JP6113668B2 - 無症候性脳虚血及び他の器官の虚血の処置のための第ｘｉｉ因子阻害剤 - Google Patents

Description

本出願は、無症候性（ｓｉｌｅｎｔ）脳虚血及び他の器官の虚血、医学的手技を受ける患者において第ＸＩＩ因子阻害剤を投与する方法、並びに無症候性脳虚血及び他の器官における虚血を研究するため、かつ有望な治療剤を評価するために有用である動物モデルに関する。

無症候性脳虚血（ＳＢＩ）は、医学的手技、特に血管の手技及び手術の副作用である脳における小さな虚血傷害の状態である。虚血はまた他の器官でも起こり得る。医学的手技の間に動脈循環中に誤って放出された外来性又は内在性のいずれか物質がＳＢＩ又は他の器官の虚血、例えばびまん性塞栓性虚血を生じ得る。ＳＢＩは不均質性の症候群であり、塞栓の正確な源は変化し得る。例えば、ＳＢＩ又は他の器官の虚血を引き起こす塞栓又は微小塞栓は、泡、油、脂肪、コレステロール、凝固血液及び／又はデブリを含む多様な物質から構成され得る。通常、虚血傷害はびまん性である。ＳＢＩにおいて、脳の領域に微小塞栓がたくさん生じ（ｓｈｏｗｅｒｅｄ）そして個々の病巣は従来の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて検出することが困難である。例えば、微小塞栓のシグナルは、造影剤の注射の間、及び血管の調査の間に発見される（非特許文献１）。ＳＢＩにおける組織損傷の正確な機構は未知である（非特許文献１）。

この傷害のびまん性に起因して、ＳＢＩを有する患者は通常、脳卒中におけるような局所的で明らかに確定される神経学的な障害がない。しかし、行動の変化、神経心理学的欠損及び悪化した血管性認知症が大手術（例えば、冠動脈バイパス、弁置換手術、頸動脈内膜切除又はステント留置）の後に多数の患者において、血管インターベンション、冠動脈造影、動脈ライン又は集中治療室における大動脈内カウンターパルセイション装置を用いる多くの患者において頻繁に観察される。これらの症状は医学的手技の後で非常に一般的であるが、手技に直接関連していると見られることは稀である。次第に高感度の画像化モダリティ、例えば拡散強調ＭＲＩ（ＤＷＩ）が出現するにつれて、麻痺又は感受性欠損のような明白な臨床症状を伴わないで存在する脳に対する損傷が次第に認知されてきた。

特に心臓及び血管構造を含む手術及び手技を受けた患者の４５％までがＳＢＩを発症する。１年で米国において２００万回超行われる冠動脈造影は、１１−１５％のＳＢＩの危険性を有する（非特許文献１）。診断的血管造影を受けた患者の２６％まで、頸動脈ステント留置を受けた患者の５４％まで、及び心臓手術後の患者の４５％までがＳＢＩを罹患し得る（非特許文献１）。

ＳＢＩの臨床症状には、認知低下の増加した危険性、脳卒中の増加した危険性、及び認知症の悪化に加えて行動的及び神経心理学的な変化が含まれる（非特許文献２；非特許文献３）。ＳＢＩの存在は、６０〜９０歳の年齢の患者において認知症の危険性を倍より多く増加させ、かつ全体の認知機能の急激な低下及び神経心理学的試験における悪化した成績を生じると示されてきた（非特許文献２；非特許文献４）。

ＳＢＩは臨床的脳卒中とは異なるものである。臨床的脳卒中は、特徴がはっきりした神経学的障害を生じ、そしてしばしば脳に酸素化された血液を供給する動脈における脆弱なプラークの突発的崩壊を含むか、又は心房細動により引き起こされる心臓からの血栓塞栓症に起因する。脳卒中と対照的に、ＳＢＩの危険性がある患者は、原因となる動脈硬化性疾患又は脳卒中若しくは血栓症の危険因子を有していないかもしれない。血管手技を受ける患者には、例えば先天性心疾患を有する患者が含まれ得る。それ以外は健常なこのような患者は、医学的手技の間に導入される微小塞栓の副作用としてＳＢＩの危険性をなお有する（非特許文献５）。従って、ＳＢＩの予防的治療又は処置から利益を受ける患者人口は、血管系の構造との接触を含む医学的手技を受ける患者を含む。

ヘパリンは動脈内脳血管造影により引き起こされる臨床的無症候性塞栓事象を減少することが示されているが（非特許文献６）、頭蓋外及び頭蓋内の出血合併症の比較的高い危険性を有する。さらに、異なる種類の塞栓により引き起こされる異なるＳＢＩ事象が類似した分子機構を含むか、かつ／又は類似した治療剤を使用して処置可能であるかどうかは不明である。望ましい治療は、泡、油、脂肪、コレステロール、凝固血液及び／又はデブリから構成される微小塞栓を含む全ての種類の塞栓により引き起こされる虚血傷害を減少させるが、ヘパリンのように止血には影響しない。従って、原因に関係なく、ＳＢＩ及び他の器官の虚血、例えばびまん性塞栓性虚血のための有効かつ安全な処置が必要とされる。ＳＢＩを研究し、かつ処置を評価するための動物モデルの開発は、明らかな脳卒中を引き起こすことなくびまん性微小傷害を生成する必要があるため困難であった。従って、ＳＢＩの現実的な動物モデルは、なお組織損傷の分子機構を研究し、かつ治療剤候補を評価する必要がある。

第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）は、内在性凝固カスケードの活性化に関与するセリンプロテアーゼである。近年、マウスにおける第ＸＩＩ因子の欠損又は阻害が脳卒中モデルにおける脳損傷を減少させ、そして動脈血栓形成に対して保護的であるが、出血の危険性を増加させないということが見出された（特許文献１；特許文献２；非特許文献７；非特許文献８）。ＦＸＩＩ欠損マウスと同様に、ＦＸＩＩを欠損したヒトは、大外科手術手技の間でさえ、異常な出血素因に苦しめられない（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。

近年インフェスチン−４は、活性化ＦＸＩＩ（ＦＸＩＩａ）の新規な阻害剤であることが報告された。インフェスチンは、シャーガス病を引き起こすことが知られている寄生生物クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）の主要なベクターである吸血昆虫のサシガメ（Ｔｒｉａｔｏｍａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の中腸由来のセリンプロテアーゼ阻害剤のクラスである（非特許文献１２；非特許文献１３）。この昆虫はこれらの阻害剤を、摂取した血液の凝固を防ぐために使用する。インフェスチン遺伝子は、凝固経路において異なる因子を阻害し得るタンパク質を生じる４つのドメインをコードする。特に、ドメイン４は、ＦＸＩＩａの強力な阻害剤であるタンパク質（インフェスチン−４）をコードする。インフェスチン−４は出血の合併症なくマウスに投与されてきた（特許文献２）。

ＷＯ ２００６／０６６８７８ ＷＯ ２００８／０９８７２０

Ｂｅｎｄｓｚｕｓ Ｍ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌ Ｇ、５ Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．３６４−３７２、２００６ Ｖｅｒｍｅｅｒ ＳＥ ｅｔ ａｌ．３４ Ｓｔｒｏｋｅ １１２６−１１２９、２００３ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．２８ Ｓｔｒｏｋｅ １９３２−１９３９、１９９７ Ｌｏｐｅｚ ＯＬ ｅｔ ａｌ．６０ Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．１３９４−１３９９、２００３ Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６ｔｈ Ｅｄ．（Ｋａｓｐｅｒ ＤＬ、Ｆａｕｃｉ、ＡＳ、Ｌｏｎｇｏ、ＤＬ、Ｂｒａｕｎｗａｌｄ Ｅ、Ｈａｕｓｅｒ ＳＬ、Ｊａｍｅｓｏｎ ＪＬ ｅｄｓ．、２００５） Ｂｅｎｄｓｚｕｓ ｅｔ ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１０：２１１０−２１１５、２００４ Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｔｚ Ｃ ｅｔ ａｌ．２０３ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．５１３−５１８、２００６ Ｒｅｎｎｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．２０２ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２７１−２８１、２００５ Ｒａｔｎｏｆｆ ＯＤ ａｎｄ Ｃｏｌｏｐｙ ＪＥ、３４ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６０２−６１３、１９５５ Ｃｏｌｍａｎ ＲＷ、Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ １０３−１２２ （Ｃｏｌｍａｎ ＲＷ、Ｈｉｒｓｃｈ Ｊ、Ｍａｄｅｒ ＶＪ、Ｃｌｏｗｅｓ ＡＷ、Ｇｅｏｒｇｅ Ｊ ｅｄｓ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２００１） Ｓｃｈｍａｉｅｒ ＡＨ，１１８ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３００６−３００９、２００８ Ｃａｍｐｏｓ ＩＴＮ ｅｔ ａｌ．３２ Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．９９１−９９７、２００２ Ｃａｍｐｏｓ ＩＴＮ ｅｔ ａｌ．５７７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１２−５１６、２００４

ＳＢＩ及び他の器官における虚血（びまん性塞栓性虚血を含む）に至る不均一機構にもかかわらず、本出願の実施態様は、ＳＢＩ及び他の器官における虚血を処置するための、ＦＸＩＩ阻害剤、特にインフェスチン−４を含むタンパク質及びその変異体を提供する。さらに、本出願は、医学的手技の間に循環中に進入し得る様々な種類の塞栓を模倣したＳＢＩの動物モデルを提供する。本明細書において記載される動物モデルは、ＳＢＩを研究し、そして治療剤候補を評価するためのツールとして有用であり得る。

要旨
本出願は、医学的手技を受ける患者において第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）阻害剤を投与する方法を提供し、ここで該医学的手技は：心臓；大動脈、大動脈弓、頸動脈、冠状動脈、腕頭動脈、椎骨脳底循環、頭蓋内動脈、腎動脈、肝動脈、腸間膜動脈、及び／又は頭部から心臓への動脈系の血管から選択される少なくとも１つの血管；並びに患者が既知の中隔欠損を有する場合の静脈血管のうちの少なくとも１つとの接触を含む。医学的手技は、標的器官における虚血を生じ得る身体中の該血管の少なくとも１つにおける少なくとも１つの塞栓の除去を含み、そしてここでＦＸＩＩ阻害剤の投与は該医学的手技の前、該医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後である。「ＦＸＩＩ阻害剤」は、第ＸＩＩ因子及び活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）のいずれか又は両方の阻害剤を指す。

塞栓は、様々な物質から構成され得る。例えば、塞栓は、泡、油、脂肪、コレステロール、凝固血液及び／又はデブリから構成される。一実施態様において、塞栓は血栓ではない。

一実施態様において、標的器官は脳であり、そして患者は、（ｉ）無症候性脳虚血、又は（ｉｉ）非血栓溶解性（ｎｏｎｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓａｂｌｅ）物質により引き起こされる脳卒中を有しているか、有していたことがあるか、又はそれらの危険性がある。別の実施態様において、標的器官は心臓、腎臓、肝臓及び／若しくは消化管器官（食道、胃、小腸、及び／又は大腸（結腸及び／又は直腸を含む）を含む）である。

一実施態様において、医学的手技は、前記血管の少なくとも１つの内側との接触を含む。別の実施態様にいて、医学的手技は前記血管の少なくとも１つ又はそれ以上をクランプすることを含む。

一実施態様において、医薬的手技は血管手術である。特定の実施態様において、医学的手技は、冠動脈造影、頸動脈ステント留置、経皮的冠動脈形成、頸動脈内膜切除、心臓血管手術である。別の実施態様において、医学的手技は狭窄した腎動脈の拡張である。一実施態様において、医学的手技は診断上の血管手技である。特定の実施態様において、医学的手技は、カテーテル、ステント、バルーン及び／又は移植片のうちのいずれか１つ又はそれ以上を含む血管手技である。別の実施態様において、特に、造影剤の注射は気泡を不注意に生じ、かつ／又はデブリを遊離させ得るので、医学的手技は、造影剤を投与することを含む。

一実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤は、野生型インフェスチン−４（配列番号１）ポリペプチド配列、又はその変異体を含む。別の実施態様において、インフェスチン−４の変異体は、野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３、及び野生型インフェスチン−４配列との差異を生じる該Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１個かつ５個までのアミノ酸変異、並びに／又は６個の保存的システイン残基及び野生型インフェスチン−４配列に対する少なくとも７０％の相同性を含む。図２を参照のこと。別の実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤は、膵臓で発現されるヒトタンパク質であるＳＰＩＮＫ−１（配列番号２）を含み、これは野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３を含むように変異されるか（配列番号３で示される）、又は該変異ＳＰＩＮＫ−１の変異体である。特定の実施態様において、該変異ＳＰＩＮＫ−１の変異体は、野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３を含み、そして野生型ＳＰＩＮＫ−１配列との差異を生じ、かつ野生型インフェスチン−４配列に対する変異体の相同性を増加させる、該Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１個かつ５個までの変異を有し、かつ／又は６個の保存的システイン残基及び野生型ＳＰＩＮＫ−１配列に対する少なくとも７０％の相同性を含む。一実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤はＳＰＩＮＫ Ｋ１、Ｋ２、又はＫ３（配列番号３、４又は５）である。

別の実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤は、ＡＴ ＩＩＩ阻害剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、Ｃ１阻害剤、アプロチニン、アルファ−１プロテアーゼ阻害剤、アンチパイン （［（Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル−カルバモイル−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｖａｌ−アルギナール（Ａｒｇｉｎａｌ））、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏアルデヒド−ジメチルアセテート、ＤＸ８８、ロイペプチン、プロリルオリゴペプチダーゼの阻害剤、例えばＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒ−ＣＮ、トウモロコシ−トリプシン阻害剤、ウシ膵臓トリプシン阻害剤の変異体、エコチン、ＹＡＰ（コガネガレイ（ｙｅｌｌｏｗｆｉｎ ｓｏｌｅ）抗凝固タンパク質）、西洋カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）トリプシン阻害剤−Ｖ（西洋カボチャイソ阻害剤（ｉｓｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）から選択される。

さらに別の実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤は抗ＦＸＩＩ抗体である。抗ＦＸＩＩ抗体は、ＦＸＩＩ及び／又はＦＸＩＩａに結合し、かつ阻害する抗体を指す。

特定の実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤は半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）に連結される。一実施態様において、ＨＬＥＰは、例えばアルブミン、アファミン（ａｆａｍｉｎ）、アルファ−フェトプロテイン又はビタミンＤ結合タンパク質であり得る。一実施態様において、ＨＬＥＰはヒトアルブミン又はその変異体であり得る。他の実施態様において、ＨＬＥＰは免疫グロブリンである。免疫グロブリン部分はＩｇＧ由来のＦｃであり得る。

別の実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤はリンカーを介してＨＬＥＰに連結される。一実施態様において、リンカーは切断可能であり得る。特定の実施態様において、リンカーは、内在性、外因性、及び／又は共通の凝固経路の凝固プロテアーゼにより切断される。一実施態様において、リンカーはＦＸＩＩａにより切断される。

本出願の別の局面は、手技を含むＳＢＩの動物モデルに関し、ここで該手技は、脳における虚血傷害を生じ得る動物の動脈系中への少なくとも１つの塞栓の放出、及び脳における虚血傷害の適応について動物を評価することを含む。虚血傷害は臨床的に無症候である。この文脈における用語「放出」又は「放出すること」は、塞栓の外部供給源を動物の動脈系中に供給すること、及び塞栓を内部で生成する技術を使用することの両方を包含するが、血栓を生成するために血管中に糸を挿入することは包含しない。一実施態様において、手技は塞栓を動脈系中に放出することを含む。一実施態様において、手技は塞栓を頸動脈中に放出することを含む。特定の実施態様において、手技はカテーテルを使用して塞栓を放出することを含む。別の実施態様において、手技はクランプすること及び／又は手術を含む。一実施態様において、動物モデルは、心臓及び／又は腎臓を含む他の標的器官における虚血傷害について動物を評価することを含む。一実施態様において、手技は血栓を生成するために糸を血管中に挿入することを含まない。一実施態様において、手技は動物において脳卒中を引き起こさない。

