CN103582492A

CN103582492A - 用于治疗无症状性脑缺血和其它器官的缺血的fxii抑制剂

Info

Publication number: CN103582492A
Application number: CN201280012251.0A
Authority: CN
Inventors: M·纳赫伦多夫; R·魏斯勒德尔; G·迪肯内特; G·施托尔; M·诺尔特
Original assignee: CSL Behring GmbH Deutschland; General Hospital Corp
Current assignee: CSL Behring GmbH Deutschland; General Hospital Corp
Priority date: 2011-03-09
Filing date: 2012-03-09
Publication date: 2014-02-12
Also published as: KR101954053B1; PL2683396T3; DK2683396T3; KR20140026399A; EP2683396B1; EP2497489A1; AU2012224510A1; EP2683396A1; JP2014514270A; HK1193569A1; US20140072572A1; JP6113668B2; ES2607063T3; CA2829128A1; WO2012120124A1; CA2829128C; US9624307B2; AU2012224510B2

Abstract

无症状性脑缺血(SBI)或其它器官的缺血可以由在医疗操作中被引入动脉系统的栓塞造成。本申请提供了在接受医疗操作的患者中施用FXII抑制剂的方法，和可用于研究缺血包括SBI和其它器官的缺血以及用于评价候选治疗剂的动物模型。

Description

用于治疗无症状性脑缺血和其它器官的缺血的FXII抑制剂

领域

本申请涉及无症状性脑缺血和其它器官的缺血，在接受医疗操作的患者中施用因子XII抑制剂的方法，和可用于研究无症状性脑缺血和其它器官中的缺血以及用于评估潜在疗法的动物模型。

背景

无症状性脑缺血(SBI)是脑力小的缺血性损伤的病况，其为医疗操作、特别地血管操作和外科手术的副作用。缺血还可在其它器官中发生。在医疗操作期间偶然地释放入动脉循环的任何外来或内源性材料均可导致SBI或其它器官的缺血，例如弥散性栓塞性缺血。SBI是一种异质性综合征，其中栓塞物的确切来源可能变化。例如，引起SBI或其它器官的缺血的栓塞物或微栓塞物可由不同的物质（包括气泡、油、脂肪、胆固醇、凝固的血液和/或碎片）组成。通常地，缺血性损伤是弥散性的。在SBI中，脑的区域散布微栓塞物，单个病灶难以利用常规磁共振成像(MRI)来检测。例如，在造影剂注射过程中和血管探测过程中发现有微栓塞物信号(Bendszus M和Stoll G,5Lancet Neurol.364-372,2006)。SBI内组织损伤的确切机制尚不清楚(Bendszus M和Stoll G,5LancetNeurol.364-372,2006)。

由于损伤的弥散性质，SBI患者通常不存在如在中风中存在的局灶性明确确定的神经功能缺损。然而，行为改变、神经心理缺损和加重的血管性痴呆经常在许多大手术(例如冠状动脉旁路术、膜置换术、颈动脉内膜切除术或支架安装)后的患者中和许多重症监护室中的具有血管介入、冠状血管造影术、动脉导管线或主动脉内反搏术(intra-aorticcounterpulsation)装置的患者中看到。这些症状在医疗操作后极其普遍，但极少看作与所述操作直接相关。随着日益灵敏的成像模式例如弥散加权磁共振成像(diffusion-weighted MRI，DWI)的出现，对无明显的临床症状例如瘫痪或敏感性缺乏但确实存在脑损伤的了解日益增加。

已进行手术和操作(尤其是牵涉心血管结构的那些手术和操作)的患者中高达45%产生SBI。在美国每年进行200多万次的冠状血管造影术具有11-15%的SBI风险(Bendszus M和Stoll G,5Lancet Neurol.364-372,2006)。高达26%的经历诊断性血管造影的患者，高达54%的经历颈动脉支架术的患者以及高达45%的心脏手术后的患者可患上SBI(Bendszus M和Stoll G,5Lancet Neurol.364-372,2006)。

除了认知功能衰退的风险增加、中风风险增加和日益恶化的痴呆外，SBI的临床表现还包括行为和神经心理学改变(Vermeer SE等人34Stroke1126-1129,2003；Kobayashi S等人28Stroke1932-1939,1997)。已显示SBI的存在使60-90岁的患者患痴呆的风险超过2倍，并且在神经心理学测试中导致更急剧的整体认知功能下降和恶化的行为(Vermeer SE等人34Stroke1126-1129,2003；Lopez OL等人60Arch.Neurol.1394-1399,2003)。

SBI与临床中风不同。临床中风会导致明确确定的神经功能缺损，并且通常涉及为脑供应含氧血的动脉中易损斑块的自发性破裂或归因于由心房颤动引起的心脏的血栓栓塞症。与中风相反，处于SBI风险中的患者可能不具有潜在的动脉粥样硬化疾病或者中风或血栓形成的风险因子。经历血管手术的患者可包括例如具有先天性心脏缺损的患者。因在医疗操作中引入的微栓塞物的副作用，此类在其它方面健康的患者仍然处于发生SBI的风险中(Harrison’s Principles of Internal Medicine第16版(Kasper DL,Fauci,AS,Longo,DL,Braunwald E,Hauser SL,Jameson JL eds.,2005))。因此，可从SBI的预防性疗法或治疗受益的患者群包括经历包括与血管系统的结构接触的医疗操作的患者。

虽然已显示肝素能减少由动脉内脑血管造影术引起的临床无症状性栓塞性事件(Bendszus等人,Circulation110:2110-2115,2004)，其具有相对高的颅外和颅内出血并发症的风险。此外，不清楚由不同类型的栓塞物引起的不同SBI事件是否牵涉相似的分子机制和/或可使用类似的治疗剂来治疗。期望的疗法将能减少由所有类型的栓塞物引起的缺血性损伤，包括由气泡、油、脂肪、胆固醇、凝固的血液和/或碎片组成的微栓塞物，但不影响止血(例如肝素所表现的)。因此，需要无论什么原因引起的SBI和其它器官中的缺血（例如弥散性栓塞性缺血）的安全有效的治疗。研究SBI和评价治疗的动物模型的开发一直面临挑战，因为需要产生弥散性微损伤而不引起明显的中风。因此，仍然需要SBI的现实动物模型来研究组织损伤的分子机制和评价治疗剂候选者。

因子XII(FXII)是参与内源性凝血级联活化的丝氨酸蛋白酶。最近，已发现小鼠中因子XII的缺乏或抑制会减少中风模型的脑损伤，并且防止动脉血栓形成，但不增加出血的风险(WO2006/066878；WO2008/098720；Kleinschnitz C等人203J.Exp.Med.513-518,2006；Renne T等人202J.Exp.Med.271-281,2005)。与FXII缺陷型小鼠类似，缺乏FXII的人，即使在大型手术期间，也不遭受异常出血的痛苦(Ratnoff OD和Colopy JE,34J.Clin.Invest.602-613,1955；ColmanRW,Hemostasis and Thrombosis.Basic Principles&ClinicalPractice103-122(Colman RW,Hirsch J,Mader VJ,Clowes AW,GeorgeJ eds.,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,2001)；Schmaier AH,118J.Clin.Invest.3006-3009,2008)。

最近，Infestin-4被报导为活化的FXII(FXIIa)的新型抑制剂。Infestin是一类来源于吸血昆虫骚扰锥蝽(Triatoma infestans)(已知引起Chagas病的寄生虫克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)的主要载体)的中肠的丝氨酸蛋白酶抑制剂(Campos ITN等人32Insect Biochem.Mol.Bio.991-997,2002；Campos ITN等人577FEBS Lett.512-516,2004)。该昆虫使用此类抑制剂来阻止摄入的血液的凝固。Infestin基因编码4个结构域，形成可抑制凝血途径中的不同因子的蛋白质。具体地，结构域4编码作为FXIIa的强抑制剂的蛋白质(Infestin-4)。Infestin-4已被施用于小鼠而无出血并发症发生(WO2008/098720)。

尽管异质性机制导致SBI和其它器官的缺血，包括弥散性栓塞性缺血，但本申请的实施方案提供了FXII抑制剂，特别地包含Infestin-4的蛋白质及其变体，来治疗SBI和其它器官的缺血。此外，本申请提供了模拟可在医疗操作期间进入循环的各种类型栓塞物的SBI的动物模型。本文中描述的动物模型可用作研究SBI和评价治疗剂候选者的工具。

发明概述

本申请提供了在接受医疗操作的患者中施用因子XII(FXII)抑制剂的方法，其中所述医疗操作包括与如下的至少一种接触：心脏；至少一种选自主动脉、主动脉弓、颈动脉、冠状动脉、头臂动脉(brachiocephalicartery)、脊椎基底动脉循环(vertebrobasilar circulation)、颅内动脉、肾动脉、肝动脉、肠系膜动脉中至少一种血管和/或心脏颅侧的动脉系统的血管；和静脉血管（如果患者具有已知的中隔缺损的话）。医疗操作包括在体内的至少一种所述血管的中释放至少一个栓塞物，这可导致目标器官的缺血，以及在医疗操作之前、期间和/或之后施用FXII抑制剂。“FXII抑制剂”是指因子XII和激活的因子XII(FXIIa)之一或两者的抑制剂。

栓塞物可由各种材料组成。例如，栓塞物由气泡、油、脂肪、胆固醇、凝固的血液和/或碎片组成。在一个实施方案中，栓塞物不是血栓。

在一个实施方案中，目标器官是脑，患者患有、已患有或有风险患上(i)无症状性脑缺血或(ii)由非血栓可溶解性(nonthrombolysable)物质引起的中风。在另一个实施方案中，目标器官是心脏、肾、肝和/或胃肠道器官，包括食管、胃、小肠和/或大肠(包括结肠和/或直肠)。

在一个实施方案中，医疗操作包括与所述血管中至少之一的内侧接触。在另一个实施方案中，医疗操作包括一个或多个所述血管的夹闭。

在一个实施方案中，医疗操作是血管手术。在某些实施方案中，医疗操作是冠状血管造影术、颈动脉支架安装、经皮冠状血管介入疗法(percutaneous coronary intervention)、颈动脉内膜切除术(carotidendarterectomy)或心血管手术。在另一个实施方案中，医疗操作是狭窄性肾动脉的扩张术。在一个实施方案中，医疗操作是诊断性的血管手术。在某些实施方案中，医疗操作是包括导管、支架、气囊和/或移植物中的任一种或多种的血管手术。在另一个实施方案中，医疗操作包括施用造影剂，因为造影剂的注射可无意中产生气泡和/或移动碎片等。

在一个实施方案中，FXII抑制剂包括野生型Infestin-4(SEQ ID NO:1)多肽序列或其变体。在另一个实施方案中，Infestin-4的变体包含野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13，和所述N末端氨基酸之外的至少一个和多达5个氨基酸突变，所述突变导致与野生型Infestin-4序列的差异；和/或包含来自野生型Infestin-4序列的6个保守半胱氨酸残基和与野生型Infestin-4序列有至少70%的同源性。参见图2。在另一个实施方案中，所述FXII抑制剂包括SPINK-1(SEQ ID NO:2)，一种在胰腺中表达的人蛋白，其被突变而包括野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13(示为SEQ ID NO:3)，或所述突变的SPINK-1的变体。在某些实施方案中，所述突变的SPINK-1的变体包括：野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13，并且具有所述N末端氨基酸之外的至少一个和多达5个氨基酸突变，所述突变导致与野生型SPINK-1序列的差异并且增加变体与野生型Infestin-4序列的同源性，和/或包括来自野生型SPINK-1序列的6个保守半胱氨酸残基和与野生型SPINK-1序列有至少70%的同源性。在一个实施方案中，FXII抑制剂是SPINK K1、K2或K3(SEQ ID NO:3、4或5)。

在另一个实施方案中，FXII抑制剂选自AT III抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、C1抑制剂、抑肽酶、α-1蛋白酶抑制剂、抗蛋白酶素([(S)-l-羧基-2-苯乙基]-氨甲酰基-L-Arg-L-Val-Arginal)、Z-Pro-Pro-醛-二甲基乙酸酯、DX88、亮抑酶肽(leupeptin)、脯氨酰寡肽酶的抑制剂例如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米胰蛋白酶抑制剂、牛胰胰蛋白酶抑制剂的突变体、大肠杆菌素(ecotin)、YAP(黄鳍金枪鱼抗凝血剂蛋白(yellowfin sole anticoagulant protein))、笋瓜（Cucurbitamaxima）胰蛋白酶抑制剂-v和/或笋瓜同效抑制剂(isoinhibitor)。

在另一个实施方案中，FXII抑制剂是抗-FXII抗体，抗-FXII抗体是指结合并且抑制FXII和/或FXIIa的抗体。

在某些实施方案中，将FXII抑制剂连接至增加半衰期的多肽(HLEP)。在一个实施方案中，HLEP可以是例如白蛋白、afamin、甲胎蛋白或维生素D结合蛋白。在一个实施方案中，HLEP可以是人白蛋白或其变体。在其它实施方案中，HLEP是免疫球蛋白。免疫球蛋白部分可以是来自IgG的Fc。

