CN112321719B - 一种药物载体蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能够穿越血脑屏障、靶向脑肿瘤的药物载体，其包括人铁蛋白、HREV‑107蛋白、Angiopep2短肽串联表达得到的新结构铁蛋白。本发明所述药物载体能够携带诊断试剂穿越血脑屏障，实现脑肿瘤的诊断和定位；还能够携带药物穿越血脑屏障，实现脑肿瘤的靶向治疗。

Description

一种药物载体蛋白及其应用
技术领域
本发明属于制药领域和基因工程领域，具体涉及一种递送药物的蛋白载体，特别是涉及一种包括人铁蛋白重链、H-REV107的N端结构域、以及Angiopep-2肽的药物载体蛋白，其编码核酸、制备方法及应用。
背景技术
脑瘤是颅内肿瘤的统称，最常见的为脑胶质瘤，占原发性中枢神经系统肿瘤40％以上。美国每年确诊的脑瘤病例中，接近一半是恶性神经胶质瘤并且会导致在18个月之内死亡。神经胶质瘤源自胶质细胞，最常见的是星形胶质细胞，并且可能出现在脑或脊髓中的任何位置，包括小脑、脑干或视交叉。神经胶质瘤可以根据其生长特性分成两组：低级神经胶质瘤和高级神经胶质瘤。低级神经胶质瘤在较长的一段时间内通常集中并且生长缓慢。低级神经胶质瘤的实例包括星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、毛细胞型星形细胞瘤。随着时间的推移，大部分这些低级神经胶质瘤去分化成生长迅速并且能够轻易扩散整个脑部的更加恶性的高级神经胶质瘤。高级神经胶质瘤的实例包括间变性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤。
血脑屏障是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，这些屏障能够阻止某些物质(多半是有害的)由血液进入脑组织。血液中多种溶质从脑毛细血管进入脑组织，有难有易；有些很快通过，有些较慢，有些则完全不能通过，这种有选择性的通透现象使人们设想可能有限制溶质透过的某种结构存在，这种结构可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义。对于中枢神经系统的肿瘤，特别是恶性肿瘤，传统的手术切除不能防止癌细胞扩散侵袭正常的神经组织，药物治疗和放射治疗也是必不可少的，然而由于血脑屏障(BBB)的限制，药物很难有效进入脑内肿瘤组织。因此药物治疗剂的全身递送在中枢神经系统(CNS)中只能勉强达到临界治疗浓度，却常产生全身性副作用。
铁蛋白(ferritin)是参与和维持铁代谢平衡的重要功能蛋白，它是一类广泛存在于动植物及微生物细胞中含高铁量的蛋白质。在体内，铁蛋白的主要生理功能是储存机体中的过剩铁，避免产生铁中毒和释放铁给需铁的细胞，用于体内生物合成含铁的蛋白质或酶。在动植物和微生物机体中，铁蛋白基因缺失或其生理功能异常可能导致生物机体的死亡。对于人类而言，许多疾病如缺铁性贫血、血色症、铁中毒、恶性肿瘤等都与铁代谢异常有关，因此人类血清铁蛋白可作为评判许多重大疾病的标志物。
Angiopep-2(TFFYGGSRGKRNNFKTEEY，相对分子质量2400)为LRP受体的配体，在体内外BBB模型和原位脑灌注中均有较高的脑渗透性，并且LRP受体也在脑胶质瘤细胞表面大量表达，angiopep-2同时发挥对脑胶质瘤细胞的二级脑靶向功能，广泛用于修饰纳米载体使其成为脑靶向递药系统。
大肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、IPTG诱导表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系统。对于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。大肠杆菌表达系统优点在于遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等。
