进一步定义的。如本文中使用的“寡聚物”意指，与至少原则上可以包含无限数量单体的多聚物不同，包含少数单体单位的分子。优选，寡聚物是蛋白质寡聚物，即寡聚物包含两个、三个、五个或甚至更多个蛋白质单体，即，寡聚物可以是例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等。二聚体定义为由两个、通常非共价结合的分子形成的大分子复合物，如蛋白质或肽。这样的复合物也可以通过蛋白质结构域形成，所述蛋白质结构域是部分的蛋白质序列和结构，其可以独立于剩余蛋白质链进化、起作用和存在。通过两个相同的分子形成同型-二聚体，形成过程被称为同型-二聚化。通过杂-二聚化作用形成的杂二聚体由两个不同的大分子形成。如本领域已知的，生物化学中的大部分二聚体不通过共价键（除了二硫桥外）连接。一些蛋白质含有专门的结构域，以确保二聚化（或寡聚化），因此称为二聚化（或寡聚化）结构域，如下文中进一步定义的和本领域公知的。三聚体是通过三个、通常非共价结合的蛋白质或蛋白质结构域形成的大分子复合物。同型-三聚体是通过三个相同的分子形成的，而杂-三聚体是通过三个不同的分子构成的。例如，胶原蛋白18是同型-三聚体蛋白。四聚体由四个分子组成，五聚体由五个分子组成，诸如此类。在这些情况中，复合物的形成常由如上所述的寡聚化结构域来介导。例如，如本文中别处所述的，可以通过免疫球蛋白的Fc结构域或通过二硫桥来介导二聚化，而对于胶原蛋白18的NC-1的三聚化，可以使用NC-1结构域内的缔合区。
本发明的蛋白质或肽寡聚物包含至少两个如本文中定义的胶原蛋白18的NC-1单体。然而，蛋白质寡聚物也可以包含三个、四个、五个、六个或甚至更多个所述胶原蛋白18（优选，人胶原蛋白18）的NC-1单体。在一些方面中，本发明的范围还涵盖，本文中提及的蛋白质寡聚物或融合蛋白可以经由一个或多个二硫键而寡聚化。进一步考虑，如本文中定义的NC-1单体通过例如化学交联或本领域已知的其他方法而共价连接。
如本文中所用的术语“蛋白质”或“肽”还包括含有本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白以及其他蛋白质的蛋白质制剂。此外，在一个方面中，该术语包括化学修饰的蛋白质或肽寡聚物或融合蛋白。这样的修饰可以是人为修饰或天然发生的修饰。
本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白应当具有本文中提及的生物特性，优选抗血管生成活性。这样的抗血管生成活性包括，例如，如下的任何生物活性：体内抑制内皮细胞和/或周细胞的生长或迁移、管或内皮的形成、新毛细血管的生长，通过截断血液供应减缓或抑制良性或恶性肿瘤的生长，通过干扰其他抗肿瘤或抗血管生成剂（例如，VEGF-抑制剂）的作用机制而降低其副作用/毒性，即，降低血压，调节恶性和良性疾病中的炎性应答，或改善病理-生理参数，如治疗后治疗时间窗口内的灌注或低氧，这又可以促进其他疗法的功效（例如，放疗、化疗或抗凋亡疗法）。可以通过体外试验或通过本领域已知的动物模型在体内测试抗血管生成活性（Abdollahi等，Cancer Res.2003,63,8890；Mol.Cell2004,13,649；PNAS2007,104,12890；Drug Resist.Update2005,8,59；Bergers等，Science1999,284,808；Javaherian等，J.Biol.Chem.2002,277,45211；Lee等，Clin.CancerRes.2008）。例如，可以通过抑制由生长因子（例如，VEGF）刺激的内皮细胞的增殖和/或迁移，在体外测试抗-血管生成活性。在体内，例如，可以通过鸡绒毛尿囊膜（CAM）试验，分析抗血管生成活性，而可以在动物肿瘤模型中测试抗肿瘤活性，所述肿瘤模型包括，例如，A549、LLC或H460非小细胞肺癌、HT29结肠癌、BxPC3胰腺癌、Karpas299淋巴瘤、MOLM-13AML（急性髓性白血病）、786-O、A2058细胞系（黑素瘤）或RENCA肾细胞癌（RCC）等等（Abdollahi等，Drug Resist.Update2005,上述引文）。
在一个方面中，可以通过本领域技术人员公知的化学合成或重组分子生物学技术，制造本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白；参见，例如，Sambrook等，2001,Molecular cloning:a laboratory manual（分子克隆：实验室手册）/Sambrook,Joseph;Russell,David W.--.第3版--New York:Cold Spring Harbor Laboratory,2001。在一个方面中，制造本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白的方法包括（a）培养包含编码本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白的核酸的宿主细胞和（b）从步骤（a）的宿主细胞获得蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白，和任选地，储存蛋白质寡聚物、肽寡聚物或融合蛋白。优选，所述方法在无血清条件下进行，因为本发明人已经发现，包含两个或多个本文中定义的NC-1单体的蛋白质寡聚物在血清或包含血清的细胞培养基中易于降解。在这个方法的一个方面中，可以通过常规纯化技术从例如宿主细胞裂解物，获得蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白，所述纯化技术包括但不限于亲和色谱、离子交换色谱、大小排阻色谱和/或制备性凝胶电泳。
在本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白的一个实施方案中，如本文中所用的本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白中的“NC-1单体”、“胶原蛋白18的NC-1单体”或“人胶原蛋白18的NC-1单体”包含本文定义的人胶原蛋白18的非胶原NC-1结构域的至少一个部分，即，至少一个结构域、区域或片段。优选地，NC-1单体是人的。在本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白的一个方面中，如本文中使用的NC-1单体包含至少一个内皮抑素衍生的肽或内皮抑素肽，其包含内皮抑素结构域的锌结合位点/结构域。人内皮抑素锌结合位点由组氨酸1、3和11以及天冬氨酸76形成（Ding等，上述引文）。已经报道了，内皮抑素的锌结合对于其抗血管生成活性是必需的（Boehm等，上述引文）。此外，Tijin等（上述引文）发现，对应于内皮抑素的N-端锌结合结构域的27个氨基酸合成肽负责其抗肿瘤活性。如本文中使用的术语“内皮抑素肽”表示，可以在NC-1的内皮抑素结构域中发现该肽的氨基酸序列。术语“内皮抑素衍生肽”意指，这样的肽可以与NC-1的内皮抑素结构域中的相应内皮抑素肽有一个、两个、三个、四个或甚至更多个氨基酸残基的不同，同时至少保持（或甚至超过）NC-1的内皮抑素结构域中相应内皮抑素肽的生物活性（如本文中别处所述）。例如，在Tijin等，上述引文，或US7,524,811中，已经描述了包含所述内皮抑素结构域的锌结合位点/结构域并且呈现抗血管生成和/或抗肿瘤活性的内皮抑素肽的实例。优选，内皮抑素衍生肽或内皮抑素肽为约10至约40个氨基酸残基长，优选23至35，更优选24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基。例如，SEQ ID NO:9显示了具有26个氨基酸残基长的NC-1-内皮抑素结构域（ED）的活性基序（即，介导抗血管生成和/或抗肿瘤活性的氨基端锌结合结构域）的相应鼠序列，而SEQ ID NO:10显示了具有25个氨基酸残基长的相应人序列。这些序列中的组氨酸特别重要，因为本发明发明人已经在之前的研究中发现，所述组氨酸被丙氨酸残基取代消除了抗肿瘤和抗血管生成活性；参见实施例2.10。在本发明的范围内，所述NC-1单体包含一个以上内皮抑素衍生肽或内皮抑素肽，例如，两个、三个、四个或甚至更多个肽。
在本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白的优选实施方案中，本发明的NC-1单体包含内皮抑素结构域或由内皮抑素结构域组成，如本文中别处限定的。优选，所述的内皮抑素衍生肽、内皮抑素肽或内皮抑素结构域在内皮抑素结构域的位置7携带谷氨酰胺至半胱氨酸的单突变。这样的突变能够形成二硫桥，并且因此能够形成二聚体；参见，例如，Kuo2001,JCB152,1233；Tjin等2005,Cancer Res65,3656。
在进一步的实施方案中，除了内皮抑素结构域、内皮抑素衍生肽、内皮抑素肽或内皮抑素结构域的锌结合位点/结构域外，本发明的NC-1单体还包含铰链区。这样的构建体将可能形成单体，可能二聚体。不能排除二聚体的形成，因为看来铰链区也可以促进这样的构建体的二聚体缔合。任选，除了所述结构域组分以外，NC-1单体还可以包含缔合结构域，即，人胶原蛋白18的非三重螺旋三聚化结构域，或如本文中提及的其它寡聚化结构域。本领域技术人员明了，缔合结构域的存在可以导致三聚体的形成。在另一个方面中，NC-1单体包含内皮抑素结构域和上述定义的NC-1结构域的缔合结构域，并且在进一步的方面中，包含缔合结构域、铰链区和内皮抑素结构域，即所述NC-1的每个结构域。在后一个方面中，NC-1单体包含人胶原蛋白18的完整NC-1结构域，或，是人胶原蛋白18的NC-1结构域，即由人胶原蛋白18的NC-1结构域（约38kDa）组成。人胶原蛋白18的NC-1结构域和所述NC-1结构域的结构已有定义，见例如Sasaki等（上述引文）。胶原蛋白18的NC-1结构域由315（小鼠）或312（人）个氨基酸残基的非三重螺旋序列组成。如上所述，已经发现，NC-1结构域经由上述缔合结构域非共价地缔合形成三聚体。
NC-1的寡聚化由该蛋白质的至少两个结构域介导：一个结构域由蛋白质N-端的大约50个氨基酸组成，定义三重螺旋结构，即，缔合结构域。参与寡聚化的第二结构域位于内皮抑素的N-端，能够结合锌。人内皮抑素锌位点由组氨酸1、3和11以及天冬氨酸76形成。已经显示，所述结构域在高浓度内皮抑素下形成二聚体（Ding等，上述引文）。蛋白酶敏感性铰链区也可能在NC-1的寡聚化中起作用（如以上已经指出的）。因此，在本发明的一些方面中，NC-1单体可以进一步包含NC-1结构域的铰链区。
本发明的NC-1单体优选长于20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300或310个氨基酸残基。在NC-1单体包含缔合结构域、铰链区和内皮抑素结构域的锌结合位点/结构域或完整的内皮抑素结构域的情况中，优选NC-1单体长于312个氨基酸残基，并且甚至更优选包含至少315、320、330、340、350、400、500或甚至更多个氨基酸残基。
如本文中使用的术语“寡聚化结构域”通常是指，介导如本文中定义的两个或更多个NC-1单体的亚单位装配的蛋白质结构域。如上所述，寡聚化结构域介导NC-1单体的二聚化、三聚化和/或四聚化等。该寡聚化导致例如多价的功能优势和高结合强度、提高的结构稳定作用和不同结构域的组合功能，从而导致增强的生物活性，如改进或提高的抗血管生成和/或抗肿瘤活性。在一个方面中，寡聚化结构域包含如上所述的NC-1结构域的缔合结构域，即，胶原蛋白18的非三重螺旋三聚化结构域，其负责NC-1单体或胶原蛋白18螺旋的非共价寡聚化。在另一个方面中，寡聚化结构域可以包含如本领域公知的提供寡聚化和更长半衰期的其他支架构造/结构域；参见，例如，Ali和Imperiali2005,Bioorganic andMedicinal Chemistry13,5013。这样的寡聚化结构域可以在结构和功能上替代如上提及的天然人NC-1结构域中的缔合结构域，或除了所述缔合结构域以外也使用这样的寡聚化结构域。在本发明的蛋白质寡聚物或融合蛋白的再一实施方案中，通过免疫球蛋白的Fc结构域介导寡聚化，即，如本文中定义的NC-1单体的寡聚化结构域包含免疫球蛋白的Fc结构域或是免疫球蛋白的Fc结构域。本领域已知，Fc结构域与例如肽或蛋白质的融合可以介导较长的循环半衰期。可以理解，除了以上提及的NC-1结构域的缔合结构域以外（例如，如以下实施例中所示的），Fc结构域也可以用于所述NC-1单体，或可以替代该缔合结构域。因为Fc自身是二聚体，Fc结构域可以赋予本文定义的NC-1单体二聚结构。在另一个实施方案中，可以通过将导致二硫键形成的结构修饰（例如，突变）引入NC-1单体中来介导寡聚化，如以下更详细说明的。进一步考虑，可以共价形成本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白。
