ES2330082T3 - Metodos y composicones para enfermedades asociadas con la amiloidosis. - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende al menos un péptido amiloide ß 1-16 palmitoilado anclado en una bicapa liposómica.
Description
Métodos y composiciones para enfermedades
asociadas con la amiloidosis.
La presente invención se refiere de manera
general a la detección, tratamiento, o prevención de enfermedades.
Específicamente, la presente invención se refiere a la detección,
tratamiento o prevención de amiloidosis o enfermedades asociadas al
amiloide.
La amiloidosis incluye diversas enfermedades
caracterizadas por una acumulación de material amiloideo en los
órganos o tejidos corporales. Esta acumulación puede dañar funciones
vitales. Las enfermedades asociadas a la amiloidosis incluyen
enfermedad de Alzheimer (EA), síndrome de Down, parálisis
supranuclear progresiva, esclerosis múltiple, y diabetes de tipo 2.
La amiloidosis localizada está asociada con el deterioro cognitivo
(amiloidosis cerebral senil; enfermedad de Alzheimer), cardiopatía
(amiloidosis cardiaca senil), tumores endocrinos (cáncer de
tiroides), y diabetes de tipo 2, enfermedades que se han encontrado
en millones de estadounidenses.
Varios daños específicos de los depósitos de
amiloide en el cerebro están relacionados con los depósitos del
péptido, péptido A\beta (péptido amiloide \beta). Las
enfermedades neurológicas asociadas a los depósitos del péptido
A\beta incluyen la enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos
de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con
amiloidosis (de tipo holandés), y el
parkinsonismo-demencia de Guam. Las placas de
péptido A\beta también se producen en personas que han
experimentado traumatismo craneal y una enfermedad coronaria
crítica.
La enfermedad más común relacionada con el
deterioro cognitivo o la demencia es la enfermedad de Alzheimer
(EA). Este trastorno está caracterizado por pérdida neuronal,
ovillos neurofibrilares, y placas neuríticas comprendidas de
péptido A\beta. Debido a la naturaleza de la amiloidosis cerebral,
el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer antes de la muerte es
difícil, y el desarrollo de terapias u otros tratamientos para la
enfermedad de Alzheimer han sido difíciles de encontrar. Muchas
terapias propuestas son incapaces de cruzar la barrera
hematoencefálica en cantidades necesarias para un tratamiento
eficaz.
En la actualidad se cree que las placas de
amiloide en el cerebro están compuestas en su mayor parte de péptido
A\beta, una proteína de 4 kD, de 39-43
aminoácidos de longitud. El péptido A\beta se expresa mediante
un gen situado en el cromosoma 21, y deriva de la escisión
proteolítica del interior de una proteína celular mucho mayor (770
restos), proteína precursora del amiloide (APP). Después de la
escisión, el péptido A\beta polimeriza en filamentos de amiloide,
que sucesivamente se agregan en depósitos de placas de amiloide. En
el cerebro, estos filamentos y agregados son tóxicos para las
neuronas, y se piensa que están relacionados con los síntomas
causales asociados a la EA.
La incapacidad para examinar los depósitos de
amiloide de la EA en pacientes antes de la muerte, dificulta la
capacidad de los investigadores para estudiar la EA y desarrollar
tratamientos eficaces con el objetivo de prevenir o anular la
formación de placas de amiloide en el cerebro. El daño a las
neuronas del sistema nervioso central debido a la EA comienza años
antes de que los síntomas clínicos sean evidentes. La prevención de
la amiloidosis en el cerebro impediría el desarrollo de la EA. Un
enfoque similar para prevenir o tratar la formación de la placa de
amilina en los pacientes con diabetes de tipo 2 sería también
beneficioso.
Otras investigaciones han identificado una serie
de mutaciones que provocan la enfermedad de Alzheimer hereditaria
(FAD), de un modo autosómico dominante. Todas la mutaciones
conocidas de FAD aumentan la producción o absoluta o relativa de
los péptidos A\beta más patógenos con 42 aminoácidos. Estas
mutaciones surgen o en el mismo gen APP, afectando los sitios diana
en la APP en los que se produce la escisión proteolítica, o en uno
de los dos genes de la presenilina, los productos proteínicos que
afectan directamente o, más probablemente, indirectamente el
procesamiento de APP. La etapa temprana de la escisión en la EA está
seguida de la polimerización del péptido a filamentos de amiloide,
que sucesivamente se agregan en los depósitos de placas de amiloide
visibles que caracterizan los cerebros de individuos con EA. Estos
filamentos, o posiblemente los protofilamentos intermedios, son
tóxicos para las neuronas, y se piensa que conducen a los ovillos
neurofibrilares, pérdida de sinapsis, y neurodegeneración, que
sirven de base al deterioro de las funciones cognitivas de los
pacientes con la enfermedad de Alzheimer.
Además de la producción del péptido A\beta
(péptido amiloide \beta), otras etapas importantes están
implicadas en la ruta patógena que conduce a la EA. Estudios tanto
genéticos como bioquímicos asignan un papel clave a un grupo de
proteínas auxiliares que funcionan como "chaperonas
patológicas". Una de tales proteínas es la antiproteasa
antiquimotripsina, y otra es la proteína de transporte lipídico,
apolipoproteína F, particularmente su forma alélica E4. Ambas
proteínas favorecen la formación y maduración de placas de Alzheimer
con su núcleo de filamentos de A\beta. Específicamente, las
chaperonas patológicas pueden demostrar in vitro que
aceleran la polimerización de A\beta en filamentos de amiloide
neurotóxicos, y experimentos con ratones transgénicos apoyan su
papel en favorecer la formación de amiloide in vivo. Ambas
proteínas son componentes secundarios de los depósitos de amiloide,
y se producen evidentemente como parte de una reacción de
inflamación que surge en respuesta a los depósitos difusos
iniciales del péptido
A\beta.
A\beta.
