CN109069591A - 治疗和诊断纤维化或纤维化相关疾病的手段和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白质寡聚体，其包含(i)至少两个胶原18的NC‑单体或(ii)至少两个胶原18的内皮抑制素结构域或(iii)至少两个胶原18内皮抑制素结构域的N端肽，用于治疗，减轻或预防纤维化或纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病。本发明还涉及所提及的蛋白质寡聚体用于检测和/或诊断纤维化或纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病。

Description

治疗和诊断纤维化或纤维化相关疾病的手段和方法

本发明涉及蛋白质寡聚体，其包含(i)至少两个胶原18的NC-1单体或(ii)至少两个胶原18的内皮抑制素结构域或(iii)至少两个胶原18内皮抑制素结构域的N端肽，所述蛋白质寡聚体用于治疗，减轻或预防纤维化或纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病。本发明还涉及所提及的蛋白质寡聚体用于检测和/或诊断纤维化或纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病。

由器官成纤维细胞过度沉积细胞外基质(ECM)组分如纤连蛋白(FN)和I型胶原(Col1α1)被定义为纤维化。器官纤维化是许多导致终末期器官衰竭的疾病的最终共同途径。不可控制的伤口愈合应答(包括急性和慢性炎症，血管生成，驻留细胞活化和细胞外基质重塑)被认为参与纤维化的发病机理。

肺纤维化包括一组肺实质的间质性疾病，其由多种原因引起，包括肺肿瘤的放疗和化疗(Am.J.Respir.Crit Care Med.(2002)165，p.277-304；Movsas等.(1997)Chest111，p.1061-1076)。辐射诱发的病理生理事件与其他类型肺损伤(如手术，化疗和特发性肺纤维化(IPF))后发生的病理生理事件有明显相似之处(Rubin等.(1995)，Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.33，p.99-109)。

在2006年根据美国医疗保健索赔数据库发表的一项研究中，IPF的患病率在每10万人中有14-42.7例，这取决于是否使用了狭义或广泛的病例发现标准(Raghu等.(2006)，Am.J.Respir.Crit.Care Med.174，p.810-6)。最近，在2012年5月，一项系统的文献调查估计，欧盟特发性肺纤维化(IPF)的患病率为每10万人26例。Rafii等的综述总结了各种关于IPF发病率的研究结果(J.Thorac Dis.(2013)，5，p.48-73)。IPF代表进行性肺病死亡的最常见原因。回顾性研究表明，IPF诊断后的中位生存期为2-3年，但IPF病程可变，部分患者经历长期稳定，而其他患者频繁发作或急剧下降(Raghu等.(2011)，Am.J.Respir.Crit.CareMed.183，p.788-824；Selman等.(2001)，Ann.Intern.Med.134，p.136-51；Boon等.(2009)，PLoS One，4，e5134)。

临床上，IPF的特征是间质浸润，进行性呼吸困难和肺功能恶化，这可导致呼吸衰竭死亡(Am.J.Respir.Crit Care Med.(2002)，165，p.277-304；Allen and Spiteri(2002)，Respir.Res.3，p.13；Gross and Hunninghake(2001)，N.Engl.J.Med.345，p.517-525)。

目前尚不存在用于IPF的理想动物模型，但迄今为止博来霉素和辐射诱发的肺纤维化模型已被用于研究肺纤维化(Rubin，同前)。

从分子的角度来看，TGF-β是原型纤维化细胞因子，它在纤维化器官中增加，通过刺激细胞外基质分子的合成、激活成纤维细胞到表达α-平滑肌肌动蛋白的肌成纤维细胞和下调基质金属蛋白酶(MMP)而促进纤维化的发展。虽然异常的TGF-β表达与系统性硬化中纤维化的发病机制有关，但在早期系统性硬化的小型试验中评估的抗TGF-β单克隆抗体未显示任何功效(Varga等.(2009)，Nature Reviews Rheumatology 5，p.200-6)。

另一项研究的结果表明PDGF信号传导在肺纤维化的发病机制中起关键作用，并表明抑制纤维发生而不是炎症对于抗纤维化治疗至关重要(Abdollahi等.(2005)，J.Exp.Med.201，p.925-35)。

最近，已经报道了在TGF-β-和博来霉素诱导的纤维化中C端内皮抑制素多肽的抗纤维化活性，但没有报道N端内皮抑制素多肽的(WO 201I/050311；Yamaguchi等.(2012)，Sci.Transl.Med.，4，p.136ra71)。内皮抑制素是胶原XVIII的天然存在的183个氨基酸的蛋白水解片段，其定位于血管周围的基底膜中。已经广泛描述了该蛋白质的抗肿瘤特性，将内皮抑制素划分为血管生成的内源性抑制剂[Bergers，G.，等.，Effects of angiogenesisinhibitors on multistage carcinogenesis in mice.Science，1999.284(5415)：p.808-12；O′Reilly，M.S.，等.，Endostatin：an endogenous inhibitor of angiogenesis andtumor growth.Cell，1997.88(2)：p.277-85.，Folkman，J.，Antiangiogenesis in cancertherapy--endostatin and its mechanisms of action.Exp Cell Res，2006.312(5)：p.594-607]。此外，它抑制许多信号级联，例如促炎性NF-κB，凝血和粘附级联[Abdollahi，A.，等.，Transcriptional network governing the angiogenic switch in humanpancreatic cancer.Proc Natl Acad Sci U S A，2007.104(31)：p.12890-5]。

尽管有医学需要，但迄今为止在开发有效的纤维化治疗策略方面取得的进展非常小(参见例如Am.J.Respir.Crit Care Med.(2002)，165，p.277-304；Allen和Spiteri，同前；Gross和Hunninghake，同前；Kamp(2003)，Chest 124，p.1187-11909；Mason等.(1999)，Am.J.Respir.Crit.Care Med.160，p.1771-1777；Rafii等.(2013)，J.Thorac Dis.5，p.48-73)。

因此，本领域需要开发有效的纤维化治疗方式。

可以将本发明所基于的技术问题视为提供符合上述需要的手段和方法。该技术问题已通过权利要求和下文中表征的实施方案解决。

因此，本发明涉及蛋白质寡聚体，其包含(i)至少两个胶原18的NC-1单体或(ii)至少两个胶原18的内皮抑制素结构域或(iii)至少两个胶原18内皮抑制素结构域的N端肽，所述蛋白质寡聚体用于治疗，减轻或预防纤维化或纤维化相关疾病。

本发明还涉及蛋白质寡聚体，其包含(i)至少两个胶原18的NC-1单体或(ii)至少两个胶原18的内皮抑制素结构域或(iii)至少两个胶原18内皮抑制素结构域的N端肽，所述蛋白质寡聚体用于治疗，减轻或预防血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病。

如本文所用，术语“蛋白质”或“多肽”或“肽”(如果没有另外说明，所有术语可互换使用)包括基本上不含其他宿主细胞多肽的分离的和/或纯化的(多)肽。本文提及的术语“肽”包括至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，45，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300个或甚至更多个氨基酸残基，其中一个的α羧基与另一个的α氨基结合。本文使用的蛋白质或肽的翻译后修饰是新形成的蛋白质或肽的修饰，并且可以涉及氨基酸的缺失，某些氨基酸的化学修饰，例如对某些氨基酸的酰胺化，乙酰化，磷酸化，糖基化，焦谷氨酸形成，甲硫氨酸上磺基的氧化/还原，或类似的小分子的添加。

如本文所用的术语“蛋白质”或“肽”包括肽拟似物。如本领域所知，肽拟似物是其基本要素(药效团)在3D空间中模拟天然肽或蛋白质并且保留与生物靶标(如纤连蛋白)相互作用并产生相同生物效应(例如，如本文所定义的抗纤维化活性)的化合物；例如，参见Vagner等2008，Current Opinion in Chemical Biology 12，Pages 292-296的评论。设计肽拟似物以避免与天然肽相关的一些问题，例如对蛋白水解的稳定性(活性持续时间)和差的生物利用度。某些其他性质，如对生物学靶标(如纤连蛋白)的选择性或生物活性(如抗纤维化活性)的效力通常可以得到显著改善。

如本文所用的蛋白质或肽修饰包括本文所述的(多)肽的合成实施方案。此外，类似物(非肽有机分子)，衍生物(从公开的(多)肽序列开始获得的化学官能化的(多)肽分子)和这些蛋白质的变体(同系物)可用于本文所述的方法和医学与诊断用途。本发明的每个(多)肽由氨基酸序列组成，其可以是天然存在的或其他的L-和/或D-氨基酸。肽可以通过各种化学技术进行修饰，以产生具有与未修饰的(多)肽基本相同活性(例如抗纤维化活性)、并任选地具有其他所需的性质的衍生物。例如，蛋白质的羧酸基团，无论是羧基端还是侧链，可以以药学上可接受的阳离子的盐的形式提供或酯化以形成C₁-C₁₆酯，或转化为式NR₁R₂的酰胺(其中R₁和R₂各自独立地为H或C₁-C₁₆烷基)，或者组合形成杂环，例如5-或6-元环。无论氨基端还是侧链，多肽的氨基可以是药学上可接受的酸加成盐的形式，例如HCl，HBr，乙酸，苯甲酸，甲苯磺酸，马来酸，酒石酸和其他有机盐，或者可以被修饰为C₁-C₁₆烷基或二烷基氨基或进一步转化为酰胺。可以使用公认的技术将多肽侧链的羟基转化为C₁-C₁₆烷氧基或C₁-C₁₆酯。多肽侧链的苯基和酚环可以被一个或多个卤素原子(例如氟，氯，溴或碘)取代，或者被C₁-C₁₆烷基，C₁-C₁₆烷氧基，羧酸及其酯，或这种羧酸的酰胺取代。多肽侧链的亚甲基可以延伸至同源的C₂-C₄亚烷基。硫醇可以用许多公认的保护基团中的任何一种(例如乙酰胺基团)保护。本领域技术人员还将认识到将环状结构引入本发明的(多)肽中以选择和提供对结构的构象限制(这导致增强的稳定性)的方法。

本文提及的蛋白质或(多)肽也可以是融合蛋白。如本文所用的术语“融合蛋白”表示嵌合蛋白(字面上，由来自不同来源的部分组成)，其通过连接最初编码分开的蛋白质的两个或更多个基因而产生。该融合基因的翻译产生具有衍生自每种原始蛋白质的功能特性的单个或多个多肽。例如，本文使用的融合蛋白包含例如胶原18的NC-1单体和免疫球蛋白的Fc区，胶原18的NC-1单体和Fc二聚体，胶原18的内皮抑制素结构域和免疫球蛋白的Fc区，胶原18的内皮抑制素结构域和Fc二聚体，在第7位具有单个突变(其中谷氨酰胺被半胱氨酸替代)的胶原18的内皮抑制素结构域和免疫球蛋白的Fc区，在第7位具有单个突变(其中谷氨酰胺被半胱氨酸替代)的胶原18的内皮抑制素结构域和Fc二聚体，胶原18内皮抑制素结构域的N端肽和免疫球蛋白的Fc区或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽和Fc二聚体。例如，在细胞中表达胶原18的NC-1单体和免疫球蛋白的Fc区以及免疫球蛋白的Fc区以避免NC-1的不受控制的聚集能够是有利的。或者可以适当地省略或突变NC-1中的天然缔合区，使得NC-1不能通过该缔合区寡聚化。如果这种没有功能性缔合区的NC-1与Fc区融合，则这导致NC-1二聚体的形成。融合蛋白可另外包括例如纤连蛋白的RGD基序和/或PHSRN基序。术语“胶原18的NC-1单体”，“胶原18的内皮抑制素结构域”，“胶原18内皮抑制素结构域的N端肽”，“Fc区”，“RGD基序”和“纤连蛋白的PHSRN基序”是如本文别处定义。本说明书中包含的其他融合蛋白在说明书和以下实施例的其他地方表示。例如，通过本领域充分描述的重组DNA技术产生重组融合蛋白，参见例如Sambrook等，Molecular cloning：a laboratorymanual/Sambrook，Joseph；Russell，David W.--.3rd ed.--New York：Cold SpringHarbor Laboratory，2001。

术语“寡聚体”通常是指在生物化学中通过一些大分子如蛋白质或核酸的非共价键合形成的大分子复合物。根据定义，二聚体是由两个通常非共价结合的分子如蛋白质或肽形成的大分子复合物。这种复合物也可以由蛋白质结构域形成，所述蛋白质结构域是蛋白质序列的一部分并且可以独立于蛋白质链的其余部分进化，发挥功能和存在的结构。同二聚体由两个相同的分子形成。潜在的过程称为同二聚化。异二聚体由两个不同的分子构建，这两个分子通过异二聚化形成。如本领域已知的，除二硫键外，生物化学中的大多数二聚体或三聚体不通过共价键连接。一些蛋白质含有专门的结构域以确保二聚化，三聚化或寡聚化，这些专门的结构域是所谓的二聚化，三聚化或寡聚化结构域，如下文进一步定义，并且是本领域熟知的。为了提供实例，二聚化可以通过免疫球蛋白的Fc结构域或通过二硫键或两者或本文其他地方描述的其他手段介导。例如，实施例11中使用的Fc-内皮抑制素(FcE)由两条Fc链(通过二硫键连接)组成，延伸至两个内皮抑制素分子，每个分子与单个Fc链连接。因此，两个相邻的内皮抑制素分子由于Fc二聚体而变成二聚体。实施例11中使用的另一种二聚体构建体包含两个胶原18内皮抑制素结构域。每个内皮抑制素结构域在7位含有单个突变，其中谷氨酰胺被半胱氨酸替代。每个内皮抑制素结构域与具有插入的肠激酶切割位点的免疫球蛋白Fc区连接。在该构建体中，Fc和内皮抑制素分子均通过其相应的二硫键二聚化。肠激酶消化该重组蛋白产生Fc二聚体和内皮抑制素二聚体。三聚体是由三个通常非共价结合的肽，蛋白质或蛋白质结构域形成的大分子复合物。例如，对于三聚化，可以使用NC-1结构域内的天然缔合区，其介导胶原18的NC-1的三聚化，因为胶原18的NC-1结构域内的天然缔合区起三聚化结构域的作用。同三聚体由三个相同的分子形成，而异三聚体由三个不同的分子构成。例如，胶原18是同三聚体蛋白质。四聚体由四个分子组成，五聚体由五个分子组成，以此类推。在这些情况下，复合物形成通常由寡聚化结构域介导，如上所述。

在本发明的上下文中，“寡聚体”应理解为“蛋白质寡聚体”或“肽寡聚体”，其包含一些单体单元，例如，两个，三个，四个，五个或甚至更多个单体单元。因此，寡聚体可以是例如二聚物，三聚物，四聚物，五聚物等。优选地，寡聚体是同二聚体，同三聚体等。如本文其他地方所述的，单体单元(或简称单体)可以是例如人或鼠胶原18的NC-1单体，人或鼠胶原18的内皮抑制素结构域，或人或鼠胶原18内皮抑制素结构域的N端肽。单体也可以是恒河猴、猕猴或灵长类动物胶原18的NC-1单体，恒河猴、猕猴或灵长类动物胶原18的内皮抑制素结构域，或恒河猴、猕猴或灵长类动物胶原18内皮抑制素结构域的N端肽。

单体也可以是融合蛋白，其包含人、恒河猴、猕猴、灵长类动物或鼠胶原18的NC-1单体，人、恒河猴、猕猴、灵长类动物或鼠胶原18的内皮抑制素结构域，或人，恒河猴，猕猴，灵长类动物或鼠胶原18内皮抑制素结构域的N端肽。如本文所用的术语“融合蛋白”包含至少一个NC-1单体，至少一个内皮抑制素结构域，或至少一个N端内皮抑制素肽或衍生自内皮抑制素结构域的N末端的肽，如本文所定义。还包括这样的融合蛋白，其包含两个，三个甚至更多的NC-1单体，两个，三个或甚至更多个内皮抑制素结构域，或两个，三个甚至更多个N端内皮抑制素肽或衍生自内皮抑制素结构域的N末端的肽，如本文所定义，例如，所述至少一个NC-1单体、内皮抑制素结构域或N端内皮抑制素肽或衍生自内皮抑制素结构域的N末端的肽可以与免疫球蛋白的Fc结构域、纯化标签、标记、另一种治疗剂(例如抗纤维化剂，抗血管生成剂和/或抗肿瘤发生剂等)或其他进行连接。本文提及的“标记”是可检测的化合物或组合物，其直接或间接与另一分子缀合以促进该分子的检测，所述另一分子是例如人、恒河猴、猕猴、灵长类动物或鼠胶原18的NC-1单体，人、恒河猴、猕猴、灵长类动物或鼠胶原18的内皮抑制素结构域，或人、恒河猴、猕猴、灵长类动物或鼠胶原18内皮抑制素结构域的N端肽。标记的具体非限制性实例包括荧光标记，酶促连接和放射性同位素。优选地，融合蛋白是人，恒河猴，猕猴或灵长类动物，更优选是人。来自免疫球蛋白的Fc结构域可以融合至如本文所定义的单体的N端或C端，优选融合至N端。

本文使用的术语“蛋白质寡聚体”(或“肽寡聚体”)还包括蛋白质制剂，其包含蛋白质寡聚体或肽寡聚体和其他蛋白质，试剂或化合物。例如，如本文所定义的所述寡聚体可以使用一种或多种其他抗纤维化，抗血管生成和/或抗肿瘤发生蛋白质、化合物或试剂以组合方案施用给有需要的受试者。与单独使用单一药物相比，药物组合通常对纤维化或纤维化相关疾病更有效。举例来说，如本文所定义的蛋白质寡聚体或肽寡聚体可以与血管抑素或血管抑素融合蛋白(如与免疫球蛋白的Fc结构域连接的血管抑素)组合使用，或与跟纤维化过程相关的其他途径的抑制剂(包括例如TGF-β，PDGF，VEGF，mTOR，CTGF，整合素，基质金属蛋白酶，抗炎剂如环加氧酶，IKK/NFkB，JAK/STAT和/或Pi3K信号转导的类固醇抑制剂)一起使用。

术语“胶原18”和“胶原XVIII”在本文中可互换使用，并且指相同的蛋白质。胶原18由一个中心的、间断的三螺旋结构域组成，在N末端(NC-11结构域)和C末端(NC-1结构域)侧翼有较大的非三螺旋状球状结构(Oh等，PNAS 1994，91，4229；Oh等，Genomics 1994，19，494；Abe等1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.196，576)。XVIII型胶原属于胶原超家族的独特且新颖的亚类，已提出其名称为“MULTIPLEXIN家族”。

Oh等(同上)已经描述了小鼠和人胶原18蛋白的克隆。小鼠胶原18的核苷酸和氨基酸序列以登录号NM_001109991.1显示，而相应的人序列显示在NM_030582.3中。此外，小鼠和人胶原18的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：1和2中。恒河猴(Macaca mulatta)胶原18的核苷酸和氨基酸序列显示在UniProt登录号I0FVB6中。优选地，本文提及的胶原18是人胶原18。

本文所用的“NC-1结构域”(或简称NC-1或NC1)衍生自或来自胶原18的C末端，并包括(i)N端缔合区(约50个氨基酸残基)，(ii)中心蛋白酶敏感性铰链区(约70个氨基酸残基)和/或(iii)C端稳定内皮抑制素结构域(约180个氨基酸残基)(Sasaki等，1998，EMBO J.17，4249)。