本发明进一步涉及用于鉴定如本文定义的NC-1结构域中单体、二聚体和/或三聚体过渡的确切边界的方法，该方法包括：a）从NC-1结构域产生一系列重组的NC-1结构域肽或衍生肽，其中从内皮抑素结构域组成的肽开始，接着按约10至20个氨基酸残基的步骤逐步地增加内皮抑素结构域组成的所述肽的大小，和b）测试步骤a）的重组肽的寡聚化特性，即，所述肽是否能够形成二聚体或三聚体，并且鉴定能够形成寡聚物的肽，和c）确定NC-1结构域中单体、二聚体和/或三聚体过渡的确切边界。该方法可以包括再一个步骤d）：使用步骤b）中鉴定的能够形成二聚体或三聚体的重组肽，构建本发明的寡聚物或融合蛋白。为了产生一系列重组的NC-1结构域肽或衍生肽，可以使用本领域已知的肽或蛋白质合成。术语“衍生”已经在本文中别处进行了定义，并且加以必要的调整，适用于衍生自NC-1结构域的肽。为了测试所述片段的寡聚化特性，可以利用Western印迹分析、免疫沉淀、SDS-PAGE、色谱方法或本领域公知的其他方法。通过上述方法产生的重组肽可以用于生产本发明的寡聚物或融合蛋白，如Fc融合蛋白，然后可以进一步测试其抗血管生成和/或抗肿瘤活性。本发明进一步涉及通过所述方法鉴定的来自或衍生自NC-1结构域的重组肽，其显示出如本文中别处限定的生物活性，优选抗血管生成和/或抗肿瘤活性。包含这样肽的本发明寡聚物或融合蛋白作为药物组合物特别有用，如本文中别处所述的。本发明还涉及，按约10至20个氨基酸残基的步骤逐步地增加内皮抑素结构域的大小而产生的来自或衍生自NC-1结构域的重组肽。这些肽中的每一个都作为候选物，通过使用本文中别处所述的体外和/或体内试验，探测其抗血管生成和/或抗肿瘤活性。
如本文中限定的人胶原蛋白18的“NC-1单体”可以包含其他的蛋白质结构域或亚基，例如，上述免疫球蛋白的Fc结构域、或蛋白质标签，例如His标签等，其可以用于例如纯化和/或检测。如本领域公知的，蛋白质标签是遗传嫁接至重组蛋白上的肽序列。在一个方面中，可以通过化学试剂或通过酶学方式去除这些标签，如蛋白水解或内含肽剪接。这样的标签可以连接至本文中提及的NC-1单体。可以将亲和标签加至蛋白质上，使得可以使用本领域公知的亲和技术将其从粗生物来源（如，细胞裂解物）中纯化出来。这些标签包括，例如，几丁质结合蛋白（CBP）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、免疫球蛋白的Fc结构域或谷胱甘肽-S-转移酶（GST）。多(His)标签是广泛使用的蛋白质标签；其结合金属基质。可以使用增溶标签，尤其是用于在伴侣分子缺陷性物种（如，大肠杆菌（E.coli））中表达的重组蛋白，以帮助蛋白质的正确折叠和阻止其沉淀。这些标签包括，例如，硫氧还蛋白（TRX）和多-(NANP)。一些亲和标签具有作为增溶剂的双重作用，如MBP和GST。可以将色谱标签用于改变NC-1单体的色谱特性，以提供跨特定分离技术的不同分辨率。常常，这些由多-阴离子氨基酸组成，如FLAG-标签。表位标签是短的肽序列，选择其是因为可以在许多不同物种中可靠地产生高亲和性抗体。这些标签通常源自病毒基因，这解释了它们的高免疫反应性。表位标签包括，例如，V5-标签、c-myc-标签和HA-标签。这些标签是有用的，例如，用于western印迹和免疫沉淀实验，但它们也可以用于蛋白质纯化中。可以将荧光标签用于在蛋白质上产生视觉读出。GFP及其变体是最常用的荧光标签。最新的GFP应用包括将其用作折叠报告分子（如果折叠了，发荧光；如果未折叠，则无色）。蛋白质标签有许多其他用途，如特定的酶学修饰（如，生物素连接酶标签）和化学修饰（Flash标签）。各种标签也可以结合，以产生NC-1单体的多功能修饰。如本文中限定的人胶原蛋白18的NC-1单体也可以包含放射性同位素，例如，124I、125I、131I、Cu-64、Cu-67、Y-86、Zr-89、Y-90、Re-188、Ga-68；或结合螯合物的放射性核素，如DTPA；毒素，例如，白喉毒素，或凋亡诱导剂；或化学物质，例如，化疗剂，如紫杉醇或吉西他滨（gemcitabine），其可以用于改善和/或检测本发明的蛋白质寡聚物或融合蛋白的抗血管生成活性。在其他实施方案中，将本发明的蛋白质寡聚物或融合蛋白PEG化。PEG化是将聚乙二醇（PEG）聚合物链共价连接到另一个分子的方法，另一个分子通常是药物或治疗蛋白。通常通过将PEG的反应性衍生物与靶大分子孵育来实现PEG化。PEG与药物或治疗蛋白的共价连接可以“掩蔽”该药剂以对抗宿主免疫系统（降低的免疫原性和抗原性）、提高药剂的流体力学大小（在溶液中的大小），这可以通过降低肾清除而延长其循环时间。PEG化还可以给疏水性药物和蛋白质提供溶解性。化合物的PEG化是本领域公知的；参见，例如，Damodaran和Fee2010,European Pharmaceutical Review15,18。
如本文中使用的术语“Fc区”或“Fc结构域”是指可结晶区片段，其是与细胞表面受体（即，Fc受体）以及补体系统的一些蛋白质相互作用的抗体或免疫球蛋白的尾部。这种特性允许抗体激活免疫系统。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc结构域由源自抗体两个重链的第二和第三恒定结构域的两个相同蛋白质片段组成；IgM和IgE Fc结构域在每个多肽链中含有三个重链恒定结构域（CH结构域2-4）。IgG的Fc结构域带有高度保守的N-糖基化位点。Fc片段的糖基化是Fc受体介导的活性所必需的。结合该位点的N-聚糖主要是复合型的核心岩藻糖基化双触角结构。此外，少量的这些N-聚糖还带有平分的GlcNAc和α-2,6连接的唾液酸残基。已经发现，免疫球蛋白的Fc结构域与蛋白质的融合增强融合蛋白在哺乳动物细胞中的产生和分泌（Lo等，1998,Protein Eng11,495,Capon et al.,1989,Nature337,525）。此外，已经发现，将抗血管生成抑制剂连接免疫球蛋白Fc结构域能提高所述抑制剂的半衰期（Capon等，1989,Nature337,525；Gordon等，2001,J Clin Oncol19,843；Holash等，2002,Proc Natl Acad Sci USA99,11393）。然而，Fc结构域不仅可以用于纯化、增溶和/或检测目的，而且有利地改变本发明的蛋白质寡聚物或融合蛋白的生物特性，如下文和以下实施例中所示的。在一个实施方案中，如果需要，可以通过用蛋白酶（肠激酶或凝血酶）处理，切除该一个或多个Fc结构域。优选，本文中提及的Fc结构域来自人IgG（Bergers和Javaherian Science1999;Lee等Clin Canc Res2008）。如本领域技术人员清楚的，原则上，可以使用任何IgG同种型来产生本发明的寡聚物或融合蛋白。为了延长本发明的寡聚物或融合蛋白的半衰期或寡聚化，甚至可以使用IgG的Fc结构域的子片段或单链。可以用于产生本发明的寡聚物或融合蛋白（例如，Fc-NC-1或NC-1-Fc融合蛋白）的小鼠和人Fc结构域的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:5和6中。
如本文中所用的术语“血管生成相关疾病”指，与异常的（不管是过多的或是不足的）血管生长相关的任何疾病。术语“血管生成相关疾病”优选选自血管生成-依赖性癌症，包括实体肿瘤，血源性肿瘤如白血病，黑素瘤，肿瘤转移，良性肿瘤，如血管瘤，听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼，化脓性肉芽肿；类风湿性关节炎；牛皮癣；眼血管生成疾病，如糖尿病性视网膜病，早产儿视网膜病，黄斑变性，角膜移植排斥，新生血管性青光眼，晶状体后纤维增生症，红变(rubeosis)；Osler-Webber综合症；心肌血管生成；斑块新血管生成；遗传性出血性毛细血管扩张症；血友病关节；血管纤维瘤；伤口肉芽；内皮细胞过度或异常刺激的疾病，如肠粘连，动脉粥样硬化，硬皮病，肥厚性瘢痕（瘢痕瘤）；血管生成作为病理性结果的疾病，如猫抓病（Rochele minalia quintosa）和溃疡（幽门螺杆菌（Helobacter pylori））。优选，本文中提及的血管生成相关疾病是黑素瘤。
如本文中使用的术语“治疗”表示，通过施用本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白，与本文中提及的血管生成相关疾病相关的一个或多个症状的改善或甚至消除。改善也可以看作如本文所述的血管生成相关疾病的进展的减缓或停止。
如本文中使用的术语“预防”表示，通过施用本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白，避免本文所述血管生成相关疾病的出现或复发。
本发明的发明人出乎预料地发现，衍生自人胶原蛋白18的三聚化NC-1（包含缔合结构域、铰链区和内皮抑素结构域的NC-1）结合纤连蛋白，而内皮抑素单体不结合纤连蛋白。纤连蛋白被认为是主要的胞外基质蛋白，结合血管生成和抗血管生成剂。内皮抑素在生理条件下是单体。内皮抑素的主要前体是NC-1，由三个相互连接的链组成的三聚体分子，每个链具有大约330个氨基酸。这表明，NC-1三聚体具有不同于内皮抑素的性质。此外，形成二聚体的Fc-内皮抑素以及在内皮抑素的氨基酸位置7带有单突变（谷氨酰胺至半胱氨酸）的人造内皮抑素二聚体保持与纤连蛋白的结合，表明寡聚化对结合纤连蛋白具有重要性。对人血清中的内皮抑素大小的分子进行研究后，发明人未能鉴定到常规大小的内皮抑素（约20kDa）。人血液循环中内皮抑素大小的分子的出现可能是由于人血清收集后NC-1三聚体被蛋白酶降解所引起的。NC-1三聚体看来是胶原蛋白18降解的主要生理产物，存在于组织和循环中，表现出（单体）内皮抑素所不具有的独特生物特性。发明人进一步证明了纤连蛋白与VEGF和NC-1三聚体的高亲和性结合、并从外周血血小板蛋白质裂解物中共免疫沉淀了三个候选物相互作用伴侣。此外，可以证明NC-1三聚体、纤连蛋白、VEGF和α5β1整联蛋白的体内共定位，提示了VEGF、NC-1三聚体、整联蛋白α5β1与纤连蛋白的整体是抗血管生成过程启动的前奏的模型。最重要地，NC-1三聚体相对于内皮抑素的抗肿瘤研究显示出，NC-1三聚体是比内皮抑素更有效的抗血管生成蛋白。在以下实施例中将更详细地具体说明以上数据。
在本发明的蛋白质寡聚物的一个实施方案中，人胶原蛋白18的NC-1单体包含（i）寡聚化结构域，（ii）铰链区和/或（iii）内皮抑素结构域或所述内皮抑素结构域的片段，和任选，铰链区内的重组蛋白酶断裂位点。优选，所述内皮抑素结构域的片段是包含内皮抑素的锌结合位点/结构域的肽。
在本发明的蛋白质寡聚物的另一个优选实施方案中，铰链区间插在寡聚化结构域和内皮抑素结构域之间。优选，铰链区位于本文中提及的NC-1单体中的寡聚化结构域和内皮抑素或内皮抑素结构域的锌结合位点/结构域之间。人胶原蛋白18的NC-1单体内的结构域排列优选是寡聚化结构域-铰链区-内皮抑素结构域，或内皮抑素结构域-铰链区-寡聚化结构域。
任选，除了铰链区的内源性蛋白酶断裂位点以外，人胶原蛋白18的NC-1单体内的铰链区还可以包含一个或多个重组蛋白酶断裂位点。这样的重组蛋白酶断裂位点可以是例如肠激酶或凝血酶断裂（Bergers和Javaherian；Lee等，上述引文）。通过相应蛋白酶的断裂允许例如本发明的蛋白质寡聚物或融合蛋白的内皮抑素结构域的释放。
在本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白的一个优选实施方案中，寡聚化结构域包含人胶原蛋白18的非-三重螺旋三聚化结构域（即，缔合结构域）、Fc结构域和/或人造寡聚化结构域。在一个方面中，寡聚化结构域包含人胶原蛋白18的非-三重螺旋三聚化结构域，其负责三条NC-1结构域链的三聚化。在另一方面，寡聚化结构域包含Fc结构域。因为Fc结构域本身是二聚体，Fc结构域可以在本文定义的NC-1单体上赋予二聚化结构。在第三个方面中，寡聚化结构域包含人造寡聚化结构域，例如，在两个单体之间导致形成二硫桥的半胱氨酸，其可以在结构上和功能上替代上文所述的天然人NC-1中发现的缔合结构域，或可以在所述缔合结构域以外额外地使用。本发明的范围还涵盖，本发明的蛋白质寡聚物或融合蛋白的寡聚化结构域包含人胶原蛋白18的非-三重螺旋三聚化结构域和Fc结构域。此外，其可以包含人造寡聚化结构域和Fc结构域。
优选，Fc结构域来自IgG或其他免疫球蛋白同种型以及本领域中描述的提供寡聚化和较长半衰期的其他支架构造；参见，例如，Lo等，Protein Engineering1998,11,495。鼠Fc结构域例如显示于SEQ ID NO:5中。更优选，Fc结构域来自人IgG，甚至更优选来自人IgG1。特别优选，人Fc结构域包含SEQ ID NO:6中显示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:6中显示的氨基酸组成。
如上所述，NC-1单体的寡聚化结构域可以是免疫球蛋白的Fc结构域，优选来自IgG1的Fc结构域。本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白也可以含有两个、三个或甚至更多个Fc结构域。在一个方面中，如果需要，可以从本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白上切除Fc结构域。例如，人造蛋白酶断裂位点，如肠激酶或凝血酶断裂位点，可以插入本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物中NC-1单体和Fc结构域之间，例如，经由相应(多)肽接头。在由相应蛋白酶断裂后，寡聚物从Fc结构域中释放出来。Fc结构域可以用于纯化和/或检测。此外，Fc结构域改变本发明的蛋白质寡聚物或融合蛋白的生物特性，如循环中的半衰期延长和生物活性的提高，优选抗血管生成活性的提高。例如，已经发现，Fc-内皮抑素融合蛋白能够作为二聚体结合纤连蛋白，而内皮抑素单体则不能。此外，Fc-内皮抑素显示比内皮抑素更长的半衰期。