一実施態様において、塞栓は蛍光物質を含む。特定の実施態様において、塞栓は非血栓溶解性物質（その塞栓が血栓溶解剤を使用して溶解されないかもしれないということを意味する）から構成される。このような実施態様において、塞栓は血栓ではない。例えば、塞栓は、ポリマー、泡、オイル、脂肪、コレステロール、及び／又はデブリから構成され得る。一実施態様において、塞栓はマイクロビーズ（マイクロスフェア又はマイクロパーティクルを含む）。塞栓は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の非血栓溶解性物質（単数又は複数）から構成され得る。別の実施態様において、塞栓は凝固血液から構成される。実施態様において、評価は画像化法及び／又は組織学を含む。一実施態様において、画像化法はＭＲＩ及び／又はＳＰＥＣＴを含む。一実施態様において、動物モデルはマウスである。別の実施態様において、動物モデルはラットである。

別の実施態様において、動物モデルはＳＢＩを減少させる治療剤候補を評価するためのものである。この実施態様において、治療剤は動物に投与され、そして脳における虚血傷害を減少させるその能力について試験される。別の実施態様において、治療剤は動物に投与され、そして他の標的器官における虚血傷害（びまん性塞栓性虚血を含む）を減少させるその能力について試験される。特定の実施態様において、治療剤候補は凝固経路の阻害剤である。一実施態様において、治療剤はＦＸＩＩ阻害剤である。一実施態様において、治療剤は抗体である。別の実施態様において、治療剤はタンパク質、ペプチド、核酸、又は小分子である。実施態様において、治療剤候補は手技の前、間かつ／又は後に動物に投与される。

一実施態様において、ＭＲＩ及び／又はＳＰＥＣＴイメージングを含む画像化法が、ＦＸＩＩ阻害剤の開発のために、標的器官における虚血傷害を評価するために使用される。画像化法は、ＦＸＩＩ阻害剤の投与の前、かつ／又は後に行われる。一実施態様において、標的器官は脳である。

さらなる実施態様は以下の項目において説明される。

項目１．医学的手技を受ける患者における虚血の予防及び／又は処置における使用のための第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）阻害剤であって、ここで該医学的手技は：
（ａ） 心臓、
（ｂ） 大動脈、大動脈弓、頸動脈、冠状動脈、腕頭動脈、椎骨脳底循環、頭蓋内動脈、腎動脈、肝動脈、腸間膜動脈、及び／又は心臓に対して近位の動脈系の血管から選択される少なくとも１つの血管、
（ｃ） 患者が既知の中隔欠損を有する場合の静脈血管；
のうちの少なくとも１つとの接触を含み、
そしてここで該医学的手技が、少なくとも１つの標的器官における該虚血を生じ得る身体中の該血管の少なくとも１つにおける少なくとも１つの塞栓の放出を含み、そしてここでＦＸＩＩ阻害剤は該医学的手技の前、該医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後に投与される。

項目２．塞栓が、泡、油、脂肪、コレステロール、凝固血液及び／又はデブリから構成される、項目１に従う使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。

項目３．標的器官が：
（ａ） 脳［ここで患者は：無症候性脳虚血、又は非血栓溶解性物質により引き起こされる脳卒中を有しているか、有していたことがあるか、又はそれらの危険性がある］；
及び／又は
（ｂ） 心臓、腎臓、肝臓；及び／若しくは消化管器官
である、項目１又は２に従う使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。

項目４．医学的手技が、
（ｉ） 前記血管の少なくとも１つ若しくはそれ以上の内側との接触；
（ｉｉ） 前記血管の少なくとも１つ若しくはそれ以上をクランプすること；
（ｉｉｉ） カテーテル、ステント、バルーン、移植片、及び／若しくは造影剤の投与のうちのいずれか１つ若しくはそれ以上を含む血管手技；
（ｉｖ） 血管手術、及び／若しくは診断上の血管手技；及び／又は
（ｖ） 冠動脈造影、頸動脈ステント留置、経皮的冠動脈形成、頸動脈内膜切除、心臓血管手術、若しくは狭窄した腎動脈の拡張
を含む、項目１〜３のいずれか１項に従う使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。

項目５．第ＸＩＩ因子阻害剤が、
（ｉ） 野生型インフェスチン−４ポリペプチド配列（配列番号１）、又はその変異体［ここで変異体は、
（ａ） 野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３、及び野生型インフェスチン−４配列との差異を生じる、該Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１個かつ５個までのアミノ酸変異；
及び／又は
（ｂ） ６つの保存的システイン残基、及び野生型インフェスチン−４配列に対する少なくとも７０％の相同性
を含む］、
（ｉｉ） 野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３を含むように変異されたＳＰＩＮＫ−１（配列番号２）、又は該変異ＳＰＩＮＫ−１の変異体［ここで変異体は、
（ａ） 野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３、及び野生型ＳＰＩＮＫ−１配列との差異を生じ、かつ野生型インフェスチン−４配列に対する変異体の相同性を増加させる、該Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１個かつ５個までのアミノ酸変異；
及び／又は
（ｂ） ６つの保存的システイン残基、及び野生型ＳＰＩＮＫ−１配列に対する少なくとも７０％の相同性
を含む］、
（ｉｉｉ） ＡＴ ＩＩＩ阻害剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、Ｃ１阻害剤、アプロチニン、アルファ−１プロテアーゼ阻害剤、アンチパイン（［（Ｓ）−１カルボキシ−２−フェニルエチル］−カルバモイル−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｖａｌ−アルギナール）、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−アルデヒド−ジメチルアセテート、ＤＸ８８、ロイペプチン、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒ−ＣＮのようなプロリルオリゴペプチダーゼの阻害剤、トウモロコシ−トリプシン阻害剤、ウシ膵臓トリプシン阻害剤の変異体、エコチン、ＹＡＰ（コガネガレイ抗凝固性タンパク質）及び西洋カボチャトリプシン阻害剤−Ｖ、西洋カボチャイソ阻害因子、及び／若しくはＰｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチル−ケトン（ＰＣＫ）；及び／又は
（ｉｖ） 抗ＦＸＩＩ抗体［ここで抗体はＦＸＩＩに結合し、かつその活性及び／又は活性化を阻害する］
を含む、項目１〜４のいずれか１項に従う使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。

項目６．変異ＳＰＩＮＫ−１の変異体が、ＳＰＩＮＫ Ｋ１、Ｋ２、又はＫ３（配列番号：３、４、又は５）である、項目５に従う使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。

項目７．ＦＸＩＩ阻害剤が半減期増強ポリペプチドに連結されており、ここで半減期増強ポリペプチドは、場合により：
（ｉ） アルブミン、アファミン、アルファ−フェトプロテイン若しくはビタミンＤ結合タンパク質；又は
（ｉｉ） ヒトアルブミン、若しくはその変異体；又は
（ｉｉｉ） 免疫グロブリン若しくはその変異体；又は
（ｉｖ） ＩｇＧのＦｃ
である、項目１〜５のいずれか１項に従う使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。

項目８．半減期増強ポリペプチドがリンカーを介してＦＸＩＩ阻害剤に連結されており、ここでリンカーが、場合により内在性、外因性、又は共通の凝固経路の凝固プロテアーゼにより切断可能である、項目７に従う使用のための第ＸＩＩ因子阻害剤。

項目９．第ＸＩＩ因子阻害剤の開発のための画像化方法の使用であって、第ＸＩＩ因子阻害剤候補を投与すること、並びに動物の標的器官における虚血に対する第ＸＩＩ因子阻害剤候補の効果を、放射線学又は核医学、例えばＣＴ（場合によりＳＰＥＣＴ−ＣＴ及び／又はＦＭＴ−ＣＴ）；ＭＲＩ（場合により拡散強調ＭＲＩ（ＤＷＩ）及び／又はｆＭＲＩ）；ＰＥＴ；光学的画像（場合により蛍光反射率画像化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）；超音波、顕微鏡法、蛍光透視法、オートラジオグラフィ、及び／又は蛍光体画像化（ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ））を使用して評価することを含み、ここで虚血は塞栓により引き起こされ、かつ
（ｉ） 標的器官は、脳、腎臓、肝臓、及び／又は消化管器官であり、そして
（ｉｉ） 標的器官が脳である場合、さらにここで、虚血傷害は臨床的に無症候性で、かつ／又は塞栓は非血栓溶解性である、
上記使用。

項目１０．第ＸＩＩ因子阻害剤の開発のための組織学的方法の使用であって、第ＸＩＩ因子阻害剤候補を投与すること、並びに動物の標的器官における虚血に対する第ＸＩＩ因子阻害剤の効果を、ＴＴＣ染色、免疫組織化学及び／又は組織化学を使用して評価することを含み、ここで虚血は塞栓により引き起こされ、かつ
（ｉ） 標的器官は、脳、心臓、腎臓、肝臓及び／又は消化管器官であり、そして
（ｉｉ） 標的器官が脳である場合、さらにここで虚血傷害は臨床的に無症候性であり、かつ／又は塞栓は非血栓溶解性である、上記使用。

項目１１．虚血の動物モデルであって、
（ａ） 少なくとも１つの標的器官において虚血傷害を生じ得る、動脈系における少なくとも１つの塞栓を故意に放出すること含む手技［ここで
（ｉ） 標的器官は脳、心臓、腎臓、肝臓及び／又は消化管器官であり；かつ
（ｉｉ） 標的器官が脳である場合、さらに虚血傷害が臨床的に無症候性でありかつ／又は塞栓は非血栓溶解性である］；
及び
（ｂ） 標的器官における虚血傷害の適応について動物を評価すること
を含む、上記動物モデル。

項目１２．手技が、
（ｉ） 塞栓を血管中に放出すること；
（ｉｉ） 塞栓を動脈中に放出すること；
（ｉｉｉ） 心臓、大動脈、大動脈弓、頸動脈、冠状動脈、腕頭動脈、椎骨脳底循環、頭蓋内動脈、腎動脈、肝動脈、腸間膜動脈、及び／若しくは頭部から心臓への動脈系の血管中に塞栓を放出すること；及び／又は
（ｉｖ） 頸動脈中に塞栓を放出すること
を含む、項目９〜１１に記載の方法。

項目１３．評価工程が、磁気共鳴画像法、及び／又はＳＰＥＣＴイメージングを含む、項目９又は１１に記載の方法。

項目１４．（ｉ） 治療剤候補が、標的器官における虚血傷害を減少させる能力について試験され、ここで治療剤候補は手技の前、間、かつ／若しくは後に動物に投与され；かつ／又は
（ｉｉ） 治療剤候補が凝固経路の阻害剤である、
虚血を処置するための治療剤候補を評価するための、項目９〜１１に記載の方法。

項目１５．治療剤候補が、
（ｉ） ＦＸＩＩ阻害剤又は
（ｉｉ） 抗体又は
（ｉｉｉ） 小分子
である、項目９〜１４に記載の方法。

本出願にける実施態様のさらなる目的及び利点は、以下の説明において一部表され、そしてこの説明から一部明らかとなり、又はそれらは実施において学ばれ得る。実施態様の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせにより表される。

図面の説明
特許又は出願書類は、少なくとも１つのサイン済みのカラー図面（ｄｒａｗｉｎｇ ｅｘｅｃｕｔｅｄ ｉｎ ｃｏｌｏｒ）を含む。カラー図面を含むこの特許又は特許出願の複写は、請求及び必要費用の支払いにより官庁により提供される。

サシガメ（Ｒ．ｐｒｏｌｉｘｕｓ）阻害剤とトロンビンとの接触部位及びＳＰＩＮＫ−１とキモトリプシンとの接触部位。＃はサシガメ（Ｒ．ｐｒｏｌｉｘｕｓ）阻害剤とトロンビンとの間の接触部位であるアミノ酸を示し；＋はＳＰＩＮＫ−１とキモトリプシンとの間の接触部位であるアミノ酸を示す。 インフェスチン−４（Ｉ４）とＳＰＩＮＫ−１ （ＳＰ）との間のアミノ酸配列類似性。^＊は同一のアミノ酸を示し；｜は類似のアミノ酸を示し；太字のアミノ酸は保存的システインであり；インフェスチン−４配列の下線を付したアミノ酸２〜１３は保存されている。 インフェスチン−４、ＳＰＩＮＫ１及び３つのＳＰＩＮＫ１変異体（Ｋ１、Ｋ２、及びＫ３）のアミノ酸配列。^＊は同一を示し；｜はインフェスチン−４配列に関して類似のアミノ酸を示す。Ｉ４の下線を付した配列を、ＳＰＩＮＫ−１の１５個のアミノ酸を置き換えるために使用してＫ１を生成した。変異体Ｋ２及びＫ３は、Ｋ１配列に対するさらなる点変異（下線を付したアミノ酸）により生成された。 モデル。（Ａ）注射前のＦＴＣ＋マイクロビーズの蛍光画像。（Ｂ）新鮮なマウス血液から作製されたエクスビボで形成及び標識された凝固血液の蛍光画像。（Ｃ） 塞栓の投与を説明する漫画（Ｃａｒｔｏｏｎ）。送達カテーテルを外頚動脈（ＥＣＡ）中に挿入する。ＩＣＡ：内頚動脈、ＣＣＡ：総頸動脈。注射の間、ＣＣＡを一時的に結紮して塞栓を強制的にＩＣＡ中に送る。（Ｄ、Ｅ）マイクロビーズ（Ｄ）又は凝固血液（Ｅ）のいずれかの注射後の脳表面の蛍光画像。 ｒＨＡ−インフェスチン−４はトリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）により定量される傷害を減少させる。塞栓の投与の３日後におけるＴＴＣ染色による組織損傷の評価を棒グラフで示す。対応する脳断面の代表的なＴＴＣスライス及び蛍光反射率画像を示す。データを平均＋標準誤差として示す。^＊ｐ＜０．０５。 二次出血はｒＨＡ−インフェスチン−４により増加されない（３日目）。ビーズ又は凝固血液の注射の３日後における二次出血の評価。１つの代表的な脳スライスをマウスごとに示す。赤い枠は出血が検出されたマウスを示す（矢印）。 ｒＨＡ−インフェスチン−４は、ＳＰＥＣＴ−ＣＴにより評価して、凝固血液の投与後に損傷領域においてＦＸＩＩＩ活性を減少させる。血漿トランスグルタミナーゼ活性（ＦＸＩＩＩａ）を、凝固血液から構成される塞栓の投与の３時間後に評価した。ＦＲＩ：蛍光反射率画像は、凝固血液の位置を示す。％ＩＤＧＴは組織１グラムあたりの注射された用量を指す。ＴＢＲ：標的対バックグラウンド比。データは平均＋標準誤差として示される。^＊ｐ＜０．０５。 ｒＨＡ−インフェスチン−４は、ＳＰＥＣＴ−ＣＴにより評価して、マイクロビーズの投与後に損傷領域においてＦＸＩＩＩ活性を減少させる。血漿トランスグルタミナーゼ活性（ＦＸＩＩＩａ）を、ビーズ塞栓の適用の３時間後に評価した。ＦＲＩ：蛍光反射率画像はビーズの位置を示す。％ＩＤＧＴは組織１グラムあたりの注射された用量を指す。ＴＢＲ：標的対バックグラウンド比。データを平均＋標準誤差として示す。^＊ｐ＜０．０５。 ＦＸＩＩＩの免疫組織化学。ビーズ又は凝固血液の投与の３時間後のＦＸＩＩＩのの免疫組織化学染色。バーは５０μｍを指す。 凝固血液の投与後にＭＲＩにより測定してＭＰＯ活性の変化はなかった。凝固血液から構成される塞栓の投与の３日後のＭＰＯ活性の評価。ＦＲＩ：蛍光反射率画像は凝固血液の位置を示す。ＡＵ：任意単位。ＣＮＲ：コントラスト対ノイズ比。データを平均＋標準誤差として示す。ｐ＞０．０５。 マイクロビーズの投与後にＭＲＩにより測定してＭＰＯ活性の変化はなかった。マイクロビーズ塞栓の投与の３日後のＭＰＯ活性の評価。ＦＲＩ：蛍光反射率画像はビーズの位置を示す。ＡＵ：任意単位。ＣＮＲ：コントラスト対ノイズ比。データを平均＋標準誤差として示す。ｐ＞０．０５。

