ES2607063T3 - Inhibidores del Factor XII para el tratamiento de isquemia cerebral silente o accidente cerebrovascular - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de Factor XII (FXII) para uso en la prevención y/o el tratamiento de isquemia en un paciente que recibe un procedimiento médico, en donde el procedimiento médico comprende el contacto con al menos uno entre: (a) corazón, (b) al menos un vaso sanguíneo seleccionado entre: la aorta, el arco aórtico, una arteria carótida, una arteria coronaria, arteria braquiocefálica, circulación vertebrobasilar, arterias intracraneales, arteria renal, una arteria hepática, una arteria mesentérica y/o un vaso sanguíneo del sistema arterial craneal hacia el corazón, (c) un vaso sanguíneo venoso si el paciente tiene un defecto septal conocido; y en donde el procedimiento médico comprende la liberación de al menos un microémbolo en al menos uno de di10 chos vasos sanguíneos en el cuerpo lo que podría dar lugar a dicha isquemia en al menos un órgano diana y en donde el inhibidor de FXII se administra antes, durante y/o después del procedimiento médico, en donde el órgano diana es el cerebro y en donde el paciente tiene, ha tenido o tiene riesgo de (i) isquemia cerebral silente o (ii) un accidente cerebrovascular causado por una sustancia no trombolizable y en donde el inhibidor de FXII comprende (i) la secuencia polipeptídica de Infestina-4 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), o una variante de la misma, en donde una variante comprende (a) los aminoácidos N-terminales 2-13 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre y al menos una y hasta cinco mutaciones de aminoácidos al margen de dichos aminoácidos N-terminales que dan lugar a diferencias con la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre; y/o (b) seis residuos de cisteína conservados de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre y una homología de al menos 70% con la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre; (ii) un anticuerpo anti-FXII, en donde el anticuerpo se une a FXII e inhibe su actividad y/o activación.

Description

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(b) evaluar el animal en busca de una indicación de una lesión isquémica en el órgano diana.

Apartado 12. El método de acuerdo con el apartado 9 a 11, en donde el procedimiento comprende

(i)

la liberación del émbolo en un vaso sanguíneo;

(ii)

la liberación del émbolo en una arteria;

(iii) la liberación del émbolo en el corazón, aorta, arco aórtico, arteria carótida, arteria coronaria, arteria braquiocefálica, circulación vertebrobasilar, arterias intracraneales, arteria renal, arteria hepática, arteria mesentérica, y/o un vaso sanguíneo del sistema arterial craneal hacia el corazón; y/o

(iv) la liberación del émbolo en una arteria carótida.

Apartado 13. El método de acuerdo con los apartados 9 o 11, en donde la etapa de evaluación comprende la formación de imágenes por resonancia magnética y/o la formación de imágenes SPECT.

Apartado 14. El método de acuerdo con los apartados 9 a 11, para la evaluación de un candidato terapéutico para el tratamiento de la isquemia, en donde

(i)

el candidato terapéutico se somete a ensayo para estudiar su capacidad para reducir una lesión isquémica en el órgano diana, y en donde el candidato terapéutico se administra al animal antes, durante y/o después del procedimiento; y/o

(ii)

el candidato terapéutico es un inhibidor de la vía de coagulación.

Apartado 15. El método de acuerdo con los apartados 9 a 14, en donde el candidato terapéutico es

(i)

un inhibidor de FXII o

(ii)

un anticuerpo o

(iii) una molécula pequeña.

Objetos y ventajas adicionales de las realizaciones en la solicitud aparecen en parte en la siguiente descripción y en parte serán obvios a partir de la descripción, o se pueden aprender con la práctica. Los objetos y las ventajas de las realizaciones se manifestarán ellos mismos por medio de los elementos y combinaciones particularmente indicados en las reivindicaciones adjuntas.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

El documento de la patente o de la solicitud contiene al menos un dibujo realizado en color. Las copias de esta patente o solicitud de patente con dibujos en color serán proporcionadas por la Oficina bajo previa petición y pago de la tasa necesaria.

Figura 1. Sitios de contacto del inhibidor de R. prolixus con trombina y de SPINK-1 con quimotripsina. # indica los aminoácidos que son sitios de contacto entre el inhibidor de R. prolixus y la trombina; + indica los aminoácidos que son sitios de contacto entre SPINK-1 y quimotripsina.

Figura 2. Similitud de la secuencia de aminoácidos entre Infestina-4 (I4) y SPINK-1 (SP). * indica un aminoácido idéntico; | indica un aminoácido similar; los aminoácidos en negrita son cisteínas conservadas; los aminoácidos 2-13 subrayados de la secuencia de Infestina-4 están conservados.

Figura 3. Secuencias de aminoácidos de Infestina-4, SPINK1 y tres variantes de SPINK1 (K1, K2 y K3). * indica idéntico; aminoácidos similares con respecto a la secuencia de Infestina-4. La secuencia subrayada de I4 se utilizó para reemplazar 15 aminoácidos de SPINK-1 para generar K1. Las variantes K2 y K3 se generaron mediante mutaciones puntuales adicionales (aminoácidos subrayados) en la secuencia de K1.

Figura 4. Modelo. (A) Imagen fluorescente de microperlas FTC+ antes de la inyección. (B) Imagen fluorescente de sangre coagulada formada y marcada ex vivo a partir de sangre fresca de ratón. (C) Boceto que ilustra la administración de los émbolos. El catéter a administrar se inserta en la arteria carótida externa (ECA). ICA: arteria carótida interna, CCA: arteria carótida común. Durante la inyección, la CCA se ligó temporalmente para forzar los émbolos en la ICA. (D, E) Imágenes fluorescentes de la superficie del cerebro después de la inyección de microperlas (D) o sangre coagulada (E).

Figura 5. rHA-Infestina-4 reduce la lesión cuantificada con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC). La evaluación de los daños tisulares mediante tinción con TTC 3 días después de la administración de un émbolo, se muestra en el gráfico de barras. Se muestran cortes con TTC representativos e imágenes fluorescentes por reflectancia de la sección correspondiente del cerebro. Los datos se presentan como medio + error estándar de la media. *p < 0,05.

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Figura 6. La hemorragia secundaria no se incrementa con rHA-Infestina-4 (día 3). Evaluación de hemorragia secundaria 3 días después de la inyección de perlas o sangre coagulada. Un corte de cerebro representativo se muestra para cada ratón. Fotogramas rojos indican ratones en los que se detectó hemorragia (flechas).

Figura 7. rHA-Infestina-4 reduce la actividad de FXIII en el área lesionada después de la administración de sangre coagulada evaluada por SPECT-CT. La actividad transglutaminasa plasmática (FXIIIa) se evaluó 3 horas después de la administración de un émbolo compuesto por sangre coagulada. FRI: formación de imágenes fluorescentes por reflectancia que muestran la ubicación de la sangre coagulada. % de IDGT se refiere a la dosis inyectada por gramo de tejido. TBR: Relación entre la diana y el ruido de fondo. Datos presentados como media + error estándar de la media. *p < 0,05.

Figura 8. rHA-Infestina-4 reduce la actividad de FXIII en el área lesionada después de la administración de microperlas evaluadas por SPECT-CT. La actividad transglutaminasa plasmática (FXIIIa) se evaluó 3 horas después de la aplicación de los émbolos de perlas. FRI: formación de imágenes fluorescentes por reflectancia que muestran la ubicación de las perlas. % de IDGT se refiere a la dosis inyectada por gramo de tejido. TBR: Relación entre la diana y el ruido de fondo. Datos presentados como media + error estándar de la media. *p < 0,05.

Figura 9. Inmunohistoquímica para FXIII. Tinción inmunohistoquímica para FXIII 3 horas después de la administración de perlas o sangre coagulada. La barra indica 50 µm.

Figura 10. No hay cambios en la actividad de MPO medida por IRM después de la administración de sangre coagulada. Evaluación de la actividad de MPO 3 días después de la administración de un émbolo compuesto por sangre coagulada. FRI: formación de imágenes fluorescentes por reflectancia que muestran la ubicación de la sangre coagulada. AU: Unidades arbitrarias. CNR: Relación entre contraste y ruido. Datos presentados como media + error estándar de la media. *p < 0,05.

