JP2019508451A - 線維症又は線維症関連疾患を治療及び診断するための手段及び方法 - Google Patents

線維症又は線維症関連疾患を治療及び診断するための手段及び方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、線維症若しくは線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患、又はマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患の治療、緩和又は予防における使用のための、(i)コラーゲン18の少なくとも2つのNC-1単量体、又は(ii)コラーゲン18の少なくとも2つのエンドスタチンドメイン、又は(iii)コラーゲン18エンドスタチンドメインの少なくとも2つのN末端ペプチド、を含むタンパク質オリゴマーに関する。本発明は更に、線維症若しくは線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患、又はマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患の検出及び/又は診断における使用のための上述のタンパク質オリゴマーに関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、線維症若しくは線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患、又はマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患の治療、緩和又は予防における使用のための、(i)コラーゲン18の少なくとも2つのNC-1単量体、又は(ii)コラーゲン18の少なくとも2つのエンドスタチンドメイン、又は(iii)コラーゲン18エンドスタチンドメインの少なくとも2つのN末端ペプチド、を含むタンパク質オリゴマーに関する。本発明は更に、線維症若しくは線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患、又はマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患の検出及び/又は診断における使用のための上述のタンパク質オリゴマーに関する。
臓器の線維芽細胞によるフィブロネクチン(FN)及びI型コラーゲン(Col1α1)のような細胞外マトリックス(ECM)の構成要素の過剰な沈着は、線維症と定義される。臓器の線維症は、最終段階の臓器不全をもたらす多くの疾患において、最終的な一般的な経路である。急性及び慢性の炎症、血管新生、常在細胞の活性化、並びに細胞外マトリックスのリモデリングを含む制御不能の創傷治癒反応は、線維症の病因に関与すると考えられている。
肺線維症は、肺新生物に対する放射線療法及び化学療法を含む、複数の原因の結果として発生する一群の肺実質の間質性疾患を含む(Am. J. Respir. Crit Care Med.(2002)165、p.277-304;Movsasら(1997)Chest 111、p.1061-1076)。放射線により誘発される病態生理学的事象は、手術、化学療法、及び特発性肺線維症(IPF)のような他の種の肺傷害の後に起こるものに対して著しい類似性を有する(Rubinら(1995)、Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 33、p.99-109)。
2006年に公表された米国の健康保険請求データベースに基づく研究において、IPFの有病率は、使用された症例発見基準が狭いか又は広いかに応じて、100,000人当たり14〜42.7人であった(Raghuら(2006)、Am. J. Respir. Crit. Care Med. 174、p.810-6)。より最近において、2012年5月における文献の体系的調査は、欧州連合における特発性肺線維症(IPF)の発生率は、100,000人当たり26人であると推定した。IPFの有病率に関する様々な研究の結果は、Rafiiら(J. Thorac Dis.(2013)、5、p.48-73)による総説に要約されている。IPFは、進行性肺疾患からの死の最も一般的な原因を表す。遡及的研究は、IPFの診断後の生存期間中央値は2〜3年であるが、IPFの経過は変動可能であり、一部の患者は長期間の安定性を経験し、他の患者は頻繁な悪化又は急速な衰弱を有することを示唆する(Raghuら(2011)、Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183、p.788-824;Selmanら(2001)、Ann. Intern. Med. 134、p.136-51;Boonら(2009)、PLoS One、4、e5134)。
臨床的に、IPFは、呼吸不全による死を招く可能性のある、間質性浸潤、進行性呼吸困難、及び肺機能の悪化を特徴とする(Am. J. Respir. Crit Care Med. (2002)、165、p.277-304; Allen and Spiteri (2002)、Respir. Res. 3、p.13; Gross and Hunninghake (2001)、N. Engl. J. Med. 345、p.517-525)。
IPFのための理想的な動物モデルは未だ存在しないが、これまでブレオマイシン及び放射線誘発の肺線維症モデルが、肺線維症を研究するために使用されている(Rubin、前掲)。
分子的な観点から、TGF-ベータ(TGF-β)は、線維症臓器において増加し、そして細胞外マトリックス分子の合成を刺激し、線維芽細胞を活性化してα-平滑筋アクチン発現筋線維芽細胞とし、かつマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)を下方制御することによって線維症の発生に寄与する、プロトタイプの線維性サイトカインである。異常なTGF-ベータの発現は、全身性硬化症における線維症の病因に関与し、抗TGF-ベータモノクローナル抗体は、早期全身性硬化症の小規模治験で評価されたが、有効性をまったく示さなかった(Vargaら(2009)、Nature Reviews Rheumatology 5、p.200-6)。
別の研究の結果は、肺線維症の病因におけるPDGFシグナル伝達の重要な役割を示唆し、炎症よりむしろ線維形成の阻害が、抗線維症治療に重要であることを示した(Abdollahiら(2005)、J. Exp.Med. 201、p.925-35)。
近年、TGF-ベータ及びブレオマイシン誘発の線維症において、C末端エンドスタチンポリペプチドについて抗線維症活性が報告されているが、N末端エンドスタチンポリペプチドについてではない(WO 2011/050311; Yamaguchiら(2012)、Sci. Transl. Med.、4、p.136ra71)。エンドスタチンは、血管周囲の基底膜に局在するコラーゲンXVIIIの自然発生する183アミノ酸のタンパク質分解断片である。このタンパク質の抗腫瘍特性は広範に記載されており、血管新生の内在性阻害剤としてエンドスタチンを画定する[Bergers, G.ら、Effects of angiogenesis inhibitors on multistage carcinogenesis in mice. Science、1999. 284(5415): p.808-12; O'Reilly, M.S.ら、Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell、1997. 88(2): p.277-85.、Folkman, J.、Antiangiogenesis in cancer therapy--endostatin and its mechanisms of action. Exp Cell Res、2006. 312(5): p.594-607]。更に、それは、炎症促進性NF-κB、凝固及び接着カスケードのような多くのシグナル伝達カスケードを抑制する[Abdollahi, A.ら、Transcriptional network governing the angiogenic switch in human pancreatic cancer. Proc Natl Acad Sci U S A、2007. 104(31): p.12890-5]。
医学的な必要性にもかかわらず、これまでのところ、線維症のための有効な治療戦略の開発における進歩はきわめて僅かである(例えば、Am. J. Respir. Crit Care Med. (2002)、165、p.277-304; Allen and Spiteri、前掲; Gross and Hunninghake、前掲; Kamp (2003)、Chest 124、p.1187-11909; Masonら(1999)、Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160、p.1771-1777; Rafiiら(2013)、J. Thorac Dis. 5、p.48-73を参照)。
したがって、線維症のための有効な治療モダリティーの開発に対する必要性が当該技術分野に存在する。
本発明の基礎となる技術的課題は、上述の必要性に沿う手段及び方法の提供の中で見ることができるであろう。この技術的課題は、特許請求の範囲及び以下の明細書によって特徴付けられる実施形態によって解決されている。
したがって、本発明は、線維症又は線維症関連疾患の治療、緩和又は予防における使用のための、(i)コラーゲン18の少なくとも2つのNC-1単量体、又は(ii)コラーゲン18の少なくとも2つのエンドスタチンドメイン、又は(iii)コラーゲン18エンドスタチンドメインの少なくとも2つのN末端ペプチド、を含むタンパク質オリゴマーに関する。
本発明は更に、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患、又はマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患の治療、緩和又は予防における使用のための、(i)コラーゲン18の少なくとも2つのNC-1単量体、又は(ii)コラーゲン18の少なくとも2つのエンドスタチンドメイン、又は(iii)コラーゲン18エンドスタチンドメインの少なくとも2つのN末端ペプチド、を含むタンパク質オリゴマーに関する。
コラーゲンXVIII及びFc-エンドスタチンのトポロジー、並びに、異なる組織におけるエンドスタチン分子の生理学的サイズを示す。 エンドスタチン、N末端ペプチド(mP1)及び(hP1)、並びにC末端E4(CE4)ペプチドの配列を示す。 Fc-Endo及びmP1処理の後に低減された放射線誘発線維症進行を示す。 照射肺におけるFc-Endo及びmP1-Endo処理後の改善された臨床パラメーター及び病理組織学的症状を示す。 Fc-Endo+X処理後のM2極性化、遺伝子及びタンパク質の発現を示す。 Fc-Endoは、高LET炭素照射後の線維症を低減した。 炭素イオン照射の後のFc-Endo処理による線維症の阻害の関連した証拠である。 炭素イオン照射による正確なマウス胸部照射の実証(SOBPにおける炭素イオン12.5Gy)である。 オリゴマーエンドスタチンのフィブロネクチン結合を示す。 オリゴマーエンドスタチンのVEGF結合を示す。 オリゴマーエンドスタチンのMMP-2/9結合を示す。 Fc-エンドスタチン(ヒトFcE)をエンドスタチン単量体及びFc二量体とするエンテロキナーゼ消化の後の、MMP-2及びフィブロネクチンに対する二量体エンドスタチン結合の消失を示す。 本発明における使用のためのタンパク質オリゴマーの概略図である。 「ノブイントゥーホール」(KiH)操作NC-1-Fc又はエンドスタチン-Fc融合コンストラクトを示す。
本明細書において使用されるとき、用語「タンパク質」又は「ポリペプチド」若しくは「ペプチド」(他に指示がない場合、全ての用語は互換的に使用される)は、他の宿主細胞のポリペプチドを本質的に含まない、単離及び/又は精製した(ポリ)ペプチドを包含する。本明細書において言及されるとき、用語「ペプチド」は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300又は更に多くのアミノ酸残基を含み、ここで、一方のアルファカルボキシル基は他方のアルファアミノ基に結合している。本明細書において使用されるとき、タンパク質又はペプチドの翻訳後修飾は、新規に形成されたタンパク質又はペプチドの修飾であり、アミノ酸の欠失、特定のアミノ酸の化学修飾、例えば、アミド化、アセチル化、リン酸化、グリコシル化、ピログルタメートの形成、メチオニン上のスルファ基の酸化/還元、又は類似の小分子の特定のアミノ酸への付加を含んでもよい。
本明細書において使用されるとき、用語「タンパク質」又は「ペプチド」は、ペプチド模倣体を包含する。当該技術分野において公知であるように、ペプチド模倣体は、その必須の要素(ファルマコフォア)が天然のペプチド又は3D空間におけるタンパク質を模倣し、かつ(フィブロネクチンのような)生物学的標的と相互作用する能力を保持して同一の生物学的効果(例えば、本明細書で定義されるような抗線維症活性)をもたらす化合物であり、例えば、Vagnerらによる総説(2008、Current Opinion in Chemical Biology 12、Pages 292-296)を参照。ペプチド模倣体は、天然のペプチドに関連するいくつかの問題、例えばタンパク質分解に対する安定性(活性の持続時間)及び不十分な生物学的利用率を回避するよう設計される。その他の特定の特性、例えばフィブロネクチンのような生物学的標的に対する選択性、又は抗線維症活性のような生物活性の効力は、しばしば実質的に改善できる。
本明細書において使用されるとき、タンパク質又はペプチドの修飾は、本明細書に記載される(ポリ)ペプチドの合成実施形態を含む。更に、類似体(非ぺプチド有機分子)、誘導体(開示される(ポリ)ペプチド配列から出発して得られる化学的に官能化された(ポリ)ペプチド分子)、及びこれらのタンパク質の変異体(相同体)を、本明細書に記載される方法並びに医療及び診断の用途において使用できる。本開示の各々の(ポリ)ペプチドは、L-及び/又はD-アミノ酸のいずれかであってよく、天然に存在するものやその他であってよい、アミノ酸の配列からなる。ペプチドは、様々な科学技術によって修飾して、非修飾の(ポリ)ペプチドと、本質的に同一の、例えば抗線維症活性のような活性を有し、任意で他の望ましい特性を有する誘導体を作製することができる。例えば、タンパク質のカルボン酸基は、カルボキシル末端であれ又は側鎖であれ、薬学的に許容可能なカチオンの塩の形態で提供することができ、又はエステル化してC1-C16エステルを形成することもでき、又は式NR1R2(式中R1及びR2は、それぞれ独立してH又はC1-C16アルキルである)のアミドに変換することもでき、又は組み合わせて5員環若しくは6員環のような複素環を形成することもできる。アミノ末端であれ又は側鎖であれ、ポリペプチドのアミノ基は、HCl、HBr、酢酸、安息香酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸、酒石酸、及び他の有機塩のような薬学的に許容可能な酸付加塩の形態であることができるか、あるいはC1-C16アルキル又はジアルキルアミノへと修飾することができるか、あるいは、アミドへと更に変換することができる。ポリペプチド側鎖のヒドロキシル基は、よく認識されている技術を用いてC1-C16アルコキシ又はC1-C16エステルへと変換してもよい。ポリペプチド側鎖のフェニル及びフェノール環を、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素のような1つ以上のハロゲン原子で置換してもよく、あるいはC1-C16アルキル、C1-C16アルコキシ、カルボン酸及びそれらのエステル、又はそのようなカルボン酸のアミドによって置換してもよい。ポリペプチド側鎖のメチレン基を、同族のC2-C4アルキレンへと拡張することができる。チオールを、アセトアミド基のような、よく認識されている多くの保護基の任意の1つによって保護することができる。当業者はまた、向上した安定性をもたらすような、構造に対する立体配座の制約を選択して提供するために、本発明の(ポリ)ペプチドに環状構造を導入する方法を認識するであろう。
本明細書で言及されるとき、タンパク質又は(ポリ)ペプチドは、融合タンパク質であることもできる。本明細書において使用されるとき、用語「融合タンパク質」は、元来別々のタンパク質をコードする2つ以上の遺伝子の接続によって作製されるキメラタンパク質(文字通り異なる供給源からの部品で作製される)を意味する。この融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能特性を有する単一又は複数のポリペプチドをもたらす。例えば、本明細書において使用されるとき、融合タンパク質は、例えばコラーゲン18のNC-1単量体と免疫グロブリンのFc領域、コラーゲン18のNC-1単量体とFc二量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメインと免疫グロブリンのFc領域、コラーゲン18のエンドスタチンドメインとFc二量体、グルタミンがシステインによって置き換えられる単一の変異を7位に有しているコラーゲン18のエンドスタチンドメインと免疫グロブリンのFc領域、グルタミンがシステインによって置き換えられる単一の変異を7位に有しているコラーゲン18のエンドスタチンドメインとFc二量体、コラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドと免疫グロブリンのFc領域、又はコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドとFc二量体を含む。例えば、NC-1の制御不能の凝集を避けるために、細胞においてコラーゲン18のNC-1単量体と免疫グロブリンのFc領域を、免疫グロブリンのFc領域と共に発現させることは有益であり得る。あるいは、NC-1における天然の結合領域を省略又は変異導入して、NC-1がこの結合領域を介してオリゴマー化することがもはやできなくすることは適切であり得る。そのような機能的結合領域を欠くNC-1をFc領域へと融合する場合、これは、NC-1二量体の形成をもたらす。融合タンパク質は、例えばフィブロネクチンのRGDモチーフ及び/又はPHSRNモチーフを更に包含できる。用語「コラーゲン18のNC-1単量体」、「コラーゲン18のエンドスタチンドメイン」、「コラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチド」、「Fc領域」、「RGDモチーフ」及び「フィブロネクチンのPHSRNモチーフ」は、本明細書の他の箇所で定義される。本発明に包含される更なる融合タンパク質は、本明細書中の他の箇所及び以下の実施例において示される。組換え融合タンパク質は、例えばSambrookら、Molecular cloning: a laboratory manual/Sambrook、Joseph;Russell、David W. --. 3rd ed. -- New York: Cold Spring Harbor Laboratory、2001を参照できる、当該技術分野においてよく記載されている、例えば組換えDNA技術によって作製される。
用語「オリゴマー」は、生化学において、通常、タンパク質又は核酸のようないくつかの巨大分子の非共有結合によって形成される巨大分子複合体を指す。定義によると、二量体は、2つの、通常非共有結合の、タンパク質又はペプチドのような分子によって形成される巨大分子複合体である。そのような複合体は、タンパク質配列の部分であるタンパク質ドメインと、進化し、機能し、タンパク質鎖の残りの部分と独立して存在することができる構造とによって形成することもできる。ホモ二量体は、2つの同一の分子より形成される。基本的なプロセスはホモ二量体化と呼ばれる。ヘテロ二量体は、2つの異なる分子により構築され、ヘテロ二量体化によって形成される。当該技術分野において公知であるように、生化学における多くの二量体又は三量体は、ジスルフィド架橋を除いて、共有結合によって結合していない。いくつかのタンパク質は、本明細書において以下に更に定義され、当該技術分野において周知である、二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、又はオリゴマー化ドメインと呼ばれる二量体化、三量体化、又はオリゴマー化を確実にする特化したドメインを含む。例を提供すると、二量体化は、免疫グロブリンのFcドメイン、若しくはジスルフィド架橋、又はその両方、又は本明細書の他の箇所に記載される他の手段によって媒介され得る。例えば、実施例11において使用されるFc-エンドスタチン(FcE)は、2つのFc鎖(ジスルフィド結合によって結合される)からなり、各々が単一のFc鎖へと連結するエンドスタチンの2つの分子へと伸長する。したがって、Fc二量体の結果として、2つの近接したエンドスタチン分子は二量体となる。実施例11において使用される別の二量体コンストラクトは、コラーゲン18の2つのエンドスタチンドメインを含んでいた。各々のエンドスタチンドメインは、グルタミンがシステインによって置き換えられる単一の変異を7位に含んでいた。各々のエンドスタチンドメインは、介在するエンテロキナーゼ切断部位を伴って免疫グロブリンのFc領域へと連結された。このコンストラクトにおいて、Fcとエンドスタチン分子の両方は、それらの対応するジスルフィド結合によって二量体化された。この組換えタンパク質のエンテロキナーゼ消化は、Fc二量体とエンドスタチン二量体をもたらした。三量体は、3つの、通常非共有結合の、ペプチド、タンパク質、又はタンパク質ドメインによって形成される巨大分子複合体である。例えば、コラーゲン18のNC-1ドメイン内の天然の結合領域が三量体化ドメインとして機能するため、コラーゲン18のNC-1の三量体化を媒介するNC-1ドメイン内の天然の結合領域を三量体化のために使用できる。ホモ三量体は、3つの同一の分子によって形成され、一方でヘテロ三量体は、3つの異なる分子によって構築される。例えば、コラーゲン18はホモ三量体のタンパク質である。四量体は4つの分子からなり、五量体は5つの分子からなるなどである。これらの場合において、複合体形成はしばしば、上述されるようなオリゴマー化ドメインによって媒介される。
本発明の文脈において、「オリゴマー」は、例えば、2、3、4、5、又は更に多くの単量体単位のようないくつかの単量体単位を含む、「タンパク質オリゴマー」又は「ペプチドオリゴマー」として理解されるべきである。したがって、オリゴマーは、例えば二量体、三量体、四量体、五量体などであり得る。好ましくは、オリゴマーは、ホモ二量体、ホモ三量体などである。単量体単位(又は簡潔に単量体)は、例えば、本明細書の他の箇所において特定される、ヒト若しくはマウスのコラーゲン18のNC-1単量体、ヒト若しくはマウスのコラーゲン18のエンドスタチンドメイン、又はヒト若しくはマウスのコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドであり得る。単量体はまた、アカゲザル、マカク若しくは霊長類のコラーゲン18のNC-1単量体、アカゲザル、マカク若しくは霊長類のコラーゲン18のエンドスタチンドメイン、又はアカゲザル、マカク若しくは霊長類のコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドであり得る。
単量体はまた、ヒト、アカゲザル、マカク、霊長類若しくはマウスのコラーゲン18のNC-1単量体、ヒト、アカゲザル、マカク、霊長類若しくはマウスのコラーゲン18のエンドスタチンドメイン、又はヒト、アカゲザル、マカク、霊長類若しくはマウスのコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドを含む融合タンパク質であり得る。本明細書において使用されるとき、用語「融合タンパク質」は、本明細書において定義されるような、少なくとも1つのNC-1単量体、少なくとも1つのエンドスタチンドメイン、又は少なくとも1つのN末端エンドスタチンペプチド若しくはエンドスタチンドメインのN末端に由来するペプチドを含む。本明細書において定義されるような、2、3、若しくは更に多くのNC-1単量体、2、3、若しくは更に多くのエンドスタチンドメイン、又は2、3、若しくは更に多くのN末端エンドスタチンペプチド若しくはエンドスタチンドメインのN末端に由来するペプチドを含む融合タンパク質もまた包含される。例えば、前記少なくとも1つのNC-1単量体、エンドスタチンドメイン、又はN末端エンドスタチンペプチド若しくはエンドスタチンドメインのN末端に由来するペプチドは、免疫グロブリンからのFcドメイン、精製タグ、標識、抗線維症剤、抗血管新生剤、及び/又は抗腫瘍化剤などのような別の治療薬へと連結することができる。本明細書において言及されるとき、「標識」は、ヒト、アカゲザル、マカク、霊長類若しくはマウスのコラーゲン18のNC-1単量体、ヒト、アカゲザル、マカク、霊長類若しくはマウスのコラーゲン18のエンドスタチンドメイン、又はヒト、アカゲザル、マカク、霊長類若しくはマウスのコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドのような別の分子へと、その分子の検出を促進するために直接的又は間接的にコンジュゲートする検出可能な化合物又は組成物である。標識の具体的な非限定的な例は、蛍光タグ、酵素結合、及び放射性同位体を含む。好ましくは、融合タンパク質は、ヒト、アカゲザル、マカク、又は霊長類であり、より好ましくはヒトである。免疫グロブリンからのFc領域は、本明細書で定義される単量体のN末端又はC末端のいずれかに融合することができ、好ましくはN末端に融合することができる。
本明細書において使用される用語「タンパク質オリゴマー」(又は「ペプチドオリゴマー」)はまた、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマー、及び追加で他のタンパク質、薬剤、又は化合物を含むタンパク質調製物を含む。例えば、本明細書で定義される前記オリゴマーは、1つ以上の更なる抗線維症、抗血管新生、及び/又は抗腫瘍化タンパク質、化合物、又は薬剤を用いる併用レジメンとしてそれを必要とする対象へと投与することができる。薬物の組み合わせはしばしば、線維症又は線維症関連疾患に対して、単独で使用される単一の薬物と比べてより効果的である。例を提供すると、本明細書で定義されるタンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーは、アンジオスタチン、又は免疫グロブリンのFcドメインに連結されたアンジオスタチンのようなアンジオスタチン融合タンパク質と組み合わせて、あるいは、例えばTGF-ベータ、PDGF、VEGF、mTOR、CTGF、インテグリン、マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害剤、シクロオキシゲナーゼ、IKK/NFkB、JAK/STAT、及び/又はPi3Kシグナル伝達のステロイド阻害剤のような抗炎症剤を含む線維症プロセスに関与する他の経路の阻害剤と共に、使用することができる。
