KR20050072744A

KR20050072744A - 암 조절 방법

Info

Publication number: KR20050072744A
Application number: KR1020057004541A
Authority: KR
Inventors: 셀리-앤 스테펜손
Original assignee: 더 퀸 엘리자베스 허스피탈 리서치 화운데이션 인코포레이티드
Priority date: 2002-09-16
Filing date: 2003-09-16
Publication date: 2005-07-12
Also published as: CN1694902A; MXPA05002894A; DE60334820D1; ES2355503T3; WO2004024773A1; CA2499130A1; AU2002951409A0; ATE486892T1; NZ539203A; EP1546205A1; US20060134118A1; CN1694902B; BR0314369A; ZA200502863B; JP2006517906A; US7722866B2; EP1546205A4; EP1546205B1; JP4799863B2

Abstract

본 발명은 EphB4 폴리펩티드의 에피토프에 결합하는 항체 또는 항원 결합부분을 사용하여 세포의 암성 성장을 저해하는 방법을 제공한다. EphB4의 정제된 항체도 제공된다. 본 발명은 또한, 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 세포의 암성 성장을 저해할 수 있는 제제를 확인하는 방법을 제공한다.

Description

암 조절 방법{Methods for Regulating Cancer}

본 발명은 암 조절 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세포의 암성 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 세포의 암성 성장을 억제할 수 있는 제제를 확인하는 방법을 제공한다.

암은 신체의 세포 성장의 이상 조절로부터 초래되는 질병들은 의미한다. 악성 암은 이러한 이상 조절된 성장으로부터 발발하고, 혈류 또는 림프계를 경유하여 신체 주위로 퍼지게 되며, 이는 전이(metastasis)로서 알려진 절차이다. 상피 조직의 악성 종양은 가장 보편적인 형태의 암이며, 서구 산업국가에서 대다수의 암 관련 사망에 대하여 책임이 있다. 호주 건강복지부(Australian Institute of Health and Welfare (AIHW))에 의하면, 평균적으로 세 명의 남성 중 한 명 및 네 명의 여성 중 한 명이 75세 이전에 암에 걸릴 것이다(1). 남성에서, 가장 보편적인 암은 전립선암, 장 암 및 폐암이며, 여성에서는 유방암, 장 암 및 흑색종(melanoma)이다. 종양 조직 내에서 특이적으로 발현되나 정상 조직 내에서는 발현되지 않는 유전자의 동정 및 그 작용에 대한 분석이 암 치료법에 대한 새로운 타겟을 확인하는데에 있어 유용하다.

몇몇 유전자가 다양한 암에 수반되어 오고 있다. 예를 들면, 발암 유전자(oncogene)는 표피 성장 인자와 같은 세포 성장 인자의 수용체를 코딩하는 것으로 알려져 있다. ras 유전자는 모든 인간 췌장암의 90%, 인간 대장암의 50%, 폐암의 40%, 및 백혈병(leukemia)의 30%까지 책임 있는 것으로 믿어지는 발암 유전자이다. 돌연변이된 발암 유전자는 암 유발 유전자가 될 수 있다. 그러한 돌연변이된 발암 유전자는 비조절된 세포 성장을 유발하는 단백질 카이나아제 및 단백질 인산화 효소와 같은 단백질을 코딩한다. EphB4는 수용체 단백질 티로신 카이나아제 부류의 최근 확인된 일원이다. Eph 수용체 부류의 일원은 신경 발달, 혈관신생(angiogenesis) 및 혈관 네트워크 어셈블리를 포함하는 많은 세포성 절차에 수반되는 것으로 확인되어 오고 있다(2-5). 이들의 리간드인 에프린(ephrins)과의 상호 작용의 결과, 이들은 접촉 억제, 세포골격 조직화 및 세포 이동과 같은 세포 기능을 조절하는 접촉-의존적 세포 상호작용을 중재한다(6,7).

세포독성 화합물과 같은 성장 억제 분자를 포함하는 다수의 항암 제제가 암을 치료하려는 시도에서 개발되어 오고 있으나, 효율적인 암 조절 방법을 제공할 필요성이 여전히 남아 있다.

도 1은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노산 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200-Snta Cruz Biotechnology)를 사용한 세 개의 상이한 대장암 및 이에 대응하는 정상적인 점막 내에서 EphB4 발현의 면역조직화학적 위치 측정(localisation)을 도시한다. 비오티닐화된 2차 항체로부터의 어두운 얼룩은 EphB4 단백질을 나타낸다. 핵을 Harris 헤마톡실린으로 착색한다. 세 개의 상이한 선암(adenocarcinoma) (잘 분화된, 중간 정도 분화된, 및 잘 분화되지 않은) 및 이에 대응하는 정상적인 점막의 고배율(100X) 확대 영상을 도시한다. 종양 조직의 강한 착색 및 정상 조직의 매우 약한 확산된 착색이 각각의 샘플 세트로부터 명백하였다. 2차 항체와의 교차-반응성은 없었다(도시하지 않음).

도 2는 다섯개의 종양(T)/정상(N) 쌍에서 EphB4(117bp) 및 내부 18S rRNA(489bp)의 발현을 비교하는 상대적 RT-PCR을 도시한다. 환자 5, C1-대장암 세포주 LIM2405, C2-대장암 세포주 SW480, RT-RT 음성 대조군, P-PCR 음성 대조군, M-pUC19/HpaII 마커로부터의 LM-간 전이 및 NL-정상 간.

도 3은 2ml DMEM 내 세포의 합류 단일층을 EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200-Santa Cruz Biotechnology)의 1/500 희석액 (0.4 ng/㎕ 최종농도)으로 처리함을 보인다. 항체와 함께 세포를 배양하면 24 내지 48 시간 사이에 가시적인 반응이 야기된다. 세포는 가벼운 교반에 의하여 쉽게 깨지는 약한 시트 내에서 배양 용기 바닥으로부터 들어올려진다. 매질의 색상 변화는 사멸한 세포로부터의 세포 내용물의 누출에 의한 0.5pH 단위 변화로 인한 것이다.

도 4는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200-Santa Cruz Biotechnology)의 증가된 투여량의 48시간 후 생체내 MCF-7 세포 성장에 대한 영향을 도시한다.

도 5는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200-Santa Cruz Biotechnology)의 투여량 의존성을 결정하기 위한 트리판 블루 배제 분석을 도시한다. 생존 가능한 세포의 수(x100000)(Y-축)는 상이한 세 개의 EphB4 항체 희석액에의 노출(X-축) 후 48에 감소한다. 1㎍/ml 첨가후 72 시간에 남아있는 생존 세포는 없었으며, 2㎍/ml 첨가후 8 시간에 남아있는 생존 세포는 없었다.

도 6은 카스파아제(caspase)-3 분석을 도시한다. 100000 세포 당 카스파아제-3 활성의 상대적인 양(Y-축)은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200-Santa Cruz Biotechnology)의 모든 희석액에 대하여 일정 시간(X-축) 후 증가한다. 1/200 희석액(1㎍/ml)에 대하여 72 시간 후, 및 1/100 희석액(2㎍/ml)에 대하여 48 시간 후, 생존 세포는 카운트되지 않았으므로, 카스파아제-3 활성을 측정하지 않았다.

