CN102552926A - 一种骨肉瘤化疗药物载体及其获得方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提出一种骨肉瘤化疗药物载体及获得该载体的方法，为骨肉瘤的治疗及其他肿瘤相应载体的获得提供技术参考。本发明的骨肉瘤化疗药物作用载体是与骨肉瘤血管内皮细胞特异性结合载体，其构成氨基酸包括：TKPDKGY。本发明首先采用噬菌体展示技术，以荷瘤裸鼠模型为实验对象，经过多轮筛选成功获得了氨基酸序列为TKPDKGY的短肽。体外合成该载体与肿瘤抑素活性片段复合物，用于骨肉瘤治疗研究表明，相对于对照组，载体-药物复合物有较好的治疗效果，说明该载体具备良好的结合性、特异性及靶向性，可以成为骨肉瘤化疗药物载体。

Description

一种骨肉瘤化疗药物载体及其获得方法

技术领域

 本发明涉及一种骨肉瘤化疗药物载体及其获得方法。

背景技术

 骨肉瘤是最为常见的恶性骨肿瘤，其发病率占原发恶性骨肿瘤的22.36%，80～90%的病人在确诊时已发生体内其它部位的转移。目前超大剂量化疗仍是骨肉瘤最主要的治疗方法之一，但化疗的同时也会对机体正常组织产生严重的毒性作用。因此，增强化疗药物针对骨肉瘤组织的靶向性，成为目前急待解决的一个课题。

肿瘤的血管生成是肿瘤发展的重要环节，肿瘤必须通过形成新的血管系统来提供足够的营养，以支持其继续生长，因此将肿瘤新生血管内皮上的某些特异性分子作为药物作用的新靶点,日益受到研究者的密切关注。为了获取能与上述靶点特异性结合的配体,必须具备有效的筛选手段。噬菌体展示技术的应用为实现此目的提供了一个全新的工具。

噬菌体展示技术是20世纪90年代发展起来并得到广泛应用的新技术，其原理是将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在噬菌体的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该噬菌体内。噬菌体展示技术的一个最基本的特征是将表现型和基因型有效联系起来，即噬菌体表面的特定表现型与噬菌体颗粒中的基因型信息相对应，如需得到某个特定的表现型，只需在噬菌体基因组中插入该表现型的相关基因即可。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序是将噬菌体展示肽库与包被有靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合的噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。将被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3～4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面的研究，包括绘制抗原表位图谱、研究蛋白质-蛋白质相互作用和鉴定非肽配体的肽模拟物等。

Ph.D.-C7C噬菌体展示肽库是将随机七肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白（pIII）上而构建成的一个组合文库。所展示的随机多肽两侧各有一个半胱氨酸（Cys）。在非还原条件下，这两个半胱氨酸自发地形成一个二硫键，使展示的多肽环化。受限于二硫键环内的7肽库已被证实能识别抗原表位结构、D-氨基酸靶分子的镜像配基及开发以多肽为基础的治疗药物等。

体内噬菌体展示技术更是创造性地将常规的噬菌体展示技术与动物模型相结合，是寻找组织、器官特异性结合多肽的有效手段。此方法可在受体分子尚不清楚的情况下，以受体天然存在的环境——组织器官为配基，利用噬菌体短肽的抗原特异性，寻找未知的靶分子，确定其结构域。

发明内容

本发明的目的是提出一种骨肉瘤化疗药物载体及获得该载体的方法，为骨肉瘤的治疗及其他肿瘤相应载体的获得提供技术参考。

本发明的骨肉瘤化疗药物作用载体是与骨肉瘤血管内皮细胞特异性结合载体，其构成氨基酸包括：TKPDKGY。

上述的骨肉瘤化疗药物作用载体的获得方法包括以下步骤：

A：在骨肉瘤荷瘤裸鼠的尾静脉注射噬菌体，体内循环10分钟，待骨肉瘤荷瘤裸鼠麻醉后，处死骨肉瘤荷瘤裸鼠，取肿瘤组织液氮速冻后，匀浆化处理，获得洗脱液；

B：取洗脱液加入对数期ER2738菌液中，在室温条件下与组织静止感染并温育至少30分钟；

C：取少量感染后的菌液测滴度，计算总产出量，剩余感染菌液加入培养基及对数期菌液中，扩增与骨肉瘤血管内皮特异性结合噬菌体；

D：利用经典PEG/NaCl法沉淀扩增后的噬菌体，制备噬菌体扩增液，利用经典方法测定噬菌体滴度；

E：若步骤D中的噬菌体滴度未达标，则重复C、D步骤进行下一轮筛选；若步骤D中噬菌体滴度达标，则电泳鉴定噬菌体是否存在插入片段，并测序获得靶向性及稳定性最好的噬菌体克隆，推导出其氨基酸序列，得到骨肉瘤化疗药物作用载体。