在本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白的再一优选实施方案中，人造寡聚化结构域在内皮抑素结构域的位置7包含单突变，其中谷氨酰胺被半胱氨酸替代。优选，在一些方面中，本文定义的单体在内皮抑素结构域的位置7包含谷氨酰胺至半胱氨酸的单突变。例如，已经发现，由于该内皮抑素结构域中邻近C7残基之间的二硫键形成，在融合蛋白的Fc结构域和内皮抑素结构域之间重组引入的肠激酶断裂位点可以在肠激酶切割后导致二聚体的形成；参见Kuo2001，JCB152，1233。如上所述，与内皮抑素单体相比，NC-1三聚体和内皮抑素二聚体具有不同的特性。以上位置7的突变（谷氨酰胺至半胱氨酸）也可以引入已经被证明是内皮抑素的抗肿瘤结构域（Tjin等，2005，Cancer Res65，3656）的内皮抑素N-端肽中。可以通过如上所述人造二聚化或仅通过重组融合Fc部分而不具有位置7的突变，实现肽的寡聚化。包含介导二聚化的所述位置7突变的本发明融合蛋白的一个实例显示于SEQID NO:15；参见实施例2.10。
在本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物的另一个优选实施方案中，铰链区内的重组蛋白酶断裂位点是肠激酶或凝血酶断裂位点。用肠激酶或凝血酶断裂蛋白质寡聚物或肽寡聚物导致内皮抑素结构域从本发明蛋白质寡聚物或肽寡聚物的释放。
在本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物的再一优选实施方案中，如本文定义的NC-1单体只含有铰链区内天然存在的蛋白酶断裂位点，即，不含重组蛋白酶断裂位点。在该情况中，可以通过例如MMP断裂铰链区，如本文中别处所示的，以释放例如内皮抑素结构域。在另一个方面中，NC-1单体的铰链区中的这些天然蛋白酶断裂位点可以被突变，使得NC-1单体不再被所述蛋白酶断裂。这样，本发明的蛋白质寡聚物的抗血管生成活性可以被提高。
在本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物的另一个实施方案中，待治疗的血管生成相关疾病选自：血管生成-依赖性癌症，包括实体肿瘤，黑素瘤，肿瘤转移，血源性肿瘤如白血病，良性肿瘤如血管瘤，听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼，化脓性肉芽肿；类风湿性关节炎；牛皮癣；眼血管生成疾病，如糖尿病性视网膜病，早产儿视网膜病，黄斑变性，角膜移植排斥，新生血管性青光眼，晶状体后纤维增生症，红变(rubeosis)；Osler-Webber综合症；心肌血管生成；斑块新血管生成；遗传性出血性毛细血管扩张症；血友病关节；血管纤维瘤；伤口肉芽；内皮细胞过度或异常刺激的疾病，如肠粘连，动脉粥样硬化，硬皮病，肥厚性瘢痕（瘢痕瘤）；血管生成作为病理性结果的疾病，如猫抓病（Rochele minalia quintosa）和溃疡（幽门螺杆菌（Helobacter pylori））。优选，本文中提及的血管生成相关疾病是肾细胞癌、结肠直肠-、前列腺-、乳房-或肺癌。
本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白优选配制为可以通过标准途径给药的药物组合物。通常，药物组合物可以通过局部、经皮、腹膜内、颅内、脑室内、脑内、阴道内、子宫内、口服、直肠或肠胃外（例如，静脉内、脊柱内、皮下或肌内）途径施用。
包含本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白作为药物活性化合物的药物组合物可以以治疗有效剂量用于在非人或优选人中治疗各种血管生成相关疾病或病症（本文别处述及）。在一个方面中，本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白可以以液体或冻干形式存在。在一个方面中，蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白可以与甘油、蛋白质稳定剂（例如，人血清白蛋白（HAS））或非蛋白质稳定剂一起存在。
本发明化合物（即，本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白）是药物组合物的活性成分，并且在一个方面中，以常规剂型给药，所述常规剂型可以根据常规程序通过将药物与标准药物载体组合来制备。按照所需制剂，酌情地，这些程序可以涉及混合、造粒和压片，或溶解成分。应明了，药物可接受的载体或稀释剂的形式和特征由与其组合的活性成分的量、给药途径和其他公知变量来决定。
在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上，载体必须是可接受的。所用的药物载体可以包括固体、凝胶或液体。示例性固体载体是乳糖、白土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯树胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例性液体载体是磷酸盐缓冲盐水溶液、糖浆、油、水、乳液、各种类型的润湿剂等。相似地，载体或稀释剂可以包括本领域公知的延时材料，如甘油基单硬脂酸酯或甘油基二硬脂酸酯单独或与蜡结合。所述合适的载体包含上述那些和本领域公知的其他载体，参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania。
选择稀释剂，使得不影响生物活性，优选，不影响该组合的抗血管生成活性。这样的稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、Ringer溶液、葡萄糖溶液和Hank溶液。此外，药物组合物或制剂还可以包括其他载体、助剂、或无毒、无治疗性、非免疫原性的稳定剂等。
治疗有效剂量是指用于药物组合物中的本发明蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白的量，该量可以预防、改善或治疗伴随本说明书中提及的血管生成相关疾病或病症的症状。可以在细胞培养物或实验动物中，通过标准药物学程序，测定化合物的治疗功效和毒性，例如，ED50（在50%群体中治疗有效的剂量）和LD50（50%群体死亡的剂量）。治疗作用和毒性作用之间的剂量比为治疗指数，并且可以表示为比例LD50/ED50。
剂量给药方案可以由主治医生和其他临床因素来决定。如医学领域公知的，用于任一位病人的剂量取决于许多因素，包括病人的尺寸、体表面积、年龄、待给药的特定化合物、性别、给药时间和途径、总体健康和并行给药的其他药物。可以通过定期评价来监控进展。
本文中提及的药物至少给药一次，用以治疗或改善或预防本说明书中提及的疾病或病症。然而，所述药物可以给药一次以上。
可以以药物领域中公知的方式来制备特定的药物组合物，其包含与药物学上可接受的载体或稀释剂混合或以其它方式组合的至少一种上文中提及的活性化合物。为了制备特定的药物组合物，通常将活性化合物与载体或稀释剂混合。所得到的制剂适用于给药方式。在处方或使用者说明书中应当标明推荐剂量，以根据所考虑的接受者预期剂量的调节。
在本发明进一步的方面中，除了本发明的蛋白质寡聚物以外，药物组合物还可以包含在配制过程中加入药物中的药剂。最后，将理解，药物组合物的配制在GMP标准化条件或类似条件下进行，以确保药物的品质、药物安全性和有效性。
在本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物的另一个优选实施方案中，寡聚物是二聚体或三聚体。然而，本发明的蛋白质寡聚物也涵盖四聚体或五聚体或具有甚至更多如本文定义的NC-1单体的寡聚物。
本发明还涉及用于生产本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白的方法，其包括（a）优选在无血清条件下，培养包含编码本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白的核酸的宿主细胞，（b）从步骤（a）的宿主细胞获得蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白，和任选地，（c）存储蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白，优选在无血清条件下。如以下实施例中所示的，本发明发明人已经发现，如果保存在血清或细胞培养基中较长的时间，即使在4℃，寡聚NC-1，如NC-1三聚体，也易于降解。因此，在无血清条件下生产和保存本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物是有利的。
此外，本发明涉及用于鉴定抗血管生成剂的方法，其包括（a）在允许本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物结合纤连蛋白和/或VEGF以形成复合物的条件下，将本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物接触纤连蛋白和/或VEGF，（b）将步骤a）的复合物接触一组试剂，（c）鉴定和分离能够结合步骤（a）的复合物的那些试剂，和（d）在体外试验中测试步骤c）中鉴定的试剂的抗血管生成活性。
可以通过自动操作来辅助本发明的方法。特别地，在一个方面中，步骤a）和/或b）和/或c）可以通过机器人设备和自动化读数系统来辅助，用于混合化合物和测量复合物形成。合适的系统是本领域已知的，并且取决于待测定的应答类型。此外，该方法可以包括涉及产生本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物的附加步骤。
如本文中所用的术语“接触”是指，使至少两种不同的化合物在物理上接近，以允许所述化合物的物理和/或化学相互作用。在上述方法中，首先将根据本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物接触纤连蛋白和/或VEGF形成复合物。此后，将所述复合物接触一组试剂，例如，怀疑包含生物活性多肽的蛋白质、肽、化学或适体文库。本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物应当在足以允许复合物形成的一段时间和条件下接触所提及的化合物。在一个方面中，如本文中使用的接触，发生在含有本发明的蛋白质聚合物或肽聚合物的宿主细胞中。所述时间和条件将取决于蛋白质寡聚物或肽寡聚物的量。本领域技术人员将认识到，根据宿主细胞和蛋白质寡聚物或肽寡聚物的种类需要使用何种条件。在另一个方面中，接触发生在包含本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物的无细胞系统中。无细胞系统将允许蛋白质寡聚物或肽寡聚物和上述化合物的复合物形成。本文中别处列出了用于测试抗血管生成活性的体外试验。
此外，本发明涉及包含本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物的药盒。
如本文中所用的术语“药盒”是指包含本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物的工具的集合，其以即用的方式在分开或共同的小瓶中提供，以用于进行如本文定义的血管生成相关疾病的治疗。在一个方面中，药盒包含用于进行血管生成相关疾病治疗的其他工具，在一个方面中，包含可以组合本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物使用的其它抗血管生成剂，如针对特别是IGFIR、c-Met、Pi3K、VEGFR、Braf、ALK-EML4、PDGFR的抗体或小分子激酶抑制剂，针对关键细胞因子如CCL2、GM-CSF/CSF、Bv8、SDF1的拮抗性抗体，以及标准抗癌治疗，如放疗和化疗。此外，在一个实施方案中，药盒包含用于进行血管生成相关疾病治疗的说明书。这些说明书可以作为手册提供，或可以是数据存储介质上的计算机-可执行算法的形式，其在执行时能够控制血管生成相关疾病治疗的一个或多个步骤。说明书包括关于本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物的剂量、给药时间和方式等的信息。在一个方面中，药盒可以用于进行上文中所列特定血管生成相关疾病，例如血管生成相关的癌症，的治疗。
本发明进一步涉及包含人胶原蛋白18的NC-1单体和免疫球蛋白的Fc结构域的融合蛋白。
术语（人胶原蛋白18的）“蛋白质”、“肽”、“NC-1单体”和（免疫球蛋白的）“Fc结构域”或“Fc区”已经在本文中别处进行了定义。所述定义和本文中别处所述的NC-1单体的实施方案在作必要的调整后将适用于本发明的融合蛋白。