用語「コラーゲン18」及び「XVIII型コラーゲン」は本明細書において互換的に使用され、同じタンパク質を指す。コラーゲン18はN末端（NC-11ドメイン）とC末端（NC-1ドメイン）でより大きな非三重らせんの球状構造に挟まれた中央の断続性三重らせんドメインからなる（Oh et al., PNAS 1994, 91, 4229; Oh et al., Genomics 1994, 19, 494; Abe et al. 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 196, 576）。XVIII型コラーゲンは、コラーゲンスーパーファミリーの固有で新しいサブクラス（「MULTIPLEXINファミリー」という名が提案されている）に属する。
マウス及びヒトコラーゲン18タンパク質のクローニングはOh et al.（前掲）より説明されている。マウスコラーゲン18のヌクレオチド及びアミノ酸配列はアクセッション番号NM_001109991.1で示されており、一方対応するヒトの配列はNM_030582.3で示されている。さらに、マウス及びヒトコラーゲン18のアミノ酸配列は配列番号1及び2にそれぞれ示されている。アカゲザル（Macaca mulatta）のコラーゲン18のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号I0FVB6に示されている。好ましくは、本明細書で参照するコラーゲン18はヒトコラーゲン18である。
本明細書で使用される「NC-1ドメイン」（又は単にNC-1又はNC1）は、コラーゲン18のC末端に由来する又はそれからのものであり、（i）N末端会合領域（約50のアミノ酸残基）、（ii）中央のプロテアーゼ感受性ヒンジ領域（約70のアミノ酸残基）、及び／又は（iii）C末端安定エンドスタチンドメイン（約180のアミノ酸残基）を含む（Sasaki et al., 1998, EMBO J. 17, 4249）。
本明細書で使用されるNC-1ドメイン「由来の（から誘導される）」（ポリ）ペプチドとは、（ポリ）ペプチドが、NC-1ドメインにおける天然の（ポリ）ペプチドの対応するアミノ酸配列と同一であるか、あるいは該アミノ酸配列から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50又はそれ以上のアミノ酸残基が異なるが、対応するNC-1ドメインの生物活性（本明細書の他で記載するようなもの）、例えばオリゴマー化特性、抗血管新生活性、抗腫瘍化活性及び/又は抗線維症活性を少なくとも維持する（又はそれを超えさえする）ことを意味する。言及する用語C-1ドメインに「由来する」（ポリ）ペプチドは、本明細書の他で定義するようなNC-1ドメインの変異体（バリアント）を含む。
マウスコラーゲン18のNC-1ドメインのアミノ酸配列は配列番号3に示されており、一方ヒトコラーゲン18配列のNC-1ドメインの対応する配列は配列番号4に示されている。
配列番号4に示されるアミノ酸配列の約10〜約60のアミノ酸残基を含むヒトNC-1ドメインの「会合ドメイン」又は「会合領域」（両方の用語は互換的である）は、NC-1単量体に球状の三量体を形成させる非共有結合的な三量体化を担っている。したがって、この会合ドメインは三量体化ドメインとして機能する。タンパク質分解切断感受性「ヒンジ領域」は、配列番号4に示されるアミノ酸配列の約61〜約129のアミノ酸残基を含む。コンパクトな「エンドスタチンドメイン」は、配列番号4に示されるアミノ酸配列の約130〜約308のアミノ酸残基を含む。例えば、Sasaki, 前掲; Kuo 2001, JCB 152, 1233; Tjin et al. 2005, Cancer Res 65, 3656.を参照。エンドスタチンドメインは、エンドスタチンのN末端に位置して亜鉛への結合を媒介する亜鉛結合部位を含む（Ding et al., 1998, PNAS 95, 10443; US 7,524,811）。興味深いことに、この亜鉛結合部位はエンドスタチンの抗腫瘍／抗血管新生作用を担っていることが示されている（Boehm et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 190）。NC-1ドメインの会合ドメインとエンドスタチンドメインは、ヒンジ領域により接続されている（Sasaki et al.、前掲を参照）。ヒンジ領域は、例えばMMP-3、-7、-9、-13及び-20などのマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）によって切断されることが分かっている（Heliasvaara et al., Exp Cell Res 2005, 307, 192）。
上述のNC-1のドメイン構造は構造データに基づいている。NC-1内のドメインの位置付けに使用される用語「約」は、言及されたドメイン間の正確な境界が示された位置から1、2、3、4、5又はそれ以上のアミノ酸残基分異なる場合があることを反映している。しかし、例えば、会合ドメインとヒンジ領域間の正確な境界は、出発点として配列番号4の約10〜約60のアミノ酸残基を含む会合ドメインを生成し、例えば長さ49、48、47、46、45などのアミノ酸残基でより短い断片を作製することによって決定することができる。その後、そのより短い断片のオリゴマー化特性について解析することができ、即ち、それらが完全な会合ドメインである場合に可能であるように、依然として三量体などのオリゴマーを形成できるかを解析し得る。
あるいは、エンドスタチンドメインをNC-1のドメインのオリゴマー化特性に対処するための出発点とすることもできる。例えば、本明細書で定義されるNC-1ドメインにおける単量体、二量体及び／又は三量体の変移（transition）の正確な境界を特定する方法は、ａa）NC-1ドメインからのものである又はNC-1ドメインに由来する、エンドスタチンドメインからなるペプチドで始まり、約10〜20アミノ酸残基ずつ大きさが増加するエンドスタチンドメインからなる前記ペプチドが続く、一連の組換えペプチドを生成する工程と、b）工程ａ）の組換えペプチドをそのオリゴマー化特性、即ち、前記ペプチドが二量体又は三量体を形成できるか否かについて試験し、かつそのようなオリゴマーを形成できるペプチドを特定する工程と、c）NC-1ドメインにおいて単量体、二量体及び／又は三量体の変移の正確な境界を決定する工程を含む。この方法はさらに、工程b）で特定された二量体又は三量体を形成できる組換えペプチドを使用してオリゴマーを構築する工程d）を含んでもよい。NC-1ドメインからのものである又はNC-1ドメインに由来する一連の組換えペプチドの生成には、当技術分野で周知のペプチド又はタンパク質合成を使用することができる。本明細書において定義したようなタンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーのオリゴマー化特性の試験には、例えばウェスタンブロット解析、免疫沈降法、SDS-PAGE、クロマトグラフィ法又はその他当技術分野で周知の方法を利用することができる。例えば、Sambrook et al., Molecular cloning : a laboratory manual / Sambrook, Joseph; Russell, David W. --. 3rd ed. -- New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001を参照。したがって、当業者は、過度の負担なく、本明細書に定義するNC-1ドメインにおける単量体、二量体及び／又は三量体の変移の正確な境界を特定することができる。さらに、上述のドメインモデルは、会合ドメインをコードするエクソン38と39、ヒンジ領域をコードするエクソン40、及びエンドスタチンドメインをコードするさらに3つのエクソンを備え、遺伝子構造に非常によく適合する（Sasaki et al.、前掲）。
上述した方法によって生成される組換え（ポリ）ペプチドを使用して、オリゴマー又はかかるオリゴマーを形成する融合タンパク質、例えばFc融合タンパク質を生成することができ、これを次に抗線維症活性、抗血管新生活性、抗浸潤/抗転移活性、血管透過性低減活性、抗炎症及び/又は抗腫瘍化活性についてさらに試験してもよい。かかる組換え（ポリ）ペプチド又は融合タンパク質を含むオリゴマーは特に、本明細書の他で定義するような線維症若しくは線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患、又はマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患を治療、緩和又は予防するための医薬組成物として有用である。
本明細書で参照する用語「コラーゲン18のNC-1単量体」は、オリゴマー化ドメイン、ヒンジ領域及び／又はエンドスタチンドメインを含む。
本明細書で使用される「オリゴマー化ドメイン」という用語は、一般に、本明細書で定義される2つ又はそれ以上のNC-1単量体のサブユニットアセンブリを媒介するタンパク質ドメインを指す。上述したように、オリゴマー化ドメインはNC-1単量体の二量体化、三量体化又は四量体化等を媒介する。そのようなオリゴマー化は、例えば、多価と高結合強度、向上された構造安定性、異なるドメインの機能組み合わせの機能的な利点につながり、NC-1単量体と比較して、生物活性の強化、例えば向上又は増加された抗線維症活性、抗血管新生活性、抗浸潤／抗転移活性、血管透過性低減活性、抗炎症及び／又は抗腫瘍化活性などをもたらす。オリゴマー化ドメインは、例えばNC-1ドメインの会合ドメイン、即ち、NC-1単量体又はコラーゲン18らせんの非共有結合的なオリゴマー化を担うコラーゲン18の非三重らせん三量体化ドメインを含み得る。例を挙げると、ヒトNC-1ドメインの会合ドメインは、配列番号4に示されるアミノ酸配列の約10〜約60のアミノ酸残基、好ましくはアミノ酸残基10〜60、又はそのペプチドを含み得る。会合ドメイン又はそのペプチドは、NC-1単量体の非共有結合三量体化を媒介することができる。会合ドメイン又はそのペプチドの三量体化特性は、当技術分野で公知でもある本明細書の他で言及する方法によって試験することができる（Sambrook,前掲）。別の態様において、オリゴマー化ドメインは、オリゴマー化とより長い半減期を提供する、文献に十分に記載されている他の足場構築物／ドメインを含むことができ、これは例えば、Ali and Imperiali 2005, Bioorganic and Medicinal Chemistry 13, 5013による概説を参照のこと。そのようなオリゴマー化ドメインは、タンパク質又はペプチドオリゴマーにおいて、上述の天然ヒトNC-1ドメインで見られるような会合ドメインと構造的及び機能的に置き換えて、又は前記会合ドメインに加えて使用される。あるいは、オリゴマー化は、免疫グロブリンのFcドメインによって媒介される、即ち、本明細書で定義されるようなNC-1単量体のオリゴマー化ドメインは、免疫グロブリンのFcドメインを含む又は免疫グロブリンのFcドメインである。当技術分野において周知であるとおり、Fcドメインの、例えば、ペプチド又はタンパク質への融合は、循環系におけるより長い半減期を媒介する。Fcドメインは、上述したNC-1ドメインの会合ドメインに加えて、前記NC-1単量体で使用でき、又は会合ドメインと置換できることが理解されるだろう。Fcドメインは、Fcそのものが二量体であるため、本明細書で定義されるNC-1単量体に二量体構造をもたらす。別の態様において、オリゴマー化は、例えば、以下でより詳細に説明されるように、ジスルフィド結合の形成を生じるNC-1単量体への変異など、構造修飾の導入によって媒介されてもよい。さらにタンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーは、共有結合により形成されてもよいと考えられる。
本明細書において言及されるとき、「ヒンジ領域」は、配列番号4に示されるアミノ酸配列の約61〜約129のアミノ酸残基、好ましくは61〜129のアミノ酸残基、又はそれらのペプチドを含む。ヒンジ領域又はそれらのペプチドは、MMP-3、-7、-9、-13又は-20切断部位のような、少なくとも1つの内在性のタンパク質分解切断部位を含み得る。場合により、コラーゲン18のNC-1単量体内のヒンジ領域は、ヒンジ領域の内在性のプロテアーゼ切断部位に加えて、1つ以上の組換えプロテアーゼ切断部位を含むことができる。そのような組換えプロテアーゼ切断部位は、例えば、エンテロキナーゼ、第Xa因子、又はトロンビン切断であり得る(Bergers及びJavaherian; Leeら、前掲)。例えば、各々のプロテアーゼによる切断は、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーからの、N末端エンドスタチンペプチドのようなエンドスタチンドメイン又はその断片の放出を可能にする。ヒンジ領域又はそれらのペプチドはまた、1より多くのタンパク質分解切断部位、例えば2、3、4、又は更に多くのタンパク質分解切断部位を含み得る。
ヒンジ領域は、オリゴマー化ドメインと、エンドスタチンドメイン又はN末端エンドスタチンペプチドのような前記エンドスタチンドメインの断片(複数可)との間に挿入され得る。好ましくは、ヒンジ領域は、本明細書において言及されるNC1-単量体において、オリゴマー化ドメインとエンドスタチンドメイン又はそれらの断片(複数可)との間に配置される。コラーゲン18のNC-1単量体内のドメインの配置は、オリゴマー化ドメイン-ヒンジ領域-エンドスタチンドメイン若しくは前記エンドスタチンドメインの断片(複数可)、又はエンドスタチンドメイン若しくは前記エンドスタチンドメインの断片(複数可)-ヒンジ領域-オリゴマー化ドメインであり得る。
上述のNC-1単量体はまた、オリゴマー化ドメイン及びエンドスタチンドメインをも含み得る。この場合、ヒンジ領域は存在しない。
本明細書において使用されるとき、「コラーゲン18のエンドスタチンドメイン」は、配列番号4に示されるアミノ酸配列の約130〜約308のアミノ酸残基、好ましくは130〜308のアミノ酸残基を含む。前記エンドスタチンドメインの対応するアミノ酸配列は、例えば、UniProtKBアクセッション番号P39060(ヒト)及びP39061(マウス)由来であり得る。更に、本明細書において使用されるとき、コラーゲン18のエンドスタチンドメインは、マウスエンドスタチンのアミノ酸配列を示す図2中の配列番号18、及びヒトエンドスタチンのアミノ酸配列を示す図2中の配列番号19を含む。配列番号18又は19の7位のグルタミンがシステインによって置き換えられ、ジスルフィド結合によって共有結合するエンドスタチン二量体をもたらすコラーゲン18のエンドスタチンドメインもまた本発明の範囲に包含される。他に特定されない場合、本明細書において使用される用語「エンドスタチン」は、コラーゲン18のエンドスタチンドメインを指す。
NC-1単量体はまた、完全なエンドスタチンドメインの代わりに前記エンドスタチンドメインの断片を含み得る。例えば、断片は、本明細書で定義されるコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドであり得る。NC-1単量体は、コラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドを少なくとも1つ含むが、2、3、4、又は更に多くのN末端エンドスタチンペプチドをも含み得る。N末端エンドスタチンペプチドは、同一の又は異なるものであり得る。直鎖状、分岐状又は環状のN末端エンドスタチンペプチドが包含される。例えば、2、3、又はそれ以上のN末端エンドスタチンペプチドを直鎖状形態に配置し得ることも想定される。エンドスタチンドメイン又はそれらのN末端ペプチドは、(少なくとも)抗線維症活性を有する。更に、エンドスタチンドメイン又はそれらのN末端ペプチドは、抗血管新生活性、抗浸潤/抗転移活性、血管透過性低減活性、抗炎症及び/又は抗腫瘍化活性を有し得る。
本明細書において使用されるとき、用語「コラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチド」は、コラーゲン18のエンドスタチンドメインのアミノ(N又はNH2)末端からの、又はそれに由来するペプチドを意味する。コラーゲン18のエンドスタチンドメインのN末端は、配列番号18(マウスのコラーゲン18のエンドスタチンドメインに対応)、又は好ましくは配列番号19(ヒトのコラーゲン18のエンドスタチンドメインに対応)のアミノ酸残基約1からアミノ酸残基約132、好ましくはアミノ酸残基1からアミノ酸残基132を含む。それらのより短い断片、すなわち、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110、120又は130のアミノ酸残基が更に包含される。例えば、配列番号19(ヒトのコラーゲン18のエンドスタチンドメインに対応)のアミノ酸残基1からアミノ酸残基132を含むポリペプチドは、そのようなより短い断片の抗線維症活性、抗血管新生活性、抗浸潤/抗転移活性、血管透過性低減活性、抗炎症及び/又は抗腫瘍化活性に取り組むための出発点としての役割を果たし得る。続いて、ヒトエンドスタチンドメインからなるペプチドから出発し、前記ヒトエンドスタチンドメインからなるペプチドのサイズをアミノ酸残基の約5〜20刻みで低減し、そして上述の活性についてこれらの組換えペプチドを分析して、ヒトエンドスタチンドメインからの、又はそれに由来する一連の組換えペプチドが作製される。前記生物活性を分析する試験は、本明細書において他の箇所に記載され、当該技術分野において公知である。好ましくは、コラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドは、配列番号20(マウス)又は配列番号22(ヒト)に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる。図2もまた参照。一態様において、コラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドは、野生型N末端エンドスタチンペプチドと比較してアミノ酸配列に変更のないN末端エンドスタチンペプチドを含む。換言すると:そのようなペプチドのアミノ酸配列は、天然のNC-1のエンドスタチンドメインに見出すことができる。「コラーゲン18のエンドスタチンドメインのN末端に由来するペプチド」は、NC-1のエンドスタチンドメイン内の対応する天然のエンドスタチンペプチドと、1、2、3、4、5、又は更に多くのアミノ酸残基において異なり得るが、NC-1のエンドスタチンドメイン内の対応するエンドスタチンペプチドの生物活性(例えば、抗線維症活性、抗血管新生活性、抗浸潤/抗転移活性、血管透過性低減活性、抗炎症及び/又は抗腫瘍化活性)を少なくとも維持(又は更に超越)する、ペプチド又はペプチド変異体を含む。そのようなペプチドは、本明細書において、「N末端エンドスタチン由来ペプチド」又は「コラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドの変異体」とも呼ばれ、本明細書において使用されるとき、用語「コラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチド」に包含される。コラーゲン18のエンドスタチンドメインのアミノ末端からの又はそれ由来のペプチドは、本明細書の他の箇所に記載される、更なる修飾を示し得る。例えば、それは、融合タンパク質の二量体化若しくはオリゴマー化を媒介するために、免疫グロブリンのFcドメインへと融合することができるか、又は本明細書で定義される別のオリゴマー化ドメインを含むことができる。融合タンパク質は、本明細書の他の箇所に記載されるような更なる治療薬を含むこともできる。
本明細書において使用されるとき、用語「治療」は、本明細書で定義されるタンパク質オリゴマー若しくはペプチドオリゴマー又は融合タンパク質の必要とする対象に対する投与によって、本明細書において言及されるような疾患に関連する1つ以上の症状の改善、又は排除さえも意味する。
本明細書において言及されるとき、用語「緩和」は、本明細書に特定されるようなタンパク質オリゴマー若しくはペプチドオリゴマー又は融合タンパク質を投与することによる、対象における本明細書において言及される疾患をより良好にするか又は改善する作用を意味する。改善はまた、疾患の進行の減速又は停止として表われてもよい。
本明細書において使用されるとき、用語「予防」は、本明細書に定義されるようなタンパク質オリゴマー若しくはペプチドオリゴマー又は融合タンパク質の投与による、本明細書において言及される疾患の発症又は再発の回避を意味する。
本明細書において使用されるとき、用語「線維症関連疾患」は、線維症と関連する任意の障害を意味する。線維症関連疾患は、好ましくは、皮膚の線維症、好ましくは強皮症;ケロイド又はケロイド瘢痕;肥厚性瘢痕;限局性強皮症;移植片対宿主病の結果としての線維症;上皮下線維症;心内膜心筋線維症;子宮線維症;骨髄線維症;後腹膜線維症;腎性全身性線維症;手術後の瘢痕;喘息;肝硬変/肝線維症;異常な創傷治癒の結果としての線維症;糸球体腎炎;子宮内膜症、多巣性線維硬化症（multifocal fibrosclerosis）;放射線誘発線維症(刺激誘発線維症の例として)、好ましくは放射線誘発肺炎又は放射線誘発肺線維症;化学療法誘発又は薬物誘発線維症、例えば、mTOR又はEGFRキナーゼ阻害の結果として;通常又は特発性肺線維症(特発性線維症の例として);自己免疫疾患の結果としての線維症、例えば、ループス、腫瘍内及び癌関連の線維症/線維形成、臓器線維症が続く慢性炎症(例えばウイルス刺激又は移植を介する);慢性腎疾患、長期透析又は糖尿病の最終段階としての臓器線維症からなる群から選択される(PMID:15939343、Common pathways in idiopathic pulmonary fibrosis and cancer、Eur Respir Rev 2013 22:265-272、Nat Rev Nephrol. 2014 Mar 25. doi: 10.1038/nrneph.2014.31. PMID:24662433、及びPMID:23938596、Nat Rev Nephrol. 2014 Apr;10(4):226-37. doi: 10.1038/nrneph.2014.14. Epub 2014 Feb 11. PMID:24514753、Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2014 Jan;11(1):4. doi: 10.1038/nrgastro.2013.227. Epub 2013 Nov 26. PMID:24275791)。
特発性肺線維症(IPF)は、特発性線維化性肺胞炎(CFA)としても知られている状態であり、肺の支持骨格(間質)の線維症を特徴とする肺疾患の慢性進行性形態である。定義により、肺線維症の原因が不明である(「特発性」)ときにのみ、この用語が使用される。IPFを有する患者からの肺組織を、病理学者が顕微鏡で検査すると、通常型間質性肺炎(UIP)として知られる組織学的/病理学的特徴の特徴的な集合を示す。UIPは、肺の支持骨格(間質)を含む両方の肺の進行性の瘢痕形成を特徴とする。
本明細書において言及されるとき、タンパク質オリゴマー若しくはペプチドオリゴマー又は融合タンパク質は、少なくとも抗線維症活性を有する。本明細書において使用されるとき、「抗線維症活性」は、線維症又は線維症関連疾患の減速、停止、又は後退をも引き起こす生物活性を意味する。好ましくは、線維症又は線維症関連疾患は、本明細書で定義されるタンパク質若しくはペプチドオリゴマー又は融合タンパク質の抗線維症活性によって治癒する。「線維症」は、臓器又は組織の正常な構成要素としての線維性組織の形成とは対照的である、(例えば、放射線及び/又は化学療法に対する反応における)修復的又は反応性のプロセスとしての、臓器又は組織中の過剰な線維性結合組織の形成又は発生である。例えば、治療に関連する線維症の低減は、サイトカイン及び増殖因子の調節と関連し得る。
本明細書で定義されるタンパク質オリゴマー若しくはペプチドオリゴマー又は融合タンパク質の抗線維症活性は、例えば当該技術分野において公知である動物モデルによって試験することができ、以下の実施例において示される。例えば、ブレオマイシン及び放射線誘発の肺線維症モデルは、肺線維症の研究に使用されている(Rubin、前掲; Kamp、前掲、Gurujeyalakshmiら(1996)、Res. Commun. Pharmacol. Toxicol. 1、p.1-15; Gurujeyalakshmiら(1999)、Am. J. Physiol. 276、p.L311-L318; Hallahanら(2002)、J. Natl. Cancer Inst. 94、p.733-741)。本明細書において特定されるタンパク質オリゴマー若しくはペプチドオリゴマー又は融合タンパク質の抗線維症活性は、組織学的に(炎症、肉芽腫形成及び/又は線維症の低減又は減少)、増殖因子及び/又はサイトカインの発現(例えば、PDGF受容体活性化の阻害、トランスフォーミング増殖因子-βの低減、受容体チロシンキナーゼ活性化の阻害、IL-1β、KC、又はTIMP-1の低減)、コラーゲンの低減、線維芽細胞増殖及び線維芽細胞から筋線維芽細胞への形質転換の阻害並びに/又はBALリンパ球の低減、高解像度コンピュータ断層撮影を用いる線維症の質的及び量的サロゲート(例えば肺密度[ハウンズフィールド単位]の増加及び肺容量の減少)の低減、改善された酸素飽和度(血液ガス分析、パルスオキシメトリ)、肺機能検査(PFT)、及び、臨床症状(呼吸数、心拍数、右心不全の徴候、拡散量、肺活量測定)の分析によってもまた分析され得る。