本发明首先采用噬菌体展示技术，以荷瘤裸鼠模型为实验对象，经过多轮筛选成功获得了氨基酸序列为TKPDKGY的短肽。体外合成该载体与肿瘤抑素活性片段复合物，经过体外、体内验证，表明该短肽与骨肉瘤血管内皮细胞有良好的结合特异性与靶向性，可以介导骨肉瘤化疗药物促进治疗，进一步证实了本噬菌体展示技术可以用于肿瘤化疗药物载体的筛选工作，为其他肿瘤治疗开了新的思路。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种骨肉瘤化疗药物作用载体及其获得方法，采用本发明的骨肉瘤化疗药物作用载体获得方法，能够较快的获得特异性及稳定性较好的骨肉瘤化疗药物作用载体，从而研发出高效低毒的化疗药物与载体复合物。从而促进新药的研发及肿瘤疾病的靶向治疗。

附图说明

图1显示免疫组化方法验证靶向噬菌体克隆骨肉瘤结合特异性与靶向性，其中A：骨肉瘤组织内可见大量噬菌体富集在肿瘤血管内壁（如箭头所示）；B：肺组织内仅有少量噬菌体富集现象（如箭头所示）；C：脑组织内未发现噬菌体富集（如箭头所示）；D：肾组织内也有少量噬菌体富集现象（如箭头所示）。

图2可见骨肉瘤血管内皮细胞（A）特异性与荧光基团-短肽复合物结合，而其他两种细胞（B:正常血管内皮细胞；C:骨肉瘤细胞）并不与荧光基团-短肽复合物结合，说明短肽（TKPDKGY）具有和靶细胞特异性结合的能力。

图3可见流式细胞仪同样显示荧光基团-短肽复合物特异性与靶细胞有着较高的结合率，而其他细胞结合率很低；同时，单纯荧光基团（FITC）并不与靶细胞结合，说明了靶细胞通过短肽（TKPDKGY）实现了与荧光基团-短肽复合物的特异性结合，即证明了在体外培养细胞中，短肽与靶细胞（骨肉瘤血管内皮细胞）具有结合特异性。

图4可见荧光特异性聚集在骨肉瘤肿瘤部位，而其他部位（除膀胱为荧光基团FITC代谢器官）不现象，说明肿瘤组织可以特异性短肽（TKPDKGY）结合。

图5可见激光共聚焦显微镜从微观上显示与骨肉瘤组织结合的短肽聚集在血管组织而其他组织并无短肽富集，说明在荷瘤裸鼠体内，短肽与骨肉瘤血管内皮细胞特异性结合，而并不与骨肉瘤细胞及机体的其他组织结合。

图6可见靶向治疗组无论对裸鼠体内VEGF表达和骨肉瘤肺转移情况都表现出明显的抑制作用，说明经靶向短肽标记的效应分子发挥了更大的抑制肿瘤作用。

图7可见短肽-凋亡肽重组靶向治疗肽对骨肉瘤荷瘤裸鼠的肿瘤抑制率要大于其他各组药物，可见在短肽的导向下，凋亡肽的抑瘤效果显著提高，某种程度上实现了骨肉瘤的靶向化疗。

具体实施方式

下面对照附图，通过对实施实例的描述，对本发明的具体实施方式如所涉及的各构件的形状、构造、各部分之间的相互位置及连接关系、各部分的作用及工作原理等作进一步的详细说明。

实施例1：

本实施例的骨肉瘤化疗药物作用载体是与骨肉瘤血管内皮细胞特异性结合载体，其构成氨基酸包括：TKPDKGY。

上述的骨肉瘤化疗药物作用载体的获得方法包括以下步骤：

A：在骨肉瘤荷瘤裸鼠的尾静脉注射噬菌体，体内循环10分钟，待骨肉瘤荷瘤裸鼠麻醉后，处死骨肉瘤荷瘤裸鼠，取肿瘤组织液氮速冻后，匀浆化处理，获得洗脱液；

B：取洗脱液加入对数期ER2738菌液中，在室温条件下与组织静止感染并温育至少30分钟；

C：取少量感染后的菌液测滴度，计算总产出量，剩余感染菌液加入培养基及对数期菌液中，扩增与骨肉瘤血管内皮特异性结合噬菌体；

D：利用经典PEG/NaCl法沉淀扩增后的噬菌体，制备噬菌体扩增液，利用经典方法测定噬菌体滴度；

E：若步骤D中的噬菌体滴度未达标，则重复C、D步骤进行下一轮筛选；若步骤D中噬菌体滴度达标，则电泳鉴定噬菌体是否存在插入片段，并测序获得靶向性及稳定性最好的噬菌体克隆，推导出其氨基酸序列，得到骨肉瘤化疗药物作用载体。