도 7은 다섯개의 상이한 EphB4 항체 처리 후 65시간에 유방암 세포의 퍼센트 생존률을 도시하는 그래프이다: (1) 마우스 EphB4(Dr Andrew Ziemiechi, University of Bern으로부터 제공)의 카르복시 말단의 아미노산 잔기 825 내지 991에 대한 EphB4 폴리클로날 항체(Swiss), (2) 숙성 EphB4(SEQ ID NO:1)의 아미노산 잔기 16 내지 34일 것으로 추정되는 EphB4 아미노산 서열의 N-말단 첫번째 19 아미노산에 대한 폴리클로날 N-말단 EphB4 항체 (N-19 Santa Cruz Biotechnology), (3) Eph B4(SEQ ID NO:1)의 아미노산 잔기 615 내지 874로 이루어지는 티로신 카이나아제 도메인에 상응하는 카르복시-말단에 대한 폴리클로날 EphB4 C-말단 항체(C-16 Santa Cruz Biotechnology), (4) EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노산 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200-Santa Cruz Biotechnology), 및 (5) EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200(old)-Santa Cruz Biotechnology-Lot number B141 batch). 세포를 스톡 항체 1/100 희석액(200㎍/ml)으로 처리한 다음, 트리판 블루로 착색하였다(사멸된 세포를 착색). 착색되지 않은(생존가능한) 세포 대 착색된(생존가능하지 않은) 세포의 비율을 각각의 처리에 대하여 네 개의 상이한 분취량에 대하여 계산하였다. 대조군-항체 첨가되지 않음. CLM- 보충 제한 배지. FCS-10% 태아 소 혈청이 배지에 첨가됨. 보충물은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200-Santa Cruz Biotechnology)의 세포사 영향에 있어 중요한 역할을 하지 않는다. 이는 정상적인 단백질 활성을 가진 배지 내 성장한 세포와(FCS 실험), 55℃에서 30분 동안 가열함에 의하여 보충 단백질이 불활성화된 배지 내에서 성장한 세포(CLM 실험)에의 항체 첨가 후 퍼센트 생존률을 비교함으로써 입증된다.

도 8은 정상적인 인간 조직과 대표적인 대장 종양에 대한 웨스턴 분석을 도시한다. (A) EphB4 단백질을 EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200-Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 동정하였다. 예측된 야생형 단백질은 120kDa이고, 화살표에 의하여 나타내어진다. (B) Coomassie 블루 착색된 한 쌍의 겔. 분자량 마커의 크기는 나타내는 바와 같다.

도 9는 야생형 EphB4 수용체의 도메인과 슬라이스 변이체 EphB4v1 및 EphB4v2의 예측된 구조를 비교하는 개략도이다. 결실된 영역은 *로 나타낸다.

도 10은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200-Santa Cruz Biotechnology)의 1/100 희석액으로 65 시간 동안 처리하거나(처리군) 어떠한 처리도 하지 않은(대조군), 유방암 세포주 MDA-MB-231(231), MDA-MB-468(468), Hs578t, MCF7 및 T47D 내에서 EphB4 유전자 및 PBGD(하우스키핑 대조군)의 발현을 도시한다. RT-ve는 역전사 시약만이 대조군. 마커 1-Spp1/EcoR1 및 마커 2-pUC19/Hpa11.

도 11은 타겟 EphB4 서열의 첫번째 125 아미노산(굵게 표시함)에 걸치도록 고안된 여섯개의 오버래핑 펩티드[SEQ ID NO:2(펩티드 1) 내지 SEQ ID NO:7(펩티드 6)으로 도시함]의 서열을 도시한다. 숫자는 성숙 EphB4 단백질(도 18에서 SEQ ID NO:1으로 도시함) 내에 아미노산의 위치를 나타낸다.

도 12는 대조군 세포(미처리), EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200-Santa Cruz Biotechnology) 단독으로 처리하거나(Ab 단독), 항체 및 펩티드 칵테일로 처리한(Ab + 모든 펩티드) 내에서 생존 가능성을 비교한 트리판 블루 배제 분석을 도시한다. 테스트는 2회 수행하였다.

도 13은 대조군 세포(미처리), EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200-Santa Cruz Biotechnology) 단독으로 처리하거나(Ab 단독), 항체 및 펩티드 칵테일로 처리한(Ab + 모든 펩티드) 내에서 카스파아제-3 활성의 상대적 레벨을 비교하는 분석을 도시한다. 테스트는 2회 수행하였다.

도 14는 합류 SW480 단일층에 대하여 5㎕의 펩티드를 나타내는 바와 같이 첨가 또는 첨가하지 않고 EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200-Santa Cruz Biotechnology)의 1/500 희석액으로 처리 후 48 시간에 수행된 트리판 블루 배제 분석의 결과를 도시한다. 펩티드 1 및 2는 Ab-개재 세포사로부터 ~50% 세포를 구한 것으로 보였다.

도 15는 펩티드 1(SEQ ID NO:2) 또는 펩티드 2(SEQ ID NO:3)의 농도 증가(10㎕까지)가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200-Santa Cruz Biotechnology) 개재 세포사로부터 완전히 세포를 구할 수 있으며, 이는 펩티드 1 및 2의 조합(각각 5㎕)의 효과와 동등함을 보인다.

도 16은 배양액 내 세포 상에서 EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200-Santa Cruz Biotechnology)의 기능을 블로킹할 수 있는 두 개의 오버래핑 펩티드의 서열[SEQ ID NO:2(펩티드 1) 및 SEQ ID NO:3(펩티드 2)로 도시함] 및 반응성 서열의 추가적인 축소를 위하여 코어 서열 GSCVV 주위로 고안된 세 개의 펩티드의 서열[SEQ ID NO:8(펩티드 7) 내지 SEQ ID NO:10(펩티드 9)로 도시함]을 보인다.

도 17은 펩티드 7(SEQ ID NO:8)이 Ab-개재 세포사로부터 세포를 완전히 구할 수 있으며, 펩티드 2(SEQ ID NO:3)의 효과와 동등함을 보인다. EphB4(SEQ ID NO:1)의 외생적 도메인 아미노 잔기 201 내지 400에 특이적인 EphB4 폴리클로날 항체(H-200-Santa Cruz Biotechnology)(0.2㎍/ml) 1 마이크로리터 및 10mg/ml 스톡 펩티드 10㎕를 500㎕의 DMEM을 포함하는 24-웰 마이크로티터 플레이트 내에서 합류 단일층 세포 첨가 전에 2 시간 동안 얼음 위에서 함께 예비 인큐베이션하였다.

도 18은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 도시한다. SEQ ID NO:1은 성숙 호모 사피엔스 에프린 타입-B 수용체 4(EphB4: Homo sapiens Ephrin type-B receptor)의 아미노산 서열이다.

도 19는 검은색 괄호로 나타내어지는 상이한 폴리클로날 항체(N-19, H-200 및 C-16)가 표적화된 도메인 영역을 가지는 EphB4 수용체 모델을 도시한다. 구형 도메인(에프린 수용체 리간드 결합 도메인)은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 29 내지 197에 상응한다 시스테인-리치 영역(Giardia 변이체 특이성 표면 단백질)은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 255 내지 313에 상응한다. 피브로넥틴 타입 III 도메인 1은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 324 내지 414에 상응한다. 피브로넥틴 타입 III 도메인은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 437 내지 517에 상응한다. 트랜스멤버레인 도메인은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 540 내지 560에 상응한다. 티로신 카이나아제 도메인은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 615 내지 874에 상응한다. SAM(무균 알파 모티프) 도메인은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 904 내지 971에 상응한다. PDZ 도메인은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 985 내지 987에 상응한다.

EphB4 아미노산 서열에 대한 이러한 도메인의 위치는 NCBI 접근 번호 NP_004435로부터의 가장 최근 보고로부터 취한 정보에 기초한 것이다. N-19 항체는, 성숙 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 아미노산 잔기 16 내지 34일 수 있는 상기 서열의 N-말단의 첫번째 19개 아미노산에 대해 맵핑한다. C-16 항체는 티로신 키아나제 도메인에 관한 것이다. H-200 항체는, 시스테인 풍부 영역 및 섬유결합소 영역에 걸친 세포외 도메인에서 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 400에 특이적으로 지향해 있는 것이다.

도 20은 제안된 에피토프 서열을 포함하도록 디자인된 펩티드 11 (SEQ ID NO:12) 및 펩티드 10(SEQ ID NO:11)의 서열을 나타내며, 이 때, 상기 와일드 타입 서열에서 전하를 가진 아미노산 아스파르테이트(D)는 유사한 측쇄 구조의 아스파라긴(N)을 가진 비하전된 아미노산으로 치환된다. 굵은 글자체로 표시한 수 및 서열은 성숙 EphB4 단백질에서의 아미노산 위치를 나타낸다.