En el documento de patente WO 99/27944 se
describe un derivado palmitoilado del péptido A/0
1-42. Pero se obtuvieron resultados decepcionantes
cuando fue administrado.
Lo que se necesita son métodos y composiciones
para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades asociadas al
amiloide.
La presente invención está dirigida a
composiciones y métodos para el diagnóstico, prevención y
tratamiento de enfermedades asociadas a la amiloidosis. De acuerdo
con la presente invención, se proporcionan composiciones y métodos
que son eficaces en la detección y tratamiento de depósitos de
amiloide, especialmente depósitos de amiloide relacionados con
enfermedades neurodegenerativas.
La presente invención comprende también métodos
y composiciones que comprenden una vacuna que provoca una respuesta
inmunitaria frente a proteínas, péptidos o fragmentos de amiloide, y
previene, detiene o dificulta los depósitos de amiloide. La vacuna
está comprendida de un antígeno, un fragmento de péptido amiloide o
epítopo, que se proporciona preferiblemente en una bicapa
liposómica. El antígeno está comprendido de un péptido amiloide
\beta_{1-16} palmitoilado, y métodos de
administración en una bicapa liposómica.
La invención proporciona también un método y
composiciones para prevenir o mitigar los síntomas de enfermedades
asociadas a la acumulación u organización molecular de proteína
amiloide o placas de amiloide en general, que incluye la
administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de un
derivado de péptido o fragmento de péptido amiloide a un
paciente.
La presente invención incluye una composición
farmacéutica en una cantidad eficaz para prevenir, detener o
dificultar uno o más síntomas de una enfermedad que implica una
acumulación anormal u organización molecular de proteína,
ensamblajes, fibrillas, filamentos, ovillos, o depósitos de placas
de amiloide. La presente invención incluye un antígeno para
estimular la producción de un anticuerpo monoclonal antiamiloide,
con la capacidad de disolver placas de amiloide. La presente
invención proporciona también un método para tratar una enfermedad
asociada a amiloidosis, que incluye la administración de una
cantidad farmacéuticamente eficaz de la vacuna a un paciente.
La presente invención comprende también métodos
para fabricar composiciones que comprenden antisueros dirigidos
contra el epítopo de las composiciones de vacuna de la presente
invención. Estas composiciones de antisueros son capaces de
disolver agregados de amiloide que comprenden el epítopo o antígeno
(por ejemplo amiloide \beta). Las composiciones de antisueros son
eficaces en el tratamiento o prevención de la acumulación de la
proteína amiloide o la formación de ensamblajes, fibrillas,
filamentos, ovillos, o depósitos de placas de amiloide y, por lo
tanto, enfermedades asociadas a la amiloidosis.
La invención comprende además métodos y
composiciones para prevenir o mitigar los síntomas de enfermedades
asociadas a la acumulación u organización molecular de proteína
amiloide o placas de amiloide, que incluyen la administración de
una cantidad farmacéuticamente eficaz de antisueros a un
paciente.
La presente invención es particularmente útil en
el tratamiento de enfermedades asociadas al amiloide,
preferiblemente enfermedades asociadas a amiloide \beta, que
incluyen enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy,
síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis
(de tipo holandés), y el complejo de
Parkinson-demencia de Guam, u otras enfermedades
que implican una acumulación anormal u organización molecular de
proteína , ensamblajes, fibrillas, filamentos, ovillos, o depósitos
de placas de amiloide.
Este y otros objetos, características, y
ventajas de la presente invención serán evidentes después de una
revisión de la siguiente descripción detallada de las realizaciones
descritas y de las reivindicaciones adjuntas.
La figura 1 es el péptido amiloide \beta
1-16 (A\beta_{1-16}) anclado en
la bicapa liposómica mediante lisinas palmitoiladas unidas a ambos
extremos del péptido A\beta 1-16.
Figura 2(a). Ruta sintética de
dipalmitoíl-lisina, usando una palmitoilación
directa descrita en los ejemplos 2 y 3.
Figura 2(b). Ruta sintética de
dipalmitoíl-lisina, usando ésteres activados
descritos en los ejemplos 2 y 3.
Figura 2(c). Ruta sintética en fase
sólida del extremo C descrita en el ejemplo 3.
La figura 3 es un espectro de masas de bombardeo
con átomos rápidos (FAB) del éster de palmitoílo de la
N-hidroxisuccinimida. Son visibles el pico esperado
a 623 Da (MH+) y la ausencia del pico del éster activado (354
Da).
La figura 4 es un espectro de ^{1}H RMN del
éster de palmitoílo de la N-hidroxisuccinimida. Son
visibles las señales esperadas.
La figura 5 representa la desagregación de las
fibras de amiloide \beta por el 6C6 = anticuerpo monoclonal (mAB)
y mediante sueros de ratones inmunizados con A\beta palmitoilado
(1-16) reconstituido en liposomas.
La presente invención está dirigida a
composiciones y métodos para el diagnóstico, tratamiento y
prevención de enfermedades asociadas a depósitos de amiloide. Las
composiciones preferidas de la presente invención incluyen
composiciones que comprenden proteínas de fusión capaces de afectar
depósitos de amiloide que pueden cruzar la barrera
hematoencefálica, y composiciones que son eficaces para provocar una
respuesta inmunitaria de epítopos de depósitos de amiloide. Los
métodos preferidos de la presente invención comprenden el uso de las
composiciones para diagnóstico, tratamiento y prevención de
enfermedades asociadas a depósitos de amiloide, y para fabricar y
usar péptidos amiloides modificados y construcciones moleculares de
genes amiloides.