Figura 11. No hay cambios en la actividad de MPO medida por IRM después de la administración de microperlas. Evaluación de la actividad de MPO 3 días después de la administración de los émbolos de microperlas. FRI: formación de imágenes fluorescentes por reflectancia que muestran la ubicación de las perlas. AU: Unidades arbitrarias. CNR: Relación entre contraste y ruido. Datos presentados como media + error estándar de la media. *p < 0,05.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Las realizaciones de la invención tal y como se describen, se refieren a un método para administrar un inhibidor del Factor XII (FXII) a un paciente que recibe un procedimiento médico, en donde el procedimiento médico comprende el contacto con al menos uno entre: corazón; al menos un vaso sanguíneo seleccionado entre: la aorta, el arco aórtico, la arteria carótida, una arteria coronaria, arteria braquiocefálica, circulación vertebrobasilar, arterias intracraneales, arteria renal, una arteria hepática, una arteria mesentérica y/o un vaso sanguíneo del sistema arterial craneal hacia el corazón; y un vaso sanguíneo venoso si el paciente tiene un defecto septal conocido. El procedimiento médico comprende la liberación de al menos un émbolo en al menos uno de dichos vasos sanguíneos en el cuerpo, lo que podría dar lugar a isquemia en un órgano diana, y la administración del inhibidor de FXII antes, durante y/o después del procedimiento médico. La isquemia puede estar causada por diversos tipos de émbolos, independientemente de si el émbolo se compone de burbujas, aceite, grasa, colesterol, sangre coagulada y/o residuos. El órgano diana es el cerebro, y el paciente tiene SBI, ha tenido SBI o tiene riesgo de padecer SBI. Además, la descripción proporciona modelos animales de SBI que pueden ser útiles para el estudio de SBI y para la evaluación de candidatos terapéuticos.

Una ventaja de las realizaciones de la solicitud es que la SBI se puede reducir en pacientes que tienen una variedad de procedimientos médicos o que presentan o no diferentes estados de enfermedad. El éxito del método no depende de si un paciente tiene o no cualquiera de los siguientes procedimientos o estados de enfermedad. Por lo tanto, el éxito del método no depende de si el paciente tiene o no alguna enfermedad subyacente o, por ejemplo, un riesgo subyacente de trombosis. De hecho, se cree que el método funciona con eficacia en pacientes sin un riesgo subyacente de trombosis, por ejemplo, pero que están recibiendo un procedimiento médico, por ejemplo, para corregir un defecto congénito del corazón. Por lo tanto, la población de pacientes es más amplia y, por lo tanto, distinta de la población de pacientes que tiene riesgo de trombosis. La solicitud pretende reivindicar subgrupos de poblaciones de pacientes incluyendo o excluyendo los que tienen ciertos procedimientos o estados de enfermedad.

I. Definiciones

La abreviatura "FXII", tal y como se usa en esta solicitud, se refiere a uno cualquiera de Factor XII y Factor XII activado (FXIIa) o a ambos. Por ello, la expresión "inhibidor de FXII" incluye inhibidores de uno cualquiera de FXII y FXIIa o de ambos. Además, los anticuerpos anti-FXII incluyen anticuerpos que se unen e inhiben a uno cualquiera de FXII y FXIIa o a ambos.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "isquemia" se refiere al estado en un paciente humano o un animal, en el que un suministro insuficiente de sangre a un tejido o un órgano diana dará lugar si no se trata a una lesión isquémica. Por ejemplo, "isquemia cerebral" o del cerebro se refiere a una reducción de la sangre en el cerebro, de manera que el suministro de oxígeno no satisface la demanda del tejido cerebral. Un "infarto" cerebral se

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refiere a tejido cerebral muerto que puede tener lugar si la isquemia o el cese de flujo sanguíneo dura el tiempo suficiente para causar muerte celular. Los infartos se pueden caracterizar mediante tomografía computarizada (CT, del inglés Computed Tomography) o IRM. Los infartos también pueden referirse a tejido muerto debido a pequeñas lesiones isquémicas o microlesiones que se caracterizan como difusas y demasiado pequeñas para dar lugar a cambios claros en una IRM convencional. Tales pequeños infartos pueden ser visibles con modalidades de formación de imagen más sensibles, tales como la IRM de difusión ponderada.

La expresión "lesión isquémica", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a un espectro de daños que pueden ocurrir en un órgano diana como consecuencia de una isquemia, tal como una isquemia difusa o focal, microdaños, isquemia transitoria, microlesiones, lesiones, microinfartos o infartos. Las lesiones isquémicas se pueden caracterizar adicionalmente porque pueden estar causadas por un émbolo que comprende burbujas, aceite, grasa, colesterol, sangre coagulada y/o residuos.

Dependiendo del tamaño del émbolo, se pueden generar diferentes eventos. Por ejemplo, si el émbolo, tal como una sustancia no trombolizable (que incluye una burbuja de aire), es más grande, podría causar un accidente cerebrovascular. Tal evento podría ser un efecto secundario de una cirugía de corazón o un procedimiento intraarterial. Si el émbolo, como por ejemplo una burbuja de aire, es más pequeño o hay una pluralidad de pequeños émbolos, tal como una pluralidad de burbujas de aire, podría causar una SBI. En una realización, el accidente cerebrovascular, por ejemplo, está causado por un émbolo compuesto por una burbuja de aire.

El término "silente", cuando se refiere a "isquemia cerebral silente" ("SBI"), o un "infarto cerebral silente", o "clínicamente silente", se refiere a un estado de isquemia en el tejido cerebral que carece de síntomas agudos y evidentes que definen el accidente cerebrovascular, como por ejemplo, hemiparesia, hipoestesia y/o afasia. Un accidente cerebrovascular se puede definir como cualquier evento clínico agudo relacionado con un deterioro de la circulación cerebral que se traduce en un déficit neurológico focal que tiene una duración de más de 24 horas. La SBI puede estar asociada con déficits neurológicos más sutiles, incluyendo, pero no limitados a, cambios de comportamiento, empeoramiento de la capacidad cognitiva, déficits del campo visual, trastornos en brazos y piernas, fragilidad, síntomas depresivos, disminución de la función física y agravamiento de la demencia vascular. Por ejemplo, los infartos que se relacionan con un ataque isquémico transitorio previo o síntomas similares al accidente cerebrovascular, se pueden definir como sintomáticos, mientras que los que no tienen síntomas similares correspondientes al accidente cerebrovascular, se pueden definir como "silentes". El término "silente" no quiere decir que no haya síntomas; significa que los síntomas son distintos de los del accidente cerebrovascular típico y generalmente más sutiles, y en ciertos casos solo se manifiestan de otras formas, que se podrían detectar solo con una formación de imágenes sofisticada o pruebas más intensas, tales como pruebas cognitivas. El término "difuso", cuando se refiere a una isquemia embólica difusa en un órgano, se refiere a una característica de la isquemia, que está causada por una dispersión de los émbolos a más de un lugar en el órgano, es decir, la isquemia no es focal.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "reducción" comprende una disminución de la probabilidad de una SBI en un individuo o en un animal, la reducción de la gravedad de cualquier síntoma y/o la reducción de la proporción de pacientes en una población que tiene riesgo de SBI, que en realidad tiene una SBI.

De este modo, "reducción" se refiere a la aminoración, disminución, descenso, limitación, recuperación o mejora de un estado de SBI. La reducción de SBI puede incluir, por ejemplo, una protección frente a la aparición de SBI; reducir el riesgo de SBI, reducir la gravedad de SBI a medida que se desarrolla o una vez que se ha desarrollado; limitar el daño de una SBI, por ejemplo, limitando que una lesión isquémica se convierta en un infarto; reducir la difusión de una SBI, por ejemplo, limitando la cantidad de área cerebral o de vasos sanguíneos que se ven afectados o dañados por una lesión isquémica; o mejorar las afecciones en el cerebro asociadas con una SBI, como inflamación o edema.