目前现有的穿透血脑屏障药物递送平台包括合成短肽类、无机粒子类、人工聚合物分子类等。短肽类药物载体，化学合成、分离纯化困难，成本高且易降解失活。无机粒子类药物载体，主要以二氧化硅、金、银等作为基质，生物相容性差、体内代谢缓慢、难以降解，具有肝毒性和/或肾毒性。聚合物分子类药物载体，例如脂质体、脂质微球等，穿透BBB的特异性不强，全身给药时，延长了药物在全身各组织的半衰期。另外，最重要的是，现有技术这些已有的穿BBB给药递送平台即使能携带药物穿越血脑屏障，对中枢系统肿瘤也缺乏靶向性。在现有穿BBB平台的基础上进一步引入靶向分子，则大大增加了穿BBB的难度。因此现有技术急需要一种操作简单、成本可控，既具有高效穿BBB功能、又对肿瘤组织具有靶向作用的中枢神经系统药物递送载体。
发明内容
为解决上述问题，本发明涉及一种能够穿越血脑屏障、靶向脑肿瘤的药物载体，其包括人铁蛋白、HREV-107蛋白、Angiopep2短肽串联表达得到的新结构铁蛋白。本发明所述药物载体能够携带诊断试剂穿越血脑屏障，实现脑肿瘤的诊断和定位；还能够携带药物穿越血脑屏障，实现脑肿瘤的靶向治疗。
具体而言，一方面，本发明提供一种药物载体蛋白，包括可操作连接的人铁蛋白重链、H-REV107的N端结构域、以及Angiopep-2肽，其特征在于所述Angiopep-2肽插入H-REV107 N端结构域序列的中间。
本发明所述药物载体蛋白，其特征在于所述Angiopep-2肽包括SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。
本发明所述药物载体蛋白，其特征在于所述Angiopep-2肽插入H-REV107N端结构域的第47位Ala残基与第48位Ala残基之间。
本发明所述药物载体蛋白，其特征在于所述H-REV107 N端结构域包括SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
本发明所述药物载体蛋白，其特征在于所述人铁蛋白重链包括SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。
本发明所述药物载体蛋白，其特征在于人铁蛋白重链、H-REV107的N端结构域和Angiopep-2肽之间通过连接子连接，所述连接子包括GGS和/或GGGS单元。
根据连接子的设计目的和设计原则，在不影响各组件功能的情况下，连接子还可以包含除GGS和/或GGGS单元以外的几个氨基酸残基，例如1-10个。
本发明所述药物载体蛋白，其特征在于还包括纯化标签，所述纯化标签包括6×His标签。
本发明所述药物载体蛋白，其特征在于所述载药蛋白包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
第二方面、本发明提供一种药物，其包括本发明所述载体蛋白、以及与之连接的活性分子。
本发明所述药物，其特征在于载体蛋白与活性分子以共价键或非共价键连接。
本发明所述药物，其特征在于所述活性分子为诊断剂或治疗剂；所述诊断剂包括荧光标记、放射标记、酶标记等，所述治疗剂包括化疗药、生物药、中药等。
第三方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码本发明所述药物载体蛋白。
第四方面，本发明还提供一种核酸构建体，其包含编码本发明所述药物载体蛋白的多核苷酸。
第五方面，本发明提供一种重组宿主细胞，其包括编码本发明所述药物载体蛋白的多核苷酸，或包括本发明所述核酸构建体。
第六方面，一种制备药物载体蛋白的方法，其包括：
a)在适合表达重组蛋白的条件下培养本发明所述重组宿主细胞；
以及可选的b)从细胞培养物中分离所述药物载体蛋白。
第七方面，本发明提供所述药物载体蛋白在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于诊断神经系统的病变。
本发明所述制备诊断剂的用途，其中所述神经系统的病变包括脑部肿瘤，例如神经胶质瘤。