Un ejemplo de una de las enfermedades asociadas
a los depósitos de amiloide es la enfermedad de Alzheimer, EA. Por
definición, la EA se diagnostica por medio del examen del tejido
cerebral, usualmente en la autopsia. El "criterio mínimo
microscópico" recomendado actualmente para el diagnóstico de la
EA está basado en el número de placas neuríticas encontradas en el
cerebro. Los núcleos amiloideos de estas placas neuríticas están
compuestos de proteína amiloide \beta, a la que también se hace
referencia en la presente invención como péptido amiloide \beta,
que está dispuesto en una configuración beta de hoja plegada de
manera predominante. Las placas de amiloide en el cerebro se
demuestran por tinción de cortes del cerebro con tioflavina S o rojo
Congo. El amiloide teñido con rojo Congo se caracteriza por un
aspecto dicroico, mostrando un color de polarización verde
amarillento. La fijación dicroica es el resultado de la estructura
beta de hoja plegada de las proteínas amiloides.
Es muy difícil diagnosticar la enfermedad de
Alzheimer antes de la muerte, para desarrollar tratamientos
farmacológicos, o para tratar la EA. Se ha sugerido un cribado para
la detección del genotipo de la apolipoproteína E como una ayuda en
el diagnóstico de la EA. Surgen dificultades con esta tecnología,
sin embargo, porque el alelo 4 de la apolipoproteína E es solamente
un factor de riesgo para la EA, no un marcador de la enfermedad.
Está ausente en muchos pacientes de la EA, y presente en muchos
ancianos que no presentan demencia. Se han desarrollado métodos de
inmunoanálisis para detectar la presencia de marcadores
neuroquímicos en pacientes de EA, y para detectar una proteína
amiloide relacionada con la EA en el líquido cefalorraquídeo. No se
ha probado que estos métodos para diagnosticar la EA detecten la EA
en todos los pacientes, particularmente en las etapas tempranas de
la enfermedad. También son relativamente invasivos, necesitándose
una punción lumbar. Recientemente, se ha usado péptido A\beta
radiomarcado para marcar placas de tipo difuso, compacto y neurítico
en cortes de cerebro con EA. Estos péptidos, sin embargo,
no cruzan normalmente la barrera hematoencefálica en las cantidades necesarias para un diagnóstico por la imagen.
no cruzan normalmente la barrera hematoencefálica en las cantidades necesarias para un diagnóstico por la imagen.
El rojo Congo puede usarse para diagnosticar la
amiloidosis in vivo en tejidos parenquimatosos no cerebrales.
Pero el rojo Congo no es adecuado probablemente para el diagnóstico
in vivo de depósitos de amiloide \beta en el cerebro, ya
que solamente pueden penetrar en el parénquima cerebral cantidades
muy pequeñas, aproximadamente 0,03% de una dosis inyectada de rojo
Congo yodado. Se han propuesto compuestos radioyodados de
bisdiazobencidina relacionados con el rojo Congo, tales como
benzo-naranja R y azul directo 4, como útiles in
vitro e in vivo para detectar la presencia y
localización de depósitos de amiloide en un órgano de un paciente.
Sin embargo, como el rojo Congo, todos los compuestos contienen
grupos de ácido sulfónico fuertemente ácidos, que limitan
fuertemente la entrada de estos compuestos en el cerebro.
También se ha procurado desarrollar anticuerpos
monoclonales como sondas para un diagnóstico por la imagen de
placas de amiloide. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra la
región del extremo N (1-28) del amiloide \beta se
unen a los ensamblajes de amiloide \beta formados in vitro,
conduciendo a la desagregación de las fibrillas y a la restauración
parcial de la solubilidad del amiloide \beta. También se ha
encontrado que algunos de los anticuerpos monoclonales dirigidos
contra el amiloide \beta (1-28) soluble inhiben la
agregación fibrilar del péptido amiloide \beta in vitro.
El éxito de estas pruebas, sin embargo, ha sido limitado debido a
la dificultad de conseguir que estas moléculas grandes crucen la
barrera hematoencefálica. Hasta la presente invención, el
diagnóstico, tratamiento y prevención de enfermedades asociadas al
amiloide han tenido poco éxito.
La presente invención comprende métodos y
composiciones para diagnosticar y tratar enfermedades y
procedimientos en los que interviene la formación de depósitos de
amiloide anormales, tales como placas de amiloide. Un aspecto de la
invención comprende métodos de administración de composiciones que
comprenden una proteína de fusión en una dosis suficiente para
detectar, y preferiblemente disolver, placas de amiloide. Otro
aspecto comprende métodos para fabricar y usar composiciones que
comprenden una vacuna o composiciones de antisueros. La presente
invención es útil en detectar y tratar enfermedades
neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Alzheimer. También
es útil en detectar y tratar placas de amiloide en la demencia con
cuerpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria
con amiloidosis (de tipo holandés) y en el complejo de
Parkinson-demencia de Guam, y en otras enfermedades
asociadas al amiloide.
La presente invención comprende además otros
métodos y composiciones para prevenir o tratar enfermedades y
procesos asociados a la amiloidosis. Un aspecto adicional de la
invención comprende la administración de composiciones que
comprenden una vacuna en una dosis suficiente para provocar una
respuesta inmunitaria frente a epítopos amiloides, tales como
proteínas o péptidos, particularmente los que se encuentran en
placas, ovillos u otros depósitos. También comprende la
administración de composiciones que comprenden antisueros dirigidos
contra epítopos amiloides o regiones inmunógenas, en una dosis
suficiente para combatir la amiloidosis. Esta invención es
particularmente útil para diagnosticar, prevenir y tratar
enfermedades neurodegenerativas asociadas a los depósitos de
amiloide, a las que también se hace referencia como enfermedades
asociadas al amiloide, tales como enfermedad de Alzheimer, y otros
trastornos asociados a la amiloidosis localizada, tales como la
diabetes de tipo 2.