En una realización, el paciente tiene o ha tenido una SBI. En ciertas realizaciones, el paciente tiene "riesgo" de padecer SBI. Un paciente que tiene "riesgo" de padecer SBI, incluye un paciente que ha recibido, recibe o recibirá un procedimiento médico que comprende el contacto con uno cualquiera entre: corazón; aorta, arco aórtico, una arteria carótida, una arteria coronaria, arteria braquiocefálica, circulación vertebrobasilar, arterias intracraneales, arteria renal, una arteria hepática, una arteria mesentérica y/o un vaso sanguíneo del sistema arterial craneal hacia el corazón; y un vaso sanguíneo venoso si el paciente tiene un defecto septal conocido. Un paciente que tiene "riesgo" de padecer SBI ha recibido, está recibiendo o recibirá un procedimiento médico que comprende la liberación de al menos un émbolo en un vaso sanguíneo en el cuerpo. Un método de administración de un inhibidor de FXII a un paciente que tiene, ha tenido o tiene "riesgo" de padecer SBI puede tener lugar antes, durante y/o después del procedimiento médico para limitar la aparición de una SBI, o para limitar el desarrollo o aminorar el daño de una SBI. En ciertas realizaciones, el paciente no tiene por qué tener una SBI para que se administre el inhibidor de FXII. Por ejemplo, un paciente puede no tener una SBI antes del procedimiento médico, o puede ser desconocido si el paciente tiene una SBI antes, durante y/o después del procedimiento médico, pero en estos casos, el paciente tiene "riesgo" de padecer una SBI debido al procedimiento médico y, por lo tanto, se puede administrar el inhibidor de FXII. En ciertas realizaciones, el paciente o el animal pueden tener una SBI antes, durante y/o después de la administración del inhibidor de FXII. En ciertas realizaciones, el paciente o el animal pueden no tener una SBI antes, durante y/o después de la administración del inhibidor de FXII.

La expresión "podría tener lugar" se entiende que incluye la situación en la que la isquemia tiene lugar en un órgano

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dimiento médico incluye la liberación de un émbolo y el émbolo puede estar compuesto por burbujas, aceite, grasa, colesterol, sangre coagulada y/o residuos. En realizaciones, el procedimiento médico comprende cualquiera o varios entre un catéter, una prótesis endovascular, un balón, un injerto y/o administrar un agente de contraste, que, entre otros, la inyección de un agente de contraste puede crear inadvertidamente burbujas de aire y/o desplazar residuos.

En una realización, el procedimiento médico es un procedimiento vascular. La expresión "procedimiento vascular" incluye cualquier procedimiento que afecta al corazón o a un vaso sanguíneo, en donde un vaso se define como una estructura que transporta o contiene sangre. Los procedimientos vasculares pueden implicar, por ejemplo, utilizar un catéter o administrar un agente de contraste. En ciertas realizaciones, el procedimiento médico implica el sistema arterial, haciendo referencia a un procedimiento que implica una arteria, ramificaciones arteriales, arteriolas, capilares o vasos implicados en el transporte de sangre desde el corazón. En realizaciones, el procedimiento médico implica uno o varios de los siguientes vasos: la aorta, el arco aórtico, una arteria carótida, una arteria coronaria, arteria braquiocefálica, circulación vertebrobasilar, arterias intracraneales, arteria renal; una arteria hepática, incluyendo, por ejemplo, la arteria hepática común y/o la arteria hepática propia; una arteria mesentérica, incluyendo por ejemplo, la arteria mesentérica superior y/o la arteria mesentérica inferior; y/o un vaso sanguíneo del sistema arterial craneal hacia el corazón; un vaso sanguíneo venoso si el paciente tiene un defecto septal conocido.

El término "diagnóstico" se refiere a un procedimiento que se realiza para identificar o evaluar una afección, una enfermedad o un trastorno. Un procedimiento de diagnóstico puede implicar por ejemplo, usar uno cualquiera o varios entre un catéter, una prótesis endovascular, un balón, un injerto y/o la administración de un agente de contraste.

En una realización, el procedimiento médico es una cirugía vascular. Una cirugía vascular se refiere a una operación que implica una estructura vascular, tal como el corazón o un vaso sanguíneo. Ejemplos de cirugías vasculares incluyen, pero no se limitan a, cirugía cardiovascular, por ejemplo, injerto de una derivación en la arteria coronaria; o injerto en una arteria cardíaca sin derivación cardiopulmonar; reemplazo o reparación de una válvula cardiaca, incluyendo, por ejemplo, la válvula aórtica o mitral, valvulotomía o valvuloplastia aórtica o mitral; trasplante de corazón; operación para mejorar un estado de estenosis o regurgitación; operación que implica un marcapasos, incluyendo un marcapasos temporal o permanente, marcapasos biventricular; operación que implica un cambio de generador, una extracción de derivaciones o un monitor cardiaco implantable, un dispositivo cardioversor/desfibrilador implantado, o un dispositivo mecánico para favorecer la circulación, por ejemplo, una bomba extracorpórea o un dispositivo de asistencia ventricular; endarterectomía carotídea; tromboendarterectomía; aneurisma aórtico y cirugía de disección; procedimiento de acceso a diálisis, tal como fístulas arterio-venosas; cirugía que implica un tumor cardíaco o una lesión cardiaca traumática; y cirugía reconstructiva o cualquier otro tipo de cirugía vascular conocida actualmente o en el futuro.

Una cirugía vascular puede implicar, por ejemplo, una operación correctora de un defecto cardiaco congénito. Las cirugías correctoras de defectos cardíacos congénitos incluyen, pero no se limitan a, una operación para reparar una malformación o un defecto, por ejemplo, la reparación de un defecto del septo atrial o ventricular; reparación de un conducto arterioso permeable; reparación de una derivación; reparación de una coartación aórtica; reparación de un retorno venoso pulmonar anómalo total o parcial; corrección de un intercambio venoso de una transposición completa de las grandes arterias o cirugía intraventricular; reparación de la tetralogía de Fallot; o cualquier otro tipo de cirugía conocida actualmente o en el futuro para un defecto cardiaco congénito.

En una realización, el procedimiento médico comprende el uso de un catéter. Tal como se utiliza en este documento, el término "catéter" se refiere a un tubo que se inserta en un vaso sanguíneo. Ejemplos de procedimientos que implican el uso de un catéter incluyen, pero no se limitan a, la colocación de una prótesis endovascular en un vaso, tal como una arteria coronaria, colocación de una prótesis endovascular en la arteria carótida, colocación de una prótesis endovascular intracraneal, arteria aorta o arteria ilíaca; angioplastia, tal como angioplastia con balón; trombectomía; trombólisis dirigida por catéter; embolización, administración directa o local de quimioterapia o calor; reemplazo o reparación de una válvula cardiaca; valvulotomía o valvuloplastia aórtica o mitral. En una realización, el procedimiento médico implica cualquier uso de un catéter o una prótesis endovascular o un procedimiento que implica la disección o el pinzamiento de un vaso. Un procedimiento vascular puede implicar tomar una muestra de un vaso, tal como una oclusión endovascular con bobina, una oclusión endovascular con aneurisma o toma de muestras de un vaso intracraneal con aplicación de cuerpos extraños (por ejemplo, espirales de platino).

En una realización, un procedimiento médico comprende la formación de imágenes. La formación de imágenes se puede utilizar para visualizar procesos biológicos y celulares in vivo, y se puede utilizar para la detección, el diagnóstico, la evaluación, el seguimiento o el tratamiento de una afección, enfermedad o trastorno. La formación de imágenes puede implicar o no el uso de un catéter. Las técnicas de formación de imágenes pueden tomar imágenes del sistema vascular, tales como angiografía coronaria, incluyendo la angiografía de diagnóstico o la angiografía basada en catéter, incluyendo la observación de la vasculatura coronaria, la vasculatura pulmonar o la vasculatura de cualquier parte del cuerpo, o aortograma.

En una realización, el procedimiento médico comprende la administración de un agente de contraste, un radioisótopo o un colorante. Para una explicación de las modalidades de formación de imágenes y los agentes de contraste usados comúnmente, véase Pysz MA et al. 65 Clinical Radiology 500-516, 2010; ejemplos de agentes de contraste y

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En una realización, un inhibidor de FXII comprende una variante de Infestina-4. En otra realización, los inhibidores de FXII comprenden el dominio 4 de Infestina, y opcionalmente los dominios 1, 2 y/o 3 de Infestina; estas proteínas son conocidas por ser potentes inhibidores de FXII (véase el documento WO 2008/098720; véase también Campos ITN et al. 577 FEBS Lett. 512-516, 2004). La secuencia del polipéptido de tipo silvestre de Infestina-4 se proporciona (SEQ ID NO: 1). Tal como se utiliza en este documento, el término "variante" se refiere a un polipéptido con una mutación de aminoácido, en donde una "mutación" se define como una sustitución, una deleción o una adición, a la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre, en donde tales cambios no alteran la capacidad funcional del polipéptido para inhibir FXII. El término "variante" incluye fragmentos de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre o mutada. Otros ejemplos de tales variantes se proporcionan a continuación.