詳細な説明
本出願の実施態様は、医学的手技を受ける患者において第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）阻害剤を投与する方法に関し、ここで医学的手技は：心臓；大動脈、大動脈弓、頸動脈、冠状動脈、腕頭動脈、椎骨脳底循環、頭蓋内動脈、腎動脈、肝動脈、腸間膜動脈、及び／又は頭部から心臓への動脈系の血管から選択される少なくとも１つの血管；並びに患者が既知の中隔欠損を有する場合の静脈血管のうちの少なくとも１つとの接触を含む。医学的手技は、標的器官の虚血を生じ得る、身体中の該血管における少なくとも１つの塞栓の放出、及び医学的手技の前、間、かつ／又は後のＦＸＩＩ阻害剤の投与を含む。虚血は、塞栓が泡、油、脂肪、コレステロール、凝固血液及び／又はデブリから構成されるかどうかに関わらず、様々な種類の塞栓により引き起こされ得る。一実施態様において、標的器官は脳であり、そして患者は、ＳＢＩを有しているか、有していたことがあるか、又はＳＢＩの危険性がある。さらに、本出願の実施態様は、ＳＢＩの研究のため、及び治療剤候補の評価のために有用であり得るＳＢＩの動物モデルを提供する。

本出願の実施態様の一つの利点は、ＳＢＩが一連の医学的手技を受けるか異なる疾患状態を示しているか又は示していない患者において減少され得るということである。特許請求された方法の成功は、以下の手技又は疾患状態のいずれかを患者が有しているか有していないかには依存しない。従って、特許請求された方法の成功は、患者がいずれかの根底にある疾患を有している有していないか、又は例えば根底にある血栓症の危険性を有しているか有していないかには依存しない。実際に、特許請求された方法は、例えば根底にある血栓症の危険性を有していないが、例えば先天性心疾患を修正するための医学的手技を受ける患者において効果的に機能すると考えられる。従って、患者人口は、血栓症の危険性がある患者人口より広く、かつそれ故血栓症の危険性がある患者人口とは異なるものである。本出願は、特定の手技又は疾患状態を有する患者を含むか又は除外する患者人口部分集合を主張することを意図する。

Ｉ．定義
本出願において使用される略語「ＦＸＩＩ」は、第ＸＩＩ因子及び活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）のいずれか又は両方を指す。従って、用語「ＦＸＩＩ阻害剤」は、ＦＸＩＩ及びＦＸＩＩａのいずれか又は両方の阻害剤を含む。さらに、抗ＦＸＩＩ抗体は、ＦＸＩＩ及びＦＸＩＩａのいずれか又は両方に結合し、かつ阻害する抗体を含む。

本明細書において使用される用語「虚血」は、ヒト患者又は動物における、処置されなければ虚血傷害を生じる、組織又は標的器官への不十分な血液供給の状態を指す。例えば、大脳又は「脳虚血」は、酸素供給が脳組織の要求を満たさないような脳への血液の減少を指す。脳「梗塞」は、虚血又は血流の停止が細胞死を生じるほど十分長く続いた場合に生じ得る死亡脳組織を指す。梗塞はコンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）又はＭＲＩを使用して特徴づけられ得る。梗塞はまた、びまん性（ｄｉｆｆｕｓｅ）であり、かつ従来のＭＲＩで明白な変化を生じるためには小さ過ぎるとして特徴づけられる小さい虚血傷害又は微小病変により引き起こされる死亡組織を指し得る。このような小さな梗塞は、拡散強調ＭＲＩのような高感度の画像化モダリティを用いて可視化され得る。

本明細書において使用される用語「虚血傷害」は、虚血、例えばびまん性若しくは局所虚血、微小傷害、一過性虚血、微小病巣、病巣、微小梗塞又は梗塞の結果としての標的器官に対して起こり得る多様な損傷を指す。虚血傷害はさらに、それらが泡、油、脂肪、コレステロール、凝固血液、及び／又はデブリを含む塞栓により引き起こされ得るという点においてさらに特徴づけられ得る。塞栓のサイズに依存して、異なる事象が生じ得る。例えば、非血栓溶解性（ｎｏｎｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓａｂｌｅ）物質（気泡を含む）のような塞栓がより大きい場合、それは脳卒中を引き起こし得る。このような事象は、心臓手術又は動脈内手技の副作用であり得る。気泡のような塞栓がより小さい場合、又は複数の気泡のような複数の小さい塞栓がある場合、それはＳＢＩを引き起こし得る。一実施態様において、例えば脳卒中は気泡から構成される塞栓により引き起こされる。

用語「無症候性（ｓｉｌｅｎｔ）」は、「無症候性脳虚血」（「ＳＢＩ」）、又は「無症候性脳梗塞」、又は「臨床的に無症候性」に言及する場合、例えば急性かつ顕性の脳卒中を特徴付ける症状、例えば片側不全麻痺、知覚減退、及び／又は失語症のない、脳組織における虚血の状態を指す。脳卒中は、２４時間より長く持続する局所的神経障害を生じる脳循環の障害に関連するいずれかの急性臨床事象として定義され得る。ＳＢＩは、よりわずかな神経障害に関連し得、これらとしては、限定されないが、行動変化、悪化した認知能力、視野欠損、腕及び足の障害、虚弱、抑うつ性症状、身体機能の低下、及び悪化した血管性認知症が挙げられる。例えば、以前の一過性虚血発作又は脳卒中様の症状に関連する梗塞は、症候性として定義され得るが、一方で対応する脳卒中様の症状のないものは「無症候性」として定義され得る。用語「無症候性」は、全く症状が無いことを意味しない；これは、症状が典型的な脳卒中とは異なり、かつ一般的にはよりかすかなものであり、そして特定の例では他の方法でのみ現れ、それらは高機能の画像化法又は認知試験のようなより徹底的な試験によってのみ検出され得るということを意味する。器官におけるびまん性塞栓性虚血に言及する場合の用語「びまん性」は、器官における１つより多くの位置への塞栓の分散により引き起こされる虚血（すなわち、虚血は局所的ではない）の特徴を指す。

本明細書で使用される用語「減少させること」は、個体若しくは動物におけるＳＢＩの可能性を低下させること、いずれかの症状の重症度を低下させること、及び／又はＳＢＩの危険性がある集団における実際にＳＢＩを有する患者の割合を低下させることを含む。従って、「減少させること」は、ＳＢＩの状態を減少させること（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）、低下させること、軽減すること、限定すること、寛解させること、又は改善することを指す。ＳＢＩを減少させることは、例えば、ＳＢＩの発生に対して保護すること；ＳＢＩの危険性を減少させること、それが生じるにつれて、若しくは一旦それが生じてしまった場合にＳＢＩの重症度を減少させること；ＳＢＩの損傷を限定すること、例えば虚血傷害が梗塞へと発達することを限定すること；ＳＢＩの拡大を減少させること、例えば虚血傷害により影響を受けるか若しくは損傷を受ける脳の領域若しくは血管の量を限定すること；又はＳＢＩに付随する脳における状態、例えば炎症若しくは浮腫を改善することを含み得る。

一実施態様において、患者はＳＢＩを有しているか、有していたことがある。特定の実施態様において、患者はＳＢＩの「危険性がある」。ＳＢＩの「危険性がある」患者には：心臓；大動脈、大動脈弓、頸動脈、冠状動脈、腕頭動脈、椎骨脳底循環、頭蓋内動脈、腎動脈、肝動脈、腸間膜動脈、及び／又は頭部から心臓への動脈系の血管；並びに患者が既知の中隔欠損を有する場合の静脈血管のうちの少なくとも１つとの接触を含む医学的手技を受けたことがあるか、受けているか、又は受けるようとしている患者が含まれる。ＳＢＩの「危険性がある」患者は、身体中の血管における少なくとも１つの塞栓の放出を含む医学的手技を受けたことがあるか、受けているか、又は受けようとしている。ＳＢＩを有するか、有していたことがあるか、又はＳＢＩの「危険性がある」患者へのＦＸＩＩ阻害剤の投与の方法はＳＢＩの発生を限定するため、ＳＢＩの損傷の発生を限定するため若しくはＳＢＩの損傷を寛解させるための医学的手技の前、間、かつ／又は後に起こり得る。特定の実施態様において、ＦＸＩＩを投与しようとする患者はＳＢＩを有している必要は無い。例えば、患者は医学的手技の前にＳＢＩを有していなくてもよいか、若しくは患者が医学的手技の前、間、かつ／又は後にＳＢＩを有しているか否かが未知であってもよいが、これらの場合、患者は医学的手技に起因するＳＢＩの「危険性があり」、従って、ＦＸＩＩ阻害剤を投与され得る。特定の実施態様において、患者又は動物は、ＦＸＩＩ阻害剤の投与の前、間、かつ／又は後にＳＢＩを有していてもよい。特定の実施態様において、患者又は動物はＦＸＩＩ阻害剤の投与の前、間、かつ／又は後にＳＢＩを有していなくてもよい。

用語「生じ得る」は、標的器官への虚血が、塞栓を生成する手技を受ける患者又は動物、及びＦＸＩＩ阻害剤を与えられていない患者又は動物において発生するという状況を含むことを意味し；これはまた、患者又は動物が以前に又は同時にＦＸＩＩ阻害剤の投与を受けているために標的器官への虚血が患者又は動物において発生しないという状況も含む。虚血（及び虚血が継続した場合に発生するであろういずれかの梗塞）はまた、患者又は動物が、手技の後短時間以内に、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは３０分位内に、１時間以内に、又は手技の終結の２、４、６、８、１２、２４、２８、７２、若しくは９６時間以内にＦＸＩＩ阻害剤を与えられる場合に発生しないかもしれない。

例えば、動物モデルの一実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤は、手技の前、間、かつ／又は手技の短時間（上で定義されたとおり）後で投与され得、従って動物はＳＢＩを発症しないかもしれない。動物モデルの別の実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤は手技の後に投与され得、そして動物はＳＢＩを発症するかもしれない。この用語はまた、包含される医学的手技のうちの１つを有する患者のそれぞれかつ全てが、実際には除去された塞栓を有するわけではないという事実も指す。これらの状況のそれぞれが本出願の実施態様に含まれる。

動物被験体における句「無症候性脳虚血を誘導する」は、実施例２Ａ及び上で記載されるように、上記動物が例えば、画像化及び／又は組織学により虚血傷害の適応（例えば脳における梗塞）を有し、かつ症状が臨床的に無症候である方法を指す。

医学的手技を「受ける（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ）」患者は、医学的手技を受けようとしている患者、医学的手技を受けている患者、又は医学的手技を受けたことがある患者を指す。

「ＦＸＩＩ阻害剤が虚血傷害を減少させることを可能にする」において使用される用語「可能にする」は、脳における虚血傷害を減少させるために十分な量で、かつ十分な投与経路を介してＦＸＩＩ阻害剤を投与することとして定義される。用語「減少させる」及び「虚血傷害」は上で定義される。虚血傷害の量は、様々な画像化モダリティーにより評価され得、これらとしては限定されないが、ＭＲＩ及び／又はＣＴが挙げられる。

「塞栓」は、血管を閉塞させることができる固体、液体、又は気体から構成されるいずれかの脱離した血管内物質を指す。閉塞は、発生点から離れた部位で起こりえる。塞栓の組成としては、限定されないが、泡若しくはＣＯ₂；油、脂肪、コレステロール；デブリ、例えば血管デブリ、例えば石灰化、組織、若しくは腫瘍断片；凝固血液、細菌若しくは寄生体のような生物、若しくは他の感染性因子；又は外来物質が挙げられる。用語「泡」は、空気若しくは他の気体、又は特定の例では、血液でも凝固血液でもない液体から形成される塞栓を含む。泡は球形でも非球形でもよい。一実施態様において、塞栓は血栓ではない。別の実施態様において、塞栓は凝固血液から構成される。用語「微小塞栓」は、本明細書で使用される用語「塞栓」に含まれ、かつ微視的サイズの塞栓を指し、そして上で定義された塞栓と同じ物質から構成され得る。従って「塞栓」は、単数若しくは複数の塞栓、微小塞栓、多数の塞栓、又は多数の微小塞栓を含む。

塞栓は動脈塞栓であってもよく、この場合、脱離した血管内物質は動脈系の動脈又は血管中にある。一実施態様において、塞栓は「奇異性塞栓」であり、これは例えば中隔欠損に起因して、動脈系中に入る静脈起源の塞栓を指す。

「相同性」は、同一であるか又は保存的置換を構成するアミノ酸のパーセンテージ数を指す。相同性は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒａｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，３８７−３９５）（これは参照により本明細書に加入される）のような配列比較プログラムを使用して決定され得る。このようにして、本明細書において挙げられているものと類似か又は実質的に異なる長さの配列が、その整列中にギャップを挿入することにより比較され得、このようなギャップは例えばＧＡＰにより使用される比較アルゴリズムにより決定される。

ＩＩ． 医学的手技
一実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤は、医学的手技を受ける患者に投与される。本明細書で使用される用語「医学的手技」は、診断、介入、処置、又は手術の行為を指す。一実施態様において、医学的手技は、心臓；大動脈、大動脈弓、頸動脈、冠状動脈、腕頭動脈、椎骨脳底循環、頭蓋内動脈、腎動脈、肝動脈、腸間膜動脈、及び／又は頭部から心臓への動脈系の血管から選択される少なくとも１つの血管；患者が既知の中隔欠損を有する場合の静脈血管のうちの少なくとも１つとの接触を含む。本明細書で使用される用語「接触」は、器具、外部物体、人物、例えば外科医、又は医学的手技に起因して前記血管構造に触れるいずれかの他の物体による前記血管構造の物理的接触を指す。一実施態様において、医学的手技は、前記血管の少なくとも１つの内側との接触を含む。特定の実施態様において、医学的手技は、前記血管の少なくとも１つ又はそれ以上をクランプすることを含む。実施態様において、医学的手技は塞栓の放出を含み、かつ塞栓は泡、油、脂肪、コレステロール、凝固血液、及び／又はデブリから構成され得る。実施態様において、医学的手技は、カテーテル、ステント、バルーン、移植片、及び／又は造影剤の投与、とりわけ気泡及び／又は除去されたデブリを不注意で生成し得る造影剤の注射のうちのいずれか１つ又はそれ以上を含む。

一実施態様において、医学的手技は血管手技である。用語「血管手技」は心臓又は血管に影響を与えるいずれかの手技を包含し、ここで血管は、血液を運搬するか含有する構造として定義される。血管手技は、例えばカテーテルを使用すること又は造影剤を投与することを含み得る。特定の実施態様において、医学的手技は動脈系を含み、動脈、動脈枝、細動脈、毛細血管、又は心臓から血液を運ぶ際に関与する血管を含む手技を指す。実施態様において、医学的手技は以下の血管の１つ又はそれ以上を含む：大動脈、大動脈弓、頸動脈、冠状動脈、腕頭動脈、椎骨脳底循環、頭蓋内動脈、腎動脈；例えば、総肝動脈及び／若しくは固有肝動脈を含む肝動脈；例えば、上腸間膜動脈、及び／若しくは下腸間膜動脈を含む腸間膜動脈；及び／又は頭部から心臓への動脈系の血管；患者が既知の中隔欠損を有する場合の静脈血管。

用語「診断的」は、状態、疾患、又は障害を同定又は評価するために行われる手技を指す。診断的手技は、例えばカテーテル、ステント、バルーン、移植片のいずれか１つ又はそれ以上を使用すること及び／又は造影剤を投与することを含み得る。