발명의 개요

본 발명은 EphB4 단백질의 특정 영역에 결합하는 항체가 암 세포의 세포사를 야기함으로써 암 세포 내에 암성 성장을 유리하게 억제할 수 있다는 놀라운 발견에 기초한 것이다.

따라서, 첫번째 측면에서, 본 발명은, 세포의 암성 성장을 억제하는 방법으로서, 상기 세포를 적어도 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 EphB4(SEQ ID NO:1의 잔기 201 내지 245, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합한다. 바람직하게, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합한다. 가장 바람직하게, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합한다. 바람직하게, 상기 서열은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 Asp(D)이 Asn(N)으로 치환된다.

두번째 측면에서, 본 발명은, 암 세포의 세포사를 유도하는 방법으로서, 상기 세포를 적어도 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 EphB(SEQ ID NO;1)의 잔기 201 내지 245, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합한다. 바람직하게, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 EphB(SEQ ID NO;1)의 잔기 220 내지 244, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합한다. 가장 바람직하게, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 EphB(SEQ ID NO;1)의 잔기 220 내지 230, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합한다. 바람직하게, 상기 서열은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 Asp(D)이 Asn(N)으로 치환된다.

세번째 측면에서, 본 발명은 대상에서 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 대상에게 적어도 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 EphB(SEQ ID NO;1)의 잔기 201 내지 245, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합한다. 바람직하게, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 EphB(SEQ ID NO;1)의 잔기 220 내지 244, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합한다. 가장 바람직하게, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 EphB(SEQ ID NO;1)의 잔기 220 내지 230, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합한다. 바람직하게, 상기 서열은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 Asp(D)이 Asn(N)으로 치환된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 세포의 암성 성장을 억제하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 제제가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90% 상동인 서열 영역 내에서 EphB4 폴리펩티드에 결합하는 능력을 평가하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 방법은 상기 제제가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90% 상동인 서열 영역 내에서 EphB4 폴리펩티드에 결합하는 능력을 평가하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 상기 방법은 상기 제제가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90% 상동인 서열 영역 내에서 EphB4 폴리펩티드에 결합하는 능력을 평가하는 단계를 포함한다. 가장 바람직하게, 상기 방법은 상기 제제가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230, 또는 이와 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90% 상동인 서열 영역 내에서 EphB4 폴리펩티드에 결합하는 능력을 평가하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 상기 서열은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 Asp(D)이 Asn(N)으로 치환된다.

본 발명은 또한 상기 방법에 의하여 확인된 제제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245와 적어도 85% 상동인, 바람직하게 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245에 적어도 90% 상동인 서열을 가지는 폴리펩티드에 결합하는 정제된 EphB4 항체를 제공한다. 바람직하게 상기 정제된 EphB4 항체는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244에 적어도 85% 상동인, 바람직하게 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244에 적어도 90% 상동인 서열을 가지는 폴리펩티드에 결합한다. 상기 정제된 EphB4 항체는 바람직하게 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230에 적어도 85% 상동인, 바람직하게 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230에 적어도 90% 상동인 서열을 가지는 폴리펩티드에 결합한다. 가장 바람직하게, 본 발명은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400 내에 위치하는 에피토프에 결합하는 정제된 EphB4 항체를 제공한다. 본 발명에 의한 정제된 EphB4 항체는 바람직하게 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 Asp(D)가 Asn(N)으로 치환된 폴리펩티드에 결합한다. 바람직하게, 상기 정제된 EphB4 항체는 모노클로날 항체이다.

발명의 상세 설명

제 1측면에서, 본 발명은 세포의 암성 성장(cancerous growth)을 저해하는 방법을 제공하는 바, 상기 방법은, 하나 이상의 항체 또는 그의 항원-결합부분과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 항체 또는 항체 결합부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400 또는 그와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열내에 위치한 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열내에 위치한 에피토프에 결합한다. 가장 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230 또는 그와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열에 위치한 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, 상기 서열은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 Asp(D)가 Asn(N)로 치환된다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합부분은 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400으로 이루어진 서열을 가진 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 바람직하게, 상기 항체 또는 항원-결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245로 이루어진 서열 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는 항체 또는 그의 항원결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244로 이루어진 서열 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열을 가지는 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다. 가장 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230로 이루어진 서열 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열을 가진 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다. 바람직하게는 상기 서열은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 Asp(D)에서 Asn(N)으로의 치환을 가진다. 가장 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원 결합부분은 다클론 또는 단일클론 항체이다. 상기 방법은 바람직하게는 세포의 사멸을 가져온다.

상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분은, 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 및 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 및 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230에 동일한 서열을 가진 폴리펩티드는, 바람직하게는, 특정한 아미노산(들)의 하나이상의 치환, 결실 또는 부가가 있는 폴리펩티드 변종을 포함한다. 이러한 폴리펩티드 변종은, 특히 이들이 항원 특성을 보유한 경우, 본 발명의 방법을 위해 추가로 유리하다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드 변종은 항원 특성을 보유하고, 폴리펩티드 생산 및/또는 용해성을 향상시키도록 설계될 수 있다.

예를 들어, 항원 예측 프로그램은, 하전된 아미노산 Asp(D)가 서열 중 유일하게 하전된 잔기이 경우, 에피토프 기능에 대해 중요할 수 있다. EphB4 단백질 (SEQ ID NO:1)의 아미노산 잔기 220 내지 244로 이루어진 펩티드 11은 도 20에 나ㅏㅌ낸 바와 같이 고안되었다. 또한, EphB4 단백질 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 Asn(N)의 치환이 있는 펩티드10이 도 20에서 지시된 바와 같이 고안될 수 있다. 펩티드 10과 펩티드 11의 아미노산 서열은 다음과 같다:

Asp 및 Asn의 측쇄는 매우 유사하여, Asp의 히드록시기는 Asn의 아민기이고, 이를 음으로 하전된 아미노산으로부터 중성의 아미노산으로 바뀐다.

본 발명의 제2 측면은 암세포의 사멸을 포함하는 방법을 제공하는 바, 상기 방법은 하나 이상의 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 가진 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 이 경우, 항체 또는 그의 항원 결합부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열내에 위치한 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245내에 위치한 에피토프 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열에 결합한다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 항원 결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 또는 그와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열 내에 위치한 에피토프에 결합한다. 가장 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열에 위치한 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, 상기 서열은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 AsP(D)가 Asn(N)으로 치환된다.

본 발명의 제3 측면은 대상에서 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공하는 바, 상기 방법은 하나 이상의 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함하며, 이 경우, 항체 또는 그의 항원 결합부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열에 위치한 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열내에 위치한 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 항원 결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 또는 그와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열내에 위치한 에피토프에 결합한다. 가장 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열에 위치한 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, 상기 서열은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 AsP(D)가 Asn(N)으로 치환된다.

상기 암은 바람직하게는, 유방암, 전립선암, 장암, 방광암, 대장암, 난소암, 폐암, 흑색종, 림프종 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 방법은 바람직하게는 대상에서 암세포의 사멸을 가져온다.

본 발명의 다른 한 측면은 세포의 암성 성장을 저해하는 제제를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 제제가 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 영역 200 내지 400의 영역 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열 내의 EphB4 폴리펩티드에 결합하는 능력을 평가하는 단계를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 제제는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열내에 포함된 에피토프에 결합한다. 바람직하게는 상기 제제는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열에 포함된 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 항원-결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열에 포함된 에피토프에 결합한다. 가장 바람직하게는, 상기 제제는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열에 포함된 에피토프에 결합한다. 바람직하게는 상기 서열은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 AsP(D)가 Asn(N)으로 치환된다.

또한, 본 발명은 전술한 방법에 의해 확인되는 제제를 제공한다.

본 명세서에서, "항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 특히 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중 특이 항체(multispecific antibody) (예를 들어, 2중특이(bispecific) 항체) 및 항체 단편을 포함하는 것이다. 용어 "에피토프(epitope)"는 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 의해 인식되는 폴리펩티드의 에피토프 영역을 의미한다.