如本文所用，“衍生自”NC-1结构域的(多)肽意指这样的(多)肽与NC-1结构域中天然(多)肽的相应氨基酸序列相同或相差1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，50或甚至更多个氨基酸残基，同时至少保持(或甚至超过)相应NC-1结构域的生物学活性(如本文其他地方所述)，如寡聚化性质，抗血管生成，抗肿瘤发生和/或抗纤维化活性。所提及的术语(多)肽“衍生自”NC-1结构域包含NC-1结构域的变体，如本文其他地方所定义。

小鼠胶原18的NC-1结构域的氨基酸序列描述于SEQ ID NO：3，而人胶原18序列的NC-1结构域的相应序列显示于SEQ ID NO：4。

包含SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的约10至约60的氨基酸残基的人NC-1结构域的“缔合结构域”或“缔合区”(两个术语可互换)负责NC-1单体的非共价三聚化以形成球状三聚体。因此，该缔合结构域起三聚化结构域的作用。对蛋白水解切割敏感的“铰链区”包含SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的约61至约129的氨基酸残基。紧密的“内皮抑制素结构域”包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的约130至约308的氨基酸残基；参见例如Sasaki，同前；Kuo 2001，JCB 152，1233；Tjin等.2005，Cancer Res 65，3656。内皮抑制素结构域包含锌结合位点，其介导与锌的结合并位于内皮抑制素的N末端(Ding等，1998，PNAS 95，10443；US7,524,811)。有趣的是，这种锌结合位点已被证明是内皮抑制素的抗肿瘤/抗血管发生活性的原因(Boehm等，1998，Biochem.Biophys.Res.Commun.252，190)。NC-1结构域中的缔合区和内皮抑制素结构域通过铰链区连接(参见Sasaki等，同上)。已发现铰链区被例如基质金属蛋白酶(MMP)切割，例如MMP-3，-7，-9，-13和-20(Heliasvaara等，Exp Cell Res 2005，307，192)。

上述NC-1的结构域结构基于结构数据。用于在NC-1内定位结构域的术语“约”反映了这样的事实，即所提及的结构域之间的确切边界可能与指定的位置相差一个，两个，三个，四个，五个或甚至更多的氨基酸残基。然而，例如，缔合结构域和铰链区之间的确切边界可以通过以下来确定：产生作为起始点的包含SEQ ID NO：4的约10至约60的氨基酸残基的缔合结构域并产生其更短的片段，例如，长度为49，48，47，46，45等个氨基酸残基。然后可以分析所述较短片段的寡聚化性质，即它们是否仍然能够如完整的缔合结构域那样形成寡聚体，例如三聚体。

备选地，内皮抑制素结构域可以作为解决NC-1结构域的寡聚化性质的起点。例如，用于鉴定如本文所定义的NC-1结构域中的单体，二聚体和/或三聚体转变的确切边界的方法可以包括：a)从NC-1结构域产生或衍生一系列重组肽，从由内皮抑制素结构域组成的肽开始，然后以约10至20个氨基酸残基的步长增加由内皮抑制素结构域组成的所述肽的大小，和b)测试步骤a)的重组肽的寡聚化性质，即所述肽是否能够形成二聚体或三聚体并鉴定能够形成这种寡聚体的肽，和c)确定NC-1结构域中单体，二聚体和/或三聚体转变的确切边界。该方法可以包括另一步骤d)：使用步骤b)中鉴定的能够形成二聚体或三聚体的重组肽构建寡聚体。为了从NC-1结构域产生或衍生一系列重组肽，可以使用本领域已知的肽或蛋白质合成。为了测试如本文所定义的蛋白质寡聚体或肽寡聚体的寡聚化性质，例如，可以使用蛋白质印迹分析，免疫沉淀，SDS-PAGE，色谱方法或本领域熟知的其他方法；参见，例如，Sambrook等，Molecular cloning：a laboratory manual/Sambrook，Joseph；Russell，David W.--.3rd ed.--New York：Cold Spring Harbor Laboratory，2001。因此，本领域技术人员能够鉴定如本文所定义的NC-1结构域中单体，二聚体和/或三聚体转变的确切边界，而没有过度负担。此外，上述结构域模型非常适合以下基因结构：具有编码缔合结构域的外显子38和39，编码铰链区的外显子40，和编码内皮抑制素结构域的三个外显子(Sasaki等，同上)。

通过上述方法产生的重组(多)肽可用于产生寡聚体或融合蛋白，例如Fc融合蛋白，其形成这种寡聚体，然后可进一步测试其抗纤维化活性，抗血管发生活性，抗侵入/抗转移活性，降低血管通透性活性，抗炎和/或抗肿瘤发生活性。包含此类重组(多)肽或融合蛋白的寡聚体特别可用作用于治疗，减轻或预防如本文其他地方所定义的纤维化或纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病的药物组合物。

如本文所提及的术语“胶原18的NC-1单体”包含寡聚化结构域，铰链区和/或内皮抑制素结构域。

如本文所用的术语“寡聚化结构域”通常是指介导如本文所定义的两个或更多个NC-1单体的亚单元组装的蛋白质结构域。如上所述，寡聚化结构域介导NC-1单体的二聚化，三聚化或四聚化等。这种寡聚化导致例如多价和高结合强度，增加的结构稳定性和不同结构域的组合功能的功能优势，与NC-1单体相比，这产生增强的生物活性，例如改善或增加的抗纤维化活性，抗血管发生活性，抗侵入/抗转移活性，降低血管通透性活性，抗炎和/或抗肿瘤发生活性。寡聚化结构域可包含例如上述NC-1结构域的缔合结构域，即胶原18的非三螺旋三聚化结构域，其负责NC-1单体或胶原18螺旋的非共价寡聚化。举例来说，人NC-1结构域的缔合结构域可包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的约10至约60的氨基酸残基，优选氨基酸残基10至60，或其肽。缔合结构域或其肽能够介导NC-1单体的非共价三聚化。缔合结构域或其肽的三聚化性质可以通过本文其他地方提及的方法测试，这些方法也是本领域已知的(Sambrook，同上)。在其他方面，寡聚化结构域可包含提供寡聚化和更长半衰期的其他支架构建体/结构域，这在文献中有充分描述；参见例如Ali和Imperiali 2005，Bioorganicand Medicinal Chemistry 13，5013。这种寡聚化结构域在结构上和功能上取代了如上所述的天然人NC-1结构域中发现的缔合结构域，或者除所述缔合结构域外也用于蛋白质或肽寡聚体中。或者，寡聚化可以由免疫球蛋白的Fc结构域介导，即如本文所定义的NC-1单体的寡聚化结构域包含免疫球蛋白的Fc结构域或者是免疫球蛋白的Fc结构域。本领域已知Fc结构域与例如肽或蛋白质的融合介导循环中更长的半衰期。应当理解，除了上述NC-1结构域的缔合结构域之外，Fc结构域也可以用于所述NC-1单体中，或者可以取代缔合结构域。Fc结构域赋予如本文所定义的NC-1单体的二聚体结构，因为Fc本身是二聚体。在另一个方面，寡聚化可以通过引入结构修饰来介导，例如，引入突变到NC-1单体中，这导致二硫键的形成，如下面更详细地阐述。还预期蛋白质寡聚体或肽寡聚体可以共价形成。

本文提及的“铰链区”包含SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的约61至约129的氨基酸残基，优选氨基酸残基61至129，或其肽。铰链区或其肽可包含至少一个内源蛋白水解切割位点，例如MMP-3，-7，-9，-13或-20切割位点。任选地，除了铰链区的内源性蛋白酶切割位点之外，胶原18的NC-1单体内的铰链区还可包含一个或多个重组蛋白酶切割位点。这种重组蛋白酶切割位点可以是，例如，肠激酶，因子Xa或凝血酶切割(Bergers和Javaherian；Lee等；同上)。例如，各蛋白酶的切割允许从蛋白质寡聚体或肽寡聚体释放内皮抑制素结构域或其片段，例如N端内皮抑制素肽。铰链区或其肽还可包含一个以上的蛋白水解切割位点，例如两个，三个，四个或甚至更多个蛋白水解切割位点。

铰链区可以插入寡聚化结构域和内皮抑制素结构域或所述内皮抑制素结构域的片段(例如N端内皮抑制素肽)之间。优选地，铰链区位于本文提及的NC-1单体中的寡聚化结构域和内皮抑制素结构域或其片段之间。胶原18的NC-1单体内的结构域排列可以是寡聚化结构域-铰链区-内皮抑制素结构域或所述内皮抑制素结构域的片段，或内皮抑制素结构域或所述内皮抑制素结构域的片段-铰链区-寡聚化结构域。

所提及的NC-1单体还可包含寡聚化结构域和内皮抑制素结构域。在这种情况下，铰链区域缺失。

如本文所用的“胶原18的内皮抑制素结构域”包含SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的约130至约308的氨基酸残基，优选氨基酸残基130至308。所述内皮抑制素结构域的相应氨基酸序列可以衍生自，例如，UniProtKB登录号P39060(人)和P39061(鼠)。此外，本文所用的胶原18的内皮抑制素结构域包含图2中的SEQ ID NO：18(其显示了鼠内皮抑制素的氨基酸序列)；包含图2中的SEQ ID NO：19(其显示了人内皮抑制素的氨基酸序列)。本发明范围还包括胶原18的内皮抑制素结构域，其中SEQ ID NO：18或19的第7位谷氨酰胺被半胱氨酸替代，产生通过二硫键共价连接的内皮抑制素二聚体。如果没有另外说明，本文使用的术语“内皮抑制素”是指胶原18的内皮抑制素结构域。

NC-1单体还可以包含所述内皮抑制素结构域的片段，而不是完整的内皮抑制素结构域。例如，片段可以是如本文所定义的胶原18的内皮抑制素结构域的N端肽。NC-1单体包含至少一个胶原18内皮抑制素结构域N端肽，但也可包含两个，三个，四个或甚至更多个N端内皮抑制素肽。N端内皮抑制素肽可以相同或不同。包括线性，分支或环状的N端内皮抑制素肽。例如，预期两个，三个或更多个N端内皮抑制素肽可以以线性形式排列。内皮抑制素结构域或其N端肽具有(至少)抗纤维化活性。此外，内皮抑制素结构域或其N端肽可具有抗血管发生活性，抗侵入/抗转移活性，降低血管通透性活性，抗炎和/或抗肿瘤发生活性。

本文所用的术语“胶原18内皮抑制素结构域的N端肽”是指来自或衍生自胶原18的内皮抑制素结构域的氨基(N或NH₂)末端的肽。胶原18的内皮抑制素结构域的N末端包含SEQID NO：18(对应于鼠胶原18的内皮抑制素结构域)或优选SEQ ID NO：19(对应于人胶原18的内皮抑制素结构域)的约氨基酸残基1至约氨基酸残基132的氨基酸残基，优选氨基酸残基1至氨基酸残基132。进一步包括其较短片段，即至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，60，70，80，90，100，110，120或130个氨基酸残基。例如，包含SEQ ID NO：19(对应于人胶原18的内皮抑制素结构域)的氨基酸残基1至氨基酸残基132的多肽可以作为解决这些较短片段的抗纤维化活性，抗血管发生活性，抗侵入/抗转移活性，降低血管通透性活性，抗炎和/或抗肿瘤发生活性的起点。随后，产生一系列来自或源自人内皮抑制素结构域的重组肽，从由人内皮抑制素结构域组成的肽开始，然后以约5至20个氨基酸的步长减少由人内皮抑制素结构域组成的所述肽的大小，并分析这些重组肽的上述活性。用于分析所述生物活性的测试在本文其他地方描述并且在本领域中是已知的。优选地，胶原18内皮抑制素结构域的N端肽包含SEQ ID NO：20(鼠)或SEQ ID NO：22(人)中所示的氨基酸序列或由其组成；另见图2。在一个方面，与野生型N端内皮抑制素肽相比，胶原18内皮抑制素结构域的N端肽包含不具有氨基酸序列变化的N端内皮抑制素肽。换句话说：这种肽的氨基酸序列可以在NC-1的天然内皮抑制素结构域中找到。“衍生自胶原18的内皮抑制素结构域的N端的肽”包含肽或肽变体，其可以与NC-1的内皮抑制素结构域中的相应天然内皮抑制素肽有一，二，三，四，五个或甚至更多个氨基酸残基不同，同时至少维持(或甚至超过)NC-1的内皮抑制素结构域中的相应内皮抑制素肽的生物活性(例如，抗纤维化活性，抗血管发生活性，抗侵入/抗转移活性，降低血管通透性活性，抗炎和/或抗肿瘤发生活性)。这样的肽在本文中被称为“N端内皮抑制素衍生肽”或“胶原18内皮抑制素结构域的N端肽的变体”，并且被如本文所用的术语“胶原18内皮抑制素结构域的N端肽”涵盖。如本文其他地方所述，来自或衍生自胶原18的内皮抑制素结构域的氨基末端的肽可以表现出进一步的修饰。例如，它可以与免疫球蛋白的Fc结构域融合，或者可以含有如本文所定义的另一个寡聚化结构域，以介导融合蛋白的二聚化或寡聚化。融合蛋白可以包括本说明书中其他地方提及的其他治疗剂。

本文所用的术语“治疗”表示通过向需要的受试者施用本文定义的蛋白质寡聚体或肽寡聚体或融合蛋白，改善或甚至消除与本文提及的疾病相关的一种或多种症状。

本文提及的术语“减轻”是指通过施用本文所述的蛋白质寡聚体或肽寡聚体或融合蛋白，改进或改善在本文提及的疾病的行为。改善也可以被视为疾病进展的减缓或停止。

本文所用的术语“预防”是指通过施用本文定义的蛋白质寡聚体或肽寡聚体或融合蛋白来避免本文提及的疾病的发生或再发生。

如本文所用的术语“纤维化相关疾病”表示与纤维化相关的任何病症。所述纤维化或纤维化相关疾病优选选自由以下各项组成的组：皮肤纤维化，优选硬皮病；瘢痕疙瘩(keloid或keloid scar)；增生性瘢痕；硬斑病；移植物抗宿主病引起的纤维化；上皮下纤维化；心内膜心肌纤维化；子宫纤维化；骨髓纤维化；腹膜后纤维化；肾源性系统性纤维化；手术后结瘢；哮喘；肝硬化/肝纤维化；异常伤口愈合导致的纤维化；肾小球肾炎；子宫内膜异位，多灶性纤维硬化；辐射诱发的纤维化(作为刺激诱发的纤维化的实例)，优选辐射诱发的肺炎或辐射诱发的肺纤维化；化疗诱发的或药物诱发的纤维化，例如，mTOR或EGFR激酶抑制所致的纤维化；常见或特发性肺纤维化(作为特发性纤维化的实例)；自身免疫疾病例如狼疮所致的纤维化，肿瘤内和癌症相关的纤维化/纤维发生，慢性炎症后的器官纤维化(例如通过病毒刺激或移植)；作为慢性肾病，长期透析或糖尿病的终末期的器官纤维化。(PMID：15939343，Common pathways in idiopathic pulmonary fibrosis and cancer，EurRespir Rev 2013 22：265-272，Nat Rev Nephrol.2014Mar 25.doi：10.1038/nrneph.2014.31.PMID：24662433和PMID：23938596，Nat Rev Nephrol.2014Apr；10(4)：226-37.doi：10.1038/nrneph.2014.14.Epub 2014Feb 11.PMID：24514753，Nat RevGastroenterol Hepatol.2014Jan；11(1)：4.doi：10.1038/nrgastro.2013.227.Epub2013Nov 26.PMID：24275791).

特发性肺纤维化(IPF)是一种又称为隐源性纤维化肺泡炎(CFA)的病症，其是一种慢性进行性肺病，特征在于肺的支持框架(间质)的纤维化。根据定义，该术语仅在肺纤维化的原因未知时使用(“特发性”)。当病理学家在显微镜下检查来自IPF患者的肺组织时，它显示出常见的间质性肺炎(UIP)的一组特征性组织学/病理学特征。UIP的特征在于两肺的涉及肺的支持框架(间质)的进行性瘢痕形成。

如本文所提及的蛋白质寡聚体或肽寡聚体或融合蛋白具有至少抗纤维化活性。本文所用的“抗纤维化活性”是指引起纤维化或纤维化相关疾病减缓，停止或甚至消退的生物活性。优选地，纤维化或纤维化相关疾病通过本文定义的蛋白质或肽寡聚体或融合蛋白的抗纤维化活性来治愈。“纤维化”是器官或组织中作为修复或反应过程(例如，对放射和/或化学疗法的反应中)的过量纤维结缔组织的形成或发展，这与作为器官或组织的正常成分的纤维组织的形成相反。例如，治疗相关的纤维化减少能与细胞因子和生长因子的调节有关。

如本文所定义的蛋白质寡聚体或肽寡聚体或融合蛋白的抗纤维化活性可以例如通过本领域已知的动物模型进行测试，并在以下实施例中显示。例如，博来霉素和辐射诱发的肺纤维化模型已被用于研究肺纤维化(Rubin，同前；Kamp，同前Gurujeyalakshmi等.(1996)，Res.Commun.Pharmacol.Toxicol.1，p.1-15；Gurujeyalakshmi等.(1999)，Am.J.Physiol.276，p.L311-L318；Hallahan等.(2002)，J.Natl.Cancer Inst.94，p.733-741)。如本文所述的蛋白质寡聚体或肽寡聚体或融合蛋白的抗纤维化活性还可以通过以下进行组织学(降低或减少炎症，肉芽肿形成和/或纤维化)分析：分析生长因子和/或细胞因子的表达(例如，PDGF-受体激活的抑制，转化生长因子-β的减少，受体酪氨酸激酶激活的抑制，IL-1β、KC或TIMP-1的减少)，胶原的减少，成纤维细胞增殖的抑制和成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的抑制，和/或BAL淋巴细胞的减少，使用高分辨率X线断层摄影术的纤维化的定性或定量替代物的减少(例如肺密度增加[Hounsfield单位]和肺容量减少)，改善的氧饱和度(血气分析，脉搏血氧测量)、肺功能检查(PFT)和临床症状(呼吸频率，心率，右心衰竭的迹象，扩散能力，肺活量测定)。

本文所用的术语“血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病”表示取决于VEGF水平失调的良性病理生理学病症(例如湿性黄斑变性，子宫内膜异位症，支气管哮喘和糖尿病，增强的VEGF诱导的血管通透性(例如脑组织辐照后增强的通透性，“放射性坏死”)，血管紧张的改变(例如高血压)，类风湿性关节炎等)，以及恶性VEGF依赖性疾病(例如肾细胞癌和其他VEGF成瘾性肿瘤，VEGF依赖性腹水发展，VEGF依赖性免疫系统抑制，例如源自骨髓的细胞(BMDC)，源自骨髓的抑制细胞(MdSC)，未成熟树突细胞等的募集和微环境训练)。优选地，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病是VEGF-A相关疾病。