第八方面，本发明提供所述药物载体蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗神经系统的病变。
本发明所述制备药物的用途，其中所述神经系统的病变包括脑部肿瘤，例如神经胶质瘤。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
1、穿BBB效果好、载药范围广。本发明设计的药物载体蛋白中人铁蛋白重链、H-REV107的N端结构域、Angiopep-2肽三者既协同发挥作用，又尽可能的减少相互之间的影响。将Angiopep-2肽融合嵌入H-REV107的N端结构域中间，增强了融合蛋白分子穿BBB的功能；融合蛋白形成的笼状球形高级结构能够负载各种药物。
2、制备方法和载药工艺操作简单。本发明设计的药物载体蛋白可以通过生物技术制备，获取方法简单，只需构建好所需氨基酸顺序的质粒，导入大肠杆菌中诱导表达、亲和纯化即可，并不需要其他的化学反应及分离纯化手段。载药工艺简单，只需通过酸碱变性复性的简单操作即可实现药物的装载。
3、具有中枢神经系统肿瘤特异性。本发明所述药物载体蛋白不仅能够高效穿越血脑屏障，还具有对中枢系统肿瘤组织的特异性靶向作用。体内试验结果表明，本发明载体蛋白递送抗肿瘤药物能够特异性的靶向脑部的肿瘤组织，实现准确诊断和精准治疗。
4、生物相容性好，安全稳定。本发明所述药物载体蛋白为天然氨基酸脱水缩合的产物，无重金属、碳纳米管、硅等难以降解且有细胞毒性的物质。在细胞中，可以在酶的作用下被降解，通过肝脏途径代谢，肾毒性小。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1：Fn-Rev-Ang蛋白的表征；
A：聚丙烯酰胺凝胶电泳图，重组表达的Fn-Rev-Ang蛋白分子量约为41kD；
B：经细菌表达亲和纯化后的Fn-Rev-Ang蛋白透射电镜图(Bar＝50nm)；
Fn-Rev-Ang蛋白纯化后自组装形成直径约12nm的球形分子；
C：经酸碱变复性后的Fn-Rev-Ang蛋白透射电镜图(Bar＝50nm)；
经过酸碱变性复性后，Fn-Rev-Ang蛋白仍保持自装配的功能，形成直径约12nm的球形分子；
D：动态光散射测定Fn-Rev-Ang蛋白粒径分布；
结果显示在溶液pH＝7.4时，蛋白质分子粒径分布主峰同样在10-12nm处；
E：电喷雾ESI质谱测定Fn-Rev-Ang分子量；
经电喷雾ESI质谱检测，Fn-Rev-Ang的分子量为40931Da。
图2：Fn-Rev-Ang蛋白穿BBB递送荧光成像结果；
Cy5.5+PBS(左)、Fn-Rev-Ang-Cy5.5(中)、Fn-Cy5.5(右)脑部活体荧光成像图，荧光强度由强至弱依次为Fn-Rev-Ang-Cy5.5>Fn-Cy5.5>Cy5.5+PBS。
图3：Fn-Rev-Ang蛋白穿BBB递送荧光成像结果；
Fn-Rev-Ang-Cy5.5(左)、Fn-Cy5.5(右)离体脑组织荧光成像图。
图4：Fn-Rev-Ang-Cy5.5注射后每间隔3min时间梯度活体荧光成像图；由左到右、由上到下的顺序：
第1行分别为注射后3min、6min、9min、12min活体荧光成像图；
第2行分别为注射后第15min、18min、21min、24min活体荧光成像图；
第3行分别为注射后第27min、30min、33min、36min活体荧光成像图；
第4行分别为注射后第39min、42min、45min、48min活体荧光成像图。
图5：Fn-Rev-Ang-Cy5.5注射后活体荧光强度变化趋势图；X轴为注射后时间，Y轴为标准化的荧光信号强度。
图6：Fn-Rev-Ang蛋白特异性靶向中枢神经系统肿瘤细胞；激光共聚焦显微镜下Fn-Rev-Ang-Cy5.5、细胞核核染色剂Hoechst与U87细胞共孵育图。
图7：Fn-Rev-Ang蛋白特异性靶向中枢神经系统肿瘤细胞；Fn-Rev-Ang-Cy5.5、溶酶体染色试剂Lysosome tracker与U87细胞共孵育图。