在另一个实施方案中，FXII抑制剂通过接头连接至HLEP。在一个实施方案中，接头可以是可切割的。在某些实施方案中，接头可被内源性、外源性和/或共同的凝血途径的凝血蛋白酶切割。在一个实施方案中，接头被FXIIa切割。

本申请的另一个方面涉及包括操作的SBI的动物模型，其中所述操作包括将至少一个栓塞物释放进入动物的动脉系统（这可导致脑的缺血性损伤），以及评价动物中脑的缺血性损伤的适应征。缺血性损伤在临床上是无症状的。在本说明书中，术语“释放”或“释出”包括将外源性来源的栓塞物提供至动物的动脉系统中和使用技术在内部产生栓塞物，但不包括将线插入血管而产生血栓。在一个实施方案中，操作包括将栓塞物释放进入动脉系统。在一个实施方案中，操作包括将栓塞物释放进入颈动脉。在某些实施方案中，操作包括使用导管释放栓塞物。在另一个实施方案中，操作包括夹闭和/或手术。在一个实施方案中，动物模型包括评价动物中其它目标器官包括心脏和/或肾的缺血性损伤。在一个实施方案中，操作不包括将线插入血管以产生血栓。在一个实施方案中，操作不会引起动物的中风。

在一个实施方案中，栓塞物包括荧光材料。在某些实施方案中，栓塞物由非血栓可溶解性材料组成(意指栓塞物可能不被血栓溶解剂溶解)。在此类实施方案中，栓塞物不是血栓。例如，栓塞物可由聚合物、气泡、油、脂肪、胆固醇和/或碎片组成。在一个实施方案中，栓塞物是微珠(包括微球体或微粒)。栓塞物可由50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的非血栓可溶解性物质组成。在另一个实施方案中，栓塞物由凝固的血液组成。在一些实施方案中，评价包括成像和/或组织学。在一些实施方案中，成像包括MRI和/或SPECT。在一个实施方案中，动物模型是小鼠。在另一个实施方案中，动物模型是大鼠。

在另一个实施方案中，所述动物模型用于评价减少SBI的治疗剂候选者。在该实施方案中，给动物施用治疗剂，测试其减少脑内缺血性损伤的能力。在另一个实施方案中，给动物施用治疗剂，测试其减少其它目标器官内缺血性损伤（包括弥散性栓塞性缺血）的能力。在某些实施方案中，治疗剂候选者是凝血途径的抑制剂。在一个实施方案中，治疗剂是FXII的抑制剂。在一个实施方案中，治疗剂是抗体。在另一个实施方案中，治疗剂是蛋白质、肽、核酸或小分子。在一些实施方案中，在操作之前、期间和/或之后给动物施用所述治疗剂候选者。

在一个实施方案中，使用成像法(包括MRI和/或SPECT成像)来评价目标器官的缺血性损伤，以开发FXII的抑制剂。在施用FXII抑制剂之前和/或之后进行成像法。在一个实施方案中，目标器官是脑。

其它实施方案示于下列项中。

项1.因子XII(FXII)的抑制剂用于预防和/或治疗接受医疗操作的患者中的缺血，其中所述医疗操作包括接触如下的至少之一：

(a)心脏，

(b)至少一种选自主动脉、主动脉弓、颈动脉、冠状动脉、头臂动脉、脊椎基底动脉循环、颅内动脉、肾动脉、肝动脉、肠系膜动脉之中的血管和/或靠近心脏的动脉系统的血管，

(c)静脉血管，如果患者具有已知的中隔缺损的话；

并且其中所述医疗操作包括在体内的至少一种所述血管中释放至少一个栓塞物，所述栓塞物可在至少一个目标器官中导致所述缺血并且其中在医疗操作之前、期间和/或之后施用FXII抑制剂。

项2.根据项1的因子XII抑制剂的使用，其中所述栓塞物由气泡、油、脂肪、胆固醇、凝固的血液和/或碎片组成。

项3.根据项1和2的因子XII抑制剂的使用，其中所述目标器官是：

(a)脑，并且其中所述患者患有、已患有或有风险患上无症状性脑缺血或中风，其中所述中风由非血栓可溶解性物质引起；和/或

(b)心脏、肾、肝；和/或胃肠道器官。

项4.根据项1至3的因子XII抑制剂的使用，其中所述医疗操作包括：

(i)与所述血管中至少一种或多种的内侧的接触；

(ii)所述血管中至少一种或多种的夹闭；

(iii)包括导管、支架、气囊、移植物和/或施用造影剂的任一个或多个的血管手术；

(iv)血管手术和/或为诊断性的血管操作；和/或

(v)冠状血管造影术、颈动脉支架安装、经皮冠状血管介入疗法(percutaneous coronary intervention)、颈动脉内膜剥离术(carotidendarerectomy)、心血管手术或狭窄肾动脉的扩张术。

项5.根据项1至4的因子XII抑制剂的使用，其中所述FXII抑制剂包括:

(i)野生型Infestin-4多肽序列(SEQ ID NO:1)或其变体，其中变体包括：

(a)野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13和所述N末端氨基酸之外的至少一个和多达5个氨基酸突变，所述突变导致与野生型Infestin-4序列的差异；

和/或

(b)来自野生型Infestin-4序列的6个保守半胱氨酸残基和与野生型Infestin-4序列有至少70%的同源性；

(ii)SPINK-1，其被突变而包括野生型Infestin-4序列N末端氨基酸2-13，或所述突变的SPINK-1的变体，其中变体包含：

(a)野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13和所述N末端氨基酸之外的至少一个和多达5个氨基酸突变，所述突变导致与野生型SPINK-1序列的差异并且增加变体与野生型Infestin-4序列的同源性；

和/或

(b)来自野生型SPINK-1序列的6个保守半胱氨酸残基和与野生型SPINK-1序列有至少70%的同源性；

(iii)AT III、血管紧张素转换酶抑制剂、C1抑制剂、抑肽酶、α-1蛋白酶抑制剂、抗蛋白酶素([(S)-1羧基-2-苯乙基]-氨甲酰基-L-Arg-L-Val-Arginal)、Z-Pro-Pro-醛-二甲基乙酸酯、DX88、亮抑酶肽、脯氨酰寡肽酶的抑制剂例如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米-胰蛋白酶抑制剂、牛胰胰蛋白酶抑制剂的突变体、大肠杆菌素、YAP(黄鳍金枪鱼抗凝血剂蛋白)、笋瓜胰蛋白酶抑制剂-v、笋瓜同效抑制剂和/或Pro-Phe-Arg-氯甲基-酮(PCK)；和/或

(iv)抗-FXII抗体，其中所述抗体结合FXII并且抑制其活性和/或活化。

项6.根据项5的因子XII抑制剂的使用，其中突变的SPINK-1的变体为SPINK K1、K2或K3(SEQ ID NO:3、4或5)。

项7.根据项1至5的因子XII抑制剂的使用，其中所述FXII抑制剂连接了增加半衰期的多肽，其中所述增加半衰期的多肽任选地是:

(i)白蛋白、afamin、甲胎蛋白或维生素D结合蛋白；或

(ii)人白蛋白或其变体；或

(iii)免疫球蛋白或其变体；或

(iv)IgG的Fc。

项8.根据项7的因子XII抑制剂的使用，其中所述增加半衰期的多肽通过接头连接至FXII抑制剂，并且其中所述接头任选地可被内源性、外源性或共同的凝血途径的凝血蛋白酶切割。

项9.成像方法用于开发因子XII抑制剂的用途，包括施用因子XII抑制剂候选物和使用放射或核医学例如CT(任选地SPECT-CT和/或FMT-CT))；MRI(任选地弥散加权磁共振(DWI)和/或fMRI)；PET；光学成像(任选地荧光反射成像(fluorescence reflectance imaging)；超声、显微镜检查、荧光检查、放射自显影术和/或磷体成像)评价因子XII抑制剂候选物对动物目标器官的缺血的效果，其中所述缺血由栓塞物引起，和

(i)所述目标器官是脑、心脏、肾、肝和/或胃肠道器官，以及

(ii)如果所述目标器官是脑，则其中所述缺血性损伤在临床上是无症状的和/或所述栓塞物是非血栓可溶解性的。

项10.组织学方法用于开发因子XII抑制剂的用途，其包括施用因子XII抑制剂候选物和使用TTC染色、免疫组织化学和/或组织化学评价所述因子XII抑制剂候选物对动物中目标器官的缺血的效果，其中所述缺血由栓塞物引起，和

(i)所述目标器官是脑、心脏、肾、肝和/或胃肠道器官，和

项11.一种缺血的动物模型，其包括：

(a)操作，其中所述操作包括有意地将至少一个栓塞物释放在动脉系统中，这可导致至少一个目标器官的缺血性损伤，

(i)其中所述目标器官是脑、心脏、肾、肝和/或胃肠道器官；和

(ii)如果所述目标器官是脑，则其中所述缺血性损伤在临床上是无症状的和/或所述栓塞物是非血栓可溶解性的；和

(b)评价所述动物中目标器官的缺血性损伤的指征。

项12.根据项9至11的方法，其中所述操作包括

(i)将所述栓塞物释放进入血管；

(ii)将所述栓塞物释放进入动脉；

(iii)将所述栓塞物释放进入心脏、主动脉、主动脉弓、颈动脉、冠状动脉、头臂动脉、脊椎基底动脉循环、颅内动脉、肾动脉、肝动脉、肠系膜动脉和/或心脏颅侧的系统的血管；和/或

(iv)将所述栓塞物释放进入颈动脉。

项13.根据项9或11的方法，其中所述评价步骤包括磁共振成像和/或SPECT成像。

项14.根据项9至11的方法，其用于评价治疗缺血的治疗剂候选物，其中

(i)测试所述治疗剂候选物降低目标器官中缺血性损伤的能力，并且其中在操作之前、期间和/或之后给所述动物施用所述治疗剂候选物；和/或

(ii)所述治疗剂候选物是凝血途径的抑制剂。

项15.根据项9至14的方法，其中所述治疗剂候选物是

(i)FXII抑制剂，或

(ii)抗体，或

(iii)小分子。

本申请中各实施方案的其它目的和有利方面部分地示于下列描述中，部分地根据所述描述而显而易见，或可在实践中学习。各实施方案的目的和有利方面将通过所附权利要求中明确指出的要素和组合来展示。

附图概述

专利或申请文件包含至少一个彩色附图。在申请并且支付必要的费用后将由专利局提供具有彩色附图的此专利或专利申请的复印件。

图1.R.prolixus抑制剂与凝血酶以及SPINK-1与胰凝乳蛋白酶的接触位点。#表示作为R.prolixus抑制剂与凝血酶之间的接触位点的氨基酸；+表示作为SPINK-1与胰凝乳蛋白酶之间的接触位点的氨基酸。

图2.Infestin-4(I4)与SPINK-1(SP)之间的氨基酸序列相似性。*表示相同的氨基酸；|表示相似氨基酸；粗体氨基酸是保守半胱氨酸；Infestin-4序列的加以下划线的氨基酸2-13是保守的。

图3.Infestin-4、SPINK1和3个SPINK1变体(K1、K2和K3)的氨基酸序列。*表示相同的氨基酸；|表示相对于Infestin-4序列相似的氨基酸。I4的加以下划性的序列被用于替代SPINK-1的15个氨基酸，产生K1。变体K2和K3是通过在K1序列上进行额外的点突变(加以下划线的氨基酸)产生的。

图4.模型。(A)注射前FTC+微珠粒的荧光图像。(B)从新鲜小鼠血液制备的离体形成和标记的凝固血液的荧光图像。(C)举例说明栓塞物的施用的卡通图。将递送导管插入颈外动脉(ECA)。ICA：颈内动脉，CCA：颈总动脉。在注射过程中，暂时结扎CCA以迫使栓塞物进入ICA。(D,E)注射微珠粒(D)或凝固血液(E)后脑表面的荧光图像。

图5.rHA-Infestin-4减少损伤，通过氯三苯基四唑(TTC)定量的。施用栓塞物后第3天利用TTC扫描对组织损伤进行的评估示于条线图中。显示了代表性TTC切片和相应脑切片的荧光反射图像。数据表示为平均值+平均值的标准误差。*p<0.05。

图6.rHA-Infestin-4不增加继发性出血(第3天)。注射珠粒或凝固血液后第3天评估继发性出血。每小鼠显示一个代表性脑切片。红色框架表示其中检测到出血(箭头)的小鼠。