本文提及的术语“基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病”是指良性和恶性疾病，其中MMP激活促成病理生理学，例如，在局部治疗失败率高的肿瘤(如胶质母细胞瘤，胰腺癌，肺癌)固有地明显的局部肿瘤侵入和癌症转移过程中MMP的激活，以及由治疗诱导选择压力(例如肿瘤缺氧和放疗后纤维化)，自身免疫疾病和慢性炎性疾病中的明显免疫反应等导致的获得性增强的MMP激活。优选地，基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病是MMP-2/MMP-9相关疾病。

在一个优选的实施方案中，除抗纤维化活性外，本文提及的蛋白质寡聚体或肽寡聚体或融合蛋白具有一种，两种或甚至更多种生物活性，其中另外的生物活性选自由以下各项组成的组：抗血管发生活性，抗侵入/抗转移活性，降低血管通透性活性，抗炎和抗肿瘤发生活性。

除抗纤维化活性外，本文定义的蛋白质寡聚体或肽寡聚体或融合蛋白可具有抗血管发生活性，抗侵入/抗转移活性，降低血管通透性活性，抗炎和/或抗肿瘤发生活性。这些活性包括，例如任何以下生物学活性：抑制内皮细胞和/或周细胞生长或迁移、管或内皮形成、体内新毛细血管生长，通过切断血液供应来减缓或抑制良性或恶性肿瘤的生长，通过干扰其作用机制减少其他抗肿瘤或抗血管生成试剂(如VEGF抑制剂)的副作用/毒性(即降低血压，调节恶性和良性疾病的炎症反应)，或改善病理生理参数，例如治疗后治疗时间窗内的灌注或缺氧；这些活性反过来可促进其他疗法(例如放疗，化疗或抗凋亡疗法)的功效。抗血管发生活性可以通过体外测定或通过本领域已知的动物模型体内测试(Abdollahi等，Cancer Res.2003，63，8890；Mol.Cell 2004，13，649；PNAS 2007，104，12890；DrugResist.Update 2005，8，59；Bergers等，Science 1999，284，808；Javaherian等，J.Biol.Chem.2002，277，45211；Lee等，Clin.Cancer Res.2008)。例如，可以通过抑制由生长因子例如VEGF刺激的内皮细胞的增殖和/或迁移来体外测试抗血管发生活性。例如，可以通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)测定来分析体内抗血管发生活性，而抗肿瘤活性可以在动物肿瘤模型中测试，所述动物肿瘤模型包括例如A549、LLC或H460非小细胞肺癌，HT29结肠癌，BxPC3胰腺癌，Karpas 299淋巴瘤，MOLM-13AML(急性髓性白血病)，786-O，A2058细胞系(黑色素瘤)或RENCA肾细胞癌(RCC)等等(Abdollahi等，Drug Resist.Update 2005，同上)。

除了本发明的融合蛋白的蛋白质寡聚体或肽寡聚体之外，还可以使用的治疗血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病的药物包括血管通透性(例如脑组织辐照后增强的通透性，“放射性坏死”)和血管紧张(如内皮素拮抗剂马西替坦(macitentan)，AT1/ACE抑制剂)的其他调节剂，哮喘中的β2-拟交感神经药和皮质激素，慢性炎症/自身免疫疾病中的免疫抑制剂，针对不同VEGF依赖性肿瘤和腹水的化疗和放疗，在例如肾细胞癌中使用的激酶抑制剂(mTORi，例如RAD001，多激酶抑制剂帕唑帕尼/西尼替尼/阿西替尼，免疫调节剂，例如检查点抑制剂抗PD-1/PD-L1抗体)。

除了本发明的蛋白质寡聚体或肽寡聚体或融合蛋白之外，还可以使用的治疗基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病的药物包括例如具有高局部区域治疗失败率的经放(化)疗的局部侵入性肿瘤，如胶质母细胞瘤，胰腺癌，抗炎和免疫抑制疗法(抗TNFα抗体/英夫利昔单抗，霉酚酸，环磷酰胺等)，癌症治疗后肿瘤侵入或假性进展，例如复发性胶质瘤中的抗血管生成疗法，具有高MMP-2/-9活性的转移性疾病(例如乳腺癌)的治疗(即激素疗法他莫昔芬，HER2+疾病中的曲妥珠单抗，化疗)。

本申请中提及的术语“受试者”涉及农场动物，宠物，猕猴(如恒河猴)或人。优选地，农场动物或宠物是哺乳动物。更优选地，受试者是患有本文定义的纤维化或纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病的人，并且因此需要治疗提及的疾病。

如本文所用，术语“约”在对所述项目，数量，百分比或词语的值进行限定时指的是所述项目，数量，百分比或词语的值的加或减10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％或1％的范围。关于氨基酸序列，术语“约”表示加或减5个氨基酸残基，4个氨基酸残基，3个氨基酸残基，2个氨基酸残基或1个氨基酸残基。优选的范围为加或减10％；或加或减3或1个氨基酸残基。

这里使用的术语“包含有”，“包含”和“由......构成”是“包括有”，“包括”或“含有着”，“含有”的同义词，并且是包含性的或开放式的并且不排除另外的，未述及的成员，要素或方法步骤。显然，术语“包含”包括术语“由......组成”。更具体地，这里使用的术语“包含”意味着权利要求包含所有列出的要素或方法步骤，但是还可以包括另外的，未命名的要素或方法步骤。例如，包括步骤a)，b)和c)的方法在其最狭义的意义上包括由步骤a)，b)和c)组成的方法。短语“由...组成”意指组合物(或装置或方法)具有所述要素(或步骤)而再无其他。相反，术语“包括”还可以涵盖包括除了步骤a)，b)和c)之外的其他步骤例如步骤d)和e)的方法。

术语“至少一个”表示一个，两个，三个，四个，五个或甚至更多。

发明人在先前的研究中发现，源自人胶原18的三聚体NC-1(具有包含缔合结构域，铰链区和内皮抑制素结构域的NC-1)结合纤连蛋白，而内皮抑制素单体缺乏与纤连蛋白的结合；参见WO2013/026913。纤连蛋白被认为是主要的细胞外基质蛋白，结合血管生成和抗血管生成试剂。内皮抑制素在生理条件下是单体。内皮抑制素的主要前体是NC-1，其是由三条相互连接的链组成的三聚体分子，每条链具有约330个氨基酸。这表明NC-1三聚体与内皮抑制素相比具有不同的特性。此外，形成二聚体的Fc-内皮抑制素以及在内皮抑制素的氨基酸位置7上具有单突变(谷氨酰胺至半胱氨酸)的人工内皮抑制素二聚体保留与纤连蛋白的结合，表明寡聚化对结合纤连蛋白的重要性。在人血清中搜索内皮抑制素大小的分子后，发明人未能鉴定常规大小的内皮抑制素(约20kDa)。人血液循环中内皮抑制素尺寸分子的出现可能是由于收集人血清后蛋白酶对NC-1三聚体的降解。NC-1三聚体似乎是胶原18降解的主要生理产物，存在于组织和循环中，显示出(单体)内皮抑制素不具有的独特生物学特性。发明人进一步证明了纤连蛋白与VEGF，NC-1三聚体的高亲和力结合并且共免疫沉淀了来自外周血血小板蛋白裂解物的这三种候选相互作用配偶体。此外，可以证明NC-1三聚体，纤连蛋白，VEGF和α5β1整合素的体内共定位，表明其中VEGF，NC-1三聚体，整合素α5β1的集合的模型，其中纤连蛋白是抗血管生成过程的开始。最重要的是，NC-1三聚体相比于内皮抑制素的抗肿瘤研究表明，NC-1三聚体是比内皮抑制素更有效的抗血管生成蛋白。

出乎意料的是，发明人在最近的研究中发现，纤维化可以通过蛋白质寡聚体成功地治疗，所述蛋白质寡聚体例如是包含N端内皮抑制素肽的Fc-内皮抑制素融合蛋白，如以下实施例所示。根据WO2011/050311(同上)和Yamaguchi等(Sci.Transl.Med.2012，4，p.136ra71)的相应科学出版物(其中仅报道了来自氨基酸残基133-180的C端内皮抑制素肽的抗纤维化活性(参见E4肽))的教导，该结果出人意料。相反，对于N端内皮抑制素肽，没有显示出这样的活性。

发明人发现已知主要参与抗血管生成作用的内皮抑制素的N端锌结合区域[Tjin，R.M.，等，A 27-amino-acid synthetic peptide corresponding to the NH2-terminalzinc-binding domain of endostatin is responsible for its antitumoractivity.Cancer Research，2005.65(9)：p.3656-3663]与该内源蛋白质引起的抗纤维化作用相关，这与Yamaguchi等(同上)最近公布的数据(主张内皮抑制素的C末端结构域的抗纤维化作用)形成鲜明对比。在发明人使用的辐射诱发的肺纤维化(RILF)模型中，C端肽对改善大多数研究的纤维化发展参数无效。总之，发明人的数据表明在RILF模型中的抗纤维化作用中内皮抑制素的N末端序列以及二聚化的重要作用。

仔细观察内皮抑制素C端(含E4肽区域)，没有明显的结构特征将该片段与潜在的蛋白质相互作用配偶连接起来，这可能为假定的分子抗纤维化作用提供机制解释。对于缺乏E4肽活性的另一种解释可能是，与Yamaguchi等使用的急性鼠纤维化模型相反，发明人利用辐射诱发的肺纤维化模型，其中纤维化发展遵循更接近于人类的病理生理学的缓慢(在照射后超过24周)和慢性动力学。

然而，在研究的进一步过程中，当使用合成的内皮抑制素二聚体(Fc-内皮抑制素)时，发明人发现了最有效的肺纤维化减弱。Fc-内皮抑制素(FcE)由两条Fc链(通过二硫键连接)组成，延伸至两个内皮抑制素分子，每个分子与单个Fc链连接。因此，两个相邻的内皮抑制素分子由于Fc二聚体而变成二聚体。

基于以下实施例中显示的数据，发明人的假设是寡聚内皮抑制素的有益抗纤维化作用至少部分地由其结合纤连蛋白的性质介导，并且这区分了NC-1寡聚体或内皮抑制素寡聚体或包含来自NC-1或内皮抑制素的单体或单体片段的至少两个内皮抑制素N端肽的寡聚体。

在发明人的观点中，内皮抑制素是NC-1的末端降解产物。它们在以下实施例中呈现新数据，进一步证明内皮抑制素二聚体和NC1三聚体的结合特性在相关蛋白质相互作用配偶体方面与内皮抑制素单体完全不同。

例如，已发现只有寡聚内皮抑制素和NC1能够结合纤连蛋白，VEGF，MMP-2和MMP-9，而单体内皮抑制素不能；另参见图9至图12。

换言之，内皮抑制素，内皮抑制素肽和NC1的寡聚化特性在其与组织重塑的关键参与者的结合中起关键作用，所述作用对其抗纤维化和抗癌作用的探索具有高度影响。

本领域技术人员将认识到，这一重要发现为通过合成设计(例如通过Fc的二聚化)或其他备选方案探寻寡聚内皮抑制素，寡聚内皮抑制素肽或内皮抑制素衍生肽的生物学特性以产生和改善模拟内皮抑制素前体分子NC1的药物开辟了新的途径。

在蛋白质寡聚体或肽寡聚体的一个实施方案中，如本文所用的“NC-1单体”或“胶原18的NC-1单体”包含胶原18的非胶原NC-1结构域的全部或至少一部分。优选地，NC-1单体是人。

如本文其他地方所述，胶原18的完整C端NC-1结构域包括N端缔合区，中心蛋白酶敏感性铰链区和C端稳定内皮抑制素结构域(Sasaki等，1998，EMBO J.17，4249)。所述NC-1结构域的至少一部分包含胶原18(优选如SEQ ID NO：2所示的人胶原18)的非胶原NC-1结构域的至少一个结构域，区域或片段。优选地，人NC-1结构域包含SEQ ID NO：4或由SEQ IDNO：4组成。

在蛋白质寡聚体或肽寡聚体的一个方面，本文所用的NC-1单体包含至少一个胶原18内皮抑制素结构域的N端肽(简称N端内皮抑制素肽或N端肽)或至少一个胶原18内皮抑制素结构域的N端内皮抑制素衍生肽。

蛋白质寡聚体或肽寡聚体，胶原18，胶原18的内皮抑制素结构域，胶原18内皮抑制素结构域的N端肽和N端内皮抑制素衍生肽已在本文别处定义。优选地，所述寡聚体，胶原18，内皮抑制素结构域，N端肽或N端内皮抑制素衍生肽是人。

还预期肽拟似物和有机拟似物实施方案，其中这种肽和有机拟似物的化学成分的三维排列模拟了多肽主链和组分氨基酸侧链的三维排列，产生了具有可测量或增强的抗纤维化活性的内皮抑制素结构域，N端内皮抑制素肽或N端内皮抑制素衍生肽的肽拟似物和有机拟似物。对于计算机建模应用，药效团是生物活性要求的结构的理想化三维定义。可以设计肽拟似物和有机拟似物以使每个药效团适合当前的计算机建模软件(使用计算机辅助药物设计或CADD)。对于CADD中使用的技术的描述，参见Walters，″Computer-AssistedModeling of Drugs，″in Klegerman&Groves，eds.，1993，PharmaceuticalBiotechnology，Interpharm Press：Buffalo Grove，Ill.，pp.165-174和Principles ofPharmacology，Munson(ed.)1995，Ch.102。还包括使用这些技术制备的拟似物。

在一个方面，N端肽或N端内皮抑制素衍生肽包含内皮抑制素结构域的完整锌结合位点/结构域，即包含SEQ ID NO：19的组氨酸1，3和11和天冬氨酸76。优选地，提及的肽至少包含SEQ ID NO：19的组氨酸1，3和11。

另一方面，N端肽或N端内皮抑制素衍生肽包含Tjin(同上)中描述的27个氨基酸的肽或其片段。优选地，所述27个氨基酸的肽的片段至少包含组氨酸1，3和11。

可用于本文所用的蛋白质寡聚体或肽寡聚体的N端肽或N端内皮抑制素衍生肽的其他实例示于图2和以下实施例中，并包含SEQ ID NO：7，9，10，13，15，18，19，20或22或已经在文献中(Tjin等，同上)或在EP 1107989 B1或US 7,524,811中描述。

优选地，内皮抑制素衍生肽或内皮抑制素肽的长度为约10至约40个氨基酸残基，优选15至35，优选20至32，更优选24，25，26，27，28，29或30个氨基酸残基。例如，SEQ ID NO：9显示了NC-1-内皮抑制素结构域(ED)的活性基序的相应鼠序列(即，介导抗血管生成和/或抗肿瘤活性的氨基末端锌结合结构域)，其长度为26个氨基酸残基，而SEQ ID NO：10显示长度为25个氨基酸残基的相应人序列。这些序列中的组氨酸残基特别重要，因为发明人在先前的研究中已发现，所述组氨酸残基被丙氨酸残基置换，这消除了抗肿瘤和抗血管发生活性。

在蛋白质寡聚体或肽寡聚体的优选实施方案中，NC-1单体包含如本文其他地方所定义的内皮抑制素结构域或由其组成。优选地，所提及的内皮抑制素衍生肽，内皮抑制素肽或内皮抑制素结构域包含内皮抑制素结构域第7位的谷氨酰胺至半胱氨酸的单突变。这些突变体能够形成二硫键，并且因此能够形成二聚体；参见，例如，Kuo 2001，JCB 152，1233；Tjin等.2005，Cancer Res 65，3656。因此，所述突变可用于本文所述的蛋白质或肽寡聚体中作为二聚化的手段。

在进一步的实施方案中，除了内皮抑制素结构域，内皮抑制素衍生肽或内皮抑制素肽外，NC-1单体还包含铰链区。这种构建体将可能形成单体，可能是二聚体。不能排除二聚体的形成，因为看起来铰链区也可能有助于这种构建体的二聚体缔合。任选地，除了所提及的成分之外，这种NC-1单体还包含缔合结构域，即人胶原18的非三螺旋三聚化结构域，或本文提到的另一种寡聚化结构域。对于本领域技术人员显而易见的是，提及的缔合结构域的存在导致三聚体的形成。在另一方面，NC-1单体包含内皮抑制素结构域和上文定义的NC-1结构域的缔合结构域，并且在又一方面，每个NC-1结构域包含缔合结构域，铰链区和内皮抑制素结构域。在后一方面，NC-1单体包含人胶原18的完整NC-1结构域，或者是(约38kDa的)人胶原18的NC-1结构域，即由其组成。人胶原18的NC-1结构域和所述NC-1结构域的结构已由例如Sasaki等定义(同上)。胶原18的NC-1结构域由315(小鼠)或312(人)个氨基酸残基的非三螺旋序列组成。如上所述，已经发现NC-1结构域通过上述缔合结构域非共价结合形成三聚体。

本文使用的NC-1单体优选为人。

NC-1的寡聚化由该蛋白质的至少两个结构域介导：一个由蛋白质N端的约50个氨基酸组成，其限定三螺旋结构，即缔合结构域。参与寡聚化的第二个结构域位于内皮抑制素的N末端并且能够与锌结合。人内皮抑制素锌位点由组氨酸1，3和11以及SEQ ID NO：19的天冬氨酸76形成。已显示所述结构域在高浓度的内皮抑制素下形成二聚体(Ding等，同上)。因此，在某些方面，NC-1单体包含缔合结构域和内皮抑制素结构域的N末端。如上所述，蛋白酶敏感性铰链区也可能在NC-1的寡聚化中起作用。因此，在本发明的一些方面，NC-1单体可以进一步包含NC-1结构域的铰链区。

本发明的NC-1单体优选长于20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，300或310个氨基酸残基并且能够二聚化或寡聚化。此外，它至少具有抗纤维化活性。在NC-1单体包含缔合结构域，铰链区和内皮抑制素结构域的锌结合位点/结构域或完整内皮抑制素结构域的情况下，优选NC-1单体长于312个氨基酸残基并且包含甚至更优选至少315，320，330，340，350，400，500或甚至更多个氨基酸残基。

在进一步的实施方案中，蛋白质寡聚体包含胶原18的至少两个内皮抑制素结构域，但也可包括三个，四个，五个或甚至更多个内皮抑制素结构域。

例如，实施例11中使用的Fc-内皮抑制素(FcE)由两条Fc链(通过二硫键连接)组成，延伸至两个内皮抑制素分子，每个分子与单个Fc链连接。因此，两个相邻的内皮抑制素分子由于Fc二聚体而变成二聚体。实施例11中使用的另一种二聚体构建体包含两个胶原18内皮抑制素结构域。每个内皮抑制素结构域在7位含有单个突变，其中谷氨酰胺被半胱氨酸替代。每个内皮抑制素结构域与具有插入的肠激酶切割位点的免疫球蛋白Fc区连接。在该构建体中，Fc和内皮抑制素通过其相应的二硫键分别二聚化。肠激酶消化该重组蛋白产生Fc二聚体和内皮抑制素二聚体。

在另一个实施方案中，蛋白质寡聚体或肽寡聚体包含至少两个胶原18内皮抑制素结构域的N端肽，但也可包括三个，四个，五个或甚至更多个所述N端肽。

本文所用的术语“胶原18内皮抑制素结构域的N端肽”是指来自胶原18的内皮抑制素结构域的氨基末端的肽。关于NC-1单体及其寡聚化的定义，解释和实施方案经必要的变更适用于胶原18内皮抑制素结构域的N端肽。胶原18的内皮抑制素结构域的N末端包含SEQID NO：18或19的氨基酸残基1至132(对应于胶原18的内皮抑制素结构域)。优选地，胶原18内皮抑制素结构域的N端肽是内皮抑制素肽(与野生型相比不改变氨基酸序列)或如本文其他地方所定义的内皮抑制素衍生肽。

