CN111543384B - 一种全肝缺血诱发缺血再灌注损伤的动物模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全肝缺血诱发缺血再灌注损伤的动物模型的构建方法。本发明所述动物模型设计合理、操作简单、重复性好，符合大鼠原味肝移植无肝期血流改变，术后存活率高。同时在结束后经病理分析，可导致肝外多器官(心脏、胰腺、结肠、小肠、肾脏)损伤。能有效解决现有研究目标必须完整复制肝移植过程，时间久、死亡率高、人员技术要求高等问题。同时可延伸到其他需阻断肝脏血流造成肝外器官缺血再灌注损伤的基础研究。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型构建技术领域，具体是指置一种全肝缺血诱发缺血再灌注损伤的动物模型的构建方法。
背景技术
肝移植技术是治疗终末期肝病的唯一手段，有效的肝移植能成功提高终末期肝病患者的存活率，改善预后，提高患者生活质量。但肝移植后的腹腔内感染、缺血再灌注损伤等肝外并发症严重制约移植的成功率，影响患者住院时间、住院费用及预后。目前虽然肝移植技术已经成熟，但是在术后肝外器官的并发症的防治方面仍存在诸多问题。肝移植后肝外器官缺血再灌注损伤的机制研究尚不清楚，其中移植过程中的无肝期血流动力学急剧变化，是导致肝移植后肝外器官缺血再灌注损伤的重要原因。目前临床上要求尽可能缩短无肝期，以保证肝外器官的血流稳定，减少缺血再灌注损伤。
目前对于大鼠肝移植的模型，多采用二袖套法，以及在此基础上的改良。而目前研究肝移植肝外器官缺血再灌注损伤的方法，多基于该模型。但使用该模型不仅练习耗时久，技术要求高，而且需要解剖显微镜的硬件支持。此外肝外器官的损害意味着模型高死亡率，不利于后续的研究。除此以外肝脏外伤及肝脏肿瘤手术，有时也需要夹闭肝脏血流，造成肝外器官缺血再灌注损伤，故此也需要动物模型建立，对缺血再灌注损伤进行基础研究。
因此，一种用于研究大鼠全肝缺血无肝期血流动力学变化诱发肝外器官缺血再灌注损伤动物模型亟待研究解决。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种全肝缺血诱发缺血再灌注损伤的动物模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)：选取在室温25±2℃、湿度50±10％的情况下饲养的重量为200～250g的SPF级大鼠，在构建模型前24小时禁食，但不禁水；
(2)：对大鼠称重选取体质量相同的大鼠，对大鼠进行异氟醚吸入麻醉并腹部消毒；
(3)：在大鼠剑突下正中切口3cm左右打开大鼠腹腔，拉钩暴露肝脏，游离肝胃韧带，用纱布包裹住肝中叶，将肝脏上翻，暴露肝门部的操作视野；
(4)：游离胆管、门静脉及肝动脉，将小肠推向左下腹腔，并用湿纱布覆盖暴露的肝、胃及肠道，游离肝下下腔静脉至右肾静脉水平；
(5)：切开大鼠下肢皮肤，暴露股静脉，经股静脉缓慢推注低分子肝素625IU/Kg，全身肝素化；
(6)：用3-0号丝线结扎门静脉、肝动脉及右肾静脉上下腔静脉并持续0～60min，在此期间减少吸入麻醉；
(7)：结扎结束后松开门静脉、肝动脉及右肾静脉上下腔静脉，逐层缝合大鼠肌肉层、皮肤层，缝合完毕后停止吸入麻醉；
(8)：结束后，大鼠麻醉清醒后在室温25±2℃、湿度50±10％的情况下继续饲养，观察大鼠的生存情况。
作为改进，所述步骤(6)中用3-0号丝线结扎门静脉、肝动脉及右肾静脉上下腔静脉持续时间为45min。
采用以上方法后，本发明具有如下优点：本发明设计合理、操作简单、重复性好，符合大鼠原位肝移植无肝期血流改变，术后存活率高。同时在术后经病理分析，可导致肝外多器官(心脏、胰腺、结肠、小肠、肾脏)损伤。能有效解决现有研究目标必须完整复制肝移植过程，时间久、死亡率高、人员技术要求高等问题。
附图说明