La presente invención está dirigida también a
métodos para inhibir la producción de amiloidosis del tipo de
Alzheimer en un mamífero, que comprende administrar una cantidad
farmacéuticamente eficaz de un péptido amiloide modificado capaz de
provocar una respuesta inmunitaria, en los que la respuesta
inmunitaria previene, dificulta o disminuye la cantidad de
depósitos de amiloide. La mitigación de síntomas relacionados con la
amiloidosis, seguido de la administración de derivados de péptidos
amiloides, tales como los descritos en la presente invención,
resulta de la estimulación de las respuestas inmunitarias apropiadas
de modo que la acumulación o formación de los agregados de amiloide
se modifica, retarda o impide de manera significativa.
Los trastornos o enfermedades asociadas al
amiloide incluyen, pero no están limitados a, diabetes de tipo 2,
amiloide A (reactivo), amiloidosis secundaria, poliserositis
familiar recurrente, nefropatía amiloide familiar con urticaria y
sordera (síndrome de Muckle-Wells), amiloide de
cadena ligera lambda o amiloide de cadena ligera kappa (idiopático,
mieloma o asociado a una macroglobulinemia), A beta 2M (hemodiálisis
crónica), ATTR (polineuropatía amiloide familiar (portuguesa,
japonesa, sueca), cardiomiopatía amiloide familiar (danesa),
amiloide cardiaco aislado (amiloidosis senil sistémica), AIAPP o
insulinoma de amilina, factor natriurético atrial (amiloide atrial
aislado), procalcitonina (carcinoma medular de tiroides), gelsolina
(amiloidosis familiar (finlandesa)), cistatina C (hemorragia
cerebral hereditaria con amiloidosis (islandesa)),
AApo-A-I (polineuropatía
amiloidótica familiar-Iowa),
AApo-A-II (senescencia acelerada en
ratones), sustancia amiloide asociada al fibrinógeno; y Asor o Pr
P-27 (encefalopatía espongiforme ovina, enfermedad
de Creutzfeld-Jakob, síndrome de
Gerstmann-Sträussler-Scheinker,
encefalopatía espongiforme bovina), o en casos de personas que son
homocigóticas para el alelo 4 de la apolipoproteína E.
Métodos y composiciones adicionales de la
presente invención comprenden composiciones que comprenden al menos
un péptido, fragmento o proteína modificados, preferiblemente
suministrados en bicapas liposómicas tales como liposomas, que se
usan en métodos para provocar una respuesta inmunitaria.
Preferiblemente, estas respuestas inmunitarias son capaces de
vencer la tolerancia inmunitaria a las proteínas "propias". Es
deseable provocar tales respuestas inmunitarias frente a péptidos
amiloides para tratar o prevenir la amiloidosis. Los productos de
la respuesta inmunitaria se usan para afectar los depósitos de
amiloide, preferiblemente solubilizando los agregados de amiloide.
Los productos de la respuesta inmunitaria, que incluyen pero no
están limitados a anticuerpos, antisueros, células estimuladas y
factores celulares, y antígenos de naturaleza amiloidea modificada,
péptidos, fragmentos o proteínas, están comprendidos en las
composiciones de la presente invención.
Una realización preferida de la presente
invención comprende composiciones de, y métodos para usar, un
péptido modificado, preferiblemente
A\beta_{1-16}, para provocar una respuesta
inmunitaria. Los productos de la respuesta inmunitaria o la
respuesta inmunitaria in vivo se usan para disolver o
disolver parcialmente depósitos de amiloide. Es deseable provocar
una respuesta inmunitaria frente al amiloide \beta
1-16 (A\beta_{1-16}). Un
anticuerpo monoclonal, 6C6, desarrollado contra el mismo epítopo, el
péptido amiloide \beta 1-16, es capaz de
solubilizar fibras y ovillos de amiloide \beta in vitro.
Esta realización particular se refiere específicamente a la
enfermedad de Alzheimer y trastornos asociados a agregados de
amiloide \beta, pero esta invención incluye derivados de péptidos
amiloides y su uso para provocar respuestas inmunitarias capaces de
prevenir o dificultar trastornos asociados a la amiloidosis en
general, y a enfermedades asociadas al amiloide.
Las composiciones preferidas comprenden péptidos
que están modificados mediante unión covalente de restos, tales
como restos lipófilos, tales restos son capaces de presentar el
péptido en el exterior del agente de suministro, tal como por
anclaje del péptido en la pared lipídica de un liposoma. Los métodos
preferidos comprenden la administración en sujetos, tales como
seres humanos, mamíferos u otros animales, por ejemplo, mediante
inyección.
Las composiciones que comprenden liposomas con
péptidos modificados se usan en métodos de vacunación y
composiciones descritos en la presente invención, que comprenden
antisueros que resultan de una respuesta inmunitaria a un antígeno,
tienen utilidad terapéutica en el tratamiento de enfermedades
asociadas al amiloide, preferiblemente EA. Las composiciones se
administran preferiblemente al sujeto que tiene una enfermedad
asociada al amiloide. Será evidente para los expertos en la técnica
que pueden usarse vehículos, dependiendo de, por ejemplo, la vía de
administración y la concentración de las composiciones de vacuna o
antisueros que se están administrando. Las composiciones de vacuna
o antisueros pueden administrarse al sujeto mediante inyección (por
ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular),
o por otros métodos tales como infusión, para asegurar que la
administración en el torrente sanguíneo es de una forma eficaz.
Están incluidas vías adicionales de administración, para que se
ejerzan los efectos terapéuticos locales así como los
sistémicos.
Las dosis eficaces y métodos de administración
para administrar las composiciones que comprenden las vacunas o
antisueros pueden determinarse empíricamente, y tales
determinaciones están dentro de la habilidad de un artesano. Los
expertos en la técnica comprenderán que la dosis que se necesita
depende del sujeto que recibe la proteína, la vía de
administración, el tipo particular de antígeno peptídico usado y de
otras sustancias que se están administrando, entre otras
consideraciones.
Las composiciones de vacuna o antisueros pueden
administrarse también al sujeto animal en combinación con
cantidades eficaces de uno o más de otros agentes terapéuticos.