图7.rHA-Infestin-4在施用凝固血液后减少受损区域中的FXIII活性，如通过SPECT-CT估量的。在施用由凝固血液组成的栓塞物后3小时估量血浆转谷氨酰胺酶活性(FXIIIa)。FRI：显示凝固血液的位置的荧光反射成像。%IDGT是指每克组织注射的剂量。TBR：目标对本底比率。数据表示为平均值+平均值的标准误差。*p<0.05。

图8.rHA-Infestin-4在施用微珠粒后减少受损区域中的FXIII活性，如通过SPECT-CT估量的。在施用珠粒栓塞物后3小时估量血浆转谷氨酰胺酶活性(FXIIIa)。FRI：显示珠粒的位置的荧光反射成像。%IDGT是指每克组织注射的剂量。TBR：目标对本底比率。数据表示为平均值+平均值的标准误差。*p<0.05。

图9.FXIII的免疫组织化学。施用珠粒或凝固血液后3小时FXIII的免疫组织化学染色。条棒表示50μm。

图10.施用凝固血液后通过MRI测量到MPO活性未改变。施用由凝固血液组成的栓塞物后3天估量MPO活性。FRI：荧光反射成像，显示凝固血液的位置。AU：任意单位。CNR：对比噪声比(Contrast To NoiseRatio)。数据表示为平均值+平均值的标准误差。*p>0.05。

图11.施用微珠粒后通过MRI测量到MPO活性未改变。施用由微珠粒栓塞物后3天估量MPO活性。FRI：荧光反射成像，显示珠粒的位置。AU：任意单位。CNR：对比噪声比。数据表示为平均值+平均值的标准误差。*p>0.05。

详细描述

本申请的实施方案涉及对接受医疗操作的患者施用因子XII(FXII)抑制剂的方法，其中医疗操作包括与下述中至少一种的接触：心脏；至少一种选自主动脉、主动脉弓、颈动脉、冠状动脉、头臂动脉、脊椎基底动脉循环、颅内动脉、肾动脉、肝动脉、肠系膜动脉中的至少一种血管和/或心脏颅侧的动脉系统的血管；和静脉血管，如果患者具有已知的中隔缺损的话。医疗操作包括在体内的至少一种所述血管中释放至少一个栓塞物，这可导致目标器官的缺血，以及在医疗操作之前、期间和/或之后施用FXII抑制剂。缺血可由各种类型的栓塞物引起，无论栓塞物是否由气泡、油、脂肪、胆固醇、凝固血液和/或碎片组成。在一个实施方案中，目标器官是脑，并且患者患有、已患有SBI或处于发生SBI的风险中。此外，本申请的实施方案提供了可用于研究SBI和用于评价治疗剂候选物的SBI动物模型。

本申请实施方案的一个有利方面是SBI可在经历一系列医疗操作或者呈现或未呈现不同疾病状况的患者中减少。所述方法的成功不依赖于患者具有还是不具有下列操作或疾病状况的任一种。所述方法的成功因而不依赖于患者具有还是不具有任何潜在的疾病或例如血栓形成的潜在风险。事实上，相信所述方法在不具有例如血栓形成的潜在风险但接受医疗操作例如以修正先天性心脏缺损的患者中有效地起作用。因此，患者群体比处于血栓形成风险中的患者群体更广泛，从而也有所不同。本申请意欲涉及包括或不包括具有特定操作或疾病状况的那些患者的患者群体亚组。

I.定义

如本申请中所用，缩写“FXII”是指因子XII或活化的因子XII(FXIIa)或两者。因此，术语“FXII抑制剂”包括FXII和FXIIa之一或两者的抑制剂。此外，抗-FXII抗体包括结合并且抑制FXII和FXIIa之一或两者的抗体。

如此处所用，术语“缺血”是指人患者或动物中对组织或目标器官的供血不足的状况，如果不治疗，所述状况可导致缺血性损伤。例如，大脑或“脑缺血”是指至脑的血液的减少，这样氧供应不能满足脑组织的需要。脑“梗死”是指如果缺血或血流停止持续足够长时间而导致细胞死亡时可导致的死亡脑组织。梗死可使用计算机断层摄影术(CT)或MRI来鉴定。梗死还可指由小的缺血性损伤或微小病变(其特征在于弥散性并且太小以至于在常规MRI中不导致明确改变)引起的死亡组织。此类小的梗死可利用更灵敏的成像模式例如弥散加权MRI来显示。

如本文中所用，术语“缺血性损伤”是指可因缺血(例如弥散性或局灶性缺血、微小损伤、短暂缺血、微小损伤、损伤、微梗死或梗死)而对目标器官发生的一系列损害。缺血损伤的进一步特征可在于它们可由栓塞物(包括气泡、油、脂肪、胆固醇、凝固血液和/或碎片)引起。取决于栓塞物的尺寸，可造成不同的事件。例如，如果栓塞物（例如非血栓可溶解性物质，包括空气泡)较大，则其可引起中风。这样的事件可以是心脏手术或动脉内手术的副作用。如果栓塞物（例如空气泡）较小或存在许多小的栓塞物例如多个空气泡，则其可引起SBI。在一个实施方案中，中风例如由空气泡所组成的栓塞物引起。

术语“无症状的”，当指“无症状性脑缺血”(“SBI”)或“无症状脑梗死”或“临床上无症状的”时，是指缺乏急性和明显的定义中风的症状例如轻偏瘫、感觉减退和/或失语症的脑组织内缺血的状况。中风可定义为与脑循环的损害相关的任何急性临床事件，其导致持续超过24小时的局灶性神经功能缺损。SBI可能与更细微的神经功能缺损相关，包括但不限于行为改变、更糟的认知能力、视野缺损、手臂和腿的扰动(arm and leg disturbance)、虚弱、抑郁性症状、躯体功能的减退和加重的血管性痴呆。例如，与先发性短暂缺血发作或中风样症状相关的梗死可被定义为症状性的，而不具有相应的中风样症状的梗死可被定义为“无症状的”。术语“无症状的”并不意味着无症状；其意指症状与典型的中风不同，并且通常更细微，在某些情况下仅以其它方式表现它们自己，仅可通过尖端的成像或更强的测试例如认知测试来检测。术语“弥散”，当指器官内的弥散性栓塞性缺血时，是指缺血的一个特征，其由栓塞物向器官中超过一个位置发生散布引起的，即缺血不是局灶性的。

如此处所用，术语“降低”包括降低个体或动物中SBI的概率，减轻任何症状的严重度，和/或降低处于患SBI风险的群体中实际患上SBI的患者的比例。因此，“减少”是指减小、降低、减弱、限制、减轻或改善SBI的状况。减少SBI可包括例如保护以免于SBI的发生；减小SBI的风险，当SBI发生或一旦其已发生时减轻其严重度；限制SBI的损伤，例如限制缺血性损伤发展成梗死；减少SBI的扩散，例如限制受缺血性损伤影响或损害的脑区域或血管的量；或改善与SBI相关的脑病况，例如炎症或水肿。

在一个实施方案中，患者患有或已患有SBI。在某些实施方案中，患者处于发生SBI的“风险”中。处于SBI“风险”中的患者包括已接受、正在接受或将接受医疗操作的患者，所述医疗操作包括与如下的任一个的接触：心脏；主动脉、主动脉弓、颈动脉、冠状动脉、头臂动脉、脊椎基底动脉循环、颅内动脉、肾动脉、肝动脉、肠系膜动脉，和/或心脏颅侧的动脉系统的血管；和静脉血管（如果患者具有已知的中隔缺损的话）。处于SBI“风险中”的患者已接受、正在接受或将接受医疗操作，所述医疗操作包括将至少一个栓塞物释放在体内血管中。可在医疗操作之前、期间和/或之后进行给患有、已患有SBI或有风险患上SBI的患者施用FXII抑制剂的方法，以限制SBI的发生，或限制SBI的发展或减轻其损害。在某些实施方案中，患者无需患有SBI来施用FXII抑制剂。例如，患者在进行医疗操作之前可能不患有SBI，或可能不知道患者在进行医疗操作之前、期间和/或之后是否患有SBI，但在这些情况下，患者因医疗操作而处于发生SBI的“风险中”，从而可施用FXII抑制剂。在某些实施方案中，患者或动物在施用FXII抑制剂之前、期间和/或之后可能患有SBI。在某些实施方案中，患者或动物在施用FXII抑制剂之前、期间和/或之后可能不患有SBI。

术语“可导致”意指包括其中目标器官的缺血在接受产生栓塞物的操作的患者或动物以及尚未接受FXII抑制剂的患者或动物中发生的情形；其还包括其中目标器官的缺血不在接受操作的人或动物中发生(因为患者或动物事先或同时接受了FXII抑制剂的施用)的情形。如果患者或动物在操作后短时间内（例如操作结束后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或30分钟内，1小时内或2、4、6、8、12、24、28、72或96小时内）接受FXII抑制剂，则缺血(以及如果缺血持续的话将会发生的任何梗死)也可能不发生。

例如，在动物模型的一个实施方案中，可在操作之前、期间和/或之后短时间内(如上定义的)施用FXII抑制剂，因此动物可能不发生SBI。在该动物模型的另一个实施方案中，可在操作之后施用FXII抑制剂，并且动物可能发生SBI。该术语还指并非具有所包括的医疗操作之一的每一个患者事实上有栓塞物被移除的事实。所有这些情形都包括在本申请的实施方案中。

短语在动物受试者中“诱导无症状性脑缺血”是指所述方法中，所述动物具有缺血性损伤的指征，例如脑的梗死，例如通过成像和/或组织学显示的，以及其中症状在临床是无症状性的，如上文中和实施例2A中所描述的。

“接受”医疗操作的患者是指将进行医疗操作、正在进行医疗操作、或已进行了医疗操作的患者。

如“允许FXII抑制剂减少缺血性损伤”中所用，术语“允许”被定义为以足以减少脑内缺血性损伤的量和施用途径施用FXII抑制剂。术语“减少”和“缺血性损伤”在上文中已定义。缺血性损伤的量可通过各种成像模式(其包括但不限于MRI和/或CT)来进行估量。

“栓塞物”是指由固体、液体或气体组成的能够阻塞血管的任何脱落的血管内物质。阻塞可在远离起始点的位置发生。栓塞物的组成包括、但不限于气泡或CO2；油、脂肪、胆固醇；碎片例如血管碎片，例如钙化物、组织或肿瘤碎片；凝固血液、生物体例如细菌或寄生虫或其它传染源；或外来物质。术语“气泡”包括由空气或其它气体或在某些情况下由不是血液或凝固血液的液体形成的栓塞物。气泡在形状上可以是球形的或非球形的。在一个实施方案中，栓塞物不是血栓。在另一个实施方案中，栓塞物由凝固血液组成。术语“微栓塞物”包括在如本文中所用的术语“栓塞物”中，是指具有微观尺寸的栓塞物，并且可由与上文中定义的栓塞物相同的材料组成。因此，“栓塞物”包括单个或多个栓塞物、微栓塞物、大批栓塞物或大批微栓塞物。

栓塞物可以是动脉栓塞物，其中脱落的血管内物质处于动脉或动脉系统的血管中。在一个实施方案中，栓塞物是“反常栓塞物”，其是指因例如中隔缺损而进入动脉系统的静脉来源栓塞物。

“同源性”是指相同的或组成保守性置换的氨基酸的百分数。同源性可使用序列比较程序例如GAP(Deveraux等人,1984,Nucleic AcidsResearch12,387-395，将所述文献通过引用并入本文)来进行测定。这样，可通过将缺口插入比对来比较具有与本文中引用的序列相似长度或明显不同长度的序列，这样的缺口可以例如通过GAP使用的比较算法来确定。

II.医疗操作

在一个实施方案中，给接受医疗操作的患者施用FXII抑制剂。如本文中所用，术语“医疗操作”是指诊断、干预、治疗或手术的行为。在一个实施方案中，医疗操作包括与如下的至少一个的接触：心脏；选自主动脉、主动脉弓、颈动脉、冠状动脉、头臂动脉、脊椎基底动脉循环、颅内动脉、肾动脉、肝动脉、肠系膜动脉中的至少一种血管，和/或心脏颅侧的动脉系统的血管；和静脉血管（如果患者具有已知的中隔缺损的话）。如本文中所用，术语“接触”是指仪器、外部物体、人例如外科医生或因医疗操作触碰所述血管结构的任何其它物体对所述血管结构的物理触碰。在一个实施方案中，医疗操作包括与所述血管中至少一种的内侧的接触。在某些实施方案中，医疗操作包括对所述血管中一种或多种的夹闭。在一些实施方案中，医疗操作包括栓塞物的释放，并且栓塞物可由气泡、油、脂肪、胆固醇、凝固血液和/或碎片组成。在一些实施方案中，医疗操作包括导管、支架、气囊、移植物中的任一种或多种，和/或施用造影剂，因为造影剂的注射可无意地产生空气泡和/或逐出碎片等。