图1是本发明一种全肝缺血诱发缺血再灌注损伤的动物模型的构建方法大鼠术后肺HE染色对比图。
图2是本发明一种全肝缺血诱发缺血再灌注损伤的动物模型的构建方法大鼠术后肾HE染色对比图。
图3是本发明一种全肝缺血诱发缺血再灌注损伤的动物模型的构建方法大鼠术后结肠HE染色对比图。
图4是本发明一种全肝缺血诱发缺血再灌注损伤的动物模型的构建方法大鼠术后小肠HE染色对比图。
图5是本发明一种全肝缺血诱发缺血再灌注损伤的动物模型的构建方法大鼠术后胰腺HE染色对比图。
图6是本发明一种全肝缺血诱发缺血再灌注损伤的动物模型的构建方法大鼠术后心脏HE染色对比图。
图7是本发明一种全肝缺血诱发缺血再灌注损伤的动物模型的构建方法大鼠术中血压变化对比图。
图8是本发明一种全肝缺血诱发缺血再灌注损伤的动物模型的构建方法大鼠术中后心率变化对比图。
如图所示：A:假手术组，B:缺血组，C：再灌注6h组D：再灌注12h组E：再灌注24h组F：再灌注48h组G：再灌注72h组H：再灌注7d组I：再灌注14d组。
具体实施方式
实施例一：大鼠对无肝期血流动力学变化的最大耐受时间
1、实验材料：重量为200-250g的SPF级大鼠、异氟醚、低分子肝素、3-0号丝线、眼科剪，眼科镊、拉钩等；
2、制备方法：(1)：选取在室温25±2℃、湿度50±10％的情况下饲养的重量为200～250g的SPF级大鼠，在构建模型前24小时禁食，但不禁水；
(2)：对大鼠称重选取体质量相同的大鼠50只，分为假手术组、缺血15min组、缺血30min组、缺血45min组、缺血60min组共计五组，每组10只，对大鼠进行异氟醚吸入麻醉并腹部消毒；
(3)：在大鼠剑突下正中切口3cm左右打开大鼠腹腔，拉钩暴露肝脏，游离肝胃韧带，用纱布包裹住肝中叶，将肝脏上翻，暴露肝门部的操作视野；
(4)：游离胆管、门静脉及肝动脉，将小肠推向左下腹腔，并用湿纱布覆盖暴露的肝、胃及肠道，游离肝下下腔静脉至右肾静脉水平；
(5)：切开大鼠下肢皮肤，暴露股静脉，经股静脉缓慢推注低分子肝素625IU/Kg，全身肝素化；
(6)：对假手术组解剖肝门部结构后不予处理，对缺血15min组、缺血30min组、缺血45min组、缺血60min组共计五组的大鼠分别用3-0号丝线结扎门静脉、肝动脉及右肾静脉上下腔静脉并持续15min、30min、45min、60min，在此期间减少吸入麻醉；
(7)：结扎结束后松开门静脉、肝动脉及右肾静脉上下腔静脉，逐层缝合大鼠肌肉层、皮肤层，缝合完毕后停止吸入麻醉；
(8)：结束后，大鼠麻醉清醒后在室温25±2℃、湿度50±10％的情况下继续饲养，观察大鼠的生存情况。
表1：大鼠对无肝期的耐受时间(观察时间14天)
与假手术组相比，具有统计学意义。
通过上表缺血组与假手术组的对比，充分的显示了大鼠对无肝期最大耐受时间为45min左右。
实施例二：模拟大鼠无肝期血流动力学变化
1、实验材料：实验材料：重量为200-250g的SPF级大鼠、异氟醚、低分子肝素、3-0号丝线、眼科剪，眼科镊、拉钩等；
2、制备方法：(1)：选取在室温25±2℃、湿度50±10％的情况下饲养的重量为200～250g的SPF级大鼠，在构建模型前24小时禁食，但不禁水；
(2)：对大鼠称重选取体质量相同的大鼠90只，分为假手术组、缺血组、再灌注6h组、再灌注12h组、再灌注24h组、再灌注48h组、再灌注72h组、再灌注7d组、再灌注14d组共计九组，每组10只，对大鼠进行异氟醚吸入麻醉并腹部消毒；
(3)：在大鼠剑突下正中切口3cm左右打开大鼠腹腔，拉钩暴露肝脏，游离肝胃韧带，用纱布包裹住肝中叶，将肝脏上翻，暴露肝门部的操作视野；
(4)：游离胆管、门静脉及肝动脉，将小肠推向左下腹腔，并用湿纱布覆盖暴露的肝、胃及肠道，游离肝下下腔静脉至右肾静脉水平；
(5)：切开大鼠下肢皮肤，暴露股静脉，经股静脉缓慢推注低分子肝素625IU/Kg，全身肝素化；