本明細書において使用されるとき、用語「血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患」は、湿性黄斑変性症、子宮内膜症、気管支喘息及び糖尿病、増強されたVEGF誘導性血管透過性(例えば、脳組織の照射後の増強された透過性、「放射線壊死」)、血管緊張の変化(例えば、高血圧)、関節リウマチなどのようなVEGFレベルの脱調節に依存する良性の病態生理学的な状態、並びに腎細胞癌及び他のVEGF依存的(addicted)腫瘍、腹水のVEGF依存性発生、免疫系のVEGF依存性抑制、例えば骨髄由来細胞(BMDC)、骨髄由来サプレッサー細胞(MdSC)、未成熟樹状細胞などの動員及び微小環境教育のような悪性VEGF依存性疾患を意味する。好ましくは、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患は、VEGF-A関連疾患である。
本明細書において言及されるとき、用語「マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患」は、MMP活性化が病態生理に寄与する良性及び悪性の疾患、例えば、神経膠芽細胞腫、膵臓癌、肺癌のような高い局所治療失敗率を有する腫瘍において固有に顕在化する局所腫瘍浸潤及び癌転移のプロセスの間のMMPの活性化、並びに、治療に誘導される選択圧に関連して獲得されたMMP活性化の増強(例えば、放射線療法後の腫瘍低酸素及び線維症)、自己免疫疾患及び慢性炎症性疾患などにおける顕著な免疫反応を意味する。好ましくは、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患は、MMP-2/MMP-9関連疾患である。
好ましい実施形態において、本明細書において言及されるタンパク質オリゴマー若しくはペプチドオリゴマー又は融合タンパク質は、抗線維症活性に加えて、1、2、又は更に多くの生物活性を有し、追加の生物活性は、抗血管新生活性、抗浸潤/抗転移活性、血管透過性低減活性、抗炎症及び抗腫瘍化活性からなる群から選択される。
抗線維症活性に加えて、本明細書で定義するタンパク質オリゴマー若しくはペプチドオリゴマー又は融合タンパク質は、抗血管新生活性、抗浸潤/抗転移活性、血管透過性低減活性、抗炎症及び／又は抗腫瘍化活性を有し得る。そのような活性には、例えば、体内における内皮細胞及び／又は周皮細胞の成長又は遊走、管又は内皮の形成、新しい毛細血管の成長を阻害する生物活性、血液供給を遮断することによる良性又は悪性腫瘍の成長速度低下又は阻害などあらゆる生物活性が含まれ、他の抗腫瘍剤又は抗血管新生剤、例えばVEGF阻害剤などの副作用／毒性を減少し、それらの作用機構との干渉によって、すなわち血圧を下げる、悪性及び良性疾患における炎症反応の調節により、又は治療後の治療可能時間域内におけるかん流若しくは低酸素症などの病態生理学的パラメータを改善して、その結果、追加治療（例：放射線治療、化学療法又は抗アポトーシス療法）の効果を促進することができる。抗血管新生活性は、インビトロアッセイで、又は当技術分野で周知の動物モデルによりインビボで、試験することができる（Abdollahi et al., Cancer Res. 2003, 63, 8890; Mol. Cell 2004, 13, 649; PNAS 2007, 104, 12890; Drug Resist. Update 2005, 8, 59; Bergers et al., Science 1999, 284, 808; Javaherian et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 45211; Lee et al., Clin. Cancer Res. 2008）。例えば、抗血管新生活性は、成長因子（例えばVEGF）により刺激された内皮細胞の増殖及び／又は遊走の阻害によってインビトロで試験することができる。インビボでは、抗血管新生活性は、例えば、ニワトリ絨毛尿膜（CAM）アッセイで分析することができ、一方抗腫瘍活性は、例えば、A549、LLC又はH460非小細胞肺癌、HT29結腸癌、BxPC3膵臓癌、Karpas 299リンパ腫、MOLM-13 AML（急性骨髄性白血病）、786-0、A2058細胞株（メラノーマ）又はRENCA腎細胞癌（RCC）及びその他多くを含む動物腫瘍モデルで試験することができる（Abdollahi et al., Drug Resist. Update 2005, 前掲）。
本発明のタンパク質オリゴマー若しくはペプチドオリゴマー又は融合タンパク質に加えて使用することができる血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患の治療のための医薬としては、例えば血管透過性の他の調節因子（例えば、脳組織の照射後の増強された透過性、「放射線壊死」）及び血管緊張の他の調節因子（例えば、エンドセリンアンタゴニストであるマシテンタン、AT1/ACEインヒビター)、喘息におけるβ2-交感神経刺激薬及びコルチコイド、慢性炎症/自己免疫疾患における免疫抑制剤、種々のVEGF依存性腫瘍及び腹水のための化学療法及び放射線療法、例えば腎細胞癌において使用されるキナーゼ阻害剤（mTORi、例えばRAD001、マルチキナーゼ阻害剤であるパゾパニブ(pazopanib)/スイチニブ(suitinib)/アキシチニブ(axitinib)、免疫モジュレーター、例えばチェックポイント阻害剤である抗PD-1/PD-L1抗体）が挙げられる。
本発明のタンパク質オリゴマー若しくはペプチドオリゴマー又は融合タンパク質に加えて使用することができるマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患の治療のための医薬としては、例えば放射線（化学）療法によって処置された局所領域療法の高い失敗率を示す局所浸潤性腫瘍、例えば神経膠芽細胞腫（glioblastoma）、膵臓癌、抗炎症及び免疫抑制療法（抗TNFα抗体/インフリキシマブ、ミコフェノール酸、シクロホスファミドなど）、癌治療、例えば再発グリオーマにおける抗血管形成治療、乳癌などの高MMP-2/-9活性を有する転移性疾患の治療（すなわちホルモン療法であるタモキシフェン、HER2+疾患におけるトラスツズマブ、化学療法）の後の腫瘍浸潤又は偽進行が挙げられる。
本出願において参照する用語「対象」は、家畜動物、ペット、マカク（Macaque）（例えばアカゲザル（Macaca mulatta））又はヒトに関する。好ましくは、家畜動物又はペットは哺乳動物である。より好ましくは、対象は、本明細書で定義するような線維症若しくは線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患、又はマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患を患うヒトであり、それゆえ上述した疾患の治療の必要がある。
本明細書で使用する用語「約」は、言及する要素、数、パーセンテージ又は用語の値を修飾する場合、言及する要素、数、パーセンテージ又は用語の値のプラスマイナス10パーセント、9パーセント、8パーセント、7パーセント、6パーセント、5パーセント、4パーセント、3パーセント、2パーセント又は1パーセントの範囲を意味する。アミノ酸配列に関して、用語「約（およそ）」は、プラスマイナス5アミノ酸残基、4アミノ酸残基、3アミノ酸残基、2アミノ酸残基又は1アミノ酸残基を意味する。好ましくは、プラスマイナス10パーセント；又はプラスマイナス3若しくは1アミノ酸残基の範囲である。
本明細書で使用する用語「含む（comprising、comprises及びcomprised of）」は、「含む（including、includes）」又は「含有する（containing、contains）」と同義語であり、包括的又は開放的であり、追加的な記載されていない部材、要素又は方法の工程を排除するものではない。明らかに、用語「含む」は、用語「からなる」を包含する。より具体的には、本明細書で使用する用語「含む」は、請求項が記載した要素又は方法の工程のすべてを包含するが、追加的な挙げていない要素又は方法の工程をも含んでもよいことを意味する。例えば、工程a)、b)及びc)を含む方法は、その最も狭い意味においては、工程a)、b)及びc)からなる方法を包含する。「からなる」という表現は、その組成物（又はデバイス、又は方法）が、記載された要素（又は工程）を有しそれ以上はないことを意味する。対照的に、用語「含む」は、さらなる工程、例えば工程a)、b)及びc)に加えて工程d)及びe)を含む方法を包含し得る。
用語「少なくとも1つ」は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又はそれ以上を意味する。
本発明者によって、以前の研究において、ヒトコラーゲン18に由来する三量体NC-1（会合ドメイン、ヒンジドメイン、エンドスタチンドメインを含むNC-1を有する）はフィブロネクチンと結合し、一方エンドスタチン単量体はフィブロネクチンへの結合を欠いていることが見出されている（WO 2013/026913参照）。フィブロネクチンは血管形成及び抗血管形成試薬と結合する主要な細胞外マトリックスタンパク質として認識されている。エンドスタチンは生理的条件下で単量体である。エンドスタチンの主要な前駆体は、それぞれが約330のアミノ酸を有する3つの相互に連結された鎖から成る三量体分子、NC-1である。これは、エンドスタチンと比較してNC-1三量体が特異的な性質を持つことを示している。さらに、二量体を形成するFc-エンドスタチン、及びエンドスタチンのアミノ酸7位で（グルタミンからシステインへの）単一変異を有する人工エンドスタチン二量体はフィブロネクチンへの結合を維持し、フィブロネクチンへの結合におけるオリゴマー化の重要性が示されている。ヒト血清中のエンドスタチンサイズの分子探しの後、発明者は従来サイズの（約20kDaの）エンドスタチンを特定できなかった。ヒト血液循環におけるエンドスタチンサイズ分子の出現はヒト血清採取後のプロテアーゼによるNC-1三量体の分解に起因する可能性がある。NC-1三量体はコラーゲン18分解の主要な生理的産物のようであり、組織と循環系に存在し、（単量体）エンドスタチンにはない特異的な生物学的特性を示す。発明者はさらにフィブロネクチンのVEGF、NC-1三量体に対する高親和性結合を実証し、末梢血血小板タンパク質溶解物からのこれら3つの相互作用パートナー候補に免疫共沈降を行った。さらに、NC-1三量体、フィブロネクチン、VEGF及びアルファ5ベータ1（α5β1）インテグリンの生体内共局在を実証することができ、このことは、フィブロネクチンとVEGF、NC-1三量体、インテグリンα5β1の集合が抗血管新生プロセス開始の前触れとなるモデルを示唆している。最も重要なことに、NC-1三量体対エンドスタチンの抗腫瘍研究により、NC-1三量体がエンドスタチンよりも有力な抗血管新生タンパク質であることが示された。
予想外にも、本発明者は、最近の研究において、以下の実施例に示すように、N末端エンドスタチンペプチドを含むFc-エンドスタチン融合タンパク質によって例証されるタンパク質オリゴマーによって成功的に治療し得ることを見出した。この結果は、抗線維症活性がアミノ酸残基133〜180のC末端エンドスタチンペプチド（E4ペプチド参照）についてのみ報告されていたWO 2011/050311（前掲）及び対応するYamaguchi et al.による科学刊行物 （Sci. Transl. Med. 2012, 4, p. 136ra71）の教示に照らして驚くべきものであった。対照的に、N末端エンドスタチンペプチドについてそのような活性は示されていなかった。
抗血管新生効果に主に関与することが知られているエンドスタチンのN末端亜鉛結合領域[Tjin, R.M.ら、A 27-amino-acid synthetic peptide corresponding to the NH2-terminal zinc-binding domain of endostatin is responsible for its antitumor activity. Cancer Research、2005. 65(9): p.3656-3663]がこの内在性タンパク質により誘発される抗線維症効果にも関連するという本発明者の知見はまた、エンドスタチンのC末端ドメインの抗線維症効果を仮定する最近公表されたYamaguchi et al.（前掲）によるデータと明らかに対照的である。本発明者が使用した放射線誘発肺線維症（RILF）モデルにおいて、C末端ペプチドは、最も研究された線維症発生のパラメーターを改善するのに有効ではなかった。まとめると、本発明者のデータは、RILFモデルにおけるその抗線維症効果の根底にあるN末端配列及びエンドスタチンの二量体化の重要な役割を示している。
E4ペプチド含有領域であるエンドスタチンC末端を詳しく調べると、分子の仮定された抗線維症効果について機序の説明を提供し得る、この断片と潜在的なタンパク質相互作用パートナーとを結びつける明白な構造的特徴は示されない。E4ペプチド活性の欠如に関する別の説明は、それらのYamaguchi et al.により使用されている急性マウス線維症モデルとは対照的に、本発明者は、線維症の発生が遅く(照射後24週を超える)、かつヒトにおける病態生理学により近く類似している慢性の動態に従う放射線誘発肺線維症モデルを使用したことであり得る。
しかしながら、さらなる研究過程において、肺線維症の最も効率的な緩和は、合成エンドスタチン二量体(Fc-エンドスタチン)を使用したときに本発明者により見出された。Fc-エンドスタチン(FcE)は、2つのFc鎖(ジスルフィド結合によって結合される)からなり、各々が単一のFc鎖へと連結するエンドスタチンの2つの分子へと伸長する。したがって、Fc二量体の結果として、2つの近接したエンドスタチン分子は二量体となる。
以下の実施例に示すデータに基づいて、本発明者による仮説は、オリゴマーエンドスタチンの有益な抗線維症効果が少なくとも部分的にはフィブロネクチンに結合するその特性によって媒介され、これによりNC-1オリゴマー又はエンドスタチンオリゴマー又はエンドスタチンの少なくとも2つのN末端ペプチドを含むオリゴマーを、NC-1又はエンドスタチンの単量体又は単量体断片と区別するということである。
本発明者の見解によると、エンドスタチンはNC-1の最終分解産物である。本発明者は、以下の実施例において、エンドスタチン二量体及びNC1三量体の結合特性が、関連するタンパク質相互作用パートナーの点でエンドスタチン単量体とはかなり異なることを更に実証する新規のデータを提示する。
例えば、オリゴマーエンドスタチン及びNC1のみが、フィブロネクチン、VEGF、MMP-2及びMMP-9に結合することができるが、単量体エンドスタチンはできないことが見出された。図9〜12も参照のこと。
換言すると、組織リモデリングの主要なプレイヤーへの結合において重要な役割を果たし、その抗線維症及び抗癌の効果の探索のために大きな影響を有することが、エンドスタチン、エンドスタチンペプチド及びNC1のオリゴマー化特性である。
当業者であれば、この重要な知見が、例えばFcを介する二量体化のような合成設計、又はエンドスタチン前駆体分子NC1を模倣する薬物を生成及び改善するための他の選択肢のいずれかによって、オリゴマーエンドスタチンペプチド又はエンドスタチン由来ペプチドの生物学的特性を追求するための新しい道を開くことを理解するだろう。
タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーの一実施形態において、本明細書で使用する「NC-1単量体」又は「コラーゲン18のNC-1単量体」は、コラーゲン18の非コラーゲン性NC-1ドメインの完全な又は少なくとも一部分を含む。好ましくは、NC-1単量体はヒトである。
本明細書の他で説明するように、コラーゲン18の完全なC末端NC-1ドメインは、N末端会合領域、中央プロテアーゼ感受性ヒンジ領域及びC末端安定エンドスタチンドメインを含む（Sasaki et al., 1998, EMBO J. 17, 4249）。上記NC-1ドメインのこの少なくとも一部分は、コラーゲン18、好ましくはヒトコラーゲン18（配列番号2に示すような）の非コラーゲン性NC-1ドメインの少なくとも1つのドメイン、領域又は断片を含む。好ましくは、ヒトNC-1ドメインは配列番号4を含む又はこれからなる。
本明細書で使用するNC-1単量体は、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーの一態様において、コラーゲン18エンドスタチンドメインの少なくとも1つのN末端ペプチド（簡単には、N末端エンドスタチンペプチド若しくはN末端ペプチド）又はコラーゲン18エンドスタチンドメインの少なくとも1つのN末端エンドスタチン由来ペプチドを含む。
タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマー、コラーゲン18、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン、コラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチド、及びN末端エンドスタチン由来ペプチドは、既に本明細書の他で定義している。好ましくは、上記オリゴマー、コラーゲン18、エンドスタチンドメイン、N末端ペプチド又はN末端エンドスタチン由来ペプチドはヒトである。
ペプチド模倣体及び有機模倣体の実施形態もまた想定され、これによりかかるペプチド及び有機模倣体の化学構成要素の3次元配置が、ポリペプチド骨格及び要素のアミノ酸側鎖の3次元配置を模倣し、測定可能な又は増強された抗線維症活性を有するエンドスタチンドメイン、N末端エンドスタチンペプチド又はN末端エンドスタチン由来ペプチドのかかるペプチド及び有機模倣体が生じる。コンピュータモデリング適用について、ファルマコフォアは、生物活性のための構造的要件の理想的な3次元定義である。ペプチド及び有機模倣体は、現在のコンピュータモデリングソフトウエアを用いて（コンピュータ支援薬物設計、すなわちCADDを用いて）各ファルマコフォアにフィッティングするように設計することができる。CADDに使用される技術の説明については、Walters, "Computer-Assisted Modeling of Drugs," Klegerman & Groves, eds., 1993, Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press: Buffalo Grove, Ill., pp. 165-174及びPrinciples of Pharmacology, Munson (ed.) 1995, Ch. 102を参照のこと。また、かかる技術を用いて調製される模倣体も含まれる。
一態様において、N末端ペプチド又はN末端エンドスタチン由来ペプチドは、エンドスタチンドメインの完全な亜鉛結合部位／ドメインを含む。すなわち、配列番号19のヒスチジン1、3及び11とアスパラギン酸76を含む。好ましくは、上述したペプチドは、配列番号19の少なくともヒスチジン1、3及び11を含む。
別の態様において、N末端ペプチド又はN末端エンドスタチン由来ペプチドは、Tjin（前掲）に記載されている27アミノ酸のペプチド、又はその断片を含む。好ましくは、その27アミノ酸ペプチドの断片は少なくともヒスチジン1、3及び11を含む。
本明細書において使用されるタンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーにおいて使用することができるN末端ペプチド又はN末端エンドスタチン由来ペプチドのさらなる例は、図2及び以下の実施例に示されており、配列番号7、9、10、13、15、18、19、20若しくは22を含む、あるいは文献に、例えば、Tjin et al.（前掲）又はEP 1107989 B1若しくはUS 7,524,811に記載されている。
好ましくは、エンドスタチン由来ペプチド又はエンドスタチンペプチドは約10〜約40アミノ酸残基の長さであり、好ましくは15〜35、好ましくは20〜32、より好ましくは24、25、26、27、28、29又は30アミノ酸残基である。例えば、配列番号9は、NC-1エンドスタチンドメイン（ED）の活性モチーフ（即ち、抗血管新生活性及び／又は抗腫瘍活性を媒介するアミノ末端亜鉛会合ドメイン）の26アミノ酸残基の長さの対応するマウス配列を示し、一方配列番号10は25アミノ酸残基の長さである対応するヒト配列を示している。これら配列においてヒスチジン残基は特に重要であり、これは本発明者により以前の研究で発見されているとおり、前記ヒスチジン残基をアラニン残基で置換すると抗腫瘍活性及び抗血管新生活性が消失するためである。
本発明のタンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーの好ましい実施形態において、NC-1単量体は、本明細書に別途定義されるエンドスタチンドメインを含む、又は前記エンドスタチンドメインからなる。好ましくは、前述のエンドスタチン由来ペプチド、エンドスタチンペプチド又はエンドスタチンドメインが、前記エンドスタチンドメインの7位でグルタミンからシステインへの単一の変異を含む。そのような変異はジスルフィド架橋を形成でき、したがって、二量体を形成することができ、これは例えば、Kuo 2001, JCB 152, 1233; Tjin et al. 2005, Cancer Res 65, 3656を参照できる。したがって、上記変異は、二量体化のための手段として、本明細書に記載されるタンパク質又はペプチドオリゴマーに使用することができる。
本発明のさらなる実施形態において、NC-1単量体は、エンドスタチンドメイン、エンドスタチン由来ペプチド又はエンドスタチンペプチドに加え、ヒンジ領域を含む。そのような構築物は恐らく単量体を形成し、あるいは二量体を形成する可能性がある。前記ヒンジ領域がそのような構築物の二量体会合に寄与する可能性もあるため、二量体の形成は除外することができない。場合により、そのようなNC-1単量体は、前述の構成要素に加えて、会合ドメイン、即ち、本明細書で言及されるヒトコラーゲン18の非三重らせん三量体化ドメイン、又は別のオリゴマー化ドメインを含む。当業者には明らかであるように、会合ドメインの存在は三量体の形成につながる。別の態様において、前記NC-1単量体は上述で定義されたNC-1ドメインのエンドスタチンドメインと会合ドメインを含み、かつさらに別の態様において、前記NC-1ドメインのそれぞれ会合ドメイン、ヒンジ領域、エンドスタチンドメインを含む。後者の態様において、前記NC-1単量体は、ヒトコラーゲン18の完全なNC-1ドメインを含むか、あるいは（約38kDaの）ヒトコラーゲン18のNC-1ドメインである、即ち、ヒトコラーゲン18のNC-1ドメインからなる。ヒトコラーゲン18のNC-1ドメイン及び前記NC-1ドメインの構造は、例えば、Sasaki et al.（前掲）によって定義されている。コラーゲン18のNC-1ドメインは、315（マウス）又は312（ヒト）アミノ酸残基の非三重らせん配列からなる。上述したように、NC-1ドメインは上述の会合ドメインを介して非共有結合的に会合し、三量体を形成することが分かっている。
本明細書において使用するNC-1単量体はヒトであることが好ましい。
NC-1のオリゴマー化はこのタンパク質の少なくとも2つのドメインによって媒介され、1つは三重らせん構造を表すタンパク質のN末端で約50のアミノ酸からなるもの、つまり、会合ドメインである。オリゴマー化に関与する第2のドメインはエンドスタチンのN末端にあり、亜鉛に結合することができる。ヒトエンドスタチン亜鉛部位は、配列番号19のヒスチジン1、3及び11とアスパラギン酸76により形成される。前記ドメインは高濃度のエンドスタチンで二量体を形成することが示されている（Ding et al.、前掲）。したがって、いくつかの態様において、NC-1単量体は、会合ドメイン及びエンドスタチンドメインのN末端を含む。また、プロテアーゼ感受性のヒンジ領域が、すでに上述したように、NC-1のオリゴマー化で役割を果たすことも可能である。したがって、本発明のいくつかの態様において、NC-1単量体はさらにNC-1ドメインのヒンジ領域を含むことができる。
本発明のNC-1単量体は好ましくは、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、又は310アミノ酸残基より長く、二量体化又はオリゴマー化が可能なものである。さらに、少なくとも抗線維症活性を有する。NC-1単量体が会合ドメイン、ヒンジ領域、及びエンドスタチンドメインの亜鉛結合部位／ドメイン又は完全なエンドスタチンドメインを含む場合、好ましくはNC-1単量体が312アミノ酸残基より長いことが、かつ少なくとも315、320、330、340、350、400、500又はそれ以上のアミノ酸残基を含むことがより好ましい。
さらなる実施形態において、タンパク質オリゴマーは、コラーゲン18の少なくとも2つのエンドスタチンドメインを含むが、3つ、4つ、5つ又はそれ以上のエンドスタチンドメインをも含んでもよい。
例えば、実施例11において使用されるFc-エンドスタチン(FcE)は、2つのFc鎖(ジスルフィド結合によって接続される)からなり、各々が単一のFc鎖へと連結するエンドスタチンの2つの分子へと伸長する。したがって、Fc二量体の結果として、2つの近接したエンドスタチン分子は二量体となる。実施例11において使用される別の二量体コンストラクトは、コラーゲン18の2つのエンドスタチンドメインを含んでいた。各々のエンドスタチンドメインは、グルタミンがシステインによって置き換えられる単一の変異を7位に含んでいた。各々のエンドスタチンドメインは、介在するエンテロキナーゼ切断部位を伴って免疫グロブリンのFc領域へと連結された。このコンストラクトにおいて、Fcとエンドスタチンの両方は、別々にそれらの対応するジスルフィド結合によって二量体化された。この組換えタンパク質のエンテロキナーゼ消化は、Fc二量体とエンドスタチン二量体をもたらした。
別の実施形態において、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーは、コラーゲン18のエンドスタチンドメインの少なくとも2つのN末端ペプチドを含むが、3つ、4つ、5つ又はそれ以上のN末端ペプチドをも含んでもよい。
本明細書において使用する用語「コラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチド」は、コラーゲン18のエンドスタチンドメインのアミノ末端からのペプチドである。NC-1単量体及びそのオリゴマー化に関する定義、説明及び実施形態は、コラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドに必要な変更を加えて適用する。コラーゲン18のエンドスタチンドメインのN末端は、配列番号18又は19（コラーゲン18のエンドスタチンドメインに対応する）のアミノ酸残基1〜132を含む。好ましくは、コラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドは、本明細書の他に定義されるようなエンドスタチンペプチド（野生型と比較してアミノ酸配列に変化なし）又はエンドスタチン由来ペプチドである。