Pueden administrarse de manera secuencial o al mismo tiempo con uno
o más de los otros agentes terapéuticos. Las cantidades de
composiciones de vacuna o antisueros y el agente terapéutico
dependen del tipo de agentes terapéuticos usados, el trastorno que
se está tratando, y el horario y vías de administración, entre
otras consideraciones. Después de la administración de las
composiciones de vacuna o antisueros al sujeto animal, se sigue el
estado fisiológico del animal de varios modos bien conocidos por el
médico experto.
Esta invención se ilustra además mediante los
siguientes ejemplos, que no han de interpretarse de ningún modo
como que imponen limitaciones a su alcance. A la inversa, ha de
entenderse claramente que puede recurrirse a otras diversas
realizaciones, modificaciones, y sus equivalentes que, después de
leer la descripción en la presente invención, se les ocurran a los
expertos en la técnica, sin apartarse del espíritu de la presente
invención y/o el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se usaron los siguientes métodos para preparar
composiciones de vacunas. Se añadieron lisinas palmitoiladas a
ambos extremos del péptido A\beta 1-16, para
anclar el péptido amiloide \beta 1-16
(A\beta_{1-16}) en la bicapa liposómica. Véase
la figura 1.
Se adoptaron dos estrategias, y se sintetizaron
dos tetrapalmitoíl-péptidos por medio de un
sintetizador de péptidos Applied Biosystems: 1) El extremo N tiene
dos restos de palmitoílo (es decir,
\alpha,\varepsilon-dipalmitoíl-lisina),
mientras que en el extremo C se insertaron de manera secuencial dos
a-palmitoíl-lisinas; 2) se insertan
cuatro a-palmitoíl-lisinas, dos en
cada extremo. Para la síntesis automática en fase sólida del
péptido, se protegió en el N el primer aminoácido, una
a-palmitoíl-lisina, y se ancló en la
resina de alcohol 4-alcoxibencílico por medio de
un enlace de éster. Se prefirió el grupo
fluorenilmetoxi-carbonilo (Fmoc) como el grupo
protector de la a-amina para la lisina y sus
derivados. Los métodos para preparar tales componentes básicos son
conocidos. Véanse las figuras 2a y b.
Se hizo reaccionar la
Fmoc-Lys(Pal)OH (de BACHEM) con la
resina de alcohol alcoxibencílico (de BACHEM) en presencia de
diciclohexilcarbodiimida (DCC, Aldrich) y dimetilaminopiridina
(DMAP, Aldrich) en cloruro de metileno seco, recién destilado,
conforme al método optimizado por G. Lu et al., J. Org.
Chem., 46, 3433 (1981). Después de agitación durante tres horas
a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró y se lavó a
fondo diez veces con cloruro de metileno seco. Para asegurar una
reacción completa, la resina obtenida se hizo reaccionar una vez
más con una porción nueva de FmocLys(Pal)OH, en
presencia de DCC y DMAP en cloruro de metileno seco, a temperatura
ambiente durante la noche. Al día siguiente, después de filtración
y lavado con cloruro de metileno, la resina se secó a vacío. El
espectro de infrarrojo con transformada de Fourier
(FT-IR) del producto muestra las bandas esperadas
para el enlace de éster a 1720 cm^{-1}, para el grupo NH a 3327
cm^{-1} y para el grupo carbonilo de amida a 1626 cm^{-1}. Todas
estas bandas están ausentes en el espectro de FT-IR
de la resina de alcohol alcoxibencílico de partida. La cantidad
final fue de 227 mg con una carga de aproximadamente 0,5 mmoles/g.
Véase la figura 6(c).
Se añadió a la resina la segunda resina
palmitoilada, por medio de FmocLys(Pal)OH después de
la desprotección (retirada del grupo Fmoc). Luego, se llevaron a
cabo 16 ciclos de síntesis para el amiloide \beta. Para fines de
ensayos, se escindió luego una pequeña cantidad de este péptido de
la resina, y se investigó mediante espectrometría de masas por
electropulverización (ES-MS). La mezcla de reacción
en bruto muestra la presencia de tres péptidos, siendo el
componente principal el deseado, con picos a 896,9, 673,0 y 538,0
Da, que corresponden a los iones moleculares cargados +3, +4 y +5,
respectivamente. El ión molecular está ausente en el espectro, pero
puede inferirse de esta serie a 2687,86 Da. Los otros dos
componentes corresponden a péptidos con una o dos lisinas
palmitoiladas menos (diferencia de masas de 367 Da), con iones
moleculares que se infieren a 2321,43 y 1953,87 Da. Esto indica que
el acoplamiento de FmocLys(Pal)OH fue incompleto.
La
\alpha,\varepsilon-dipalmitoíl-lisina
se acopló al resto de la resina sin escindir. Incluso tiempos
prolongados de acoplamiento (durante la noche a temperatura
ambiente) dejaron material sin reaccionar (ensayo de la ninhidrina)
debido a la baja solubilidad en DMF de la lisina dipalmitoilada.
Después de la escisión de la resina, el espectro de
ES-MS muestra que el
tetrapalmitoíl-péptido deseado (M+ = 3292,43) está
presente solamente en aproximadamente 20%.
En un segundo experimento, para evitar el
acoplamiento lento con
\alpha,\varepsilon-dipalmitoíl-lisina,
después de completarse los 16 ciclos que aprehendieron los restos
de amiloide \beta en las dos primeras
palmitoíl-lisinas, se insertaron dos
palmitoíl-lisinas secuenciales al final, llevándose
a cabo el acoplamiento dos veces para cada una. El espectro de
ES-MS después de la escisión de la resina (con ácido
trifluoroacético (TFA)) muestra los picos deseados del
tetrapalmitoíl-péptido como el M4+ a 855,4 Da y el
M5+ a 05,4 que correspondían a un ión molecular de 3421,65. Este
péptido equivale a aproximadamente 35% de la mezcla, siendo el
principal componente un péptido con dos restos menos de
Lys(Pal) (M+ a 2688,58 Da). Un componente secundario tenía un
resto más ausente (M+ a 2560,42 Da).