在一个实施方案中，医疗操作是血管操作。术语“血管操作”包括影响心脏或血管的任何操作，其中血管被定义为运输或包含血液的结构。血管操作可包括例如使用导管或施用造影剂。在某些实施方案中，医疗操作牵涉动脉系统，指涉及动脉、动脉分支、小动脉、毛细血管或参与将血液运离心脏的血管的手术。在一些实施方案中，医疗操作牵涉下列血管的一种或多种：主动脉、主动脉弓、颈动脉、冠状动脉、头臂动脉、脊椎基底动脉循环、颅内动脉、肾动脉；肝动脉，包括例如肝总动脉和/或肝固有动脉（hepatic artery proper）；肠系膜动脉，包括例如肠系膜上动脉和/或肠系膜下动脉；和/或心脏颅侧的动脉系统的血管；静脉血管（如果患者具有已知的中隔缺损的话）。

术语“诊断性的”是指实施来鉴定或评价病况、疾病或障碍的操作。诊断性操作可包括例如使用导管、支架、气囊、移植物中的任一种或多种和/或施用造影剂。

在一个实施方案中，医疗操作是血管手术。血管手术是指牵涉脉管结构例如心脏或血管的手术。血管手术的实例包括、但不限于心血管手术，例如冠状动脉-旁路移植术；或无心肺转流的心脏动脉移植；心瓣膜置换或修复术，包括例如主动脉或二尖瓣、主动脉或二尖瓣瓣膜切开术或瓣膜成形术；心脏移植；改善狭窄或反流的病况的手术；牵涉心脏起搏器包括临时起搏器或永久性起搏器、两心室起搏器的手术；牵涉发生器(generator)改变、拔除导线或可植入的环状记录器、植入的心律转换器(cardioverter)/去纤颤器装置或支持循环的机械装置例如体外泵或心室辅助装置的手术；颈动脉内膜切除术；动脉内膜血栓切除术；主动脉瘤与剥离手术；透析入口操作例如动静脉瘘；牵涉心脏肿瘤或外伤性心脏损伤的手术；和重建性手术或任何其它目前已知的手术或未来的血管手术。

血管手术可以例如包括先天性心脏缺损的纠治性手术。先天性心脏缺损的纠治性手术包括但不限于修复畸形或缺损的手术，例如房间隔或室间隔缺损的修复；动脉导管开放的修复；分流的修复；主动脉缩窄修复；全部或部分肺静脉回流异常的修复；大动脉完全错位的静脉开关校正或心室内手术；法乐四联症状的修复；或用于先天性心脏缺损的任何其它目前已知的手术或未来的手术。

在一个实施方案中，医疗操作包括使用导管。如本文中所用，术语“导管”是指被插入血管的管。牵涉使用导管的操作的实例包括但不限于给血管安装支架例如冠状动脉、颈动脉安装支架、颅内支架安装、主动脉或髂动脉血管成形术；血管成形术例如气囊血管成形术；血栓切除术；导管定向的溶栓术；栓塞物形成、化疗法或加热的直接或局部施用；心瓣膜置换术或修复；或主动脉或二尖瓣瓣膜切开术或瓣膜成形术。在一个实施方案中，医疗操作包括导管或支架的任何使用或牵涉血管剥离或夹闭的操作。血管手术可包括血管探测术例如血管内一线圈栓塞术(endovascular-coil occlusion)、血管内动脉瘤闭塞术或利用异物(例如铂线圈(platinum coils))的颅内血管探测术。

在一个实施方案中，医疗操作包括成像。成像可用于使体内生物学和细胞过程可视化，并且可用于筛选、诊断、评价、监测或治疗病况、疾病或障碍。成像可以包括或可以不包括使用导管。成像技术可使血管系统成像，例如冠状血管造影术，包括诊断性血管造影或基于导管的血管造影术，包括观察冠状血管系统、肺血管系统或身体的任何部分的血管系统或主动脉造影照片。

在一个实施方案中，医疗操作包括施用造影剂、放射性同位素或染料。关于成像模式和通常使用的造影剂的论述，参见Pysz MA等人65Clinical Radiology500-516,2010；下面给出造影剂和各种成像技术的实例。

例如，用于CT的造影剂包括但不限于钡、碘、氪和氙。单光子-发射计算机断层摄影术(single photon-emission computed tomography，SPECT-CT)中使用的造影剂包括但不限于^99mTc、¹²³I、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu。正电子发射断层摄影术(positron emission tomography，PET)中使用的常用造影剂包括但不限于同位素¹¹C、¹⁸F、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga。MRI中使用的造影剂包括但不限于钆(Gd³⁺)、氧化铁颗粒(SPIO、USPIO)、氧化锰和¹⁹F。磁共振波谱分析(MRS)中使用的造影剂包括但不限于胆碱、肌酸、乳酸盐、脂质、聚（多）胺和N-乙酰基-天冬氨酸。微气泡造影剂(Contrast microbubble)可用于超声(US)例如充气微球(例如过氟丁烷)或脂质外壳的气泡。荧光分子、染料和/或吸光颗粒可用于光学成像技术。放射性示踪元素可用于肿瘤学、心血管或神经学成像，例如¹¹C、¹⁸F、⁶⁴Cu、¹¹¹In、^99mTc、⁹⁰Y、¹³¹I、¹²³I-/¹³¹和¹⁵³Sm。组织蛋白酶(Capthesin)B-或MMP2/9-激活的“智能(smart)”荧光探针可用于光学断层摄影术。造影剂包括NIRF染料、量子点和具有表面增强拉曼散射(SERS)性质的纳米颗粒可用于拉曼光谱分析。其它成像技术可包括利用对比例如微泡的超声心动描记术(ECHO)，包括二维ECHO、负荷超声(stress echo)、多普勒ECHO和经食管内ECHO。成像技术可包括显微术、光声成像或任何其它目前已知或未来的分子成像模式和/或相关造影剂。分子成像可包括施用结合至组织或疾病特异性标志物，或附着至用于靶向递送的治疗剂候选物的微珠粒(包括微球体和微粒)和纳米颗粒。

可在进行医疗操作之前、期间和/或之后给患者施用FXII抑制剂。可在进行医疗操作之前、期间和/或之后1、2、4、6、12、24、48、72或96小时或更长时间内施用FXII抑制剂。FXII抑制剂可以以单次剂量或以多个剂量施用，或在进行医疗操作之前、期间和/或之后以0.25、0.5、1、2、4、6、12、24或48小时或更长时间的间隔反复施用。还可在进行医疗操作之前、期间和/或之后以连续输注的形式施用FXII抑制剂1、2、4、6、12、24、48、72或96小时或更长时间。由于不增加出血风险的有利性质，因此可在进行医疗操作之前、期间和/或之后施用FXII抑制剂。可在临床试验中针对每一个具体操作确定施用的最佳时间。施用的时间安排还可取决于一系列因素，例如操作的类型或患者个体的病况，包括患者的病史、潜在疾病和/或其它疗法的使用，并且可由医护人员确定。

III.FXII抑制剂

如上文中所讨论的，“FXII”是指因子XII和活化因子XII(FXIIa)之一或两者。因此，“FXII抑制剂”包括FXII和FXIIa之一或两者的抑制剂。此外，抗-FXII抗体包括结合和抑制FXII和FXIIa之一或两者的抗体。术语“FXII抑制剂”还意欲包括与延长半衰期的多肽连接的FXII抑制剂，在一个实施方案中所述多肽包括接头。

在一个实施方案中，FXII/FXIIa抑制剂是特异性FXII/FXIIa抑制剂，优选特异性FXIIa抑制剂。

特异性FXII/FXIIa抑制剂是指如果以1:1的摩尔比使用时，抑制除FXII和/或FXIIa外的血浆丝氨酸蛋白酶(plasmatic serineproteases)的水平低于或等于25%的抑制剂。换句话说：当将所述抑制剂以相应血浆丝氨酸蛋白酶对所述抑制剂的摩尔比1:1使用时，特异性FXII/FXIIa抑制剂抑制除FXII和/或FXIIa外的血浆丝氨酸蛋白酶低于或等于25%。例如，特异性FXII/FXIIa mAb抑制血浆丝氨酸蛋白酶FXIa仅5%，其中FXIa对所述mAb的摩尔比为1:1，而同一FXII/FXIIa mAb抑制FXIIa至少80%，优选至少90%。

在本发明的一个实施方案中，如果以相应血浆丝氨酸蛋白酶对所述抑制剂的摩尔比1:1使用时，一种其它的血浆丝氨酸蛋白酶被抑制超过50%。

在本发明的另一个实施方案中，如果以相应血浆丝氨酸蛋白酶对所述抑制剂的摩尔比1:1使用时，两种其它的血浆丝氨酸蛋白酶被抑制超过50%。

在另一个实施方案中，FXII/FXIIa抑制剂是人FXII/FXIIa抑制剂，包括人源化单克隆抗体，优选完全人源化的单克隆抗体。

A.Infestin-4

在一个实施方案中，本申请提供了包含Infestin结构域4(Infestin-4)的FXII抑制剂。在一个实施方案中，FXII抑制剂包含Infestin-4的变体。在另一个实施方案中，FXII抑制剂包含Infestin结构域4以及任选地Infestin结构域1、2和/或3；这类蛋白质已知为FXII的强效抑制剂(参见WO2008/098720；也参见Campos ITN等人577FEBS Lett.512-516,2004)。提供了Infestin-4的野生型多肽序列(SEQID NO:1)。如本文中所用的，术语“变体”是指具有氨基酸突变的多肽，其中“突变”被定义为相对于野生型Infestin-4序列的置换、缺失或添加，其中此类变化不改变多肽抑制FXII的功能性能力。术语“变体”包括野生型或突变的Infestin-4序列的片段。下面提供此类变体的进一步实例。

在一个实施方案中，Infestin-4变体包括野生型Infestin-4序列的N末端氨酸2-13(参见图2中加以下划线的序列)，以及所述N末端氨基酸之外的至少一个和多达5个氨基酸突变，所述突变导致与野生型Infestin-4序列的差异，或6个保守性半胱氨酸残基(参见图2中以粗体标示的氨基酸)并且与野生型Infestin-4序列有至少70%的同源性。基于相关抑制剂长红锥蝽(Rhodnius prolixus)(PDB:1TSO)对凝血酶结合的结构数据的分析和SPINK-1对胰凝乳蛋白酶结合的分析，Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13对于对FXII的结合可能是非常重要的，这两种抑制剂共有接触位点集中在N末端区域的共同特征，如图1中显示的。因此，在一个实施方案中，Infestin-4的变体包含野生型Infestin-4序列的保守性N末端区域氨基酸2-13，以及这些保守性N末端氨基酸之外的至少一个和多达5个氨基酸突变，所述突变导致与野生型Infestin-4序列的差异。突变可以是置换、缺失或添加。如本文中所用，术语“在所述N末端氨基酸之外”是指沿着变体的多肽链在除包含序列VRNPCACFRNYV(即来自野生型Infestin-4序列的氨基酸2-13)的氨基酸连续区段外的任何氨基酸。在另一个实施方案中，Infestin-4变体包含6个保守性的半胱氨酸残基并且与野生型Infestin-4序列具有至少70%的同源性。在一个实施方案中，所述6个保守性半胱氨酸残基是野生型Infestin-4序列的位置6、8、16、27、31和48处的氨基酸(参见图2)。在一个实施方案中，变体包含最后的保守性半胱氨酸。在其它实施方案中，半胱氨酸的确切位置和彼此的相对位置可能因Infestin-4变体中的插入或缺失而从位置6、8、16、27、31和48发生改变。然而，在这些实施方案中，Infestin-4变体包含所有6个半胱氨酸并且与野生型Infestin-4序列可能共有70%、75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。

在一些实施方案中，Infestin-4变体的特征在于其抑制FXII。可以例如通过体外和/或体内鉴定(包括测试FXII酶活性的抑制、延长的凝固时间即激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)的直接测定或评估凝固的体内方法)来评估抑制FXII的功能活性。Infestin-4变体的其它实例是下文中描述的SPINK-1突变体。

B.SPINK-1突变体

一个实施方案涉及用于人的治疗性应用的FXII抑制剂。可使用与Infestin-4具有高度相似性的人蛋白质。例如，与Infestin-4具有最高相似性的人蛋白质是SPINK-1，一种在胰腺中表达的Kazal-型丝氨酸蛋白酶抑制剂(也称为胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂,PSTI)。Kazal-型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族是丝氨酸蛋白酶抑制剂的众多家族之一。来自不同物种的许多蛋白质已有描述(Laskowski MKato I,49Ann.Rev.Biochem.593-626,1980)。Infestin-4与SPINK-1之间的氨基酸序列相似性概述于图2中。

基于野生型SPINK-1序列(SEQ ID NO:2)，可产生不同的变体以增加SPINK-1序列与Infestin-4的同源性。短语“增加与Infestin-4的同源性”是指对SPINK-1产生氨基酸突变以使SPINK-1序列更接近Infestin-4序列的方法。