一実施態様において、医学的手技は血管手術である。血管手術は、血管構造、例えば心臓又は血管を含む手術である。血管手術の例としては、限定されないが、心臓血管手術、例えば、冠動脈バイパス術；又は心肺バイパス術を含まない心臓動脈グラフト；例えば、大動脈弁又は僧帽弁、大動脈、又は僧帽弁切開術又は弁形成術を含む心臓弁置換又は修復；心臓移植；狭窄又は逆流の状態を改善するための手術；一時的又は永続的なペースメーカー、両室ペースメーカーを含む、ペースメーカーを含む手術；発電機交換、リード除去（ｌｅａｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）又は移植可能ループレコーダー、移植された電気除細動器／除細動器デバイス、又は循環を支援する機械機器、例えば体外ポンプ又は心室補助装置に関わる手術；頸動脈内膜剥離術；血栓内膜摘除術；大動脈瘤及び切開手術；透析アクセス手技、例えば動脈−静脈フィステル；心臓腫瘍又は外傷性心損傷に関わる手術；及び再建手術又はいずれかの他の現在公知であるか若しくは将来の血管手術が挙げられる。

血管手術は、例えば先天性心欠陥のための矯正的（ｃｏｒｒｅｃｔｉｖｅ）手術を含み得る。先天性心欠陥のための矯正的手術としては、限定されないが、先天異常若しくは欠陥の修復のための手術、例えば、心房中隔欠損若しくは心室中隔欠損の修復；動脈管開存の修復；シャントの修復；大動脈縮窄修復；全体的若しくは部分的な肺静脈還流異常の修復；大血管の完全転移の静脈転換矯正（ｖｅｎｏｕｓ ｓｗｉｔｃｈ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）若しくは心室内手術；Ｆａｌｌｏｔの四徴症の修復；又はいずれかの他の現在公知であるか若しくは将来の、先天性心欠陥のための手術が挙げられる。

一実施態様において、医学的手技はカテーテルを使用することを含む。本明細書で使用される用語「カテーテル」は、血管に挿入される管を指す。カテーテルを使用することを含む手技の例としては、限定されないが、冠動脈、頸動脈ステント挿入、頭蓋内ステント挿入、大動脈若しくは腸骨動脈のような血管へのステント挿入；血管形成術、例えばバルーン血管形成術；血栓摘出；カテーテル血栓溶解療法（ｃａｔｈｅｔｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ）；塞栓形成、化学療法剤若しくは熱の直接的若しくは局所的投与；心臓弁置換若しくは修復；又は大動脈若しくは僧帽弁切開若しくは弁形成術が挙げられる。一実施態様において、医学的手技は、カテーテル若しくはステントのいずれかの使用、又は血管の切開若しくはクランプすることを含む手技を含む。血管手技は血管プロービング、例えば血管内コイル閉塞、血管内動脈瘤閉塞又は異物（例えば白金コイル）の適用を用いた頭蓋内血管プロービングを含み得る。

一実施態様において、医学的手技は画像化法を含む。画像化法は、インビボでの生物学的及び細胞プロセスを可視化するために使用され得、そして状態、疾患又は障害のスクリーニング、診断、評価、モニタリング又は処置のために使用され得る。画像化法は、カテーテルを使用することを含んでいても含んでいなくてもよい。画像化技術は、冠動脈造影法のような血管系を画像化し得、これらとしては、冠血管系、肺血管系、若しくは身体のいずれかの部分の血管を調べること、又大動脈造影を含む診断的血管造影又はカテーテルベースの血管造影が挙げられる。

一実施態様において、医学的手技は造影剤、放射性同位体又は色素の投与を含む。画像化モダリティ及び一般的に使用される造影剤の考察については、Ｐｙｓｚ ＭＡ ｅｔ ａｌ．６５ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ ５００−５１６、２０１０を参照のこと；造影剤及び様々な画像化技術の例は以下に示される。

例えば、ＣＴにおいて使用される造影剤としては、限定されないが、バリウム、ヨウ素、クリプトン、及びキセノンが挙げられる。単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ−ＣＴ）において使用される造影剤としては、限定されないが、^99mＴｃ、¹²³Ｉ、¹¹¹Ｉｎ、¹⁷⁷Ｌｕが挙げられる。陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）において使用される一般的な造影剤としては、限定されないが、同位体¹¹Ｃ、¹⁸Ｆ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁸Ｇａが挙げられる。ＭＲＩにおいて使用される造影剤としては、限定されないが、ガドリニウム（Ｇｄ³⁺）、酸化鉄粒子（ＳＰＩＯ、ＵＳＰＩＯ）、酸化マンガン、及び¹⁹Ｆが挙げられる。磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）において使用される造影剤としては、限定されないが、コリン、クレアチン、ラクテート、脂質、ポリアミン類、及びＮ−アセチル−アスパラギン酸が挙げられる。造影微小気泡（Ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ）が超音波法（ＵＳ）において使用される、例えば、ガス充填マイクロスフェア（例えばペルフルオロブタン）又は脂質シェル化気泡（ｌｉｐｉｄ−ｓｈｅｌｌｅｄ ｂｕｂｂｌｅｓ）。蛍光分子、色素、及び／又は光吸収分子が光学画像化技術において使用され得る。放射性トレーサが、腫瘍学的、心血管又は神経学的な画像化において使用され得る、例えば¹¹Ｃ、¹⁸Ｆ、⁶⁴Ｃｕ、¹¹¹Ｉｎ、^99mＴｃ、⁹⁰Ｙ、¹³¹Ｉ、¹²³Ｉ−／¹³¹、及び¹⁵³Ｓｍ。Ｃａｐｔｈｅｓｉｎ Ｂ−又はＭＭＰ２／９−活性化「スマート（ｓｍａｒｔ）」蛍光プローブが光断層撮影において使用され得る。表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）特性を有するＮＩＲＦ色素、量子ドット、及びナノ粒子を含む増強剤がラマン分光法において使用され得る。他の画像化技術としては、例えば微小気泡で造影した心エコー法（ＥＣＨＯ）が挙げられ得、これには二次元ＥＣＨＯ、負荷心エコー、ドプラＥＣＨＯ、及び経食道ＥＣＨＯが含まれる。画像化技術には顕微鏡法、光音響イメージング、又はいずれかの他の現在公知である将来の分子画像化モダリティ及び／又は関連する造影剤が含まれ得る。分子画像化法は、組織若しくは疾患特異的マーカーに結合されるか、又は標的化送達のために治療剤候補に結合された、マイクロビーズ（マイクロスフェア及びマイクロパーティクルを含む）及びナノ粒子の投与を含み得る。

ＦＸＩＩ阻害剤は、医学的手技の前、間かつ／又は後に患者に投与され得る。ＦＸＩＩ阻害剤は、医学的手技の１、２、４、６、１２、２４、４８、７２、若しくは９６時間又はそれ以上前、間かつ／又は後に投与され得る。ＦＸＩＩ阻害剤は、医学的手技の前、間かつ／又は後に、単回用量若しくは複数回用量で、又は０．２５、０．５、１、２、４、６、１２、２４、若しくは４８時間又はそれ以上の間隔で繰り返し投与され得る。ＦＸＩＩ阻害剤はまた、持続注入として医学的手技の前、間かつ／又は後に１、２、４、６、１２、２４、４８、７２、又は９６時間又はそれ以上投与され得る。出血の危険性を増加させないという有利な特性のために、ＦＸＩＩ阻害剤は、医学的手技の前、間かつ／又は後に投与され得る。最適な投与回数は、臨床試験において各特定の手技について決定され得る。投与のタイミングもまた、手技の種類又は個々の患者の状態（患者の病歴、根底にある疾患、及び／又は他の薬物の使用を含む）のような因子に依存し得、そして医療提供者により決定され得る。

ＩＩＩ． ＦＸＩＩ阻害剤
上で考察したように、「ＦＸＩＩ」は第ＸＩＩ因子及び活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）のいずれか又は両方を指す。従って、「ＦＸＩＩ阻害剤」は、ＦＸＩＩ及びＦＸＩＩａのいずれか又は両方の阻害剤を含む。さらに、抗ＦＸＩＩ抗体は、ＦＸＩＩ及びＦＸＩＩａのいずれか又は両方に結合し、かつ阻害する抗体を含む。用語「ＦＸＩＩ阻害剤」はまた、半減期延長ポリペプチド（これは一実施態様においてリンカーを含む）に連結されたＦＸＩＩ阻害剤を含むことも意図される。

一実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は特異的ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤であり、好ましくは特異的ＦＸＩＩａ阻害剤である。

特異的ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、１：１のモル比で使用された場合に、ＦＸＩＩ及び／又はＦＸＩＩａ以外の血漿セリンプロテアーゼを２５％又はそれ以下阻害する阻害剤を指す。換言すると：特異的ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤は、その阻害剤が１：１の各血漿セリンプロテアーゼ対上記阻害剤のモル比で使用される場合に、ＦＸＩＩ及び／又はＦＸＩＩａ以外の血漿セリンプロテアーゼを２５％又はそれ以下だけ阻害する。例えば、特異的ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ ｍＡｂは、血漿セリンプロテアーゼＦＸＩａを５％だけ阻害し、ここでＦＸＩａ対上記ｍＡｂのモル比は１：１であるが、一方で同じＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ ｍＡｂはＦＸＩＩａを少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％阻害する。

本発明の一実施態様において、１つの他の血漿セリンプロテアーゼは、１：１の各血漿セリンプロテアーゼ対上記阻害剤のモル比で使用された場合に５０％より多く阻害される。

本発明の別の実施態様において、２つの他の血漿セリンプロテアーゼは、１：１の各血漿セリンプロテアーゼ対上記阻害剤のモル比で使用された場合に５０％より多く阻害される。

さらに別の実施態様において、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤はヒトＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤であり、これにはヒト化モノクローナル抗体が含まれ、好ましくは完全ヒト化モノクローナル抗体である。

Ａ．インフェスチン−４
一実施態様において、本出願は、インフェスチンドメイン４、インフェスチン−４を含むＦＸＩＩ阻害剤を提供する。一実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤はインフェスチン−４の変異体を含む。別の実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤はインフェスチンドメイン４、そして場合によりインフェスチンドメイン１、２及び／又は３を含み；これらのタンパク質はＦＸＩＩの強力な阻害剤であることが公知である（ＷＯ２００８／０９８７２０を参照のこと；またＣａｍｐｏｓ ＩＴＮ ｅｔ ａｌ．５７７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１２−５１６，２００４も参照のこと）。インフェスチン−４の野生型ポリペプチド配列を提供する（配列番号１）。本明細書において使用される用語「変異体」は、アミノ酸変異を有するポリペプチドを指し、ここで「変異」は、野生型インフェスチン−４配列に対する置換、欠失又は付加として定義され、ここでこのような変化はＦＸＩＩを阻害するそのポリペプチドの機能的能力を変更しない。用語「変異体」は、野生型又は変異インフェスチン−４配列のフラグメントを含む。このような変異体のさらなる例は以下に提供される。

一実施態様において、インフェスチン−４変異体は、野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３（図２において下線を付された配列を参照のこと）、及び野生型インフェスチン−４配列との差異を生じる、Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１個かつ５個までのアミノ酸変異、又は６個の保存的システイン残基（図２における太字のアミノ酸を参照のこと）並びに野生型インフェスチン−４配列に対する少なくとも７０％の相同性を含む。インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３は、トロンビンに結合する関連する阻害剤ベネズエラサシガメ（Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐｒｏｌｉｘｕｓ）（ＰＤＢ：１ ＴＳＯ）についての構造的データの分析、及びキモトリプシンに結合するＳＰＩＮＫ−１の分析にもとづいて、これらは両方とも図１に示されるようにＮ末端領域において接触部位の蓄積という共通の特徴を共有しており、ＦＸＩＩの結合のために重要であり得る。従って一実施態様において、インフェスチン−４の変異体は、野生型インフェスチン−４配列のアミノ酸２〜１３の保存的Ｎ末端領域、及び野生型インフェスチン−４配列との差異を生じる、これらの保存的Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１個かつ５個までのアミノ酸変異を含む。変異は置換でも欠失でも付加でもよい。本明細書において使用される用語「Ｎ末端アミノ酸の外側」は、配列ＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶ、すなわち野生型インフェスチン−４配列からのアミノ酸２〜１３を含むアミノ酸の連続した配列以外の変異体ポリペプチド鎖に沿ったいずれかのアミノ酸を指す。別の実施態様において、インフェスチン−４変異体は、６つの保存的システイン残基を含み、野生型インフェスチン−４配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する。一実施態様において、この６つの保存的システイン残基は野生型インフェスチン−４配列の６位、８位、１６位、２７、３１位及び４８位のアミノ酸である（図２を参照のこと）。一実施態様において、変異体は最後の保存的システインを含む。他の実施態様において、システイン残基の正確な位置、及び互いに対する相対的な位置は、インフェスチン−４変異体における挿入又は欠失に起因して野生型インフェスチン−４配列の６位、８、１６、２７、３１、及び４８位から変化し得る。それにももかかわらず、これらの実施態様では、インフェスチン−４変異体は６個全てのシステインを含み、かつ野生型インフェスチン−４配列に対して７０％、７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を共有し得る。

実施態様において、インフェスチン−４の変異体はそれがＦＸＩＩを阻害するという点で特徴付けられる。ＦＸＩＩを阻害する機能的活性は、例えばインビトロ及び／又はインビボの特徴付けにより評価され得、これらとしては、ＦＸＩＩ酵素活性の阻害を試験する直接的アッセイ、延長された凝固時間、すなわち、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、又は凝固を評価するインビボでの方法が挙げられる。インフェスチン−４変異体のさらなる例はＳＰＩＮＫ−１変異体であり、これは以下に記載される。

Ｂ． ＳＰＩＮＫ−１変異体
一実施態様は、ヒトにおける治療上の使用のためのＦＸＩＩ阻害剤を含む。インフェスチン−４に対して高い類似性を有するヒトタンパク質が使用され得る。例えば、インフェスチン−４に対する最も高い類似性を有するヒトタンパク質は、膵臓で発現されるＫａｚａｌ型セリンプロテアーゼ阻害剤であるＳＰＩＮＫ−１である（膵分泌性トリプシン阻害剤、ＰＳＴＩとしても知られる）。Ｋａｚａｌ型セリンプロテアーゼ阻害剤ファミリーは、セリンプロテアーゼ阻害剤の多数のファミリーのうちの一つである。様々な種由来の多くの蛋白質が記載されている（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ Ｍ ａｎｄ Ｋａｔｏ Ｉ、４９ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９３−６２６、１９８０）。インフェスチン−４とＳＰＩＮＫ−１との間のアミノ酸配列類似性の概要を図２に示す。

野生型ＳＰＩＮＫ−１配列（配列番号２）に基づいて、インフェスチン−４に対するＳＰＩＮＫ−１配列の相同性を増加させるために様々な変異体が生成され得る。句「インフェスチン−４に対する増加した相同性」は、ＳＰＩＮＫ−１配列をインフェスチン−４配列に近づけるためにＳＰＩＮＫ−１に対して行われるアミノ酸変異のプロセスを指す。

一実施態様において、ＳＰＩＮＫ−１は野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３を含むように変異され；ポリペプチド配列が生じ、これはＫ１と呼ばれる（配列番号３）。上記のように、インフェスチン−４配列のＮ末端部分はＦＸＩＩ阻害機能のために重要と考えられる。