La mezcla de péptidos estaba compuesta del
péptido tetrapalmitoilado deseado y de péptidos a los que faltaban
restos de palmitoílo, haciendo de este modo la doble inserción en
los liposomas improbable. Por lo tanto, se decidió usar las mezclas
para la preparación de liposomas.
La palmitoilación directa de lisina con cloruro
de palmitoílo en una reacción de Schotten-Baumann
con hidróxido sódico acuoso, a una escala de 20 g, condujo a un
material que contenía cantidades apreciables de ácido palmítico y
que no pudo separarse de la a,e dipalmitoíl-lisina
deseada. Tuvo que adoptarse un método indirecto siguiendo los
procedimientos de H. Kiwada, et al., Chem. Pharm.
Bull., 35, 2935-39 (1987); Y. Lapidat, et
al., J. Lipid Res., 9, 142-44 (1967).
El éster de palmitoílo de la
N-hidroxisuccinimida se sintetizó en primer lugar a
partir de ácido palmítico (Fluka),
N-hidroxisuccinimida (Aldrich), en presencia de DCC
(Aldrich) en acetato de etilo con un rendimiento de 77%. Este éster
activado se hizo reaccionar posteriormente con la sal sódica de
lisina den tetrahidrofurano acuoso. El producto en bruto obtenido
después de la filtración y lavado con agua contenía todavía algo de
éster activado sin reaccionar, como lo demuestran los espectros de
RMN de protón y de masas con bombardeo con átomos rápidos (FAB). La
recristalización con cloroformo proporcionó una muestra pura de 640
mg. Su espectro de masas FAB muestra el pico esperado a 623 Da
(MH+) y la ausencia del pico para el éster activado (354 Da). Véanse
las figuras 3 y 4.
Se usaron liposomas con lípido A como
auxiliares, en un intento de romper la tolerancia inmunitaria del
ratón a A\beta 1-16. Se prepararon mezclando
dimiristoíl-fosfatidilcolina,
dimiristoíl-fosfatidil-glicerol, y
colesterol (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, EE.UU.) en razones
molares de 0,9, 0,1:0,7. Se añadió lípido A monofosforilado, un
inmunomodulador fuerte (IASL Biologicals, Campbell, CA, EE.UU.) en
una concentración de 40 mg por mmol de fosfolípidos. Tosi et
al., Biochem. Mophys. Res, Com., 212,
494-500 (1995). Los péptidos palmitoilados se
añadieron con una razón molar con relación a los fosfolípidos de
1:100 y 1:200. Los disolventes se evaporaron. La película
resultante, después de hidratación con disolución salina tamponada
con fosfato estéril (PBS, pH 7,4) con una concentración final de
fosfolípidos de 4 mM, se homogeneizó adicionalmente mediante
agitación orbital. La suspensión de liposomas se mezcló con Alum
estéril 15 minutos antes de la inyección (9:1 vol:vol, Rehydrogel,
HYA, Rebeis Inc, Berkley Heights, NJ).
Se inmunizaron ocho ratones BALB/c (Charles
River Laboratories, Wilmington, MA, EE.UU.) mediante 6 inoculaciones
i.p. en intervalos de dos semanas, con 200 \mul de la suspensión
del péptido palmitoilado-liposoma/Alum. Un grupo de
3 ratones fue inmunizado conforme al mismo protocolo sólo con
PBS/Alum. Otro grupo de 3 ratones fue inmunizado conforme a este
protocolo, con fosfolípidos 4 mM en PBS y Alum, sin A\beta
1-16 palmitoilado. Se recogió sangre de la vena de
la cola 4 días después de la inyección. La sangre recogida
(10-30 \mul) se diluyó inmediatamente con 10
\mul de PBS y 5 \mul de heparina. Las muestras se centrifugaron,
se retiró el suero, y se ensayaron en un análisis ELISA.
Un segundo grupo de 19 ratones transgénicos
(NORBA, Hoechst Marion Roussel, Bridgewater, NJ) de diferentes
edades, presentaban de manera constitutiva placas de amiloide
\beta en sus páncreas. Fueron inmunizados usando el mismo
protocolo descrito anteriormente. Antes de ser sacrificados, los
ratones NORBA inmunizados recibieron una 5ª inmunización. Se recogió
sangre, y se analizó para detectar anticuerpos antiamiloide \beta
en un análisis ELISA.
Además, 12 ratones B57131/6 fueron inmunizados
como se ha descrito anteriormente. En este grupo se usaron para
inyección liposomas y amiloide \beta (1-16)
palmitoilado, liposomas; mezclados con amiloide \beta
(42-1) "scrambled" y liposomas. Se añadió Alum
como anteriormente. Como testigos adicionales, se inmunizaron 3
ratones con liposomas y amiloide \beta (1-16)
palmitoilado, pero sin Alum. Se recogió sangre, y se ensayó como se
ha descrito.
Se revistieron placas para microvaloracion con
50 \mul de disolución de amiloide \beta 1-28 (1
mg/ml), durante la noche a 40ºC. Siguió el bloqueo de los pocillos
con 200 \mul de seroalbúmina bovina (BSA)/PBS (BSA al 0,5%)
durante dos horas a 37ºC, antes de lavar con 200 \mul de PBS/Tween
20 al 0,005%.
Se incubaron diversas diluciones de suero
(1:100-1:100.000) durante 2 horas a 37ºC. Las placas
se lavaron luego dos veces con 200 \mul de PBS/Tween 20 al
0,005%, antes de añadir 50 \mul de un anticuerpo caprino
anti-ratón (conjugado con fosfatasa alcalina) en una
dilución 1:30.000. Después de 2 horas a 37ºC, los pocillos se
lavaron como se ha descrito anteriormente. Luego, se añadieron 100
\mul del sustrato (pNPP, fosfato de
p-nitrofenilo, 1 comprimido en 5 ml de agua
destilada), y se determinó la absorción a 405 nm mediante un lector
de ELISA 30-60 min más tarde.