항체는, 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된 4개의 폴리펩티드 사슬, 2개의 중쇄(heavy chain) 및 2개의 경쇄(light chain)로 이루어진 면역 글로블린 분자를 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 변화 영역(HCVR: heavy chain variable region) 및 중쇄 일정 영역(heavy chain constant region)으로 이루어져 있다. 상기 중쇄 일정 영역은 3개의 영역 CH1, CH2 및 CH3 로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 변화영역(LCVR 또는 VL) 및 경쇄 일정 영역으로 이루어진다. 상기 경쇄 일정 영역은 하나의 도메인, CL로 이루어진다. 상기 VH 및 VL 영역은 추가로 고변위성(hypervariablility)의 영역들로 다시 나뉘며, 이는 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)이라고 불리우며 프레임워크 영역(frame work:FR)이라고 불리우는 보다 보전된 영역들이 산재하여 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지며, 하기의 순서로 아미노-말단(amino-terminus) 부터 카르복시 말단(carboxy-terminus)으로 배열되어 있다: FR, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4

본 명세서에서 사용된 항체의 "항원-결합 부분(antigen-binding portion)" (또는 간단히 "항체 부분")이라는 용어는 항원에 특이하게 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합기능은 전체 길이의 단편에 의해서도 수행될 수 있다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 상기 용어에 의해 포함되는 결합 단편의 예는 (I) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉 힌지 영역에서 디설파이드 브리지에 의해 링크된 2개의 Fab 단편으로 이루어진 2가의 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (vi) 항체의 단일 암(single arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인 또는 VL 도메인(9)으로 이루어진 dAb 단편(8) ; 및, (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)을 포함한다. 나아가, 상기 Fv 단편의 2개의 영역 VL 및 VH은 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은, 재조합 방법을 사용하여, 이들을, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 (단일 사슬 Fv(scFv) (10) (11))로 공지된)1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들어지게 할 수 있는, 합성 링커에 의해 합쳐질 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 의해 포함될 수 있다. 다이어바디(diabody) 또는 트리아바디(triabody)와 같은 단일 사슬 항체의 다른 형태도 포함될 수 있다. 다이어바디는 2가의 이중 특이성 항체이며, 이 경우 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬상에 표현되나, 너무 짧아 동일 사슬 상의 두개의 도메인 사이에 짝지움을 허용하지 않는 링커를 사용하고 이로써 이들 도메인이 다른 사슬의 상보적 도메인과 짝을 이루게 하고, 2개의 항원 결합 사이트(12, 13)을 생성한다. 바람직하게는, 상기 항체는 EpHB4(H-200) 래빗 다클론성 IgG 항체이다(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California).

보다 바람직하게, 상기 항체는 단일 클론 항체 또는 그의 단편이고, 특히, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400 혹은 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열내의 에피토프에 결합한 단일 클론항체 또는 그의 단편으로부터 선택된다. 바람직하게는 상기 단일클론 항체 또는 그의 단편은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열내 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, 상기 단일클론 항체 또는 그의 단편은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열내의 에피토프에 결합한다. 가장 바람직하게는, 단일항체 또는 그의 단편은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230 내 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열내의 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, 상기 서열은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 AsP(D)가 Asn(N)으로 치환된다.

본 발명의 추가적 측면에서, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245와 85% 이상이 동일한, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245와 90% 이상이 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 결합하는 정제된 EphB4 항체가 제공된다. 바람직하게는, 상기 정제된 EphB4 항체는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244와 85% 이상 동일한, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244와90% 이상 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 결합한다. 상기 정제된 EphB4 항체는 바람직하게는, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230과 85% 이상이 동일한, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230과 90% 이상 동일한 서열을 가진 폴리펩티드와 결합한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400 내에 위치한 에피토프에 결합하는 정제된 EphB4 항체를 제공한다. 본 발명에 따른 정제된 EphB4 항체는, 바람직하게는, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 AsP(D)가 Asn(N)으로 치환된 폴리펩티드에 결합한다. 더욱 바람직하게는, 상기 정제된 EphB4 항체는 단일 클론 항체이다.

본 명세서에서 사용된 "단일클론 항체"라는 용어는 실질적으로 균질의 항체의 모집단으로부터 수득한 항체를 가리키는 것으로, 즉, 모집단을 포함하는 개개의 항체가 자연적으로 발생할 가능성이 있고 소량으로 존재가능한 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 말한다. 단일항체는 매우 특이적이고, 단일 항원 사이트에 반대로 향한다. 나아가, 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 반대로 향하는 상이한 항체를 포함하는 통상의 (다클론) 항체 조제와 대조적으로, 각각의 단일 항체는 상기 항원상의 단일 결정인자에 반대로 향한다. 변경인자 "단일클론"은 실질적으로 균질의 항체 모집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 요구하는 것으로 해석되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에서 사용되는 단일 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조되어, 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있거나, 혹은 DNA 재조합법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 기술은, 하이브리도마 기술(14), 트리오마(trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(15) 및, 인간단일항체를 제조하기 위한 EBV 하이브리도마 기술(16)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가로, 인간화된 모노클론 항체는 미국특허 제6,090,382호에 기술된 방법에 따라 생성될 수 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 전체 개시내용과 참조문헌이 본 명세서에 통합된다. 상기 문헌은 재조합 인간 항체의 발현을 위한 적절한 숙주 세포 및 재조합 인간 항체를 합성하는 방법을 제공한다. 나아가, 적절한 인간 항체는 트랜스제닉 동물을 사용하여, 예를 들어, Oncology 29 (Supp 4) 47-50 (2002)에 기술된 예시적 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 본 발명의 항체는 상업적 공급원으로부터 구할 수 있다.

당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열에 결합할 수 있는 다클론 항체를 제조할 수 있다. 항체의 제조를 위해, 다양한 숙주 동물을 EphB4 단백질 또는 적절한 담체에 결합된 EphB4 폴리펩티드 단편의 주입으로 면역화시킬 수 있다. 적절한 캐리어는, BSA (소혈청 알부민), KLH(열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌: keyhole-limpet hemocyanin), OVA(난알부민:ovalbumin), THY(갑상샘 글로블린: thyroglobulin) 및 RSA (토끼 혈청 알부민)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 숙주동물은 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 EphB4 폴리펩티드로 면역화될 수 있다. 바람직하게는, 상기 숙주 동물은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 EphB4 단백질 또는 폴리펩티드로 면역화될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 숙주 동물은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 포함하는EphB4 단백질 또는 폴리펩티드로 면역화될 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 숙주 동물은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 EphB4 단백질 또는 폴리펩티드로 면역화될 수 있다. 바람직하게, 상기 서열은, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 AsP(D)가 Asn(N)으로 치환된다.

적절한 숙주 동물은, 래빗, 마이스, 래트 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 숙주종에 따라 다양한 애주번트(adjuvant)를 사용하여 면역학적 반응을 증가시킬 수 있으며, 상기 애주번트는, 알루미늄 히드록시드와 같은 프로이드 (완전 또는 불완전) 미네랄 겔, 라이소레시틴(lysolecithin)과 같은 표면활성물질, 플루로닉(pluronic) 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 디니트로페놀 및, Bacillus Calmette-Geurin(BCG) 및 Corynebacterium Parvum 과 같이 잠재적으로 유용한 휴먼 애주번트를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 항체 및 항체 단편은 (예를 들어, 조직 배양 또는 발효통을 사용한 세럼 프리와 같은) 표준 기술에 의해 대량으로 제조되고, (예를 들어, 생쥐 Mabs를 위한) 단백질 A, (래트 Mab를 위한) 단백질 G 또는 (IgM 및 IgG Mabs를 위한) MEP HYPERCEL 과 같이 친화성 컬럼을 사용하여 정제될 수 있다.

적절한 항체는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400을 포함하는 서열 또는 상기와 85%이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항원 결합 부분을 포함하는 항체단편을 포함할 수 있다. 상기항체의 항원 결합 부분은 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400의 유전형(idiotype) 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항체 단편은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245을 포함하는 서열 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항원 결합부분을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항체 단편은, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244를 포함하는 서열 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항원 결합부분을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 항체 단편은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230을 포함하는 서열 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항원 결합부분을 포함한다. 바람직하게는, 상기 서열은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 AsP(D)가 Asn(N)으로 치환된다.