従って、一実施態様において、変異ＳＰＩＮＫ−１の変異体はまた、野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３、及び野生型ＳＰＩＮＫ−１配列との差異を生じ、かつ野生型インフェスチン−４配列に対する変異体の相同性を増加させる、上記Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１個かつ５個までのアミノ酸変異を含む。別の実施態様において、変異ＳＰＩＮＫ−１の変異体は６つの保存的システイン残基を含み、そして野生型ＳＰＩＮＫ−１配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する。変異は置換でも、欠失でも、付加でもよい。上で定義されたように、用語「上記Ｎ末端アミノ酸の外側」は、配列ＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶ、すなわち野生型インフェスチン−４配列からのアミノ酸２〜１３から構成されるアミノ酸の連続した配列以外の変異体のポリペプチド鎖に沿ったいずれかのアミノ酸を指す。用語「変異体」は上記変異ＳＰＩＮＫ−１配列のフラグメントを含む。一実施態様において、６個の保存的システイン残基は野生型ＳＰＩＮＫ−１配列の９位、１６位、２４位、３５位、３８位、及び５６位のアミノ酸であり得る（図２を参照のこと）。一実施態様において、変異体は最終保存的システインを含む。別の実施態様において、システインの正確な位置、及び互いに対する相対的な位置は、ＳＰＩＮＫ−１変異体における挿入又は欠失に起因して、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列の９位、１６位、２４位、３５位、３８位、及び５６位から変化し得る。それにもかかわらず、これらの実施態様において、ＳＰＩＮＫ−１変異体は６個全てのシステインを含む。実施態様において、ＳＰＩＮＫ−１変異体はそれがＦＸＩＩを阻害するという点でも特徴づけられる。

このようなＳＰＩＮＫ−１変異体の例が生成され、Ｋ２、及びＫ３と名付けられる（それぞれ配列番号４及び５）。ＳＰＩＮＫ−１変異体Ｋ２及びＫ３において、Ｎ末端の外側のさらなるアミノ酸置換が、インフェスチン−４に対する相同性を増加させるために作成され、ここで変異体はそれらがＦＸＩＩ活性を阻害するという点でも特徴づけられる。ＷＯ２００８／０９８７２０を参照のこと。図３はこれらの変異体のアミノ酸配列及びＳＰＩＮＫ−１野生型配列に対する変化の程度を示す。ＳＰＩＮＫ−１変異体Ｋ３の場合、５個のアミノ酸置換が、インフェスチン−４に対する相同性を増加させるために作成された。従って、実施態様において、ＳＰＩＮＫ−１変異体は野生型ＳＰＩＮＫ−１配列と７０％、７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を共有し得る。

Ｃ． 他のＦＸＩＩ阻害剤
一実施態様において、ＦＸＩＩの他の阻害剤が医学的手技を受ける患者に投与される。上で考察したように、用語ＦＸＩＩ阻害剤は、ＦＸＩＩ及びＦＸＩＩａの両方の阻害剤を含む。Ｗ０２００６／０６６８７８において、ＦＸＩＩに対する抗体の使用又はＦＸＩＩの阻害剤の使用が提案される。具体的には、ＦＸＩＩに対する阻害剤としては、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ ＩＩＩ）、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、Ｃ１阻害剤、アプロチニン、アルファ−１プロテアーゼ阻害剤、アンチパイン （［（Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル−カルバモイル−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｖａｌ−アルギナール（Ａｒｇｉｎａｌ））、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏアルデヒド−ジメチルアセテート、ＤＸ８８（Ｄｙａｘ Ｉｎｃ．、３００ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｑｕａｒｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ ０２１３９、ＵＳＡ；Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ａ ａｎｄ Ｂａｉｒｄ ＬＧ、２９ Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｓｃｉ．２５５−２５８、２００３中に引用される）、ロイペプチン、プロリルオリゴペプチダーゼの阻害剤、例えばＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒ−ＣＮ、トウモロコシ−トリプシン阻害剤（ＣＴＩ）、ウシ膵臓トリプシン阻害剤の変異体、エコチン、コガネガレイ（ｙｅｌｌｏｗｆｉｎ ｓｏｌｅ）抗凝固タンパク質（ＹＡＰ）、西洋カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）トリプシン阻害剤−Ｖ（西洋カボチャイソ阻害剤（ｉｓｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）及びハマダリン（Ｈａｍａｄａｒｉｎ）（Ｉｓａｗａ Ｈ ｅｔ ａｌ．２７７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６５１−２７６５８、２００２に開示されるとおり）を含む）、及びＰｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチル−ケトン（ＰＣＫ）が挙げられる。

ＦＸＩＩ阻害剤は、例えば抗体、又は阻害活性を保持している同じもの又は模倣物のフラグメント、例えば米国特許第６，６１３，８９０号、第４〜８欄に開示されるようなアミロイド前駆体タンパク質のＫｕｎｉｔｚプロテアーゼ阻害剤ドメインの類似体であり得る。他の適切な阻害剤は、Ｉｓａｗａ Ｈ ｅｔ ａｌ．２７７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６５１−２７６５８、２００２に開示されるハマダリンであり得る。適切なトウモロコシトリプシン阻害剤及びその製造方法は、Ｃｈｅｎ Ｚ ｅｔ ａＩ．６５ Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１３２０−１３２４、１９９９、及びＷｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．１８ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１３−８１４、１９９２に開示される。

別の実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤は、ＦＸＩＩに結合し、かつＦＸＩＩ活性化及び／又は活性を阻害する抗ＦＸＩＩ抗体であり得る。このような抗体は例えばＷＯ２００６／０６６８７８、及びＲａｖｏｎ ｅｔ ａｌ．、１ Ｂｌｏｏｄ ４１３４−４３、１９９５において記載される。上で考察したように、「抗ＦＸＩＩ抗体」は、ＦＸＩＩ及びＦＸＩＩａのいずれか又は両方に結合し、かつ阻害する抗体を含む。抗ＦＸＩＩ抗体は以下でさらに詳細に記載される。

Ｄ．半減期増強ポリペプチドに連結されたＦＸＩＩ阻害剤
本出願の別の局面は、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）に連結されたＦＸＩＩ阻害剤を提供する。一実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤は小タンパク質である。従って、他の小タンパク質について公開されているような急速な腎クリアランスが予測され得る（Ｗｅｒｌｅ Ｍ ａｎｄ Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ Ａ、３０ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ３５１−３６７、２００６）。ポリペプチド性（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｉｃ）化合物の短い血漿半減期に対処するための１つの方法は、それを繰り返し注射するか又は持続注入することである。別のアプローチは、ポリペプチド自体の本質的な血漿半減期を増加させることである。例えば、一実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤は半減期延長タンパク質に連結される。

「半減期増強ポリペプチド」は、患者又は動物においてインビボでのＦＸＩＩ阻害剤の半減期を増加させる。例えば、アルブミン及び免疫グロブリン並びにそれらのフラグメント又は誘導体は、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）として記載されている。Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．（ＷＯ２００１／７９２７１）は、ヒト血清アルブミンに融合された場合に、インビボでの増加した機能的半減期及び延長された貯蔵寿命を有すると予測される多数の様々な治療用ポリペプチドの融合ポリペプチドを記載した。

用語「アルブミン」及び「血清アルブミン」は、ヒトアルブミン（ＨＡ）及びその変異体、示される完全成熟形態（配列番号６）、さらには他の種由来のアルブミン及びその変異体を包含する。本明細書で使用される「アルブミン」は、アルブミンポリペプチド若しくはアミノ酸配列、又はアルブミンの１つ若しくはそれ以上の機能的活性（例えば生物学的活性）を有するアルブミン変異体を指す。本明細書で使用されるアルブミンは、ＦＸＩＩ阻害剤の治療的活性を安定化するか又は延長することができる。アルブミンは、いずれかの脊椎動物、特にいずれかの哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、又はブタ由来のものであり得る。非哺乳動物アルブミンとしては、限定されないが、ニワトリ及びサケ由来のアルブミンが挙げられる。アルブミン連結ポリペプチドのアルブミン部分は、治療的ポリペプチド部分と異なる動物由来であってもよい。アルブミン融合タンパク質の例についてはＷＯ２００８／０９８７２０を参照のこと。

一実施態様において、アルブミン変異体は、少なくとも１０、２０、４０、若しくは少なくとも７０アミノ酸長であるか、又はＨＡ配列（配列番号６）からの１５、２０、２５、３０、５０若しくはそれ以上の連続したアミノ酸を含み得るか、又はＨＡの特異的ドメインの一部若しくは全てを含み得る。アルブミン変異体は、保存的又は非保存的置換のいずれでも、アミノ酸置換、欠失又は付加を含み得、ここでこのような変化は、半減期増強ポリペプチドの治療的活性をもたらす活性部位又は活性ドメインを実質的に変更しない。これらの変異体は、７０％、７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を共有し得る。

一実施態様において、アルブミン変異体はフラグメントを含み、そしてアルブミンの少なくとも１つのドメイン全体又はそのドメインのフラグメント、例えばドメイン１（配列番号６のアミノ酸１〜１９４）、２（配列番号６のアミノ酸１９５〜３８７）、３（配列番号６のアミノ酸３８８〜５８５）、１＋２（配列番号６の１〜３８７）、２＋３（配列番号６の１９５−５８５）又は１＋３（配列番号６のアミノ酸１〜１９４＋配列番号６のアミノ酸３８８−５８５）からなるものであり得、またあるいはこれらを含み得る。各ドメインはそれ自体で、残基Ｌｙｓ１０６〜Ｇｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２〜Ｖａｌ３１５及びＧｌｕ４９２〜Ａｌａ５１１を含む可撓性のサブドメイン間リンカー領域と共に、２つの相同サブドメイン、すなわち、１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１及び５１２〜５８５から構成される。

別の実施態様において、構造的又は進化的にアルブミンと関連する他のタンパク質はＨＬＥＰとして使用され得、これらとしては、限定されないが、アルファ−フェトプロテイン（ＷＯ２００５／０２４０４４；Ｂｅａｔｔｉｅ ａｎｄ Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ、２０ Ｇｅｎｅ ４１５−４２２、１９８２）、アファミン（ａｆａｍｉｎ）（Ｌｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２６９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８１４９−１８１５４、１９９４）、及びビタミンＤ結合タンパク質（Ｃｏｏｋｅ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ、７６ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２４２０−２４２４、１９８５）が挙げられる。それらの遺伝子は、ヒト、マウス、及びラットにおける同じ染色体領域に位置する構造的及び機能的な類似性を有する多重遺伝子クラスターを代表する。アルブミンファミリーメンバーの構造的類似性は、ＨＬＥＰとしてのそれらの有用性を示唆する。例えば、アルファ−フェトプロテインは、付着された治療用ポリペプチドの半減期をインビボで延長させると主張されている（ＷＯ２００５／０２４０４４）。治療活性を安定化させるか又は延長させることができるこのようなタンパク質、又はその変異体が使用され得、そしてこれらはいずれかの脊椎動物、特にいずれかの哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、若しくはブタ、又はニワトリ若しくはサケを含むがこれらに限定されない非哺乳動物由来であり得る。ＷＯ２００８／０９８７２０を参照のこと。このような変異体は１０若しくはそれ以上のアミノ酸長のものであり得、又はそれぞれのタンパク質配列の約１５、２０、２５、３０、５０若しくはそれ以上の連続したアミノ酸を含み得、又はそれぞれのタンパク質の特異的ドメインの一部若しくは全てを含み得る。アルブミンファミリーメンバー融合タンパク質は天然に存在する多形変異体を含み得る。

別の実施態様において、免疫グロブリン（Ｉｇ）又はその変異体はＨＥＬＰとして使用され得、ここで変異体はフラグメントを含む。一実施態様において、免疫グロブリン定常領域のＦｃドメイン又は部分が使用される。定常領域はＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＥ免疫グロブリンのものであり得る。治療用ポリペプチド部分は、抗体のヒンジ領域又は切断可能であり得るペプチドリンカーを介してＩｇに接続される。いくつかの特許及び特許出願は、治療用タンパク質のインビボでの半減期を延長するための免疫グロブリン定常領域への治療用タンパク質の融合を記載する（ＵＳ２００４／００８７７７８、ＷＯ２００５／００１０２５、ＷＯ２００５／０６３８０８、ＷＯ２００３／０７６５６７、ＷＯ ２００５／０００８９２、ＷＯ２００４／１０１７４０、ＵＳ６，４０３，０７７）。例えば、サイトカインＩＦＮ−βに融合したＦｃは、増強されたＩＦＮ−β生物学的活性、延長された循環半減期及びより高い溶解度を達成した（ＷＯ２００６／０００４４８）。従って、別の実施態様は、このような免疫グロブリン配列、例えば、免疫グロブリン及びその変異体のＦｃフラグメントをＨＬＥＰとして使用することである。ＦＸｌｌ阻害剤は、免疫グロブリン定常領域のＦｃドメイン又は少なくとも一部にＨＬＥＰとして融合され得、そして原核生物若しくは真核生物宿主細胞、例えば細菌、酵母、植物、動物（昆虫を含む）若しくはヒトの細胞株において、又はトランスジェニック動物において組み換え分子として産生され得る（ＷＯ２００８／０９８７２０）。ＳＰＩＮＫ−Ｋ２−Ｆｃ融合タンパク質は例として配列番号７で示される。

Ｅ．リンカー
一実施態様において、介在するペプチドリンカーは、治療用ポリペプチドとＨＬＥＰとの間に導入され得る。一実施態様において、切断可能なリンカーが、特にＨＬＥＰが治療用ポリペプチドの特異的活性に、例えば立体障害により干渉する場合に導入される。特定の実施態様において、リンカーは、内在性、外因性、又は共通の凝固経路の凝固プロテアーゼのような酵素により切断される。内在性経路の凝固プロテアーゼは、接触活性化経路におけるプロテアーゼであり、これらとしては、例えば、ＦＸｌｌａ、ＦＸｌａ、又はＦＩＸａが挙げられる。一実施態様において、リンカーはＦＸｌｌａにより切断される。外因性経路のプロテアーゼとしては、組織因子経路におけるプロテアーゼ、例えばＦＶＩＩａが挙げられる。共通経路のプロテアーゼとしては、フィブリノゲンのフィブリンへの変換に関与するプロテアーゼ、例えば、ＦＸａ、ＦＩＩａ、及びＦＸＩＩＩａが挙げられる。

Ｆ．治療製剤及び投与
ＦＸＩＩ阻害剤またはその変異体は、８０％より高い純度、又は９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％より高い純度を有し得る。一実施態様において、変異体は、他のタンパク質及び核酸のような高分子の混入に関して９９．９％より高い純度であり、かつ感染性及び発熱性の因子を含まない、薬学的に純粋な状態を有し得る。

精製されたＦＸＩＩ阻害剤を、場合により製剤添加物が添加され得る従来の生理学的に適合性の水性緩衝液中に溶解して、患者においてＳＢＩを処置するための医薬製剤が得られ得る。このような製剤担体及び添加剤、さらには適切な医薬製剤は、当該分野で周知である。例えばＫｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、（３^rd ｅｄ．、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ）、２０００を参照のこと。医薬組成物は、凍結乾燥又は安定な可溶形態で製剤化され得る。ポリペプチドは当該分野で公知の様々な手順により凍結乾燥され得る。凍結乾燥製剤は、１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる希釈剤、例えば注射用滅菌水又は滅菌生理食塩水を加えることにより使用前に再構成される。

ＦＸＩＩ阻害剤の製剤は、いずれかの薬学的に適切な投与手段により患者に送達される。様々な送達系が公知であり、いずれかの都合の良い経路により組成物を投与するために使用され得る。組成物は例えば非経口で全身投与され得る。本明細書で使用される用語「非経口」として、皮下、静脈内、筋内、動脈内及び気管内の注射、点滴注入、噴霧適用及び注入技術が挙げられる。非経口製剤は、ボーラス形態で若しくは持続注入としてのいずれかで静脈内投与され得、又は公知の手順に従って皮下投与され得る。非経口用途に関して周知の液体担体としては、滅菌水、食塩水、水性デキストロース、糖溶液、エタノール、グリコール、及びオイルが挙げられる。全身用途については、治療用タンパク質は静脈内ライン又は動脈ライン用に製剤化され得る。製剤は注入により又はボーラス注射により連続的に投与され得る。いくつかの製剤は持続放出（ｓｌｏｗ ｒｅｌｅａｓｅ）系を包含する。一実施態様において、製剤はパッチとして投与される。経口投与用の錠剤及びカプセル剤は従来の添加剤、例えば結合剤、フィラー、滑沢剤又は湿潤剤などを含有し得る。経口液体製剤は水性若しくは油性の懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤などの形態であり得、又は水若しくは使用のための他の適切なビヒクルでの再構成のための乾燥製剤として提供され得る。このような液体製剤は、従来の添加剤、例えば懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル及び保存料を含有し得る。