一実施形態において、コラーゲンエンドスタチンドメインのN末端ペプチドは、配列番号18又は19（コラーゲン18のエンドスタチンドメイン）のアミノ酸残基約1からアミノ酸残基約132のアミノ酸配列である又はこれを含む。
マウスコラーゲン18のエンドスタチンドメインの対応するアミノ酸配列は配列番号18に示され、これに対してヒトコラーゲン18のエンドスタチンドメインの対応するアミノ酸配列は配列番号19に示される。図2も参照のこと。本出願で参照する用語「コラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチド」は、配列番号19のアミノ酸残基約1（H; ヒスチジン）と132（E; グルタミン酸）の間、好ましくは配列番号19のアミノ酸残基約1（H; ヒスチジン）と115（P; プロリン）の間、好ましくはアミノ酸残基約1（H; ヒスチジン）と92（G; グリシン）の間、より好ましくは配列番号19のアミノ酸残基約1（H; ヒスチジン）と76（D; アスパラギン酸）の間、よりさらに好ましくは配列番号19のアミノ酸残基約1（H; ヒスチジン）と27（R; アルギニン）の間又は配列番号19のアミノ酸残基約1（H; ヒスチジン）と25（G; グリシン）の間に位置するペプチドを含む。コラーゲン18エンドスタチンドメインの別のN末端ペプチドの例はTjin et al.（前掲）又はUS 7,524,811若しくはEP1668129 B1に示されており、参照により本明細書に組み入れる。好ましくは、エンドスタチン由来ペプチド又はエンドスタチンペプチドは、約10〜約40アミノ酸残基の長さ、好ましくは約15〜35、好ましくは約20〜32、より好ましくは約24、25、26、27、28、29若しくは30アミノ酸残基である。コラーゲン18エンドスタチンドメインの別の好ましいN末端ペプチドは以下の実施例において例示されている。
エンドスタチンのN末端亜鉛結合ドメイン又はエンドスタチンのN末端亜鉛結合ドメインに対応する合成ペプチドは、例えば配列番号9及び10のアミノ酸配列に示されている。本発明には、配列番号9及び10のアミノ酸配列の変異体（バリアント）が包含され、例えば配列番号9及び10のより短いアミノ酸配列を同様に用いることができる。例えば、本発明者は、配列番号9の1〜13位又は配列番号10の1〜12位に対応するペプチドをタンパク質又はペプチドオリゴマーにおけるエンドスタチンペプチドとして使用し得ることを見出した。さらに、少なくともNC-1のエンドスタチンドメインの対応するエンドスタチンペプチドの抗線維症活性（本明細書の他で記載するような）を維持（又は超えさえする）しながら、そのようなペプチドが、対応するエンドスタチンペプチド又はエンドスタチン由来ペプチドとは1、2、3、4又はそれ以上のアミノ酸残基で異なっていてもよい。これに関して、本明細書の他で記載した理由のため、配列番号9又は10の1、3及び/又は11位に相当するヒスチジンアミノ酸残基を維持することが重要である。さらに、他の類似の二価カチオン（すなわち銅）による亜鉛の置き換えは、亜鉛と比較してより強力なエンドスタチンのN末端ペプチド、エンドスタチン及びNC-1ドメイン又は単量体を生じ得る。
WO 2011/050311及びYamaguchi et al.（Sci. Transl. Med. 2012, 4, p. 136ra71）に記載されているC末端エンドスタチンポリペプチド又はペプチド、すなわちWO 2011/050311における配列番号2、4又は13及び本出願の配列番号21のアミノ酸残基133〜180の40個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド又はポリペプチドは本発明の範囲から除外される。さらに、本発明の知見とは対照的に、Yamaguchi et al.による刊行物ではN末端エンドスタチンペプチドE1（アミノ酸残基1〜45）及びE2（アミノ酸残基71〜115）については抗線維症活性は示されなかったことに留意のこと（以下の実施例を参照）。この点に関して、本出願の知見はさらにいっそう驚くべきものである。
本明細書で定義される「コラーゲン18のNC-1単量体」、「コラーゲン18のエンドスタチンドメイン」又は「コラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチド」は、追加のタンパク質ドメイン又はサブユニット、例えば、上述の免疫グロブリンのFcドメイン、又は、例えば精製及び／若しくは検出に使用することができる、タンパク質タグ、例としてHisタグ、c-mycタグ、Flagタグなどを含んでもよい。当技術分野で周知のとおり、タンパク質タグは組換えタンパク質に遺伝子工学的に移植したペプチド配列である。一態様において、これらのタグは、化学試薬によって又はタンパク質分解若しくはインテインスプライシングなどの酵素的手段によって除去可能である。そのようなタグは、本明細書で言及されるNC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン又はコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドに結合される。タンパク質にアフィニティタグが付けられ、当技術分野で周知のアフィニティ法を使用して細胞溶解物などのそれらの粗製の生物源からそれらを精製することができる。これらには例えば、キチン質結合タンパク質（CBP）、マルトース結合タンパク質（MBP）、免疫グロブリンのFcドメイン又はグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）が含まれる。ポリ（His）タグはタンパク質タグとして広く使用されており、金属マトリックス上に結合する。可溶性タグは、タンパク質における適切な折りたたみを支援し、沈殿しないようにするために、特に大腸菌などのシャペロン欠損種において発現される組換えタンパク質に使用される。これらには、例えば、チオレドキシン（TRX）及びポリ-(NANP)が含まれる。一部のアフィニティタグはMBP、及びGSTなどの可溶化剤として二重の役割を有する。クロマトグラフィータグは、NC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン又はコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドのクロマトグラフィー特性を変えるために使用され、特定の分離法にわたる異なる分解能を可能にする。往々にして、これらはFLAGタグなどのポリアニオンアミノ酸から成る。エピトープタグは、多くの異なる種において高親和性の抗体を高い信頼性で産生することができるために選択された短いペプチド配列である。これらは通常ウイルス遺伝子に由来し、これがそれらの高い免疫活性を説明している。エピトープタグは、例えば、V5タグ、c-mycタグ、HAタグを含む。これらのタグは、例えば、ウェスタンブロッティング及び免疫沈降法の実験に有用であり、またタンパク質精製にも利用できる。蛍光タグはタンパク質に関する可視的な情報を提供するために用いられる。最も一般的に使用される蛍光タグはGFP及びその変異体である。GFPのより高度な応用には、折りたたみレポーター（折りたたみの場合蛍光色、そうでない場合色なし）としての使用が含まれる。タンパク質タグには、特異的な酵素修飾（ビオチンリガーゼタグなど）及び化学修飾（Flashタグ）など、その他多くの利用法がある。また、さまざまなタグを組み合わせて、NC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン又はコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドの多機能的修飾を生み出すこともできる。
本明細書で定義されるヒトコラーゲン18のNC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン又はコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドは、タンパク質オリゴマーの抗線維症活性、抗血管新生活性及び／又は抗腫瘍化活性の向上及び／又は検出に役立つ可能性がある、例えば、124I、125I、131I、Cu-64、Cu-67、Y-86、Zr-89、Y-90、Re-188、Ga-68などの放射性同位元素；又はDTPAなどのキレートに結合する放射性核種；ジフテリア毒素、又はアポトーシス誘導剤などの毒素；又は化学物質、例えばタキソール又はゲムシタビンなどの化学療法剤も含んでもよい。
他の実施形態において、タンパク質又はペプチドオリゴマーはPEG化される。PEG化（pegylation）は、一般に薬物又は治療用タンパク質（本明細書に定義するようなタンパク質又はペプチドオリゴマーなど）である他の分子にポリエチレングリコール（PEG）高分子鎖を共有結合するプロセスである。PEG化は通常、PEGの反応性誘導体と標的高分子のインキュベーションにより達成される。PEGの薬物又は治療用タンパク質に対する共有結合は、宿主の免疫系から物質を「マスク」でき（免疫原性と抗原性を減弱化する）、物質の流体力学的サイズ（溶液中の大きさ）を増加して、腎クリアランスを減少することで体内循環時間を延長する。PEG化は疎水性薬物及びタンパク質に水溶性を提供することもできる。化合物のPEG化は当技術分野で周知であり、例えばDamodaran and Fee 2010, European Pharmaceutical Review 15, 18を参照のこと。
本明細書で使用される「Fc領域」又は「Fcドメイン」という用語は、細胞表面受容体と相互作用する抗体又は免疫グロブリンのテール領域である結晶化フラグメント領域、即ち、Fc受容体、及び補体系の一部タンパク質を指す。この特性は抗体が免疫系を活性化することを可能にする。IgG、IgA及びIgD抗体アイソタイプにおいて、Fcドメインは抗体の2本の重鎖の第2及び第3定常ドメインに由来する2つの同一タンパク質断片から構成され、IgM及びIgEのFcドメインは各ポリペプチド鎖に3つの重鎖定常ドメイン（CHドメイン2〜4）を含む。IgGのFcドメインは非常によく保存されたN-グリコシル化部位を有する。Fc断片のグリコシル化はFc受容体媒介活性に不可欠である。この部位に付加されたN-グリカンは主に複合型のコアフコシル化二分岐構造である。加えて、これらN-グリカンの少量はバイセクティングGlcNAcとα-2,6結合型シアル酸残基も有する。免疫グロブリンのFcドメインのタンパク質への融合は哺乳動物細胞における融合タンパク質の産生と分泌を強化することが分かっている（Lo et al., 1998, Protein Eng. 11, 495, Capon et al., 1989, Nature 337, 525）。さらに、血管新生阻害剤の免疫グロブリンFcドメインへの結合は当該阻害剤の半減期を増加することが示されている（Capon et al. 1989, Nature 337, 525; Gordon et al., 2001, J. Clin. Oncol. 19, 843; Holash et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11393）。しかしながら、Fcドメインは精製、可溶化及び／又は検出目的に利用できるのみならず、以下の説明と続く実施例に示すように、タンパク質又はペプチドオリゴマーの生物学的特性を有利に変える。一実施形態において、1つ又はそれ以上のFcドメインが、希望に応じて、エンテロキナーゼ又はトロンビンなどのプロテアーゼで処理することにより切断可能である。好ましくは、本明細書で言及されるFcドメインはヒトIgG由来である（Bergers and Javaherian Science 1999; Lee et al Clin Canc Res 2008）。当業者に明らかであるように、原則的に、任意のIgGアイソフォームを使用して本発明のオリゴマーを生成することができる。IgGのFcドメインのサブフラグメント又は単鎖でさえも本明細書に記載するオリゴマーの半減期延長又はオリゴマー化に使用することができる。本明細書で言及するオリゴマー又は融合タンパク質の生成に使用できるマウス及びヒトFcドメインのアミノ酸配列、例えば、Fc-NC-1又はNC-1-Fc融合タンパク質、又はFc-エンドスタチン若しくはエンドスタチン-Fc融合タンパク質は、配列番号5及び6にそれぞれ示されている。同様に、N末端エンドスタチンペプチド-Fc融合タンパク質又はFc-N末端エンドスタチンペプチドは、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーにおいて使用することができる。換言すれば、Fcドメインは、本発明の融合タンパク質において、N末端にも又はC末端にも位置することができる。
一態様において、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーは、当業者に周知の化学合成又は組換え分子生物技法により製造することができる。例えば、Sambrook et al., Molecular cloning : a laboratory manual / Sambrook, Joseph; Russell, David W. --. 3rd ed. -- New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001参照。
例えば、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーは、(a)タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーをコードする核酸配列を含む宿主細胞を、好ましくは血清不含条件下で、培養する工程、(b)工程(a)の宿主細胞からタンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーを取得する工程、及び場合により、(c)タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーを、好ましくは血清不含条件下で、保存する工程を含む方法によって生成することができる。本発明者により、オリゴマーNC-1、例えばNC-1三量体が、長期にわたる血清又は細胞培養培地中で維持された場合に、4℃でさえも分解を受けやすいということが見出された。したがって、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーを血清不含条件下で製造及び維持することが有利である。あるいは、コラーゲン18のNC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン又はコラーゲン18のエンドスタチンドメインのN末端ペプチドをコードするポリヌクレオチドを好適な条件下で、適当な宿主細胞において発現させ得る。記載のNC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン又はN末端エンドスタチンペプチドの二量体又はオリゴマーへの集合（アセンブリ）は細胞内で生じる。続いて、二量体又はオリゴマーを当技術分野で公知の方法により単離及び／又は精製することができる（例えばSambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y.及びAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)参照）。例えば、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーは、例えば宿主細胞溶解物から、慣用的な精製技法、限定されるものではないが、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ及び／又は分取（preparative）ゲル電気泳動などにより得ることができる。あるいは、記載したNC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン又はN末端エンドスタチンペプチドは、細胞からNC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン又はN末端エンドスタチンペプチドを単離及び／又は精製した後に、in vitroにおいて二量体又はオリゴマーにアセンブルすることができる。
一実施形態において、タンパク質又はペプチドオリゴマーはフィブロネクチンに結合する。さらに、オリゴマーは、VEGF、好ましくはVEGF-A、MMP-2、MMP-9及び／又はインテグリンα5β1に結合することができる。この本発明のタンパク質又はペプチドオリゴマーのフィブロネクチン、VEGF、MMP-2、MMP-9及び／又はインテグリンα5β1への結合は、当技術分野で公知の方法により、例えば免疫沈降、ELISAアッセイ又はBiacoreにより決定することができる。
タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーの別の実施形態において、ヒトコラーゲン18のNC-1単量体は、オリゴマー化ドメイン、ヒンジ領域及び／又はエンドスタチンドメイン又は該エンドスタチンドメインの断片を含む。いくつかの実施形態において、ヒトコラーゲン18のNC-1単量体は、オリゴマー化ドメイン、ヒンジ領域及び完全なエンドスタチンドメインを含む。他の具体的な実施形態において、ヒトコラーゲン18のNC-1単量体は、オリゴマー化ドメイン、ヒンジ領域及びエンドスタチンドメインの断片を含む。エンドスタチンドメインの断片は、好ましくはエンドスタチンドメインのN末端断片、より好ましくはエンドスタチンドメインのN末端ペプチド又はコラーゲン18のエンドスタチンドメインのN末端に由来するペプチドである。エンドスタチンドメインの断片は、好ましくは、NC-1単量体において、本明細書に定義するようなN末端エンドスタチンペプチドの少なくとも1つを含む。上記エンドスタチンドメインの断片は、本明細書に定義するようなN末端エンドスタチンペプチドの2つ、3つ、4つ又はそれ以上をも含んでもよい。
タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーの別の好ましい一実施形態において、ヒンジ領域はオリゴマー化ドメインとエンドスタチンドメイン又は該エンドスタチンドメインの断片の間に介在される。好ましくは、ヒンジ領域は、本明細書で言及されるNC-1単量体におけるオリゴマー化ドメインとエンドスタチンドメイン又はその断片の間に位置する。ヒトコラーゲン18のNC-1単量体内のドメイン配置は、好ましくは、オリゴマー化ドメイン−ヒンジ領域−エンドスタチンドメイン若しくは該エンドスタチンドメインの断片、又はエンドスタチンドメイン若しくは該エンドスタチンドメインの断片−ヒンジ領域−オリゴマー化ドメインである。
場合により、ヒトコラーゲン18のNC-1単量体内のヒンジ領域は、ヒンジ領域の内因性MMPプロテアーゼ切断部位に加えて又はその代わりに、1つ又はそれ以上の組換えプロテアーゼ切断部位を含むことができる。そのような組換えプロテアーゼ切断部位は、例えば、エンテロキナーゼ又はトロンビン切断とすることができる（Bergers and Javaherian; Lee et al. 前掲; Lo et al., 1998, Protein Engineering 11(6), 1998, p. 495-500）。上記刊行物はさらに、上記切断部位（複数でもよい）を導入するために使用することができる適切なリンカー領域、例えばポリ-グリシンリンカーなどを記載している。それぞれのプロテアーゼによる切断は、例えば、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーのエンドスタチンドメインの放出を可能にする。
別の実施形態において、本明細書で参照するNC-1単量体はヒンジ領域を欠損する。
タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーの別の実施形態において、コラーゲン18のNC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン又はコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドはさらに、フィブロネクチンのRGDモチーフ及び／又はPHSRNモチーフを、好ましくは融合タンパク質中に含む。好ましくは、コラーゲン18のNC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン又はコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドは、フィブロネクチンのRGDモチーフ及びPHSRNモチーフを含む。
例えば、配列番号11及び12は、フィブロネクチンのインテグリンへの結合にとって重要なRGDモチーフと周囲のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供する。簡単に言うと、フィブロネクチンはインテグリンα5β1及びαVβ3によって認識される。インテグリン結合のためのフィブロネクチンの一次配列モチーフは、力を受ける（force-bearing）FN-III10のG鎖とF鎖に繋がるループ上にあるトリペプチド、Arg-Gly-Asp（RGD）である。フィブロネクチンのインテグリン結合に関与するのはタイプIIIフィブロネクチンの第9ドメインにあるPro-His-Ser-Arg-Asn（PHSRN）モチーフである。
対応するマウス及びヒトフィブロネクチン（FN）のアミノ酸配列は、例えば、アクセッション番号NP_034363.1及びNP_997647.1にそれぞれ示されている。ヒトFNのドメイン構造は、例えばWijelath et al. 2006, Circ. Res. 99, 853-860の刊行物から誘導することができる。好ましくは、フィブロネクチンのRGDモチーフは配列番号11、12又は17を含む、又はこれら配列のいずれかからなる。
好ましくは、エンドスタチンペプチド又はエンドスタチン由来ペプチドは、融合タンパク質のN末端に位置し、フィブロネクチンのRGDモチーフ及び／又はPHSRNモチーフは、C末端に位置する。
好ましくは、そのような融合タンパク質は配列番号7又は13に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい一実施形態において、融合タンパク質はさらに本明細書で定義されるようにFcドメイン又は人工オリゴマー化ドメインを含む。好ましくは、人工オリゴマー化ドメインを有する融合タンパク質は、配列番号15に示されるアミノ酸配列を含む。好ましくは、融合タンパク質は、本明細書に定義されるようなFcドメイン及び人工オリゴマー化ドメインを含む。
WO 2013/026913における以前の実験データに基づき、本発明者はオリゴマーNC-1がフィブロネクチン（FN）を介してその効果が導き出されると仮定した。これに加えて、以下の実施例では、オリゴマーNC-1及びオリゴマーエンドスタチンが、細胞外マトリックスのリモデリング、線維症の発生、癌の進行及び転移において重要な役割を果たすVEGF及びマトリックスメタロプロテイナーゼMMP-2/MMP-9に結合することが見出された。さらに、WO 2013/026913において、長い暴露、即ち、4連続インビボ継代後、FNが腫瘍で大幅に下方制御され、オリゴマーNC-1（Fc-エンドスタチン）に対して耐性を示すようになることがわかった。このため、FNを失うことがオリゴマーNC-1に対する先天的及び後天的耐性の主要な機序を構成する可能性があると仮定した。この概念を証明するために、エンドスタチン（ED）−フィブロネクチン複合体の主要な効果を模擬して最小ペプチド配列が操作された。この目的のために、発明者らはまず、27のアミノ酸−NH2−末端領域から成るEDドメイン全体で最も活性のあるモチーフを選択した（Tjin Tham Sjin et al. 2005, Cancer Res. 65, 3656-63）。本発明者によるデータは、この領域自体がVEGFに結合可能であり、このペプチド配列におけるヒスチジン（亜鉛結合ドメイン）がVEGF結合に不可欠である可能性があることを示している。これは、ヒスチジンがアラニン残基で置換された変異ペプチドはVEGF−ED−二量体（Fc-エンドスタチン）結合と競合することができなかったため想定しることである。一方、フィブロネクチンは、ITGA5B1への結合に不可欠な2つの活性モチーフ、即ち、PHSRN依存モチーフとRGD依存モチーフを含む。NC-1−EDのインテグリンシグナル伝達とその他特性を媒介したオリゴマーNC-1とFNの生理学的錯体を模擬するために、発明者らはこれら2つの不可欠のモチーフ、即ち、上述のNC-1−EDドメインで最も活性があるモチーフと、「RGD」及び結合に重要な周囲のアミノ酸残基を含むフィブロネクチンのインテグリン結合モチーフを融合し、「スーパースタチン」（Superstatin）と呼ばれるハイブリッドの融合タンパク質を生成した。各融合タンパク質について、マウス及びヒトの相当物が設計された。マウス（C57BL6）LLC（ルイス肺癌）肺がんモデルを使用して、発明者らはマウススーパースタチンペプチドが腫瘍の成長を強く阻害する有効性を示すことができた。加えて、スーパースタチンは対照群と比較して大幅に長く生存した。対照的に、FNモチーフ単独では腫瘍成長の予防において有意な改善は見られなかった。
マウス（m）スーパースタチンの対応するアミノ酸配列は配列番号7に示されており、一方ヒト（h）スーパースタチンの対応するアミノ酸配列は配列番号13に示されている。スーパースタチンはほぼ単量体である。配列番号15は、配列番号13の7位でグルタミンをシステインにより置換することによって、二量体化が可能なヒトスーパースタチンアミノ酸配列の変異型を示す。FNのRGDモチーフの代わりにPHSRNを含む別の構築物、及びジスルフィド結合又はFc領域を介したスーパースタチンの二量体化を促進する構築物が調製され、抗線維症活性に関して評価される。
タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーの別の実施形態において、ヒトコラーゲン18のNC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン又はコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドは、天然又は異種のオリゴマー化ドメインを含む。