(6):利用BL-420F生物机能实验系统记录各组大鼠有创动脉(右颈动脉置管)心电图；
(7)：分别对假手术组、缺血组、再灌注6h组、再灌注12h组、再灌注24h组、再灌注48h组、再灌注72h组、再灌注3d组、再灌注7d组九组大鼠用3-0号丝线结扎门静脉、肝动脉及右肾静脉上下腔静脉持续0min、45min、45min、45min、45min、45min、45min、45min、45min，在此期间减少吸入麻醉；
(7)：结扎结束后松开门静脉、肝动脉及右肾静脉上下腔静脉，逐层缝合大鼠肌肉层、皮肤层，缝合完毕后停止吸入麻醉；
(8)：记录操作全程大鼠有创血压、心电图变化(详见附图7和附图8)；
(8)：结束后，大鼠麻醉清醒后在室温25±2℃、湿度50±10％的情况下继续饲养，并分别对假手术组、缺血组、再灌注6h组、再灌注12h组、再灌注24h组、再灌注24h组、再灌注48h组、再灌注72h组、再灌注3d组、再灌注7d组九组大鼠间隔0h、0h、6h、12h、24h、48h、72h、3d、7d进行再灌注血，观察大鼠的生存情况。
实施例三：模拟大鼠无肝期血流动力学变化诱发肝外器官缺血再灌注损伤的影响
1、实验材料：重量为200-250g的SPF级大鼠、异氟醚、低分子肝素、3-0号丝线、眼科剪，眼科镊、拉钩等；
2、制备方法：
(1)：选取在室温25±2℃、湿度50±10％的情况下饲养的重量为200～250g的SPF级大鼠，在构建模型前24小时禁食，但不禁水；
(2)：对大鼠称重选取体质量相同的大鼠90只，分为假手术组、缺血组、再灌注6h组、再灌注12h组、再灌注24h组、再灌注48h组、再灌注72h组、再灌注7d组、再灌注14d组共计九组，每组10只，对大鼠进行异氟醚吸入麻醉并腹部消毒；
(3)：在大鼠剑突下正中切口3cm左右打开大鼠腹腔，拉钩暴露肝脏，游离肝胃韧带，用纱布包裹住肝中叶，将肝脏上翻，暴露肝门部的操作视野；
(4)：游离胆管、门静脉及肝动脉，将小肠推向左下腹腔，并用湿纱布覆盖暴露的肝、胃及肠道，游离肝下下腔静脉至右肾静脉水平；
(5)：切开大鼠下肢皮肤，暴露股静脉，经股静脉缓慢推注低分子肝素625IU/Kg，全身肝素化；
(6)：分别对假手术组、缺血组、再灌注6h组、再灌注12h组、再灌注24h组、再灌注24h组、再灌注48h组、再灌注72h组、再灌注3d组、再灌注7d组九组大鼠用3-0号丝线结扎门静脉、肝动脉及右肾静脉上下腔静脉持续0min、45min、45min、45min、45min、45min、45min、45min、45min，在此期间减少吸入麻醉；
(7)：结扎结束后松开门静脉、肝动脉及右肾静脉上下腔静脉，逐层缝合大鼠肌肉层、皮肤层，缝合完毕后停止吸入麻醉；
(8)：结束后，大鼠麻醉清醒后在室温25±2℃、湿度50±10％的情况下继续饲养，并分别对假手术组、缺血组、再灌注6h组、再灌注12h组、再灌注24h组、再灌注48h组、再灌注72h组、再灌注7d组、再灌注14d组九组大鼠间隔0h、0h、6h、12h、24h、48h、72h、7d、14d进行再灌注血，观察大鼠的生存情况。
3、分别选取动大鼠物肺、肾、结肠及小肠、胰腺、心脏组织，浸泡于4％多聚甲醛溶液内固定24小时。
(1)固定组织切割
将组织从固定液中取出，在通风橱内用手术刀进行切割，组织厚度3mm左右。将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
(2)组织脱水
将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I1h-蜡II 1h-蜡III 1h。(脱水机完成，若不同组织的程序不同，应注明不同组织的程序)
(3)组织石蜡包埋