ＦＸＩＩ阻害剤の用量は、多くの因子、例えば適応症、処方、又は投与様式に依存し得、そしてそれぞれの適応症について前臨床試験及び臨床試験において決定され得る。ＦＸＩＩ阻害剤の用量は、医学的手技の前、医学的手技の間、かつ／又は医学的手技の後に患者に投与され得る。一実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤は、医学的手技の前、医学的手技の間、かつ／又は医学的手技の後、１、２、４、６、１２、２４、４８、７２、若しくは９６時間以内に投与され得る。ＦＸＩＩ阻害剤は、医学的手技の前、医学的手技の間、かつ／又は医学的手技の後に、単回用量で、又は複数回用量で、０．２５、０．５、１、２、４、６、１２、２４、若しくは４８時間の期間の持続注入として、又は０．２５、０．５、１、２、４、６、１２、２４、若しくは４８時間間隔で繰り返し投与され得る。出血の危険性を増加させないという有利な特性のために、一実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤は手技の間に投与される。医薬組成物は、単独で、又は他の治療剤と併用して投与され得る。これらの薬剤は、同時に処方され（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）得るか、又は同時に若しくは別々に、かつ同じ投与経路か若しくは異なる投与経路のいずれかで別々の製剤として投与され得る。ＦＸＩＩ阻害剤の投与スケジュール又は用量はまた、同じ適応症又は異なる適応症で、他の医学的状態又は治療のような因子に依存して、個々の患者によって変動し得る。

ＩＶ．ＳＢＩの動物モデル
本出願の一局面は、少なくとも１つの標的器官において虚血傷害をもたらし得る塞栓の不均一機構及び供給源を模倣した虚血の動物モデルに関する。一実施態様において、動物モデルは、少なくとも１つの標的器官において虚血傷害を生じ得る動物の動脈系における少なくとも１つの塞栓の放出を含む手技を含み、ここで標的器官は、脳、心臓、腎臓、肝臓及び／又は消化管器官（食道、胃、小腸、及び／又は大腸（結腸及び／又は直腸を含む）を含む）であり、そしてさらにここで、標的器官が脳である場合、虚血傷害は臨床的に無症候性であることを特徴とし、かつ／又は塞栓は非血栓溶解性である。一実施態様において、標的器官は脳である。一実施態様において、動物は臨床的に無症候性である脳における虚血傷害の適応について評価される。特定の実施態様において、動物はまた、標的器官において虚血傷害を減少させる治療剤候補の能力について試験するために治療剤候補を投与される。用語「臨床的に無症候性」は上で定義される。この実施態様において、脳における虚血傷害が「臨床的に無症候性」であるかどうかを評価するためにマウスを臨床的に評価する、すなわち、脳卒中に関連する急性の、明白な行動又は運動障害について動物を評価する。脳卒中の徴候としては、限定されないが、ジスキネジー、嗜眠、握力、肢衰弱、眼瞼下垂、歩行障害、旋回行動、及び回転が挙げられる。塞栓の投与後に脳卒中様の症状を示さない動物は臨床的に無症候性である脳における虚血傷害を有し得る。

動物モデルはまた、脳における虚血傷害の適応についての動物の評価を含む。一実施態様において、評価は画像化を含む。虚血傷害の「徴候」は、脳の画像を評価することにより当業者に明らかになり得る。例えば、組織損傷を生じる虚血傷害は、脳画像における組織の外観の物理的変化により、又は脳のある領域における若しくはある領域の周囲での炎症、凝固、若しくは浮腫の証拠により明らかになり得る。例えば、拡散強調（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ）ＭＲＩ（ＤＷＩ）は、分子の拡散が損傷した組織とその周囲とで異なるので、虚血傷害を可視化するために使用され得る。

動物モデルは、非治療的モデルと考えられる、すなわち、これは、塞栓の臨床的影響を評価するための研究ツールである。このモデルにおいて、塞栓は虚血を引き起こす目的で意図的に動物において放出され、そしてこのような塞栓は、他の工程が取られなければ虚血傷害を生じるだろう。換言すると、動物の健康及び健全性は、手技により改善されず、従って治療的とみなすことはできず、有益な外科手術とみなされることもできない。動物は評価プロセスの間に、又は評価の終わりに屠殺される。それにもかかわらず、一実施態様において、動物モデルは虚血を処置するための治療剤候補を評価するために有用であり得る。これらの実施態様において、治療剤候補は動物モデルにおいて治療結果を有し得るが、治療的とみなされるものは治療剤候補であり、動物モデルではない。

Ａ．動物
動物モデルは、その動物が哺乳動物であり得るということさらに特徴とし、これらとしては、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、又はサルが挙げられる。例えば、動物はマウス又はラットであり得る。動物は雄性でも雌性でもよく、かついずれの年齢でもよい、使用され得るマウス系統の例としては、限定されないが、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７／ＢＬ６、Ｃ５７／ＣＬ１０Ｊ、ＣＢＡ／Ｊ、ＤＢＡ／Ｊ、ＦＶＢ／Ｊ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ａ／Ｊ、ＡＫＲ／Ｊ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ、１２９Ｘ１／ＳｖＪ、ＮＯＤ、ＳＪＬ、ＴＡＬＬＹＪＯ／ＪｎｇＪ、ＭＲＬ、ＮＺＷ、サブ系統（ｓｕｂ−ｓｔｒａｉｎｓ）及びハイブリッド系統（ｈｙｂｒｉｄ ｓｔｒａｉｎｓ）が挙げられる。使用され得るラット系統の例としては、限定されないがＣＤ、ウィスター、フィッシャー、スプラーグドーリー、ＢＢＤＰ、ロングエバンス、ズッカー、無毛ラット、並びにサブ系統及びハイブリッド系統が挙げられる。

一実施態様において、動物モデルの動物は改変されており、例えば遺伝子改変された動物又は手技若しくは物質の投与のような別の方法で変更されている動物である。遺伝子改変された動物は、ノックアウト若しくはノックインされた遺伝子（単数又は複数）、又は条件的にノックアウト若しくはノックインされた遺伝子（単数又は複数）を有し得る。動物は、それが別の疾患のためのモデルとして使用されることを特徴とし得る。例えば、動物は、遺伝的バックグラウンドに起因して、又は疾患若しくは変更された状態（例えば、ＮＯＤマウスおけるような、又はＭＯＧ誘導ＥＡＥにおけるような、自己免疫疾患）を誘導する薬剤若しくは手技を受けたことに起因して別の疾患に感受性であってもよい。このような改変された状態又は疾患の状況におけるＳＢＩを研究するために動物モデルを使用することは興味深いものであり得る。

Ｂ．塞栓
一実施態様において、非血栓溶解性塞栓は、医学的手技の間に導入され得る少なくとも１つの塞栓を模倣するために動物に投与される。本明細書において使用される用語「非血栓溶解性」は、血栓溶解薬で溶解されない塞栓（すなわち、血液から構成されていない塞栓）を指す。これらの実施態様において、手技は血栓でない塞栓を放出する。非血栓溶解性塞栓の例としては、限定されないが、泡、油、脂肪、コレステロール及び／又はデブリが挙げられる（これらの塞栓は血栓溶解薬で溶解可能ではないため）。

一実施態様において、塞栓は、超音波のような画像化技術において使用される造影剤を模倣するマイクロバブルの溶液である。従って脳における毛細血管及び小動脈は、局所的な分布よりもむしろ拡散した分布で閉塞され得る。

一実施態様において、非溶解性塞栓を模倣するためにマイクロビーズを使用し、そしてこれは投与が顕性の脳卒中様の症状を生じないということを特徴とする。用語「マイクロビーズ」はマイクロスフェア及び他のマイクロパーティクル（例えば形状が一様に球状ではないマイクロパーティクル）を含む。一実施態様において、非血栓溶解性塞栓を模倣するためにマイクロビーズを使用する。マイクロビーズのサイズは、例えば２０〜２００μｍ、２５〜１００μｍ、又は３０〜５０μｍからのいずれかのサイズであり得る。投与されるマイクロビーズの量は、５００、１０００、又は２０００個のマイクロビーズで有り得、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、５００〜９００、５００〜１０００、及び５００〜２０００個のマイクロビーズからのいずれかの量を含む。マイクロビーズの数は、動物のサイズ、マイクロビーズの種類及びサイズ、並びに他の実験的要因によって変わり得る。マイクロビーズは天然又は合成の材料から作製され得、これらとしては、限定されないが、ポリスチレン、ポリエチレン若しくは他のポリマー、ラテックス、ガラス、セラミック、金属、量子ドット、又は常磁性材料が挙げられる。一実施態様において、マイクロビーズは蛍光性であり、これは塞栓物質の追跡を可能にし得る。蛍光色素としては、限定されないが、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、若しくはフィコエリトリン、又はそれらの複合体が挙げられる。マイクロビーズは内部で着色されていても、蛍光色素に結合されていてもよい。投与にマイクロビーズを使用することに対する一つの利点は、それらが容易に標準化されることであり、ここでマイクロビーズのサイズ及び量が定量され得、そして投与される量は多数の動物にわたって一定に維持され得る。

別の実施態様において、塞栓は動物に投与され、ここで塞栓は凝固血液を含む。凝固血液は、組織均質化又は超音波処理のような技術を使用して小さな断片にされ得る。凝固血液の供給源は、投与を受ける同じ動物の血液由来であっても、同じ系統若しくは種の動物由来であっても、又は投与を受ける動物とは異なる系統若しくは種の動物由来であってもよい。凝固は、公知の凝固試薬、例えばＣａＣｌ₂、トロンビン、又はヒトトロンビンを
使用して誘導され得る。一実施態様において、凝固血液は、例えば造影剤又は血液プール剤、例えば近赤外血液プール剤を使用することにより蛍光性にされ得る。

別の実施態様において、塞栓はカテーテルを使用して動物の動脈系において放出される。別の実施態様において、塞栓はクランプすることを含む手技及び／又は手術に起因して動物の動脈系において放出される。

Ｃ．手技
一実施態様において、少なくとも１つの塞栓が動物の動脈系中に注射される。塞栓は、大動脈、大動脈弓、頸動脈、冠状動脈、腕頭動脈、椎骨脳底循環、頭蓋内動脈、腎動脈、肝動脈、腸間膜動脈、及び／又は頭部から心臓への動脈系の血管を含むいずれかの動脈中に注射され得る。

一実施態様において、塞栓は頸動脈中に注射される。一実施態様において、動脈はクランプされる。特定の実施態様において、一時的な結紮が動脈の周り、例えば頸動脈の周りで結ばれる。一実施態様において、塞栓は心臓内注射により投与され得るが、このアプローチはいくつかの不利な点を有する。この実施態様において、塞栓は動物全体にわたって分布し、このことが、どれくらい多くの塞栓が脳に留まっているかは不明であるため、標準化をより困難にする。さらに、手技の死亡率は高く、そして注射が成功したか否かは不明であるかもしれない。特定の状況において、心臓内注射は、標的器官、例えば心臓、腎臓、肝臓、及び／又は消化管器官（食道、胃、小腸、及び／又は大腸（結腸及び／又は直腸を含む）を含む）に対する虚血の評価のために有用であり得る。

一実施態様において、管又はカテーテルが塞栓を投与するために使用される。カテーテルは動脈カテーテルであり得る。カテーテルは、ポリエチレン、ポリウレタン、又は他のポリマー若しくは材料から作製され得る。カテーテルは、注入部位及び動物のサイズに適したサイズのものであり得る。カテーテルは、塞栓の注射において補助するように改変され得、例えば、カテーテルは、小さい実験動物における使用に適したより幅が狭く、より薄く、又はより先のとがったカテーテルを手動で達成するために管状部材を伸縮させることにより改変され得る。一実施態様において、注射針が使用され、ここで当業者は動物の動脈系中に塞栓を技術的に注射することができる。

Ｄ．評価
実施態様において、動物モデルは評価工程を含む。評価はインビボ又はエクスビボの技術、例えば画像化及び／又は組織学を含み得る。画像化技術としては、限定されないが、放射線学又は核医学、例えばＣＴ（ＳＰＥＣＴ−ＣＴ及び／又はＦＭＴ−ＣＴを含む）；ＭＲＩ（拡散強調ＭＲＩ（ＤＷＩ）又はｆＭＲＩを含む）；ＰＥＴ；光学的画像（場合により蛍光反射率画像化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）；超音波、顕微鏡法、蛍光透視法、オートラジオグラフィ、及び／又は蛍光体画像化（ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ））が挙げられる。組織学及び／又は染色技術、例えばＴＴＣ染色、免疫組織化学及び／又は組織化学が行われ得る。

一実施態様において、動物モデルは、生理的過程、例えば炎症、血液凝固、又は塞栓の放出に起因して生じ得る補体活性化を評価するために分子画像化技術と共に使用され得る。例えば、目的の生理的過程に関与する分子を、画像化モダリティに適した造影剤、放射性同位体又は色素で標識し得る。様々な画像化モダリティにおいて使用される色素及び造影剤は上で記載されており、そして当業者に周知である。例えば、Ｐｙｓｚ ＭＡ ｅｔ ａｌ．６５ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ ５００−５１６、２０１０を参照のこと。

Ｅ．治療剤候補
別の実施態様において、動物モデルは、ＳＢＩを処置するための治療剤候補の評価に有用であり得る。句「治療剤候補を、脳における虚血傷害を減少させるその能力について試験する」において使用される用語「減少させる能力」は、治療剤候補を試験する目的が、それが虚血傷害を減少させ得るかどうか、すなわち治療剤候補がＳＢＩを限定し得るか又は処置し得るかどうかを評価することである場合に試験されるいずれかの治療剤候補として理解されることを意図される。従って、試験治療剤候補はＳＢＩの動物モデルにおいて投与され得、そして脳における虚血傷害を減少させるその能力が評価される。この評価は、脳における虚血傷害の量又は虚血傷害に関連する状態を、治療剤候補が減少させるか、増加させるか、又は変化を生じないかを明らかにし得る。

一実施態様において、治療剤候補は手技の前、間かつ／又は後に動物に投与される。評価は試験全体をとおして１回又は複数回行われ得る。例えば、インビボ画像化は、手技又は治療剤候補の投与の前、間、かつ／又は後に行われ得る。コントロールは、治療剤候補を投与されていない動物を含み得るか、又は手技若しくは治療剤候補の投与の前後で動物を画像化することを含み得る。

動物モデルの一実施態様において、治療剤候補は、手技の前、間、かつ／又は後、１、２、４、６、１２、２４、４８、７２、又は９６時間若しくはそれ以上以内に投与され得る。治療剤候補は、手技の前、間、かつ／又は後に、単回用量若しくは複数回用量で、又は０．２５、０．５、１、２、４、６、１２、２４若しくは４８時間若しくはそれ以上の間隔で繰り返し投与され得る。一実施態様において、治療剤候補はＦＸＩＩ阻害剤である。出血の危険性を増加させないという利点のために、ＦＸＩＩ阻害剤は手技の間、かつ／又は手技の前かつ／又は後に投与され得る。治療剤候補の用量は、治療剤候補の特性、例えば半減期若しくは毒性に依存し得、又は使用される動物の種類若しくはサイズ、又は使用される動物の状態に依存し得、そして経験的に決定する必要があるかもしれない。例えば、一実施態様において、ＦＸＩＩ阻害剤の用量は１ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇであるか、又は１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、若しくは５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、若しくは１００〜２００ｍｇ／ｋｇからのものである。治療剤候補の用量は、治療剤候補を動物に投与するために使用されるいずれかの方法により動物に投与され得る。一実施態様において、治療剤候補は全身投与される。一実施態様において、治療剤候補は尾静脈静脈内注射により投与される。