En una realización, una variante de Infestina-4 comprende los aminoácidos N-terminales 2-13 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre (véase la secuencia subrayada en la Figura 2), y al menos una y hasta cinco mutaciones de aminoácidos al margen de los aminoácidos N-terminales, lo que da lugar a diferencias con la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre, o seis residuos de cisteína conservados (véanse los aminoácidos en negrita en la Figura 2) y una homología de al menos 70% con la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre. Los aminoácidos N-terminales 213 de la secuencia de Infestina-4 pueden ser importantes para la unión al FXII, basándose en el análisis de datos estructurales para un inhibidor relacionado, Rhodnius prolixus (PDB: 1 TSO) que se une a la trombina, y el análisis de la unión de SPINK-1 a la quimotripsina, ya que ambos comparten una característica común de la acumulación de sitios de contacto en la región N-terminal, como se muestra en la Figura 1. Por lo tanto, en una realización, una variante de Infestina-4 comprende la región N-terminal conservada de los aminoácidos 2-13 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre, y al menos una y hasta cinco mutaciones de aminoácidos al margen de estos aminoácidos Nterminales conservados, lo que da lugar a diferencias con la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre. Una mutación puede ser una sustitución, una deleción o una adición. Tal como se utiliza en este documento, la expresión "al margen de dichos aminoácidos N-terminales" se refiere a cualquier aminoácido a lo largo de la cadena polipeptídica de la variante que no sea el tramo de aminoácidos contiguos que comprende la secuencia VRNPCACFRNYV, es decir, los aminoácidos 2-13 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre. En otra realización, una variante de Infestina-4 comprende seis residuos de cisteína conservados y tiene una homología de al menos 70% con la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre. En una realización, los seis residuos de cisteína conservados son los aminoácidos en las posiciones 6, 8, 16, 27, 31 y 48 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre (véase la Figura 2). En una realización, la variante comprende la cisteína final conservada. En otras realizaciones, las posiciones exactas de los residuos de cisteína, y las posiciones relativas entre sí, pueden cambiar desde las posiciones 6, 8, 16, 27, 31 y 48 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre, debido a inserciones o deleciones en la variante de Infestina-4. Sin embargo, en estas realizaciones, una variante de Infestina-4 comprende las seis cisteínas y puede compartir 70%, 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de homología con la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre.

En realizaciones, una variante de Infestina-4 se caracteriza porque inhibe FXII. La actividad funcional de la inhibición de FXII se puede determinar, por ejemplo, a través de una caracterización in vitro y/o in vivo, incluyendo ensayos directos para someter a ensayo la inhibición de la actividad de la enzima FXII, el tiempo de coagulación prolongado, es decir, el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa), o métodos in vivo para evaluar la coagulación. Otros ejemplos de variantes de Infestina-4 son mutantes de SPINK-1, que se describen a continuación.

B. Mutantes de SPINK-1

La descripción también implica inhibidores de FXII para uso terapéutico en seres humanos. Se puede emplear una proteína humana con una similitud muy alta con Infestina-4. Por ejemplo, la proteína humana con la mayor similitud con Infestina-4 es SPINK-1, un inhibidor de la proteasa de serina de tipo Kazal, expresado en el páncreas (también conocido como inhibidor de la tripsina secretora pancreática, PSTI). La familia de inhibidores de la proteasa de serina de tipo Kazal es una de las numerosas familias de inhibidores de proteasa de serina. Se han descrito muchas proteínas de diferentes especies (Laskowski M y Kato I, 49 Ann. Rev. Biochem. 593-626, 1980). Las similitudes en la secuencia de aminoácidos entre Infestina-4 y SPINK-1 se indican en la Figura 2.

Basándose en la secuencia de SPINK-1 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) se pueden generar diferentes variantes con el fin de aumentar la homología de la secuencia de SPINK-1 con Infestina-4. La expresión "una homología incrementada con Infestina-4" se refiere al proceso mediante el cual se realizan mutaciones de aminoácidos en SPINK-1 para hacer que la secuencia de SPINK-1 se parezca más a la secuencia Infestina-4.

En una realización, SPINK-1 está mutada para comprender los aminoácidos N-terminales 2-13 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre; la secuencia del polipéptido se proporciona y se conoce como K1 (SEQ ID NO: 3). Como se ha descrito anteriormente, se cree que la porción N-terminal de la secuencia de Infestina-4 es importante para la función inhibidora de FXII.

Por lo tanto, en una realización, una variante de SPINK-1 mutada también comprende los aminoácidos N-terminales 2-13 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre, y al menos una y hasta cinco mutaciones de aminoácidos al margen de dichos aminoácidos N-terminales, lo que da lugar a diferencias entre la secuencia de SPINK-1 de tipo silvestre e incrementa la homología de la variante con la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre. En otra realización, una variante de SPINK-1 mutada comprende seis residuos de cisteína conservados y tiene una homología de

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madura completa se proporciona (SEQ ID NO: 6), así como albúminas de otras especies y variantes de las mismas. Tal y como se usa en este documento, "albúmina" se refiere a una secuencia polipeptídica o de aminoácidos de albúmina, o a una variante de la albúmina, que tiene una o varias actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas) de albúmina. Tal y como se emplea en la presente memoria, la albúmina es capaz de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica de un inhibidor de FXII. La albúmina se puede obtener a partir de cualquier vertebrado, especialmente cualquier mamífero, por ejemplo, ser humano, mono, vaca, oveja o cerdo. Albúminas de animales no mamíferos incluyen, pero no se limitan a, albúmina de gallina y salmón. La porción de albúmina del polipéptido ligado a albúmina puede ser de un animal diferente de la porción de polipéptido terapéutico. Véase el documento WO 2008/098720 para ejemplos de proteínas de fusión de albúmina.

En una realización, una variante de la albúmina tiene al menos 10, 20, 40 o al menos 70 aminoácidos de longitud o puede incluir 15, 20, 25, 30, 50 o más aminoácidos contiguos procedentes de la secuencia de HA (SEQ ID NO 6) o puede incluir parte o la totalidad de los dominios específicos de la HA. Una variante de la albúmina puede incluir una sustitución, deleción o adición de aminoácidos, ya sea una sustitución conservadora o no conservadora, en donde tales cambios no alteran sustancialmente el sitio activo, o el dominio activo que confiere las actividades terapéuticas de los polipéptidos que mejoran la semivida. Estas variantes pueden compartir 70%, 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de homología.

En una realización, la variante de la albúmina incluye fragmentos y puede consistir o comprender alternativamente al menos un dominio completo de la albúmina o fragmentos de dichos dominios, por ejemplo, los dominios 1 (aminoácidos 1-194 de SEQ ID NO 6), 2 (aminoácidos 195-387 de SEQ ID NO 6), 3 (aminoácidos 388-585 de SEQ ID NO 6), 1 + 2 (1-387 de SEQ ID NO 6), 2 + 3 (195-585 de SEQ ID NO 6) o 1 + 3 (aminoácidos 1-194 de SEQ ID NO 6 + aminoácidos 388-585 de SEQ ID NO 6). Cada dominio está a su vez compuesto por dos subdominios homólogos, a saber, 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 y 512-585, en donde las regiones de enlazadores flexibles entre los subdominios comprenden los residuos Lys106 a Glu119, Glu292 a Val315 y Glu492 a Ala511.