如本文中使用的术语“融合蛋白”表示，包含至少一个如本文中定义的NC-1单体的多肽，所述NC-1单体连接至少一个衍生自免疫球蛋白的Fc结构域。优选，融合蛋白是人类的。Fc结构域可以融合NC-1单体的N-端或C-端，优选N-端。
在本发明的融合蛋白的一个优选实施方案中，融合蛋白包含寡聚化结构域、铰链区和/或内皮抑素结构域，和任选的，铰链区内的重组蛋白酶断裂位点。以下的实施例中显示了这样的Fc-NC-1融合蛋白的产生和表达。在本发明的融合蛋白包含如本文中定义的缔合结构域和Fc结构域的情况中，使用缺乏单个二硫桥的Fc结构域可能是有益的。出于以下原因，二硫桥的去除可能是有益的：Fc是二聚体，而NC-1是三聚体，这意味着二聚体需要连接到三聚体。因此，构建在Fc上不存在单个二硫化物的NC-1-Fc融合蛋白有助于防止Fc的二聚体形成，以避免例如差的蛋白质表达。例如，这可以通过将Fc结构域的N端半胱氨酸（例如，SEQ ID NO:6中所示的人Fc结构域的氨基酸残基11和14半胱氨酸）突变成丙氨酸来实现。预期这种方法将提供由于非三重螺旋三聚化结构域介导的NC-1三聚化而形成的三聚体Fc-三聚体NC-1构建体。在其他方面中，融合蛋白可以包含例如寡聚化结构域和内皮抑素结构域。可以进一步包含铰链区，任选具有重组蛋白酶断裂位点。或者，其可以包含铰链区和内皮抑素结构域。
在本发明的融合蛋白的另一个优选实施方案中，寡聚化结构域包含人胶原蛋白18的非三重螺旋三聚化结构域和/或人造寡聚化结构域和/或其他上述用于单体寡聚化的机制。
优选，Fc结构域（如所述的，例如，在SEQ ID NO:5或6中）来自IgG。在一个方面中，如本文中定义的NC-1单体经由(多)肽接头与一个或多个Fc结构域融合。例如，NC-1单体可以通过多甘氨酸(poly Gly)接头与人IgG的Fc部分融合。
在本发明的融合蛋白进一步优选的实施方案中，人造寡聚化结构域在内皮抑素结构域的位置7包含单突变，其中谷氨酰胺被半胱氨酸替代。
在一个实施方案中，将铰链区插入本文所述NC-1单体中的内皮抑素结构域和Fc结构域之间。所述铰链区可以包含重组蛋白酶断裂位点，如肠激酶或凝血酶断裂位点。任选，除了铰链区的内源性蛋白酶断裂位点（例如，用于MMP），胶原蛋白18的NC-1单体内的铰链区还可以包含一个或多个重组蛋白酶断裂位点。
在本发明的融合蛋白的另一个优选实施方案中，融合蛋白的结构域排列为Fc结构域-寡聚化结构域-铰链区-内皮抑素结构域或寡聚化结构域-铰链区-内皮抑素结构域-Fc结构域或Fc结构域-内皮抑素结构域-铰链区-寡聚化结构域或内皮抑素结构域-铰链区-寡聚化结构域-Fc结构域。优选融合蛋白的结构域排列介导内皮抑素单体经由结合在两个Fc-片段之间的二硫化合物而寡聚化。
在本发明的融合蛋白的再一优选实施方案中，融合蛋白缺乏NC-1结构域的缔合结构域，即，其包含Fc结构域作为寡聚化结构域。
除了本发明的蛋白质寡聚物，最近已经构建了包含NC-1单体和免疫球蛋白的Fc结构域的Fc-NC-1融合蛋白，并且将测试其抗血管生成活性和/或抗肿瘤活性和较长的半衰期。预期这样的融合蛋白仍然将呈现出比本发明的蛋白质寡聚物更长的半衰期和/或仍然提高的抗血管生成活性。
在融合蛋白的一个实施方案中，所述融合蛋白是蛋白质寡聚物，优选二聚体、三聚体或四聚物。术语“蛋白质寡聚物”已经在本文中别处进行了定义。本发明的蛋白质寡聚物的定义和实施方案，作出必要的调整后，适用于包含如本文中定义的NC-1单体和免疫球蛋白Fc结构域的本发明融合蛋白。本发明的范围内包括所述融合蛋白可以包含一个以上如本文中定义的NC-1单体，例如，两个、三个、四个或甚至更多个单体。在这样的实施方案中，本发明的融合蛋白用作寡聚物。此外，所述融合蛋白可以包含一个以上Fc结构域，例如，两个、三个、四个或甚至更多个Fc结构域。
在本发明的融合蛋白的一个优选实施方案中，本发明的融合蛋白中的铰链区在MMP蛋白酶断裂位点中包含导致降低的所述MMP蛋白酶断裂的结构修饰，例如，一个或多个突变。
本发明还涉及一种融合蛋白，其包含：
a）内皮抑素肽或内皮抑素衍生肽；和
b）纤连蛋白的RGD基序和/或PHSRN基序。
关于本发明的蛋白质寡聚物或肽寡聚物或融合蛋白（包含NC-1单体和Fc结构域）的定义和实施方案，作出必要的调整后，适用于包含如上所述的特征a）和b）的本发明融合蛋白。
本文中别处已经描述“内皮抑素肽”或“内皮抑素-衍生肽”，如内皮抑素的N-端锌结合结构域或对应于内皮抑素的N-端锌结合结构域的合成肽，并且详细显示于以下的实施例中；参见，例如，SEQ ID NO.9和10的氨基酸序列。本发明包括SEQ ID NO.9和10的氨基酸序列的变体，例如，也可以使用SEQ ID NO.9和10的较短的氨基酸序列。例如，本发明发明人已经发现，对应于SEQ ID NO:9的位置1至13或SEQ ID NO:10的位置1至12的肽可以用作上述本发明的融合蛋白中的内皮抑素肽。此外，这样的肽可以与相应的内皮抑素肽或内皮抑素衍生肽有一个、两个、三个、四个或甚至更多个氨基酸残基的不同，同时至少保持（或甚至超过）NC-1的内皮抑素结构域中的相应内皮抑素肽的生物活性（如本文中别处所述的）。根据这，出于本文中别处所列的原因，重要的是，维持对应于SEQ ID NO.9或10的位置1、3和/或11的组氨酸氨基酸残基。可以用于本申请的融合蛋白或寡聚物中的表现出抗血管生成和/或抗肿瘤活性的内皮抑素肽的实例已经有更多的描述，例如，在Tjin等，上述引文中，或US7,524,811中。
相似地，本文中别处已经提及了纤连蛋白（FN）中的RGD基序和/或PHSRN基序，并且在以下实施例中进一步表征。例如，SEQ ID NO.11和12提供了包含RGD基序和对于纤连蛋白结合整联蛋白重要的周围氨基酸残基的氨基酸序列。简而言之，纤连蛋白由整联蛋白α5β1和αVβ3识别。用于整联蛋白结合的纤连蛋白的主要序列基序是三肽，Arg-Gly-Asp（RGD），位于连接FN-III10的承力G-和F-带的环上。在纤连蛋白的整联蛋白结合中进一步涉及Pro-His-Ser-Arg-Asn（PHSRN）基序，其位于III型纤连蛋白的第九结构域。例如，分别在登录号NP_034363.1和NP_997647.1中显示了鼠和人纤连蛋白（FN）的相应氨基酸序列。人FN的结构域结构可以源自例如Wijelath等.2006,Circ.Res.99,853-860的出版物。优选，纤连蛋白的RGD基序包含SEQ ID NO.11、12或17或由SEQ ID NO.11、12或17组成。
优选，内皮抑素肽或内皮抑素衍生肽位于融合蛋白的氨基-端末端，并且纤连蛋白的RGD基序和/或PHSRN基序位于本发明的融合蛋白的羧基-端末端。
优选，本发明的融合蛋白包含如SEQ ID NO:7或13中显示的氨基酸序列。
在本发明的融合蛋白的另一个优选实施方案中，融合蛋白进一步包含如本文中定义的Fc结构域或人造寡聚化结构域。优选，具有人造寡聚化结构域的融合蛋白包含如SEQID NO:15中所示的氨基酸序列。
基于以下实施例中所示的实验数据，本发明发明人提出假说：寡聚NC-1可以经由结合纤连蛋白（FN）通过干扰至少两个关键血管生成途径（即，VEGF和整联蛋白α5β1（ITGA5B1）信号传导）而发挥其作用。此外，他们发现，在长期暴露（即，四次连续体内传代）后变得抵抗寡聚NC-1（Fc-内皮抑素）的肿瘤中，FN显著下调。因此，他们提出，FN的丢失可能是内在的和获得性的寡聚NC-1抗性的关键机制。为了证明此想法，已经工程化构建了最小的肽序列，其模拟内皮抑素（ED）-纤连蛋白复合物的关键作用。为此，发明人首先选择了由27个氨基酸-NH2-末端区组成的完整ED-结构域中最有活性的基序（Tjin Tham Sjin等，2005,Cancer Res.65,3656-63）。本发明发明人的初步数据表明，该区域自身能够结合VEGF，并且该肽序列中的两个组氨酸（锌结合结构域）对于VEGF结合可能是关键的。这是可能的，因为其中组氨酸被丙氨酸残基替代的突变肽不能与VEGF-ED-二聚体（Fc-内皮抑素）竞争结合。另一方面，纤连蛋白含有对于其结合ITGA5B1关键的两个活性基序，即，PHSRN-和RGD-依赖性基序。图10显示了ED-结构域和FN内的关键基序的示意性概图。为了模拟寡聚NC-1和FN的生理复合物（其介导NC-1-ED的整联蛋白信号传导和其他特性），发明人将这两个关键基序融合，即，上述NC-1-ED结构域中最有活性的基序以及包含“RGD”和对结合重要的周围氨基酸残基的纤连蛋白的整联蛋白-结合基序，并且产生了称为“超级他汀（Superstatins）”的杂交融合蛋白。对于每个融合蛋白，设计了鼠和人等价物，如以下和实施例2.10中更详细描述的。使用鼠（C57BL6）LLC（Lewis肺癌）肺癌模型，发明人能够证实鼠超级他汀肽有效地抑制肿瘤生长的功效；参见图11。此外，超级他汀与对照相比，显著延长了存活。相反，单独的FN-基序没有显示出阻止肿瘤生长的显著改善。
鼠超级他汀的相应氨基酸序列显示于SEQ ID NO:7中，而人超级他汀的相应氨基酸序列显示于SEQ ID NO:13中。超级他汀可能是单体。SEQ ID NO:15显示了人超级他汀氨基酸序列的变体，由于SEQ ID NO:13中位置7的谷氨酰胺被半胱氨酸替代，其能够二聚化。本发明的该融合蛋白将允许分析二聚化对抗肿瘤活性的影响。含有PHSRN替代FN的RGD基序的其他构建体，以及经由二硫化物结合或Fc区而促进超级他汀二聚化的构建体目前在制备中，或者已经处于体内评价下。可以将人超级他汀肽（SEQ ID NO:13）与螯合剂1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（也称为DOTA）缀合，所述螯合剂使得肽能够与例如放射性核素（如，镓（68Ga））缀合，用于非侵袭性成像（正电子发射X射线层析照相术，PET）。发明人目前在BxPC3人胰腺癌模型中检查DOTA缀合是否影响人超级他汀肽在体内的功效。一旦这个实验证实了超级他汀-DOTA构建体的活性，可以考虑评价超级他汀-DOTA作为诊断剂潜能的体内PET-成像；参见实施例2.10。
因此，本发明进一步涉及融合蛋白，其包含a）内皮抑素肽或内皮抑素-衍生肽和b）纤连蛋白的RGD基序和/或PHSRN基序，用作诊断组合物。优选，将人超级他汀肽（SEQ ID NO:13）与螯合剂1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（也称为DOTA）缀合。
在本发明该融合蛋白的另一个优选实施方案中，融合蛋白可以用于鉴定和/或表征纤连蛋白结合内皮抑素的区域。这样的方法是本领域已知的，参见，例如，BiaCore。
本发明的融合蛋白的更多实施方案可以源自以下实施例。
本发明进一步涉及编码本发明融合蛋白的多核苷酸。
如本文中所用的术语“多核苷酸”是指单-或双-链DNA分子以及RNA分子。所述术语包括基因组DNA、cDNA、hnRNA、mRNA以及这些分子的所有天然产生的或人工修饰的衍生物。在一个方面中，多核苷酸可以是线性或环状分子。此外，除了编码本发明融合蛋白的核酸序列以外，本发明的多核苷酸还可以包含正确转录和/或翻译所需的其他序列，如5’-或3’-UTR序列。编码本发明的融合蛋白的核酸序列可以由本领域技术人员，无需过度劳动，从所设想的本发明融合蛋白的氨基酸序列而获得。根据遗传密码的简并性，在本发明的多核苷酸中，编码融合蛋白的核酸序列中可以使用优化的密码子。由此，可以在例如本发明的宿主细胞中获得最佳表达。
将理解，本发明还包括本发明融合蛋白的特定氨基酸序列或编码它们的核酸序列的变体，只要这些变体序列仍允许形成本发明的融合蛋白即可。所述变体优选具有如本文中别处定义的抗血管生成活性。在一个方面中，如本文中使用的序列变体与之前具体描述的特定氨基酸序列或特定核酸序列有一个或多个氨基酸或核苷酸取代、添加和/或缺失的不同。在另一个方面中，所述变体序列，与本发明融合蛋白的特定序列，在该特定序列的整个长度或至少一半长度链上，具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。如本文中使用的术语“同一性”是指，通过确定两个序列之间的相同氨基酸数目来表征的序列同一性，其中将所述序列进行比对以使得获得最高匹配。可以使用在计算机程序中编码的公开技术或方法，例如，BLASTP或FASTA来计算（Altschul1990,J Mol Biol215,403）。在一个方面中，在整个氨基酸序列或查询序列的至少50%的序列链上计算百分比同一性值。本领域工作人员可以获得基于各种算法的多个程序，用于比较不同的序列。在本文中，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法给出特别可靠的结果。为了进行序列比对，可以使用程序PileUp（Higgins1989,CABIOS5,151）或程序Gap和BestFit（Needleman1970,J Mol Biol48;443；Smith1981,Adv Appl Math2,482），其是GCG软件包的一部分（Genetics Computer Group1991,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711）。在本发明的另一个方面中，使用以下设定，在整个序列区上，使用程序GAP来测定上述序列同一性值（表示为百分比（%））：空位权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000，和平均错配：0.000，除非另外具体指出，否则这些设定应当总是用作序列比对的标准设定。