在一个实施方案中，胶原内皮抑制素结构域的N端肽是或包含SEQ ID NO：18或19的约氨基酸残基1至约氨基酸残基132的氨基酸序列(胶原18的内皮抑制素结构域)。

鼠胶原18的内皮抑制素结构域的相应氨基酸序列显示在SEQ ID NO：18中，而人胶原18的内皮抑制素结构域的相应氨基酸序列显示在SEQ ID NO：19中，另见图2。本申请中提及的术语“胶原18内皮抑制素结构域的N端肽”包含位于SEQ ID NO：19的约氨基酸残基1(H；组氨酸)和132(E；谷氨酸)之间的肽，优选在SEQ ID NO：19的约氨基酸残基1(H；组氨酸)和115(P；脯氨酸)之间，优选在约氨基酸残基1(H；组氨酸)和92(G；甘氨酸)之间，更优选在SEQID NO：19的约氨基酸酸残基1(H；组氨酸)和76(D；天冬氨酸)之间，甚至更优选在SEQ IDNO：19的约氨基酸残基1(H；组氨酸)和27(R；精氨酸)之间或者在SEQ ID NO：19的氨基酸残基1(H；组氨酸)和25(G；甘氨酸)之间。胶原18内皮抑制素结构域的其他N端肽的实例显示于Tjin等(同上)中或在US 7,524,811或EP1668129 B1中，所述文献通过引用结合于此。优选地，内皮抑制素衍生肽或内皮抑制素肽的长度为约10至约40个氨基酸残基，优选约15至35，优选约20至32，更优选约24，25，26，27，28，29或30个氨基酸残基。在以下实施例中，说明了胶原18内皮抑制素结构域的进一步优选的N端肽。

内皮抑制素的N端锌结合结构域或对应于内皮抑制素的N端锌结合结构域的合成肽显示在例如SEQ ID NO：9和10的氨基酸序列中。本发明包括SEQ ID NO：9和10的氨基酸序列的变体，例如，也可以使用SEQ ID NO：9和10的较短氨基酸序列。例如，发明人发现对应于SEQ ID NO：9的第1至13位或SEQ ID NO：10的第1至12位的肽可用作蛋白质或肽寡聚体中的内皮抑制素肽。此外，这种肽可以与相应的内皮抑制素肽或内皮抑制素衍生肽有一个，两个，三个，四个或甚至更多个氨基酸残基不同，同时至少维持或甚至超过NC-1的内皮抑制素结构域中相应的内皮抑制素肽的抗纤维化活性(如在本文其他地方所述)。鉴于此，重要的是出于本文其他地方所述的原因保持对应于SEQ ID NO：9或10的位置1，3和/或11的组氨酸氨基酸残基。此外，当与锌相比时，用其他类似的二价阳离子(即铜)替代锌可以产生更有效的内皮抑制素的N端肽、内皮抑制素和NC-1结构域或单体。

WO 2011/050311和Yamaguchi等(Sci.Transl.Med.2012，4，p.136ra71)描述的C端内皮抑制素多肽或肽，即由WO2011/050311中的SEQ ID NO：2，4或13的氨基酸残基133-180的40个连续氨基酸残基组成的肽或多肽，以及本申请的SEQ ID NO：21不包括在本发明的范围内。还要注意的是，在Yamaguchi等的出版物中，与本发明的发现相反，N末端内皮抑制素肽E1(氨基酸残基1至45)和E2(氨基酸残基71至115)没有显示出抗纤维化活性；见以下实施例。鉴于此，本申请中的发现更出人意料。

如本文所定义的“胶原18的NC-1单体”，“胶原18的内皮抑制素结构域”或“胶原18内皮抑制素结构域的N端肽”可以包含另外的蛋白质结构域或亚基，例如，上述免疫球蛋白的Fc结构域或蛋白质标签，例如，His标签，c-myc标签，Flag标签等，其可用于例如纯化和/或检测。如本领域众所周知的，蛋白质标签是遗传移植到重组蛋白质上的肽序列。在一个方面，这些标签可以通过化学试剂或酶促方法除去，例如蛋白水解或内含肽剪接。如本文所述，这种标签附接于NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽。将亲和标签附接到蛋白质上，使得可以使用本领域熟知的亲和技术从它们的粗生物来源例如细胞裂解物中纯化它们。这些包括，例如，几丁质结合蛋白(CBP)，麦芽糖结合蛋白(MBP)，免疫球蛋白的Fc结构域或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。聚(His)标签是广泛使用的蛋白质标签；它与金属基质结合。使用增溶标签，特别是对于在分子伴侣缺陷物种如大肠杆菌中表达的重组蛋白，以帮助蛋白质的正确折叠并防止它们沉淀。这些包括例如硫氧还蛋白(TRX)和聚-(NANP)。一些亲和标签具有作为增溶剂的双重作用，例如MBP和GST。色谱标签用于改变NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽的色谱性质，以在特定分离技术中提供不同的分辨率。通常，它们由多阴离子氨基酸组成，例如FLAG标签。表位标签是选择的短肽序列，因为可以在许多不同物种中可靠地产生高亲和力抗体。这些通常来自病毒基因，这解释了它们的高免疫反应性。表位标签包括例如V5标签，c-myc标签和HA标签。这些标签可用于例如蛋白质印迹和免疫沉淀实验，尽管它们也可用于蛋白质纯化。荧光标签用于对蛋白质进行视觉读数。GFP及其变体是最常用的荧光标签。GFP的更高级应用包括将其用作折叠报告物(如果折叠则为荧光，否则为无色)。蛋白质标签发现许多其他用途，例如特定的酶修饰(例如生物素连接酶标签)和化学修饰(Flash标签)。各种标签也可以组合以产生NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽的多功能修饰。

如本文所定义的人胶原18的NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽也可包含放射性同位素，例如，¹²⁴I，¹²⁵I，^13１I，Cu-64，Cu-67，Y-86，Zr-89，Y-90，Re-188，Ga-68；或与螯合物如DTPA结合的放射性核素；毒素，例如白喉毒素或细胞凋亡诱导剂；或化学品，例如化学治疗剂如紫杉醇或吉西他滨，其可用于改善和/或检测蛋白质寡聚体的抗纤维化，抗血管生成和/或抗肿瘤发生活性。

在其他实施方案中，蛋白质或肽寡聚体是聚乙二醇化的。聚乙二醇化是聚乙二醇(PEG)聚合物链与另一分子共价连接的过程，所述另一分子通常是药物或治疗性蛋白质，例如本文定义的蛋白质或肽寡聚体。通常通过将PEG的反应性衍生物与靶标大分子一起温育来实现聚乙二醇化。PEG与药物或治疗性蛋白质的共价连接可以“掩蔽”来自宿主免疫系统的药剂(降低的免疫原性和抗原性)，增加药剂的流体动力学大小(溶液中的大小)，这通过减少肾脏清除来延长其循环时间。聚乙二醇化还可以为疏水性药物和蛋白质提供水溶性。化合物的聚乙二醇化是本领域熟知的；参见，例如，Damodaran和Fee 2010，EuropeanPharmaceutical Review 15，18。

本文所用的术语“Fc区”或“Fc结构域”是指片段可结晶区域，其是抗体或免疫球蛋白的尾区，所述尾区与细胞表面受体即Fc受体和补体系统的一些蛋白质相互作用。该特性允许抗体激活免疫系统。在IgG，IgA和IgD抗体同种型中，Fc结构域由衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域的两个相同的蛋白质片段构成；在每条多肽链中IgM和IgE Fc结构域含有三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。IgG的Fc结构域具有高度保守的N-糖基化位点。Fc片段的糖基化对于Fc受体介导的活性是必需的。与该位点连接的N-聚糖主要是复杂类型的核心-岩藻糖基化的二天线结构。此外，少量这些N-聚糖还具有分叉GlcNAc和α-2，6连接的唾液酸残基。已经发现免疫球蛋白的Fc结构域与蛋白质的融合增强了哺乳动物细胞中融合蛋白的产生和分泌(Lo等，1998，Protein Eng.11，495，Capon等，1989，Nature337，525)。此外，血管生成抑制剂与免疫球蛋白Fc结构域的连接已显示出增加所述抑制剂的半衰期(Capon等.1989，Nature 337，525；Gordon等，2001，J.Clin.Oncol.19，843；Holash等，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，11393)。然而，Fc结构域不仅可用于纯化，增溶和/或检测目的，而且可有利地改变蛋白质或肽寡聚体的生物学性质，如下文和下列实施例中所述。在一个实施方案中，如果需要，可以通过用蛋白酶(例如肠激酶或凝血酶)处理来切割一个或多个Fc结构域。优选地，本文提及的Fc结构域来自人IgG(Bergers和JavaherianScience 1999；Lee等Clin Canc Res 2008)。对于本领域技术人员显而易见的是，原则上，任何IgG同种型都可用于产生本发明的寡聚体。甚至可以使用IgG的Fc结构域的亚片段或单链以延长本文所述寡聚体的半衰期或寡聚化。可用于产生本文提及的寡聚体或融合蛋白(例如，Fc-NC-1或NC-1-Fc融合蛋白或Fc-内皮抑制素或内皮抑制素-Fc融合蛋白)的小鼠和人Fc结构域的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：5和6中。类似地，可以在蛋白质寡聚体或肽寡聚体中使用N端内皮抑制素肽-Fc融合蛋白或Fc-N端内皮抑制素肽。换句话说：Fc结构域可位于本发明的融合蛋白中的N-或C端。

在一个方面，蛋白质寡聚体或肽寡聚体可以通过本领域技术人员熟知的化学合成或重组分子生物学技术制备；参见，例如，Sambrook等，Molecular cloning：a laboratorymanual/Sambrook，Joseph；Russell，David W.--.3rd ed.--New York：Cold SpringHarbor Laboratory，2001。

例如，蛋白质寡聚体或肽寡聚体可以通过以下方法产生，包括(a)优选在无血清条件下培养包含编码蛋白质寡聚体或肽寡聚体的核酸序列的宿主细胞，(b)从步骤(a)的宿主细胞获得蛋白质寡聚体或肽寡聚体，和任选地，(c)优选在无血清条件下储存蛋白质寡聚体或肽寡聚体。发明人已发现，即使在4℃下如果保留在血清或细胞培养基中较长时间，寡聚NC-1如NC-1三聚体也易于降解。因此，有利的是在无血清条件下产生和保留蛋白质寡聚体或肽寡聚体。或者，可以在合适的条件下，在合适的宿主细胞中表达编码胶原18的NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18的内皮抑制素结构域的N端肽的多核苷酸。所提及的NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或N端内皮抑制素肽组装成二聚体或寡聚体在细胞内发生。随后，可以通过本领域已知的方法分离和/或纯化二聚体或寡聚体(参见，例如，Sambrook，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)N.Y.和Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，Green PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y.(1994))。例如，蛋白质寡聚体或肽寡聚体可以通过常规纯化技术从例如宿主细胞裂解物中获得，所述纯化技术包括但不限于亲和色谱，离子交换色谱，尺寸排阻色谱和/或制备型凝胶电泳。或者，在分离和/或纯化所提及的NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或N端内皮抑制素肽之后，所述NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或N端内皮抑制素肽可在体外组装成二聚体或寡聚体。

在一个实施方案中，蛋白质或肽寡聚体结合纤连蛋白。此外，寡聚体可以与VEGF结合，优选VEGF-A，MMP-2，MMP-9和/或整合素α5β1。本发明的蛋白质或肽寡聚体与纤连蛋白，VEGF，MMP-2，MMP-9和/或整合素α5β1的所述结合可通过本领域已知的方法测定，例如免疫沉淀，ELISA测定或Biacore。

在蛋白质寡聚体或肽寡聚体的另一个实施方案中，人胶原18的NC-1单体包含寡聚化结构域，铰链区和/或内皮抑制素结构域或所述内皮抑制素结构域的片段。在一些实施方案中，人胶原18的NC-1单体包含寡聚化结构域，铰链区和完整的内皮抑制素结构域。在其他具体实施方案中，人胶原18的NC-1单体包含寡聚化结构域，铰链区和内皮抑制素结构域的片段。内皮抑制素结构域的片段优选是内皮抑制素结构域的N端片段，更优选内皮抑制素结构域的N端肽或衍生自胶原18的内皮抑制素结构域的N末端的肽。在NC-1单体中，内皮抑制素结构域的片段优选包含至少一个如本文所定义的N端内皮抑制素肽。在NC-1单体中，所述内皮抑制素结构域的片段还可包含如本文所定义的两个，三个，四个或甚至更多个N端内皮抑制素肽。

在蛋白质寡聚体或肽寡聚体的另一个优选实施方案中，铰链区插入寡聚化结构域和内皮抑制素结构域或所述内皮抑制素结构域的片段之间。优选地，铰链区位于本文提及的NC-1单体中的寡聚化结构域和内皮抑制素结构域或其片段之间。人胶原18的NC-1单体内的结构域排列优选是寡聚化结构域-铰链区-内皮抑制素结构域或所述内皮抑制素结构域的片段，或内皮抑制素结构域或所述内皮抑制素结构域的片段-铰链区-寡聚化结构域。

任选地，除了或备选地铰链区的内源性MMP蛋白酶切割位点之外，人胶原18的NC-1单体内的铰链区还可包含一个或多个重组蛋白酶切割位点。这种重组蛋白酶切割位点可以是，例如，肠激酶或凝血酶切割(Bergers和Javaherian；Lee等.；同前；Lo等，1998，ProteinEngineering 11(6)，1998，p.495-500)。所述出版物进一步描述了可用于引入所提及的切割位点的合适的接头区域，例如聚甘氨酸接头等。各蛋白酶的切割允许例如释放蛋白质寡聚体或肽寡聚体的内皮抑制素结构域。

在备选实施方案中，本文提及的NC-1单体缺少铰链区。

在蛋白质寡聚体或肽寡聚体的另一个实施方案中，胶原18的NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽还优选地以融合蛋白包含纤连蛋白的RGD基序和/或PHSRN基序。优选地，胶原18的NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽包含纤连蛋白的RGD基序和PHSRN基序。

例如，SEQ ID NO：11和12提供了包含RGD基序和对于纤连蛋白与整合素的结合是重要的周围氨基酸残基的氨基酸序列。简而言之，纤连蛋白被整合素α5β1和αVβ3识别。用于整合素结合的纤连蛋白的一级序列基序是三肽，Arg-Gly-Asp(RGD)，位于连接FN-III10的承力的G-和F-链的环上。进一步参与纤连蛋白与整合素结合的是Pro-His-Ser-Arg-Asn(PHSRN)基序，其位于III型纤连蛋白的第九结构域中。

鼠和人纤连蛋白(FN)的相应氨基酸序列分别以登录号NP_034363.1和NP_997647.1显示。人FN的结构域结构可以例如从Wijelath等2006，Circ.Res.99，853-860的出版物中获得。优选地，纤连蛋白的RGD基序包含SEQ ID NO.11，12或17或由其组成。

优选地，内皮抑制素肽或内皮抑制素衍生肽位于融合蛋白的N末端，并且纤连蛋白的RGD基序和/或PHSRN基序位于C末端。

优选地，这种融合蛋白包含SEQ ID NO：7或13中所示的氨基酸序列。

在另一个优选的实施方案中，融合蛋白还包含如本文所定义的Fc结构域或人工寡聚化结构域。优选地，具有人工寡聚化结构域的融合蛋白包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。优选地，融合蛋白包含Fc结构域和如本文定义的人工寡聚化结构域

基于WO 2013/026913中的先前实验数据，发明人假设寡聚NC-1可通过纤连蛋白(FN)引发其作用。除此之外，在以下实施例中已发现寡聚NC-1和寡聚内皮抑制素结合VEGF和基质金属蛋白酶MMP-2/MMP-9，它们是纤维化发展，癌症进展和转移中细胞外基质重塑的重要参与者。此外，在WO 2013/026913中他们发现在长期暴露(即四次连续体内传代)后对寡聚NC-1(Fc-内皮抑制素)产生抗性的肿瘤中FN显著下调。因此，他们假定FN的丧失可能构成对寡聚NC-1的固有和获得性抗性的关键机制。为了证明这一概念，我们设计了一种最小的肽序列，模仿内皮抑制素(ED)-纤连蛋白复合物的关键作用。为此，发明人首先在整个ED-结构域中选择由27个氨基酸-NH₂-末端区域组成的最具有活性的基序(Tjin Tham Sjin等.2005，Cancer Res.65，3656-63)。发明人的数据表明该区域本身能够结合VEGF，并且该肽序列中的组氨酸(锌结合结构域)可能对VEGF结合至关重要。这是可以想象的，因为其中组氨酸被丙氨酸残基替代的突变肽未能与VEGF-ED-二聚体(Fc-内皮抑制素)结合竞争。另一方面，纤连蛋白含有两个活性基序，其对于其与ITGA5B1的结合是关键的，即PHSRN-和RGD-依赖性基序。为了模拟介导整合素信号传导和NC-1-ED的其他性质的寡聚NC-1和FN的生理复合物，发明人融合了这两个关键基序，即NC-1-ED结构域中的上述最具活性的基序和纤连蛋白的包含“RGD”和对结合重要的周围氨基酸残基的整合素结合基序，并产生称为“超级他汀肽(Superstatin)”的嵌合(或杂合)融合蛋白。对于每种融合蛋白，设计了小鼠和人等同物。使用鼠(C57BL6)LLC(Lewis肺癌)肺癌模型，发明人能够显示鼠超级他汀肽有效抑制肿瘤生长的功效。此外，与对照相比，超级他汀肽显著延长了存活期。相比之下，单独的FN基序在预防肿瘤生长方面没有显示出显著的改善。

鼠(m)超级他汀肽的相应氨基酸序列显示在SEQ ID NO：7中，而人(h)超级他汀肽的相应氨基酸序列显示在SEQ ID NO：13中。超级他汀肽可能是单体。SEQ ID NO：15显示人超级他汀肽氨基酸序列的变体，其由于半胱氨酸置换SEQ ID NO：13中第7位的谷氨酰胺而能够二聚化。将制备含有FN的PHSRN而不是RGD基序的其他构建体，以及通过二硫键结合或Fc区促进超级他汀肽二聚化的构建体，并评价其抗纤维化活性。

在蛋白质寡聚体或肽寡聚体的另一个实施方案中，人胶原18的NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽包含天然或异源寡聚化结构域。