Después de la tercera inyección con
liposomas/amiloide \beta (1-16) palmitoilado, los
análisis ELISA mostraron una respuesta inmunitaria significativa en
los ratones Balb/c vacunados. Los anticuerpos fueron específicos
para el antígeno inyectado. Las DO_{405} de las diluciones 1:5000
de los sueros recogidos fueron de 10 a 20 veces superiores a las de
los testigos, que fueron diluciones de ratones sin tratar. De este
modo, este procedimiento de inmunización provocó una respuesta
inmunitaria frente a A\beta 1-16 en ratones. No se
detectó respuesta inmunitaria en los ratones que habían recibido
las inmunizaciones testigo.
Se usó el mismo protocolo de inmunización para
la inoculación de ratones transgénicos NORBA, para estudiar la
unión a, y posiblemente la disolución de, placas de amiloide \beta
en sus páncreas in vivo. Se inmunizaron 19 ratones
transgénicos (NORBA, Hoechst Marion Roussel, Bridgewater, NJ) de
diferentes edades, que presentaban de manera constitutiva placas de
amiloide \beta en sus páncreas. Antes de ser sacrificados, los
ratones NORBA inmunizados recibieron una séptima inmunización. Se
recogió sangre, y se analizó para detectar anticuerpos antiamiloide
\beta en un análisis ELISA. En las diluciones 1:5,000 de los
sueros, la DO_{405} fue 10 veces superior a la de los testigos.
Los ratones NORBA testigos no mostraron ningún anticuerpo
anti-A\beta en sus sueros. El tercer grupo de
ratones C57B1/6 inmunizados que recibieron A\beta
1-16 así como el A\beta 42-1
"scrambled" y como testigos, liposomas sin péptido, alcanzó un
valor cuantitativo diez veces superior en una dilución 1:10,000 de
los sueros frente a los testigos. Véanse las tablas 1 y 2.
\vskip1.000000\baselineskip
- (Balb/c) inyección de refuerzo. Se inyectaron 3 animales para cada antígeno/auxiliares.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones C57B1/6 inmunizados fueron sometidos
a una investigación patológica después de que hubo finalizado el
procedimiento de inmunización. Se analizaron cortes de riñón,
hígado, médula ósea, páncreas, bazo, y cerebro.
\vskip1.000000\baselineskip
Fueron inmunizados 23 ratones NORBA de
diferentes edades con A\beta (1-16) palmitoilado
reconstituido en liposomas, con animales
amiloide-\beta-positivos y
amiloide-\beta-negativos, como se
ha descrito (19 ratones), o sólo con liposomas (4 ratones). Estos
animales tenían las placas de amiloide \beta en el páncreas en vez
de en el cerebro. Los ratones vacunados se sacrificaron después de
la 7ª inyección, se recogieron sus páncreas y se conservaron en
formalina. Los fragmentos de páncreas conservados se sumergieron en
una disolución de sacarosa para prepararlos para cortes congelados.
Los cortes delgados obtenidos se analizaron mediante tioflavina T,
un colorante fluorescente específico para tinción de agregados de
amiloide \beta (Vassar y Culling. 1959), para detectar amiloide
\beta en la superficie del páncreas. Los cortes se analizaron
también usando anticuerpo antiamiloide \beta marcado con FITC
(Accurate Chemical Co., Westbury. CT). La unión de los
"autoanticuerpos" de ratón a las placas de amiloide \beta se
analizó con anticuerpos de conejo contra la IgG de ratón, marcados
con FITC.
Se llevó a cabo un estudio histológico de cortes
de páncreas teñidos con tioflavina T de ratones transgénicos NORBA,
vacunados con A\beta (1-16) palmitoilado
reconstituido en liposomas. El tejido pancreático teñido de un
animal amiloide-\beta-negativo
mostró una fluorescencia de fondo débil y difusa con algunas manchas
brillantes que representaban vasos. Las células acinares eran
completamente oscuras. Un animal de 18 meses de edad con placas de
amiloide \beta completamente desarrolladas mostró una
fluorescencia intensa por todas las partes de los campos de las
células acinares. También hubo áreas fluorescentes muy brillantes
que indicaban vasos sanguíneos más grandes. Un ratón de 18 meses de
edad con placas de amiloide \beta completamente desarrolladas,
que fue vacunado y examinado 4 meses después de la primera
inoculación, mostró áreas focales (zonas localizadas) de
fluorescencia entre células acinares, pero de modo predominante
muchas zonas localizadas de células acinares no fluorescentes. Los
resultados mostraron que la vacunación o disgregó las placas de
amiloide \beta o anularon su depósito.
La evaluación cuantitativa de la intensidad de
fluorescencia media en cada corte teñido con tioflavina usando un
programa informático de análisis de luminosidad, indicó que los
cortes de páncreas de animales NORBA vacunados de 19 meses de edad
mostraron menos de 25% de la fluorescencia de gran intensidad que
los mismos animales sin vacunar. Un muestreo de estas
cuantificaciones se muestra en la tabla 3.
Cada valor es la media de 5 recuentos. Resulta
que la vacunación reduce notablemente (más de 70%) la fluorescencia
de alta intensidad en los cortes de páncreas teñidos con tioflavina
de los ratones transgénicos NORBA que desarrollaron completamente
placas de amiloide \beta. La fluorescencia de intensidad
intermedia y baja, que es inespecífica ya que también es detectada
en los testigos negativos, permanece inalterada tras la vacunación.
No hay una alta intensidad de fluorescencia en los testigos
negativos.