图8：Fn-Rev-Ang蛋白特异性靶向中枢神经系统肿瘤细胞；大鼠元代神经胶质细胞与Fn-Rev-Ang-Cy5.5共孵育图；共孵育10min和40min后，未检测到Cy5.5荧光；Bright为明场；Cy5.5为Cy5.5场。
图9：Fn-Rev-Ang蛋白载药穿BBB递送的MRI图；
A：MRI下Fn-Rev-Ang-GdDTPA T1浓度梯度图；
B：Fn-Rev-Ang-GdDTPA弛豫曲线；
C：三种试剂健康鼠MRI成像图；
D：三种试剂健康鼠MRI灰度数值曲线；
E：Fn-Rev-Ang-GdDTPA注射后脑部Gd含量随时间变化图。
图10：Fn-Rev-Ang-GdDTPA穿BBB递送至荷瘤鼠中枢神经系统的MRI图；
A：荷瘤鼠注射Fn-Rev-Ang-GdDTPA T1脑部MRI成像；
B：荷瘤鼠注射Fn-Rev-Ang-GdDTPA脊髓部MRI成像；
C：荷瘤鼠注射Fn-Rev-Ang-GdDTPA肿瘤脑组织与正常脑组织灰度曲线；
D：Fn-Rev-Ang-GdDTPA注射后肿瘤组织灰度变化(n＝3)；
E：Fn-Rev-Ang-GdDTPA注射荷瘤鼠后左右半脑Gd元素含量(n＝3)。
图11：Fn-Rev-Ang-GdDTPA注射后的血脑屏障完整性；
A：透射电镜(TEM)下观察脑部血管壁完整；
B：透射电镜(TEM)下观察脑部血管基底完整；
C：透射电镜(TEM)下观察紧密连接完整；
D：荷瘤鼠脑切片HE染色全景图；
E：荷瘤鼠脑中肿瘤组织内新生血管丰富；
F：肿瘤组织细胞核大而深染。
图12：Fn-Rev-Ang-GdDTPA注射后各组织切片HE染色图；观察Fn-Rev-Ang-GdDTPA注射后1、7、14天的组织切片，以PBS注射后14天、GdDTPA注射后14天作为对照。
图13：Fn-Rev-Ang-Dox治疗脑瘤的效果；
A：Fn-Rev-Ang-Dox给药组与PBS对照组脑部肿瘤荧光图；给药组脑部肿瘤逐渐缩小，而对照组小鼠脑部肿瘤逐渐增大；
B：给药组与对照组小鼠体重变化趋势图(n＝5)；给药组小鼠体重下降幅度减小；
C：小鼠脑部肿瘤荧光信号变化图(n＝5)；给药组小鼠脑部荧光数值逐渐降低，而对照组小鼠脑部荧光数值逐渐增加；
D：小鼠生存期曲线图(n＝5)；给药组小鼠相对于对照组小鼠生存期明显延长。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例一、Fn-Rev-Ang设计、合成、纯化、表征、性质实验
为了实现获得产率高、水溶性好、肿瘤靶向性好的新结构铁蛋白，在本研究中我们利用Escherichia coli细菌，表达了人重链铁蛋白、HREV-107蛋白、Angiopep2短肽及组氨酸标签串联而成的新结构铁蛋白Fn-Rev-Ang。我们构建了新结构铁蛋白氨基酸序列的质粒，利用大肠杆菌表达系统成功表达。超声破碎大肠杆菌，离心后取上清液，利用镍离子亲和柱纯化此蛋白。经蛋白质凝胶电泳分析，纯化后的蛋白仅具有一个条带，新结构铁蛋白单体分子质量在41kD处[图1.A]。利用电喷雾质谱，我们同样获得了此新结构铁蛋白单体的分子量为40.93kD[图1.E]。经透射电子显微镜成像，分析结果显示，经酸碱变复性自组装后的新结构铁蛋白纳米颗粒[图1.C]和直接纯化得到的铁蛋白纳米颗粒[图1.B]形貌均为笼装球型分子，其直径约为12nm。经粒径测试仪表征，在溶液pH＝7.4时，蛋白质分子粒径分布主峰同样在10-12nm处[图1.D]。
首先我们进行新结构铁蛋白穿越血脑屏障能力探究。将Fn-Rev-Ang浓度调成2mg/mL，pH调至7.4，将荧光标记分子Cy5.5-NHS加入到Fn-Rev-Ang溶液中，室温下混合均匀，振荡反应两小时，此时溶液呈蓝色均一透明液体。利用超滤离心管(截留分子量为10kD)，超速离心10min，3000r/min，共计三次。收集得到的液体，利用脱盐柱洗脱掉游离的Cy5.5-NHS，获得到纯化后的Fn-Rev-Ang-Cy5.5。