本发明进一步涉及包含本发明多核苷酸的载体。
优选，载体是表达载体。
术语“载体”优选包括噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体以及人造染色体，如细菌或酵母人造染色体。此外，该术语还涉及靶向构建体，其允许靶向构建体随机或定点整合至基因组DNA中。在一个方面中，这样的靶向构建体包含足够长度的DNA，用于同源或异源重组，如以下详细描述的。在一个方面中，包括本发明多核苷酸的载体进一步包含可选择标志物，用于在宿主细胞中繁殖和/或选择。载体可以通过本领域公知的各种技术引入至宿主细胞中。例如，质粒载体可以在沉淀物中引入，如磷酸钙沉淀物或氯化铷沉淀物，或在与带电荷脂质体的复合物中或基于碳的团簇物如富勒烯（fullerens）中引入。或者，可以通过热休克或电穿孔技术引入质粒载体。如果载体是病毒，可以在应用于宿主细胞之前，使用合适的包装细胞系在体外包装。逆转录病毒载体可以是能复制的或复制缺陷的。在后一种情况中，病毒繁殖通常只发生在互补宿主/细胞中。
此外，在本发明的一个方面中，所述载体中，多核苷酸可操作地连接表达控制序列，以允许在原核生物或真核生物宿主细胞中或其分离的级分中表达。因此，一方面，载体是表达载体。多核苷酸的表达包括多核苷酸转录成可翻译的mRNA。确保在宿主细胞中表达的调控元件是本领域公知的。在一个方面中，它们包含确保转录启动的调控序列和/或确保转录终止和转录产物稳定的poly-A信号。其他调控元件可以包括转录以及翻译增强子。允许在原核生物宿主细胞中表达的可能的调控元件包括，例如，大肠杆菌中的lac-、trp-或tac-启动子，以及允许在真核生物宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOX1-或GAL1-启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-、SV40-、RSV-启动子（劳斯肉瘤病毒）、CMV-增强子、SV-40增强子或球蛋白内含子。此外，可诱导表达控制序列可以用于本发明的表达载体中。这样的可诱导载体可以包含tet或lac操作子序列或通过热休克或其他环境因素可诱导的序列。合适的表达控制序列是本领域公知的。除了负责转录启动的元件，如调控元件，还可以包含转录终止信号，如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点，在多核苷酸的下游。在此，合适的表达载体是本领域已知的，如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1（Pharmacia）、pBluescript（Stratagene）、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（Invitrogen）或pSPORT1（Invitrogen）。优选，所述载体是表达载体以及基因转移或靶向载体。源自病毒（如，逆转录病毒、痘病毒、腺-相关病毒、疱疹病毒或牛乳头状瘤病毒）的表达载体可以用于本发明的多核苷酸或载体递送至靶向的细胞群中。本领域技术人员公知的方法可以用于构建重组病毒载体；参见，例如，Sambrook,Molecular Cloning A Laboratory Manual（分子克隆，实验室手册）,Cold Spring Harbor Laboratory(2001)N.Y.和Ausubel,CurrentProtocols in Molecular Biology（分子生物学通用实验方案）,Green PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y.(1994)中所述的技术。
本发明进一步涉及包含本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞。
如本文中所用的术语“宿主细胞”包括原核生物和真核生物宿主细胞。在一个方面中，宿主细胞是细菌细胞。在一个方面中，所述细菌宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞。这样的细菌宿主细胞可以用于例如本发明的多核苷酸或载体的复制。
在一个方面中，真核生物宿主细胞是包含本发明的融合蛋白和多核苷酸或载体的细胞，其中所述多核苷酸或载体在宿主细胞中表达，以产生融合蛋白。可以将多核苷酸瞬时地或稳定地引入宿主细胞中。在一个方面中，真核生物宿主细胞可以是稳定表达本发明的多核苷酸的真核生物宿主细胞系的细胞。在另一个方面中，宿主细胞是用本发明的多核苷酸或载体瞬时转染并且表达本发明的多核苷酸的真核生物宿主细胞。在另一个方面中，所述细胞是已经遗传工程化来产生本发明的融合蛋白的细胞。这样的细胞怎样通过分子生物学技术来工程化是本领域技术人员公知的。
本发明进一步涉及一种用于生产本发明的融合蛋白的方法，其包括;
a）培养包含编码本发明的融合蛋白的核酸的宿主细胞，优选在无血清条件下，
b）从步骤a）的宿主细胞获得本发明的融合蛋白。
本发明进一步涉及一种药物，优选药物组合物，其包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸、载体、宿主细胞或融合蛋白。
在一个方面中，如本文中所用的术语“药物”是指，含有本发明的编码融合蛋白的多核苷酸、载体、宿主细胞或融合蛋白作为药物活性化合物的药物组合物，其中药物组合物可以以治疗有效剂量用于非人类或优选人类以治疗本文中别处具体说明的各种血管生成相关疾病或病症。本文中别处已经列出了可能的给药途径。在一个方面中，本发明的编码融合蛋白的多核苷酸、载体、宿主细胞或融合蛋白可以以液体或冻干形式存在。在一个方面中，所述化合物可以与甘油、蛋白质稳定剂（例如，人血清白蛋白（HAS））或非-蛋白质稳定剂一起存在。在另一个方面中，所述化合物是PEG化的。
化合物（即，本发明的编码融合蛋白的多核苷酸、载体、宿主细胞或融合蛋白）是组合物的活性成分，并且在一个方面中，以根据常规程序通过将药剂与标准药物载体组合而制得的常规剂型来给药。按照所需制剂，酌情地，这些程序可以涉及混合、造粒和压片，或溶解成分。将理解，药物学可接受的载体或稀释剂的形式和特征由待混合的活性成分的量、给药途径和其他公知变量来决定。
在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上，载体必须是可接受的。所用的药物载体可以包括固体、凝胶或液体。示例性固体载体是乳糖、白土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯树胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例性液体载体是磷酸盐缓冲盐水溶液、糖浆、油、水、乳液、各种类型的润湿剂等。相似地，载体或稀释剂可以包括本领域公知的延时材料，如甘油基单硬脂酸酯或甘油基二硬脂酸酯单独或与蜡结合。所述合适的载体包含上述那些和本领域公知的其他载体，参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania。
选择稀释剂，使得不影响生物活性，优选，不影响所述组合的抗血管生成活性。这样的稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、Ringer溶液、葡萄糖溶液和Hank溶液。此外，药物组合物或制剂还可以包括其他载体、助剂、或无毒、无治疗性、非免疫原性的稳定剂等。
治疗有效剂量是指用于本发明药物中的化合物的量，该量可以预防、改善或治疗伴随本说明书中提及的血管生成相关疾病或病症的症状。可以在细胞培养物或实验动物中，通过标准药物学程序，测定化合物的治疗功效和毒性，例如，ED50（在50%群体中治疗有效的剂量）和LD50（50%群体死亡的剂量）。治疗作用和毒性作用之间的剂量比为治疗指数，并且可以表示为比例LD50/ED50。
剂量给药方案可以由主治医生和其他临床因素来决定。如医学领域公知的，用于任一位病人的剂量取决于许多因素，包括病人的尺寸、体表面积、年龄、待给药的特定化合物、性别、给药时间和途径、总体健康和并行给药的其他药物。可以通过定期评价来监控进展。
本文中提及的药物至少给药一次，用以治疗或改善或预防本说明书中提及的疾病或病症。然而，所述药物可以给药一次以上。
可以以药物领域中公知的方式来制备具体的药物组合物，其包含与药物学上可接受的载体或稀释剂混合或以其它方式组合的至少一种上文中提及的活性化合物。为了制备具体的药物组合物，通常将活性化合物与载体或稀释剂混合。所得到的制剂经调整以适应给药方式。在处方或使用者说明书中应当标明推荐剂量，以便根据所考虑的接受者预期剂量的调节。
在本发明进一步的方面中，除了本发明编码融合蛋白的多核苷酸、载体、宿主细胞或融合蛋白以外，本发明药物还可以包含在配制过程中加入药物中的药剂。最后，将理解，药物的配制在GMP标准化条件或类似条件下进行，以确保药物的品质、药物安全性和有效性。
在本发明的融合蛋白的进一步优选的实施方案中，包含编码本发明融合蛋白的多核苷酸、本发明载体、宿主细胞或融合蛋白的药物或药物组合物用于治疗或预防血管生成相关疾病，所述疾病选自：血管生成-依赖性癌症，包括实体肿瘤，黑素瘤，肿瘤转移，血源性肿瘤如白血病，良性肿瘤如血管瘤，听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼，化脓性肉芽肿；类风湿性关节炎；牛皮癣；眼血管生成疾病，如糖尿病性视网膜病，早产儿视网膜病，黄斑变性，角膜移植排斥，新生血管性青光眼，晶状体后纤维增生症，红变(rubeosis)；Osler-Webber综合症；心肌血管生成；斑块新血管生成；遗传性出血性毛细血管扩张症；血友病关节；血管纤维瘤；伤口肉芽；内皮细胞过度或异常刺激的疾病，如肠粘连，动脉粥样硬化，硬皮病，肥厚性瘢痕（瘢痕瘤）；血管生成作为病理性结果的疾病，如猫抓病（Rochele minalia quintosa）和溃疡（幽门螺杆菌）。
本发明进一步涉及包含本发明的多核苷酸、载体、宿主细胞或融合蛋白的诊断组合物。
本发明进一步涉及包含本发明的多核苷酸、载体、宿主细胞或融合蛋白用于在体外或体内确定样品中的抗血管生成活性的用途。
本发明进一步涉及包含本发明的多核苷酸、载体、宿主细胞或融合蛋白和说明书的药盒，用于治疗血管生成相关疾病。
如本文中所用的术语“药盒”是指包含本发明融合蛋白、编码融合蛋白的多核苷酸、载体和/或宿主细胞的工具的集合，其以即用的方式在分开或共同的小瓶中提供，以用于进行血管生成相关疾病的治疗。在一个方面中，药盒包含用于进行血管生成相关疾病治疗的其他工具，在一个方面中，包含可以组合本发明的蛋白寡聚物或融合蛋白使用的其它抗血管生成剂（例如，本文所述的那些）。此外，在一个实施方案中，药盒包含用于进行血管生成相关疾病治疗的说明书。这些说明书可以作为手册提供，或可以是数据存储介质上的计算机-可执行算法的形式，其在执行时能够控制血管生成相关疾病治疗的一个或多个步骤。说明书包括关于本发明的融合蛋白的剂量、给药时间和方式等的信息。在一个方面中，药盒可以用于进行上文中所列特定血管生成相关疾病的治疗。
本发明进一步涉及用于鉴定抗血管生成剂的（体外）方法，其包括：
a）在允许本发明寡聚物或融合蛋白结合纤连蛋白和/或VEGF形成复合物的条件下，将本发明的寡聚物或融合蛋白接触纤连蛋白和/或VEGF，
b）将步骤a）的复合物接触一组试剂，
c）鉴定并分离能够结合步骤a）的复合物的那些试剂，和
d）在体外试验中测试步骤c）中鉴定的试剂的抗血管生成活性。
步骤b）中使用的该组试剂可以是例如蛋白质或抗体文库、噬菌体展示文库、小的有机化合物等。该方法可以进一步包括步骤（e），其中可以鉴定负责结合本发明的寡聚物或融合蛋白的纤连蛋白的区域。然后可以将这一信息用于抗血管生成和/或抗肿瘤治疗剂的分子设计。
使用本发明蛋白质寡聚物的方法的定义和实施方案加以必要的调整后适用。
本发明还涉及一种用于生产本发明的突变NC-1-Fc或Fc-NC-1融合蛋白的方法，包括：
a）通过用半胱氨酸替代谷氨酰胺，在NC-1-Fc或Fc-NC-1融合蛋白中的内皮抑素结构域的氨基酸位置7引入单突变，和
b）分离步骤a）的突变NC-1-Fc或Fc-NC-1融合蛋白。
所述突变已经在本文中的别处进行了描述。
最后，与之前的报道相反，本发明人能够在小鼠中产生对Fc-内皮抑素具有抗性的肿瘤。Fc-内皮抑素形成寡聚物，并且例如因为其结合纤连蛋白（内皮抑素单体不结合），因此模拟本文中所述的寡聚NC-1的作用。这些肿瘤通过在鼠肺癌（LLC）和人胰腺癌（BxPC3）中多达4代连续植入和处理肿瘤而产生。全基因组表达谱揭示了纤连蛋白的下调，该下调是导致肿瘤对Fc-内皮抑素治疗的抗性的重要机制。这与发明人的观察——寡聚Fc-内皮抑素和寡聚NC-1与纤连蛋白选择性结合——相一致。
因此，本发明涉及一种用于预测癌症患者对所用的癌症疗法的应答的方法，其包括步骤：a）通过使用本发明的NC-1寡聚物或融合蛋白测量患者样品中的纤连蛋白的水平，和b）预测所述患者对所述癌症疗法的应答，其中与（健康受试者的）参照水平相比，低纤连蛋白水平指示患者对所用的癌症疗法无应答。