一実施態様において、治療剤候補は抗体である。抗体は全長Ｉｇ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖの形態、若しくは他の形態又はそれらの変異体であり得る。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。抗体は、アイソタイプがＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、若しくはＩｇＥであるか、又はそれらの変異体であるかという点で特徴づけられ得る。抗体は哺乳動物種由来であり得、これらとしては、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ハムスター、又はサルが挙げられる。抗体はヒト化又はＣＤＲ移植されていてもよい。抗体は免疫原性、半減期を変更するため、又は治療用抗体に関連する他の有利な特性を付与するために変異又は改変され得る。一実施態様において、抗体はＳＢＩの病態生理学に関与する分子を阻害する。一実施態様において、抗体は抗ＦＸＩＩ抗体である。この実施態様において、抗体は、ＦＸＩＩ（ここで、「ＦＸＩＩ」はＦＸＩＩ及びＦＸＩＩａを含む）の重鎖又は軽鎖上のエピトープ、例えば中和エピトープに結合し得る。抗体は、ＦＸＩＩに対する結合について高親和性及び／又は高アビディティであり得る。抗体は１つより多くの抗原を認識することができる特性を有し得る。抗体はポリペプチド、核酸又は小分子に結合され得る。

別の実施態様において、治療剤はタンパク質、ペプチド、核酸、又は小分子である。用語「小分子」は、低分子量化合物を指す。小分子は、例えば１０００ダルトン未満であり得、細胞膜を越えた拡散を可能にする。小分子は、それが凝固経路の分子、又はＦＸＩＩ、又はＳＢＩの病態生理学に関与する分子に高親和性で結合するということで特徴づけられ得る。好ましい小分子はＧＩ管から再吸収され得るものである。

実施態様は、以下の実施例によりさらに説明され、これらは限定として解釈されるべきではない。他の実施態様は、明細書及び開示される実施態様の実施を考慮することにより当業者に明らかとなるだろう。本出願を通して引用される全ての参考文献、特許及び公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に加入される。．

実施例１： インフェスチン−４及びｒＨＡ−インフェスチン−４の製造
インフェスチン−４相補ＤＮＡ配列を合成し、そしてその５位においてリンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）₃についてのコード配列で伸長し、そしてｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＢａｍＨ１及びＮｏｔＩ部位中に挿入した。アルブミン相補ＤＮＡを、順方向プライマー５−ＧＣＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＣＣ−３ （配列番号８）及び逆方向プライマー５−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＣＴＴＧ−３ （配列番号９）を用いてＰＣＲにより増幅した。増幅産物をＮｈｅＩ及びＢａｍＨ１を用いて消化し、そしてインフェスチン−４ベクターのＮｈｅＩ／ＢａｍＨ１部位中に挿入した。アルブミン−リンカーインフェスチン−４（ｒＨＡ−インフェスチン−４）からなる融合タンパク質を発現することができる得られたベクターをエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で増殖し、そして標準的プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製した。ＨＥＫ−２９３細胞をリポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトし、そして無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓ）で４μｇ／ｍＬプロマイシンの存在下にて増殖させた。トランスフェクトされた細胞集団を発酵槽で増殖させた。産生された融合タンパク質の精製のために上清を採取した。ｒＨＡ−インフェスチン−４を免疫アフィニティクロマトグラフィーにより精製した。発酵上清を平衡化抗アルブミンカラムにアプライした。生成物をグリシン緩衝液（ｐＨ ２．５）で溶出した。ＷＯ２００８／０９８７２０；Ｈａｇｅｄｏｒｎ Ｉ ｅｔ ａｌ．１１７ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１５３−１１６０、２０１０を参照のこと。

（Ｈｉｓ）₆−タグ化インフェスチン−４構築物を生成し、そしてこれはｒＨＡ−インフェスチン−４構築物と比較した場合により短い半減期を有することがわかった。ＷＯ２００８／０９８７２０；Ｈａｇｅｄｏｒｎ Ｉ ｅｔ ａｌ．１１７ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１５３−１１６０、２０１０を参照のこと。（Ｈｉｓ）₆−タグ化インフェスチン−４をＰＯＲＯＳ ＭＣ ２０での銅金属キレートクロマトグラフィーにより精製した。発酵上清を、リン酸−塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した硫酸銅をロードしたカラムにアプライした。続いて（Ｈｉｓ）₆−タグ化インフェスチン−４をイミダゾールグラジエントで溶出した。

実施例２： ＳＢＩの動物モデル
本出願は、ＳＢＩに至る不均一機構を反映する現実的な動物モデルを提供する。動物モデルの一実施態様において、虚血傷害は、例えば血管手技及び手術から生じ得る空気又は脂肪のような非血栓溶解性塞栓を模倣するマイクロビーズにより誘導され得る。動物モデルの別の実施態様において、虚血傷害は、凝固カスケード又は血管壁傷害における障害から生じ得る凝固血液により誘導され得る。

全ての実験を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から入手した成体Ｂａｌｂ／ｃマウス（２５〜３０ｇ；ｎ＝２４）で行った。施設内倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）は全ての動物実験を承認した。動物を、全ての手技の間及び後に生理学的にモニタリングした。マウスをイソフルラン室にて２Ｌ／分の補足酸素を用いた吸入により２％イソフルランで麻酔し、そしてイソフルラン下で仰臥位で温加熱パッドに移した。以下に記載した手技を使用して、マイクロビーズ又はエクスビボで形成した凝固血液を、総頸動脈を一時的に閉塞させながら外頸動脈を通して内頚動脈中へ片側逆行的に（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅｌｙ）注射して、灌流を危険にさらすことなく塞栓を脳の動脈系に強制的に入れた。

Ａ．手技
動物を麻酔した後、頸部の毛を剃り、そして完全な除毛のためにＮａｉｒを塗布した。次いで頸部をイソプロピルアルコールで拭いて滅菌ガーゼで覆った。垂直切開を頸部に対して作成し、そして露出した耳下腺を脇に移動させた。総頸動脈、内頚動脈及び外頚動脈を同定した単離した。１０−０ Ｅｔｈｉｃｏｎナイロン縫合糸（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を動脈結紮のために使用した。２本の１０−０縫合糸を外頚動脈の周りで、１本を内頚動脈の周りで、そして１本を総頸動脈の周りで縛った。次いで外頚動脈の周りの２本の縫合糸を縛り、次いで動脈をその間で切断した。この時点で、外頚動脈の結紮のみを受けたコントロールグループのマウスには、手技のこの部分はいずれの脳傷害も生じないことを確かにするためにさらなる介入は行わなかった。次いで一時的結紮を総頸動脈及び内頚動脈の周りで縛った。改造したＩｎｔｒａｍｅｄｉｃポリエチレンＰＥ１０カテーテル（Ｉ．Ｄ．０．２８ｍｍ、Ｉ．Ｄ．０．６１ｍｍ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）を外頚動脈の近位の開口端部中に挿入し、適所で縫合した。カテーテルは、わずかに狭い管腔及び直径を達成するために手動で管状部材を、穏やかに牽引力を印加して引き伸ばすことにより改造した標準ＰＥ１０カテーテルであった。次いで内頚動脈上の結紮を開放して、内頚動脈のみに対して脳に供給する動脈系中への血流を可能にした。カテーテル中への動脈血のフラッシュバックを観察し、次いで準備したマイクロビーズ又は凝固血液のいずれかを注射した（図４）。

蛍光性マイクロビーズについて、約５００個のマイクロビーズの頸動脈内注射が、再現性のある臨床的に無症候性の微小病巣を生じることを確定した。約５００個のＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ^TM Ｐｌａｉｎ ＹＧ ４５マイクロスフェア（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ、直径４２．５８±０．８μｍ、励起極大＝４４１ｎｍ、発光極大＝４８６ｎｍ）をロードしたシリンジをカテーテルに取り付けて注射した（図４Ａ＋Ｄ）。

蛍光性凝固血液のために、新鮮な異種マウス血液５００μＬをドナーマウスから心穿刺により抜き取り、そして直ぐに初期抗凝固のためにクエン酸ナトリウム溶液（最終濃度、０．３２％）に加えた。２０μｍｏｌ ＣａＣｌ₂を血漿に加え、続いて凝固を誘導するために高活性ヒトトロンビン１０単位（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ^(R)、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ＭＷ ３７，０００、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、特異的活性２８００ ＮＩＨ単位／タンパク質ｍｇ）を加えた。血液を室温で１時間凝固させた後、近赤外血液プール剤のＧｅｎｈａｎｃｅ ６８０ＴＭ（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ） ２ｎｍｏｌを４℃で７２時間のインキュベーションのために加えた。これにより蛍光画像化による後のエクスビボ検出のために凝固血液の蛍光染色を可能にした。この時間は凝固血液の収縮（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）及び安定化を可能にした。使用の準備ができたら、凝固血液を取り出し、そして生理食塩水で洗浄した。生理食塩水２５０μＬを凝固血液に加え、次いで組織ホモジナイザーを使用して凝固血液を小さい粒子にした（図４Ｂ）。次いでこの蛍光性微小塞栓溶液１０μＬをシリンジで抜き取って注射した。

マイクロビーズ又は凝固血液のいずれかを注射した後、カテーテルを除去し、そしてカテーテルを適所に保持していた縫合糸を引き抜いて外頚動脈を閉じた。次いで内頚動脈及び総頸動脈における結紮を再び開いて脳への血流を回復させ、そし耳下腺をもとに戻し、そして７−０ナイロン縫合糸で皮膚を縫合した。動物をそのケージに戻し、回復させた。

麻酔から回復した後、マウスを顕性の行動障害及び運動障害について評価した。各動物を、ジスキネジー、嗜眠、握力、肢衰弱、眼瞼下垂、歩行障害、旋回行動、及び回転について観察した。上記の症状のいずれかが観察されると脳卒中の徴候であるとみなし、上記の症状がないことは、顕性脳卒中が起こらなかったことを示し、ＳＢＩの可能性と一致した。脳卒中の症状がない場合、マウスをＳＢＩのさらなる評価に使用した。それ以外は、マウスをＳＢＩの評価のさらなる評価から除いて屠殺した。

Ｂ．処置グループ
ＳＢＩモデルの最適化後、４つのコホートを調べた（１グループあたりｎ＝５〜７）：凝固血液又はマイクロビーズによりＳＢＩを誘導されたマウス（未処置コントロール）、及びマウスを２００ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈静脈内注射によりｒＨＡ−インフェスチン−４で処置した２つのさらなるグループ。ＳＢＩ誘導直後にそれらの最初の注射を受けたマウス。ＦＸＩＩＩ活性の単一光子放射型コンピュータ断層撮影法−コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ−ＣＴ）画像化をＳＢＩの３時間後に行った。ＳＢＩの３日後にＭＲＩにより画像化されたコホートに、傷害の３日後まで及び３日後を含めて毎日注射した。塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）染色をＳＢＩの３日後に評価した。

Ｃ．ＭＲＩ
炎症をＭＲＩ（ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）−Ｇｄ、３日目）により評価した。ＭＲＩをＢｒｕｋｅｒ ４．７Ｔスキャナーを使用してＲＡＲＥ Ｔ１スキャン（ＴＲ：１５００ｍｓ、ＴＥ：８．４８ｍｓ、積算回数（Ａｖｇ）：８、マトリックス：１９２ｘ１９２ｘ２２、ボクセルサイズ：０．１３３ｍｍ ｘ ０．１３ｍｍ ｘ ０．５ｍｍ）、同じジオメトリを用いるＲＡＲＥ Ｔ２（ＴＲ：５６２２．８９３、ＴＥ：２０ｍｓ、積算回数：４）及び６つの拡散方向を用いたＥＰＩ拡散強調シーケンスを使用する拡散強調画像（ＤＷＩ）（ＴＲ：４８００ｍｓ、ＴＥ：３２ｍｓ、マトリックス：１２８ ｘ １２８ ｘ ２２、ボクセルサイズ：０．１９５ｍｍ ｘ ０．１９５ｍｍ ｘ ０．５ｍｍ）を用いて行った。

マウスを、１０％ ＤＭＳＯで希釈された０．３ｍｍｏｌ／ｋｇのミエロペルオキシダーゼ−ガドリニウム造影剤の静脈内投与の前、及び９０分後まで１５分毎にスキャンした。次いでマウスを屠殺し、灌流し、そして脳を採取し、ＳＢＩが発生したことを実証するためにＯＶ−１００顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）での蛍光画像化のためにスライスした。

データ解析のために、Ａｍｉｒａソフトウェア（Ｖｉｓａｇｅ Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用した。対象領域（ＲＯＩ）を注射９０分後のＴ１スキャンの各画像スライスで同定した。ＭＰＯポジティブ領域の自動分割の前に脳室を個々に除外し、そしてこの分割は放射線科専門医（ｂｏａｒｄ ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ ｒａｄｉｏｌｏｇｉｓｔ）により検証された。ＭＰＯポジティブボクセルを、平均通常脳バックグラウンドシグナルの１．２５倍のシグナル強度により自動的に同定した。シグナル振幅値を、マウスの身体外のＲＯＩからのノイズの標準偏差で割り、ＭＰＯポジティブボクセルのコントラストノイズ比（ＣＮＲ）を計算した。Ｔ２画像を同様のやり方で３Ｄ可視化のために分割した。

Ｄ．ＳＰＥＣＴ−ＣＴ
凝固をＳＰＥＣＴ−ＣＴ（ＦＸＩＩＩ−Ｉｎｄ、３時間）により評価した。マウスグループに、インジウム−１１１で標識したＦＸＩＩＩ−基質ペプチド約１ｍＣｉ（注射した実際の量は７３１〜１２７３μＣｉであった）の注射の１時間前にＳＢＩ誘導及び処置を行った。注射の２時間後、Ｇａｍｍａ Ｍｅｄｉｃａ−Ｉｄｅａｓ Ｘ−ＳＰＥＣＴ小動物画像化システムを使用してＳＰＥＣＴ−ＣＴを行った。ＣＴスキャンを固体ＣＭＯＳ検出器を備えたコーンビーム（５０ｋＶｐ、５００ｍＡ）ｘ線管を使用して２５６投影にわたって行った。これらの投影を、改変フェルトカンプ（ｆｅｌｄｋａｍｐ）再構成アルゴリズムを使用して再構成した。ＳＰＥＣＴスキャンは、１ｍｍ中エネルギー用ピンホールコリメータを備えた二重ガンマカメラ（ｄｕａｌ ｇａｍｍａ ｃａｍｅｒａｓ）を６４投影に対して９０秒／投影で利用した（各カメラから３２投影）。ＳＰＥＣＴ画像をオーダーサブセット期待値最大化法（ｏｒｄｅｒｅｄ ｓｕｂｓｅｔｓ ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ）アルゴリズム（ＯＳＥＭ）を使用して再構成し、そして分子情報の正確な解剖学的共局在化のためにＣＴ画像に融合させた。

ＳＰＥＣＴ−ＣＴ画像化の直後に血液サンプルを採取して動物を屠殺した。動物を２０ｍｌ食塩水で灌流した。筋肉サンプルを採取し；脳を摘出し、血液サンプルと共に、Ｗａｌｌａｃ Ｗｉｚａｒｄ １４８０ガンマウェルカウンターでカウントした。次いで脳を２ｍｍの切片にスライスし、そしてＯｌｙｍｐｕｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＯＶ−１００蛍光スキャナーで画像化した。脳スライスを両側で画像化した。その後、スライスをオートラジオグラフィーのためにホスホイメージャープレート上に終夜置いた。プレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｔｙｐｈｏｏｎホスホイメージャープレートリーダーで読み取った。