以相同的方法标记人铁蛋白，获得Fn-Cy5.5。利用活体动物荧光成像仪，将Fn-Rev-Ang-Cy5.5、Fn-Cy5.5、Cy5.5的荧光数值调成一致，比较在相同浓度荧光分子的状态下，何种物质穿越血脑屏障能力强，经Nanodrop测定蛋白质浓度。取裸鼠，分别将小鼠给药的Fn-Rev-Ang-Cy5.5、Fn-Cy5.5、Cy5.5溶液，注射后分钟，在活体动物荧光成像仪中，在激发/发射波长在660nm/710nm处成像，可以发现，Fn-Rev-Ang-Cy5.5的荧光信号最强，其次是Fn-Cy5.5，最弱的是Cy5.5分子[图2]。心脏灌流后，将鼠解剖，取出大脑，荧光成像结果一致[图3]。此实验提示，融合表达有Rev-Ang的铁蛋白比单纯铁蛋白更容易进入血脑屏障。利用Balb/c裸鼠，尾静脉注射的Fn-Rev-Ang-Cy5.5分子，利用活体动物成像仪时间梯度成像功能拍照，可以发现在尾静脉注射五分钟后，脑部荧光就可以保持长时间平稳状态，直至四十分钟后逐渐衰减[图4和图5]。
实施例二、Fn-Rev-Ang中枢神经系统肿瘤细胞特异性
将Fn-Rev-Ang-Cy5.5分子分别加入到大鼠脑原代神经胶质细胞与人脑胶质瘤U87细胞当中共孵育，在激光共聚焦显微镜下，可以观察到，加入Fn-Rev-Ang-Cy5.5后进入人脑胶质瘤U87细胞的Fn-Rev-Ang-Cy5.5远比进入正常脑原代神经胶质细胞的多[图6、图8]。可以利用这个性质，来实现中枢神经系统肿瘤的靶向成像及给药。将溶酶体染色试剂Lysosome tracker，Fn-Rev-Ang-Cy5.5、与U87细胞37℃下共孵育，在4h时发现Fn-Rev-Ang-Cy5.5有斑点状分布。[图7]
实施例三、Fn-Rev-Ang载GdDTPA的MRI实验
利用Fn-Rev-Ang酸碱变复性的特性，尝试进行了载药及中枢神经系统递送，具体操作如下：
利用小鼠，我们尝试了Fn-Rev-Ang-GdDTPA、Fn-GdDTPA和GdDTPA三种化合物穿越血脑屏障能力。将三种分子的Gd元素浓度调节至2×10-4mol，将小鼠尾静脉注射后，进入磁共振成像仪中，选择T1成像模式，每隔90秒扫一次，轴位成像。观察到的结果为：注射GdDTPA组小鼠，在全部磁共振成像的两小时内，脑部无明显变化，灰度值未见增加，注射后3min，肾脏及膀胱灰度值明显增加。注射Fn-GdDTPA组小鼠，脑部灰度值在40min左右，有3％的升高[图9.C]，注射后发现，肾脏及膀胱灰度有增加，但是胆囊有更明显成像增强，说明铁蛋白包裹的GdDTPA大部分是经胆道代谢，而不是进入肾脏后排除体外。注射Fn-Rev-Ang-GdDTPA组小鼠，小鼠脑部有明显的灰度增加，在注射40min后灰度值到达峰值，经测量，灰度增加约30％[图9.C]。在60min以后，灰度值降到注射前水平。类似于Fn-GdDTPA，注射Fn-Rev-Ang-GdDTPA小鼠肾脏和膀胱部位的未见灰度变化，而肝脏及胆囊有明显变化，也可以证明，Fn-Rev-Ang-GdDTPA也是经胆道排出体外。以上三组实验可以证明，新结构铁蛋白包裹的GdDTPA可以迅速穿过血脑屏障并且实现磁共振增强成像[图9.D]。在临床检查中，GdDTPA的副作用就是肾脏纤维化[17]，利用Fn-Rev-Ang载药，可以改变其代谢途径，从而避免重金属Gd离子进入肾脏细胞中所带来的细胞毒性，从胆汁中肠道从而排出体外。利用ICP-MS技术，我们定量探究了小鼠脑中的Gd元素含量。尾静脉注射100μL的Fn-Rev-Ang-GdDTPA，每隔20分钟处死一组(n＝3)，心脏灌流后，将大脑取出，匀浆后消化，经ICP-MS测定，40min脑部Gd元素数值达到最高峰[图9.E]。这与活体小鼠磁共振成像的灰度值变化结果相互吻合。
实施例四、Fn-Rev-Ang-GdDTPA的分布、代谢、毒性研究。