在一个实施方案中，将SPINK-1突变以包含野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13；已给出了所述多肽序列并且被称为K1(SEQ IDNO:3)。如上所述，Infestin-4序列的N末端部分被认为对于FXII抑制功能是非常重要的。

因此，在一个实施方案中，突变的SPINK-1的变体还包含野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13，以及所述N末端氨基酸之外的至少一个和多达5个氨基酸突变，所述突变导致与野生型SPINK-1序列的差异并且增加变体与野生型Infestin-4序列的同源性。在另一个实施方案中，突变的SPINK-1的变体包含6个保守的半胱氨酸残基并且与野生型SPINK-1序列具有至少70%的同源性。突变可以是置换、缺失或添加。如上文中定义的，术语“在所述N末端氨酸之外”是指沿着变体多肽链除由序列VRNPCACFRNYV(即来自野生型Infestin-4序列的氨基酸2-13)组成的氨基酸连续区段外的任何氨基酸。术语“变体”包括所述突变的SPINK-1序列的片段。在一个实施方案中，所述6个保守的半胱氨酸残基可以是野生型SPINK-1序列的位置9、16、24、35、38和56处的氨基酸(参见图2)。在一个实施方案中，变体包含最后的保守半胱氨酸。在另一个实施方案中，半胱氨酸的确切位置和彼此的相对位置可因SPINK-1变体中的插入或缺失而从野生型SPINK-1序列的位置9、16、24、35、38和56发生改变。然而，在这些实施方案中，SPINK-1变体包含所有6个半胱氨酸。在一些实施方案中，SPINK-1变体的特征也在于其抑制FXII。

已给出了这样的SPINK-1变体的实例，被命名为K2和K3(分别地SEQ ID NO:4和5)。在SPINK-1变体K2和K3中，在N末端之外产生进一步氨基酸置换以增加与Infestin-4的同源性，其中变体的特征也在于它们抑制FXII活性。参见WO2008/098720。图3显示这类变体的氨基酸序列以及相对SPINK-1野生型序列的改变程度。在SPINK-1变体K3的情况下，产生5个氨基酸置换以增加与Infestin-4的同源性。因此在一些实施方案中，SPINK-1变体与野生型SPINK-1序列可能具有70%、75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。

C.其它FXII抑制剂

在一个实施方案中，给接受医疗操作的患者施用FXII的其它抑制剂。如上所述，术语FXII抑制剂包括FXII和FXIIa二者的抑制剂。在W02006/066878中，推荐使用抗FXII抗体或FXII抑制剂。具体地，FXII的抑制剂包括抗凝血酶III(AT III)、血管紧张素转换酶抑制剂、C1抑制剂,抑肽酶、α-1蛋白酶抑制剂、抗蛋白酶素([(S)-l-羧基-2-苯乙基]-氨甲酰基-L-Arg-L-Val-Arginal)、Z-Pro-Pro-醛-二甲基乙酸酯、DX88(Dyax Inc.,300Technology Square,Cambridge,MA02139,USA;Williams A和Baird LG.2003.DX-88and HAE:a developmentalperspective.Transfus Apheresis Sci.29:255-258中引用的)、亮抑酶肽、脯氨酰寡肽酶的抑制剂例如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)、牛胰胰蛋白酶抑制剂的突变体、大肠杆菌素、黄鳍金枪鱼抗凝血剂蛋白、笋瓜(Cucurbita maxima)胰蛋白酶抑制剂-v包括笋瓜同效抑制剂和Hamadarin(如由Isawa H等人J.Biol.Chem.277:27651-27658公开的)和Pro-Phe-Arg-氯甲基-酮(PCK)。

FXII抑制剂可以是例如抗体或抗体片段或保持抑制性活性的模拟物，例如美国专利No.6,613,890中第4至8栏中公开的淀粉样蛋白前体蛋白的Kunitz蛋白酶抑制剂结构域的类似物。其它适当的抑制剂可以是Isawa H等人277J.Biol.Chem.27651-27658,2002中公开的Hamadarin。适当的玉米胰蛋白酶抑制剂及其产生方法公开于Chen Z等人，65Applied and Environmental Microbiology,1320-1324,1999和Wen L等人，18Plant Mol.Biol.813-814,1992中。

在另一个实施方案中，FXII抑制剂可以是结合FXII并且抑制FXII激活和/或活性的抗-FXII抗体。这样的抗体已在例如WO2006/066878和Ravon等人,1Blood4134-43,1995中进行了描述。如上所论述的，“抗-FXII抗体”包括结合并且抑制FXII和FXIIa之一或两者的抗体。下面更详细地描述抗-FXII抗体。

D.连接至增加半衰期的多肽的FXII抑制剂

本申请的另一个方面提供了连接至增加半衰期的多肽(HLEP)的FXII抑制剂。在一个实施方案中，FXII抑制剂是小的蛋白质。因此，预计其会象针对其它小蛋白质所公布的那样被快速肾清除(Werle M和Bernkop-Schnurch A,30Amino Acids351-367,2006)。解决多肽化合物血浆半衰期较短的一个方法是反复地注射其或通过连续输注进行注射。另一个方法是增加多肽本身的固有血浆半衰期。例如，在一个实施方案中，将FXII抑制剂连接延长半衰期的蛋白质。

“增加半衰期的多肽”增加FXII抑制剂在患者或动物中的体内半衰期。例如，白蛋白和免疫球蛋白以及其片段或衍生物已被描述为增加半衰期的多肽(HLEP)。Ballance等人(WO2001/79271)描述了许多不同治疗性多肽的融合多肽，所述治疗性多肽当与人血清白蛋白融合时，预测具有增加的体内功能半衰期和延长的贮存期限。

术语“白蛋白”和“血清白蛋白”包括人白蛋白(HA)及其变体（给出了其完全成熟形式(SEQ ID NO:6)）以及来自其它物种的白蛋白及其变体。如本文中所用，“白蛋白”是指白蛋白多肽或氨基酸序列或具有白蛋白的一个或多个功能活性(例如生物活性)的白蛋白变体。如本文中所用，白蛋白能够稳定或延长FXII抑制剂的治疗活性。白蛋白可来源于任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物例如人、猴、牛、绵羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括但不限于来自母鸡和鲑鱼的白蛋白。白蛋白连接的多肽的白蛋白部分可来自与治疗性多肽部分不同的动物。关于白蛋白融合蛋白的实例，参见WO2008/098720。

在一个实施方案中，白蛋白变体在长度上为至少10、20、40或至少70个氨基酸，或可包括来自HA序列(SEQ ID NO6)的15、20、25、30、50或更多个连续氨酸，或可包括HA的特定结构域的部分或全部。白蛋白变体可包括氨基酸置换、缺失或添加，包括保守或非保守置换，其中此类改变不会显著地改变赋予所述增加半衰期的多肽的治疗活性的活性部位或活性结构域。这类变体可以共有70%、75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。

在一个实施方案中，白蛋白变体包括片段，并且可由白蛋白的至少一个完整结构域或所述结构域的片段组成或可选择地包含所述结构域或片段，所述结构域可以是例如结构域1(SEQ ID NO6的氨基酸1-194)、2(SEQ ID NO6的氨基酸195-387)、3(SEQ ID NO6的氨基酸388-585)、1+2(SEQ ID NO6的1-387)、2+3(SEQ ID NO6的195-585)或1+3(SEQ ID NO6的氨基酸1-194+SEQ ID NO6的氨基酸388-585)。每一个结构域本身由两个同源的亚结构域即1-105、120-194、195-291、316-387、388-491和512-585组成，具有包含残基Lys106至Glu119、Glu292至Val315和Glu492至Ala511的柔性亚结构域间接头区域。

在另一个实施方案中，在结构或进化上与白蛋白相关的其它蛋白质可用作HLEP，包括但不限于甲胎蛋白(WO2005/024044;Beattie和Dugaiczyk,20Gene415-422,1982)、afamin(Lichenstein等人269J.Biol.Chem.18149-18154,1994)和维生素D结合蛋白(Cooke和David,76J.Clin.Invest.2420-2424,1985)。它们的基因代表具有结构和功能相似性的一个多基因簇，在人、小鼠和大鼠中作图到同一染色体区域。白蛋白家族成员的结构相似性显示它们可用作为HLEP。例如，已声称甲胎蛋白会延长所连接的治疗性多肽的体内半衰期(WO2005/024044)。可使用能够稳定或延长治疗活性的此类蛋白质或其变体，并且其可衍生自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，例如人、猴、牛、绵羊或猪，或非哺乳动物包括但不限于鸡或鲑鱼。参见WO2008/098720。此类变体在长度上可具有10个或更多个氨基酸，或可包括各自蛋白质序列的约15、20、25、30、50或更多个连续氨基酸，或可包括各自蛋白质的特定结构域的部分或全部。白蛋白家族成员融合蛋白可包括天然存在的多态性变体。

在另一个实施方案中，免疫球蛋白(Ig)或其变体可用作HLEP，其中变体包括片段。在一个实施方案中，使用免疫球蛋白恒定区的Fc结构域或部分。恒定区可以是IgM、IgG、IgD、IgA或IgE免疫球蛋白的恒定区。治疗性多肽部分通过抗体的铰链区或肽接头连接至Ig，其中所述肽接头可以是能切割的。几项专利和专利申请描述了治疗性蛋白质与免疫球蛋白恒定区的融合以延长治疗性蛋白质的体内半衰期(US2004/0087778、WO2005/001025、WO2005/063808、WO2003/076567、WO2005/000892、WO2004/101740、US6,403,077)。例如，细胞因子IFN-β与Fc融合获得了增强的IFN-β生物活性，延长的循环半衰期和更大的溶解度(WO2006/000448)。

因此，另一个实施方案是使用此类免疫球蛋白序列（例如免疫球蛋白的Fc片段及其变体）作为HLEP。可将FXII抑制剂与免疫球蛋白恒定区的Fc结构域或至少部分(作为HLEP)融合，并且可将其在原核或真核宿主细胞例如细菌、酵母、植物、动物(包括昆虫)或人细胞系中或在转基因动物(WO2008/098720)中作为重组分子产生。SPINK-K2-Fc融合蛋白示例性地示于SEQ ID NO:7中。

E.接头

在一个实施方案中，可在治疗性多肽与HLEP之间引入间插肽接头。在一个实施方案中，引入可切割的接头，特别地如果HLEP通过例如位阻干扰治疗性多肽的特异性活性时。在某些实施方案中，接头通过酶例如内源性、外源性或共同的凝血途径的凝血蛋白酶切割。内源性途径的凝血蛋白酶是接触活化途径中的蛋白酶，包括例如FXIIa、FXIa或FIXa。在一个实施方案中，接头由FXIIa切割。外源性途径的蛋白酶包括组织因子途径中的蛋白酶例如FVIIa。共同途径的蛋白酶包括参与血纤蛋白原向血纤蛋白转化的蛋白酶，例如FXa、FIIa和FXIIIa。

F.治疗性制剂和施用

FXII抑制剂或其变体可具有高于80%或高于95%、96%、97%、98%或99%纯度的纯度。在一个实施方案中，变体可具有相对于污染性大分子例如其它蛋白质和核酸而言大于99.9%纯度的药物纯状态，以及不含感染因子和热源。

可将纯化的FXII抑制剂溶解在常规生理相容性含水缓冲液中，任选地可向其中添加药物赋形剂以提供用于治疗患者的SBI的药物制剂。此类药物载体和赋形剂以及适当的药物配方在本领域是公知的。参见例如Kibbe等人Handbook of Pharmaceutical Excipients,(第3版,Pharmaceutical Press),2000。可以以冷冻干燥或稳定的可溶形式配制药物组合物。可利用本领域已知的多种方法冷冻干燥多肽。冻干的制剂可在使用前通过添加一种或多种药学上可接受的稀释剂例如注射用无菌水或无菌生理盐水溶液来进行重建。

可利用任何药学上适当的施用工具将FXII抑制剂的制剂递送至患者。各种递送系统是已知的并且可用于通过任何方便的途径施用组合物。组合物可全身性例如通过胃肠外途径施用。如本文中所用，“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌内、动脉内和气管内注射、滴注、喷雾施用和输注技术。胃肠外制剂可按照已知的方法，通过静脉内途径以单次快速推射(bolus)的形式或以持续输注(constant infusion)的形式施用或通过皮下途径施用。对于胃肠外使用公知的脂质载体包括无菌水、盐水、含水葡萄糖、糖溶液、乙醇、二醇类和油。对于全身性使用，可配制治疗性蛋白质以用于静脉内管线(intravenous line)或动脉管线(intravenous line)使用。可通过输注连续地或通过单次快速推注施用制剂。一些制剂包含缓释系统。在一个实施方案中，以贴剂方式施用制剂。用于口服施用的片剂和胶囊可包含常规赋形剂例如粘合剂、填料、润滑剂或湿润剂等。口服液体制剂可以以含水或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂、酏剂等形式存在，或可以以无水产品(使用时利用水或其它适当的载体重建)形式提供。适当的液体制剂可包含常规添加剂例如悬浮剂、乳化剂、非水性载体和防腐剂。