优选地，天然寡聚化结构域是人胶原18的非三螺旋三聚化结构域。

优选地，异源寡聚化结构域是选自由以下各项组成的组的寡聚化结构域：Fc结构域和人工寡聚化结构域。

本文提及的寡聚化结构域可包含人胶原18的非三螺旋三聚化结构域(即缔合结构域)，Fc结构域或人工寡聚化结构域。在一个方面，寡聚化结构域包含天然寡聚化结构域，即人胶原18的非三螺旋三聚化结构域，其负责NC-1结构域的三条链的三聚化。在另一个方面，它包含异源寡聚化结构域，例如，来自抗体或免疫球蛋白的Fc结构域。Fc结构域向如本文所定义NC-1单体，内皮抑制素结构域或内皮抑制素结构域的N端肽赋予二聚体结构，因为Fc结构域本身是二聚体。在第三方面，它包括人工寡聚化结构域，例如，点突变为半胱氨酸导致两个单体之间的二硫键，所述人工寡聚化结构域在结构上和功能上替代如上文提到的天然人NC-1中发现的缔合结构域，或者除了所述缔合结构域或Fc结构域之外也被使用。用于二聚化或寡聚化的其他手段和方法已在本文其他地方描述并且是本领域已知的，包括例如卷曲螺旋，亮氨酸拉链，CovX体技术等，并且包括如本文所用术语“异源寡聚化结构域”或“人工寡聚化结构域”。本发明的范围还包括的是，蛋白质寡聚体的寡聚化结构域包含人胶原18的非三螺旋三聚化结构域和Fc结构域。此外，它可以包含人工寡聚化结构域和Fc结构域。例如，实施例11中使用的二聚体构建体之一包含两个胶原18内皮抑制素结构域。每个内皮抑制素结构域在7位含有单个突变，其中谷氨酰胺被半胱氨酸替代。每个内皮抑制素结构域与具有插入的肠激酶切割位点的免疫球蛋白Fc区连接。在该构建体中，Fc和内皮抑制素通过其相应的二硫键分别二聚化。肠激酶消化该重组蛋白产生Fc二聚体和内皮抑制素二聚体。

优选地，Fc结构域来自IgG或其他免疫球蛋白同种型以及本领域中描述的提供寡聚化和更长半衰期的其他支架构建体；参见，例如，Lo等，Protein Engineering 1998，11，495。例如，在SEQ ID NO：5中显示了鼠Fc结构域。更优选地，Fc结构域来自人IgG，甚至更优选来自人IgG1。特别优选地，人Fc结构域包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列或由其组成。

在另一个优选的实施方案中，Fc结构域是“突起入孔”(knobs-into-holes，KiH)改造的Fc结构域。“突起入孔”是针对抗体的第三恒定结构域的良好验证的异二聚化技术。基本上，该概念依赖于在大多数相互作用发生的两个CH3结构域之间的界面的修饰。将大残基引入一条抗体重链的CH3结构域，并且作用类似于钥匙。在另一条重链中，形成“孔”，其能够容纳这种大残基，模仿锁。得到的异二聚体Fc部分可以通过人工二硫键进一步稳定。在优化异二聚化界面的过程中，使用噬菌体展示文库评估并最终优化各种合理设计，包括空间互补性，KiH，二硫键和在CH3结构域任一侧与相反电荷的残基并置的盐桥。通过引入以下六个突变可以实现产生高于97％的异二聚化的正确重链缔合：“突起”重链中的S354C，T366W和“孔”重链中的Y349C，T366S，L368A，Y407V(Klein等，MAbs.2012Nov 1；4(6)：653-663；Ridgway等，Protein Eng.1996Jul；9(7)：617-21)。此外，具有KiH突变的抗体的性质如(热)稳定性，FcγR结合和效应子功能(例如，ADCC，FcRn结合)和药代动力学(PK)行为不受影响。非共价相互作用以及铰链区中的二硫键驱动组装形成异二聚体并使组合异质性最小化。使用常规方法产生NC-1具有低蛋白质产率。此外，由于形成许多不同的聚集，因此与Fc融合的NC-1的产生也不是一项微不足道的任务。如本领域技术人员所理解的，这种异质性在药物组合物中是不希望的。KiH技术可用于产生作为单体的NC-1并避免形成这种异质聚集(如NC-1二聚体，三聚体，四聚体，五聚体等的混合物)。合适的KiH工程化的Fc结构域描述于例如SEQ ID NO.25，26，28和30。例如，SEQ ID NO：25显示具有“突起”突变S354C/T366W的人IgG1 Fc的氨基酸序列，并且SEQ ID NO：26描述具有“孔”突变Y349C/T366S/L368A/Y407V的人IgG1 Fc的氨基酸序列。

SEQ ID NO：27显示包含通过肠激酶切割位点和接头(从N-至C-末端)融合至具有“突起”突变(S354C/T366W)的人IgG1 Fc的人NC-1的融合蛋白质的氨基酸序列。该融合蛋白能够与具有“孔”突变Y349C/T366S/L368A/Y407V(SEQ ID NO：28)的人IgG1 Fc异二聚化。这种异二聚体如图14B所示。通过肠激酶切割异二聚体导致NC-1单体的产生。然后NC-1单体可用于产生NC-1二聚体或NC-1三聚体。显然，如果要产生单体内皮抑制素，可以使用内皮抑制素而不是NC-1。

SEQ ID NO：29显示融合蛋白的氨基酸序列，所述融合蛋白包含经由接头和肠激酶切割位点(从N-至C-末端)融合至人NC-1的具有“突起”突变(S354C/T366W)的人IgG1 Fc。该融合蛋白能够与具有“孔”突变Y349C/T366S/L368A/Y407V(SEQ ID NO：30)的人IgG1 Fc异二聚化。这种异二聚体如图14A所示。通过肠激酶切割异二聚体导致NC-1单体的产生。显然，如果要产生单体内皮抑制素，可以使用内皮抑制素而不是NC-1。

出于上述原因，“突起入孔”(KiH)改造的Fc结构域特别适用于NC-1单体或内皮抑制素单体的产生。因此，优选人免疫球蛋白的KiH改造的Fc结构域，更优选人IgG1的KiH改造的Fc结构域用于产生本发明的蛋白质寡聚体，肽寡聚体或融合蛋白。

例如，在细胞中一起表达胶原18的NC-1单体和免疫球蛋白的Fc区以及免疫球蛋白的Fc区以避免NC-1的不受控制的聚集。该方法导致形成Fc-Fc二聚体，其中一个Fc与NC-1单体连接。如果在Fc和NC-1单体之间插入蛋白酶(例如凝血酶或肠激酶)可切割的接头，则NC-1单体可以在用相应的蛋白酶切割后从异二聚体释放。类似的方法可用于产生内皮抑制素单体。

在另一个实施方案中，可以适当地省略或突变NC-1结构域中的天然N端缔合区，使得NC-1不再能通过其天然缔合区寡聚化。例如，可以产生一系列重组NC-1结构域，其中天然缔合区随后被减少例如3，5或10个氨基酸残基。然后测试它们的寡聚化性质，以鉴定不再能够通过其天然缔合区寡聚化的NC-1变体。为了测试所述变体的寡聚化性质，可以使用蛋白质印迹分析，免疫沉淀，SDS-PAGE，色谱方法或本领域熟知的其他方法。通过上述方法产生的重组多肽可用于产生本发明的蛋白质寡聚体或融合蛋白，然后可进一步测试其如本文所定义的生物学活性。在另一个实施方案中，通过结构分析(例如计算或3D结构分析如SAPIN)鉴定缔合所需的氨基酸残基，然后通过本领域已知的重组方法进行相应的突变(参见Sambrook和Russell，2001，同上)，这样NC-1就不能再寡聚化了。在另一个实施方案中，可以完全省略NC-1结构域中的天然N端缔合区。如果没有功能性缔合区的NC-1结构域与Fc区融合，则这种单体可用于产生NC-1二聚体，其中二聚化通过Fc区介导。本发明的蛋白质寡聚体可包含至少一个，或两个或更多个人胶原18的NC-1单体，所述单体在天然N端缔合区具有这种改变或缺失，如本文其他地方所定义。

NC-1单体，内皮抑制素结构域或内皮抑制素结构域的N端肽的寡聚化结构域可以是免疫球蛋白的Fc结构域，优选来自IgG1的Fc结构域，或来自IgG1的KiH改造的Fc结构域，这些是如以上所述的。蛋白质寡聚体或肽寡聚体还可含有两个，三个或甚至更多个Fc结构域。在一个方面，如果需要，可以从蛋白质寡聚体或肽寡聚体上切下Fc结构域。例如，可以在NC-1单体或内皮抑制素结构域与蛋白质寡聚体或肽寡聚体中的Fc结构域之间例如通过相应的(多)肽接头插入人工蛋白酶切割位点，例如肠激酶或凝血酶切割位点(参见，例如，Bergers和Javaherian；Lee等；同前；Lo等，1998，Protein Engineering 11(6)，1998，p.495-500)。在被相应蛋白酶切割后，寡聚体从Fc结构域释放。

Fc结构域也可用于纯化和/或检测。此外，Fc结构域改变蛋白质寡聚体的生物学特性，例如循环中的半衰期延长和生物活性的改善，优选抗纤维化，抗血管发生活性和/或抗肿瘤活性的改善。例如，已发现Fc-内皮抑制素融合蛋白能够作为二聚体结合纤连蛋白，而内皮抑制素单体不能结合，如以下实施例所示。此外，Fc-内皮抑制素显示出比内皮抑制素更长的半衰期。

在蛋白质寡聚体或肽寡聚体的另一个优选实施方案中，人工寡聚化结构域包含内皮抑制素结构域第7位的单突变，其中谷氨酰胺被半胱氨酸替代。优选地，如本文所定义的NC-1单体，内皮抑制素结构域或内皮抑制素结构域的N端肽在一些方面包含在内皮抑制素结构域的第7位的谷氨酰胺至半胱氨酸的单突变。例如，已发现融合蛋白中Fc结构域和内皮抑制素结构域之间的重组导入的肠激酶切割位点导致肠激酶切割后形成二聚体，因为内皮抑制素结构域中相邻C7残基之间形成二硫键；参见Kuo 2001，JCB 152，1233和以下实施例。如上所述，与内皮抑制素单体相比，NC-1三聚体和内皮抑制素二聚体具有不同的性质。以上第7位的突变(谷氨酰胺到半胱氨酸)也可以在内皮抑制素的N端肽中引入，已经显示内皮抑制素的N端肽代表内皮抑制素的抗肿瘤结构域(Tjin等.2005，Cancer Res 65，3656)。内皮抑制素结构域的N端肽的寡聚化可以通过如上所述的人工二聚化或简单地通过重组融合至Fc部分而在第7位没有突变来实现。包含在第7位介导二聚化的所述突变的融合蛋白的实例显示在SEQ ID NO：15中。

在蛋白质寡聚体或肽寡聚体的另一个优选实施方案中，铰链区内的重组蛋白酶切割位点是肠激酶或凝血酶切割位点。用肠激酶或凝血酶切割蛋白质寡聚体或肽寡聚体导致内皮抑制素结构域从蛋白质寡聚体或肽寡聚体中释放。

在蛋白质寡聚体或肽寡聚体的另一个优选实施方案中，如本文所定义的NC-1单体仅含有天然存在于铰链区内的蛋白酶切割位点，即它不包含重组蛋白酶切割位点。在这种情况下，铰链区可以例如被如本文其他地方所述的MMP切割，以从NC-1单体释放例如内皮抑制素结构域。另一方面，可突变NC-1单体的铰链区中的这些天然存在的蛋白酶切割位点，使得NC-1单体不再被所述蛋白酶切割。以这种方式，例如，蛋白质寡聚体的半衰期，抗纤维化，抗血管生成和/或抗肿瘤活性仍可得到改善。

在蛋白质寡聚体或肽寡聚体的另一个优选实施方案中，寡聚体是二聚体或三聚体。然而，蛋白质寡聚体或肽寡聚体所涵盖的还有四聚体或五聚体或具有甚至更多个NC-1单体、内皮抑制素结构域或内皮抑制素结构域的N端肽的寡聚体，这些如本文所定义。

包含蛋白质寡聚体或肽寡聚体作为药物活性化合物的药物组合物可以治疗有效剂量用于非人类或优选人类治疗纤维化或纤维化相关疾病。本发明的药物组合物还可用于治疗血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病。本文提及的“受试者”优选是患有纤维化或纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病的人。

优选地，所述纤维化或纤维化相关疾病优选选自由以下各项组成的组：皮肤纤维化，优选硬皮病；瘢痕疙瘩；增生性瘢痕；硬斑病；移植物抗宿主病引起的纤维化；上皮下纤维化；心内膜心肌纤维化；子宫纤维化；骨髓纤维化；腹膜后纤维化；肾源性系统性纤维化；手术后结瘢；哮喘；肝硬化/肝纤维化；异常伤口愈合导致的纤维化；肾小球肾炎；多灶性纤维硬化；辐射诱发的纤维化(作为刺激诱发的纤维化的实例)，优选辐射诱发的肺炎或辐射诱发的肺纤维化；化疗诱发的或药物诱发的纤维化，例如，mTOR或EGFR激酶抑制所致的纤维化；常见或特发性肺纤维化(作为特发性纤维化的实例)；自身免疫疾病例如狼疮所致的纤维化，肿瘤内和癌症相关的纤维化/纤维发生，慢性炎症后的器官纤维化(例如通过病毒刺激或移植)；作为慢性肾病，长期透析或糖尿病的终末期的器官纤维化。

优选地，所述血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病选自由以下各项组成的组：取决于VEGF水平失调的良性病理生理学病症(例如湿性黄斑变性，子宫内膜异位症，支气管哮喘和糖尿病，增强的VEGF诱导的血管通透性(例如脑组织辐照后增强的通透性，“放射性坏死”)，血管紧张的改变(例如高血压)，类风湿性关节炎)，以及恶性VEGF相关疾病(例如肾细胞癌和其他VEGF成瘾性肿瘤，VEGF依赖性腹水发展，VEGF依赖性免疫系统抑制，例如源自骨髓的细胞(BMDC)，源自骨髓的抑制细胞(MdSC)，或未成熟树突细胞的募集和微环境训练)。

优选地，所述基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病选自由以下各项组成的组：良性和恶性疾病，其中MMP激活化促成病理生理学，例如，在局部治疗失败率高的肿瘤(例如胶质母细胞瘤，胰腺癌，肺癌)中固有地明显的局部肿瘤侵入和癌症转移过程期间MMP的激活，以及由治疗诱导选择压力(例如肿瘤缺氧和放疗后纤维化)，自身免疫疾病和慢性炎性疾病中的明显免疫反应导致的获得性增强的MMP激活。

在一个方面，蛋白质寡聚体或肽寡聚体可以以液体或冻干形式存在。在一个方面，蛋白质寡聚体或肽寡聚体可以与甘油，蛋白质稳定剂(例如人血清白蛋白(HSA))或非蛋白质稳定剂一起存在。

蛋白质寡聚体或肽寡聚体是药物组合物或药物的活性成分(两个术语可互换使用)，并且在一个方面，以通过根据常规程序将药物与标准药物载体组合制备的常规剂型施用。这些程序可以涉及混合、制粒和压缩或溶解适合所需制剂的成分。应该理解的是，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征取决于与其组合的活性成分的量、给药途径和其他众所周知的变量。

载体在与配制品的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上必须是可接受的。所用的药物载体可以包括固体、凝胶或液体。固体载体的实例是乳糖、白土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。液体载体的实例是磷酸盐缓冲盐溶液、糖浆、油、水、乳剂、各种类型的润湿剂等。类似地，载体或稀释剂可以包括本领域公知的延时材料，如单独的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯或与蜡一起。所述合适的载体包括上面提到的那些和本领域公知的其他载体，参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。

选择稀释剂以便不影响药物组合物的生物活性，优选抗纤维化活性，抗血管发生活性，抗侵入/抗转移活性，降低血管通透性活性，抗炎和/或抗肿瘤发生活性。这些稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液(Ringer′s solution)、葡萄糖溶液和汉克氏溶液(Hank′s solution)。此外，药物组合物或配制品还可包括其他载体，佐剂或无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。

蛋白质寡聚体或肽寡聚体优选配制成药物组合物，其可以通过标准途径施用。通常，药物组合物可以通过局部，透皮，腹膜内，颅内/鞘内，玻璃体内，脑室内，脑内，阴道内，子宫内，口服，直肠或肠胃外(例如静脉内，脊柱内，皮下或肌肉内)途径施用。

优选地，蛋白质寡聚体或肽寡聚体通过静脉内，皮下，颅内/鞘内，玻璃体内或腹膜内施用。

治疗有效剂量是指用于药物组合物中的蛋白质寡聚体或肽寡聚体的量，所述量预防，改善或治疗伴随本说明书中提及的疾病的症状。所述化合物的治疗功效和毒性可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序，例如ED50(50％群体中治疗有效的剂量)和LD50(50％群体致死剂量)来确定。治疗和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为比率LD50/ED50。

剂量方案将由主治医师和其他临床因素确定。如在医学领域中众所周知的，任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者体型、体表面积、年龄、待给药的具体化合物、性别、给药时间和途径、一般健康状况和其他药物同时施用。可以通过定期评估来监测进展情况。

优选地，蛋白质寡聚体或肽寡聚体以约1至100mg/kg的浓度施用。更优选地，浓度为约5至75mg/kg或约10至50mg/kg，最优选约15mg/kg。甚至更优选地，蛋白质寡聚体或肽寡聚体以0.1-1mg/kg/天的浓度施用。

本文提及的药物或药物组合物至少施用一次，以治疗或改善或预防本说明书中所述的疾病。然而，所述药物可以施用一次以上，例如，两次，三次，四次，五次，六次或甚至更频繁地施用。

具体的药物组合物以药学领域熟知的方式制备，并包含与药学上可接受的载体或稀释剂混合的或以其他方式关联的至少一种上文提及的活性化合物。为了制备这些具体的药物组合物，通常将活性化合物与载体或稀释剂混合。所得配制品应适合于施用方式。剂量建议应在开处方者或使用者说明书中说明，以便根据所考虑的接受者预测剂量调整。

在本发明的另一方面，药物组合物可包含除蛋白质寡聚体外的药物，其在药剂配制过程中加入药剂中。例如，它可以与组合方案中的血管抑素一起使用。此外，另一方面设想了与最近批准的纤维化调节剂如VEGF/PDFG RTKi(例如Nindetanib)，TGF-β信号传导的特异性和非特异性抑制剂(Perfinidone)和整合素信号传导的调节剂(西仑吉肽，或抗αV阿比珠单抗)或炎症的调节剂(白细胞浸润，细胞因子抑制剂，抗亚群的抗体)的组合。除了蛋白质寡聚体或肽寡聚体之外，还可以使用的治疗血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病的药物包括血管通透性(例如脑组织辐照后增强的通透性，“放射性坏死”)和血管紧张的其他调节剂(如内皮素拮抗剂马西替坦(macitentan)，AT1/ACE抑制剂)，哮喘中的β2-拟交感神经药和皮质激素，慢性炎症/自身免疫疾病中的免疫抑制剂，针对不同VEGF依赖性肿瘤和腹水的化疗和放疗，在例如肾细胞癌中使用的激酶抑制剂(mTORi，例如RAD001，多激酶抑制剂帕唑帕尼/西尼替尼/阿西替尼，免疫调节剂，例如检查点抑制剂抗PD-1/PD-11)。除了蛋白质寡聚体或肽寡聚体之外，还可以使用的治疗基质金属蛋白酶相关疾病的药物包括例如具有高局部区域治疗失败率的经放(化)疗的局部侵入性肿瘤，如胶质母细胞瘤，胰腺癌，抗炎和免疫抑制疗法(抗TNFα抗体/英夫利昔单抗，霉酚酸，环磷酰胺等)，癌症治疗后肿瘤侵入或假性进展，例如复发性胶质瘤中的抗血管生成疗法，具有高MMP-2/MMP-9活性的转移性疾病(例如乳腺癌)的治疗(即激素疗法他莫昔芬，HER2+疾病中的曲妥珠单抗，化疗)。