好ましくは、天然のオリゴマー化ドメインはヒトコラーゲン18の非三重らせん三量体化ドメインである。
好ましくは、異種のオリゴマー化ドメインは、Fcドメイン及び人工オリゴマー化ドメインからなる群より選択されるオリゴマー化ドメインである。
本明細書で参照されるオリゴマー化ドメインは、ヒトコラーゲン18の非三重らせん三量体化ドメイン（即ち、会合ドメイン）、Fcドメイン及び／又は人工オリゴマー化ドメインを含み得る。オリゴマー化ドメインは、一態様において、天然のオリゴマー化ドメイン、すなわちNC-1ドメインの3つ鎖の三量体化を担うヒトコラーゲン18の非三重らせん三量体化ドメインを含む。別の態様においては、異種のオリゴマー化ドメイン、例えば抗体又は免疫グロブリンのFcドメインを含む。Fcドメインはそれ自体が二量体であるため、本明細書で定義されるNC-1単量体、エンドスタチンドメイン又は該エンドスタチンドメインのN末端ペプチドに二量体構造をもたらす。第三の態様において、人工オリゴマー化ドメイン、例えば、2つの単量体間のジスルフィド架橋をもたらすシステインへの点変異（上述の天然のヒトNC-1において見られる会合ドメインを構造的且つ機能的に置換する、又は前記会合ドメイン若しくはFcドメインに加えて使用される）を含む。二量体化又はオリゴマー化のための他の手段及び方法は本明細書の他で記載されており、当技術分野において公知であり、例えばコイルドコイル、ロイシンジッパー、CovX体技術などが含まれ、本明細書で使用される用語「異種のオリゴマー化ドメイン」又は「人工オリゴマー化ドメイン」に含まれる。また、本発明の範囲には、タンパク質オリゴマーのオリゴマー化ドメインが、ヒトコラーゲン18の非三重らせん三量体化ドメインとFcドメインを含むことが包含される。さらに、人工オリゴマー化ドメインとFcドメインを含み得る。例えば、実施例11において使用された二量体コンストラクトの1つは、コラーゲン18の2つのエンドスタチンドメインから構成される。それぞれのエンドスタチンドメインは、グルタミンがシステインで置き換えられた7位に単一変異を含んだ。各々のエンドスタチンドメインは、介在するエンテロキナーゼ切断部位を伴って免疫グロブリンのFc領域へと連結された。このコンストラクトにおいて、Fcとエンドスタチンの両方は、それらの対応するジスルフィド結合によって二量体化された。この組換えタンパク質のエンテロキナーゼ消化は、Fc二量体とエンドスタチン二量体をもたらした。
好ましくは、FcドメインがIgG又はその他免疫グロブリンアイソフォーム、及び当技術分野で説明されるオリゴマー化とより長い半減期を提供するその他足場構築物に由来し、これは例えば、Lo et al., Protein Engineering 1998, 11, 495を参照できる。マウスFcドメインは、例えば配列番号5に示されている。より好ましくは、FcドメインがヒトIgG由来であり、さらに好ましくはヒトIgG1由来である。特に好ましくは、前記ヒトFcドメインが配列番号6又は配列番号24に示されるアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなる。
別の好ましい実施形態において、Fcドメインは「ノブイントゥーホール(knobs-into-holes)」(KiH)操作Fcドメインである。ノブイントゥーホールは、抗体の第3の定常ドメインに対する、よく検証されたヘテロ二量体化技術である。基本的に、概念は、最も多くの相互作用が起きる2つのCH3ドメイン間の接点の修飾に依存する。かさ高い残基が1つの抗体重鎖のCH3ドメインに導入され、それは鍵と同様に作用する。他の重鎖において、このかさ高い残基を収容することのできる、錠を模倣する「ホール」が形成される。生じるヘテロ二量体のFc部分は、人工的なジスルフィド架橋によって更に安定化され得る。ヘテロ二量体化接点（interface）の最適化のプロセスにおいて、立体的な相補性、KiH、ジスルフィド結合、及びCH3ドメインのそれぞれの側において反対に荷電した残基を並置する塩橋を含む様々な合理的設計を評価し、最終的にファージディスプレイライブラリーを用いて最適化した。「ノブ」重鎖における「S354C、T366W」、「ホール」重鎖における「Y349C、T366S、L368A、Y407V」の6つの変異を導入することによって、97％を超える収率でヘテロ二量体化を伴う正しい重鎖結合を達成することができる(Kleinら、MAbs. 2012 Nov 1; 4(6): 653-663; Ridgwayら、Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-21)。更に、KiH変異を有する抗体の、(熱)安定性、FcγR結合及びエフェクター機能(例えば、ADCC、FcRn結合)、並びに薬物動態(PK)挙動のような特性は影響を受けない。非共有結合相互作用は、ヒンジ領域のジスルフィド架橋と共に、ヘテロ二量体形成に向かう会合を促し、組み合わせの異質性を最小にする。従来のアプローチを用いるNC-1の産生は、低いタンパク質収率に悩まされる。更に、Fcに融合したNC-1の産生もまた、多くの異なる凝集の形成のために些細な作業ではない。そのような異質性は、当業者に理解されるように、医薬組成物においては望まれない。NC-1を単量体として産生し、そのような(NC-1二量体、三量体、四量体、五量体などの混合物のような)異質性の凝集の形成を避けるためにKiH技術を使用することができる。好適なKiH操作Fcドメインは、例えば、配列番号25、26、28、及び30に記載される。例えば、配列番号25は、「ノブ」変異S354C/T366Wを有するヒトIgG1 Fcのアミノ酸配列を示し、配列番号26は、「ホール」変異Y349C/T366S/L368A/Y407Vを有するヒトIgG1 Fcのアミノ酸配列を記載する。
配列番号27は、「ノブ」変異(S354C/T366W)を有するヒトIgG1 Fcと、エンテロキナーゼ切断部位及びリンカーを介して融合したヒトNC-1を含む融合タンパク質のアミノ酸配列(N末端からC末端)を示す。この融合タンパク質は、「ホール」変異Y349C/T366S/L368A/Y407Vを有するヒトIgG1のFc(配列番号28)とヘテロ二量体化することができる。そのようなヘテロ二量体は、図14Bに図示される。エンテロキナーゼによるヘテロ二量体の切断は、NC-1単量体の生成をもたらす。NC-1単量体は、NC-1二量体又はNC-1三量体の生成に使用できる。明らかに、単量体エンドスタチンを産生する必要がある場合、NC-1の代わりにエンドスタチンを使用することができる。
配列番号29は、ヒトNC-1とリンカー及びエンテロキナーゼ部位を介して融合した「ノブ」変異(S354C/T366W)を有するヒトIgG1のFcを含む融合タンパク質のアミノ酸配列(N末端からC末端)を示す。この融合タンパク質は、「ホール」変異Y349C/T366S/L368A/Y407Vを有するヒトIgG1 Fc(配列番号30)とヘテロ二量体を形成することができる。そのようなヘテロ二量体は、図14Aに図示される。エンテロキナーゼによるヘテロ二量体の切断は、NC-1単量体の生成をもたらす。明らかに、単量体エンドスタチンを産生する必要がある場合、NC-1の代わりにエンドスタチンを使用することができる。
「ノブイントゥーホール」(KiH)操作Fcドメインは、上述の理由により、NC-1単量体又はエンドスタチン単量体の作製に特に有用である。したがって、ヒト免疫グロブリンのKiH操作Fcドメイン、より好ましくはヒトIgG1のKiH操作Fcドメインを本発明のタンパク質オリゴマー、ペプチドオリゴマー又は融合タンパク質の作製に使用することは好ましい。
別の実施形態において、NC-1の制御不能の凝集を避けるために、細胞においてコラーゲン18のNC-1単量体と免疫グロブリンのFc領域を、免疫グロブリンのFc領域と共に発現させる。このアプローチは、1つのFcがNC-1単量体に結合するFc-FC二量体の形成をもたらす。(トロンビン又はエンテロキナーゼのような)プロテアーゼ切断可能なリンカーをFcとNC-1単量体の間に挿入する場合、それぞれのプロテアーゼによる切断の際に、ヘテロ二量体からNC-1単量体を放出することができる。エンドスタチン単量体の生成においても同様のアプローチを使用できる。
更に別の実施形態において、NC-1ドメインにおける天然のN末端結合領域を省略又は変異導入して、NC-1がその天然の結合領域を介してオリゴマー化することがもはやできなくすることは適切であり得る。例えば、天然の結合領域が、例えば3、5、又は10アミノ酸残基で連続して低減する、一連の組換えNC-1ドメインを作製することができる。次いで、もはやそれらの天然の結合領域を介してオリゴマー化することができないNC-1変異体を同定するために、それらのオリゴマー化特性を試験する。前記変異体のオリゴマー化特性の試験のために、ウェスタンブロット解析、免疫沈降、SDS-PAGE、クロマトグラフィー法、又は当該技術分野において周知である他の方法を使用することができる。上述の方法によって作製された組換えポリペプチドを、本発明のタンパク質オリゴマー又は融合タンパク質を作製するのに使用することができ、次いで、本明細書で定義されるそれらの生物活性を更に試験することができる。別の実施形態において、結合に必要なアミノ酸残基を構造分析(例えば、SAPINのような計算又は3D構造分析)によって同定し、次いでこれに従って当技術分野に公知の組換え法(Sambrook and Russell、2001、前掲を参照)によって変異導入し、NC-1がもはやオリゴマー化することができなくする。別の実施形態において、NC-1ドメイン内の天然のN末端結合領域を完全に省略できる。機能的な結合領域を有さないNC-1ドメインをFc領域に融合する場合、二量体化がFc領域に媒介されるNC-1二量体の作製にそのような単量体を使用することができる。本明細書の他の箇所で定義されるように、本発明のタンパク質オリゴマーは、天然のN末端の結合領域内にそのような改変又は欠失を有する、ヒトコラーゲン18のNC-1単量体を、少なくとも1、若しくは2以上含むことができる。
NC-1単量体のオリゴマー化ドメイン、エンドスタチンドメイン又はエンドスタチンドメインのN末端ペプチドは、上述の説明のとおり、免疫グロブリンのFcドメイン、好ましくはIgG１由来のFcドメイン、又はIgG1由来のKiH操作Fcドメインとすることができる。タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーは、2つ、3つ又はそれ以上のFcドメインを含んでもよい。一態様において、Fcドメイン（複数可）は、必要に応じて、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーを切断してもよい。例えば、エンテロキナーゼ又はトロンビン切断部位などの人工プロテアーゼ切断部位は、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマー中のNC-1単量体又はエンドスタチンドメインとFcドメイン間に、例えば、対応する（ポリ）ペプチドリンカーによって、介在されてもよい（例えば、Bergers and Javaherian; Lee et al.; 前掲.; Lo et al., 1998, Protein Engineering 11(6), 1998, p. 495-500参照）。それぞれのプロテアーゼによる切断で、オリゴマーはFcドメイン（複数可）から放出される。
Fcドメイン（複数可）は精製及び／又は検出に使用することができる。さらに、Fcドメインは、循環中の半減期延長、及び生物活性の改善、好ましくは抗線維症活性、抗血管新生活性及び／又は抗腫瘍化活性の改善など、タンパク質オリゴマーの生物学的特性を変化させる。例えば、以下の実施例において実証するように、Fc-エンドスタチン融合タンパク質は二量体としてフィブロネクチンと結合することができることが分かっており、一方エンドスタチン単量体はできない。さらに、Fc-エンドスタチンはエンドスタチンより長い半減期を示す。
タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーのさらに好ましい実施形態において、人工オリゴマー化ドメインはエンドスタチンドメインの7位に単一の変異を含み、グルタミンがシステインにより置換される。好ましくは、本明細書で定義されるNC-1単量体、エンドスタチンドメイン又はエンドスタチンドメインのN末端ペプチドは一部の態様において、エンドスタチンドメインの7位でグルタミンからシステインへの単一の変異を含む。例えば、融合タンパク質中のFcドメインとエンドスタチンドメイン間の組換えにより導入されたエンテロキナーゼ切断部位は、エンドスタチンドメイン中の隣接するC7残基間のジスルフィド結合形成により、エンテロキナーゼ切断に際して二量体の形成につながることが分かっている。これはKuo 2001, JCB 152, 1233及び以下の実施例を参照できる。上述したように、NC-1三量体とエンドスタチン二量体は、エンドスタチン単量体と比較して、特異的な特性を有する。上述の7位での（グルタミンからシステインへの）変異は、エンドスタチンの抗腫瘍ドメインを表すことが示されている、エンドスタチンのN末端ペプチドに導入することもできる（Tjin et al. 2005, Cancer Res 65, 3656）。エンドスタチンドメインのN末端ペプチドのオリゴマー化は、上述した人工的二量体化、又は単に7位での変異のない、Fc部分への組換え融合のいずれかにより達成することができる。二量体化を媒介する7位での変異を含む融合タンパク質の例は、配列番号15に示されている。
タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーの別の好ましい実施形態において、ヒンジ領域内の組換えプロテアーゼ切断部位はエンテロキナーゼ又はトロンビン切断部位である。タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーのエンテロキナーゼ又はトロンビンによる切断は、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーからのエンドスタチンドメインの放出をもたらす。
タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーのさらに好ましい実施形態において、本明細書で定義されるNC-1単量体は、ヒンジ領域内で自然に発生するプロテアーゼ切断部位のみを含み、即ち、組換えプロテアーゼ切断部位を含まない。この場合、ヒンジ領域は、本明細書で別途説明されるように、例えば、NC-1単量体から、エンドスタチンドメインをリリースするために、例えば、MMPによって切断することができる。別の一態様において、NC-1単量体のヒンジ領域において自然に発生するこれらのプロテアーゼ切断部位は、NC-1単量体がプロテアーゼにより切断されなくなるように変異させることができる。この方法で、例えばタンパク質オリゴマーの半減期、抗線維症活性、抗血管新生活性、及び／又は抗腫瘍活性を依然として改善することができる。
タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーの別の好ましい態様において、オリゴマーは二量体又は三量体である。しかしながら、四量体若しくは五量体、又はより多くの、本明細書に定義されるようなNC-1単量体、エンドスタチンドメイン又はエンドスタチンドメインのN末端ペプチドを有するオリゴマーが、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーに包含される。
タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーを医薬活性化合物として含む医薬組成物は、治療的に有効な用量で、線維症若しくは線維症関連疾患の非ヒト又は好ましくはヒトの治療のために使用することができる。本発明の医薬組成物はまた、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患又はマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患の治療のために使用することができる。本明細書で参照する「対象」は、好ましくは線維症若しくは線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患又はマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患を患うヒトである。
好ましくは、線維症関連疾患は、皮膚の線維症、好ましくは強皮症;ケロイド又はケロイド瘢痕;肥厚性瘢痕;限局性強皮症;移植片対宿主病の結果としての線維症;上皮下線維症;心内膜心筋線維症;子宮線維症;骨髄線維症;後腹膜線維症;腎性全身性線維症;手術後の瘢痕;喘息;肝硬変/肝線維症;異常な創傷治癒の結果としての線維症;糸球体腎炎;多巣性線維硬化症（multifocal fibrosclerosis）;放射線誘発線維症(刺激誘発線維症の例として)、好ましくは放射線誘発肺炎又は放射線誘発肺線維症;化学療法誘発又は薬物誘発線維症、例えば、mTOR又はEGFRキナーゼ阻害の結果として;通常又は特発性肺線維症(特発性線維症の例として);自己免疫疾患の結果としての線維症、例えば、ループス、腫瘍内及び癌関連の線維症/線維形成、臓器線維症が続く慢性炎症(例えばウイルス刺激又は移植を介する);慢性腎疾患、長期透析又は糖尿病の最終段階としての臓器線維症からなる群から選択される。
好ましくは、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患が、VEGFレベルの脱調節に依存する良性の病態生理学的状態、例えば湿性黄斑変性症、子宮内膜症、気管支喘息及び糖尿病、増強されたVEGF誘導性血管透過性(例えば、脳組織の照射後の増強された透過性、「放射線壊死」)、血管緊張の変化(例えば、高血圧)、関節リウマチなど、並びに悪性VEGF依存性疾患、例えば腎細胞癌及び他のVEGF依存的腫瘍、腹水のVEGF依存性発生、免疫系のVEGF依存性抑制、例えば骨髄(bone marrow)由来細胞(BMDC)、骨髄(myeloid)由来サプレッサー細胞(MdSC)、又は未成熟樹状細胞の動員及び微小環境教育などからなる群より選択される。
好ましくは、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患は、MMP活性化が病態生理に寄与する良性及び悪性の疾患、例えば、神経膠芽細胞腫、膵臓癌、肺癌のような高い局所治療失敗率を有する腫瘍において固有に顕在化する局所腫瘍浸潤及び癌転移のプロセスの間のMMPの活性化、並びに、治療に誘導される選択圧に関連して獲得されたMMP活性化の増強(例えば、放射線療法後の腫瘍低酸素及び線維症)、自己免疫疾患及び慢性炎症性疾患における顕著な免疫反応からなる群より選択される。
一態様において、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーは液体又は凍結乾燥の形態で存在することができる。一態様において、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーは、グリセロール、タンパク質安定化剤（例えば、ヒト血清アルブミン（HSA））又は非タンパク質安定化剤と共に存在することができる。
タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーは、医薬組成物又は医薬（両用語は互換的に使用される）の有効成分であり、一態様において、従来の手順に従って薬物を標準の医薬担体と組み合わせることで調製された従来の剤形で投与される。これらの手順は、成分を所望の配合に合わせて混合、造粒、圧縮、又は溶解することを含むことができる。当然ながら、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤の形態及び性質は、それが組み合わされる有効成分の量、投与経路、その他周知の変数によって決まる。
担体は、製剤のその他成分と混合可能であり、かつその被提供者にとって有害でないという意味で許容可能でなければならない。使用される医薬担体は、固形、ゲル、又は液体を含むことができる。固形担体の例は、ラクトース、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸及び類似物である。液体担体の例は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、シロップ、オイル、水、乳剤、多様な種類の浸潤剤及び類似物である。同様に、担体又は希釈剤は、単独又は蝋を含むモノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリルなど、当技術分野で周知の時間遅延物を含むことができる。前記適した担体は、上述のもの及び当技術分野で周知のその他のものを含み、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaを参照。
希釈剤は、医薬組成物の生物活性、好ましくは抗線維症活性、抗血管新生活性、抗浸潤／抗転移性活性、血管透過性低減活性、抗炎症及び／抗腫瘍化活性に影響しないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液である。さらに、医薬組成物又は製剤はまたその他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤及び類似物を含むことができる。
タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーは、標準的な経路により投与することができる医薬組成物として製剤化されることが好ましい。一般的には、医薬組成物は、局所、経皮、腹腔内、頭蓋内/髄腔内、硝子体内、脳室内、大脳内、膣内、子宮内、経口、直腸又は非経口（例えば静脈内、脊髄内、皮下又は筋内）経路で投与することができる。
好ましくは、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーは、静脈内、皮下、頭蓋内/髄腔内、硝子体内、又は腹腔内投与される。
治療的に有効な量とは、医薬組成物において使用され、本明細書で言及される疾患に付随する症状を予防、改善又は治療する、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーの量を指す。化合物の治療的有効性及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ED50（集団の50％に治療的効果を有する用量）及びLD50（集団の50％に致死的な用量）によって判定することができる。治療的効果と有害作用の間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50の比率で表すことができる。
投与レジメンは、担当医師とその他臨床的因子によって決定される。医療の分野で周知であるように、任意の1人の患者に対する用量は、患者の体重、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全般的健康状態、同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。進歩は定期的な評価によって監視することができる。
好ましくは、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーは、約1〜100mg/kgの濃度で投与される。より好ましくは、濃度は約5〜75mg/kg又は約10〜50mg/kgであり、最も好ましくは約15mg/kgである。よりさらに好ましくは、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーは0.1〜1mg/kg/日の濃度で投与される。
本明細書で言及される医薬又は医薬組成物は、本明細書で列挙される疾患を治療又は改善あるいは予防するために少なくとも1回投与される。しかしながら、医薬は1回を超えて、例えば2回、3回、4回、5回、6回又はそれ以上の頻度で投与してもよい。
特定の医薬組成物は医薬分野で周知の方法で調製され、上述で言及された少なくとも1つの活性化合物を混合剤中に又はその他の方法で薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と共に含む。それら特定の医薬組成物を作るために、前記活性化合物は通常担体又は希釈剤と混合される。得られた製剤が投与形態に適応される。検討される被提供者に応じて用量の調整を行うために、処方者又は使用者向けの説明書で推奨される用量を示す必要がある。
医薬組成物は、本発明のさらなる態様において、タンパク質オリゴマーに加えて製剤中に薬剤に添加される薬物を含むことができる。例えば、組み合わせレジメン（併用レジメン）においてアンジオスタチンと共に使用してもよい。さらに、別の態様において、線維症の最近認可されたモジュレーター、例えばVEGF/PDFG RTKi（例えばニンデタニブ（Nindetanib））、TGF-βシグナル伝達の特異的及び非特異的阻害剤（ペルフィニドン（Perfinidone））、及びインテグリンシグナル伝達のモジュレーター（シレンジチド（cilengitide）、又は抗アルファVアビツズマブ）又は炎症（白血球浸潤、サイトカインインヒビター、亜集団に対する抗体）との組み合わせが想定される。タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーに加えて使用することができる血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患の治療のための医薬としては、例えば血管透過性の他の調節因子（例えば、脳組織の照射後の増強された透過性、「放射線壊死」）及び血管緊張の調節因子（例えば、エンドセリンアンタゴニストであるマシテンタン、AT1/ACEインヒビター)、喘息におけるβ2-交感神経刺激薬及びコルチコイド、慢性炎症/自己免疫疾患における免疫抑制剤、種々のVEGF依存性腫瘍及び腹水のための化学療法及び放射線療法、例えば腎細胞癌において使用されるキナーゼ阻害剤（mTORi、例えばRAD001、マルチキナーゼ阻害剤であるパゾパニブ(pazopanib)/スイチニブ(suitinib)/アキシチニブ(axitinib)、免疫モジュレーター、例えばチェックポイント阻害剤である抗PD-1/PD-L1抗体）が挙げられる。タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーに加えて使用することができるマトリックスメタロプロテイナーゼ関連疾患の治療のための医薬としては、例えば放射線（化学）療法によって処置された局所領域療法の高い失敗率を示す局所浸潤性腫瘍、例えば神経膠芽細胞腫（glioblastoma）、膵臓癌、抗炎症及び免疫抑制療法（抗TNFα抗体/インフリキシマブ、ミコフェノール酸、シクロホスファミドなど）、癌治療、例えば再発グリオーマにおける抗血管形成治療、乳癌などの高MMP-2/-9活性を有する転移性疾患の治療（すなわちホルモン療法であるタモキシフェン、HER2+疾患におけるトラスツズマブ、化学療法）の後の腫瘍浸潤又は偽進行が挙げられる。