FXII抑制剂的剂量可取决于许多因素，例如适应症、制剂或施用模式，并且对于各适应症，可在临床前试验和临床试验中进行确定。可在医疗操作之前、期间和/或之后施用FXII抑制剂的剂量。在一个实施方案中，可在医疗操作之前和/或之后1、2、4、6、12、24、48、72或96小时内施用FXII抑制剂。可在医疗操作之前、期间和/或之后，以单次剂量或以多次剂量或以0.25、0.5、1、2、4、6、12、24、或48小时的间隔反复施用FXII抑制剂。由于具有不增加出血风险的有利性质，因此在一个实施方案中，在操作期间施用FXII抑制剂。可单独地或与其它治疗剂组合地施用药物组合物。这些药剂可共配制，或可将其作为单独的制剂同时或分开地、通过相同或不同的施用途径施用。FXII抑制剂的施用方案或剂量还可在具有相同适应症或不同适应症的患者个体间变化，这取决于例如其它治疗状况或疗法等因素。

IV.SBI的动物模型

本申请的一个方面涉及缺血的动物模型，该模型模拟可在至少一个目标器官中导致缺血性损伤的栓塞物的异质机制和来源。在一个实施方案中，动物模型包括操作，其中操作包括将至少一个栓塞物释放在动物的动脉系统中，这可导致至少一个目标器官的缺血性损伤，其中所述目标器官是脑、心脏、肾、肝和/或胃肠道器官(包括食管、胃、小肠和/或大肠(包括结肠和/或直肠)，和此外，如果目标器官是脑，则其中缺血性损伤表征为临床上无症状和/或栓塞物是非血栓可溶解性的。在一个实施方案中，目标器官是脑。在一个实施方案中，评价动物中临床上无症状的脑内缺血性损伤的指征。在某些实施方案中，动物也接受治疗剂候选物来测试治疗剂候选物减少目标器官内缺血性损伤的能力。术语“临床上无症状的”是如上定义的。在该实施方案中，临床上评估小鼠以评价脑中的缺血性损伤是否是“临床上无症状的”，即评估动物中与中风相关的急性、明显的行为或运动缺陷。中风的指标包括但不限于运动障碍、昏睡、紧握(grip)、四肢无力、眼睑下垂、步态障碍(gaitdisturbance)、转圈和打滚(rolling)。在施用栓塞物后不显示中风样症状的动物可能在脑中具有临床上无症状的缺血性损伤。

动物模型还包括评估动物脑内的缺血性损伤的指征。在一个实施方案中，评估包括成像。通过评价脑的图像，缺血性损伤的“指征”对于本领域技术人员来说是明显的。例如，导致组织损害的缺血性损伤在脑图像上明显地表现为组织外观的物理变化，或表现为脑区域中或周围的炎症、凝血或水肿。例如，弥散加权磁共振成像(DWI)可用于使缺血性损伤可视化，因为分子的扩散在受伤组织中和周围不同。

动物模型被认为是非治疗性模型，即其是用于评价栓塞物的临床影响的研究工具。在该模型中，在动物中有意地释放栓塞物，意在引起缺血，如果不采取其它步骤的话，这样的栓塞物将产生缺血性损伤。换句话说，动物的健康和身体状况未被操作改善，从而其不能被认为是治疗性的，也不能被认为是有益的手术操作。在评价过程中或在评价结束时处死动物。然而，在一个实施方案中，动物模型可用于评价治疗剂候选物治疗缺血的效力。在这类实施方案中，虽然治疗性候选物可能在动物模型中具有治疗性结果，但只是治疗性候选物而非动物模型被认为是治疗性的。

A.动物

动物模型的特征还在于所述动物可以是哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪或猴。例如，动物可以是小鼠或大鼠。动物可以是雄性的或雌性的以及可以是任何年龄。可使用的鼠品系的实例包括但不限于BALB/c、C57/BL6、C57/CL10J、CBA/J、DBA/J、FVB/J、C3H/HeJ、A/J、AKR/J、129S1/SvImJ、129X1/SvJ、NOD、SJL、TALLYJO/JngJ、MRL、NZW、亚系和杂交系。可使用的大鼠品系的实例包括但不限于CD、Wistar、Fisher、Sprague Dawley、BBDP、Long-Evans、Zucker、Hairless大鼠以及亚系和杂交系。

在一个实施方案中，所述动物或动物模型是被修饰的，例如经遗传修饰的动物或已以另一种方式例如通过操作或物质的施用改变的动物。遗传修饰动物可具有敲除或敲入的基因，或条件化敲除或敲入的基因。所述动物的特征还可以在于其可用作另一种疾病的模型。例如，动物可因遗传背景或者因接受诱导疾病或改变的病况(例如自身免疫疾病，例如在NOD小鼠中，或在MOG诱导的EAE中)的药剂或操作而对另一种疾病易感。使用动物模型在这样的修饰状态或疾病背景中研究SBI也可能会令人感兴趣。

B.栓塞物

在一个实施方案中，给动物施用非血栓可溶解性栓塞物以模拟至少一个可在医疗操作期间被引入的栓塞物。如本文中所用，术语“非血栓可溶解性的”是指不被溶栓性药物溶解的栓塞物(即栓塞物不由血液组成)。在此类实施方案中，操作释放并不是血栓的栓塞物。非血栓可溶解性栓塞物的实例包括但不限于气泡、油、脂肪、胆固醇和/或碎片，因为这类栓塞物不被溶栓药物溶解。

在一个实施方案中，栓塞物是模拟成像技术例如超声中使用的造影剂的微泡溶液。因此脑中的毛细血管和小动脉可以以弥散状分布而非局灶状分布的方式被阻塞。

在一个实施方案中，将微珠粒用于模拟不可溶解的栓塞物，其特征在于施用不导致明显的中风样症状。术语“微珠粒”包括微球体和其它微粒(例如在形状上不是均一球状的微粒)。在一个实施方案中，将微珠粒用于模拟非血栓可溶解性栓塞物。微珠粒的尺寸可以是例如20-200μm、25-100μm或30-50μm的任何尺寸。施用的微珠粒的量可以是500或1000或2000个微珠粒，包括500-600、500-700、500-800、500-900、500-1000以及500-2000个微珠粒的任何量。取决于动物的尺寸、微珠粒的类型和尺寸以及其它实验因素，微珠粒的数目可变化。微珠粒可由天然或合成材料制成，包括但不限于聚苯乙烯、聚乙烯或其它聚合物、胶乳、玻璃、陶瓷、金属、量子点或顺磁性材料。在一个实施方案中，微珠粒是荧光剂，其可允许示踪栓塞物材料。荧光染料包括但不限于香豆素、荧光素、罗丹明或藻红蛋白或者其缀合物。微珠粒可以被内部染色或缀合至荧光染料。使用微珠粒进行施用的一个有利方面是它们容易被标准化，其中微珠粒的尺寸和量可被定量并且施用的量可在多个动物间保持恒定。

在另一个实施方案中，将栓塞物给动物施用，其中栓塞物包括凝固血液。使用一些技术例如组织匀浆或超声处理可将凝固血液减小成小碎片。凝固血液的来源可来自接受施用的相同动物或来自相同品系或物种的动物或者来自与接受所述施用的动物不同的品系或物种的动物的血液。凝血可使用已知的凝血剂例如CaCl₂、凝血酶或人凝血酶来诱导。在一个实施方案中，例如通过使用造影剂或血池剂(blood pool agent)例如近红外线血池剂来使血液凝固血液产生荧光。

在另一个实施方案中，使用导管在动物的动脉系统中释放栓塞物。在另一个实施方案中，栓塞物因包括夹闭和/或手术的原因而被释放在动物的动脉系统中。

C.操作

在一个实施方案中，将至少一个栓塞物注射进入动物的动脉系统。可将栓塞物注射进入任何动脉，包括主动脉、主动脉弓、颈动脉、冠状动脉、头臂动脉、脊椎基底动脉循环、颅内动脉、肾动脉、肝动脉、肠系膜动脉和/或心脏颅侧的动脉系统的血管。

在一个实施方案中，将栓塞物注射进入颈动脉。在一个实施方案中，夹闭动脉。在某些实施方案中，环绕动脉例如颈动脉进行短暂结扎。在一个实施方案中，栓塞物可通过心内注射进行施用，但该方法具有严重的不利方面。在该实施方案中，栓塞物遍布整个动物，使得标准化更加困难，因为不清楚有多少栓塞物在脑中留存。此外，这种操作的死亡率很高，并且可能不清楚注射是否成功。在某些情况下，心内注射可能对于评价针对目标器官例如心脏、肾、肝和/或胃肠道器官包括食管、胃、小肠和/或大肠(包括结肠和/或直肠)的缺血是有用的。

在一个实施方案中，将管或导管用于施用栓塞物。导管可以是动脉导管。导管可由聚乙烯、聚氨酯或其它聚合物或材料制造。导管可具有适于注射的位置和动物尺寸的尺寸。导管可被改造来帮助栓塞物的注射，例如，可通过拉伸管道以手工获得适用于小型实验室动物的更窄、更细或更尖的导管来改造导管。在一个实施方案中，使用注射针，其中本领域技术人员可技术性地将栓塞物注射进入动物的动脉系统。

D.评价

在一些实施方案中，动物模型包括评价步骤。评价可包括体内或离体技术，例如成像和/或组织学技术。成像技术包括但不限于放射学或核医学，例如CT，包括SPECT-CT和/或FMT-CT；MRI，包括弥散加权磁共振成像(DWI)或fMRI；PET；光学成像，例如荧光反射成像；超声、显微镜检查、荧光检查、放射自显影术和/或磷成像。可进行组织学和/或染色技术，例如TTC染色、免疫组织化学和/或组织化学。

在一个实施方案中，可将动物模型与分子成像技术一起用于评价生理过程。例如炎症、血液凝固或可因栓塞物的释放而发生的补体活化。例如，参与目标生理学过程的分子可利用适合于成像模式的造影剂、放射性同位素或染料来标记。用于各种成像模式的染料和造影剂在上文中进行了描述，并且对于本领域技术人员来说是公知的。参见例如，Pysz MA等人65Clinical Radiology500-516,2010。

E.治疗剂候选物

在另一个实施方案中，动物模型可用于评价治疗SBI的治疗剂候选物。如短语“测试治疗剂候选物的减少脑中缺血性损伤的能力”中所用的，术语“减少……的能力”意欲理解为被测试的任何治疗剂候选物，其中测试治疗剂候选物的目的是评价其是否可减少缺血性损伤，即治疗剂候选物是否可限制或治疗SBI。因此，可在SBI的动物模型中施用测试治疗剂候选物，评价其减少脑中缺血性损伤的能力。评价可显示治疗剂候选物减少、增加脑内缺血性损伤或与所述脑内缺血性损伤相关的病况的量或不导致改变。

在一个实施方案中，在进行操作之前、期间和/或之后给动物施用治疗剂候选物。可以在整个测试过程中进行一次或多次评价。例如，可在进行操作或治疗剂候选物的施用之前、期间和/或之后进行体内成像。对照可包括不接受治疗剂候选物的动物，或可包括在进行操作或施用治疗剂候选物之前和之后给动物成像。

在动物模型的一个实施方案中，可在进行操作之前、期间和/或之后1、2、4、6、12、24、48、72或96小时或更长时间内施用治疗剂候选物。可在进行操作之前、期间和/或之后以单次剂量或以多份剂量施用，或以0.25、0.5、1、2、4、6、12、24或48小时或更长时间的间隔反复施用治疗剂候选物。在一个实施方案中，治疗剂候选物是FXII抑制剂。由于不增加出血风险的有利性质，可在进行操作期间和/或之前和/或之后施用FXII抑制剂。治疗剂候选物的剂量可取决于治疗剂候选物的性质，例如半衰期或毒性，或可取决于使用的动物的类型或尺寸，或所使用动物的状况，并且可能需要凭经验来确定。例如，在一个实施方案中，FXII抑制剂的剂量为1mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg或1-1000mg/kg或50-500mg/kg、或100-200mg/kg。可通过用于给动物施用治疗剂候选物的任何方法来将治疗剂候选物的剂量施用给动物。在一个实施方案中，全身性施用治疗剂候选物。在一个实施方案中，通过静脉内尾静脉注射施用治疗剂候选物。