因此，在蛋白质寡聚体或肽寡聚体的优选实施方案中，所述寡聚体还包含血管抑素(US 8,206,718)。在具体的实施方案中，血管抑素是Fc-血管抑素或血管抑素-Fc融合蛋白，优选人融合蛋白。

应理解，药物组合物的配制品在GMP标准化条件等下进行，以确保药剂的质量，药物安全性和有效性。

如上所述，优选蛋白质寡聚体，肽寡聚体和融合蛋白是人序列或由人序列组成。

本发明还涉及蛋白质寡聚体，其包含(i)至少两个人胶原18的NC-1单体或(ii)至少两个胶原18的内皮抑制素结构域或(iii)至少两个胶原18内皮抑制素结构域的N端肽，其用于检测和/或诊断纤维化或纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶相关疾病。

关于蛋白质寡聚体或肽寡聚体的医学用途提供的定义和实施方案经必要的变更适用于本发明的诊断应用和用途。

本文所用的术语“检测”是指在受试者中发现或确定纤维化或纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶相关疾病的存有或存在。

本说明书中提及的术语“诊断”是指通过检查在受试者中识别纤维化或纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶相关疾病。这里使用的诊断应理解为医学诊断，其指的是试图确定或鉴定可能的疾病的过程和在这种意义上的诊断也可以被称为(医学)诊断程序，并且通过所述程序达到的意见被称为(医学)诊断意见。

在受试者中检测和诊断纤维化或纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶相关疾病可以通过本领域已知的方法进行，例如计算机断层扫描(例如，高分辨率计算机断层扫描)，超声波，血液分析(例如血气分析，酸碱平衡)，生物标志物分析，例如蛋白酶(MMP)，生长因子和/或细胞因子，组织病理学(胶原沉积，炎症应答标志物)，临床试验(器官功能，例如限制性肺病试验FEVl等，器官功能障碍)，细胞试验，侵入性(外科活检)和非侵入性试验，其他侵入性和非侵入性检查，例如MRI，PET/CT以及类似其他或其组合(参见，例如，Raghu等.2011，Am.J.Respir.Crit.Care Med.183，p.788-824)。

例如，特发性肺纤维化(IPF)的诊断准确性随着临床，放射学和组织病理学相关性而增加，并且可以通过该领域的有经验的临床专家的多学科讨论来完成。

对于检测和/或诊断纤维化或纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶相关疾病，人胶原18的NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽可以用放射性同位素，与螯合物如DTPA结合的放射性核素，荧光蛋白或本文其他地方描述的其他标记物进行标记。

例如，人超级他汀肽(SEQ ID NO：13)可以与络合剂1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(也称为DOTA)缀合，DOTA提供能力将肽与例如镓(⁶⁸Ga)的放射性核素缀合用于非侵入性成像(正电子发射断层扫描，PET)。体内PET成像评估了超级他汀肽-DOTA作为诊断纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶相关疾病的药剂的潜力。

因此，优选地，人超级他汀肽肽(SEQ ID NO：13)与络合剂1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(也称为DOTA)缀合。

本发明还涉及融合蛋白，其包含至少一个胶原18的NC-1结构域，至少一个胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽，其用于诊断，预防，治疗或改善纤维化或纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶相关疾病。

关于蛋白质寡聚体或肽寡聚体的医学用途提供的定义和实施方案经必要的变更适用于本发明的融合蛋白的治疗或诊断应用和用途。

合适的和优选的蛋白质寡聚体，融合蛋白，胶原18的NC-1结构域，胶原18的内皮抑制素结构域和胶原18内皮抑制素结构域的N端肽在本文别处定义并显示在附图和实施例中。优选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：3，4，7，9，10，13，15，18，19，20，22，27或29，或Tjin等(同上)或US 7,524,811中描述的胶原18内皮抑制素结构域的N端肽。优选的Fc序列描述于SEQ ID NO.6，24，25，26，28或30中。

需要本发明的融合蛋白能够通过本文其他地方定义的寡聚化结构域二聚化或寡聚化。如本文其他地方所述，该二聚化或寡聚化是融合蛋白与纤连蛋白，VEGF，整合素，MMP-2和MMP-9结合的先决条件，并且是可能进一步结合迄今尚未揭示的配偶体的先决条件。优选地，寡聚化结构域是Fc结构域(优选来自或衍生自IgG，更优选人IgG，甚至更优选人IgG1)和/或人工寡聚化结构域，如本文其他地方所述的。此外，融合蛋白优选具有抗纤维化活性，抗炎，抗侵入/转移，降低血管通透性，抗血管发生活性和/或抗肿瘤发生活性。还优选融合蛋白包含一个或多个本发明说明书中定义的纤连蛋白的RGD基序和/或PHSRN基序。进一步优选融合蛋白是人。

本发明进一步描述了编码NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽的多核苷酸，并且涉及编码本发明的融合蛋白的多核苷酸。

如本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指单链或双链DNA分子以及RNA分子。所述术语包括基因组DNA，cDNA，hnRNA，mRNA以及这些分子种类的所有天然存在的或人工修饰的衍生物。多核苷酸在一个方面可以是线性或环状分子。此外，除了编码NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽或包含所述单体或肽的融合蛋白的核酸序列外，多核苷酸还可以包含额外的正确转录和/或翻译所需的序列，例如5′-或3′-UTR序列。鉴于遗传密码的简并性，优化的密码子可用于编码NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽或包含所述单体或肽的融合蛋白的核酸序列。由此，可以实现例如宿主细胞中的最佳表达。

应当理解，本发明还包括NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽的特定氨基酸序列或编码它们的核酸序列的变体，只要这些变体序列还允许形成蛋白质寡聚体或肽寡聚体。所述变体优选具有抗纤维化活性，并且还可具有本文其他地方所定义的抗血管生成和/或抗肿瘤活性。在一个方面，本文使用的序列变体与前面指定的特定氨基酸序列或特定核酸序列的不同之处在于一个或多个氨基酸或核苷酸置换，添加和/或缺失。在另一方面，所述变体序列与NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽的特定核酸序列或氨基酸序列在整个长度上或在特定序列长度的至少一半长度上为至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，与至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同。优选地，所述变体序列与人NC-1单体或SEQ ID NO：4所示的结构域或者小鼠NC-1单体或如SEQ ID NO：3所示的结构域的特定氨基酸序列在整个长度上为至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93的％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同。还优选所述变体序列与SEQ ID NO：7，9，10，13，15，18，19，20，22，27或29在整个长度上为至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同。本文所用的术语“相同”是指序列同一性，其特征在于确定序列之间相同氨基酸的数目，其中序列对齐以获得最高级匹配。它可以使用在计算机程序中编码的公开技术或方法计算，例如BLASTP或FASTA(Altschul 1990，J Mol Biol215，403)。在一个方面，同一性百分比值是在整个氨基酸序列上或在查询序列的至少50％的序列段上计算的。基于各种算法的一系列程序可供技术人员用于比较不同的序列。在这种情况下，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法给出了特别可靠的结果。为了进行序列比对，可以使用程序PileUp(Higgins 1989，CABIOS 5，151)或程序Gap和BestFit(Needleman 1970，J Mol Biol 48；443；Smith 1981，Adv Appl Math 2，482)，它们是GCG软件包(Genetics Computer Group 1991，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)的部分。在本发明的另一个方面，在整个序列区域上使用具有以下设置的程序GAP确定以百分比(％)表述的序列同一性值：缺口权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000和平均不匹配：0.000，除非另有说明，否则应始终用作序列比对的标准设置。

本发明进一步描述了载体，其包含编码NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽或包含所述单体，结构域或肽的融合蛋白的多核苷酸。

优选地，载体是表达载体。

术语“载体”优选包括噬菌体，质粒，病毒或逆转录病毒载体以及人工染色体，例如细菌或酵母人工染色体。此外，该术语还涉及靶向构建体，其允许靶向构建体随机或定点整合到基因组DNA中。在一个方面，此类靶构建体包含用于如下文详细描述的同源或异源重组的足够长度的DNA。在一个方面，包含所提及的多核苷酸的载体还包含用于在宿主细胞中繁殖和/或选择的选择标记。载体可以通过本领域熟知的各种技术结合到宿主细胞中。例如，质粒载体可以在沉淀物(例如磷酸钙沉淀物或氯化铷沉淀物)中引入，或者与带电荷的脂质形成复合物或者在基于碳的簇中(例如富勒烯)中引入。或者，可以通过热休克或电穿孔技术引入质粒载体。如果载体是病毒，可以在应用于宿主细胞之前使用合适的包装细胞系在体外包装。逆转录病毒载体可以是复制型或复制缺陷型。在后一种情况下，病毒繁殖通常仅在互补宿主/细胞中发生。

此外，在一个方面，上述多核苷酸与表达控制序列有效地连接，从而允许在所述载体中的原核或真核宿主细胞或其分离的部分中表达。因此，在一个方面，载体是表达载体。多核苷酸的表达包括将多核苷酸转录成可翻译的mRNA。确保在宿主细胞中表达的调节元件是本领域熟知的。在一个方面，它们包含确保转录起始的调节序列和/或确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。其他调节元件可包括转录增强子和翻译增强子。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调节元件包括例如大肠杆菌中的lac-，trp-或tac-启动子，并且允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的实例是酵母中的AOXl-或GAL1-启动子，或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-，SV40-，RSV-启动子(劳氏肉瘤病毒)，CMV-增强子，SV40-增强子或珠蛋白内含子。此外，诱导型表达控制序列可用于表达载体。此类诱导型载体可包含tet或lac操纵子序列或可通过热休克或其他环境因素诱导的序列。合适的表达控制序列是本领域熟知的。除了负责转录起始的元件之外，这些调节元件还可以包含转录终止信号，例如多核苷酸下游的SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。在本文中，合适的表达载体是本领域已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)，pBluescript(Stratagene)，pCDM8，pRc/CMV，pcDNAl，pcDNA3(Invitrogen)或pSPORT1(Invitrogen)。优选地，所述载体是表达载体和基因转移或靶向载体。衍生自病毒如逆转录病毒，痘苗病毒，腺相关病毒，疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于将多核苷酸或载体递送到靶细胞群中。可以使用本领域技术人员熟知的方法构建重组病毒载体；参见，例如，Sambrook，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)N.Y.and Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and WileyInterscience，N.Y.(1994)中描述的技术。

本发明进一步描述了宿主细胞，其包含编码NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽或包含所述单体或肽的融合蛋白的多核苷酸，或含有这种多核苷酸的载体。

如本文所用的术语“宿主细胞”包括原核和真核宿主细胞。在一个方面，宿主细胞是细菌细胞。在一个方面，所述细菌宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞。这种细菌宿主细胞可用于例如复制所提及的多核苷酸或载体。

在一个方面，真核宿主细胞是包含对NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽，或包含所述单体、结构域或肽的融合蛋白，或载体进行编码的多核苷酸的细胞，其中所述多核苷酸或载体在宿主细胞中表达以产生蛋白质或肽或其寡聚体。可以将多核苷酸瞬时或稳定地引入宿主细胞中。在一个方面，真核宿主细胞可以是稳定表达多核苷酸的真核宿主细胞系的细胞。另一方面，宿主细胞是真核宿主细胞，其已被多核苷酸或载体瞬时转染并表达多核苷酸。在另一个方面，所述细胞是经遗传改造以产生蛋白质或肽的细胞。如何通过分子生物学技术对这些细胞进行遗传改造是本领域技术人员公知的。

本发明还涉及包含本发明的蛋白质寡聚体或融合蛋白的试剂盒。

如本文所用的术语“试剂盒”是指本发明的蛋白质寡聚体或融合蛋白的集合，其可以包装或不包装在一起。如本文其他地方所解释的，需要融合蛋白能够寡聚化。该试剂盒可以包括用于配制本发明的蛋白质寡聚体或融合蛋白作为药物或诊断组合物的其他组分。试剂盒的组分可以由单独的小瓶(即作为单独部分的试剂盒)包含或提供在单个小瓶中。此外，应理解，本发明的试剂盒用于治疗或诊断上文提到的疾病。在一个方面，设想所有组分以即用方式提供，用于实施本文提及的治疗或诊断用途。在另一方面，该试剂盒包含用于实施所述用途的说明书。说明书可以由纸质或电子形式的用户手册提供。

本发明还涉及本发明的蛋白质寡聚体或融合蛋白用于产生和优选改善模拟NC1的药物组合物的用途。

此外，本发明涉及本发明的蛋白质寡聚体或融合蛋白用于开发用于治疗或诊断如本文所定义的纤维化相关疾病，VEGF相关疾病或MMP相关疾病的NC1-拟似物或寡聚内皮抑制素拟似物的用途。

最后，本发明涉及本发明的蛋白质寡聚体或融合蛋白用于开发用于调节纤连蛋白功能的NC1-拟似物或寡聚内皮抑制素拟似物的用途。

本文其他地方已经解释了拟似物应理解的内容。

纤连蛋白(FN)是一种多效分子，在基质重塑，免疫应答，侵入和上皮-间质转化中具有许多活性和结合配偶体。越多理解本发明的寡聚体如何与纤连蛋白功能相互作用，这些功能就能被越具体地靶向。例如，如果本发明的蛋白质寡聚体与VEGF一样结合FN(肝素结合位点II)的相同肝素结合位点，则可以分析如果FN被捕获用于VEGF结合的含义是什么，或者结合整合素或MMP的效果是什么。FN产生许多由NC1差异调节的效果。关于这些调节的知识越多，它们就能更好地通过NC-1以自然方式被靶向。

用于本发明的医学和诊断用途的特别优选的蛋白质寡聚体，肽寡聚体和融合蛋白描述于附图和实施例中。

序列

序列显示：

SEQ ID NO：1：鼠胶原18

SEQ ID NO：2：人胶原18

SEQ ID NO：3：鼠胶原18的NC-1结构域

SEQ ID NO：4：人胶原18的NC-1结构域

SEQ ID NO：5：鼠Fc结构域

SEQ ID NO：6：人Fc结构域

SEQ ID NO：7：鼠超级他汀肽

SEQ ID NO：8：鼠纤连蛋白基序

SEQ ID NO：9：鼠N端锌结合结构域内皮抑制素

SEQ ID NO：10：人N端锌结合结构域内皮抑制素

SEQ ID NO：11：鼠RGD基序

SEQ ID NO：12：人RGD基序

SEQ ID NO：13：人超级他汀肽

SEQ ID NO：14：人超级他汀肽，其中第1位和第3位的His被Ala替代

SEQ ID NO：15：人超级他汀肽，其中在第7位的Gln被Cys替代

SEQ ID NO：16：人超级他汀肽，其中“RGD”基序被“RAD”基序替代

SEQ ID NO：17：鼠纤连蛋白的整合素结合基序

SEQ ID NO：18：m内皮抑制素(鼠)

SEQ ID NO：19：h内皮抑制素(人)

SEQ ID NO：20：mP1肽(鼠；N端)

SEQ ID NO：21：内皮抑制素的E4肽(人；C端)

SEQ ID NO：22：内皮抑制素的hP1肽(人；N端)

SEQ ID NO：23：肠激酶切割位点

SEQ ID NO：24：野生型人IgG1的Fc序列

SEQ ID NO：25：Fc序列“突起”人IgG1 Fc：S354C/T366W

SEQ ID NO：26：Fc序列“孔”人IgG1 Fc Y349C/T366S/L368A/Y407V

SEQ ID NO：27：具有“突起”突变(S354C/T366W)的NC-1-肠激酶位点-接头-人IgG1Fc

SEQ ID NO：28：具有“孔”突变Y349C/T366S/L368A/Y407V的人IgG1 Fc

SEQ ID NO：29：具有“突起”突变(S354C/T366W)的人IgG1 Fc-接头-肠激酶位点-NC-1

SEQ ID NO：30：具有“孔”突变Y349C/T366S/L368A/Y407V的人IgG1 Fc

SEQ ID NO：1-17也描述于WO 2013/026913中，其公开内容通过引用并入本文。人纤连蛋白的氨基酸序列以UniProt登录号P02751显示。人基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的氨基酸序列以UniProt登录号P08253显示。人基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的氨基酸序列以UniProt登录号P14780显示。人血管内皮生长因子(VEGF-A)的氨基酸序列以UniProt登录号P15692显示。肠激酶的识别和切割位点以及适当接头区描述于例如Lo等，1998，ProteinEngineering 11(6)，1998，p.495-500中。

附图

附图显示：

图1.胶原XVIII和Fc-内皮抑制素的拓扑结构以及不同组织中内皮抑制素分子的生理学大小。(A)胶原XVIII的结构由信号肽，卷曲结构域，三螺旋重复，NC1结构域组成。ES基序在NC1的背景下是生理学上的三聚体。(B)两个ES结构域合成至IgG Fc结构域的示意图。(C，D)通过免疫印迹在小鼠脑，骨骼肌，心脏，肾，睾丸和肝组织提取物和血清中发现内皮抑制素的含量。图像再现自Kuo，C.J.等，Oligomerization-dependent regulation ofmotility and morphogenesis by the collagen X VIII N C1/endostatin domain.JCell Biol，2001.152(6)：p.1233-46.；Sasaki，T.，等，Structure，function and tissueforms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing theangiogenesis inhibitor endostatin.EMBO J，1998.17(15)：p.4249-56.]。

图2.内皮抑制素，N端肽(mP1)和(hP1)和C端E4(CE4)肽的序列。

图3.在Fc-Endo和mP1处理后减少辐射诱发的肺纤维化发展。(A)在照射后24周的终点处对照组和治疗组的微CT成像。在接受假光子照射(X-20Gy)的小鼠中发现大量纤维化，肺中留有有限的有效通气空间。在CE4处理后(CE4+X)，在经辐射的肺中间质纤维化也是显著的。在用mP1-Endo(mP1+X)处理的和特别是Fc-Endo处理的小鼠(Fc-Endo+X)中经辐射的肺中发现了明显的肺实质。(B)定量临床CT测量分别发现Fc-Endo+X和mP1-Endo+X组的平均肺密度(MLD)以及总肺容量(LV)损失显著降低。(C)与仅用IR的组(X20Gy)相比，Fc-Endo+X和mP1-Endo+X处理组的纤维化指数(FI)显著降低。CE4-Endo+X处理和仅用IR的组之间没有统计学差异。(D)对于Fc-Endo+X和mP1-Endo+X组，发现了很大的存活益处，但是对于CE4+X处理组没有(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，ns＝无统计学显著性)。

图4.在经辐射的肺中Fc-Endo和mP1-Endo处理后改善的临床参数和病理组织学表现。(A，B)在照射后在24周的结束点在仅IR(X-20Gy)组中，血气分析表明血液中的二氧化碳(pCO₂)的分压增加，pH水平降低(酸中毒)。用Fc-Endo+X或mP1-Endo+X处理的小鼠的PCO₂和pH水平显著改善。(C)含有内皮抑制素多肽片段的所有处理组在体重增加方面受益。其中，发现Fc-Endo具有最显著的改善。(D)Fc-Endo+X和mP1-Endo+X处理组中的组织病理学检查证实的炎症和纤维化显著减少。(E)未经辐射的Fc-Endo，mP1-Endo和CE4-Endo处理组之间未发现组织病理学差异(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。

图5.Fc-Endo+X处理后的M2极化，基因和蛋白质表达。(A)Fc-Endo+X处理抑制ECM蛋白的转录特征。(B)还发现Fc-Endo减弱辐射诱发的促纤维化M2巨噬细胞极化。(C)Fc-Endo处理逆转辐射诱发的FGF2-和CD31表达的丧失。相反，相比于X20Gy处理Fc-Endo+X增加了抗纤维化HGF的表达。(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001).