此外，本发明包括一种药盒，其包含本发明的NC-1寡聚物或融合蛋白，用于预测肿瘤对使用本发明寡聚NC-1或融合蛋白的治疗的应答。如上所述，所述的本发明化合物可以用于检测癌症患者样品中的纤连蛋白或其片段的水平。
发明人已经令人惊讶地发现，通过使用本发明的NC-1寡聚物或融合蛋白分析纤连蛋白水平，可以预测癌症治疗应答。本发明的NC-1寡聚物或融合蛋白结合纤连蛋白的能力可以用于例如确定癌症患者样品中的纤连蛋白水平。通过本发明的NC-1寡聚物或融合蛋白检测到的低纤连蛋白水平指示坏的预后，并且因此可以用作分子治疗预测剂，以鉴定癌症患者中的治疗应答者和无应答者。更特别地，经历了抗肿瘤治疗（如，但不限于，通过本发明的NC-1寡聚物或Fc融合蛋白的治疗、化疗或抗体治疗）的癌症患者的肿瘤、肿瘤环境、血清、血浆或尿液中的低纤连蛋白浓度，是患者对所用治疗具有差的应答或无应答的预后。
令人感兴趣地，发明人鉴定到激活后导致肿瘤抵抗Fc-内皮抑素治疗的多个补偿性通路。特别地，用IGF1R抑制剂序贯治疗似乎是有前景的，并且CCL2似乎构成了另一个有前景的候选靶标，如以下实施例中所示的。由于Fc-内皮抑素模拟本发明的NC-1寡聚物或融合蛋白的作用，该发现对如下患者也是相关的，其中所述患者抵抗通过所述NC-1寡聚物或融合蛋白进行的治疗。为了避开对本发明的寡聚NC-1或融合蛋白的获得性药物抗性，可以使用抗-IGF1R、-CCL2或-PI3K靶向剂的并行或序贯治疗。为此，可以使用所述靶标的抑制剂，如本领域中描述的抗体或PI3K抑制剂。
根据以上所述的，本发明进一步涉及与抗-IGF1R和/或-CCL2靶向剂（如-但不限于-抗体）的并行或序贯治疗，以避免对寡聚NC-1的获得性抗药性。
说明书中引用的所有参考文献在此通过引用而并入其完整公开内容和说明书中特意提及的公开内容。
在以下附图和实施例中，术语“hNC-1”对应于人NC-1结构域，而术语“mNC-1”是鼠NC-1结构域。如果没有另外指出，NC-1结构域是天然的胶原蛋白18的三聚体NC-1，其包含缔合结构域、铰链区和内皮抑素结构域（包括锌结合位点）。
附图说明
图1（A）：人血小板的免疫沉淀
使用25mM Tris、0.15M NaCl、1%NP-40，pH7.5和蛋白酶抑制剂的混合物裂解来自15ml新鲜收集的血浆的血小板（总体积为3ml）。将裂解物离心并过滤。将蛋白质Fc、Fc-VEGF和Fc-内皮抑素（各自为10μg）分别地加入1ml裂解物中。使用了蛋白A。孵育时间为4℃18h。三次洗涤后，将洗脱的样品施加于PAGE，并且用考马斯染料染色。对照泳道是缺少裂解物的样品。从凝胶中切出候选蛋白质，并且送去质谱分析。
图1（B）：Elisa
在PBS中以10μg/ml的浓度进行蛋白质的包被。相同浓度的纤连蛋白用作配体。所有缓冲剂含有2%BSA、0.1%吐温-20。
图1（C）：Biacore测量内皮抑素单体、二聚体和NC-1三聚体与纤连蛋白结合的平衡常数。
以0.78nM-100nM范围，系列稀释至0.01M Hepes，pH7.4，0.15M NaCl，0.05%表面活性剂（含有1mg/ml BSA）中，制备纤连蛋白样品，以60μl/min的流速流过对照和衍生后的表面三分钟。监控离解相5分钟。包括零浓度空白缓冲剂循环作为阴性对照样品。每个相互作用分析循环后，使用1分钟注射1M乙醇胺，pH8.5，再生传感器表面。没有观察到传感器表面CM4的非特异性结合作用。显示了计算的ka、kd和KD。不同曲线对应于不同浓度的纤连蛋白。
图2：内皮抑素结合活性以及与血管中纤连蛋白的共定位。
使用免疫组织化学，验证处理后ASPC-1异种移植物小鼠中Fc-内皮抑素的分布。（A）在肿瘤、心脏和肾脏中，通过Alexa488-标记的抗体（绿色）检测了外源性内皮抑素，并且使用了血管标志物CD31，通过Alexa594-标记的抗体（红色）进行了检测。（B）使用α-SMA（周细胞标志物，红色）来证实内皮抑素与肿瘤血管的结合。（C）外源性内皮抑素（绿色）分布与肿瘤中的纤连蛋白（红色）相似。人Fc（hFc）对照没有显示出结合。（D）在未处理的动物肿瘤中，通过抗内皮抑素和纤连蛋白的多克隆抗体来检测内源性胶原蛋白18（绿色）和纤连蛋白（红色）。（E）Fc-内皮抑素和整联蛋白α5β1的染色。（F）vW和整联蛋白α5β1的染色。（G）使用E14.5小鼠脑胚胎切片来验证纤连蛋白、VEGF和Fc-内皮抑素的分布（Bar，100μm）。
图3（A）：Fc-内皮抑素和胶原蛋白hNC-1与内皮细胞的结合。
与Fc-内皮抑素一起孵育HUVEC，并且用Alexa488IgG或人NC-1（hNC-1）三聚体检测，并通过抗-His标签单克隆抗体来检测。纤连蛋白染色显示为红色（Bar，20μm）。
图3（B）：hNC-1抑制内皮细胞迁移。
将HUVEC种在transwell板的24-孔插入物中，一式两份。下室装了含有100ng/ml恒河猴VEGF（rhVEGF）加上不同浓度的hNC-1的无血清培养基。在37℃培养16h后，将细胞固定并染色。内皮细胞在100和200ng/ml hNC-1的处理下显示出较少的迁移（a）。hNC-1在内皮细胞迁移抑制中的作用显示U-形曲线（b）。将内皮抑素单体、二聚体和NC-1用于比较（c）。
图4：人血清和血小板的免疫沉淀和之后的Western分析。
（A）M1和M2分别是指重组内皮抑素（187个氨基酸）和NC-1。1）免疫前(pre-immune)和人血清。2）内皮抑素抗体和人血清。（B）M含有hNC1和内皮抑素标志物。泳道1和2与（A）中相同。泳道3（免疫前血清）和4（抗-内皮抑素抗体）对应于未出现在（A）中的个体的血清。（C）从与（A）中所用不同的PRP样品获得的人血清的亲和纯化，接着Western分析，没有IP步骤。（D）人血小板的免疫沉淀。hNC-1和内皮抑素标志物在泳道M中。1）免疫前血清和血小板裂解物。2）抗-内皮抑素抗体和血小板裂解物。在蛋白A的存在下进行IP。将样品进行PAGE和转移后，用抗-内皮抑素单克隆抗体PDM处理膜。
图5：用hNC-1治疗带有人黑素瘤癌细胞（A2058）的小鼠。
用hNC-1（100μg/鼠，一天一次）、临床级内皮抑素（100和500μ g/鼠，一天一次）或PBS，皮下（s.c.）治疗每个组中的4-6只荷瘤裸鼠。在坏死发展之前，停止治疗。注射部位远离肿瘤。显示了肿瘤大小和治疗/对照（T/C）比例。hNC-1治疗的组在实验结束时显示出67%的肿瘤生长抑制，而用内皮抑素治疗的组只显示出48%抑制。
图6：纤连蛋白、整联蛋白α5β1、VEGF-A和hNC-1之间相互作用的示意性模型。
图7：作为在293肾细胞转染中使用的质粒量的函数，鼠Fc-NC-1融合蛋白在还原和非还原条件下的SDS凝胶。
在还原条件下，产物是由Fc和NC-1组成的单链。在非还原条件下，产物是二聚体，因为Fc是二硫化物键合的。凝胶中间的单条带是由内皮抑素标志物而产生的，其具有20Kd的分子量。
图8：长期暴露于小鼠Fc-制管张素(angiostatin)和Fc-内皮抑素后体内抗性Lewis肺癌肿瘤的产生。
使用IgG-Fc获得了NC-1内皮抑素结构域的二聚化。肿瘤生长的强烈初始抑制（p1）后，通过在肿瘤达到了>1000-1500mm3的肿瘤大小后将肿瘤重新植入新的动物中，使肿瘤长期地暴露于Fc-内皮抑素抗-血管生成治疗（多达四次连续传代，p1-4）。进行连续体内肿瘤传代，以实现长期的和连续的抗血管生成治疗暴露，以富集抗性肿瘤细胞群。P4肿瘤（下图）甚至比未治疗的对照p4肿瘤生长更快，尽管连续暴露于寡聚NC-1-片段（Fc-内皮抑素）。这些数据清楚地表明，肿瘤可以发展出获得性的抗寡聚NC-1片段的抗药性。
图9：寡聚-NC-1片段（mFc-内皮抑素）抗性Lewis肺癌（LLC）肿瘤的全基因组表达谱。
表达谱揭示了，纤连蛋白（FN1）在鼠(m)Fc-内皮抑素（FcEndo）抗性肿瘤中显著下调（热图，绿色框）。通过q-RT-PCR证实了候选基因的调节，并且呈现了相对于p4对照肿瘤的倍数表达比率（图表）。该发现支持了发明人的数据，证明了寡聚NC-1片段通过结合FN1来发挥抗血管生成作用。因此，肿瘤中FN1的下调使得它们对寡聚NC-1具有抗性。此外，发明人鉴定了在Fc-内皮抑素抗性肿瘤中上调的几个关键通路，如IGF1R和CCL2（红色框）。因此，关键结合伴侣的下调和替代性血管生成通路的补偿性上调构成了协同机制，肿瘤通过该机制可以逃避使用寡聚NC-1片段的治疗。因此，FN1水平以及IGF1R/CCL2调节可以成为预测肿瘤对寡聚-NC-1片段癌症治疗的应答的工具。
图10：内皮抑素（ED）-结构域和纤连蛋白（FN）内的关键基序的示意性概览。
FN内的整联蛋白结合结构域由两个基序RGD和PHSRN基序组成。与NC1-ED类似，可以获得肝素结合位点，如HepII，其介导与其他肝素结合因子（如，VEGF）的结合。NC1-ED的氨基端锌结合基序含有两个关键组氨酸（H），其一旦被丙氨酸（A）突变，将导致活性的消除；改编自Tjin Tham Sjin等，Cancer Res2005，65，3656-63和Wijelath等，2006，Circ.Res.99，853-860。
图11：超级他汀有效地抑制肿瘤生长。
将野生型LLC肿瘤（10,000个细胞）s.c.植入C57Bl6小鼠中。对肿瘤进行假性治疗（PBS，对照），用仅含有“LYAVTGRGDSPASSK”序列（SEQ ID NO:8）的参照FN-模拟肽（“FN-基序”）或使用鼠超级他汀（SEQ ID NO:7）治疗，剂量为100μl PBS中50μg肽，每12h一次，s.c.（n:每个组5只）。肿瘤植入后4天开始治疗（“预防试验”）并持续24天。值得注意的是，在治疗期中，在超级他汀组中仅有单个肿瘤生长。仅在停止超级他汀治疗后出现了另两个肿瘤，表明这些难以治疗的肿瘤受到了这种疗法的控制。在Kaplan-Meier分析中，达到1000mm2的肿瘤大小被认为是死亡事件。与对照相比，超级他汀显著延长了存活（p<0.03，通过对数秩（log-rank）检验）。相反，单独的FN-基序（SEQ ID NO:8）在肿瘤生长的预防中没有显示出显著的改善作用。
图12：纤连蛋白（FN）的敲低(knockdown)使得肿瘤对寡聚NC1物质具有抗性，以ED-二聚体（Fc-内皮抑素）举例说明。
相反，超级他汀肽（SEQ ID NO:7）对C57B16小鼠中s.c.生长的FN-/-LLC肿瘤发挥了有效的肿瘤生长抑制作用。
图13：使用IGF1R-抑制剂的序贯治疗在鼠Fc-内皮抑素（muFcEndo）-抗性LLC肿瘤的治疗中是有效的。
将之前产生的第四代Fc-内皮抑素-抗性LLC细胞（Endo P4，如以下实施例中所述的）皮下注入C57Bl6小鼠中。在第5代中，与假性治疗的肿瘤（对照）相比，如果维持内皮抑素选择压力，肿瘤生长更快。IGF1R信号传导的相继抑制（20mg/kg cyclolignanpicropodophyllin，PPP，IP注射）抑制了肿瘤生长。然而，并行给药只部分地逆转了mFc-Endo选择压力诱导的增强的生长动力学。
图14：第5代（P5）的Fc-内皮抑素-(Endo)-抗性LLC肿瘤细胞中蛋白质的差异表达。
通过Western印迹的蛋白质分析进一步证实了，第5代LLC肿瘤中，随着鼠Fc-内皮抑素（Endo）的治疗，IGF1R表达和磷酸化（p-IGF1R）的增强、纤连蛋白的下调和CCL2的上调。使用IGF1R抑制剂的序贯治疗部分地逆转了这种表型。
实施例
现通过实施例举例说明本发明，然而，不应当认为实施例限制本发明的范围。
实施例1：材料和方法
1.1细胞系和细胞培养物。将人肿瘤细胞系A2058（黑素瘤）和人胰腺癌细胞系ASPC-1在含有L-谷氨酰胺并补充了10%FCS和抗生素的DMEM中培养。将HUVEC（Lonza，瑞士）维持于含有抗生素的EBM内皮生长培养基和EGM Bullet试剂盒（Lonza，瑞士）中。
1.2表达和纯化。之前已经描述了人Fc-内皮抑素（hFc-内皮抑素）、人造内皮抑素二聚体和NC-1的构建、表达和纯化（Bergers等，1999,Science284,808，Lo等，1998,ProteinEng11，495；Kuo等，2001,J Cell Biol152,1233；Wen等，1999，Cancer Res59，1233）。通过在内皮抑素的N-端放置Fc结构域，制备重组构建体。在NS/0鼠骨髓瘤细胞中生产这些构建体的稳定细胞系。表达蛋白质并且分泌至培养基中。将蛋白A用于重组蛋白质的纯化（至少90%纯度）。大约，通过使用10-18升容量的发酵罐获得了50mg/升的Fc-内皮抑素。之前描述了人胶原蛋白18NC-1制备（Wen等，上述引文）。表达该蛋白质，并且分泌至培养基中，然后在Ni-琼脂糖（Invitrogen）上纯化。
1.3表面等离子体共振（SPR）结合试验。该分析提供一种用于测量两个结合伴侣之间的平衡常数的独特方法。通过记录复合物形成（ka）和解离（kd）的速率，接着使用软件确定这两个参数的值，能够评价相互作用动力学。通过计算kd/ka比，获得平衡常数（KD）。将人VEGF（R&D）、内皮抑素、内皮抑素二聚体和人NC-1（hNC-1）在10mM醋酸钠，pH5.5中稀释至50μg/ml，并且经由标准N-乙基-N’-(二甲基-氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）胺偶联程序固定在系列S传感器芯片CM4上。相似地准备对照表面，没有蛋白质衍生化，并且用作参照表面用于化合物结合实验。