在一个实施方案中，治疗剂候选物是抗体。抗体可以以全长Ig、Fab、F(ab)₂、Fv、scFv或其它形式或其变体的形式存在。抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体的特征可在于同种型是IgM、IgD、IgA、IgG或IgE或其变体。抗体可来自哺乳动物物种，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、山羊、仓鼠或猴。抗体可以是人源化的或CDR-移植的。抗体可被突变或修饰以改变免疫原性、半衰期或赋予与治疗性抗体相关的其它有利性质。在一个实施方案中，抗体抑制参与SBI的病理生理学的分子。在一个实施方案中，抗体是抗-FXII抗体。在该实施方案中，抗体可结合FXII(其中，“FXII”包括FXII和FXIIa)的重链或轻链上的表位，例如中和性表位。抗体对于与FXII的结合可以是高亲和力和/或高亲合性的。抗体可具有能够识别超过一个抗原的能力。抗体可缀合至多肽、核酸或小分子。

在另一个实施方案中，治疗剂是蛋白质、肽、核酸或小分子。术语“小分子”是指低分子量化合物。小分子可以例如低于1000道尔顿，从而允许扩散穿过细胞膜。小分子的特征可以在于其以高亲和力结合凝血途径的分子或FXII或参与SBI的病理生理学的分子。优选小分子是可从GI道再吸收的小分子。

通过下列不应当解释为限制性的实施例来进一步举例说明各实施方案。根据所公开的实施方案的说明书和实践，其它实施方案对于本领域技术人员来说是显而易见的。本申请中通篇引用的所有参考资料、专利和公布的专利申请的内容通过引用并入本文。

实施例

实施例1：Infestin-4和rHA-Infestin-4的产生

合成Infestin-4的互补DNA序列，并且在其5’位置延伸接头(Gly-Gly-Ser)₃的编码序列，随后插入pIRESpuro3(BD Biosciences,Heidelberg,Germany)的BamH1和NotI位点。利用正向引物5-GCGGCTAGCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCC-3(SEQ ID NO:8)和反向引物5-GCGGGATCCTCCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-3(SEQ ID NO:9)，通过PCR扩增白蛋白互补DNA。利用NheI和BamH1消化扩增子，将其插入Infestin-4载体的NheI/BamH1位点。将所得的能够表达由白蛋白-接头Infestin-4(rHA-Infestin-4)组成的融合蛋白的载体在大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)中扩增，使用标准方案(Qiagen,Hilden,Germany)进行纯化。利用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen)转染HEK-293细胞，将所述细胞在4μg/mL嘌呤霉素存在的情况下于无血清培养基(Invitrogen293Express)中生长。将转染的细胞群体在发酵罐中生长。收集上清液用于纯化所产生的融合蛋白。通过免疫亲和层析纯化rHA-Infestin-4。将发酵上清液过平衡的抗-白蛋白柱。利用甘氨酸缓冲液(pH2.5)洗脱产物。参见WO2008/098720；Hagedorn I等人117Circulation1153-1160,2010。

产生(His)₆-标记的Infestin-4构建体，发现其与rHA-Infestin-4构建体相比较具有更短的半衰期。参见WO2008/098720；Hagedorn I等人117Circulation1153-1160,2010。在POROS MC20上通过铜金属螯合层析纯化(His)₆-标记的Infestin-4。将发酵上清液过加载有硫酸铜的柱子，利用磷酸盐-氯化钠缓冲液(pH7.7)进行平衡。随后在咪唑梯度中洗脱(His)₆-标记的Infestin-4。

实施例2:SBI的动物模型

本申请提供了反映导致SBI的异质性机理的现实动物模型。在动物模型的一个实施方案中，可利用微珠粒诱导缺血性损伤，所述微珠粒模拟可因例如血管操作和手术造成的非血栓可溶解性栓塞物例如空气或脂肪。在动物模型的另一个实施方案中，缺血性损伤可以由可能因凝血级联的扰乱或血管壁损伤而引起的凝固血液所诱导。

全部实验在获自Charles River Laboratories,Inc.(Wilmington,MA)的成年Balb/c小鼠(25-30g；n=24)中进行。机构伦理委员会批准了全部动物实验。在进行操作期间和之后在生理学上监测动物。在异氟烷室中通过以2L/分钟吸入补充氧来利用2%异氟烷麻醉小鼠，随后将其以仰卧位转移至温暖的加热垫上，同时保持在异氟烷下。使用下述操作，将微珠粒或离体形成的凝固血液在一侧逆行性地通过颈外动脉注射进入颈内动脉，同时短暂结扎颈总动脉以迫使栓塞物进入脑的动脉系统而不减弱灌注。

A.操作

在麻醉动物后，剃除颈部毛发，施加奈尔脱毛膏(Nair)以使完全除去毛发。随后用异丙醇擦拭颈部，利用灭菌纱布覆盖颈部。对颈部产生纵形切口，将暴露的腮腺移至一旁。鉴别和分离颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。10-0Ethicon尼龙缝线(Johnson&Johnson,Brussels,Belgium)用于所有动脉结扎术。将两根10-0缝线环绕颈外动脉系缚，一根环绕颈内动脉，一根环绕颈总动脉。随后将环绕颈外动脉的两根缝线打结，随后在其间切割动脉。此时，对照组中的小鼠(其仅接受颈外动脉的结扎)不进行进一步干预以确保操作的该部分不会导致任何脑损伤。随后将环绕颈总动脉和颈内动脉打结，进行短暂结扎。将改进的Intramedic聚乙烯PE10导管(I.D.0.28mm,I.D.0.61mm,Becton Dickinson andCompany,Sparks,MD)插入颈外动脉的近端开口端，随后原位缝合。导管是标准PE10导管，其通过轻轻施加牵引力和手工拉伸管(以获得略微更窄的腔和直径)来进行改进。随后释放颈内动脉上的结扎，从而允许仅流至颈内动脉进入供应脑的动脉系统。观察到动脉血向导管的闪回(Flashback)，随后注射制备的微珠粒或凝固的血液(图4)。

对于荧光珠粒，已测定约500个珠粒的颈内动脉注射会导致可重现的临床上无症状的微小病变。将装载有约500个Fluoresbrite^TM Plain YG45微球体(Polysciences,Inc.,Warrington,PA,直径42.58±0.8μm,最大激发=441nm,最大发射=486nm)的注射器连接至导管，进行注射(图4A+D)。

对于荧光凝固血液，经心脏穿刺从供体小鼠抽取500μL的新鲜异源小鼠血液，随后立即添加至柠檬酸钠溶液以进行初始抗凝(终浓度，0.32%)。将20μmol CaCl₂添加至血浆，随后添加10个单位的高活性人凝血酶以诱导凝血(

EMD Chemicals,Inc.,Darmstadt,Germany,MW37,000,100单位/mL,比活性2800NIH单位/mg蛋白质)。让血液在室温凝固1小时后，添加2nmol Genhance680TM(一种近红外血池剂)(VisEn Medical,Bedford,MA)以在4℃温育72小时。这允许对凝固血液进行荧光染色以备通过荧光成像进行随后的离体检测。该时间段允许凝固血液收缩和稳定化。当准备使用时，取下凝固血液，利用生理盐水进行洗涤。将250μL生理盐水添加至凝固的血液，随后使用组织匀浆器将凝固血液减小成小颗粒(图4B)。随后将10μL的该荧光微栓塞物溶液抽入注射器，进行注射。

在注射微珠粒或凝固血液后，取出导管，拉紧一直原位保持导管的缝线以封闭颈外动脉。随后重新打开颈内动脉和颈总动脉上的结扎以恢复至脑的血流，将腮腺复位，用7-0尼龙缝线缝合皮肤。将动物送回其笼内，让其恢复。

在从麻醉恢复后，评估小鼠的明显行为和运动缺陷。观察每一只动物的运动障碍、昏睡、握紧、四肢无力、眼睑下垂、步态障碍、打圈和打滚。观察到任何上述症状被认为是中风的标志，而缺乏上述症状表示未发生明显的中风，与SBI的可能性一致。如果不存在中风症状，则将小鼠用于SBI的进一步评价。否则排除小鼠用于SBI的进一步评价并且将其处死。

B.处理组

在优化SBI模型后，研究4个组群(n=5-7/组)：利用凝固血液或微珠粒诱导SBI的小鼠(未处理的对照)，和其中利用200mg/kg剂量的rHA-Infestin-4经静脉内尾静脉注射处理小鼠的另外两个组。小鼠在SBI诱导后立即接受它们的第一次注射。在SBI后3小时进行FXIII活性的单光子发射计算机断层摄影术-计算机断层摄影术(SPECT-CT)成像。在SBI后3天利用MRI成像的组群每天接受注射，直至并且包括损伤后第3天。SBI后3天评估氯化三苯基四唑

(TTC)染色。

C.MRI

利用MRI(髓过氧化物酶(MPO)-Gd,第3天)评估炎症。使用Bruker4.7T扫描仪，通过RARE T1扫描(TR:1500ms,TE:8.48ms,Avg:8,矩阵(Matrix):192x192x22,体素(Voxel Size):0.133mm x0.13mmx0.5mm)、具有相同几何形状(TR:5622.893,TE:20ms,Avg:4)的RARET2和使用EPI扩散加权顺序，利用6个扩散方向的弥散加权成像(DWI)(TR:4800ms,TE:32ms,矩阵:128x128x22,体素:0.195mmx0.195mm x0.5mm)进行MRI。

在静脉内施用0.3mmol/kg于10%DMSO中稀释的髓过氧化物酶-钆造影剂之前扫描小鼠以及在所述施用后每15分钟(直至90分钟)扫描小鼠。随后处死小鼠，灌注小鼠，收集脑，切片以在OV-100显微镜(Olympus)上进行荧光成像来验证SBI存在。

为了进行数据分析，使用Amira软件(Visage Imaging,San Diego,CA)。在注射T1扫描后90分钟的每一张图像切面上鉴定到目标区域(ROI)。在MPO阳性区域的自动化分割之前单个地排除脑室，由委员会认证的放射科医生确定该分割。利用为平均正常脑本底信号1.25倍的信号强度自动地鉴定MPO阳性体素。将信号幅值除以来自小鼠体外的ROI的噪声的标准差来计算MPO阳性体素的对比噪声比(CNR)。以相似的方式分割T2图像以进行3D显影。

D.SPECT-CT

利用SPECT-CT(FXIII-Ind,3小时)评估凝血。各组小鼠在注射约1mCi的用铟-111标记的FXIII-底物肽(实际注射量为731-1273μCi)之前1小时经历SBI诱导和处理。注射后2小时，使用Gamma Medica-IdeasX-SPECT小型动物成像系统进行SPECT-CT。使用锥形束(50kVp,500mA)x射线管，利用固态CMOS检测器对256个投影进行CT扫描。使用改良的费尔德坎普重建算法(modified feldkamp reconstruction algorithm)重建这些投影。SPECT扫描使用具有以90s/投影通过64个投影(每一个照相机32个投影)的1mm中等能量针孔瞄准器的双γ照相机。使用有序亚组期望最大算法(ordered subsets expectation maximizationalgorithm，OSEM)重建SPECT图像，将其与CT图相融合以进行分子信息的准确解剖学共定位。

在SPECT-CT成像后立即处死动物，采集血液样品。利用20ml盐水灌注动物。采集肌肉样品；切取脑，连同血液样品一起，在WallacWizard1480γ进式计数器进行计数。随后将脑切成2mm的切片，在Olympus Biosystems OV-100荧光扫描仪上进行成像。将脑切片的两侧进行成像。随后，将切片置于磷屏成像仪(phosphorimager)板上过夜以进行放射自显影。在Molecular Dynamics Typhoon磷屏成像仪平板读数器上对板读数。

为了进行SPECT-CT数据分析，使用Amira软件手工地从CT图像分割脑和肌肉，以计算脑对肌肉的目标本底比值(TBR)。将数据针对脑的质量和每只动物的注射剂量进行标准化。对放射自显影、γ计数和SPECT数据进行衰减修正。使用Osirix软件(Pixmeo,Geneva,Switzerland)重建SPECT-CT数据的3D可视化显影。

E.离体评估

在MRI和SPECT-CT成像研究完成后，处死动物，取出脑。

如果小鼠是SPECT-CT亚组的部分，则首先通过闪烁计数测量脑的总放射活性。随后使用小鼠脑切片机(Zivic Instruments,Pittsburgh,PA)将新鲜脑切成2mm厚的冠状缝切片。随后立即用OV-100^TM小型动物成像系统(Olympus,Center Valley,PA)(平面反射荧光成像系统与高倍显微镜的混合体)对全部脑进行成像。脑切片使用亮视野来成像，GFP荧光通道(激发400nm，发射508nm)用于微珠粒，近红外线通道用于荧光凝固血液(发射680nm)，使用达到16倍的放大倍数。取决于选择的分辨率、波长和放大倍数，图像采集时间在每图像帧5ms与60秒之间的范围内。也使用数码相机获得白光图像以评估由损伤引起的潜在出血。对于SPECT-CT研究中的小鼠，则将脑切片置于磷屏成像仪上进行过夜。