En otra realización, otras proteínas que están estructural o evolutivamente relacionadas con la albúmina se pueden utilizar como HLEPs, incluyendo, pero no limitadas a alfa-fetoproteína (documento WO 2005/024044; Beattie y Dugaiczyk, 20 Gene 415-422, 1982), afamina (Lichenstein et al. 269 J. Biol. Chem. 18149-18154, 1994), y la proteína que se une a vitamina D (Cooke y David, 76 J. Clin. Invest. 2420-2424, 1985). Sus genes representan un grupo de multigenes con similitudes estructurales y funcionales que se cartografían en la misma región cromosómica en los seres humanos, ratones y ratas. La similitud estructural de los miembros de la familia de la albúmina sugiere su utilidad como HLEPs. Por ejemplo, se ha reivindicado que la alfa-fetoproteína prolonga la semivida de un polipéptido terapéutico fijado in vivo (documento WO 2005/024044). Tales proteínas, o variantes de las mismas, que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica, se pueden utilizar, y se pueden obtener a partir de cualquier vertebrado, especialmente cualquier mamífero, por ejemplo, ser humano, mono, vaca, oveja o cerdo, o un no mamífero, incluyendo pero no limitados a, gallina o salmón. Véase el documento WO 2008/098720. Tales variantes pueden tener 10 o más aminoácidos de longitud o pueden incluir aproximadamente 15, 20, 25, 30, 50 o más aminoácidos contiguos de la secuencia de la proteína respectiva o pueden incluir parte o la totalidad de los dominios específicos de las respectivas proteínas. Las proteínas de fusión de los miembros de la familia de la albúmina pueden incluir variantes polimórficas de origen natural.

En otra realización, una inmunoglobulina (Ig), o variantes de la misma, se pueden utilizar como un HELP, en donde una variante incluye fragmentos. En una realización, se emplea el dominio Fc o porciones de la región constante de la inmunoglobulina. La región constante puede ser la de una inmunoglobulina IgM, IgG, IgD, IgA o IgE. La porción de polipéptido terapéutico está conectada a la Ig a través de la región bisagra del anticuerpo o un enlazador peptídico, que puede ser escindible. Varias patentes y solicitudes de patente describen la fusión de proteínas terapéuticas con regiones constantes de inmunoglobulinas para extender la semivida de la proteína terapéutica in vivo (documentos US 2004/0087778, WO 2005/001025, WO 2005/063808, WO 2003/076567, WO 2005/000892, WO 2004/101740, US 6.403.077). Por ejemplo, un Fc fusionado a la citocina IFN-ß conseguía mejorar la actividad biológica de IFN-ß, prolongaba la semivida en circulación y tenía una mayor solubilidad (documento WO 2006/000448). Por lo tanto, otra realización es emplear tales secuencias de inmunoglobulina, por ejemplo, fragmentos Fc de inmunoglobulinas y variantes de los mismos, como HLEPs. Los inhibidores de FXII se pueden fusionar a dominios Fc o al menos a porciones de regiones constantes de inmunoglobulinas como HLEPs y pueden ser producidos como moléculas recombinantes en células hospedadoras procariotas o eucariotas, tales como bacterias, levaduras, plantas, animales (incluyendo los insectos) o líneas celulares humanas o en animales transgénicos (documento WO 2008/098720). Una proteína de fusión SPINK-K2-Fc se muestra a modo de ejemplo en SEQ ID NO: 7.

E. Enlazadores

En una realización, un enlazador peptídico intercalado se puede introducir entre el polipéptido terapéutico y el HLEP. En una realización, se introduce un enlazador escindible, particularmente si el HLEP interfiere con la actividad específica del polipéptido terapéutico, por ejemplo, por impedimento estérico. En ciertas realizaciones, el enlazador es escindido por enzimas tales como proteasas de coagulación de la vía de coagulación intrínseca, extrínseca o común. Las proteasas de coagulación de la vía intrínseca son proteasas en la vía de activación por contacto, incluyendo, por ejemplo, FXIIa, FXIa o FIXa. En una realización, el enlazador es escindido por FXIIa. Las proteasas de la vía extrínseca incluyen proteasas en la vía del factor tisular, por ejemplo, FVIIa. Las proteasas de la vía común in

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comportamiento manifiesto o motores, asociados con un accidente cerebrovascular. Los indicadores de accidente cerebrovascular, incluyen, pero no se limitan a, discinesia, letargo, agarre, debilidad en las extremidades, caída del párpado, trastorno de la marcha, caminar en círculos y revolcarse. Un animal que no presenta síntomas similares al accidente cerebrovascular después de la administración de un émbolo, puede tener una lesión isquémica en el cerebro que es clínicamente silente.

El modelo animal también implica la evaluación del animal para estudiar una indicación de una lesión isquémica en el cerebro. En una realización, la evaluación implica la formación de imágenes. Una "indicación" de lesión isquémica puede ser evidente para un experto en la técnica mediante la evaluación de imágenes del cerebro. Por ejemplo, una lesión isquémica que se traduce en daños en los tejidos puede ser evidente por cambios físicos en la apariencia del tejido en las imágenes cerebrales, o por una evidencia de inflamación, coagulación o edema en un área del cerebro

o alrededor de la misma. Por ejemplo, se puede utilizar IRM de difusión ponderada (DWI) para visualizar una lesión isquémica, ya que la difusión de las moléculas difiere en el tejido lesionado y alrededor del mismo.

El modelo animal se considera que es un modelo no terapéutico, a saber, que es una herramienta de investigación para evaluar el impacto clínico de un émbolo. En este modelo, un émbolo se libera intencionadamente en el animal con la intención de causar isquemia, y un émbolo de este tipo crearía una lesión isquémica si no se tomaran otras medidas. En otras palabras, la salud del animal y el bienestar no se mejora con el procedimiento y por lo tanto no se puede considerar que sea un agente terapéutico, ni se puede considerar que sea un procedimiento quirúrgico beneficioso. El animal es sacrificado durante el proceso de evaluación o al concluir la evaluación. Sin embargo, en una realización, el modelo animal puede ser útil para la evaluación de un candidato terapéutico para el tratamiento de la isquemia. En estas realizaciones, aunque un candidato terapéutico puede tener un resultado terapéutico en el modelo animal, es el candidato terapéutico y no el modelo animal, el que se considera que es terapéutico.

A. Animales

El modelo animal se caracteriza además porque el animal puede ser un mamífero, incluyendo, pero no limitado a, un ratón, rata, conejo, gato, perro, cerdo o mono. Por ejemplo, el animal puede ser un ratón o una rata. El animal puede ser macho o hembra y tener cualquier edad. Ejemplos de cepas murinas que se pueden emplear incluyen, pero no se limitan a, BALB/c, C57/BL6, C57/CL10J, CBA/J, DBA/J, FVB/J, C3H/HeJ, A/J, AKR/J, 129S1/SvlmJ, 129X1/SvJ, NOD, SJL, TALLYJO/JngJ, MRL, NZW, subcepas y cepas híbridas. Ejemplos de cepas de ratas que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, ratas CD, Wistar, Fisher, Sprague Dawley, BBDP, Long-Evans, Zucker, Hairless, y subcepas y cepas híbridas.

En una realización, el animal del modelo animal se modifica, tal como un animal modificado genéticamente o un animal que ha sido alterado de otro modo, como mediante un procedimiento o administración de una sustancia. Un animal modificado genéticamente puede tener uno o varios genes desactivados o activados, o uno o varios genes que están desactivados o activados de forma condicional. El animal se puede caracterizar porque se utiliza como modelo para otra enfermedad. Por ejemplo, un animal puede ser susceptible de otra enfermedad debido al trasfondo genético, o debido a la recepción de un agente o un procedimiento que induce una enfermedad o un estado alterado (por ejemplo, una enfermedad autoinmune, tal como en los ratones NOD, o en EAE inducida por MOG). Puede ser de interés utilizar el modelo animal para estudiar SBI en tales contextos de estados modificados o de enfermedad.

B. Émbolo

En una realización de la invención como se describe, un émbolo no trombolizable se administra a un animal para imitar al menos un émbolo que se puede introducir durante un procedimiento médico. Tal como se utiliza en este documento, la expresión "no trombolizable" se refiere a un émbolo que no se lisa con fármacos trombolíticos (es decir, el émbolo no está compuesto por sangre). En estas realizaciones, el procedimiento libera un émbolo que no es un trombo. Ejemplos de un émbolo no trombolizable incluyen, pero no se limitan a, burbujas, aceite, grasa, colesterol y/o residuos, ya que estos émbolos no se lisan con fármacos trombolíticos.

En una realización, un émbolo es una solución de microburbujas que imita agentes de contraste utilizados en las técnicas de formación de imágenes como la ecografía. Los capilares y las arteriolas en el cerebro se pueden ocluir de este modo de una manera difusa en lugar de con una distribución focal.