이러한 항체 단편은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 이러한 단편은, 항체 분자의 펩신 소화에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편; 상기 F(ab')2 단편의 디설파이드 브리지의 환원에 의해 생성될 수 있는 Fab' 단편; 파파인과 환원제로 항체 분자를 처리하여 생성될 수 있는 Fab 단편 및 Fv 단편을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가의 기술로서, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 220 내지 244, 더욱 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 220 내지 230을 포함하는 서열 또는 이들과 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 특이적인 재조합 항체를 제조할 수 있으며, 다양한 종류의 세포 형태로 다른 곳에서(ectopically) 발현시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 AsP(D)가 Asn(N)으로 치환된다.

본 발명에서 사용되는 항체는 면역 글로블린, 면역 글로블린사슬 또는 그의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원-결합 서브 시퀀스)인, 비-인간(예를 들어, 생쥐의) 항체의 휴머나이즈드 형태(humanized form)를 포함할 수 있다. 대부분의 경우, 상기 휴머나이즈드 항체는 인간 면역 글로블린 (수용체 항체)로서, 이 경우, 수용체의 상보적 결정 영역(CDR)로부터의 잔기는, 소망하는 특이성, 친화성 및 능력을 가진 마우스, 래트, 래빗과 같은, 비인간 종(공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체될 수 있다. 어떤 경우, 인간 면역 글로블린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 FR 잔기에 의해 교체될 수 있다. 나아가, 휴머나이즈드 항체는 수용자 항체에서도 발견되지 않고 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변경은 추가로 항체 기능을 정련하고 최적화할 수 있다.

본 명세서에서 "EphB4 단백질" 이라는 용어는, 전체길이의 EphB4 단백질 또는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400 또는 상기와 85% 이상 또는 90% 이상이 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 단편을 포함하는 것이다. 바람직하게는, 상기 EphB4 단백질은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열를 포함하는 폴리펩티드 단편을 포함한다. 바람직하게는, EphB4 단백질은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 단편을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 EphB4 단백질은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 동일한 서열을 포함한 폴리펩티드 단편을 포함한다. 바람직하게는, 상기 서열은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 AsP(D)가 Asn(N)으로 치환된다.

EphB4 변종 단백질은 아미노산 수준에서 개질될 수 있으며, 보존성 아미노산 치환과 같이, 단백질의 기능성에 영향을 주지 않는 아미노산의 부가, 결실, 치환을 포함한다. EphB4 단백질은 끝이 잘린(truncated) EphB4 단백질도 포함할 수 있다. EphB4 단백질은 천연의 것이거나 혹은 재조합된 것이다. EphB4 단백질은 동물종으로부터 유래된 것일 수도 있고, EphB4 단백질은 사람일 수 있다.

본 발명의 방법에 적절한 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 바람직하게는 EphB4 단백질의 활성을 저해함에 의해 세포의 암성 성장을 저해할 수 있다. 본 명세서에서, "암성 성장(cancerous growth)"라는 용어는 세포의 미정상적이고 제어되지 않는 분할 및 성장을 지칭하는 것이다. 전형적으로, 이러한 세포는, 다른 조직을 공격하거나 파열할 수 있는 암세포로서 밝혀지며, 신체의 다른 영역으로 퍼지는 잠재성을 가진다. 세포의 암성 성장은 양성 또는 악성의 종양 형성을 유도할 수 있다.

본 명세서에서 "세포"라는 용어는, 모든 세포를 포함하는 것이다. 바람직하게, 상기 세포는, 인간, 마이스, 소, 양 또는 가축과 같은 포유류로부터 유도된 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 세포는, 전립선 세포, 유방세포, 대장 세포, 섬유모세포, 표피 세포, 태반, 간, 신장, 췌장, 심장, 신경 또는 근육세포 또는 암 또는 종양세포를 포함하는 군으로부터 선택되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포는 통상의 세포, 사멸세포, 성숙세포, 성숙세포, 배아세포일 수 있다. 상기 세포는 단일세포, 배양된 세포 또는 조직의 일부일 수 있다. 상기 세포는 트랜스제닉 세포와 같이, 유전학적으로 개질된 재조합 세포일 수 있다. 바람직하게, 상기 세포는 EphB4를 발현한다. 상기 세포는 전체 동물의 일부일 수 있다. 상기 세포는 세포주로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 세포는 전립선, 유방, 대장 또는 자궁 세포주로부터 유래된 세포주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포주는 바람직하게는 대장 SW 480, 대장 SW 620, 대장 LIM 1215, 유방 MCF7, 유방 T47-D, 유방 MDA-MB-231, 유방 MDA-MB-453, 방광 J82, 방광 T24, 방광 RT 119 및 방광 5637로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포주는 유방암 세포주 MCF-7 및 대장암 세포주 SW 480으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 바람직하게는, 유방암 세포, 전립선암 세포, 장암 세포, 방광암 세포, 대장암 세포, 자궁암 세포, 폐암세포, 흑색종 세포, 림프종 세포 및 백혈병 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암세포의 암성 성장을 저해할 수 있다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 바람직하게는, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 201 내지 245 잔기, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 220 내지 244 잔기, 더욱 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 220 내지 230 잔기를 포함한 서열 또는 이들과 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열을 가진 폴리펩티드를 특이적으로 결합한다. 본 발명의 한 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 201 내지 245 잔기, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 220 내지 244 잔기, 더욱 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 220 내지 230 잔기내에 포함된 에피토프 또는 이들과 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열에 특이적으로 결합한다.

"특이적으로 결합한다"라는 것은, 항체 또는 항원 결합 부분의 결합특성을 나타내는 것으로, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 201 내지 245 잔기, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 220 내지 244 잔기, 더욱 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 220 내지 230 잔기를 포함하는 서열 또는 이들과 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 독점적으로 결합하는 것을 말한다. 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 바람직하게는, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 201 내지 245 잔기, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 220 내지 244 잔기, 더욱 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 220 내지 230 잔기를 포함하는 서열 또는 이들과 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 다클론 또는 단일클론 항체이다. 바람직하게는 상기 항체는, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 세포 외 도메인 아미노 잔기에 특이적으로 지향된 EphB4 다클론항체(H-200-Santa Cruz Biotechnology)이다.

본 발명은, 세포의 암성 성장을 저해하는 방법을 제공하는 바, 상기 방법은, 하나 이상의 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 세포를 접촉시키는 것을 포함하며, 이 경우, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 보다 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230 또는 이들과 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열내에 위치한 에피토프 결합한다. 바람직하게는, 상기 서열은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 AsP(D)가 Asn(N)으로 치환된다.

바람직하게는, 하나 이상의 항체 또는 그의 항원결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 400을 포함하는 서열 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 결합한다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원-결합부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245를 포함하는 서열 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 가진 EphB4 단백질에 결합한다. 바람직하게, 상기 항체 또는 그의 항원결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244를 포함하는 서열 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 가진 EphB4 단백질에 결합한다. 더욱 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230을 포함하는 서열 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 가진 EphB4 단백질에 결합한다. 바람직하게는, 상기 서열은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 AsP(D)가 Asn(N)으로 치환된다.

본 명세서에 사용된 "세포의 암성 성장을 저해한다"는 문장은, 세포의 암성 성장이 실질적으로 감소하거나 예방되는 것을 의미한다. 본 발명에서, 세포는 하나 이상의 항체 또는 그의 항원결합 부분과 접촉하며, 이 때, 상기 항체 또는 그의 항원결합부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 보다 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230 를 포함한 서열 또는 이들과 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 가진 폴리펩티드와 결합하고, 그 결과 미처리된 세포와 비교하여, 상기 세포의 암성 성장이 저해된다. 바람직하게는, 상기 서열은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 AsP(D)가 Asn(N)으로 치환된다.