如果小鼠为MRI亚组的部分，则将脑切片置于PBS中的1%TTC溶液中，在37℃进行30分钟。随后用PBS洗涤脑切片3次，每次1分钟。随后使用数码相机(Olympus FE-280)对脑成像以评估TTC染色。活的脑组织被TTC染成红色，而梗死区域不染色。对于用于免疫组织化学(IHC)的小鼠，中央脑切片被TTC染色，而邻近切片被包埋用于IHC。

为了进行进一步组织学分析，将脑组织的相邻切片包埋在O.C.T.化合物(Sakura Finetek,Torrance,CA)中，切取一系列5μm的冷冻切片。将抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶法用于IHC，利用FXIII抗体：C-20(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)，随后利用生物素化的抗-山羊IgG二抗(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)温育组织切片。利用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)底物(DakoCytomation,Carpinteria,CA)使反应可视化，利用Harris苏木素溶液对所有切片进行复染色。将载片在400倍放大率下自动地进行数字化，使用NanozoomerHT1.0(Hamamatsu,Japan)捕获图像。

结果表达为平均值+SEM。利用Student’s t检验评价两个组之间的统计学比较，利用ANOVA进行修正以进行多重比较。p<0.05的值被认为表示统计显著性。在给出P值的整个实施例中使用相同的统计学分析。

两个模型都产生了可导致临床上无症状的脑缺血症(图5)的小血管内脑血管闭塞(图4D+E)。

如TTC染色所评估的，两个模型都产生占总脑(如通过TTC染色评估的)不到5%的小梗死(图5)。微珠粒法相较于凝固血液模型产生略微更多的组织损害。主要在注射侧观察到病损。

实施例3:利用rHA-Infestin-4治疗SBI

在用rHA-Infestin-4处理后，两个SBI模型中的小鼠都经历显著更少的微梗死，梗死减少超过50%（如通过TTC染色检测到的）。相较于微珠粒模型的梗死面积(54%的减少，图5A)，在凝固血液模型中梗死面积(66%的减少，图5B)减少略微更多。微珠粒模型模拟来自不直接影响凝血途径的物质的栓塞物；然而rHA-Infestin-4也减少该模型内的梗死面积。

在两个SBI模型中都发现微出血的相对频繁的证据，在微珠粒模型中有6/8(75%)的小鼠，在血栓栓塞模型中有5/9(56%)的小鼠(图6)。然而，在施用rHA-Infestin-4后，在两个模型中都未发现增加频率的微出血。事实上，在凝固血液模型中可能存在降低的微出血率(只有1/8的动物具有微出血，图6，右下)。

有趣地，与先前对中风的研究(Kleinschnitz C等人,J Exp Med.,203:513-518,2006；Hagedorn I等人Circulation,121:1510-1517,2010)类似，在SBI中也未发现增加的出血频率，在rHA-Infestin-4处理后，在凝固血液模型中具有更低的出血率。虽然该更低的比率需要被确认和进一步研究，但其表明rHA-Infestin-4可能减少由凝固血液引起的血管损伤。此外，其具有临床相关性，因为由于一般抗凝疗法通常具有增加的出血风险，所以其意味着对于不期望副作用的有利模式。在我们目前研究中情况并非如此。

实施例4:rHA-Infestin-4减弱SBI中FXIII活性

为了评估rHA-Infestin-4对凝血级联的影响，评价FXIII的活性，所述FXIII的活性位于FXII的下游并且受其影响，负责交联血纤蛋白凝块。在SBI诱导后的急性期过程中使用FXIII特异性探针FXIII-Ind进行体内SPECT-CT成像(Tung CH等人4Chembiochem.897-899,2003；Nahrendorf M等人113Circulation1196-1202,2006)。在凝固血液(图7)和微珠粒(图8)模型中，在rHA-Infestin-4施用后，FXIII活性的量显著下降。对离体脑样本的放射自显影实验(图7和8，中间图框)确认了这一点。FXIII活性减少的总体程度良好地显现在3D融合图像(图7和8，左图框)上。与梗死减少的程度相似，相较于微珠粒模型，在凝固血液模型中存在更显著的FXIII活性降低。体内成像结果通过FXIII的免疫组织化学染色得到确认(图9)。

有趣地指出，微珠型模型引起了升高的因子XIII/凝血活性，其可通过施用rHA-Infestin-4来降低。这表明微珠粒栓塞物形成引起血纤蛋白凝块形成，并且因组织损伤而诱导继发性凝血，这可引起受累血管的进一步损害和阻塞。事实上，我们在组织病理学上发现，在未处理的对照小鼠的受损脑区域中存在增加的FXIII含量(图9)。有趣地，相较于凝固血液模型，微珠粒模型导致更多的损伤和出血面积。可推测微珠粒模型大致上是永久性模型，其加重了病理效应，而注射的凝固血液可经历(部分)溶栓，从而导致不太严重的结果。然而，在两个模型中观察到的这种继发性凝块形成能够被rHA-Infestin-4显著减少，从而限制所使用的栓塞物质的损害。

实施例5:rHA-Infestin-4在SBI后不改变脑内髓过氧化酶活性

髓过氧化物酶(MPO)是在炎症过程中由许多促炎性髓样细胞例如中性粒细胞、Ly6C^hi单核细胞和活化巨噬细胞与小神经胶质细胞的亚组分泌的最丰富的酶，因此是炎症反应的适当的成像生物标志物。为了评估MPO活性，在SBI后3天，使用探针MPO-Gd(Chen JW等人240Radiology473-481,2006；Querol M等人4Org Biomol Chem.1887-1895,2006)进行体内MRI，所述探针对于MPO活性是高度特异性的和灵敏性的(Rodriguez E等人132J.Am.Chem.Soc.168-177,2010；Ronald JA等人120Circulation592-599,2009；Chen JW等人131Brain1123-1133,2008；Breckwoldt MO等人105PNAS18584-18589,2008；Nahrendorf M等人117Circulation1153-1160,2008)。

相较于梗死区域，存在更多的影响更大容积的弥散性MPO活性，如通过两个模型内的T2-加权成像(图10和11，左图图框，注意：相较于蓝色(T2高强度病灶)病损存在更多的橙色(MPO+区域)，和右上图框，显示T2标准化的MPO+区域大于一致水平)报告的。当与凝固血液模型(CNR,珠粒：36±1，凝块：23±2,p<0.05)相比较时，微珠粒模型诱导更大的MPO活性和更大的损伤(脑中T2+体素的数目，珠粒：3162±1435，凝块：548±207；p=0.05)。

在施用rHA-Infestin-4后，两种SBI模型中MPO+损伤的标准化面积和所有MPO+损伤的平均CNR没有显著的变化，这表明rHA-Infestin-4不影响MPO活性，从而不影响髓样细胞活性。因此，尽管从FXII的功能推断可能有抗炎作用，但rHA-Infestin-4在SBI诱导后第3天不改变每损伤的MPO活性量。第3天被选择用来评价MPO活性和炎症，因为发现该时间点是中风模型中最大MPO活性的时间点(Breckwoldt MO等人105PNAS18584-18589,2008)。因此，炎症级联的其它部分可能受rHA-Infestin-4影响，这未在第3天的MPO活性上得到反映(BreckwoldtMO等人105PNAS18584-18589,2008)。牵涉脑缺血症的大部分炎症细胞是髓性细胞，因此，即使其它因子也受rHA-Infestin-4影响，但作用可能较小。

FXII抑制剂rHA-Infestin-4可用于治疗与各种类型的导致SBI的栓塞物相关的缺血性损伤，而不会增加患者或动物的出血风险。此外，所述动物模型和成像方法可用作研究SBI的病理生理学背后的机制以及评价和监测治疗剂候选物的工具。

Claims

1.因子XII(FXII)抑制剂用于预防和/或治疗接受医疗操作的患者的缺血的用途，其中所述医疗操作包括与如下至少一种的接触：

(a)心脏，

(b)至少一种选自下述的血管：主动脉、主动脉弓、颈动脉、冠状动脉、头臂动脉、脊椎基底动脉循环、颅内动脉、肾动脉、肝动脉、肠系膜动脉，和/或靠近心脏的动脉系统的血管，

(c)静脉血管，如果患者具有已知的中隔缺损的话；

其中所述医疗操作包括在体内所述血管的至少一种血管中释放至少一个栓塞物，所述栓塞物可在至少一个目标器官中导致所述缺血，并且其中在所述医疗操作之前、期间和/或之后施用所述FXII抑制剂。

2.权利要求1的FXII抑制剂的用途，其中所述栓塞物由气泡、油、脂肪、胆固醇、凝固的血液和/或碎片组成。

3.根据权利要求1和2的因子XII抑制剂的用途，其中所述目标器官是：

(a)脑，并且其中所述患者患有、已患有如下疾病或处于患所述疾病的风险中:

(i)无症状性脑缺血，或

(ii)由非血栓可溶解性物质引起的中风；

和/或

(b)心脏、肾、肝；和/或胃肠道器官。

4.根据权利要求1至3的任一项的因子XII抑制剂的用途，其中所述医疗操作包括与至少一种或多种所述血管的内侧的接触。

5.根据权利要求1至4的任一项的因子XII抑制剂的用途，其中所述医疗操作包括对至少一种或多种所述血管的夹闭。

6.根据权利要求1至5的任一项的因子XII抑制剂的用途，其中所述医疗操作是包括导管、支架、气囊、移植物和/或施用造影剂中任一项或多项的血管操作。

7.根据权利要求1至6的任一项的因子XII抑制剂的用途，其中所述医疗操作是血管外科手术和/或为诊断性的血管操作。

8.根据权利要求1至7的任一项的因子XII抑制剂的用途，其中所述医疗操作是冠状血管造影术、颈动脉支架安装、经皮冠状动脉介入疗法、颈动脉内膜剥离术、心血管手术或狭窄肾动脉的扩张术。

9.根据权利要求1至8的任一项的因子XII抑制剂的用途，其中所述FXII抑制剂包括：

和/或

(ii)SPINK-1(SEQ ID NO:2)，其被突变而包括野生型Infestin-4序列N末端氨基酸2-13，或所述突变的SPINK-1的变体，其中变体包含

a)野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13和所述N末端氨基酸之外的至少一个和多达5个氨基酸突变，所述突变导致与野生型SPINK-1序列的差异并且增加变体与野生型Infestin-4序列的同源性；

和/或

b)来自野生型SPINK-1序列的6个保守半胱氨酸残基和与野生型SPINK-1序列有至少70%的同源性；

(iii)AT III、血管紧张素转换酶抑制剂、C1抑制剂、抑肽酶、α-1蛋白酶抑制剂、抗蛋白酶素([(S)-1羧基-2-苯乙基]-氨甲酰基-L-Arg-L-Val-Arginal)、Z-Pro-Pro-醛-二甲基乙酸酯、DX88、亮抑酶肽、脯氨酰寡肽酶的抑制剂例如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米-胰蛋白酶抑制剂、牛胰胰蛋白酶抑制剂的突变体、大肠杆菌素、YAP(黄鳍金枪鱼抗凝血剂蛋白)、笋瓜胰蛋白酶抑制剂-V、笋瓜同效抑制剂和/或Pro-Phe-Arg-氯甲基-酮(PCK)；

10.根据权利要求9的因子XII抑制剂的用途，其中所述突变的SPINK-1的变体为SPINK K1、K2或K3(SEQ ID NO:3、4或5)。

11.根据权利要求1至9的任一项的因子XII抑制剂的应用，其中所述FXII抑制剂连接了增加半衰期的多肽，其中所述增加半衰期的肽任选地是白蛋白、afamin、甲胎蛋白或维生素D结合蛋白、人白蛋白或其变体、免疫球蛋白或其变体、IgG的Fc。

12.根据权利要求11的因子XII抑制剂的用途，其中所述增加半衰期的多肽通过接头连接至FXII抑制剂。

13.根据权利要求12的因子XII抑制剂的用途，其中所述接头是

(i)可切割的；

(ii)可被内源性、外源性或共同的凝血途径的凝血蛋白酶切割的；

(iii)可被FXIIa切割的。

14.缺血症的动物模型用于评价候选治疗剂治疗缺血的用途，其中测试所述候选治疗剂减少目标器官中缺血性损伤的能力，其中所述动物模型包括

(a)操作，其中所述操作包括将至少一个栓塞物释放在动脉系统中，这可导致至少一个目标器官的缺血性损伤，

(ii)如果所述目标器官是脑，则其中所述缺血性损伤在临床上是无症状的和/或所述栓塞物由非血栓可溶解性物质组成；

和

(b)评价所述动物的目标器官中缺血性损伤的指征。

15.权利要求14的动物模型，其中所述目标器官是脑。

16.成像方法用于评价用于开发FXII抑制剂的动物的目标器官中缺血性损伤的用途，其中所述成像方法包括磁共振成像和/或SPECT成像，并且其中在施用FXII抑制剂之前和/或之后进行所述成像方法。

17.权利要求16的成像法的用途，其中所述目标器官是脑。