经健康小鼠检验Fn-Rev-Ang-GdDTPA穿越血脑屏障能力之后，我们尝试利用荷瘤小鼠检验对比剂的靶向能力。首先是构建脑部荷瘤小鼠模型：取裸鼠，细胞系选取人脑胶质瘤U87MG细胞(含有Luciferase表达基因)。将消化后的U87MG细胞离心，经细胞计数，利用微量注射器抽取1×105个细胞。固定小鼠位置后，向其右脑注射5mm深度，注射定位至小鼠右侧尾状核内。经10日饲养，给予脑部荷瘤小鼠腹腔注射100μL浓度为1mg/mL的萤火虫荧光素酶底物，10min后经活体动物成像仪检测，发现小鼠的脑部、颈椎段脊髓、腰段脊髓均有肿瘤细胞信号，提示脑部肿瘤建模成功，脑部肿瘤在原位以及延脊髓随脑积液有播散现象产生。利用100μL浓度为7％的水合三氯乙醛腹腔注射脑部荷瘤小鼠，经T1扫描，未见脑部出现明显异常现象，脊髓胸段、腰段未见异常。小鼠尾静脉给药，剂量与健康鼠测试时相同。在给药后40min后，可以明显发现在小鼠右脑有增强点，灰度强度增加30％[图10.C.D]，测量肿瘤信号面积为0.8mm×1mm[图10.A]。经小鼠解剖，取出大脑HE染色，可以发现切片中与磁共振成像中的肿瘤位置、大小相互吻合[图11.D]。HE染色可以发现肿瘤组织细胞核变大，颜色变深[图11.E.F]，有多核聚细胞出现等现象，符合肿瘤细胞的全部特征。说明经注射Fn-Rev-Ang-GdDTPA的肿瘤鼠磁共振成像能够实现早期的脑胶质瘤诊断。再利用轴位磁共振成像观察颈椎、腰椎段脊髓的肿瘤播散现象。在未注射Fn-Rev-Ang-GdDTPA时，颈椎、腰椎段脊髓未见异常，注射后可以观测到颈椎及胸椎断脊髓的灰度升高30％[图10.B]，与活体动物荧光成像仪中荧光定位位置相同。将右脑荷瘤鼠注射Fn-Rev-Ang-Gd约40分钟后处死，将左右半脑切开，分别匀浆后消化，利用ICP-MS技术测定左右半脑的Gd元素含量，可以发现右脑(荷瘤)比左脑Gd元素高[图10.E]，说明Fn-Rev-Ang-Gd在小鼠右侧半脑富集含量更高，可以证明Fn-Rev-Ang-Gd对脑胶质瘤有一定的靶向作用。
我们又将脑部荷瘤小鼠心脏灌流后加入多聚甲醛固定，切片后再利用TEM技术观测血脑屏障完整性，可以发现小鼠脑部血管完整[图11.A]、基底完整[图11.B]、紧密连接完整[图11.C]。可以得出结论，荷瘤小鼠的血脑屏障未被破坏。由于胆道成像明显，我们想了解Fn-Rev-Ang-GdDTPA是否会有肝脏等毒性。我们利用成像使用的剂量，尾静脉注射健康小鼠，1、7、14天后分别处死，心脏灌流后将心、肝、脾、肺、肾等主要器官进行HE染色，经病理切片分析，注射Fn-Rev-Ang-GdDTPA并未造成组织异常[图12]。以上实验表明，可以利用MRI对比剂Fn-Rev-Ang-Gd对脑部荷瘤小鼠脑中尚未破坏血脑屏障微小肿瘤(1mm×1mm)成像，且可以观察到脑胶质瘤随脑脊液在脊髓内的播散增强信号，说明Fn-Rev-Ang-GdDTPA既有穿越血脑屏障能力，又有靶向肿瘤细胞能力。同时又避免了游离的GdDTPA对于肾脏产生的毒性，可以直接经胆道排入肠道。
实施例五、Fn-Rev-Ang载Doxorubin治疗脑瘤鼠实验
在诊断试剂相关测试结束后，我们又对新结构铁蛋白载荷抗肿瘤药物进行相关性质测试。利用酸碱变复性的方法，将抗肿瘤药物Doxorubicin载入至铁蛋白空腔中。利用U87MG细胞进行细胞测试，发现10μmol浓度的Fn-Rev-Ang-Dox可以对于肿瘤细胞进行杀伤。利用脑部荷瘤小鼠进行Fn-Rev-Ang-Dox治疗实验。小鼠荷瘤模型建立方法同上(n＝5)，建立模型10日后，以2mg/mL，100μL的剂量，每日尾静脉注射荷瘤小鼠。肿瘤治疗评价方式：每日对于小鼠的体重进行测量；每日腹腔注射100μL 100mg/mL的萤火虫荧光酶底物，20分钟后对小鼠脑部进行成像，绘制荧光曲线；记录小鼠生存期。经过16天的给药实验，我们发现，对照组小鼠全部死亡，给药组小鼠生存期明显延长[图13.D]。对照组小鼠体重比给药组小鼠低10％[图13.B]；脑部荧光数值，给药组减小，而对照组小鼠荧光数值明显升高[图13.A.C]。可以得出结论，给予Fn-Rev-Ang-Dox的荷瘤小鼠从体重，脑部肿瘤荧光、生存期等诸多方面指标均比对照组小鼠有所提升。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京劲捷生物科技有限公司