体外合成该短肽（TKPDKGY）并将其与荧光素、肿瘤抑素等偶联，经过裸鼠模型的体外、体内验证，结果如下：

1、免疫组化验证克隆靶向性：如图1所示，其中A：骨肉瘤组织内可见大量噬菌体富集在肿瘤血管内壁（如箭头所示）；B：肺组织内仅有少量噬菌体富集现象（如箭头所示）；C：脑组织内未发现噬菌体富集（如箭头所示）；D：肾组织内也有少量噬菌体富集现象（如箭头所示）。

2、短肽与FITC偶联验证其作用靶向性：图2可见骨肉瘤血管内皮细胞（A）特异性与荧光基团-短肽复合物结合，而其他两种细胞（B:正常血管内皮细胞；C:骨肉瘤细胞）并不与荧光基团-短肽复合物结合，说明短肽（TKPDKGY）具有和靶细胞特异性结合的能力。

3、流式细胞仪检测骨肉瘤血管内皮细胞与荧光基团-短肽复合物（FITC-TKPDKGY）结合度：图3可见流式细胞仪同样显示荧光基团-短肽复合物特异性与靶细胞有着较高的结合率，而其他细胞结合率很低；同时，单纯荧光基团（FITC）并不与靶细胞结合，说明了靶细胞通过短肽（TKPDKGY）实现了与荧光基团-短肽复合物的特异性结合，即证明了在体外培养细胞中，短肽与靶细胞（骨肉瘤血管内皮细胞）具有结合特异性。

图4可见荧光特异性聚集在骨肉瘤肿瘤部位，而其他部位（除膀胱为荧光基团FITC代谢器官）不现象，说明肿瘤组织可以特异性短肽（TKPDKGY）结合。

图5可见激光共聚焦显微镜从微观上显示与骨肉瘤组织结合的短肽聚集在血管组织而其他组织并无短肽富集，说明在荷瘤裸鼠体内，短肽与骨肉瘤血管内皮细胞特异性结合，而并不与骨肉瘤细胞及机体的其他组织结合。

各治疗组裸鼠VEGF表达及骨肉瘤肺转移情况：图6可见靶向治疗组无论对裸鼠体内VEGF表达和骨肉瘤肺转移情况都表现出明显的抑制作用，说明经靶向短肽标记的效应分子发挥了更大的抑制肿瘤作用。

各组药物对骨肉瘤荷瘤裸鼠的肿瘤抑制率：图7可见短肽-凋亡肽重组靶向治疗肽对骨肉瘤荷瘤裸鼠的肿瘤抑制率要大于其他各组药物，可见在短肽的导向下，凋亡肽的抑瘤效果显著提高，某种程度上实现了骨肉瘤的靶向化疗。

Claims (2)

1.一种骨肉瘤化疗药物作用载体，其特征在于：该骨肉瘤化疗药物作用载体是与骨肉瘤血管内皮细胞特异性结合载体，其构成氨基酸包括：TKPDKGY。

2.根据权利要求1所述的骨肉瘤化疗药物作用载体的获得方法，其特征在于包括以下步骤：

A：在骨肉瘤荷瘤裸鼠的尾静脉注射噬菌体，体内循环10分钟，待骨肉瘤荷瘤裸鼠麻醉后，处死骨肉瘤荷瘤裸鼠，取肿瘤组织液氮速冻后，匀浆化处理，获得洗脱液；

B：取洗脱液加入对数期ER2738菌液中，在室温条件下与组织静止感染并温育至少30分钟；

C：取少量感染后的菌液测滴度，计算总产出量，剩余感染菌液加入培养基及对数期菌液中，扩增与骨肉瘤血管内皮特异性结合噬菌体；

D：利用经典PEG/NaCl法沉淀扩增后的噬菌体，制备噬菌体扩增液，利用经典方法测定噬菌体滴度；

E：若步骤D中的噬菌体滴度未达标，则重复C、D步骤进行下一轮筛选；若步骤D中噬菌体滴度达标，则电泳鉴定噬菌体是否存在插入片段，并测序获得靶向性及稳定性最好的噬菌体克隆，推导出其氨基酸序列，得到骨肉瘤化疗药物作用载体。

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