従って、タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーの好ましい実施形態において、該オリゴマーはさらにアンジオスタチン（US 8,206,718）を含む。具体的な実施形態において、アンジオスタチンは、Fc-アンジオスタチン又はアンジオスタチン-Fc融合タンパク質、好ましくはヒト融合タンパク質である。
医薬組成物の製剤は、医薬の品質、医薬的安全性、有効性を確約するために、GMP標準条件又は類似の条件下で行われると理解される必要がある。
上記から明らかなように、タンパク質オリゴマー、ペプチドオリゴマー及び融合タンパク質は、ヒト配列である又はそれから構成されることが好ましい。
本発明はさらに、線維症若しくは線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患、又はマトリックスメタロプロテイナーゼ関連疾患の検出及び／又は診断に使用するための、(i)ヒトコラーゲン18の少なくとも2つのNC-1単量体、又は(ii)コラーゲン18の少なくとも2つのエンドスタチンドメイン、又は(iii)コラーゲン18エンドスタチンドメインの少なくとも2つのN末端ペプチド、を含むタンパク質オリゴマーに関する。
タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーの医薬用途に関して提供される定義及び実施形態は、本発明の診断用途及び使用に必要な変更を加えて適用する。
本明細書で使用する用語「検出」は、対象において、線維症若しくは線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患、又はマトリックスメタロプロテイナーゼ関連疾患の実在又は存在を発見又は確証することを意味する。
本明細書で参照する用語「診断」は、検査により、対象において、線維症若しくは線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患又はマトリックスメタロプロテイナーゼ関連疾患を認識することを意味する。本明細書で使用される診断は、可能性ある疾患の決定又は同定を試みるプロセスの両方を指す医学的診断であると理解すべきであり、この意味での診断はまた、（医学的）診断手順とも呼ばれ、このプロセスによって達せられる意見もまた（医学的）診断意見と称される。
対象における、線維症若しくは線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患又はマトリックスメタロプロテイナーゼ関連疾患の検出及び診断は、当技術分野で公知の方法により、例えばコンピュータ断層撮影（例えば高解像度コンピュータ断層撮影）、超音波、血液分析（例えば血液ガス分析、酸性-塩基性バランス）、生物学的マーカー、例えばプロテイナーゼ（MMP）、増殖因子及び/又はサイトカインなどの分析、組織病理学（コラーゲン沈着、炎症応答マーカー）、臨床試験（臓器機能、例えばFEV1などの制限肺疾患検査、臓器機能不全）、細胞検査、侵襲的（外科生検）及び非侵襲検査、MRI、PET/CTなどの他の侵襲的及び非侵襲的検査、又はそれらの組み合わせにより行うことができる（例えばRaghu et al. 2011, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, p. 788-824参照）。
例えば、突発性肺線維症（IPF）の診断の正確性は、臨床的、放射線学的及び組織病理学的相関によって高まり、その分野の経験のある臨床専門家の間の学際的な議論によって達成することができる。
線維症若しくは線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患又はマトリックスメタロプロテイナーゼ関連疾患の検出及び/又は診断のため、ヒトコラーゲン18のNC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン又はコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドを、放射性同位体、キレート（DTPAなど）への放射性核種結合、蛍光タンパク質又は本明細書の他で記載する他の標識で標識してもよい。
例えば、ヒトスーパースタチン（Superstatin）ペプチド（配列番号13）を、錯化剤1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸（DOTAとしても知られる）に共役して、非侵襲的画像化（陽電子放出断層撮影；PET）のために、ペプチドと、例えば放射性核種（ガリウム（68Ga）など）との共役する能力を提供してもよい。線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患又はマトリックスメタロプロテイナーゼ関連疾患の診断のための薬剤としてのスーパースタチン-DOTAの可能性のin-vivo PETイメージング評価が想定される。
したがって、好ましくは、ヒトスーパースタチンペプチド（配列番号13）が錯化剤1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸（DOTAとしても知られる）に共役される。
本発明はまた、線維症若しくは線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患又はマトリックスメタロプロテイナーゼ関連疾患の診断、予防、治療又は緩和に使用するための、コラーゲン18の少なくとも1つのNC-1ドメイン、少なくとも1つのコラーゲン18のエンドスタチンドメイン又はコラーゲン18エンドスタチンのN末端ペプチド（複数可）を含む融合タンパク質に関する。
タンパク質オリゴマー又はペプチドオリゴマーの医学的用途に関して提供された定義及び実施形態は、本発明の融合タンパク質の治療又は診断用途及び使用に必要な変更を加えて適用する。
好適かつ好ましいタンパク質オリゴマー、融合タンパク質、コラーゲン18のNC-1ドメイン、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン及びコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチド（複数可）は、本明細書の他で定義され、図面及び実施例において示されている。好ましくは、上記融合タンパク質は、配列番号3、4、7、9、10、13、15、18、19、20、22、27若しくは29、又はTjin et al.（前掲）又はUS 7,524,811に記載のコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチド（複数可）を含む。好ましいFc配列は配列番号6、24、25、26、28又は30に記載されている。
本発明の融合タンパク質は、本明細書の他で定義したようにオリゴマー化ドメインを介して二量体化又はオリゴマー化することができることが必要である。本明細書の他で説明したように、この二量体化又はオリゴマー化は、融合タンパク質のフィブロネクチン、VEGF、インテグリン、MMP-2及びMMP-9、並びに現在はまだ明らかにされていない可能性ある他の結合パートナーとの結合の前提条件である。好ましくは、オリゴマー化ドメインは、本明細書の他で特定したような、Fcドメイン（好ましくはIgG、より好ましくはヒトIgG、よりさらに好ましくはヒトIgG1に由来する又はそれから誘導される）及び／又は人工オリゴマー化ドメインである。さらに融合タンパク質は、好ましくは抗線維症活性、抗炎症活性、抗浸潤／転移性活性、血管透過性低減活性、抗血管新生活性、及び/又は抗腫瘍化活性を有する。また、融合タンパク質は、本明細書で定義したようなフィブロネクチンのRGDモチーフ及び/又はPHSRNモチーフの1以上を含むことが好ましい。さらに融合タンパク質はヒトであることが好ましい。
本発明はさらに、NC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン又はコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチド（複数可）をコードするポリヌクレオチドを記載し、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖のDNA分子及びRNA分子を指す。この用語は、ゲノムDNA、cDNA、hnRNA、mRNA及びそれら分子種のすべての天然の又は人工的に修飾された誘導体を含む。前記ポリヌクレオチドは一態様において線状又は環状分子である。さらに、NC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン若しくはコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチド、又は該単量体若しくはペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸配列に加え、ポリヌクレオチドは、5’-又は3’-UTR配列など適切な転写及び／又は翻訳に必要な追加の配列を含んでもよい。遺伝子コードの縮重を考慮し、NC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン若しくはコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチド、又は該単量体若しくはペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸配列では最適化されたコドンを使用してもよい。それにより、例えば、宿主細胞で最適な発現を達成することができる。
本発明は、NC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン若しくはコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドのそのような特定のアミノ酸配列又はそれらをコードする核酸配列の変異型（バリアント）も、これらの変異型配列がタンパク質又はペプチドオリゴマーの形成を可能とする限りにおいて、含むと理解される。前記変異型は、好ましくは本明細書の他で定義される抗線維症活性とまた抗血管新生活性及び／又は抗腫瘍活性を有する。一態様において、本明細書で使用される配列の変異型は、前に説明された特定のアミノ酸配列又は特定の核酸配列と、1つ又はそれ以上のアミノ酸又はヌクレオチドの置換、付加及び／又は欠失によって異なる。別の態様において、前記変異型の配列は、NC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン若しくはコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドの特定の核酸配列又はアミノ酸配列と、その特定の配列の全長にわたり又は少なくとも半分の長さのストレッチにわたり、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％、同一である。好ましくは、上記変異型配列は、配列番号4に示されるヒトNC-1単量体若しくはドメイン又は配列番号3に示されるマウスNC-1単量体若しくはドメインの特定のアミノ酸配列に対して、その全長にわたって少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％同一である。また、上記変異型配列は、配列番号7、9、10、13、15、18、19、20、22、27又は29に示される配列に対して、全長にわたって少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％同一であることが好ましい。本明細書で使用される「同一」という用語は、配列間の同一のアミノ酸の数を判定することにより特徴付けられる配列の同一性を指し、そのうち、配列は最高の順序一致が得られるようにアラインメントされる。公開されている技法、又は例えば、BLASTP若しくはFASTAなどコンピュータプログラムで体系化された方法を使用して算出することができる（Altschul 1990、J Mol Biol 215, 403）。同一性のパーセント値は、一態様において、アミノ酸配列全体又はクエリー配列の少なくとも50％の配列ストレッチにわたって算出される。さまざまなアルゴリズムに基づいた一連のプログラムが異なる配列を比較するために当業者に利用可能となっている。この文脈では、Needleman-Wunsch又はSmith-Watermanのアルゴリズムで特に信頼性の高い結果を得ることができる。配列アラインメントを実施するために、PileUpプログラム（Higgins 1989, CABIOS 5, 151）又はGCGソフトウェアパッケージ（Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）の一部である、Gap及びBestFitプログラム（Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482）を使用することができる。上に挙げられたパーセント（％）単位での配列同一性の値は、本発明の別の一態様において、GAPプログラムを配列領域全体にわたり、ギャップ加重：50、長さ加重：3、平均一致：10.000及び平均不一致：0.000の設定で使用して決定され、これが、別途特定されない限り、配列アラインメントのための標準設定として常に用いられる。
本発明はさらに、NC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン若しくはコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチド（複数可）、又は上記単量体、ドメイン若しくはペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを説明する。
好ましくは、ベクターは発現ベクターである。
「ベクター」という用語は、好ましくはファージ、プラスミド、ウイルス又はレトロウイルスベクター、及び細菌又は酵母人工染色体などの人工染色体を含む。さらに、この用語は、ゲノムDNAへの標的化構築物の無作為又は部位指向的組込みを可能にする標的化構築物にも関する。そのような標的構築物は、一態様において、以下で詳細に説明する相同組換え又は異種組換えに充分な長さのDNAを含む。記載したポリヌクレオチドを包含するベクターは、一態様において、宿主細胞での増殖及び／又は選択のための選択マーカーをさらに含む。前記ベクターは、当技術分野で周知の多様な技法によって宿主細胞中に組込むことができる。例えば、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿又は塩化ルビジウム沈殿などの沈殿内、又は荷電脂質との複合体内、あるいはフラーレンなど炭素ベースのクラスター内に導入できる。あるいは、プラスミドベクターは熱ショック法やエレクトロポレーション法により導入することができる。ベクターがウイルスである場合、宿主細胞への適用の前に、好適なパッケージング細胞株を用いて、インビトロでパッケージングすることができる。レトロウイルスベクターは、複製能力を有するか、又は複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般的には補完的宿主細胞中でのみ起こる。
さらに、一態様において、上述したポリヌクレオチドは発現制御配列に機能的に連結され、前記ベクターで原核又は真核宿主細胞あるいはその単離された画分における発現を可能にする。したがって、一態様において、ベクターは発現ベクターである。ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なmRNAへのポリヌクレオチドの転写を含む。宿主細胞における発現を確約する調節エレメントは当技術分野で周知である。一態様において、それらは転写の開始を確約する調節配列及び／又は転写の終了及び転写の安定化を確約するポリAシグナルを含む。別の調節エレメントとしては転写及び翻訳エンハンサーを含むことがある。原核宿主細胞中での発現を可能にする考えられる調節エレメントは、例えば、大腸菌におけるlac、trp若しくはtacプロモーターを含み、真核宿主細胞中での発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母におけるAOX1若しくはGAL1プロモーター又は哺乳動物及び他の動物細胞におけるCMV、SV40、RSVプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、CMVエンハンサー、SV40エンハンサー若しくはグロビンイントロンである。さらに、誘導可能な発現制御配列を、発現ベクター中で用いることができる。そのような誘導性ベクターは、tet又はlacオペレーター配列あるいは熱ショック又は他の環境因子により誘導可能な配列を含んでもよい。好適な発現制御配列は、当技術分野で周知である。転写の開始を担うエレメントの他に、そのような調節エレメントはまた、ポリヌクレオチドの下流に、SV40-ポリA部位又はtk-ポリA部位などの転写終結シグナルを含んでもよい。この文脈において、好適な発現ベクターは当技術分野で公知であり、例えばOkayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1（Pharmacia）、pBluescript（Stratagene）、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（Invitrogen）又はpSPORT1（Invitrogen）などである。好ましくは、ベクターは発現ベクターであり、かつ遺伝子導入又は標的化ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、若しくはウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターは、標的化された細胞集団中へのポリヌクレオチド又はベクターの送達に用いることができる。当業者には周知の方法を用いて、組換えウイルスベクターを構築することができる。例えばSambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y.及びAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載の技術を参照できる。
本発明はさらに、NC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン若しくはコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチド（複数可）、又は上記単量体若しくはペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はかかるポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を記載する。
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、原核宿主細胞と真核宿主細胞を含む。一態様において、前記宿主細胞は細菌細胞である。一態様において、前記細菌性宿主細胞は大腸菌宿主細胞である。そのような細菌性宿主細胞は、例えば記載されるポリヌクレオチド又はベクターの複製に使用することができる。
真核宿主細胞は、一態様において、NC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン若しくはコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチド（複数可）、又は上記単量体、ドメイン若しくはペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はベクターを含む細胞であり、そこでポリヌクレオチド又はベクターは、上記タンパク質若しくはペプチド又はそのオリゴマーを生成するために宿主細胞で発現される。ポリヌクレオチドは一過性又は安定に宿主細胞に導入されることができる。一態様において、真核宿主細胞は、ポリヌクレオチドを安定に発現する真核宿主細胞株の細胞とすることができる。別の態様において、宿主細胞はポリヌクレオチド又はベクターで一過的にトランスフェクションされ、ポリヌクレオチドを発現する、真核宿主細胞である、別の態様において、細胞はタンパク質又はペプチドを産生するために遺伝子操作された細胞である。そのような細胞がどのように分子生物学的方法によって遺伝子操作されるかについては、当業者に周知である。
本発明はまた、本発明のタンパク質オリゴマー又は融合タンパク質を含むキットに関する。
本明細書で使用される「キット」という用語は、一緒にパッケージングされてもされなくてもよい本発明のタンパク質オリゴマー又は融合タンパク質の集合を指す。融合タンパク質は、本明細書の他で説明するように、オリゴマー化することができる必要がある。キットは、医薬組成物又は診断用組成物として、本発明のタンパク質オリゴマー又は融合タンパク質を製剤化するための別の成分を包含し得る。キットの成分は、別々のバイアルに含まれていてもよいし（すなわち別個の部分のキット）、又は単一バイアル中に提供されてもよい。さらに、本発明のキットは、本明細書の上で参照した疾患の治療又は診断に用いられることが理解されるだろう。一態様において、本明細書で参照する治療又は診断用途の実施のために即時使用形式で全ての成分が提供されることが想定される。さらなる態様において、キットは、上記用途を実施するための説明書を含む。説明書は、紙又は電子形式のユーザマニュアルにより提供され得る。
本発明は更に、NC1を模倣する医薬組成物の作製、及び好ましくはその改善のための、本発明のタンパク質オリゴマー又は融合タンパク質の使用に関する。
更に、本発明は、本明細書で定義されるような、線維症関連疾患、VEGF関連疾患、又はMMP関連疾患の治療又は診断のためのNC1模倣体又はオリゴマーエンドスタチン模倣体の開発のための、本発明のタンパク質オリゴマー又は融合タンパク質の使用に関する。
最終的に、本発明は、フィブロネクチン機能の調節のためのNC1模倣体又はオリゴマーエンドスタチン模倣体の開発のための、本発明のタンパク質オリゴマー又は融合タンパク質の使用に関する。
模倣体によって理解すべきことは、本明細書の他の箇所に説明されている。
フィブロネクチン(FN)は、マトリックスリモデリング、免疫応答、浸潤、及び上皮間葉転換において多数の活性及び結合パートナーを有する多面的な分子である。本発明のオリゴマーがフィブロネクチンの機能といかに相互作用するかをより多く理解すれば、より多くの具体的なそれらの機能を標的化することができる。例えば、本発明のタンパク質オリゴマーが、VEGFが結合するのと同一のFNのヘパリン結合部位(ヘパリン結合部位II)に結合する場合、FNがVEGF結合のために捕捉されている場合の影響は何であるか、又はインテグリン若しくはMMPへの結合の効果は何であるかを分析することができる。FNは、NC1によって異なった調節を受ける数多くの効果を示す。これらの調節についてより多く知ると、NC-1を介して意図された自然の方法をよりよく標的化することができる。
本発明の医療及び診断の使用のために特に好ましいタンパク質オリゴマー、ペプチドオリゴマー、及び融合タンパク質は、図面及び実施例に記載される。
配列
配列は以下を示す。
配列番号1:マウスコラーゲン18
配列番号2:ヒトコラーゲン18
配列番号3:マウスコラーゲン18のNC-1ドメイン
配列番号4:ヒトコラーゲン18のNC-1ドメイン
配列番号5:マウスFcドメイン
配列番号6:ヒトFcドメイン
配列番号7:マウススーパースタチン
配列番号8:マウスフィブロネクチンモチーフ
配列番号9:マウスN末端亜鉛結合ドメインエンドスタチン
配列番号10:ヒトN末端亜鉛結合ドメインエンドスタチン
配列番号11:マウスRGDモチーフ
配列番号12:ヒトRGDモチーフ
配列番号13:ヒトスーパースタチン
配列番号14:1位及び3位においてHisがAlaによって置き換えられたヒトスーパースタチン
配列番号15:7位においてGlnがCysによって置き換えられたヒトスーパースタチン
配列番号16:「RGD」モチーフが「RAD」モチーフによって置き換えられたヒトスーパースタチン
配列番号17:マウスフィブロネクチンのインテグリン結合モチーフ
配列番号18:mエンドスタチン(マウス)
配列番号19:hエンドスタチン(ヒト)
配列番号20:mP1ペプチド(マウス、N末端)
配列番号21:エンドスタチンのE4ペプチド(ヒト、C末端)
配列番号22:エンドスタチンのhP1ペプチド(ヒト、N末端)
配列番号23:エンテロキナーゼ切断部位
配列番号24:野生型ヒトIgG1のFc配列
配列番号25:Fc配列「ノブ」を含むヒトIgG1 Fc:S354C/T366W
配列番号26:Fc配列「ホール」を含むヒトIgG1 Fc Y349C/T366S/L368A/Y407V
配列番号27:NC-1-エンテロキナーゼ部位-リンカー-「ノブ」変異(S354C/T366W)を有するヒトIgG1のFc
配列番号28:「ホール」変異Y349C/T366S/L368A/Y407Vを有するヒトIgG1のFc
配列番号29:「ノブ」変異(S354C/T366W)を有するヒトIgG1のFc-リンカー-エンテロキナーゼ部位-NC-1
配列番号30:「ホール」変異Y349C/T366S/L368A/Y407Vを有するヒトIgG1のFc
配列番号:1〜17はまた、参照によりその開示内容を本明細書に組み入れる、WO2013/026913にも記載される。ヒトフィブロネクチンのアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号P02751に示される。ヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ-2(MMP-2)のアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号P08253に示される。ヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ-9(MMP-9)のアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号P14780に示される。ヒト血管内皮増殖因子(VEGF-A)のアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号P15692に示される。エンテロキナーゼの認識及び切断部位、並びに適切なリンカー領域は、例えばLoら、1998、Protein Engineering 11(6)、1998、p.495-500に記載される。