본 발명은 또한 암 세포의 세포사멸을 유도하는 방법을 제공하는 바, 상기 방법은 하나 이상의 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 세포를 접촉하는 단계를 포함하며, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 400을 포함하는 서열 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 결합한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 항체 또는 그의 항원-결합부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열에 포함된 에피토프에 결합한다. 바람직하게, 하나 이상의 항체 또는 그의 항원결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열내에 포함된 에피토프에 결합한다. 더욱 바람직하게는, 하나이상의 항체 또는 그의 항원결합 부분은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230 내에 포함된 에피토프 또는 상기와 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 동일한 서열 결합한다. 바람직하게는, 상기 서열은 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 AsP(D)가 Asn(N)으로 치환된다.

"암세포의 세포 사멸을 유도한다"는 문장은, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 더욱 바람직하게는 EphB4 (SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230을 포함하는 서열 또는 이들과 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 동일한 서열을 가진 폴리펩티드와 결합하는 하나 이상의 항체 또는 그의 항원결합 부분과 접촉한 암세포가 세포사멸되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 상기 항체는, EphB4 (SEQ ID NO:1)의 세포외 도메인 아미노 잔기 201 내지 400을 특이적으로 지향하는 EphB4 다클론 항체 (H-200-Santa Cruz Biotechnology)이다.

암세포의 세포사멸은 다양한 분석방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, caspase-3 활성은 세포 사멸 중 세포적 사건의 개시에 중요 역할을 하는 것으로 생각되고 있다. caspase-3 활성의 정량화를 위한 다양한 키트가 시판되고 있다. 미토콘드리아성 막의 탈분극(depolarization)은 종종 세포사멸의 초기 단계와 연관된다. 상기 막 전위의 변화는 미토콘드리아성 투과도 전이 포어의 열림으로 인한 것으로 추정되며, 세포자멸사(apoptosis)에 중심 역할을 할 수 있다. 탈분극은, 활성 사립체(mitochondria)에 축적되는 녹색 형광 음이온 염료로서, 세포 파열의 신속하고 용이한 검출을 가능하게 하는 높은 막 전위(membrane potential)를 가진 로다민(Rhodamine)(123)의 이용을 포함하는 여러 가지 분석법에 의해 검출될 수 있다. 락테이트 탈수소효소(lactate dehydrogenase; LDH)는 모든 세포에 존재하는 안정한 세포질 효소이다. 이것은 형질막이 손상되면 세포 배지 상청액으로 신속히 방출된다. LDH 활성도는 시판되는 키트를 이용하는 분광광도식 플레이트 판독기를 이용한 단일점 분석에 의해 배지 상청액에서 용이하게 측정할 수 있다. 배지에서의 상승된(elevated) LDH는 세포 괴사를 나타내는 것이다.

세포의 형태는 또한 세포 괴사를 평가하기 위해서도 시험할 수 있다. 예를 들면, 아폽토시스(apoptosis)는, 예를 들면, 세포가 수축되고 분할되어 막 결합 세포 사멸체(apoptotic body)로 바뀌는 일련의 일반적 형태학적 현상을 특징으로 하는 프로그램된 세포사이다(17). 이러한 현상은 광 현미경을 이용하여 볼 수 있다. 또한, 세포사와 관련된 유전자 발현에 대해 세포를 시험할 수 있다. 또한, 4종의상이한 유방암 세포주로부터의 EphB4 항체 처리 세포 및 미처리 세포를 비교하는 RT-PCR 분석 결과 EphB4 유전자 발현이 처리된 세포에서 하향 조절되는(down-regulated) 것으로 나타났다.

본 발명의 또 다른 태양은 대상에서의 암을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법은, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기(residue) 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 보다 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230을 포함하는 서열, 또는 이들 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 결합하는 적어도 하나의 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분(antigen-binding portion)의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 서열은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 Asp(D) 내지 Asn(N)이 치환되어 있는 것이 바람직하다. 상기 방법은 바람직하게 대상의 암세포를 사멸시킨다.

상기 암은 유방암, 전립선암, 장암, 방광암, 결장암, 난소암, 폐암, 흑색종, 림프종 및 백혈병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법으로 치료하는 대상은, 비제한적으로, 인간, 양, 가축, 말, 소, 돼지, 가금류, 개 및 고양이로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 방법에서, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 보다 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230을 포함하는 서열, 또는 이들 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 결합하는 적어도 하나의 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분의 유효량이 대상에 투여된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 적어도 하나의 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분은, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 보다 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230, 또는 이들과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열 내에 함유된 에피토프(epitope)에 결합한다. 상기 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분은 바람직하게, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 보다 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230을 포함하는 서열, 또는 이들 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 보다 바람직하게는, 상기 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분은 다클론(polyclonal) 항체 또는 단클론(monoclonal) 항체이다.

"유효량"이라는 용어는 치료 또는 예방되는 암에 대해 치료 또는 예방을 제공하기에 충분한 용량을 의미한다. 이 양은 대상 및 처리되는 암의 형태에 따라 변동된다. 본 발명의 방법에서 사용되는 적어도 하나의 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분의 유효량은 투여 방식, 처리할 동물의 상태에 따라 변동될 수 있고, 궁극적으로는 투여를 행하는 과학자, 의사 또는 수의사에 의해 결정될 것이다.

대상을 치료하거나 예방하는 데 사용되는 적어도 하나의 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분의 양은 또한 특정한 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분의 본성 및 본질에 따라 변동될 것이다.

항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분은 당업자에게 공지되어 있는 임의의 적당한 수단에 의해 대상에 투여되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분을, 예를 들면, 정맥내 주입을 포함하는 여러 가지 방식으로 세포와 접촉시킬 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분을 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합하여 인간 또는 동물 대상에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물을 형성한다. 적합한 담체 또는 희석제로는 인산염 완충 식염수와 같은 식염수 등장액(isotonic saline solution)이 포함된다. 적어도 하나의 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분을 포함하는 약제학적 조성물은 비경구 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 안내(intraocular) 투여, 경구 투여 또는 경피 투여용으로 조제될 수 있다. 항체는 대상의 체중에 따라 적합한 용량으로 투여될 수 있다. 그러나, 당업자는 어느 특정 대상 및 암에 대한 최적의 투여 경로 및 투여량을 용이하게 결정할 수 있을 것이므로, 전술한 투여 경로 및 투여량은 하나의 가이드 역할을 하는 것으로 이해해야 한다.

본 발명의 방법에서 사용되는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분은, 예를 들면, 유화제, 계면활성제, 안정화제, 염료, 투과력 증각제, 항산화제, 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌글리콜, 젤라틴, 락토오스, 마그네슘스테아레이트 및 규산(silicic acid)과 같은 적당한 부형제와 조합할 수 있다. 상기 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분은 무균 수용액으로 조제되는 것이 바람직하다. 상기 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분은 상기 항체의 활성도와 필적하는 부가물(adjunct) 성분과 조합할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분은 바람직하게 기존의 암 치료에 대한 보완물로 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 방사선치료, 화학요법(예; 안트라사이클린, 5FU, 국소이성화 효소(topoisomerase) 억제제, 시스플라틴 및 카보플라틴의 사용), 또는 호르몬 개질제(예; 카타목시펜(Catamoxifen))를 활용하는 호르몬 치료와 같은 전통적 암 치료법과 함께 사용할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 태양에서, 세포의 암 형태의 성장을 억제하는 작용제(agent)를 동정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 보다 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230을 포함하는 서열, 또는 이들 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 결합하는 상기 작용제의 결합 능력을 평가하는 단계를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 작용제는, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 보다 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230, 또는 이들과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열 내에 함유된 에피토프에 결합한다. 바람직하게, 상기 작용제는, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 보다 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230을 포함하는 서열, 또는 이들 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 가진 EphB4 단백질에 결합한다.