图6.Fc-Endo在高LET照射后减少纤维化。(A)在照射后24周的终点处的微CT成像。在用碳离子12.5Gy(C12.5)照射的小鼠中发现了大量纤维化，肺中留有有限的有效通气空间。然而，在用Fc-Endo+C12.5处理的小鼠中肺结构保存良好。(B)定量临床CT测量显示相比于C12.5组，Fc-Endo+C12.5组的平均肺密度(MLD)以及总肺容量(LV)损失显著降低。(C)Fc-Endo+C12.5治疗组的纤维化指数(FI)显著低于单独的C12.5组的FI。(D)病理组织学检查证实相比于单独碳照射，Fc-Endo+C12.5后的炎症和纤维化显著减少(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。

图7.碳离子照射后Fc-Endo处理抑制纤维化的相关证据。(A)还发现Fc-Endo减弱促纤维化M2巨噬细胞浸润。(B)Fc-Endo降低了促纤维化FGF2的表达。(C)Fc-Endo增加抗纤维化HGF的表达。(D)Fc-Endo逆转内皮标记物CD31的丧失。(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001).

图8.通过碳离子照射(在SOBP的碳离子12.5Gy)的精确小鼠胸照射的示范。(A)将小鼠固定在专门设计的胸照射支架上。(B)通过入口和出口膜(Kodak EDR2)验证，肺中的颗粒剂量是均匀的。(C)照射后立即进行PET/CT光束验证，确认肺部区域有精确的剂量沉积。呼吸运动也被考虑在内。

图9.纤连蛋白与寡聚内皮抑制素的结合。NC1和内皮抑制素(ES)二聚体(但不是单体)与纤连蛋白(FN)的排他性结合。用人纤连蛋白包被Elisa板。用BSA封闭后，内皮抑制素单体，二聚体和NC1用作指定浓度的配体。为了检测与纤连蛋白结合的内皮抑制素，使用抗内皮抑制素抗体。

图10.VEGF与寡聚内皮抑制素的结合。NC1和内皮抑制素(ES)二聚体(但不是内皮抑制素单体)与血管内皮生长因子(VEGF)的排他性结合。用人VEGF包被Elisa板。用BSA封闭后，内皮抑制素单体，二聚体和NC1用作指定浓度的配体。为了检测与VEGF结合的内皮抑制素，使用抗内皮抑制素抗体。

图11.MMP-2/9与寡聚内皮抑制素的结合。NCl，内皮抑制素(ES)二聚体和Fc-内皮抑制素(Fc部分上的二聚化)分别与MMP-2(A)和MMP-9(B)结合。相反，内皮抑制素单体显示出与MMP的弱结合。Elisa板分别用人MMP-2或MMP-9包被。用BSA封闭后，内皮抑制素(ES)单体，内皮抑制素(ES)二聚体，Fc-内皮抑制素(Fc-ES)，Fc-对照(Fc)和NC1用作指定浓度的配体。为了检测与MMP结合的内皮抑制素，使用抗内皮抑制素抗体。

图12.肠激酶将Fc-内皮抑制素(人FcE)消化成内皮抑制素单体和Fc-二聚体后，二聚体内皮抑制素与MMP-2和纤连蛋白结合的丧失。(A)通过肠激酶消化hFcE的SDS-聚丙烯酰胺电泳。泳道1(蛋白质标记)。泳道2：hFcE。泳道3；在用肠激酶消化后，上带是Fc-二聚体，下带是消化后的内皮抑制素单体。2和3中的样品处于非还原条件下。泳道5：hFcE。泳道6：消化后的上带Fc和下带内皮抑制素单体。泳道5和6在还原条件下进行。(B)如上所述的Elisa测定法分别检测二聚体内皮抑制素(FcE)与纤连蛋白和MMP-2的结合。注意，肠激酶消化产生单体内皮抑制素和二聚体Fc，使得与两种候选靶分子的结合显著降低。

图13.用于本发明的蛋白质寡聚体的示意图。(A)包含N端同二聚体Fc融合构建体的蛋白质寡聚体。野生型人IgG1 Fc通过蛋白酶可切割的接头与NC-1或内皮抑制素的N末端融合。(B)包含C端同二聚体Fc融合构建体的蛋白质寡聚体。野生型人IgG1 Fc通过蛋白酶可切割的接头与NC-1或内皮抑制素的C末端融合。

图14.“突起入孔”(KiH)-改造的NC-1-Fc或内皮抑制素-Fc融合构建体(A)异二聚体，其包含通过蛋白酶可切割的接头与NC-1或内皮抑制素的N末端融合的具有“突起”突变的人IgG1 Fc，以及具有“孔”突变的人IgG1 Fc。(B)异二聚体，其包含通过蛋白酶可切割的接头与NC-1或内皮抑制素的C末端融合的具有“突起”突变的人IgG1 Fc，以及具有“孔”突变的人IgG1 Fc。

现在将通过实施例说明本发明，但是，这些实施例不应解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：内皮抑制素

Fc-内皮抑制素(Fc-Endo)是内皮抑制素与人IgG的Fc区的融合蛋白。它显示出相对于内皮抑制素显著改善的药代动力学和生物学效力[Lee，T.Y.，等，Linking antibodyFc domain to endostatin significantly improves endostatin half-life andefficacy.Clin Cancer Res，2008.14(5)：p.1487-93]。此外，Fc-内皮抑制素中两个内皮抑制素单体分子与的IgG Fc结构域的融合导致分子的合成二聚化(图1B)。有趣的是，先前已显示内皮抑制素的寡聚化赋予分子额外的性质[Sudhakar，A.，等，Human tumstatin andhuman endostatin exhibit distinct antiangiogenic activities mediated by alphav beta 3and alpha 5beta 1 integrins.Proc Natl Acad Sci U S A，2003.100(8)：p.4766-71]。值得注意的是，胶原18(NC-1)的天然非胶原区域由分别在蛋白酶敏感的铰链和三聚区域上连接的三个内皮抑制素单体组成(图1A)。因此，单体内皮抑制素可被认为是原始三聚体分子的最终蛋白水解片段。实际上，在不同组织和血清中生理学上发现了比单体内皮抑制素更大的片段(图1C)。在相同的上下文中，发明人已经显示寡聚化是Fc-内皮抑制素和NC-1与纤连蛋白(FN)结合的先决条件，而内皮抑制素单体不结合FN(WO 2013/026913)。FN被认为是纤维化发病机制中的关键参与者，导致广泛的下游和相关的促纤维化信号传导级联反应。例如，据报道FN结合整合素α5(ITGA5B)和αvβ₃[Torres，P.H.，G.L.Sousa，和P.G.Pascutti，Structural analysis of the N-terminal fragment ofthe antiangiogenic protein endostatin：a molecular dynamics study.Proteins，2011.79(9)：p.2684-92]，其与促纤维化有关。因此，内皮抑制素例如通过Fc-内皮抑制素的寡聚化可对其多效性功能有影响。

Yamaguchi等报道，内皮抑制素通过其C端结构域(E4肽)引起抗纤维化作用[Yamaguchi，Y.，等，A peptide derived from endostatin ameliorates organfibrosis.Sci Transl Med，2012.4(136)：p.136ra71]。然而，锌结合结构域先前已被限制在N末端(内皮抑制素mP1肽)，并且对于该分子的许多功能是至关重要的[Tjin，R.M.，等，A27-amino-acid synthetic peptide corresponding to the NH2-terminal zinc-binding domain of endostatin is responsible for its antitumor activity.CancerResearch，2005.65(9)：p.3656-3663]。在以下实施例中，发明人旨在更好地理解寡聚化(Fc-内皮抑制素)以及内皮抑制素的N端片段相比于C端片段(N端内皮抑制素肽mP1，SEQ IDNO：20；C端内皮抑制素肽E4或CE4，SEQ ID NO：21)对调节辐射诱发的肺纤维化的影响。

实施例2：内皮抑制素施用

用mFc-内皮抑制素(如SEQ ID NO：18所示的鼠内皮抑制素与鼠免疫球蛋白γ-2a链的Fc片段融合，如Bergers等，Science 284(5415)，p.808-812，1999中所述)处理小鼠，所述处理是从照射前3天直到试验结束，每5天皮下递送100μg/小鼠的剂量。同时，内皮抑制素肽组除了放射之外还以100μg/小鼠/b.i.的剂量皮下施用mP1内皮抑制素(N末端；SEQ IDNO：20)或E4(或CE4)肽(C末端；SEQ ID NO：21；参见Yamaguchi，Y.，等，A peptide derivedfrom endostatin ameliorates organ fibrosis.Sci Transl Med，2012.4(136)：p.136ra71)。对照组仅用PBS，mFc-内皮抑制素，mP1内皮抑制素或E4肽处理，并且未接受照射。

实施例3：光子照射和高LET碳照射

如前所述进行修改来执行全胸照射(Abdollahi，J.Exp.Med.2005，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15781583)。

将全胸照射施用于8周龄的C57BL/6小鼠(Taconis，Bomholtvej，Denmark)。将小鼠维持在无特定病原体的条件下，并且按照德国癌症研究中心的动物护理和使用委员会(Animal Care and Use Committee of the German Cancer Research Center，DKFZ)批准的机构指南进行实验。在胸照射之前，通过腹膜内施用0.36ml/kg Rompun 2％(BayerHealthCare)和0.54ml/kg氯胺酮10％(Pfizer)麻醉小鼠。

粒子照射在德国海德堡的海德堡离子束治疗中心(Heidelberg Ion-BeamTherapy Center，HIT)进行。照射设置如下所示(图8)。在展开的布拉格峰(Bragg peak)(SOBP，252.400-270.550MeV/u)施加碳离子(12C)，线性能量转移(LET)＝70-157keV/μm(平均值为86keV/μm)。

在德国海德堡的DKFZ，用Artiste直线加速器(Siemens，Germany)以6Mv和3Gy/min的剂量率进行光子照射。

通过解剖学和放射学估计调整所有照射计划，确保肺部区域的完全覆盖并最大限度地使邻近组织不受伤害。碳离子照射后立即使用PET/CT(Biograph mCT，Siemens)成像进行光束验证。

实施例4：纤维化指数(FI)计算

临床PET/CT扫描仪(Biograph mCT，Siemens)用于照射前(pre-IR)的和照射后(post-IR)每4周的定量CT成像。在异氟醚麻醉下(2％异氟烷，21/min氧气)进行CT成像。CT部分的标准方案如下：80kV，80mA，间距0.6mm，切片厚度0.6mm，采集时间32s。使用滤波器内核H50s(Siemens)将图像重建为作为512×512矩阵的138×138mm2轴向视场，其中在一次扫描中包括三只动物。在总视场中，每次扫描的X射线曝光约为4mGy，每只动物大约小于1mGy。

在OsiriX成像软件(OsiriX v.3.9.464位版本，Pixmeo SARL，瑞士)和MITK软件(德国癌症研究中心医学和生物信息学部(Medical and Biological Informatics，GermanCancer Research Center))中观察和分析从临床CT扫描仪获得的图像。由于图像的分辨率相对较低，微血管的HU强度与周围的含气组织平均。由此使用具有-900HU的下阈值和-100HU的上阈值的三维(3D)区域生长算法对肺以及所有微结构进行分段。在患有肺气肿(-450HU)的动物上使用-600HU的较下阈值。在分段后手动切除气管和原代支气管。在分段区域内计算平均HU值和体积大小之后，提取分组在10HU的区间中的相同肺区域的直方图，以实现对阈值的选择不敏感的更可靠的评估。使用原型SPECT-CT-OT系统的微CT组件和Inveon SPECT/PET/CT(Siemens，Germany)在相应的时间点(IR前和IR后每4周)进行微CT成像用于进一步验证临床CT结果。对于原型SPECT-CT-OT系统，在以下条件下进行CT采集：40kV管电压，0.4mA阳极电流，每投射1秒采集时间，每360度旋转240个投射。将图像重建为512×512×1024的矩阵，各向同性体元大小为0.065mm。对于Inveon SPECT/PET/CT，在以下条件下应用CT采集：80kV管电压，0.5mA阳极电流，每投射1秒采集时间，每360度旋转720个投射，有效像素尺寸为19.29μm。使用MITK软件观察和分析微CT数据。手动对10个连续的轴向CT切片进行肺部区域的分段。输出所选感兴趣体积中的每个体元的HU值以计算平均HU值，然后用于生成直方图。

肺部密度(由CT中整个肺部区域的平均HU值表示)从分段肺计算。纤维化指数(FI)是基于以Hounsfield单位(HU)的平均肺密度(MLD)和肺容量的CT测量提出的：

其中是分段肺的增加的HU值的平均；是参考年龄匹配对照的减少的肺容量。

实施例5：内皮抑制素使光子辐射诱发的肺纤维化减弱

Fc-内皮抑制素和mP1内皮抑制素抑制肺纤维化并延长存活期

用Fc-内皮抑制素(Fc-Endo)，N末端内皮抑制素肽(mP1)或C末端内皮抑制素E4肽(CE4)(参见图2)结合光子20Gy全胸照射(参见实施例3)处理小鼠。微CT成像显示在20Gy照射的组织中弥漫性磨玻璃混浊和结构变形，表明产生大量间质纤维化。在CE4结合照射组中也观察到严重的纤维化肺实质。相反，在Fc-Endo和mP1处理组中观察到显著减少的纤维化(图3)。

在照射后24周的终点完成定量临床CT随访(图3B)。与仅电离放射(IR)相比，在Fc-Endo+X和mP1+X处理组中发现显著降低的平均肺密度(MLD)(分别为P＜0.001，P＜0.05)。与此一致，在这些组中总肺容量(LV)保留，而在仅IR小鼠中发生LV的显著损失(相对于仅IR，对于Fc-Endo+X和mP1+X分别为P＜0.001，P＜0.05)。与仅IR小鼠相比，在MLD或降低的LV方面，在CE4+X处理组中未观察到显著差异(P＞0.05)。与相同参数(MLD和LV，数据未显示)中的对照组相比，在Fc-Endo，mP1或CE4处理组中未发现统计学差异。

基于发明人的辐射诱发的肺纤维化(RILF)，纤维化指数(FI)被认为是用于定量评估肺纤维化的最可靠和稳健的指标(参见实施例4)。在Fc-Endo+X(约3.03，43％降低)和mP1+X(约1.86，26％降低)处理组中观察到显著减弱的FI水平(分别为P＜0.001，P＜0.05)。然而，CE4+X施用组和仅用IR的组之间没有统计学显著差异(P＝0.43)(图3C)。

Fc-Endo和mP1处理组中降低的辐射诱发的FI值与存活益处相关；例如，在观察期结束时(IR后25周)的存活率分别地对于Fc-Endo+X为80％并且对于mP1+X arm为60％，相比之下在仅IR的小鼠中仅为10％(分别为P＜0.01和P＜0.05)。发明人没有观察到CE4+X和仅用IR的组之间的统计学显著差异(图3D)。

实施例6：Fc-内皮抑制素和mP1内皮抑制素改善肺功能

作为肺纤维化的伴随症状，在所有组中研究了肺功能的恶化(图4A，B)。与对照组相比，仅用IR的组具有显著更高的pCO₂和更低的pH(分别为P＜0.05，P＜0.001)，表明由于严重的通气障碍导致的慢性呼吸性酸中毒。相反，这些测量在Fc-Endo处理组或mP1+X处理组与对照组之间没有显著差异(分别为P＞0.05，P＞0.05)，显示出在这些组中有利的呼吸功能。

与仅IR的组(X 20Gy)相比，使用Fc-Endo+X处理实现了在pCO₂和pH方面最良好保护的肺功能(分别为P＜0.05，P＜0.001)。第二个最佳结果由mP1+X提供，其中pCO₂和pH也与仅IR(X20Gy)条件显著不同(分别为P＜0.05，P＜0.05)。

与仅IR的小鼠相比，用CE4+X处理的小鼠没有发现显著的益处(pCO₂和pH)(分别为P＞0.05，P＞0.05)。评估终点处的体重减轻(图4C)。与仅IR的小鼠相比，观察到所有内皮抑制素治疗组具有较少的体重减轻(均P＜0.05)。特别地，就体重而言，Fc-Endo+X处理的小鼠优于mP1-Endo-X和CE4-Endo+X-处理的小鼠(相对于Fc-Endo，均P＜0.05)。

组织病理学分析表明，与仅用IR的小鼠相比，接受Fc-Endo+X或mP1-Endo+X的小鼠的炎性细胞浸润，隔膜厚度和肺泡结构明显改善。Fc-Endo+X和mP1-Endo+X处理组在三色染色中也显示出显著更少的胶原沉积和瘢痕形成(图4D)。用Fc-Endo，mP1-Endo或CE4-Endo处理的未照射的肺没有差异(图4E)。

实施例7：Fc-内皮抑制素对M2极化，基因和蛋白质调节的影响

异常的ECM重塑是肺纤维化的一个特征。发明人发现包括韧黏素C，胶原I和III，弹性蛋白，原纤蛋白，α-肌动蛋白和MMP的各种关键ECM蛋白在转录水平被Fc-Endo+X抑制或“关闭”(图5A)。与此一致，免疫组织化学结果表明Fc-内皮抑制素+X相比于20Gy照射的肺中M2巨噬细胞流入的减少(图5B)。

辐射诱发的肺纤维化(X20Gy)与CD31减少和增强的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF2)蛋白水平相关。将Fc-Endo添加至放疗使该表型逆转至假处理对照中检测到的水平(图5)。有趣的是，最近与抗纤维化特性相关联的肝细胞生长因子(HGF)[Crestani，B.，等，Hepatocyte growth factor and lung fibrosis.Proc Am Thorac Soc，2012.9(3)：p.158-63；Phin，S.，等，Imbalance in the pro-hepatocyte growth factoractivation system in bleomycin-induced lung fibrosis in mice.Am J Respir CellMol Biol，2010.42(3)：p.286-93]与单独的IR(X-20Gy)相比，在Fc-Endo+X后的表达水平高得多(P＜0.05)(图5D)。

实施例8：Fc-内皮抑制素抑制碳离子诱导的肺纤维化

Fc-内皮抑制素抑制由碳离子诱导的肺纤维化

鉴于Fc-内皮抑制素在抑制光子诱导的肺纤维化方面比其他内皮抑制素肽片段更有效，发明人接下来研究了Fc-内皮抑制素调节由高LET碳照射诱导的纤维化的功效。

微CT成像显示碳离子12.5Gy照射后弥漫性纤维化肺(C12.5)。相反，在Fc-Endo+C12.5处理组中观察到显著减少的纤维化(图6A)。

在24周的终点进行定量临床CT随访(图6B)。Fc-Endo+C12.5组的肺密度(MLD)显著低于单独用碳(C12.5)的组(P＜0.01)。与此一致，在Fc-Endo+C12.5处理的小鼠中总LV也得以保留，而单独用碳(C12.5)小鼠的总LV显著损失(P＜0.01)。