En una realización, se utiliza una microperla para imitar un émbolo no lisable y se caracteriza porque la administración no da lugar a síntomas similares a un accidente cerebrovascular manifiesto. El término "microperla" incluye microperlas y otras micropartículas (por ejemplo, una micropartícula que no tiene una forma uniformemente esférica). En una realización, una microperla se utiliza para imitar un émbolo no trombolizable. El tamaño de la microperla puede ser, por ejemplo, cualquier tamaño desde 20-200 μm, 25-100 μm o 30-50 μm. La cantidad de microperlas administradas puede ser 500 o 1000 o 2000 microperlas, incluyendo cualquier cantidad desde 500-600, 500-700, 500-800, 500-900, 500-1000 y 500-2000 microperlas. El número de microperlas puede variar dependiendo del tamaño del animal, del tipo y del tamaño de la microperla, y otros factores experimentales. Una microperla puede estar formada por materiales naturales o sintéticos, incluyendo, pero no limitados a, poliestireno, polietileno u otros polímeros, látex, vidrio, cerámica, metal, puntos cuánticos o material paramagnético. En una realización, la microperla es fluorescente, lo que puede permitir el seguimiento de los materiales embólicos. Los colorantes fluorescentes

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ensayo del candidato terapéutico es evaluar si puede reducir una lesión isquémica, es decir, si el candidato terapéutico puede limitar o tratar una SBI. Por lo tanto, un candidato terapéutico del ensayo se puede administrar a un modelo animal de SBI, y se evalúa su capacidad para reducir una lesión isquémica en el cerebro. La evaluación puede revelar que el candidato terapéutico disminuye, aumenta o no produce ningún cambio en la cantidad de lesión isquémica o los estados asociados con la lesión isquémica en el cerebro.

En una realización, el candidato terapéutico se administra al animal antes, durante y/o después del procedimiento. La evaluación se puede realizar una o varias veces durante todo el ensayo. Por ejemplo, la formación de imágenes in vivo se puede realizar antes, durante y/o después del procedimiento o de la administración del candidato terapéutico. Los controles pueden incluir un animal que no recibe el candidato terapéutico o pueden incluir la formación de imágenes de un animal antes y después del procedimiento o de la administración del candidato terapéutico.

En una realización del modelo animal, el candidato terapéutico se puede administrar 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72 o 96 horas o más antes, durante y/o después del procedimiento. El candidato terapéutico se puede administrar en una sola dosis, o en dosis múltiples, o repetidamente a intervalos de 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 o 48 horas o más antes, durante y/o después del procedimiento. En una realización, el candidato terapéutico es un inhibidor de FXII. Debido a la propiedad ventajosa de no aumentar el riesgo de hemorragia, el inhibidor de FXII se puede administrar durante el procedimiento y/o antes y/o después del procedimiento. La dosis de candidato terapéutico puede depender de las propiedades del candidato terapéutico, tales como la semivida o la toxicidad, o puede depender del tipo o del tamaño del animal utilizado, o del estado del animal que se utiliza, y puede ser necesario que se determine empíricamente. Por ejemplo, en una realización, la dosis de inhibidor de FXII es 1 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg, 500 mg/kg, 1000 mg/kg, o desde 1-1000 mg/kg, o 50-500 mg/kg, o 100-200 mg/kg. La dosis del candidato terapéutico se puede administrar al animal a través de cualquier método utilizado para administrar un candidato terapéutico a un animal. En una realización, el candidato terapéutico se administra sistémicamente. En una realización, el candidato terapéutico se administra mediante inyección intravenosa en la vena de la cola.

En una realización, el candidato terapéutico es un anticuerpo. Un anticuerpo puede estar en forma de una Ig de longitud completa, Fab, F(ab)2, Fv, scFv u otra forma o variante de los mismos. El anticuerpo puede ser monoclonal

o policlonal. El anticuerpo puede estar caracterizado porque el isotipo es IgM, IgD, IgA, IgG o IgE, o variantes de los mismos. El anticuerpo puede ser de una especie de mamífero, incluyendo, pero no limitadas a, ser humano, ratón, rata, conejo, cabra, hámster o mono. El anticuerpo puede estar humanizado o injertado con CDR. El anticuerpo puede estar mutado o modificado para alterar la inmunogenicidad, la semivida o para impartir otras propiedades ventajosas asociadas con un anticuerpo terapéutico. En una realización, el anticuerpo inhibe una molécula implicada en la fisiopatología de la SBI. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo anti-FXII. En esta realización, el anticuerpo se puede unir a un epítopo en la cadena pesada o la cadena ligera de FXII (en donde "FXII" incluye FXII y FXIIa), tal como un epítopo neutralizante. El anticuerpo puede tener afinidad elevada y/o avidez elevada para unirse a FXII. El anticuerpo puede tener la propiedad de ser capaz de reconocer más de un antígeno. El anticuerpo se puede conjugar con un polipéptido, un ácido nucleico o una molécula pequeña.

En otra realización, el agente terapéutico es una proteína, un péptido, un ácido nucleico o una molécula pequeña. La expresión "molécula pequeña" se refiere a un compuesto de bajo peso molecular. Una molécula pequeña puede ser, por ejemplo, menor de 1000 Dalton, lo que permite la difusión a través de las membranas celulares. Una molécula pequeña se puede caracterizar porque se une con alta afinidad a una molécula de la vía de coagulación, o FXII, o una molécula implicada en la fisiopatología de la SBI. Una molécula pequeña preferida es una que se puede reabsorber desde el tracto GI.

Las realizaciones de la invención tal como se describe, se ilustran adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes. Otras realizaciones serán evidentes para los expertos en la técnica gracias a la consideración de la memoria descriptiva y la puesta en práctica de las realizaciones descritas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Producción de Infestina-4 y rHA-Infestina-4

La secuencia de ADN complementaria de Infestina-4 se sintetizó y se extendió con una secuencia codificadora de un enlazador (Gly-Gly-Ser)3 en su posición 5 y se insertó en los sitios BamH1 y NotI de pIRESpuro3 (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). El ADN complementario a albúmina fue amplificado por PCR con el cebador directo 5-GCGGCTAGCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCC-3 (SEQ ID NO: 8) y el cebador inverso 5-GCGGGATCCTCAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-3 (SEQ ID NO: 9). El amplicón se digirió con NheI y BamH1 y se insertó en los sitios NheI/BamH1 del vector de Infestina-4. El vector resultante, capaz de expresar una proteína de fusión que consistía en albúmina-enlazador Infestina-4 (rHA-Infestina-4), se cultivó en Escherichia coli TOP10 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se purificó usando protocolos convencionales (Qiagen, Hilden, Alemania). Las células HEK-293 se transfectaron con el reactivo Lipofectamina 2000 (Invitrogen) y se cultivaron en medio exento de suero (Invitrogen 293 Express) en presencia de 4 µg/ml de puromicina. Las poblaciones de células transfectadas se cultivaron en fermentadores. Se recogió el material sobrenadante para purificar la proteína de fusión producida. rHAInfestina-4 se purificó mediante cromatografía de afinidad inmunológica. El material sobrenadante de la fermentación se aplicó a una columna anti-albúmina equilibrada. El producto se eluyó con un tampón de glicina (pH 2,5). Véase el

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sujetando el catéter en su lugar, se retiró para cerrar la arteria carótida externa. Las ligaduras en la arteria carótida interna y carótida común se volvieron a abrir para restaurar el flujo sanguíneo al cerebro, y se volvió a colocar la glándula parótida y la piel se cosió con una sutura de nailon 7-0. El animal fue devuelto a su jaula y se permitió su recuperación.

Después de la recuperación de la anestesia, los ratones fueron evaluados para estudiar los déficits de comportamiento y motores manifiestos. En cada animal se observó discinesia, letargo, agarre, debilidad en las extremidades, caída del párpado, trastorno de la marcha, caminar en círculos y revolcarse. La observación de cualquiera de los síntomas mencionados anteriormente se consideró que era un indicador de accidente cerebrovascular, mientras que la falta de los síntomas anteriores indicaba que no se había producido un accidente cerebrovascular manifiesto, lo que era compatible con la posibilidad de SBI. Si no había síntomas de accidente cerebrovascular, los ratones se utilizaron para una evaluación adicional de la SBI. De lo contrario, los ratones fueron excluidos de la evaluación adicional de la SBI y se sacrificaron.