본 발명에서, "작용제"라는 용어는, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 보다 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230, 또는 이들과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열에 결합(상호 반응)할 수 있는 임의의 분자, 화합물 또는 단백질을 포함하는 것으로 한다. 적합한 작용제는, 바람직하게, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 보다 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230을 포함하는 서열, 또는 이들 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 상기 상체의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 작용제가, 다클론 항체 또는 단클론 항체인 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분이다. 상기 방법은 암 세포의 세포사를 유도하는 상기 작용제의 능력을 평가하는 단계를 포함한다. 상기 작용제는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분과 같이, 바람직하게 EphB4 단백질에 대해 특이적이고 세포의 암 형태 성장을 억제하는 능력에 대해 시험관내 또는 생체내 시스템에서 테스트하기 위한 상업적으로 개발될 수 있거나 입수할 수 있는 EphB4 리간드인 것이 바람직하다.

예를 들면, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 보다 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230, 또는 이들과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열의 특정 에피토프로 유도되는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분에 대해, 세포의 암 형태 성장을 억제하는 능력, 바람직하게는 세포사를 유도하는 능력을 테스트할 수 있다. 항체의 IC50을 평가하기 위한 투여 감응 곡선은 테스트된 각 항체의 효능을 테스트하도록 인도될 수 있다. 또한, 항체/수용체-배위자(receptor-ligand) 결합 연구는 리간드 결합을 방지하는 항체의 능력을 평가하기 위해 실행될 수 있다. 항체 결합에 이어지는 EphB4 수용체의 티로신 포스포릴화(tyrosine phosphorylation)는 각각의 항체를 사용한 수용체의 면역침전(immunoprecipitation)에 이어서, EphB4 수용체가 비활성화 되어 있는지를 확인하기 위한 안티-포스포티로신 항체를 사용한 웨스턴 분석(Western analysis)에 의해 평가될 수 있다. 추가의 생체내 테스트를 위해, 티로신 포스포릴화 및 시험관내 세포 성장을 억제하고, EphB4 수용체에 대한 리간드의 결합을 50% 이상의 억제 농도(IC50)으로 방지하는 측면에서 최량의 중화 작용성을 가진 항체를 선택할 수 있다.

예를 들면, 면역결핍 NOD-SCID(non-obese diabetic, combined immunodeficiency) 마우스를 이용한 전이 및 종양 성장의 생체내 모델을 이용하여, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 보다 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230을 포함하는 서열, 또는 이들 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 결합할 수 있는 잠정적 작용제가 갖는 항암제로서의 효능에 대한 능력을 테스트할 수 있다. 상기 서열은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 Asp(D) 내지 Asn(N)이 치환되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 대부분이 이종이식(xenograft)으로서 성장시킬 수 있고 인간 유방암 세포주 MCF-7 및 결장암 세포주 HT29를 포함하는, 활용 가능한 종양 세포주의 다양한 배열은 시험관내 테스트에 이용할 수 있다. 이종이식 종양은 마우스 모델에서, 매스(mass)로서 성장하는 피하 주입 후 또는 꼬리 정맥 내의 주입 후 성장시킴으로써 다른 기관에서의 2차 퇴적을 초래하는 전이의 혈행 확산(hematogenous spread)의 의태를 가능하게 한다. 각각의 세포주에 대한 적합한 융합 기간(engraftment period) 및 접종 투여가 이루어지면, 상기 모델은, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244, 보다 바람직하게는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230을 포함하는 서열, 또는 이들 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 가진 폴리펩티드에 결합하는 다양한 작용제를 테스트하는 데 이용할 수 있다. 세포는 또한 처리된 세포의 융합을 미처리 세포와 비교하여 평가하기 위해 IC₅₀ 및 IC₇₅와 동등한 선택된 EphB4 항체의 준치사 투여량(sub-lethal dose)으로 처리할 수 있다. 이로써 종양 세포주의 형성 및 전이에 대한 EphB4의 감소된 기능 발현의 효과를 평가할 수 있다.

생체내 모델은 또한 EphB4 양성 종양 세포주의 처리를 위한 새로운 잠재적 치료법의 임상전 평가에 이용할 수도 있다. 피하 주사를 이용함으로써 여러 가지 시간 주기에 대한 수립을 가능하게 한 종양을 시험할 수 있다. 이것은 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분과 같은 작용제가 새로이 정상적으로 형성된 종양을 제거할 수 있는 능력을 비이클 대조와 비교하여 판정하는 데 이용될 수 있다. 꼬리 정맥 주입 방식은 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분으로 처리한 결과 혈행 확산의 결과로서 형성된 전이의 수를 감소시키는지 여부를 판정하는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 동정된 작용제는 암의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다. 본 발명은 또한 이상과 같이 설명한 방법에 의해 동정된 작용제를 제공한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 사용하는 "포함하다(comprise)"라는 용어 또는 이의 문법적 변화의 표현은 언급한 엘리먼트, 완전체(integer) 또는 단계(step), 엘리먼트의 군을 포함하는 것을 의미하며 다른 엘리먼트, 완전체 또는 단계, 엘리먼트의 군을 배제하는 것이 아님을 이해할 것이다.

이하에서 비제한적 도면 및 실시예를 이용하여 본 발명을 설명한다.

실시예 1 - EphB4의 면역조직화학적 국재성(immunohistochemical localisation):

EphB4(SEQ ID NO:1)의 세포외 도메인 아미노 잔기 202 내지 400에 특이적으로 인도되는 EphB4 다클론 항체(H-200 Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 종양 및 정상 조직 내 EphB4 단백질의 국재화를 분석했다. 결장 및 유방 조직은 대응하는 정상 조직과 비교할 때, 종양 상피 세포에서 이 단백질의 레벨에 뚜렷한 증가를 나타냈다(도 1에 나타냄). 가장 흔히 발병되는 암 중 2종에서 종양 상피 세포에서 EphB4의 높은 발현이 나타난 것은 EphB4가 이들 종양의 진전에 결정적임을 암시한다.

실시예 2 - EphB4의 RT-PCR 발현:

역 전사효소-폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 5종의 종양(T)/정상(N) 쌍에서 EphB4(1187bp)의 발현과 내부 18SrRNA(489bp)를 비교했다(결과를 도 2에 나타냄). 환자 60명으로부터 63종의 결장암을 분석한 결과, 환자 80%의 종양 조직에서 EphB4가 과잉발현되는 것으로 나타났으며, 이는 치료 표적으로서 광범위한 적용을 의미한다(도 2). 종양 세포와 정상 조직 사이의 차등 발현은 항-EphB4 종양 치료가 결장(및 기타) 종양에 대해 선택적 효과를 가질 수 있음을 암시한다.

EphB4의 발현 프로파일을 임상 시험(HER2, EGFR 및 VEGFR)에서 이미 표적으로 되어 있는 다른 수용체 단백질 티로신 키나아제와 비교한바, EphB4의가 정상 조직에서 상대적으로 적게 발현됨을 나타낸다. EST 데이터베이스로부터의 정보는 EphB4의 저수준 발현이 신장, 난소 및 태반에 존재할 수 있고, 매우 낮은 수준의 발현은 심장, 폐, 말초신경 및 혈관 조직에 존재할 수 있음을 나타낸다. 따라서, EphB4를 표적으로 하는 치료는 다른 수용체 티로신 키나아제를 표적으로 하는 것보다 적은 부작용을 일으킬 것으로 기대할 수 있다.

실시예 3 - EphB4 특이적 항체 연구:

생체내에서 EphB4(SEQ ID NO:1)의 세포외 도메인 아미노 잔기 201 내지 400에 특이적으로 지향하는 EphB4 다클론 항체(H-200, Santa Cruz Biotechnology)의 직접적 종양파괴 효과를 입증했다. 결장암 세포주 SW480 및 SW620의 완전 융합성(fully confluent) 단일층을 EphB4 항체 H-200(Santa Cruz Biotechnology-로트번호 B141 및 F182)의 1/500 희석액과 함께 배양한바 세포가 배양 용기 바닥에서 들어 올려져서 괴사했다(도 3). 이것은 SW480, SW620, LIM1215를 포함하는 결장암 세포주, 유방암 세포주 MCF-7, T47-D, MDA-MB-453, MDA-MB-231 및 Hs578t, 방광암 세포주 J82, RT119, 5637 및 T24를 처리할 때 나타나는 보편적인 감응이었다.