使用BiacoreTM T100（GE Healthcare，Uppsala，瑞典）仪器进行了结合测量，其使用表面等离子体共振来检测和监控分子相互作用。
使用Biacore T100评价软件v1.1.1进行了数据分析。通过减去参照表面数据和空白缓冲液样品数据（通常称为“双重参照”的一种方法），处理数据，并且拟合1:1朗缪尔（lanmuir）结合模型。
1.4动物和肿瘤模型。所有动物操作依从Children’s Hospital Boston指南。实验方案获得Institutional Animal Care and Use Committee批准。使用了八周龄雄性（24-27g）裸/裸鼠（Massachusetts General Hospital，Boston，MA）。使小鼠适应环境，每组五只在屏障护理设施中笼养，并且随意摄取动物饲料和饮水。通过CO2吸入使动物安乐死。将人黑素瘤细胞系A2058用于动物研究。将0.1ml PBS中的2×106肿瘤细胞的悬浮液在近中线皮下（s.c.）注入小鼠的背部中。将小鼠称重，并且使用数字卡尺以两个直径每周监控肿瘤两次。使用a2×b×0.52测定了肿瘤体积（其中a是最短直径，而b是最长直径）。使肿瘤生长至～100mm3，并将小鼠随机化。通过皮下加速浓注进行治疗。实验完成后，切出肿瘤和器官，并且固定于4%多聚甲醛中，或快速冷冻。每个组处理四至六只小鼠。
1.5免疫细胞化学。将HUVEC接种并生长于盖玻片上。用10μg/ml hFc-内皮抑素、hFc、hNC-1或对照IgG，将细胞在37℃孵育120min，并且随后固定。将盖玻片在封闭缓冲液（2%BSA PBS）中孵育30min。对于hFc-内皮抑素或hFc组，用Alexa488抗人IgG孵育载玻片，用于成像。对于hNC-1或IgG组，用鼠抗-His-标签单克隆抗体孵育载玻片，然后通过Alexa488抗-小鼠IgG探测。将抗-纤连蛋白抗体（R&D）用于所有载玻片的二次染色，并通过Alexa594抗-山羊IgG探测，通过共聚焦显微镜成像。细胞核的DAPI复染显示为蓝色。
1.6免疫组织化学。用冷PBS漂洗肿瘤切片，并且用4%多聚甲醛固定10min，接着染色。通过Alexa488抗-人IgG检测了人Fc-内皮抑素。将胶原蛋白18（R&D）、纤连蛋白（R&D）、整联蛋白α5（R&D）CD31（BD Pharmingen，San Jose，CA）和von Willebrand因子（Dako，Carpinteria，CA）、α-SMA（Dako，Carpinteria，CA）的抗体用于染色。通过Alexa488或594-标记的二抗（Molecular Probes，Eugene，OR）来检测一抗。通过共聚焦显微镜（型号DM IRE2；Leica）对切片成像。
1.7内皮细胞迁移试验。用无血清EBM培养基将HUVEC洗涤两次，以5×104细胞/孔重悬浮于0.6ml培养基中，种在24-孔插入物（Coring，8μm孔径）中，一式两份。下室加入0.6ml含有100ng/ml恒河猴（rh）VEGF（R&D）的无血清EBM培养基。在37℃孵育16h后，通过甲醇固定细胞，并用曙红和苏木精染色。用棉签去除跨孔膜上侧的细胞。计数迁移至膜下侧的细胞。
1.8结合在细胞表面上的人Fc-内皮抑素（hFcES）的流式细胞术分析。所有操作在4℃进行。将HUVEC用胰蛋白酶消化，并且重悬浮于PBS（2%BSA）中30min，接着用1和10μg/mlhFcES或hFc孵育1h。将细胞离心，并且用冷PBS洗涤，然后用抗人Fc片段的FITC-标记的二抗（Sigma，St.Louis，MO）孵育，并通过BD Biosciences FACS Calibur流式细胞仪分析。
1.9统计学方法。将数据表示为平均值加或减SD。使用Student t检验来评价统计学显著性。
实施例2：结果
2.1二聚化内皮抑素和NC-1结合纤连蛋白。由于报道证明了血小板中存在内皮抑素，已经用血小板裂解物来鉴定结合内皮抑素的蛋白质（Italiano等，2008，Blood111，1227）。Fc-内皮抑素的优点之一是，其使得能够使用该构建体用于免疫沉淀（IP），而无需引入额外抗体来形成复合物。使用了三种蛋白质构建体，人Fc（对照）、二聚化人(h)Fc-内皮抑素和hFc-VEGF。数据显示于图1(A)中。比较上述三种试剂的IP结果，考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶泳道中的主要差异是在200kDa附近。该区域的质谱分析导致纤连蛋白被鉴定为内皮抑素和VEGF两者的候选结合蛋白。为了证实内皮抑素和VEGF与纤连蛋白的结合，进行了Elisa（图1B）。内皮抑素二聚体、NC-1、VEGF和整联蛋白α5β1（纤连蛋白的天然受体）结合纤连蛋白，而内皮抑素单体不结合。通过在重组Fc-内皮抑素中在内皮抑素的氨基酸位置7引入单突变（将谷氨酰胺改变成半胱氨酸）产生了人造内皮抑素二聚体。通过肠激酶消化该突变蛋白质后，产生了通过二硫键连接的内皮抑素二聚体（Kuo等，上述引文）。
为了测量以上蛋白质的平衡结合常数，使用了Biacore。对于内皮抑素二聚体、NC-1和VEGF，获得了高亲和力常数（图1C）。在内皮抑素单体和纤连蛋白之间没有检测到结合。作为该数据的支持，之前其他研究组已经报道了VEGF结合纤连蛋白（Wijelath等，2006，Circ Res99，853）。Fc-内皮抑素在Fc二聚体C-端的两个内皮抑素分子上赋予二聚体结构。Fc-内皮抑素与纤连蛋白的结合常数与内皮抑素二聚体相似（数据未显示）。
2.2免疫组织化学研究证明了二聚体内皮抑素通过纤连蛋白靶向内皮细胞。在ASPC-1异种移植物动物模型中，使用免疫荧光（IF）分析来证实hFc-内皮抑素的全身性分布。使用Fc的抗体检测了外源性寡聚化内皮抑素的分布，并且显示于图2A中。成像结果显示，不仅在肿瘤中发现了注射的寡聚内皮抑素，而且在心脏和肾脏内皮细胞中也发现了注射的寡聚内皮抑素。除了CD31（内皮细胞）染色外，还使用了周细胞标志物α-SMA来证实内皮抑素与血管的相互作用（图2B）。为了检测内皮抑素与纤连蛋白的结合，制备了hFc-内皮抑素处理的异种移植物模型的肿瘤切片。外源性二聚hFc-内皮抑素（hFcES）显示出与内源性纤连蛋白共定位（图2C）。还检测到了内源性胶原蛋白18和内源性纤连蛋白的共定位（图2D）。整联蛋白α5β1是纤连蛋白的受体（Hynes1992，Cell69，11）。成像数据显示，hFcES也与整联蛋白α5β1共定位（图2E）。最后，我们在肿瘤切片上检测到VWF、整联蛋白α5β1的共定位（图2F）。这些数据证明了二聚-hFcES、纤连蛋白、整联蛋白α5β1和血管紧靠。此外，将离体E14.5鼠脑胚胎切片用于证实这种现象。在鼠胚胎脑中，纤连蛋白、VEGF和hFcES显示出相似的结合模式（图2G），证实了VEGF是该组装的一个成分。
2.3寡聚hFc-内皮抑素和hNC-1与HUVEC的结合。使用免疫荧光技术，检测寡聚内皮抑素和NC-1的内皮细胞表面结合。当细胞只培养了24小时时，Fc-内皮抑素和NC-1显示出与HUVECS差的结合（数据未显示）。将孵育时间延长至72小时导致了显著的结合，这可能是纤连蛋白上调的结果（图3A上图）。这些数据表明，纤连蛋白作为二聚化内皮抑素与内皮细胞结合的介质的关键作用。3D图像显示出内皮抑素和纤连蛋白在内皮细胞上的分布。
2.4hNC-1抑制内皮细胞迁移。内皮细胞迁移是新血管形成和肿瘤血管生成中的重要步骤。为了评价hNC-1对内皮细胞迁移的影响，将rhVEGF用于跨孔试验中以诱导HUVEC迁移。监控并定量细胞的迁移。用蓝-紫染料染色跨膜迁移的细胞（图3B（a））并计数。作为浓度的函数，hNC-1抑制了VEGF-诱导的内皮细胞迁移，剂量效应遵循U-形曲线（图3B（b））（Lee等，上述引文）。NC-1是测试的不同内皮抑素分子中最有效的抗迁移剂（图3B（c））。
2.5人循环中不存在内皮抑素。内皮抑素最初从小鼠肿瘤细胞系（EOMA）的条件培养基中分离得到。蛋白质的纯化涉及多个步骤。其N-端序列的鉴定导致以N-端序列“HTH”开始的内皮抑素分子。基于这个N-端序列构建了重组小鼠和人内皮抑素（O’Reilly等，1997，Cell88，277）。
研究了几个个体的血清中内皮抑素的大小。为此，获得4天前从1-4个个体收集的半升袋的PRP（血小板富集血浆）。低RPM离心除去血小板后，使用高RPM获得血清。将血清通过蛋白A来除去IgG。然后用内皮抑素多克隆抗体对其进行免疫沉淀，接着进行Western分析。将针对内皮抑素的单克隆抗体用于处理膜（图4）。蛋白质标志物是NC-1和内皮抑素。鉴定的蛋白质的大小在两个标志物之间，存在几个蛋白质条带（图4A）。对来自不同个体的血清使用相同的程序（图4B）。为了验证这些数据，蛋白A步骤后，早先的PRP样品（不同于所提到的PRP袋）的亲和纯化产生了相似大小的分子（图4C）。最后，用相同多克隆抗体进行的血小板免疫沉淀显示出，鉴定的蛋白质是大小比内皮抑素大的分子（图4D）。
这些结果促使发明人重新分析有关内皮抑素的早先数据（O’Reilly等，上述引文）。最早用于内皮抑素分离的条件培养基在最终纯化步骤前在4℃连续保存了长时间（至少一个月）。培养基中胎牛血清的存在可能引起NC-1的降解。发明人实验室的另一研究组在一年后使用相同的小鼠肿瘤细胞系，验证了该假设（Wen等，上述引文）。在缩短蛋白质分离的持续时间并使用单个纯化步骤后，发现主要的蛋白质是mNC-1和内皮抑素（Wen等，上述引文）。因此，内皮抑素大小蛋白质仅是HPLC纯化后的产物的该早先观察，强烈支持了发明人的假设：NC-1在4℃长期孵育后，被完全消化成内皮抑素大小的分子。支持这一假设的其他证据来自不同研究组的公开数据（Sasaki等，1998，EMBO J17，4249）。
最有可能的是，最先报道的内皮抑素是在实验室中发生的降解的结果。NC-1是内皮抑素的前体。发明人有关人血清的数据所基于的是收集和纯化后数天进行的实验，发明人不能避免NC-1消化成较小的片段。发明人从这些数据得出结论，与小鼠EOMA相反，人血清和血小板中不存在187个氨基酸的内皮抑素。在NC-1的大于内皮抑素的降解产物中一些可能对应于二聚体，其是存在于人循环中的可能候选物或是NC-1收集后降解的结果。因此，本发明的数据强烈表明，NC-1是在人循环中最生理相关的分子。
2.6hNC-1在体内抑制肿瘤生长。为了比较NC-1和内皮抑素的抗肿瘤活性，使用了带有人黑素瘤细胞系A2058的裸鼠。数据显示于图5中。使用了蛋白质浓度相差5倍的两个剂量的临床级内皮抑素（低和高剂量）。相应的低剂量NC-1显示出与高剂量内皮抑素相似的抗肿瘤活性。结果证明了NC-1与内皮抑素相比更高的抗肿瘤功效。不能排除注入的NC-1在进入循环中时被降解的可能性。
2.7mFc-NC-1融合蛋白的产生和表达。
已经在293肾细胞中产生和表达了鼠Fc-NC-1融合构建体，其包含小鼠胶原蛋白18的NC-1结构域的非三重螺旋三聚化结构域（缔合结构域）、铰链区和内皮抑素结构域（包含锌结合位点），显示在SEQ ID NO:3中。在这个构建体中，SEQ ID NO:5中所示的Fc结构域位于N-端，而鼠NC-1结构域（SEQ ID NO:3中所示）位于所述融合蛋白的C-端。此外，已经将携带肠激酶断裂位点的接头插入Fc和NC-1之间，以允许断裂该融合构建体。本领域技术人员清楚，用于患者给药的相应治疗产品将不具有这样的断裂位点。图7显示了在还原和非还原条件下，作为293肾细胞转染中使用的质粒量的函数，所述鼠Fc-NC-1融合构建体的SDS凝胶照片。在还原条件下，产物是由Fc和NC-1组成的单链。在非还原条件下，产物是二聚体，因为Fc是二硫化物键合的。二聚化Fc通过共价连接只能够容纳两条NC-1链。因此，推测非共价连接的第三条NC-1链在SDS存在下解离，并且因此存在于加样样品和凝胶自身中。凝胶中部的单条条带是由于内皮抑素标志物产生的，其具有20Kd的分子量。随后，将测试所述构建体的抗肿瘤活性和该蛋白质较长的半衰期。
2.8对内源性血管生成抑制剂内皮抑素的获得性抗药性
将鼠Lewis肺癌（LLC）肿瘤皮下植入C57/Bl6小鼠中。用所示剂量的鼠寡聚-NC1片段，mFc-内皮抑素治疗肿瘤。通过在肿瘤逃避治疗并且达到大约1000-2000mm3的大小后连续移植肿瘤（多达四代，p4），使LLC肿瘤在体内长期暴露于mFc-内皮抑素。对照肿瘤也连续移植到新的小鼠中，没有mFc-内皮抑素处理。通过卡尺测量，测量了肿瘤体积（图8）。四次传代后，切出mFc-内皮抑素抗性肿瘤以及对照肿瘤，分离总RNA，并且在QC后，在全基因组微阵列上杂交，用于转录分析。使用SUMO软件包，分析了微阵列数据。使用Taqman技术进行了定量实时RT-PCR，以证实通过微阵列分析鉴定的候选基因的表达。
结果，数据表明，与之前的报道相反，发明人能够产生对mFc-内皮抑素（模拟NC-1作用，见本文中别处所述）具有抗性的肿瘤。在鼠肺癌（LLC）和人胰腺癌（BxPC3）多达4次传代中，通过肿瘤的连续植入和处理，产生了这些肿瘤。全基因组表达谱发现揭示了纤连蛋白的下调赋予肿瘤对mFc-内皮抑素治疗的抗性（图9）。这与发明人的观察——寡聚mFc-内皮抑素和寡聚NC-1与纤连蛋白选择性结合——相一致。因此，纤连蛋白水平的分析可以用作癌症治疗应答的预后标志物。此外，发明人鉴定了多个补偿性通路，其被激活以赋予肿瘤对Fc-内皮抑素治疗的抗性，特别地，根据初步动物数据，使用IGF1R抑制剂的序贯治疗似乎是有前景的，并且CCL2似乎是另一个有前景的候选靶标。