図面
図１：コラーゲンXVIII及びFc-エンドスタチンのトポロジー、並びに、異なる組織におけるエンドスタチン分子の生理学的サイズ。(A)コラーゲンXVIIIの構造は、シグナルペプチド、frizzledドメイン、三重らせんリピート、NC1ドメインからなる。ESモチーフは、NC1との関係において生理学的に三量体化している。(B)IgG Fcドメインに対する2つのESドメインの合成の概略図。(C、D)エンドスタチンの内容物が、イムノブロットによってマウスの脳、骨格筋、心臓、腎臓、精巣及び肝臓の組織の抽出物中並びに血清中に見出された。画像は、Kuo, C.J.、ら、Oligomerization-dependent regulation of motility and morphogenesis by the collagen XVIII NC1/endostatin domain. J Cell Biol、2001. 152(6): p.1233-46.; Sasaki, T.ら、Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J、1998. 17(15): p.4249-56から転載された。
図２：エンドスタチン、N末端ペプチド(mP1)及び(hP1)、並びにC末端E4(CE4)ペプチドの配列。
図３：Fc-Endo及びmP1処理の後に低減された放射線誘発線維症進行。(A)照射後24週の終点における対照及び処理群のマイクロCT撮影。限定された有効な呼吸スペースが肺に残っている偽光子照射(X-20Gy)を受けたマウスにおいて、塊状線維症が見出された。間質性線維症は、CE4処理後の照射された肺においても顕著であった(CE4+X)。mP1-Endo(mP1+X)で処理した照射肺、及び特にFc-Endo処理マウス(Fc-Endo+X)において、はるかに明確な肺実質が見出された。(B)定量的臨床CT測定は、Fc-Endo+X群及びmP1-Endo+X群において、それぞれ有意に低下した平均肺密度(MLD)及び総肺容量(LV)の損失を見出した。(C)Fc-Endo+X処理群及びmP1-Endo+X処理群の線維症指数(FI)は、IR単独群(X20Gy)のものと比べて有意に低下する。CE4-Endo+X処理群とIR単独群との間に統計的有意差は存在しなかった。(D)Fc-Endo+X群及びmP1-Endo+X群において、大きな延命効果が認められたが、CE4+X処理群においては認められなかった(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、ns=統計的に有意ではない)。
図４：照射肺におけるFc-Endo及びmP1-Endo処理後の改善された臨床パラメーター及び病理組織学的症状。(A、B)血液ガス分析は、照射後24週の終点における、IR単独(X-20Gy)群における血液中の上昇した二酸化炭素の分圧(pCO2)及び減少したpHレベル(アシドーシス)を実証した。Fc-Endo+X又はmP1-Endo+Xで処理したマウスのPCO2及びpHレベルは、有意に緩和された。(C)エンドスタチンポリペプチド断片を含む全ての処理群は、体重増加の点で有益であった。これらのうち、Fc-Endoは、最も顕著な改善を有していることが見出された。(D)病理組織学的検査は、Fc-Endo+X処理群及びmP1-Endo+X処理群において有意に低下した炎症及び線維症を確認した。(E)照射されていないFc-Endo処理群、mP1-Endo処理群、及びCE4-Endo処理群の間に組織病理学的な差異は見出せなかった(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。
図５：Fc-Endo+X処理後のM2極性化、遺伝子及びタンパク質の発現。(A)ECMタンパク質の転写シグネチャーは、Fc-Endo+X処理によって抑制された。(B)Fc-Endoはまた、放射線誘発性の線維症促進性M2マクロファージ極性化を緩和することを見出した。(C)Fc-Endo処理は、放射線誘発性のFGF2発現及びCD31発現の消失を逆転させた。対照的に、抗線維症のHGFの発現は、X20Gy処理に対してFc-Endo+X処理において増加した(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。
図６：Fc-Endoは、高LET炭素照射後の線維症を低減した。(A)照射後24週の終点におけるマイクロCT撮影。限定された有効な呼吸スペースが肺に残っている炭素イオン12.5Gy(C12.5)による照射を受けたマウスにおいて、塊状線維症が見出された。しかしながら、肺の構造は、Fc-Endo+C12.5処理マウスにおいてよく保存されていた。(B)定量的臨床CT測定は、C12.5群に対してFc-Endo+C12.5群において、有意に低下した平均肺密度(MLD)及び総肺容量(LV)の損失を示した。(C)Fc-Endo+C12.5処理群の線維症指数(FI)は、C12.5単独群のFIよりも有意に低かった。(D)病理組織学的検査は、炭素照射単独に対してFc-Endo+C12.5後に有意に低減した炎症及び線維症を確認した(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。
図７：炭素イオン照射の後のFc-Endo処理による線維症の阻害の関連した証拠。(A)Fc-Endoはまた、線維症促進性M2マクロファージ浸潤を緩和することを見出した。(B)線維症促進性FGF2の発現はFc-Endoによって低下した。(C)抗線維症のHGFの発現は、Fc-Endoによって増加した。(D)内皮マーカーCD31の消失はFc-Endoによって逆転した(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。
図８：炭素イオン照射による正確なマウス胸部照射の実証(SOBPにおける炭素イオン12.5Gy)。(A)マウスを胸部照射のために特別に設計されたホルダーに固定した。(B)肺における粒子線量は、入口及び出口のフィルム(Kodak EDR2)によって検証されるように均質であった。(C)照射直後のPET/CTビーム検証は、肺領域における正確な線量の沈着を確認した。呼吸動作もまた考慮された。
図９：オリゴマーエンドスタチンのフィブロネクチン結合。NC1及びエンドスタチン(ES)二量体はフィブロネクチン(FN)に排他的に結合するが、単量体は結合しない。Elisaプレートをヒトフィブロネクチンでコーティングした。BSAによるブロッキングの後、エンドスタチン単量体、二量体、及びNC1を、示した濃度においてリガンドとして使用した。フィブロネクチンに結合したエンドスタチンの検出のために、抗エンドスタチン抗体を利用した。
図１０：オリゴマーエンドスタチンのVEGF結合。NC1及びエンドスタチン(ES)二量体は血管内皮増殖因子(VEGF)に排他的に結合するが、エンドスタチン単量体は結合しない。ElisaプレートをヒトVEGFでコーティングした。BSAによるブロッキングの後、エンドスタチン単量体、二量体、及びNC1を、示した濃度においてリガンドとして使用した。VEGFに結合したエンドスタチンの検出のために、抗エンドスタチン抗体を利用した。
図１１：オリゴマーエンドスタチンのMMP-2/9結合。NC1、エンドスタチン(ES)二量体、及びFc-エンドスタチン(Fc部分において二量体化)の、MMP-2(A)及びMMP-9(B)のそれぞれへの結合。対照的に、エンドスタチン単量体は、MMPに対して弱い結合を示す。ElisaプレートをヒトMMP-2又はMMP-9のそれぞれでコーティングした。BSAによるブロッキングの後、エンドスタチン(ES)単量体、エンドスタチン(ES)二量体、Fc-エンドスタチン(Fc-ES)、Fc-対照(Fc)、及びNC1を、示した濃度においてリガンドとして使用した。MMPに結合したエンドスタチンの検出のために、抗エンドスタチン抗体を利用した。
図１２：Fc-エンドスタチン(ヒトFcE)をエンドスタチン単量体及びFc二量体とするエンテロキナーゼ消化の後の、MMP-2及びフィブロネクチンに対する二量体エンドスタチン結合の消失。(A)hFcEのエンテロキナーゼによる消化のSDS-ポリアクリルアミド電気泳動。レーン1(タンパク質マーカー)。レーン2:hFcE。レーン3;上部のバンドはFc二量体であり、下部のバンドはエンテロキナーゼによる消化後のエンドスタチン単量体である。2及び3におけるサンプルは、非還元条件下である。レーン5:hFcE。レーン6;上部のバンドはFcであり、下部のバンドは消化後のエンドスタチン単量体である。レーン5及び6は、還元条件下で実施した。(B)上述のようなElisaアッセイは、フィブロネクチン及びMMP-2のそれぞれに対する二量体エンドスタチン(FcE)の結合を検出する。エンテロキナーゼ消化が単量体エンドスタチン及び二量体のFcをもたらし、両方の候補標的分子に対する有意に減少した結合をもたらすことを注目すべきである。
図１３：本発明における使用のためのタンパク質オリゴマーの概略図。(A)N末端ホモ二量体Fc融合コンストラクトを含むタンパク質オリゴマー。野生型ヒトIgG1のFcを、プロテアーゼ切断可能なリンカーを介して、NC-1又はエンドスタチンのN末端へと融合する。(B)C末端ホモ二量体Fc融合コンストラクトを含むタンパク質オリゴマー。野生型ヒトIgG1のFcを、プロテアーゼ切断可能なリンカーを介して、NC-1又はエンドスタチンのC末端へと融合する。
図１４：「ノブイントゥーホール」(KiH)操作NC-1-Fc又はエンドスタチン-Fc融合コンストラクト。(A)プロテアーゼ切断可能なリンカーを介して、NC-1又はエンドスタチンのN末端に融合した「ノブ」変異を有するヒトIgG1のFcと、「ホール」変異を有するヒトIgG1のFcとを含むヘテロ二量体。(B)プロテアーゼ切断可能なリンカーを介して、NC-1又はエンドスタチンのC末端に融合した「ノブ」変異を有するヒトIgG1のFcと、「ホール」変異を有するヒトIgG1のFcとを含むヘテロ二量体。
本発明を実施例により説明するが、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
[実施例1]エンドスタチン
Fc-エンドスタチン(Fc-Endo)は、ヒトIgGのFc領域に対するエンドスタチンの融合タンパク質である。それは、エンドスタチンと比べて有意に改善された薬物動態及び生物学的効率を示す[Lee, T.Y.ら、Linking antibody Fc domain to endostatin significantly improves endostatin half-life and efficacy. Clin Cancer Res、2008. 14(5): p.1487-93]。更に、Fc-エンドスタチンにおける、2つのエンドスタチン単量体分子のIgG Fcドメインに対する融合は、分子の合成的二量体化をもたらす(図1B)。興味深いことに、エンドスタチンのオリゴマー化は、これまでに分子に追加の特性を与えることが示されていた[Sudhakar, A.ら、Human tumstatin and human endostatin exhibit distinct antiangiogenic activities mediated by alpha v beta 3 and alpha 5 beta 1 integrins. Proc Natl Acad Sci U S A、2003. 100(8): p.4766-71]。注目すべきは、コラーゲン18(NC-1)の天然の非コラーゲン領域は、それぞれプロテアーゼ感受性のヒンジ領域及び三量体化領域上に連結した3つのエンドスタチン単量体からなる(図1A)。したがって、単量体エンドスタチンは、元の三量体分子の最終的なタンパク質分解断片と考えることができる。実際、単量体エンドスタチンより大きい断片は、異なる組織及び血清中に生理学的に見出された(図1C)。同じ文脈において、本発明者は、オリゴマー化はFc-エンドスタチン及びNC-1のフィブロネクチン(FN)への結合の前提であるが、一方でエンドスタチン単量体はFNに結合しないことを示した(WO2013/026913)。FNは線維症の病因において重要な役割を果たすと認識されており、広範囲の下流の及び関連する線維症促進性シグナル伝達カスケードを導く。例えば、FNは、線維化促進に関連するインテグリンアルファ5(ITGA5B)及びαVβ3に結合すると報告されている[Torres, P.H.、G.L. Sousa、及びP.G. Pascutti、Structural analysis of the N-terminal fragment of the antiangiogenic protein endostatin: a molecular dynamics study. Proteins、2011. 79(9): p.2684-92]。したがって、例えばFc-エンドスタチンを介するエンドスタチンのオリゴマー化は、その多面的な機能に影響を及ぼす可能性がある。
Yamaguchiらは、そのC末端ドメイン(E4ペプチド)を介してエンドスタチンが、抗線維症効果を誘発していることを報告した[Yamaguchi, Y.ら、A peptide derived from endostatin ameliorates organ fibrosis. Sci Transl Med、2012. 4(136): p.136ra71]。しかしながら、亜鉛結合ドメインは、これまではN末端(エンドスタチンmP1ペプチド)に限定されており、分子の多数の機能にとって重要であった[Tjin, R.M.ら、A 27-amino-acid synthetic peptide corresponding to the NH2-terminal zinc-binding domain of endostatin is responsible for its antitumor activity. Cancer Research、2005. 65(9): p.3656-3663]。以下の実施例において、本発明者は、オリゴマー化(Fc-エンドスタチン)及びエンドスタチンのN末端対C末端断片(N末端エンドスタチンペプチドmP1、配列番号20、C末端エンドスタチンペプチドE4又はCE4、配列番号21)の、放射線誘発肺線維症の調節に対する影響をよりよく理解することを目的とする。
[実施例2]エンドスタチン投与
マウスを、照射の3日前から試験の終了まで、5日ごとに100μg/マウスの用量で皮下送達するmFc-エンドスタチン(Bergersら、Science 284(5415)、p.808-812、1999に記載されるような、マウス免疫グロブリンのγ-2a鎖のFc断片に融合した配列番号18に記載されるマウスエンドスタチン)で処理した。並行して、エンドスタチンペプチド群に、照射に加えてmP1エンドスタチン(N末端、配列番号20)又はE4(若しくはCE4)ペプチド(C末端、配列番号21、Yamaguchi, Y.ら、A peptide derived from endostatin ameliorates organ fibrosis. Sci Transl Med、2012. 4(136): p.136ra71を参照)のいずれかを、100μg/マウス/b.i.の用量で皮下投与した。対照群をPBS、mFc-エンドスタチン、mP1エンドスタチン又はE4ペプチド単独で処理し、照射を全く受けなかった。
[実施例3]光子照射及び高LET炭素照射
全胸部照射は、以前に記載されているものに修正を加えて実施した(Abdollahi、J. Exp.Med. 2005、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15781583)。
全胸部照射を8週齢のC57BL/6マウス(Taconis、Bomholtvej、Denmark)に施した。マウスは特定病原体フリーの条件下で維持され、実験はドイツ癌研究センター(German Cancer Research Center)(DKFZ)の実験動物委員会(Animal Care and Use Committee)によって承認された機関ガイドラインに準拠して実施した。胸部照射の前に、0.36ml/kg Rompun 2％(Bayer HealthCare)及び0.54ml/kgケタミン10％(Pfizer)の腹腔内適用によってマウスを麻酔した。
粒子照射は、ドイツ、ハイデルベルクのハイデルベルクイオンビーム治療センター(Heidelberg Ion-Beam Therapy Center)(HIT)で実施した。照射の設定は以下に示す(図8)。炭素イオン(12C)を、線形エネルギー移動(LET)=70-157keV/μm(平均で86keV/μm)の拡大ブラッグ(Bragg)ピーク(SOBP、252.400〜270.550MeV/u)で適用した。
光子照射は、ドイツ、ハイデルベルクのDKFZにおいて、6MV、3Gy/分の線量率でArtiste線形加速器(Siemens、ドイツ)を用いて実施した。
全ての照射計画は、解剖学的及び放射線学的推定によって調整され、肺領域を完全に有効範囲に含むことを確実にし、隣接組織を最大限に免れるようにした。PET/CT(Biograph mCT、Siemens)撮影は、炭素イオン照射直後のビーム検証にもまた適用された。
[実施例4]線維症指数(FI)計算
照射前(IR前)及び照射後(IR後)4週間ごとに、定量的CT撮影のための臨床PET/CTスキャナー(Biograph mCT、Siemens)を適用した。CT撮影は、イソフルラン(isoflurace)麻酔(2％イソフルラン、2リットル/分の酸素)下で行った。CT部分の標準プロトコールは以下の通りであった:80kV、80mA、0.6mmのピッチ、0.6mmのスライス厚、及び取得時間32秒。画像は、フィルタカーネルH50s(Siemens)を用いて138×138mm2の体軸横断の視野に512×512マトリックスとして再構成し、ここで3匹の動物を1回のスキャンに含めた。X線曝露は、視野全体で約4mGy/スキャンであり、およそ1mGy/動物未満であった。
臨床CTスキャナーから取得した画像を、OsiriX Imaging Software(OsiriX v.3.9.4 64ビット版、Pixmeo SARL、スイス)及びMITKソフトウェア(医学及び生物情報学(Medical and Biological Informatics)、ドイツ癌研究センター)において、観察して分析した。画像の比較的低い解像度のため、微小血管系のHU強度を周囲の空気含有組織によって平均化した。全ての微細構造と共に肺を、-900HUの下方閾値及び-100HUの上方閾値を有する三次元(3D)領域拡張アルゴリズムを用いて分画化した。-600HUの下方閾値を、肺気腫を有する動物において使用した(-450HU)。気管及び一次気管支を分画化の際に手動で除いた。分画化した領域内で平均HU値及び容量サイズを計算した後、閾値の選択の影響を受けない、より信頼性の高い評価を達成するために、10HUの間隔でビニングされた同一の肺領域のヒストグラムを抽出した。臨床CT結果の更なる検証のために、対応する時点(IR前及びIR後の4週間ごと)においてプロトタイプのSPECT-CT-OTシステム及びInveon SPECT/PET/CT(Siemens、ドイツ)の両方のマイクロCT構成要素を使用して、マイクロCT撮影を実施した。プロトタイプのSPECT-CT-OTシステムに関して、CT取得は、40kVの管電圧、0.4mAの陽極電流、投影当たり1秒の取得時間、360度の回転ごとに240回の投影で実施した。画像は、0.065mmの等方性ボクセルサイズで512×512×1024のマトリックスに再構成した。Inveon SPECT/PET/CTに関して、CT取得を、80kVの管電圧、0.5mAの陽極電流、投影当たり1秒の取得時間、360度回転当たり720回の投影として、19.29μmの有効画素サイズで適用した。マイクロCTデータをMITKソフトウェアで観察及び分析した。肺領域の分画化は、連続する10枚の体軸横断のCTスライスについて手動で実施した。目的の選択した容量の各々のボクセルに対するHU値をエクスポートして平均HU値を計算し、その後、ヒストグラムを作成するために使用した。
CTにおける肺領域全体の平均HU値によって表される肺密度を、分画化した肺から計算した。線維症指数(FI)は、肺容量及びハウンズフィールド単位(HU)における平均肺密度(MLD)のCT測定に基づいて
のように提案され、
式中、
は、分画化した肺からのHU値の増加の平均であり、
は、年齢が一致する対照と比べて減少した肺容量である。
[実施例5]光子照射誘発肺線維症のエンドスタチンによる緩和
Fc-エンドスタチン及びmP1エンドスタチンは、肺線維症を阻害し、生存期間を延長した
光子20Gy全胸部照射(実施例3を参照)と組み合わせてFc-エンドスタチン(Fc-Endo)、N末端エンドスタチンペプチド(mP1)、又はC末端エンドスタチンE4ペプチド(CE4)(図2を参照)によってマウスを処理した。マイクロCT撮影は、20Gy照射組織における拡散したすりガラス状陰影及び構造的歪みを明らかにし、塊状の間質性線維症の発生を示した。重度の線維性肺実質もまた、CE4と組み合わせた照射群において見られた。対照的に、顕著に減少した線維症がFc-Endo及びmP1処理群で観察された(図3)。
定量的臨床CTフォローアップは、照射後24週の終点で完了した(図3B)。電離放射線(IR)単独の条件と比較して、Fc-Endo+X及びmP1+X処理群において有意に低減した平均肺密度(MLD)が見出された(それぞれP<0.001、P<0.05)。これに伴い、全肺容量(LV)はこれらの群で維持されたが、IR単独マウスでは有意なLVの損失が生じた(IR単独と比べたFc-Endo+X及びmP1+Xに対して、それぞれP<0.001、P<0.05)。MLD又は減少したLVに関して、CE4+X処理群において、IR単独マウスと比べて有意差は観察されなかった(P>0.05)。同一のパラメーター(MLD及びLV、データは示さず)について、Fc-Endo、mP1又はCE4処理群において、対照群と比べて統計的差異は見出せなかった。
本発明者の放射線誘発肺線維症(RILF)に基づいて、線維症指数(FI)は肺線維症の定量的評価のための最も信頼性が高く、強固な指標であると考えられた(実施例4を参照)。Fc-Endo+X(約3.03、43％減少)及びmP1+X(約1.86、26％減少)処理群において、著しく減弱したFIレベルが観察された(それぞれP<0.001、P<0.05)。しかしながら、CE4+X投与群とIR単独群との間に統計的な有意差はなかった(P=0.43)(図3C)。
減少した放射線誘発FI値は、Fc-Endo及びmP1処理群における延命効果と相関し、例えば、観察期間の終点(IR後25週)の生存率は、それぞれFc-Endo+Xにおいて80％、mP1+Xアームにおいて60％であったのに対し、IR単独マウスにおいて僅か10％であった(それぞれP<0.01及びP<0.05)。本発明者は、CE4+X群とIR単独群との間に統計的な有意差を観察しなかった(図3D)。
[実施例6]Fc-エンドスタチン及びmP1エンドスタチンは肺機能を改善した
肺線維症に付随する症状として、肺機能の低下を全ての群において調査した(図4A、B)。IR単独群は、対照群と比べて有意に高いpCO2及び低いpHを有し(それぞれP<0.05、P<0.001)、呼吸の重篤な障害に起因する慢性の呼吸性アシドーシスを示している。対照的に、これらの測定は、Fc-Endo-又はmP1+X処理群と対照群との間で有意に異ならず(それぞれP>0.05、P>0.05)、これらの群における好ましい呼吸機能を明らかにした。
IR単独群(X20Gy)と比較して、pCO2及びpHに関して最もよく保護された肺機能は、Fc-Endo+X処理によって達成した(それぞれP<0.05、P<0.001)。次善の結果はmP1+Xによってもたらされ、これはpCO2及びpHについてもまたIR単独(X20Gy)条件とは有意に異なる(それぞれp<0.05、P<0.05)。
IR単独マウスと比べてCE4+Xで処理したマウスにおいて有意な有益性(pCO2及びpH)は見出せなかった(それぞれP>0.05、P>0.05)。終点における体重減少を評価した(図4C)。全てのエンドスタチン処理群は、IR単独のマウスと比べて、より少ない体重減少であると観察された(全てP<0.05)。特に、Fc-Endo+Xによって処理したマウスは、体重に関して、mP1-Endo-X及びCE4-Endo+Xで処理したマウスよりも有利であった(Fc-Endoに対して両方ともP<0.05)。
病理組織学的分析は、IR単独のマウスと比べて、Fc-Endo+X又はmP1-Endo+Xを投与したマウスにおいて、炎症細胞浸潤、中隔厚及び肺胞構造の明らかな改善を示唆した。Fc-Endo+X及びmP1-Endo+X処理群もまた、トリクローム染色において著しく少ないコラーゲン沈着及び瘢痕化を示した(図4D)。Fc-Endo、mP1-Endo又はCE4-Endoで処理した非照射肺においては差異がなかった(図4E)。
[実施例7]M2極性化、遺伝子及びタンパク質の調節に対するFc-エンドスタチンの影響
異常なECMのリモデリングは、肺線維症の特徴である。本発明者は、テネイシンC、コラーゲンI及びIII、エラスチン、フィブリリン、α-アクチン並びにMMPを含む様々な重要なECMタンパク質が、Fc-Endo+Xによって転写レベルで抑制又は「スイッチオフ」されることを見出した(図5A)。このことに呼応して、免疫組織化学結果は、20Gy照射肺に対してFc-エンドスタチン+Xにおいて、M2マクロファージ流入の低減を示唆した(図5B)。
放射線誘発肺線維症(X20Gy)は、低減したCD31及び増強した塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF又はFGF2)のタンパク質レベルと関連していた。放射線療法に対するFc-Endoの付加は、この表現型を、偽処理対照において検出されるレベルへと逆転させた(図5)。興味深いことに、近年抗線維症特性に関連しているとされる肝細胞増殖因子(HGF)[Crestani, B.ら、Hepatocyte growth factor and lung fibrosis. Proc Am Thorac Soc、2012. 9(3): p.158-63; Phin, S.ら、Imbalance in the pro-hepatocyte growth factor activation system in bleomycin-induced lung fibrosis in mice. Am J Respir Cell Mol Biol、2010. 42(3): p.286-93]が、IR単独(X-20Gy)と比べてFc-Endo+X後にはるかに高いレベルで発現していた(P<0.05)(図5D)。