ＳＰＥＣＴ−ＣＴデータ解析のために、脳及び筋肉を手動でＡｍｉｒａソフトウェアを使用してＣＴ画像から分割して脳対筋肉の標的対バックグラウンド比（ＴＢＲ）を計算した。データを脳の質量及び各動物の注射用量に対して正規化した。オートラジオグラフィー、ガンマ計数及びＳＰＥＣＴデータを減衰補正した。ＳＰＥＣＴ−ＣＴデータの３Ｄ可視化を、Ｏｓｉｒｉｘソフトウェア（Ｐｉｘｍｅｏ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して再構成した。

Ｅ．エクスビボ評価
ＭＲＩ及びＳＰＥＣＴ−ＣＴ画像化研究を完了した後、動物を屠殺し、そして脳を取り出した。

マウスがＳＰＥＣＴ−ＣＴサブグループの一部である場合、脳を最初にシンチレーション測定により全体の放射線活性について測定した。次いで新鮮な脳を、マウス脳スライサー（Ｚｉｖｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して厚さ２ｍｍの冠状断面に切断した。次いで直ぐに全ての脳をＯＶ−１００^TM小動物画像化システム（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）（平面反射率蛍光（ｐｌａｎａｒ ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）画像化システム及び高倍率顕微鏡のハイブリッド）を用いて画像化した。脳切片をマイクロビーズについて明視野及びＧＦＰ蛍光チャネル（励起４００ｎｍ、発光５０８ｎｍ）及び蛍光性凝固血液について近赤外チャネル（発光６８０ｎｍ）を使用して１６倍までの倍率を用いて画像化した。選択した解像度、波長、及び倍率に依存して、画像収集時間は画像についてフレームあたり５ｍｓと６０秒との間の範囲に及んだ。傷害により生じた潜在的出血を評価するために白色光画像もデジタルカメラで取得した。ＳＰＥＣＴ−ＣＴ研究のマウスについては、次いで脳スライスをホスホイメージャーに終夜置いた。

マウスがＭＲＩサブグループの一部である場合、脳スライスを３７℃のＰＢＳ溶液中１％ＴＴＣに３０分間置いた。次いで脳切片をＰＢＳでそれぞれ１分間３回洗浄した。次いでＴＴＣ染色について評価するために脳をデジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＥ−２８０）で画像化した。生存能組織はＴＴＣで赤色に染色されたが、梗塞領域は染色されなかった。免疫組織化学（ＩＨＣ）に使用したマウスについては、中央の脳スライスがＴＴＣで染色され、隣接したスライスをＩＨＣのために包埋した。

さらなる組織学的分析のために、脳組織の隣接スライスをＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で包埋し、そして連続した５μｍ凍結切片を切り取った。アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ法をＩＨＣに使用し、そして組織切片をＦＸＩＩＩ抗体：Ｃ−２０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）と共にインキュベートし、続いてビオチン化抗ヤギＩｇＧ二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と共にインキュベートした。反応を３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）基質（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）で可視化し、そして全ての切片をＨａｒｒｉｓヘマトキシリン溶液で対比染色した。スライドを倍率４００で自動的にデジタル化し、そして画像をＮａｎｏｚｏｏｍｅｒ ＨＴ１．０（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）で捕捉した。

結果を平均＋ＳＥＭとして表す。２つのグループ間の統計的比較をスチューデントのｔ検定により評価し、そしてＡＮＯＶＡにより多重比較に対して補正した。ｐ＜０．０５の値を統計的有意を示すとみなした。ｐ値が示されている場合、同じ統計的分析を実施例全体にわたって使用した。

両方のモデルが、小血管における脳血管閉塞を生じ（図４Ｄ＋Ｅ）、これは臨床的に無症候性の脳虚血を生じ得る（図５）。

ＴＴＣ染色により評価して、両方のモデルが小さい梗塞を生じ（図５）、これは脳全体の＜５％を占めていた。マイクロビーズ法は、凝固血液モデルと比較してわずかに多く組織損傷を生じた。病巣は主に注射の側で観察された。

実施例３：ｒＨＡ−インフェスチン−４でのＳＢＩの処置
ｒＨＡ−インフェスチン−４で処置した後、両方のＳＢＩモデルのマウスにおいて、ＴＴＣ染色により検出された梗塞が＞５０％減少し、有意に少ない微小梗塞を経験した。凝固血液モデルでは、マイクロビーズモデル（５４％減少、図５Ａ）と比較して、梗塞面積のわずかに多い減少（６６％減少、図５Ｂ）があった。マイクロビーズモデルは、凝固経路に直接影響を及ぼさない物質由来の塞栓を模倣するが；しかしｒＨＡ−インフェスチン−４はこのモデルにおいても梗塞領域を減少させた。

微小出血の比較的頻繁な証拠が、両方のＳＢＩモデルにおいて、マイクロビーズモデルではマウスの６／８（７５％）において、そして血栓塞栓モデルではマウスの５／９（５６％）において見られた（図６）。しかし、ｒＨＡ−インフェスチン−４投与後には、微小出血の増加した頻度は、いずれのモデルでも見られなかった。実際には、おそらく凝固血液モデルにおいて減少した微小出血率であった（１／８の動物のみが微小出血を有していた、図６、右下）。

興味深いことに、脳卒中に関する以前の研究と同様に（Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｔｚ Ｃ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．、２０３：５１３−５１８、２００６；Ｈａｇｅｄｏｒｎ Ｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１２１：１５１０−１５１７、２０１０）、ＳＢＩにおける増加した頻度の出血も見られず、ｒＨＡ−インフェスチン−４処置後に凝固血液モデルにおけるより低い比率の出血があった。このより低い比率を確証しそしてさらに研究する必要があるが、これは、ｒＨＡ−インフェスチン−４が凝固血液により引き起こされる血管傷害を減少し得るということを示唆する。さらに、一般的な抗凝固治療は通常出血の増加した危険性を有するので、これは望ましくない副作用の有利なプロフィールを示すため、臨床的な関連性を有する。これは我々の現在の研究では異なっていた。

実施例４： ｒＨＡ−インフェスチン−４はＳＢＩにおけるＦＸＩＩＩ活性を減少させる
ｒＨＡ−インフェスチン−４の凝固カスケードに対する効果を評価するために、ＦＸＩＩＩの活性を評価した、これはＦＸＩＩの下流であり、かつＦＸＩＩに影響され、そして架橋フィブリン塊の原因である。インビボＳＰＥＣＴ−ＣＴ画像化を、ＦＸＩＩＩ特異的プローブＦＸＩＩＩ−Ｉｎｄ（Ｔｕｎｇ ＣＨ ｅｔ ａｌ．４ Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．８９７−８９９、２００３；Ｎａｈｒｅｎｄｏｒｆ Ｍ ｅｔ ａｌ．１１３ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１９６−１２０２、２００６）を使用してＳＢＩ誘導後の急性期の間に行った。凝固血液モデル（図７）及びマイクロビーズモデル（図８）の両方においてｒＨＡ−インフェスチン−４の投与後にＦＸＩＩＩ活性の量の有意な減少があった。これは、エクスビボ脳検体に対するオートラジオグラフィー実験により裏付けられた（図７及び８、中央のパネル）。ＦＸＩＩＩ活性減少の全体の程度は、３Ｄ融合画像において十分に可視化された（図７及び８、左パネル）。梗塞減少の程度と同様に、マイクロビーズモデルと比較して凝固血液モデルにおいてＦＸＩＩＩ活性のより顕著な減少があった。インビボ画像化の結果は、ＦＸＩＩＩについての免疫組織化学染色により確認された（図９）。

マイクロビーズモデルが、上昇した第ＸＩＩＩ因子／凝固活性を生じ、これが ｒＨＡ−インフェスチン−４投与により減少されるということに注目するのは興味深いことである。このことは、マイクロビーズ塞栓形成がフィブリン塊形成を引き起こし、そして影響を受けた血管のさらなる損傷及び閉塞を引き起こしたかもしれない組織傷害に起因して二次凝固を誘導したということを示唆する。実際には我々は、未処置のコントロールマウスの傷害脳領域において増強されたＦＸＩＩＩ含量があることを組織病理において見出した（図９）。興味深いことに、マイクロビーズモデルは凝固血液モデルと比較してより多くの傷害及び出血領域を生じた。マイクロビーズモデルは事実上永久モデルであり、これは病理的影響を悪化させ、一方で注射された凝固血液は（部分的）血栓溶解を受けてより重症度の低い結果をもたらし得ると仮定し得るだろう。それにもかかわらず、両方のモデルにおいて観察されたこの二次的な塊形成は、ｒＨＡ−インフェスチン−４により有意に低減されて使用された塞栓物質からの損傷を限定し得る。

実施例５： ｒＨＡ−インフェスチン−４はＳＢＩの後、脳におけるミエロペルオキシダーゼ活性を変更しない
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、多くの炎症促進性骨髄性細胞、例えば好中球、Ｌｙ６Ｃ^hi単球、及び活性化マクロファージの小集団並びに小膠細胞により炎症の間に分泌される最も豊富な酵素であり、それ故炎症応答の適切な画像化バイオマーカーである。ＭＰＯ活性を評価するために、インビボＭＲＩを、ＳＢＩの３日後に、ＭＰＯ活性に対して高度に特異的かつ感受性であるプローブＭＰＯ−Ｇｄ（Ｃｈｅｎ ＪＷ ｅｔ ａｌ．２４０ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ ４７３−４８１、２００６；Ｑｕｅｒｏｌ Ｍ ｅｔ ａｌ．４ Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ．１８８７−１８９５、２００６）を使用して行った（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｅ ｅｔ ａｌ．１３２ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１６８−１７７、２０１０；Ｒｏｎａｌｄ ＪＡ ｅｔ ａｌ．１２０ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ５９２−５９９、２００９；Ｃｈｅｎ ＪＷ ｅｔ ａｌ．１３１ Ｂｒａｉｎ １１２３−１１３３、２００８；Ｂｒｅｃｋｗｏｌｄｔ ＭＯ ｅｔ ａｌ．１０５ ＰＮＡＳ １８５８４−１８５８９、２００８；Ｎａｈｒｅｎｄｏｒｆ Ｍ ｅｔ ａｌ．１１７ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１５３−１１６０、２００８）。

両方のモデルにおいて、Ｔ２強調画像化により報告された梗塞領域と比較して、より大きな体積に影響するより拡散したＭＰＯ活性があった（図１０及び１１、左パネル、青い（青色の（Ｔ２高信号フォーカス（ｆｏｃｉ））病巣と比較してより多くの橙色（ＭＰＯ＋領域）があり、そして右上パネルは、単一より高いＴ２正規化ＭＰＯ＋領域を示す）。マイクロビーズモデルは、凝固血液モデルと比較した場合により多くのＭＰＯ活性（ＣＮＲ、ビーズ：３６±１、血塊：２３±２、ｐ＜０．０５）、そしてより大きな病巣（脳におけるＴ２＋ボクセルの数、ビーズ：３１６２±１４３５、血塊：５４８±２０７；ｐ＝０．０５）を誘導した。

ｒＨＡ−インフェスチン−４投与後に、両方のＳＢＩモデルにおいて、ＭＰＯ＋病巣の正規化領域及び全てのＭＰＯ＋病巣の平均ＣＮＲにおいて有意な変化はなく、ｒＨＡ−インフェスチン−４がＭＰＯ活性に影響せず、従って骨髄性細胞活性に影響しないことを実証した。従って、ＦＸＩＩの機能から推測される可能な抗炎症性効果にもかかわらず、ｒＨＡ−インフェスチン−４はＳＢＩ誘導の３日後に病巣あたりのＭＰＯ活性の量を変化させなかった。３日目をＭＰＯ活性及び炎症の評価のために選択した。なぜならば、この時点が脳卒中モデルにおける最大のＭＰＯ活性の時点であることがわかったからである（Ｂｒｅｃｋｗｏｌｄｔ ＭＯ ｅｔ ａｌ．１０５ ＰＮＡＳ １８５８４−１８５８９、２００８）。従って、３日目にＭＰＯ活性において反映されない炎症カスケードの他の部分は、ｒＨＡ−インフェスチン−４により影響を受け得る（Ｂｒｅｃｋｗｏｌｄｔ ＭＯ ｅｔ ａｌ．１０５ ＰＮＡＳ １８５８４−１８５８９、２００８）。脳虚血に関与する炎症性細胞の大部分は骨髄性細胞であり、従って、たとえ他の因子がｒＨＡ−インフェスチン−４により影響されても、その効果は小さいかもしれない。

ＦＸＩＩ阻害剤ｒＨＡ−インフェスチン−４は、患者又は動物において出血の危険性を増加させることなく、ＳＢＩをもたらす様々な種類の塞栓に関連する虚血傷害を処置するために使用され得る。さらに、上記動物モデル及び画像化アプローチは、ＳＢＩの病態生理学の根底にある機構を研究するため、及び治療剤候補を評価及びモニタリングするためのツールとして有用であり得る。

Claims (10)

1. 医学的手技を受ける患者における無症候性脳虚血、又は非血栓溶解性物質により引き起こされる脳卒中の予防及び／又は処置用の医薬組成物であって、
   該組成物は第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）阻害剤を含み、
   該医学的手技は：
   （ａ） 心臓、
   （ｂ） 大動脈、大動脈弓、頸動脈、冠状動脈、腕頭動脈、椎骨脳底循環、頭蓋内動脈、腎動脈、肝動脈、腸間膜動脈、及び／又は頭部から心臓への動脈系の血管から選択される少なくとも１つの血管、
   （ｃ） 患者が既知の中隔欠損を有する場合の静脈血管；
   のうちの少なくとも１つとの接触を含み、
   そして該医学的手技が、少なくとも１つの標的器官における上記虚血を生じ得る身体中の該血管の少なくとも１つにおける少なくとも１つの微小塞栓の放出を含み、そして該医薬組成物は該医学的手技の前、該医学的手技の間、かつ／又は該医学的手技の後に投与され、
   該標的器官が脳であり、
   該ＦＸＩＩ阻害剤は、
   （ｉ） 野生型インフェスチン−４ポリペプチド配列（配列番号１）、又はその変異体［該変異体は、
   （ａ） 野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３、及び野生型インフェスチン−４配列との差異を生じる、該Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１個かつ５個までのアミノ酸変異；
   及び／又は
   （ｂ） 野生型インフェスチン−４配列からの６つの保存的システイン残基、及び野生型インフェスチン−４配列に対する少なくとも７０％の相同性を含む］、
   （ｉｉ） 抗ＦＸＩＩ抗体［該抗体はＦＸＩＩに結合し、かつその活性及び／又は活性化を阻害する］
   を含む、上記医薬組成物。
2. 塞栓が、泡、油、脂肪、コレステロール、凝固血液及び／又はデブリから構成される、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 医学的手技が、少なくとも１つ又はそれ以上の前記血管の内側との接触を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. 医学的手技が、少なくとも１つ又はそれ以上の前記血管をクランプすることを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
5. 医学的手技が、カテーテル、ステント、バルーン、移植片、及び／又は造影剤の投与のうちのいずれか１つ又はそれ以上を含む血管手技である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. 医学的手技が血管手術であり、かつ／又は診断上の血管手技である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
7. 医学的手技が、冠動脈造影、頸動脈ステント留置、経皮的冠動脈形成、頸動脈内膜切除、心臓血管手術、又は狭窄した腎動脈の拡張である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. ＦＸＩＩ阻害剤が半減期増強ポリペプチドに連結されており、ここで半減期増強ペプチドは、任意に、アルブミン、アファミン、アルファ−フェトプロテイン又はビタミンＤ結合タンパク質、ヒトアルブミン、又はその変異体、免疫グロブリン又はその変異体、ＩｇＧのＦｃである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
9. 半減期増強ポリペプチドがリンカーを介してＦＸＩＩ阻害剤に連結されている、請求項８に記載の医薬組成物。
10. リンカーが、
    （ｉ） 切断可能であるか；
    （ｉｉ） 内在性、外因性、又は共通の凝固経路の凝固プロテアーゼにより切断可能であるか；
    （ｉｉｉ） ＦＸｌｌａにより切断可能である、
    請求項９に記載の医薬組成物。