<120> 一种药物载体蛋白及其应用
<130> 无
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 369
<212> PRT
<213> 药物载体蛋白
<400> 1
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Ile Glu Ile Phe Arg Pro Phe Tyr Arg His Trp Ala Ile Tyr Val Gly
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Val Val His Leu Ala Pro Pro Ser Glu Val Ala Gly Ala Gly Ala Ala
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Ser Val Met Ser Ala Leu Thr Asp Lys Ala Ile Val Lys Lys Glu Leu
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Asp Asp Lys Tyr Ser Pro Leu Pro Ser Ser Lys Ile Ile Gln Arg Ala
85 90 95
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100 105 110
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<213> Angiopep-2
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165 170 175
Asn Glu Ser

Claims (11)

1.一种药物载体蛋白，包括可操作连接的人铁蛋白重链、H-REV107的N端结构域、以及Angiopep-2肽，其特征在于所述Angiopep-2肽插入H-REV107 N端结构域序列的中间；所述人铁蛋白重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述Angiopep-2肽的氨基酸序列如SEQID NO:3所示；所述H-REV107 N端结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述药物载体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种药物，其包括权利要求1所述载体蛋白及与之连接的活性分子。
3.如权利要求2所述药物，其特征在于载体蛋白与活性分子以共价键或非共价键连接。
4.如权利要求2或3所述药物，其特征在于所述活性分子为诊断剂或治疗剂；所述诊断剂包括荧光标记、放射标记、酶标记，所述治疗剂包括化疗药、生物药、中药。
5.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述药物载体蛋白。
6.一种核酸构建体，其包括权利要求5所述多核苷酸。
7.一种重组宿主细胞，其包括权利要求5所述多核苷酸或权利要求6所述核酸构建体。
8.一种制备药物载体蛋白的方法，其包括a)在适合表达重组蛋白的条件下培养权利要求7所述重组宿主细胞，以及可选的b)从细胞培养物中分离药物载体蛋白。
9.权利要求1所述药物载体蛋白在制备诊断剂载体中的用途，所述诊断剂用于诊断神经系统的病变。
10.权利要求1所述药物载体蛋白在制备药物载体中的用途，所述药物用于治疗神经系统的病变。
11.如权利要求9或10所述的用途，其特征在于，所述神经系统的病变包括脑部肿瘤。
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