2.9具有抗肿瘤活性的新杂合肽“超级他汀”
在之前的实施例中，发明人假设并提供证据证实，人循环中胶原蛋白18的生理性物质是来自胶原蛋白18的非胶原NC-1区的内皮抑素结构域（ED）的寡聚物。此外，他们证实了，基于内皮抑素与人免疫球蛋白Fc-区的融合构建的合成ED-二聚体（Fc-内皮抑素）结合纤连蛋白（FN），而单体不结合。进一步证实了FN与VEGF的高亲和结合。综合起来，发明人提出，寡聚NC-1可以经由FN结合通过干扰至少两个关键血管生成通路（即，VEGF和整联蛋白α5β1（ITGA5B1））而发挥其作用。此外，他们发现，在长期暴露（即，四次连续体内传代）后对寡聚NC-1（Fc-内皮抑素）产生抗性的肿瘤中，FN显著下调。因此，他们提出，FN的丢失可能是针对寡聚NC-1物质的内在性和获得性抗性的关键机制。
发明人使用两个策略来提供这一概念的最终证据。
第一个方法是，工程化构建模拟ED-FN复合物的关键作用的最小肽序列。为此，发明人选择了最初由Javaherian博士（本发明发明人之一）鉴定的由27个氨基酸-NH2-末端区组成的完整ED-结构域中最有活性的基序（Tjin Tham Sjin等，2005，Cancer Res.65，3656-63）。本发明发明人的初步数据表明，该区域本身可能能够结合VEGF，并且这个肽序列中的两个组氨酸（锌结合结构域）可能对于VEGF结合是关键的。这是可以想到的，这是因为其中组氨酸被丙氨酸残基替代的突变肽不能与VEGF-ED-二聚体（Fc-内皮抑素）竞争结合。另一方面，纤连蛋白含有两个对于其结合ITGA5B1关键的活性基序，即，PHSRN-和RGD-依赖性基序。图10显示了ED-结构域和FN内关键基序的概览。
为了模拟寡聚NC-1和FN的生理复合物（其介导了整联蛋白信号传导和NC-1-ED的其他特性），发明人旨在融合这两个关键基序，即，上述NC-1-ED结构域中最有活性的基序和纤连蛋白中包含“RGD”和周围氨基酸的整联蛋白-结合基序，产生了称为超级他汀的杂合肽。对于每个肽序列，设计了人和小鼠等价物，如实施例2.10中更详细描述的。
在下文中，使用鼠超级他汀序列，呈现了同基因鼠肺癌模型（LLC）中的数据：
HTHQDFQPVLHLVLYAVTGRGDSPASSK(SEQ ID NO:7)
NC1-ED基序–FN-基序杂合体
为了证明所述作用不是由FN-基序本身介导的，使用了缺乏NC1-ED模拟基序的参照肽，即，仅有FN-基序组成：
LYAVTGRGDSPASSK(SEQ ID NO:8)。
含有PHSRN替代FN的RGD基序的其他构建体，以及促进超级他汀肽经由二硫键或Fc区二聚化的构建体，目前正在制备中，或已经处于体内评价中；参见实施例2.10。
使用原型LLC鼠（C57BL6）肺癌模型，发明人能够证实鼠超级他汀肽有效地抑制肿瘤生长的功效。
如图11中所示，将野生型LLC肿瘤（10.000细胞）s.c.植入C58Bl6小鼠中。对肿瘤进行假性治疗（PBS）、用仅含有“LYAVTGRGDSPASSK”序列（SEQ ID NO:8；FN基序）的参照FN-模拟肽或使用鼠超级他汀（SEQ ID NO:7）治疗，剂量为100μl PBS中50μg肽，每12h，s.c.（n:每个组5只）。肿瘤植入后4天开始治疗（“预防试验”）并持续24天。值得注意的是，在治疗期中，在超级他汀组中仅有单个肿瘤生长。仅在停止超级他汀治疗后出现了另两个肿瘤，表明这些难以治疗的肿瘤受到这种疗法的控制。在Kaplan-Meier分析中，达到1000mm2的肿瘤大小被认为是死亡事件。与对照相比，超级他汀显著延长了存活（p<0.03，通过对数秩（log-rank）检验测得）。相反，单独的FN-基序（SEQ ID NO:8）在肿瘤生长的预防中没有显示出显著改善作用。
一旦证实了超级他汀肽（SEQ ID NO:7）的功效，发明人移向第二个策略，以确认提出的概念：FN信号传导对于寡聚NC-1发挥其抗血管生成和抗肿瘤作用是关键的。使用对抗鼠纤连蛋白的慢病毒shRNA构建体，它们下调LLC中的FN，模拟之前产生的p4Fc-内皮抑素抗性肿瘤的天然表型。将LLC FN-/-肿瘤细胞（100.000）植入C57Bl6小鼠中，并且在植入后4天开始用二聚体鼠Fc-内皮抑素相对于超级他汀进行治疗。FN的敲低造成LLC肿瘤对寡聚NC-1（Fc-内皮抑素）的抗性。此外，与最初报道的关于天然选择的p4抗性LLC肿瘤细胞的数据类似，与对照相比，LLC FN-/-肿瘤显示出更快生长的趋势。相反，与对照或Fc-内皮抑素治疗的肿瘤相比，含有ED-基序和FN-基序两者的超级他汀肽（SEQ ID NO:7）显著抑制了肿瘤生长（p<0.01）；参见图12。这些数据证实，超级他汀活性与肿瘤中的FN可得性无关，由此避开了引起肿瘤抵抗寡聚NC-1的抗性机制。
基于之前实施例中的发现，发明人提出，为了避开对ED衍生剂或寡聚NC-1的获得性肿瘤抗性，鉴定的促肿瘤生成和促血管生成通路的补偿性上调可能构成有前景的靶标。由于可得到已经进入后期临床试验阶段的药剂，两个特定通路（即，IGF1R信号传导和CCL2）的抑制被提出是最有前景的。在此，发明人证实，序贯地而非同时地给药IGF1R抑制剂削弱了对鼠Fc-内皮抑素（NC-1-ED-二聚体）具有抗性的肿瘤的生长；参见图13。
通过Western印迹的蛋白质分析进一步证实，在第5代LLC肿瘤中，随着使用鼠Fc-内皮抑素（恩度）治疗，IGF1R表达和磷酸化的增强、纤连蛋白的下调和CCL2的上调；参见图14。使用IGF1R抑制剂的序贯治疗部分地逆转了这种表型。
实施例2.10：设计的肽
本发明发明人之前的数据已经证明，NC-1-ED的活性基序存在于蛋白质的N-端，并且可以通过25个氨基酸的肽来模拟。SEQ ID NO:9显示了相应的鼠序列，而SEQ ID NO:10显示了相应的人序列。此外，鉴于ED的锌结合坐标由该肽中的三个组氨酸介导的事实，发明人之前已经证实，丙氨酸替代组氨酸导致了在抑制肿瘤生长、血管生成和血管渗透性方面没有活性的肽（Tjin Tham Sjin等，Cancer Res.2005,65,3656-63）。
SEQ ID NO:11（鼠）和SEQ ID NO:12（人）显示，纤连蛋白中的“RGD”基序和对于结合整联蛋白α5β1重要的周围氨基酸的序列。此外，已经发现，纤连蛋白的整联蛋白结合结构域中的“PHSRN”基序对于纤连蛋白与ITGA5B1（整联蛋白α5β1）的结合是关键的。
基于发明人的寡聚内皮抑素（NC-1）结合纤连蛋白的初步数据，他们已经产生了一系列肽，所述肽组合所述内皮抑素N-端肽和纤连蛋白的含RGD结构域的基序。
SEQ ID NO:7显示了相应的鼠超级他汀序列，而SEQ ID NO:13显示了相应的人超级他汀序列，即，本发明的杂合肽序列。
为了检测内皮抑素的锌结合区对于杂合肽的抗肿瘤特性的重要性，发明人已经通过用丙氨酸替代位置1和3的关键组氨酸（SEQ ID NO:14）修饰了人超级他汀（SEQ ID NO:13）。
为了测试杂合肽的二聚化特性与抗肿瘤活性的相关性，发明人使用了早先报道的内皮抑素二聚化方法（Kuo等，2001,JCB152,1233-46）。通过用半胱氨酸替代人超级他汀序列（SEQ ID NO:13）中位置7的谷氨酰胺，杂合肽应当形成二聚体，并且可以在带有肿瘤的小鼠中测试活性（SEQ ID NO:15）。
作为纤连蛋白的RGD结合整联蛋白的对照，已经在新的杂合肽（SEQ ID NO:16）中，将人超级他汀序列（SEQ ID NO:13）中的“RGD”改变成“RAD”，以评价其与野生型肽相比的抗肿瘤活性。
呈现了这些修饰肽的人形式（用“h”表示）。鼠形式是相似的序列（用“m”表示），并且可以基于本文中提供的序列信息来衍生。
目前设计其他较大的对照肽，其含有纤连蛋白的整联蛋白结合区的25个氨基酸（SEQ ID NO:17），以在抗肿瘤研究中评价。
最后，将人超级他汀肽（SEQ ID NO:13）与螯合剂1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（也称为DOTA）缀合，使得肽能够与例如放射性核素（如，镓（68Ga））缀合以用于非侵袭性成像（正电子发射X射线层析照相术，PET）。发明人目前在BxPC3人胰腺癌模型中检查DOTA缀合是否影响人超级他汀肽在体内的功效。如果这个实验证实超级他汀-DOTA构建体的活性，可以考虑体内PET-成像，评价超级他汀-DOTA作为诊断剂的潜能。
上述肽的相应序列显示于以下的表1中：
3.讨论
在这些实施例中，发明人已经呈现了强烈证据——文献中报道的内皮抑素大小的分子可能是收集小鼠细胞培养基或人血清后蛋白酶降解的产物。Sasaki和合作者呈现的证据（上述引文）似乎支持这个假设。他们对两个纯化步骤后人血清的分析，导致了就大小而言多个内皮抑素-样分子。所有三个报道的分子都在N-端具有其他氨基酸，表明不存在N-端以报道的组氨酸开始的内皮抑素分子。没有报道较高分子量条带的氨基酸序列分析。此外，作者在不同小鼠器官中对胶原蛋白18分布的研究表明了，在不同组织提取物中不存在内皮抑素大小分子（Sasaki等，上述引文）。最显著的鉴定的蛋白质对应于NC-1。
发明人已经鉴定出纤连蛋白是寡聚内皮抑素（Fc-内皮抑素和人造内皮抑素二聚体）的结合蛋白，而不结合内皮抑素单体。NC-1和内皮抑素二聚体之前已经被证实结合多种ECM蛋白，该特性是内皮抑素单体所没有的（Sasaki等，上述引文；Javaherian等，2002,JBiol Chem277,45211）。然而，纤连蛋白具有截然不同的特性，这使其在ECM蛋白中是独特的。血管生成抑制肽利用血浆纤连蛋白来返回血管生成脉管系统（Yi等，2003,PNAS100,11435）。纤连蛋白含有氨基酸RGD的序列，其允许该蛋白质结合多种整联蛋白。整联蛋白α5β1是细胞表面上结合纤连蛋白的受体。这种整联蛋白是血管生成的重要介质（Hynes，上述引文）。
2001年首先报道了结合两种整联蛋白αvβ3和α5β1的内皮抑素（Rehn等，2001，PNAS98,1024）。推测该结合抑制纤连蛋白与这些整联蛋白的结合。之后，另一组研究者呈现了数据，表明内皮抑素只结合α5β1（Wickstrom等，2002,Cancer Res62,5580）。内皮抑素缺乏序列RGD。因此，该结合必须由内皮抑素上的其他氨基酸来介导。本发明的发明人已经尝试了使用Elisa、免疫沉淀和细胞粘附试验来证明内皮抑素与α5β1的直接结合，但没有成功。
发明人的数据指向寡聚内皮抑素和NC-1的重要性（Lee等，上述引文）。从NC-1三聚体前体开始，在降解引起的大小减小后，NC-1转化成二聚体。最后，在进一步的大小减小后形成内皮抑素单体。发明人的数据支持了假设——hNC-1和可能地大于内皮抑素的分子的二聚体存在于循环中。循环中内皮抑素大小单体的存在是可疑的。之前已经表明，由内皮抑素引起的血管生成过程的生理性终止是充分协同的（Abdollahi等，2004,Mol Cell13,649）。
整合本文给出的数据，发明人提出了其中纤连蛋白作为模板的模型（图6）。VEGF和NC-1都结合纤连蛋白。VEGF和NC-1的存在经由与整联蛋白α5β1的相互作用而调节生物活性。促血管生成蛋白（VEGF）和抗-血管生成蛋白（NC-1）的相互作用可能对于在细胞表面调节血管生成是关键的。
发明人利用Fc-内皮抑素（二聚体）已经清楚地证明了其远远优于普通的内皮抑素（单体）（Lee等，上述引文）。与单独的内皮抑素相比，获得相同的肿瘤减小，需要小得多剂量的Fc-内皮抑素（50-100倍）。在过去，发明人将这种差异归因于与任何Fc偶联分子相关的更长半衰期。发明人的目前数据表明，Fc-内皮抑素中的内皮抑素二聚化状态也可以有助于更好功效的呈现。另一方面，将NC-1注入小鼠后，其可能经历快速降解，这可能解释了为什么与内皮抑素相比其抗肿瘤作用没有剧烈提高。在该情况下，NC-1与免疫球蛋白Fc结构域结合的融合构建体可能是不同类型的内皮抑素中用于抗癌治疗的改进试剂。这种类型的实验正在进行中；参见实施例2.7。
总之，这些数据表明，FN对于胶原蛋白18片段的抗血管生成和抗肿瘤作用是关键的。超级他汀，一种含有关键的FN基序和ED-基序的杂合肽，能够有效地抑制/防止肿瘤生长和逆转由纤连蛋白的肿瘤特异性下调而导致的抗性表型。或者，可以合理设计联合疗法和开发创新的日程安排方案，以靶向Fc-内皮抑素抗性肿瘤中激活的补偿性通路，这对于避开或逆转先天性的或获得性的肿瘤抗性，可能成为有前景的策略。

Claims (6)

1.一种融合蛋白，其由SEQ ID NO:7或13中显示的氨基酸序列和免疫球蛋白Fc结构域组成。
2.权利要求1的融合蛋白，其中Fc结构域来自IgG。
3.由SEQ ID NO:7或13中显示的氨基酸序列组成的肽。
4.包含权利要求1或2的融合蛋白或权利要求3的肽的药物或诊断组合物。
5.一种药盒，其包含权利要求1或2的融合蛋白或权利要求3的肽。
6.权利要求1或2的融合蛋白在制备用于预测癌症患者对所用的癌症疗法的应答的药物中的用途，其中所述预测包括步骤：
a)通过使用权利要求1或2的融合蛋白，测量患者样品中的纤连蛋白的水平，和
b)预测所述患者对所述癌症疗法的应答，其中与健康受试者的参照水平相比，低纤连蛋白水平指示患者对所用的癌症疗法无应答。
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