将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出放入包埋框并贴上对应的标签。包埋好的蜡块置于-20°冻台上冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
(4)石蜡切片
将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
(5)石蜡切片脱蜡至水
依次将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。
(6)苏木素染细胞核
切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。
(7)伊红染细胞质
切片入伊红染液中染色1-3min。
(8)切片脱水封片
将切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
(9)染色后切片镜检
将染色封固后的切片至于正置白光显微镜下镜检染色质量，以细胞核蓝色，细胞浆红色，红色与蓝色对比清晰作为染色合格标准。
经HE染色光学显微镜下观察分别显示下列变化：
肺：结束后6小时大鼠逐渐出现肺泡壁炎性细胞浸润，肺泡壁增厚；结束后24-48小时可出现肺泡内出血、肺泡壁重度增厚，炎性细胞大量浸润，肺泡塌陷，肺泡腔消失，气管内出现粘液。局部大气道上皮细胞增生、坏死。结束后72小时肺部病理改变逐渐消散，但到14天时仍可发现肺泡腔的结构破坏，结果见附图1。
肾：肾脏在6小时后可见较多肾小管上皮细胞颗粒变性，胞质疏松淡染；个别上皮细胞脂肪变性；肾小管扩张；有的肾小管上皮细胞脱落，胞核消失，少量肾小管中可见丝状物；肾小管坏死，胞质嗜酸性增强，胞核固缩、碎裂、消失；肾小管刷状缘脱落；髓质可见较多管型。结束后72小时开始恢复，至14天时基本恢复正常，结果见附图2。
结肠及小肠：结肠及小肠组织在结束后6小时出现肠黏膜上皮抬高,绒毛向两侧倒伏,绒毛顶端脱落。炎性细胞聚集，在12小时后逐渐恢复，24小时基本正常，结果见附图3、附图4。
胰腺：胰腺在结束后6小时后出现组织水肿，小叶间隙增宽，局部腺泡细胞坏死，细胞分界不清，胞核碎裂溶解，伴有炎性细胞浸润，此改变可持续至结束后48小时，结果见附图5。
心脏：心脏在结束后6小时至72小时可在心内膜处观察到出血，心肌坏死，水肿，结构疏松，心肌细胞间质变大，伴少量炎性细胞浸润及结缔组织增生，结果见附图6。
最后说明的是，以下实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (2)
1.一种全肝缺血诱发缺血再灌注损伤的动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)：选取在室温25±2℃、湿度50±10％的情况下饲养的重量为200～250g的SPF级大鼠，禁食24小时，但不禁水；
(2)：对大鼠称重选取体质量相同的大鼠，对大鼠进行异氟醚吸入麻醉并腹部消毒；
(3)：游离肝下下腔静脉至右肾静脉水平；
(4)：经股静脉缓慢推注低分子肝素625IU/Kg，全身肝素化；
(5)：用3-0号丝线结扎门静脉、肝动脉及右肾静脉上下腔静脉并持续0～60min，在此期间减少吸入麻醉；
(6)：结扎结束后松开门静脉、肝动脉及右肾静脉上下腔静脉，逐层缝合大鼠肌肉层、皮肤层，缝合完毕后停止吸入麻醉；
(7)：大鼠麻醉清醒后在室温25±2℃、湿度50±10％的情况下继续饲养，观察大鼠的生存情况。
2.根据权利要求1所述的一种全肝缺血诱发缺血再灌注损伤的动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中用3-0号丝线结扎门静脉、肝动脉及右肾静脉上下腔静脉持续时间为45min。
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