FI被认为是肺纤维化评估中最重要的指标(参见实施例4)。Fc-Endo+C12.5组的FI明显低于碳照射(C12.5)组的FI(P＜0.001)(图6C)。

组织病理学分析表明，与碳照射(C12.5)小鼠相比，接受Fc-Endo+C12.5的小鼠的炎症，隔膜厚度和肺泡结构有明显改善。同样地，在Fc-Endo+C12.5处理的小鼠的三色染色中发现较少的胶原沉积和瘢痕形成(图6D)。

实施例9：高LET照射后Fc-内皮抑制素抑制纤维化的免疫学和分子学确认

接受Fc-内皮抑制素处理的小鼠在碳照射的肺中具有明显减少的促纤维化M2巨噬细胞(CD206和CLL22阳性)(图7A)。与内皮抑制素对光子照射的肺的作用一致，相比于单独的碳照射，在Fc-Endo+C12.5后发现FGF2诱导的逆转和CD31蛋白水平的损失(图7B)。此外，Fc-内皮抑制素处理导致碳照射的肺中抗纤维化HGF蛋白水平升高(P＜0.05)(图7C)。

总之，这些数据证实了在与放射质量无关的纤维化的发展中，M2极化、减少的由血气屏障(CD31阳性微血管)组成的完整肺结构和生长因子/细胞因子谱(FGF)的相关性。Fc-内皮抑制素在碳和光子照射模型中有效地逆转了这种表型。

实施例10：Fc-内皮抑制素抑制纤维化的可能机制

发明人发现Fc-内皮抑制素(Fc-Endo)和N末端内皮抑制素(mP1内皮抑制素)肽是由光子或碳离子照射诱导的肺纤维化的有效抑制剂。在存活，放射学，生理学，组织学检查，M2巨噬细胞极化和Th2偏向免疫，ECM组成，细胞结构变化等方面，Fc-内皮抑制素优于mP1。这可能是具有更长半衰期(暴露)(如针对Fc-内皮抑制素的抗癌活性所报道的)的Fc-内皮抑制素的改善的药代动力学的结果[Lee，T.Y.，等，Linking Antibody Fc Domain toEndostatin Significantly Improves Endostatin Half-life and Efficacy.ChnicalCancer Research，2008.14(5)：p.1487-1493]。备选地，不同的作用机制可能控制Fc-内皮抑制素的抗纤维化作用。考虑到内皮抑制素是胶原18的非胶原结构域1(NC-1)(其在生理学上是三聚体)的蛋白水解片段，通过Fc-缀合的内皮抑制素的二聚化可能代表该内源蛋白质的更具生理学的关联。有趣的是，发现内皮抑制素血浆水平在肺纤维化患者中增强。发明人先前已经表明，作为合成二聚体的Fc-内皮抑制素可以与纤连蛋白(FN)结合，而内皮抑制素单体不结合(参见WO 2013026913)。FN被认为在纤维化发展的起始和扰动中具有重要作用[参见，W.S.和K.S.Midwood，Plasma and cellular fibronectin：distinct andindependent functions during tissue repair.Fibrogenesis Tissue Repair，2011.4：p.21]。因此，吸引人的是推测Fc-内皮抑制素与FN结合，导致广泛的下游抗纤维化信号级联反应。

基质形成需要FN，整合素和分子与细胞骨架的粘附[Schwarzbauer，J.E和D.W.DeSimone，Fibronectins，their fibrillogenesis，and in vivo functions.ColdSpring Harb Perspect Biol，2011.3(7)]。整合素介导的结缔组织生成是纤维发生的必需途径。大多数整合素通过FNIII₁₀中的RGD环和FNIII₉中的相邻PHSRN序列与FN结合。人们普遍接受的是，促纤维化整合素(例如，α₅β₁，α_vβ₁，α_Vβ₃)与FN的结合是FN-基质组装进展中的关键步骤[Takahashi，S.，等，The RGD motif in fibronectin is essential fordevelopment but dispensable for fibril assembly.J Cell Biol，2007.178(1)：p.167-78；Leiss，M.，等，The role of integrin binding sites in fibronectin matrixassembly in vivo.Curr Opin Cell Biol，2008.20(5)：p.502-7]。

发明人发现Fc-内皮抑制素强烈激活αIIb整合素。特别地，还发现激活整合素αIIb的关键分子Kindlin-3在转录上是高度上调的(数据未显示)。整合素αIIb与FNIII_9-10处的FN结合，FNIII_9-10是那些促纤维化整合素的相同位点[Leiss，M.，等，The role ofintegrin binding sites in fibronectin matrix assembly in vivo.Curr Opin CellBiol，2008.20(5)：p.502-7.，Chada，D.，T.Mather，和M.U.Nollert，The synergy site offibronectin is required for strong interaction with the platelet integrinalphaIIbbeta3.Ann Biomed Eng，2006.34(10)：p.1542-52]。因此，除了FN结合之外，内皮抑制素诱导的整合素αIIb上调可以竞争性地抑制纤连蛋白与常见的促纤维化整合素的结合。正在进行进一步的亲和力测定以了解内皮抑制素-整合素-FN相互作用背后的潜在机制。发明人还发现Fc-内皮抑制素和mP1后HGF的表达增强。最近发现HGF可引发推定的抗纤维化作用[Crestani，B.，等，Hepatocyte growth factor and lung fibrosis.Proc AmThorac Soc，2012.9(3)：p.158-63；Phin，S.，等，Imbalance in the pro-hepatocytegrowth factor activation system in bleomycin-induced lung fibrosis in mice.AmJ Respir Cell Mol Biol，2010.42(3)：p.286-93]。

迄今为止发明人可以提供的最引人注目的数据是已知主要参与抗血管生成作用的内皮抑制素的N端锌结合区[Tjin，R.M.，等，A 27-amino-acid synthetic peptidecorresponding to the NH2-terminal zinc-binding domain of endostatin isresponsible for its antitumor activity.Cancer Research，2005.65(9)：p.3656-3663]也与该内源蛋白质引起的抗纤维化作用有关。这与最近发表的假定内皮抑制素的C端结构域的抗纤维化作用的数据形成鲜明对比[Yamaguchi，Y.，等，A peptide derived fromendostatin ameliorates organ fibrosis.Sci Transl Med，2012.4(136)：p.136ra71]。在发明人使用的辐射诱发的肺纤维化模型中，C端肽对改善大多数研究的纤维化发展参数无效。总之，发明人的数据表明在RILF模型中的抗纤维化作用中内皮抑制素的N末端序列以及二聚化的重要作用。

实施例11：寡聚内皮抑制素的结合特性

发明人先前已经表明，内皮抑制素的抗纤维化作用最可能不限于其如Yamaguchi等，2012(同上)所提出的其C端片段。仔细观察内皮抑制素C端(含E4肽区域)，没有明显的结构特征将该片段与潜在的蛋白质相互作用配偶连接起来，这可能为假定的分子抗纤维化作用提供机制解释。对于缺乏E4活性的另一种解释可能是与他们的急性鼠纤维化模型相反，发明人利用辐射诱发的肺纤维化模型，其中纤维化发展遵循更接近于人类的病理生理学的缓慢(在照射后超过24周)和慢性动力学。

发明人进一步表明，N端锌结合片段引发中等抗纤维化活性。然而，当使用合成的内皮抑制素二聚体(Fc-内皮抑制素)时，发现最有效的肺纤维化减弱。Fc-内皮抑制素(FcE)由两条Fc链(通过二硫键连接)组成，延伸至两个内皮抑制素分子，每个分子与单个Fc链连接。因此，两个相邻的内皮抑制素分子由于Fc二聚体而变成二聚体。

本发明人先前已经表明，在人血液中循环的生理分子是胶原18的内皮抑制素前体NC1片段，其是具有三个内皮抑制素结构域(内皮抑制素三聚体)的寡聚内皮抑制素分子。此外，发明人显示，将Fc-内皮抑制素与血小板裂解物，纤连蛋白(FN)混合免疫沉淀，而不需要额外的抗体来促进它们的相互作用。发明人的数据后来清楚地表明，FN的结合对于寡聚内皮抑制素(二聚体或三聚体NC1)是独特的，并且内皮抑制素单体(迄今其被认为是源自胶原18的关键抗血管生成分子)不共享这一点(图9)。值得注意的是，纤连蛋白是组织纤维化发展的中心分子。因此，发明人的假设是，寡聚内皮抑制素的有益抗纤维化作用至少部分地由其结合FN的性质介导，并且这将NC1或内皮抑制素寡聚体与单体或其片段(N端，中间或C端片段)区分开。

在发明人的观点中，内皮抑制素是NC1的末端降解产物。它们在这里呈现新数据，进一步证明内皮抑制素二聚体和NC1三聚体的结合特性在相关蛋白质相互作用配偶体方面与内皮抑制素单体完全不同。换言之，内皮抑制素的寡聚化特性在其与组织重塑的关键参与者的结合中起重要作用，所述作用对其抗纤维化和抗癌作用的探索具有高度影响。

发明人的新发现是寡聚内皮抑制素与血管内皮生长因子(VEGF)的结合，血管内皮生长因子是许多所谓的VEGF相关疾病中的关键分子，所述疾病包括从湿性黄斑变性到癌症和纤维化的广泛病理生理病症。实际上，最近被批准用于治疗肺纤维化的Nindetanib是PDGF和VEGF信号传导的有效抑制剂。与内皮抑制素二聚体和NC1相反，VEGF不与内皮抑制素单体结合(图10)。

内皮抑制素的结晶学先前已证明该蛋白质是各自结合锌原子的二聚体(Ding，Y.H.，K.Javaherian，K.M.Lo，等.1998.Zinc-dependent dimers observed in crystalsof human endostatin.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95，10443-10448)。有趣的是，内皮抑制素的N端锌结合结构域类似于MMP(基质金属蛋白酶)的；MMP是重建细胞外基质，纤维化发展，癌症进展和转移的重要参与者。在此，发明人证明了内皮抑制素二聚体和NC1三聚体确实与MMP-2和MMP-9结合；内皮抑制素单体不共有此性质(图11)。这一发现为通过合成设计(例如通过Fc的二聚化)或其他替代物探寻寡聚内皮抑制素的生物学特性以产生和改善模拟内皮抑制素前体分子NC1的药物开辟了新的途径。

基于发明人对内皮抑制素二聚体晶体结构的研究，他们认识到距离N末端第7位的氨基酸谷氨酰胺与第二链中的相同氨基酸紧密相邻。他们在这个位置用C(Cys)替代Q(Gln)，预测会产生通过二硫键共价连接的人工内皮抑制素二聚体。他们的预测证明是正确的。新的人工二聚体如先前一样在Fc-内皮抑制素载体中表达。然而，Fc和内皮抑制素通过其相应的二硫键分别二聚化。肠激酶消化该重组蛋白导致Fc二聚体和内皮抑制素二聚体，其在S-200Sephadex上纯化。在该实施例11中提供的所有结合测定中使用的术语“内皮抑制素二聚体”(ES二聚体)是指该纯化的分子。

另一个令人信服的证据支持他们的假设，即仅用寡聚内皮抑制素观察到此处呈现的结合特性，如图12所示。在Fc-内皮抑制素中的Fc和内皮抑制素之间进行肠激酶结合位点工程改造。用肠激酶(EK)消化该分子产生Fc二聚体和两个内皮抑制素单体。在没有任何额外修饰的情况下，Fc和内皮抑制素的混合物显示出与完整Fc-内皮抑制素不同的特性。

总之，发明人在此显示了解释寡聚但非单体内皮抑制素的新结合配偶体的其他数据，内皮抑制素在器官纤维化的发展中具有关键作用。寡聚内皮抑制素靶向这些分子的独特性质为NC1或NC1样寡聚内皮抑制素(例如Fc-ES)优于发明人在鼠肺纤维化模型中测试的单体末端降解产物或甚至其肽片段(mP1或E4)的抗纤维化活性提供了合理的解释。发明人的新发现开辟了开发NC1或由寡聚内皮抑制素(至少二聚体)组成的NC1拟似物不仅用于治疗纤维化相关疾病，还用于治疗VEGF相关疾病，MMP依赖性疾病，以及调节纤连蛋白功能的新途径。

实施例11中使用的试剂列于以下：

-Corning，96孔EIA/RIA高度结合，聚苯乙烯，平底，透明，无菌#3590

-BSA(Sigma Aldrich#A7030无IgG)

-重组hMMP-2(R&D#902-MP-010)在PBS中＞1μg/ml

-重组hMMP-9(R&D#911-MP-010)在PBS中＞1μg/ml

-R7012a.p.(抗内皮抑制素抗体)

-ABTS(Rockland#ABTS-100)

-过氧化物酶缀合的亲和纯的山羊抗兔IgG(H+L)(Jackson Immuno Research#111-035-0032.0ml)

-hFN(R&D#1918FN-02M)

-重组人VEGF165(R&D Systems a biotechne brand#293-VE-010/CF)

Proteingel：

-Page Ruler Plus Prestained Protein Ladder(Thermo Scientific#26619)

-SDS page 4-20％：

Mini-Protean TGX Precast Protein Gels(BioRad#4561094)

-肠激酶，轻链，猪(GenScript#Z01003

Claims (18)

1.蛋白质寡聚体，其包含(i)至少两个胶原18的NC-1单体或(ii)至少两个胶原18的内皮抑制素结构域或(iii)至少两个胶原18内皮抑制素结构域的N端肽，其用于治疗，减轻或预防纤维化或纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病。

2.用于根据权利要求1的用途的蛋白质寡聚体，其中所述蛋白质寡聚体与纤连蛋白，VEGF，MMP-2和/或MMP-9结合。

3.用于根据权利要求1或2的用途的蛋白质寡聚体，其中人胶原18的NC-1单体包含寡聚化结构域，铰链区和/或内皮抑制素结构域或所述内皮抑制素结构域的片段，以及任选的铰链区内的重组蛋白酶切割位点。

4.用于根据权利要求1或2的用途的蛋白质寡聚体，其中胶原18的内皮抑制素结构域选自SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的氨基酸序列或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽选自SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的氨基酸残基1至132的氨基酸序列。

5.用于根据权利要求1至4中任一项的用途的蛋白质寡聚体，其还在胶原18的NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽中包含纤连蛋白的RGD基序和/或PHSRN基序。

6.用于根据权利要求1至5中任一项的用途的蛋白质寡聚体，其中人胶原18的NC-1单体，胶原18的内皮抑制素结构域或胶原18内皮抑制素结构域的N端肽包含天然或异源寡聚化结构域。

7.用于根据权利要求6的用途的蛋白质寡聚体，其中所述天然寡聚化结构域是胶原18的非三螺旋三聚化结构域。

8.用于根据权利要求6的用途的蛋白质寡聚体，其中所述异源寡聚化结构域是选自由以下各项组成的组的寡聚化结构域：Fc结构域，人工寡聚化结构域或Fc结构域和人工寡聚化结构域两者。

9.用于根据权利要求8的用途的蛋白质寡聚体，其中所述Fc结构域来自IgG，优选人IgG1或knobs-into-holes(KiH)改造的人IgG1。

10.用于根据权利要求8的用途的蛋白质寡聚体，其中所述人工寡聚化结构域包含胶原18的内皮抑制素结构域的第7位的单突变，其中谷氨酰胺被半胱氨酸替代。

11.用于根据权利要求1至10中任一项的用途的蛋白质寡聚体，其还包含血管抑素，血小板反应蛋白，抗PD-1/PD-L1抗体或用于纤维化或纤维化相关疾病，VEGF相关疾病或MMP相关疾病的另一种疗法。

12.用于根据权利要求1至11中任一项的用途的蛋白质寡聚体，其中所述纤维化或纤维化相关疾病选自由以下各项组成的组：皮肤纤维化，优选硬皮病；瘢痕疙瘩；增生性瘢痕；硬斑病；移植物抗宿主病引起的纤维化；上皮下纤维化；心内膜心肌纤维化；子宫纤维化；骨髓纤维化；腹膜后纤维化；肾源性系统性纤维化；手术后结瘢；哮喘；肝硬化/肝纤维化；异常伤口愈合导致的纤维化；肾小球肾炎；多灶性纤维硬化；辐射诱发的纤维化，优选辐射诱发的肺炎或辐射诱发的肺纤维化；化疗诱发的或药物诱发的纤维化，例如，mTOR或EGFR激酶抑制所致的纤维化；常见或特发性肺纤维化；自身免疫疾病例如狼疮所致的纤维化，肿瘤内和癌症相关的纤维化/纤维发生，慢性炎症后的器官纤维化，例如通过病毒刺激或移植；作为慢性肾病，长期透析或糖尿病的终末期的器官纤维化。

13.用于根据权利要求1至11中任一项的用途的蛋白质寡聚体，其中所述血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病是取决于VEGF水平失调的良性病理生理学病症，如湿性黄斑变性，子宫内膜异位症，支气管哮喘和糖尿病，增强的VEGF诱导的血管通透性(例如脑组织辐照后增强的通透性，“放射性坏死”)，血管紧张的改变(例如高血压)，类风湿性关节炎，以及恶性VEGF依赖性疾病，如肾细胞癌和其他VEGF成瘾性肿瘤，VEGF依赖性腹水发展，VEGF依赖性免疫系统抑制，例如源自骨髓的细胞(BMDC)、源自骨髓的抑制细胞(MdSC)、或未成熟树突细胞的募集和微环境训练。

14.用于根据权利要求1至11中任一项的用途的蛋白质寡聚体，其中所述基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病是良性和恶性疾病，其中MMP激活促成病理生理学，例如，在局部治疗失败率高的肿瘤如胶质母细胞瘤、胰腺癌、肺癌中固有地明显的局部肿瘤侵入和癌症转移过程期间的MMP激活，以及由治疗诱导的选择压力(例如肿瘤缺氧和放疗后纤维化)、自身免疫疾病和慢性炎性疾病中的明显免疫反应导致的获得性增强的MMP激活。

15.用于根据权利要求1至14中任一项的用途的蛋白质寡聚体，其中蛋白质寡聚体以0.1-1mg/kg/天的浓度施用。

16.用于根据权利要求1至15中任一项的用途的蛋白质寡聚体，其中所述蛋白质寡聚体通过静脉内，颅内/鞘内，玻璃体内，皮下或腹膜内施用。

17.用于根据权利要求1至16中任一项的用途的蛋白质寡聚体，其中所述蛋白质寡聚体具有一种或多种选自由以下各项组成的组的生物活性：抗纤维化活性，抗血管发生活性，抗侵入/抗转移活性，降低血管通透性活性，抗炎和抗肿瘤发生活性。

18.蛋白质寡聚体，其包含(i)至少两个胶原18的NC-1单体或(ii)至少两个胶原18的内皮抑制素结构域或(iii)至少两个胶原18内皮抑制素结构域的N端肽，其用作诊断组合物以用于检测和/或诊断纤维化或纤维化相关疾病，血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病。