B. Grupos de tratamiento

Después de la optimización de los modelos de SBI, se estudiaron 4 cohortes (n = 5-7 por grupo): ratones con inducción de SBI mediante sangre coagulada o microperlas (controles no tratados), y 2 grupos adicionales en los que los ratones fueron tratados con rHA-Infestina-4 a una dosis de 200 mg/kg mediante inyección intravenosa en la vena de la cola. Los ratones recibieron su primera inyección inmediatamente después de la inducción de SBI. La formación de imágenes mediante tomografía computarizada de emisión monofotónica-tomografía computarizada (SPECT-CT) de la actividad del FXIII se realizó 3 horas después de la SBI. Las cohortes a partir de las cuales se obtuvieron imágenes tres días después de SBI por IRM, recibieron inyecciones diarias hasta e incluido el día 3 después de la lesión. La tinción con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) se evaluó 3 días después de la SBI.

C. IRM

La inflamación se evaluó mediante IRM (mieloperoxidasa (MPO)-Gd, día 3). La IRM se realizó utilizando un escáner Bruker 4.7T con una exploración RARE T1 (TR:1500 ms, TE:8,48 ms, Promedio: 8, Matriz: 192 x 192 x 22, Tamaño de vóxel: 0,133 mm x 0,13 mm x 0,5 mm), una RARE T2 con la misma geometría (TR:5622,893, TE: 20 ms, Promedio: 4) y una imagen de difusión ponderada (DWI), utilizando una secuencia de difusión ponderada EPI con 6 direcciones de difusión (TR:4800 ms, TE: 32 ms, Matriz: 128 x 128 x 22, Tamaño de vóxel: 0,195 mm x 0,195 mm x 0,5 mm).

Los ratones fueron escaneados antes y cada 15 min, hasta 90 min después de la administración intravenosa de 0,3 mmol/kg de agente de contraste gadolinio-mieloperoxidasa, diluido en 10% de DMSO. Los ratones se sacrificaron después, se perfundieron y los cerebros se recogieron y se realizaron cortes para la formación de imágenes fluorescentes en el microscopio OV-100 (Olympus) para verificar que se había producido SBI.

Para el análisis de datos, se empleó el programa informático Amira (Visage Imaging, San Diego, CA). Las regiones de interés (ROIs) se identificaron en cada corte de imagen de las exploraciones T1, 90 minutos después de la inyección. Los ventrículos cerebrales fueron excluidos individualmente antes de la segmentación automática de áreas positivas para MPO y esta segmentación fue verificada por un radiólogo acreditado. Los vóxeles positivos para MPO fueron identificados automáticamente por la intensidad de la señal de 1,25 veces la señal de fondo normal promedio del cerebro. Los valores de amplitud de la señal se dividieron por la desviación estándar del ruido de una ROI fuera del cuerpo del ratón, para calcular la relación entre contraste y ruido (CNR) de los vóxeles positivos para MPO. Las imágenes T2 fueron segmentadas de una manera similar para la visualización 3D.

D. SPECT-CT

La coagulación se evaluó mediante SPECT-CT (FXIII-Ind, 3 horas). Los grupos de ratones se sometieron a inducción de SBI y tratamiento una hora antes de la inyección, de aproximadamente 1 mCi de un péptido FXIII-sustrato marcado con indio-111 (la cantidad real inyectada era de 731-1273 µCi). Dos horas después de la inyección, se realizó la SPECT-CT utilizando el sistema de formación de imágenes para animales pequeños Gamma Medica-Ideas X-SPECT. La exploración de CT se realizó empleando un tubo de rayos x con haz cónico (50 kVp, 500 mA) con un detector CMOS en estado sólido durante 256 proyecciones. Estas proyecciones se reconstruyeron utilizando el algoritmo de reconstrucción Feldkamp modificado. La exploración SPECT utilizaba dos cámaras gamma con colimadores de agujero estenopeico de energía media de 1 mm, a través de 64 proyecciones (32 proyecciones de cada cámara) a 90 s/proyección. Las imágenes de SPECT se reconstruyeron utilizando el algoritmo de maximización de la esperanza de subconjuntos ordenados (OSEM) y se fusionaron con las imágenes de la CT para una colocalización anatómica precisa de la información molecular.

Los animales fueron sacrificados inmediatamente después de la formación de imágenes SPECT-CT, tomando una muestra de sangre. El animal fue perfundido con 20 ml de solución salina. Se tomó una muestra de músculo; el cerebro se extirpó y, junto con la muestra de sangre, se realizó un recuento en un contador de pocillos gamma Wallac Wizard 1480. A continuación, el cerebro se cortó en secciones de 2 mm y se tomaron imágenes sobre el escáner fluorescente Olympus Biosystems OV-100. Se obtuvieron imágenes de los cortes del cerebro en ambos lados. Después los cortes se colocaron en placas de un dispositivo Phosphorimager durante una noche, para la autorradio

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grafía. Las placas se leyeron en un lector de placas de un dispositivo Phosphorimager Typhoon de Molecular Dynamics.

Para el análisis de los datos de SPECT-CT, el cerebro y el músculo fueron segmentados manualmente a partir de las imágenes de CT, utilizando el programa informático Amira para calcular la relación entre diana y ruido de fondo (TBR) entre el cerebro y el músculo. Los datos se normalizaron para la masa del cerebro y la dosis inyectada de cada animal. En la autorradiografía, en el recuento gamma y en los datos de SPECT se corrigió la atenuación. Visualizaciones en 3D de los datos de SPECT-CT fueron reconstruidas utilizando el programa informático Osirix (Pixmeo, Ginebra, Suiza).

E. Evaluación ex vivo

Después de los estudios de formación de imágenes IRM y SPECT-CT, los animales fueron sacrificados y los cerebros se extirparon.

Si el ratón formaba parte del subgrupo SPECT-CT, el cerebro se midió primero en busca de actividad radiactiva general mediante recuento de centelleo. El cerebro fresco se cortó entonces en secciones coronales de 2 mm de espesor utilizando un aparato para cortar secciones de cerebro de ratón (Zivic Instruments, Pittsburgh, PA). A continuación, se formaron imágenes inmediatamente con todos los cerebros con un sistema de formación de imágenes OV-100™ para animales pequeños (Olympus, Center Valley, PA), un híbrido de un sistema de formación de imágenes con fluorescencia por reflectancia planar y un microscopio de alta potencia. Se formaron imágenes de las secciones de cerebro utilizando un canal de fluorescencia de campo brillante y GFP (excitación a 400 nm, emisión a 508 nm) para las microperlas y el canal cercano al infrarrojo para la sangre coagulada fluorescente (emisión a 680 nm), con un máximo de 16 aumentos. Dependiendo de la resolución seleccionada, la longitud de onda y los aumentos, los tiempos de adquisición de imágenes oscilaron entre 5 ms y 60 segundos por fotograma para las imágenes. Las imágenes de luz blanca también se adquirieron con una cámara digital para evaluar una hemorragia potencial causada por la lesión. Para los ratones en el estudio SPECT-CT, los cortes de cerebro se colocaron después una noche en un generador de imágenes con fósforo.

Si el ratón formaba parte del subgrupo IRM, los cortes de cerebro se colocaron en TTC al 1% en solución de PBS durante 30 minutos a 37°C. A continuación, las secciones del cerebro se lavaron tres veces con PBS un minuto cada vez. Después se fotografió el cerebro con una cámara digital (Olympus FE-280) para evaluar la tinción con TTC. El tejido cerebral viable se teñía de rojo con TTC, mientras que las regiones infartadas no se teñían. Para los ratones utilizados para la inmunohistoquímica (IHC), un corte central del cerebro se tiñó con TTC, mientras que los cortes adyacentes se fijaron para IHC.

Para un análisis histológico adicional, los cortes adyacentes de tejido cerebral se fijaron en compuesto O.C.T. (Sakura Finetek, Torrance, CA), y se cortaron secciones congeladas en serie de 5 μm. El método de avidina-biotina peroxidasa se utilizó para IHC y las secciones de tejido se incubaron con anticuerpo de FXIII: C-20 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) seguido de anticuerpo secundario biotinilado anti-IgG de cabra (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). La reacción se visualizó con un sustrato de 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) (DakoCytomation, Carpinteria, CA) y todas las secciones se contratiñeron con una solución de hematoxilina de Harris. Los cortes se digitalizaron de forma automática con un aumento de 400 y las imágenes fueron capturadas utilizando NanoZoomer HT1.0 (Hamamatsu, Japón).