[実施例8]炭素イオン誘発肺線維症のFc-エンドスタチンによる阻害
Fc-エンドスタチンは炭素イオンにより誘発される肺線維症を阻害した
光子誘発肺線維症を阻害する点において、Fc-エンドスタチンが他のエンドスタチンペプチド断片よりも有効であったことを考慮して、本発明者は、高LET炭素照射に誘発される線維症を調節するFc-エンドスタチンの有効性を次に検討した。
マイクロCT撮影は、炭素イオン12.5Gy照射(C12.5)の後、びまん性線維症の肺を示した。対照的に、顕著に減少した線維症がFc-Endo+C12.5処理群で観察された(図6A)。
24週の終点における定量的臨床CTフォローアップを実施した(図6B)。Fc-Endo+C12.5群の肺密度(MLD)は、炭素単独(C12.5)群のものよりも有意に低かった(P<0.01)。これに伴い、総LVもFc-Endo+C12.5処理マウスにおいて保存されたが、炭素単独(C12.5)マウスにおいて総LVの有意な損失があった(P<0.01)。
FIは、肺線維症評価において最も重要な指標であると考えられた(実施例4を参照)。Fc-Endo+C12.5群のFIは、炭素照射(C12.5)群のものよりも著しく低かった(P<0.001)(図6C)。
病理組織学的分析は、炭素照射(C12.5)マウスと比べ、Fc-Endo+C12.5を投与したマウスの炎症、中隔厚及び肺胞構造における明らかな改善を示唆した。同様に、Fc-Endo+C12.5処理マウスのトリクローム染色において、より少ないコラーゲン沈着及び瘢痕が見出された(図6D)。
[実施例9]Fc-エンドスタチンによる高LET照射後の線維症の阻害の免疫学的及び分子的確認
Fc-エンドスタチン処理を受けたマウスは、炭素照射肺における線維症促進性M2マクロファージ(CD206及びCLL22陽性)の明らかな低減を有した(図7A)。光子照射肺におけるエンドスタチン効果に伴って、FGF2誘導及びCD31タンパク質レベルの消失の逆転が、炭素照射単独に対してFc-Endo+C12.5の後に見出された(図7B)。更に、Fc-エンドスタチン処理は、炭素照射肺における上昇した抗線維性HGFタンパク質レベルをもたらした(P<0.05)(図7C)。
まとめると、これらのデータは、放射線の質と無関係に、線維症の発生におけるM2分極化、血液ガス関門(CD31陽性微小血管)からなる低減した無傷肺構造、及び増殖因子/サイトカインプロファイル(FGF)の関連性を確認する。Fc-エンドスタチンは、炭素と光子照射モデルの両方において、この表現型を効率的に逆転させた。
[実施例10]線維症の阻害におけるFc-エンドスタチンの可能性のある機序
本発明者は、Fc-エンドスタチン(Fc-Endo)及びN末端エンドスタチン(mP1エンドスタチン)ペプチドが、光子又は炭素イオン照射により誘発される肺線維症の有効な阻害剤であることを見出した。生存、放射線学的、生理学的、組織学的検査、M2マクロファージ極性化及びTh2バイアス免疫、ECM組成、細胞型交替などの点で、Fc-エンドスタチンはmP1よりも優れていた。これは、この化合物の抗癌活性について報告されているように、より長い半減期(曝露)を有するFc-エンドスタチンの改善された薬物動態の結果であり得る[Lee, T.Y.ら、Linking Antibody Fc Domain to Endostatin Significantly Improves Endostatin Half-life and Efficacy. Clinical Cancer Research、2008. 14(5): p.1487-1493]。代替的に、異なる作用機序が、Fc-エンドスタチンの抗線維症効果を制御し得る。エンドスタチンが生理学的に三量体であるコラーゲン18非コラーゲンドメイン1(NC-1)のタンパク質分解断片であることを考慮すると、Fcコンジュゲーションを介するエンドスタチンの二量体化は、この内在性タンパク質のより生理学的な相関物を表し得る。興味深いことに、エンドスタチンの血漿レベルは、肺線維症を有する患者において増強していることが見出された。本発明者は、合成二量体としてのFc-エンドスタチンがフィブロネクチン(FN)に結合することができるが、エンドスタチン単量体は結合しないことを以前に示している(WO2013026913を参照)。FNは線維症進行の開始及び摂動に中心的役割を果たすと考えられている[To, W.S.及びK.S. Midwood、Plasma and cellular fibronectin: distinct and independent functions during tissue repair. Fibrogenesis Tissue Repair、2011. 4: p.21]。したがって、FNに対するFc-エンドスタチンの結合が、広範囲の下流の抗線維症シグナル伝達カスケードをもたらすことを推測することが魅力的である。
マトリックス形成は、FN、インテグリン及び細胞骨格への分子接着を必要とする[Schwarzbauer, J.E.及びD.W. DeSimone、Fibronectins、their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harb Perspect Biol、2011. 3(7)]。インテグリン媒介の結合組織産生は、線維形成における必須経路である。多くのインテグリンは、FNIII10内のRGDループ及びFNIII9内の隣接するPHSRN配列を介してFNに結合する。線維症促進性インテグリン(例えば、α5β1、αVβ1、αVβ3)のFNへの結合は、FN-マトリックス形成の進行における重要なステップであることは十分に認められている[Takahashi, S.ら、The RGD motif in fibronectin is essential for development but dispensable for fibril assembly. J Cell Biol、2007. 178(1): p.167-78; Leiss, M.ら、The role of integrin binding sites in fibronectin matrix assembly in vivo. Curr Opin Cell Biol、2008. 20(5): p.502-7]。
本発明者は、Fc-エンドスタチンによるαIIbインテグリンの強力な活性化を見出した。特に、インテグリンαIIbを活性化するための重要な分子であるKindlin-3もまた、転写的に高く上方制御されることを見出された(データは示さず)。インテグリンαIIbはFNIII9-10でFNに結合し、これらは線維症促進性インテグリンと同一の部位である[Leiss, M.ら、The role of integrin binding sites in fibronectin matrix assembly in vivo. Curr Opin Cell Biol、2008. 20(5): p.502-7.、Chada, D.、T. Mather、及びM.U. Nollert、The synergy site of fibronectin is required for strong interaction with the platelet integrin alphaIIbbeta3. Ann Biomed Eng、2006. 34(10): p.1542-52]。したがって、エンドスタチン誘導インテグリンαIIb上方制御は、FN結合に加えて、共通の線維症促進性インテグリンへのフィブロネクチンの結合を競合的に阻害し得る。エンドスタチン-インテグリン-FN相互作用の背後の潜在的な機序を理解するために、更なる親和性アッセイが進行中である。本発明者は、Fc-エンドスタチン及びmP1の後に増強したHGF発現をもまた見出した。HGFは、推定としての抗線維症効果を誘発することが最近同定されている[Crestani, B.ら、Hepatocyte growth factor and lung fibrosis. Proc Am Thorac Soc、2012. 9(3): p.158-63; Phin, S.ら、Imbalance in the pro-hepatocyte growth factor activation system in bleomycin-induced lung fibrosis in mice. Am J Respir Cell Mol Biol、2010. 42(3): p.286-93]。
これまでに本発明者が提供できる最も顕著なデータは、その抗血管新生効果に主に関与することが知られているエンドスタチンのN末端亜鉛結合領域[Tjin, R.M.ら、A 27-amino-acid synthetic peptide corresponding to the NH2-terminal zinc-binding domain of endostatin is responsible for its antitumor activity. Cancer Research、2005. 65(9): p.3656-3663]もまた、この内在性タンパク質により誘発される抗線維症効果に関連するということである。これは、エンドスタチンのC末端ドメインの抗線維症効果を仮定する最近公表されたデータと明らかに対照的である[Yamaguchi, Y.ら、A peptide derived from endostatin ameliorates organ fibrosis. Sci Transl Med、2012. 4(136): p.136ra71]。本発明者が使用した放射線誘発肺線維症モデルにおいて、C末端ペプチドは、最も研究された線維症発生のパラメーターを改善するのに有効ではなかった。まとめると、本発明者のデータは、RILFモデルにおけるその抗線維症効果の根底にあるN末端配列及びエンドスタチンの二量体化の重要な役割を示している。
[実施例11]オリゴマーエンドスタチンの結合特性
エンドスタチンの抗線維症効果が、Yamaguchiら、2012、前掲によって提案されるようにそのC末端断片に限定されることが、おそらくないという可能性があることを、本発明者は以前に示した。E4ペプチド含有領域であるエンドスタチンC末端を詳しく調べると、分子の仮定された抗線維症効果について機序の説明を提供し得る、この断片と潜在的なタンパク質相互作用パートナーとを結びつける明白な構造的特徴は示されない。E4活性の欠如に関する別の説明は、それらの急性マウス線維症モデルとは対照的に、本発明者は、線維症の発生が遅く(照射後24週を超える)、かつヒトにおける病態生理学により近く類似している慢性の動態に従う放射線誘発肺線維症モデルを使用したことであり得る。
本発明者は、N末端亜鉛結合断片が中程度の抗線維症活性を誘発することを更に示した。しかしながら、肺線維症の最も効率的な緩和は、合成エンドスタチン二量体(Fc-エンドスタチン)を使用したときに見出された。Fc-エンドスタチン(FcE)は、2つのFc鎖(ジスルフィド結合によって結合される)からなり、各々が単一のFc鎖へと連結するエンドスタチンの2つの分子へと伸長する。したがって、Fc二量体の結果として、2つの近接したエンドスタチン分子は二量体となる。
本発明者は以前に、ヒト血液中を循環する生理学的分子が、3つのエンドスタチンドメイン(エンドスタチン三量体)を有するオリゴマーエンドスタチン分子であるコラーゲン18のエンドスタチン前駆体NC1断片であることを示した。更に、本発明者は、Fc-エンドスタチンを血小板溶解物と混合すると、フィブロネクチン(FN)は、それらの相互作用を促進するための追加の抗体を必要とせずに免疫沈降したことを示した。本発明者のデータは、FNの結合がオリゴマーエンドスタチン(二量体又は三量体NC1)に特有であり、コラーゲン18由来の重要な抗血管新生分子であるとこれまでのところ考えられているエンドスタチン単量体と共有されないことを後から明らかにした(図9)。注目すべきは、フィブロネクチンが組織線維症の発生における中心的な分子である。したがって、本発明者による仮説は、オリゴマーエンドスタチンの有益な抗線維症効果が少なくとも部分的にはFNに結合するその特性によって媒介され、これによりNC1又はエンドスタチンオリゴマーを、単量体又はその断片(N末端、中間、又はC末端断片)と区別するということである。
本発明者の見解によると、エンドスタチンはNC1の最終分解産物である。本発明者は、エンドスタチン二量体及びNC1三量体の結合特性が、関連するタンパク質相互作用パートナーの点でエンドスタチン単量体とはかなり異なることを更に実証する新規のデータをここに提示する。換言すると、エンドスタチンのオリゴマー化特性は組織リモデリングの主要なプレイヤーへの結合において重要な役割を果たし、その抗線維症及び抗癌の効果の探索のために大きな影響を与える。
本発明者の新規な発見は、湿性黄斑変性症から癌及び線維症までの広範囲の病態生理学的状態を包含する多数のいわゆるVEGF関連疾患の中枢分子である血管内皮増殖因子(VEGF)に対するオリゴマーエンドスタチンの結合である。実際に、肺線維症の治療のために最近認可されたニンデタニブ（Nindetanib）は、PDGF及びVEGFシグナル伝達の強力な阻害剤である。エンドスタチン二量体及びNC1と対照的に、VEFGはエンドスタチン単量体に結合しない(図10)。
エンドスタチンの結晶学は、このタンパク質が、各々が亜鉛の原子に結合する二量体であることを以前に実証していた(Ding, Y. H.、K. Javaherian、K. M. Loら、1998. Zinc-dependent dimers observed in crystals of human endostatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95、10443-10448)。興味深いことに、エンドスタチンのN末端亜鉛結合ドメインは、細胞外マトリックスのリモデリング、線維症の発生、癌の進行及び転移における重要な役割を果たすMMP(マトリックスメタロプロテイナーゼ)のものに類似している。ここで、本発明者は、実際にエンドスタチン二量体及びNC1三量体がMMP-2及びMMP-9に結合し、この特性がエンドスタチン単量体によって共有されないことを実証する(図11)。この発見は、例えばFcを介する二量体化のような合成設計、又はエンドスタチン前駆体分子NC1を模倣する薬物を生成及び改善するための他の選択肢のいずれかによって、オリゴマーエンドスタチンの生物学的特性を追求するための新しい道を開く。
本研究者らのエンドスタチン二量体の結晶構造の研究に基づいて、本発明者はN末端から7位におけるアミノ酸であるグルタミンが第2鎖の同一のアミノ酸にきわめて近接していることを認識した。本発明者は、この位置においてQ(Gln)をC(Cys)によって置き換え、人工エンドスタチン二量体が、ジスルフィド結合による共有結合をもたらすことを予測した。本発明者の予測は正しいことが判明した。この新規の人工二量体は、以前のようにFc-エンドスタチンベクターにおいて発現した。しかしながら、Fcとエンドスタチンの両方は、それらの対応するジスルフィド結合によって別々に二量体化された。この組換えタンパク質のエンテロキナーゼ消化は、Fc二量体及びエンドスタチン二量体をもたらし、これをS-200 Sephadexで精製した。この実施例11に示される全ての結合アッセイにおいて利用された用語「エンドスタチン二量体」(ES二量体)は、この精製した分子を指す。
本明細書に提示した結合特性がオリゴマーエンドスタチンのみで観察されるという本発明者の仮説を裏付ける別の説得力のある証拠が図12に示されている。エンテロキナーゼ結合部位を、Fc-エンドスタチン内のFcとエンドスタチンの間で操作した。この分子のエンテロキナーゼ(EK)による消化は、Fc二量体と2つのエンドスタチン単量体をもたらした。追加の修飾が一切ないと、Fcとエンドスタチンの混合物は無傷のFc-エンドスタチンとは異なる特性を示した。
まとめると、本発明者は、本明細書において、臓器線維症の発生に中心的役割を果たすオリゴマーエンドスタチンに対するものであるが、単量体エンドスタチンに対してではない、新規の結合パートナーを解明する更なるデータを示す。これらの分子を標的とするオリゴマーエンドスタチンの特有の特性は、マウス肺線維症モデルにおいて本発明者によって試験された、単量体末端分解産物又はそのペプチド断片(mP1又はE4)さえもに対するNC1又はNC1様オリゴマーエンドスタチン(例えばFc-ES)の優れた抗線維症活性についての説得可能な説明を提供する。本発明者による新規の発見は、線維症関連疾患に対する治療のためだけでなく、VEGF関連疾患、MMP依存性疾患、及びフィブロネクチン機能の調節に対しての治療のためでもある、オリゴマーエンドスタチン(少なくとも二量体)からなるNC1又はNC1模倣体の開発を追求する新しい道を開く。
実施例11において使用されている試薬を以下に列挙する。
- Corning、96ウェルEIA/RIA高結合、ポリスチレン、平底、透明、非滅菌#3590
- BSA(Sigma Aldrich #A7030 IgGフリー)
- 組換えhMMP-2 (R&D #902-MP-010) PBS中、>1μg/ml
- 組換えhMMP-9 (R&D #911-MP-010) PBS中、>1μg/ml
- R7012 a.p.(抗エンドスタチン抗体)
- ABTS(Rockland #ABTS-100)
- ペルオキシダーゼコンジュゲートAffini Pureヤギ抗ウサギIgG(H+L)(Jackson Immuno Research#111-035-003 2.0ml)
- hFN(R&D #1918FN-02M)
- 組換えヒトVEGF165 (R&D Systems a biotechne brand #293-VE-010/CF)
プロテインゲル:
- Page Ruler Plus Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific #26619)
- SDS page 4-20％:
Mini- Protean TGX Precast Protein Gels (BioRad #4561094)
- エンテロキナーゼ、軽鎖、ブタ(GenScript #Z01003)

Claims (18)

  1. 線維症若しくは線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患、又はマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患の治療、緩和又は予防における使用のための、(i)コラーゲン18の少なくとも2つのNC-1単量体、又は(ii)コラーゲン18の少なくとも2つのエンドスタチンドメイン、又は(iii)コラーゲン18エンドスタチンドメインの少なくとも2つのN末端ペプチド、を含むタンパク質オリゴマー。
  2. 前記タンパク質オリゴマーがフィブロネクチン、VEGF、MMP-2、及び/又はMMP-9に結合する、請求項1に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  3. ヒトコラーゲン18のNC-1単量体が、オリゴマー化ドメイン、ヒンジ領域、及び/又はエンドスタチンドメイン若しくは前記エンドスタチンドメインの断片、並びに場合により、ヒンジ領域内の組換えプロテアーゼ切断部位を含む、請求項1又は2に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  4. コラーゲン18のエンドスタチンドメインが配列番号18若しくは配列番号19のアミノ酸配列から選択されるか、又はコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドが配列番号18若しくは配列番号19のアミノ酸残基1〜132由来のアミノ酸配列から選択される、請求項1又は2に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  5. コラーゲン18のNC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン、又はコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドにおいて、フィブロネクチンのPHSRNモチーフ及び/又はRGDモチーフを更に含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  6. ヒトコラーゲン18のNC-1単量体、コラーゲン18のエンドスタチンドメイン、又はコラーゲン18エンドスタチンドメインのN末端ペプチドが、天然又は異種のオリゴマー化ドメインを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  7. 天然のオリゴマー化ドメインが、コラーゲン18の非三重らせん三量体化ドメインである、請求項6に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  8. 異種のオリゴマー化ドメインが、Fcドメイン、人工オリゴマー化ドメイン、又はFcドメインと人工オリゴマー化ドメインの両方からなる群から選択されるオリゴマー化ドメインである、請求項6に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  9. Fcドメインが、IgG由来であり、好ましくはヒトIgG1又はノブイントゥーホール(KiH)操作ヒトIgG1由来である、請求項8に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  10. 人工オリゴマー化ドメインが、グルタミンがシステインによって置き換えられる単一の変異をコラーゲン18のエンドスタチンドメインの7位に含む、請求項8に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  11. アンジオスタチン、トロンボスポンジン、抗PD-1/PD-L1抗体、又は、線維症若しくは線維症関連疾患、VEGF関連疾患又はMMP関連疾患に利用される別の療法を更に含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  12. 線維症又は線維症関連疾患が、皮膚の線維症、好ましくは強皮症;ケロイド又はケロイド瘢痕;肥厚性瘢痕;限局性強皮症;移植片対宿主病の結果としての線維症;上皮下線維症;心内膜心筋線維症;子宮線維症;骨髄線維症;後腹膜線維症;腎性全身性線維症;手術後の瘢痕;喘息;肝硬変/肝線維症;異常な創傷治癒の結果としての線維症;糸球体腎炎;多巣性線維硬化症（multifocal fibrosclerosis）;放射線誘発線維症、好ましくは放射線誘発肺炎又は放射線誘発肺線維症;化学療法誘発又は薬物誘発線維症、例えば、mTOR又はEGFRキナーゼ阻害の結果として;通常又は特発性肺線維症;自己免疫疾患の結果としての線維症、例えば、ループス、腫瘍内及び癌関連の線維症/線維形成、臓器線維症が続く慢性炎症、例えばウイルス刺激又は移植を介する;慢性腎疾患、長期透析又は糖尿病の最終段階としての臓器線維症からなる群から選択される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  13. 血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患が、VEGFレベルの脱調節に依存する良性の病態生理学的状態、例えば湿性黄斑変性症、子宮内膜症、気管支喘息及び糖尿病、増強されたVEGF誘導性血管透過性(例えば、脳組織の照射後の増強された透過性、「放射線壊死」)、血管緊張の変化(例えば、高血圧)、関節リウマチなど、並びに悪性VEGF依存性疾患、例えば腎細胞癌及び他のVEGF依存的腫瘍、腹水のVEGF依存性発生、免疫系のVEGF依存性抑制、例えば骨髄(bone marrow)由来細胞(BMDC)、骨髄(myeloid)由来サプレッサー細胞(MdSC)、又は未成熟樹状細胞の動員及び微小環境教育などである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  14. マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患が、MMP活性化が病態生理に寄与する良性及び悪性の疾患、例えば、神経膠芽細胞腫、膵臓癌、肺癌のような高い局所治療失敗率を有する腫瘍において固有に顕在化する局所腫瘍浸潤及び癌転移のプロセスの間のMMPの活性化、並びに、治療に誘導される選択圧に関連して獲得されたMMP活性化の増強(例えば、放射線療法後の腫瘍低酸素及び線維症)、自己免疫疾患及び慢性炎症性疾患における顕著な免疫反応である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  15. タンパク質オリゴマーが0.1〜1mg/kg/日の濃度で投与される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  16. タンパク質オリゴマーが静脈内、頭蓋内/髄腔内、硝子体内、皮下、又は腹腔内に投与される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  17. タンパク質オリゴマーが、抗線維症活性、抗血管新生活性、抗浸潤/抗転移活性、血管透過性低減活性、抗炎症及び抗腫瘍化活性からなる群から選択される1つ以上の生物活性を有する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の使用のためのタンパク質オリゴマー。
  18. 線維症若しくは線維症関連疾患、血管内皮増殖因子(VEGF)関連疾患、又はマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)関連疾患の検出及び/又は診断のための診断用組成物としての使用のための、(i)コラーゲン18の少なくとも2つのNC-1単量体、(ii)コラーゲン18の少なくとも2つのエンドスタチンドメイン、又は(iii)コラーゲン18エンドスタチンドメインの少なくとも2つのN末端ペプチド、を含むタンパク質オリゴマー。
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