Se llevaron a cabo experimentos in vitro
para investigar el mecanismo mediante el cual los
"autoanticuerpos" disgregan las placas. Se prepararon
agregados de amiloide \beta usando la secuencia A\beta
(1-28), incubando durante 7 días a 37ºC en
disolución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH=7,1. Esta es la
secuencia usada para la inmunización de los ratones. Estos
depósitos fueron detectables por tinción con tioflavina T ("Th
T"). Th T tiñe depósitos de tipo amiloide, y muestra una emisión
de fluorescencia intensificada a 482 nm, y un nuevo pico de
excitación a 450 nm cuando se añade a una suspensión de
preparaciones de hojas \beta agregadas (Solomon et
al.(1997) PNAS 94,
4109-4112). La figura 5 muestra de manera comparativa la desagregación de fibras de amiloide \beta mediante el anticuerpo monoclonal 6C6, y mediante sueros de ratones inmunizados con A\beta (1-16) palmitoilado reconstituido en liposomas.
4109-4112). La figura 5 muestra de manera comparativa la desagregación de fibras de amiloide \beta mediante el anticuerpo monoclonal 6C6, y mediante sueros de ratones inmunizados con A\beta (1-16) palmitoilado reconstituido en liposomas.
Resulta que ambos anticuerpos tienen propiedades
solubilizantes, pero los anticuerpos monoclonales tienen un efecto
significativamente más fuerte que el suero de los ratones
inmunizados, que contiene anticuerpos policlonales.
Cualquier patente u otra publicación mencionada
en esta memoria descriptiva son indicativas de los niveles de los
expertos en la técnica con la que está relacionada. Un experto en la
técnica apreciará fácilmente que la presente invención se adapta
bien para llevar a cabo los objetos, y obtener los fines y ventajas
mencionados y los intrínsecos. Los presentes ejemplos junto con los
métodos, procedimientos, tratamientos, composiciones, y compuestos
específicos descritos en la presente invención, son representativos
actualmente de realizaciones preferidas, y no tienen la finalidad
de limitar el alcance de la invención. Los expertos en la técnica
conocerán o serán capaces de descubrir muchos equivalentes a las
realizaciones específicas de la invención descritas en los ejemplos
anteriores, usando solamente experimentos habituales.
<110> Aventis Pharma S.A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos y composiciones para
enfermedades asociadas con la amiloidosis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 14723-0112WP
49055-263528
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/255,033
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-12-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/230,391
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-09-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Anticuerpo monoclonal 6C6
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(333)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Murinae gen. sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 209
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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sintético
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Claims (15)
1. Una composición que comprende al menos un
péptido amiloide \beta 1-16 palmitoilado anclado
en una bicapa liposómica.
2. La composición conforme a la reivindicación
1, en la que la capa liposómica es un liposoma.
3. La composición conforme a una cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el resto de palmitoílo es una
lisina palmitoilada.
4. La composición conforme a la reivindicación
3, en la que las lisinas palmitoiladas se añaden al extremo C del
péptido amiloide \beta 1-16.
5. La composición conforme a la reivindicación
4, en la que se añaden dos lisinas palmitoiladas al extremo C del
péptido amiloide \beta 1-16.
6. La composición conforme a la reivindicación
3, en la que las lisinas palmitoiladas se añaden al extremo N del
péptido amiloide \beta 1-16.
7. La composición conforme a la reivindicación
6, en la que se añaden dos lisinas palmitoiladas al extremo N del
péptido amiloide \beta 1-16.
8. La composición conforme a una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4 y 6, en la que las lisinas palmitoiladas
se añaden al extremo C y al extremo N del péptido amiloide \beta
1-16.
9. La composición conforme a una cualquier de
las reivindicaciones 1 a 8, en la que el péptido amiloide \beta
1-16 palmitoilado comprende cuatro restos de
palmitoílo.
10. La composición conforme a una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, en la que se añaden dos lisinas
palmitoiladas al extremo C del péptido amiloide \beta
1-16, y se añaden dos lisinas palmitoiladas al
extremo N del péptido amiloide \beta 1-16.
11. Una composición farmacéutica que comprende
una composición conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 10, y un vehículo.
12. Un medicamento que comprende una cantidad
farmacéuticamente eficaz de una composición conforme a una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
13. Uso de una composición conforme a una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para fabricar un
medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas al
amiloide.
14. Uso conforme a la reivindicación 13, en la
que la enfermedad asociada al amiloide es la enfermedad de
Alzheimer.
15. Uso conforme a la reivindicación 13, en el
que las enfermedades asociadas al amiloide comprenden diabetes de
tipo 2, amiloide A (reactivo), amiloidosis secundaria, poliserositis
familiar recurrente, nefropatía amiloide familiar con urticaria y
sordera (síndrome de Muckle-Wells), amiloide de
cadena ligera lambda o amiloide de cadena ligera kappa (idiopático,
mieloma o asociado a una macroglobulinemia), A beta 2M (hemodiálisis
crónica), ATTR (polineuropatía amiloide familiar (portuguesa,
japonesa, sueca), cardiomiopatía amiloide familiar (danesa),
amiloide cardiaco aislado (amiloidosis senil sistémica), AIAPP o
insulinoma de amilina, factor natriurético atrial (amiloide atrial
aislado), procalcitonina (carcinoma medular de tiroides), gelsolina
(amiloidosis familiar (finlandesa)), cistatina C (hemorragia
cerebral hereditaria con amiloidosis (islandesa)),
AApo-A-I (polineuropatía
amiloidótica familiar-Iowa),
AApo-A-II (senescencia acelerada en
ratones), sustancia amiloide asociada al fibrinógeno; y Asor o Pr
P-27 (encefalopatía espongiforme ovina, enfermedad
de Creutzfeld-Jakob, síndrome de
Gerstmann-Sträussler-Scheinker,
encefalopatía espongiforme bovina), y personas que son homocigóticas
para el alelo 4 de la apolipoproteína E.
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