Los resultados se expresan como media + SEM. Las comparaciones estadísticas entre los dos grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student y se corrigieron con ANOVA para comparaciones múltiples. Un valor de p <0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Los mismos análisis estadísticos se utilizaron en todos los ejemplos, cuando se observaron los valores de p.

Ambos modelos producían oclusiones vasculares cerebrales en vasos pequeños (Figura 4D + E) que pueden dar lugar a isquemia cerebral clínicamente silente (Figura 5).

Ambos modelos producían pequeños infartos (Figura 5) que ocupaban <5% del cerebro total, tal como se evaluó mediante tinción con TTC. El método de microperlas producía una lesión tisular ligeramente mayor en comparación con el modelo de sangre coagulada. Se observaron lesiones principalmente en el lado de la inyección.

Ejemplo 3: Tratamiento de SBI con rHA-Infestina-4

Después del tratamiento con rHA-Infestina-4, los ratones en ambos modelos de SBI experimentaron significativamente menos microinfartos, con una reducción >50% en los infartos detectados mediante tinción con TTC. Había una reducción ligeramente mayor en el área del infarto en el modelo de sangre coagulada (reducción del 66%, Figura 5B) en comparación con la del modelo de microperlas (reducción del 54%, Figura 5A). El modelo de microperlas imita émbolos de sustancias que no afectan directamente a la vía de coagulación; sin embargo rHA-Infestina-4 también reducía las áreas infartadas en este modelo.

Se encontró una evidencia relativamente frecuente de microhemorragias en ambos modelos de SBI, con 6/8 (75%) de los ratones en el modelo de microperlas y 5/9 (56%) de los ratones en el modelo de tromboémbolos (Figura 6).

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Sin embargo, después de la administración de rHA-Infestina-4 no se encontró un aumento de la frecuencia de microhemorragias en ningún modelo. De hecho, posiblemente había una disminución de la tasa de microhemorragias en el modelo de sangre coagulada (solo 1/8 animales tenían microhemorragias, Figura 6, abajo a la derecha).

Curiosamente, de forma similar a los estudios anteriores de accidente cerebrovascular (Kleinschnitz C et al., J Exp Med., 203:513-518, 2006; Hagedorn I et al. Circulation, 121:1510-1517, 2010), tampoco se encontró un aumento de la frecuencia de hemorragia en SBI, con una menor tasa de hemorragia en el modelo de sangre coagulada, después del tratamiento con rHA-Infestina-4. A pesar de que hay que corroborar y estudiar más a fondo esta tasa más baja, esto implica que rHA-Infestina-4 puede reducir la lesión vascular causada por sangre coagulada. Además, tiene relevancia clínica porque apunta a un perfil favorable de efectos secundarios no deseados, ya que la terapia anticoagulante general conlleva generalmente un aumento del riesgo de hemorragia. Este no era el caso en nuestro estudio actual.

Ejemplo 4: rHA-Infestina-4 disminuye la actividad del FXIII en SBI

Para evaluar el efecto de la rHA-Infestina-4 sobre la cascada de la coagulación, se evaluó la actividad de FXIII, que se encuentra aguas abajo de FXII y está afectada por FXII, y es responsable de la formación de coágulos de fibrina reticulados. La formación de imágenes in vivo con SPECT-CT se realizó empleando una sonda específica de FXIII, FXIII-Ind (Tung CH et al. 4 Chembiochem. 897-899, 2003; Nahrendorf M et al. 113 Circulation 1196-1202, 2006) durante el estadio agudo, después de la inducción de SBI. Había una reducción significativa de la cantidad de actividad de FXIII después de la administración de rHA-Infestina-4, tanto en el modelo de sangre coagulada (Figura 7) como en el de microperlas (Figura 8). Esto fue corroborado por experimentos de autorradiografía en especímenes cerebrales ex vivo (Figuras 7 y 8, paneles centrales). El grado global de reducción de la actividad de FXIII se visualizaba bien en las imágenes fusionadas en 3D (Figuras 7 y 8, paneles de la izquierda). Al igual que con el grado de reducción del infarto, había una reducción más pronunciada de la actividad de FXIII en el modelo de sangre coagulada, en comparación con el modelo de microperlas. Los resultados in vivo de la formación de imágenes se confirmaron mediante tinción inmunohistoquímica para FXIII (Figura 9).

Es interesante observar que el modelo de microperlas producía una actividad elevada del Factor XIII/coagulación, la cual disminuía con la administración de rHA-Infestina-4. Esto sugiere que la embolización con microperlas causaba una formación de coágulos de fibrina, y una coagulación secundaria inducida, debido a una lesión del tejido que podía haber causado un daño adicional y oclusión de los vasos afectados. De hecho, encontramos en la histopatología que había un mayor contenido de FXIII en las áreas del cerebro dañadas de ratones control sin tratar (Figura 9). Curiosamente, el modelo de microperlas daba lugar a más lesiones y áreas hemorrágicas, en comparación con el modelo de sangre coagulada. Se podría especular que el modelo de microperlas es más o menos un modelo permanente, lo que agrava los efectos patológicos, mientras que la sangre coagulada inyectada puede estar sujeta a una trombólisis (parcial) que conduce a resultados menos graves. Sin embargo, esta formación de coágulos secundarios observada en ambos modelos se puede reducir de manera significativa con rHA-Infestina-4, para limitar el daño procedente de las sustancias embolizadas empleadas.

Ejemplo 5: rHA-Infestina-4 no altera la actividad de lamieloperoxidasa en el cerebro después de SBI

La mieloperoxidasa (MPO) es la enzima secretada de forma más abundante en muchas células mieloides proinflamatorias, tales como neutrófilos, monocitos Ly6chi y subconjuntos de macrófagos activados y microglía durante la inflamación y, por lo tanto, es un biomarcador adecuado de la respuesta inflamatoria en la formación de imágenes. Para evaluar la actividad de la MPO, IRM in vivo se realizó tres días después de SBI, utilizando la sonda MPO-Gd (Chen JW et al. 240 Radiology 473-481, 2006; Querol M et al. 4 Org Biomol Chem. 1887-1895, 2006), que es altamente específica y sensible para la actividad de MPO (Rodriguez E et al. 132 J. Am. Chem. Soc. 168-177, 2010; Ronald JA et al. 120 Circulation 592-599, 2009; Chen JW et al. 131 Brain 1123-1133, 2008; Breckwoldt MO et al. 105 PNAS 18584-18589, 2008; Nahrendorf M et al. 117 Circulation 1153-1160, 2008).

Había más actividad de MPO difusa que afectaba a un volumen mayor, en comparación con las áreas infartadas según lo informado por la formación de imágenes ponderadas T2 en ambos modelos (Figuras 10 y 11, panel izquierdo, obsérvese que hay más lesiones naranjas (MPO+ áreas) en comparación con las azules (focos hiperintensos T2), y el panel de arriba a la derecha, que muestra MPO+ áreas normalizadas para T2 que son mayores que la unidad). El modelo de microperlas inducía una mayor actividad de MPO, en comparación con el modelo de sangre coagulada (CNR, perlas: 36 ± 1, coágulos: 23 ± 2, p <0,05) y lesiones de mayor tamaño (número de T2 + vóxeles en el cerebro, perlas: 3162 ± 1435, coágulos: 548 ± 207; p = 0,05).

Después de la administración de rHA-Infestina-4, no había un cambio significativo en las áreas normalizadas de MPO+ lesiones y la CNR promedio de todas las MPO+ lesiones en ambos modelos de SBI, lo que demuestra que la rHA-Infestina-4 no afecta a la actividad de MPO y, por lo tanto, a la actividad de células mieloides. Por ello, a pesar de un posible efecto antiinflamatorio deducido de la función de FXII, la rHA-Infestina-4 no cambiaba la cantidad de actividad de MPO por lesión el día 3 después de la inducción de SBI. El día 3 fue elegido para evaluar la actividad de MPO y la inflamación, porque se encontró que este punto de tiempo era el punto de tiempo con la máxima actividad de MPO en un modelo de accidente cerebrovascular (Breckwoldt MO et al. 105 PNAS 18584-18589, 2008). Por lo tanto, otras partes de la cascada inflamatoria pueden verse afectadas por rHA-Infestina-4 lo que no se refleja en la

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