유방암 세포주 MCF-7 및 결장암 세포주 SW480을 농도가 상이한 3가지 항체(2 ㎍/ml, 1 ㎍/ml 및 0.2 ㎍/ml)와 함께 배양한 결과, 투여량에 관계 없이 세포가 사멸되었다(도 4 및 도 5 참조). 이 효과는 내피 세포주 JUVEC-C를 EphB4 항체에 노출시킨 다음에는 나타나지 않았다. 카스파아제-3 활성을 분석한바, 세포사는 아폽토시스를 통한 것이 아님을 암시한다(도 6). 이러한 결과는 막수용체에 대한 가교 또는 결합에 의해, 항체는 수용체 활성을 모방 또는 조절하고, 이들 항체 생성 막 신호(transmembrane signal)는 아폽토시스 또는 성장 억제를 야기할 수 있음을 암시한다(18). 세포사를 유도하기 위한 다른 메커니즘으로 가능한 것에는 라스-중재된(ras-mediated) 비아폽토시스(non-atoptotic) 세포사 또는 갭 정션 세포간 교신(gap junction intercellular communication; GJIC)의 복구, Eph 수용체 시그널에 의해 방지되는 것으로 알려진 직접적 세포-세포간 교신 경로 등이 포함된다(19)

EphB4에 특이적인 다클론 항체가 개발되어 시험관내 및 생체내 시스템에서 이들 항체를 테스트하기 위해 상업적으로 입수할 수 있다. 도 7은 이하에 구체적으로 제시한 5종의 EphB4 항체로 처리한 후 유방암 세포의 생존가능성 퍼센트의 결과를 나타낸다:

(1) 마우스 EphB4의 카르복시 말단의 아미노산 잔기 825 내지 991을 지향하는 EphB4 다클론 항체(스위스);

(2) 성숙한 EphB4(SEQ ID NO:1)의 아미노산 잔기 16 내지 34일 가능성이 높은 EphB4 아미노산 서열의 N-말단 최소 19개 아미노산을 지향하는 다클론 N-말단 EphB4 항체(N-19 Santa Cruz Biotechnology);

(3) EphB4(SEQ ID NO:1)의 아미노산 잔기 615 내지 874로 이루어진 티로신 키나아제 도메인에 대응하는 카르복시-말단을 지향하는 다클론 C-말단 EphB4 항체(C-16 Santa Cruz Biotechnology);

(4) EphB4(SEQ ID NO:1)의 세포외 도메인 아미노산 잔기 201 내지 400을 특이적으로 지향하는 EphB4 다클론 항체(H-200, Santa Cruz Biotechnology);

(5) EphB4(SEQ ID NO:1)의 세포외 도메인 아미노산 잔기 201 내지 400을 특이적으로 지향하는 EphB4 다클론 항체(H-200(old), Santa Cruz Biotechnology, 로트번호 B141 배치).

EphB4(SEQ ID NO:1)의 세포외 도메인 아미노산 잔기 201 내지 400을 특이적으로 지향하는 H-200 항체로 처리 시 세포사 효과가 나타났다. 활성 보충 단백질을 함유하거나 함유하지 않은 배지에서의 세포 성장을 비교하면 Ab-개재 세포사에서 보충은 아무 역할을 하지 않는 것으로 나타난다(도 7 참조).

세포사의 메커니즘은 또한 마이크로어레이(microaray) 기술을 이용한 H-200 EphB4 항체의 준치사 투여량으로 배양한 후 시험관내 암 세포에서 유도된 유전자 발현에 대한 변화를 분석함으로써 알 수 있다.

실시예 4 - 인간 조직에서의 EphB4의 발현:

정상적 인간 조직에 대한 EST 데이터베이스 및 노던 분석(Northern analysis)로부터의 정보(20)는 EphB4의 저수준 발현이 신장, 난소 및 태반에 존재할 수 있고, 매우 낮은 수준의 발현은 심장, 폐, 말초신경 및 혈관 조직에 존재할 수 있으며, 뇌에서는 발현이 없음을 나타낸다. 유전자 발현이 단백질 수준과 관련이 있는지 여부를 판정하기 위해, EphB4(SEQ ID NO:1)의 세포외 도메인 아미노산 잔기 201 내지 400을 특이적으로 지향하는 EphB4 다클론 항체(H-200, Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 이들 조직을 이용한 실제로 해독된 웨스턴 분석을 실행했다. 단일 클론 종양 샘플과 비교한 결과, 유전자 발현 수준은 이들 조직에서 생성된 EphB4 단백질의 양에 대응하지 않는 것으로 나타났다(도 8). 종양 세포와 정상 조직 사이의 차등 발현은 항-EphB4 종양 치료가 결장 종양에 대해 선택적 효과를 가질 수 있음을 암시한다.

웨스턴 블롯 분석으로 여러 개의 혼성 밴드(hybridising band)를 얻었다(데이터는 제시되지 않음). 그러나, 상기 종양 샘플(들)에 특이적이고 테스트한 모든 종양 샘플에 공통적인 이들 단백질 밴드의 본체는 판정해야 할 사항이지만, 삽입 변형(splice variation)에 대응할 것이다. 2개의 EphB4 삽입 변종(명칭: EphB4v1 및 EphB4v2)을 동정했다. EphB4 유전자 구조를 측정한바, EphB4v1은 전체 엑손 16에 의해 코딩된 53개 아미노산의 부재로 인한 것으로 나타났다(도 9). EphB4v1이 해독되면, 얻어지는 단백질은 신호를 세포내 표적에 전달하는 역할을 하는 것으로 알려져 있는 2개의 단백질 도메인, 즉 키아나제 도메인과 SAM 도메인 모두의 일부분이 결핍될 것이다. EphB4v2는 111개 아미노산의 부재를 초래하는 전체 엑손 6의 인프레임 결실(in-frame deletion)에 의해 유발된다. EphB4v2는 제1 피브로넥틴 타입 III 반복(repeat)이 결핍된 단백질을 코딩할 것이다. 피브로넥틴 타입 III 반복의 역할은 알려져 있지 않고, 이들 반복 중 하나를 제거하는 데 대한 효과도 현재로는 알려져 있지 않다.

실시예 5 - EphB4의 RT-PCR 분석:

혈관형성에서의 EphB4의 가능한 역할 때문에, RT-PCT을 이용한 내피 세포에서 EphB4의 발현을 행했다. 낮은 수준의 EphB4의 발현이 관찰되었다. 그러나, 이들 세포를 EphB4(SEQ ID NO:1)의 세포외 도메인 아미노산 잔기 201 내지 400을 특이적으로 지향하는 EphB4 다클론 항체(H-200, Santa Cruz Biotechnology)의 존재 하에 성장시켰을 때, 항체의 농도가 가장 높은 상태에서도 세포 성장 또는 형태상에는 외견상 변화가 없었다. NIH3T3 세포의 성장 및 형태에 대한 EphB4 항체의 효과도 테스트했다. 형태 또는 성장에 대한 감응이 없었다(데이터 제시되지 않음). 섬유낭 유방 질환(21)을 가진 36세의 카프카스인 환자로부터 채취한 조직으로 수립된 비종양형성 유방 세포주 MCF10A도 테스트하였으며, 저수준에서 EphB4를 발현하는 것을 관찰하였으나 항-EphB4 항체에 대한 감응은 없었다(데이터 제시되지 않음). 이들 결과는 정상 인간 조직의 웨스턴 분석으로부터 얻어진 결과(실시예 5)와 함께 고찰하면, 높은 수준의 EphB4 발현을 나타내는 조직은 EphB4 항체에 의해 부정적 영향을 받는다는 것을 시사한다.

상기 결과는 EphB4(SEQ ID NO:1)의 세포외 도메인 아미노산 잔기 201 내지 400을 특이적으로 지향하는 EphB4 다클론 항체(H-200, Santa Cruz Biotechnology)로 처리한 후에 상기 EphB4 유전자가 하향 조절됨을 나타낸다(도 10). 이는 대부분의 항체가 리간드-수용체 상호작용을 블록킹하고 리간드-유도 RTK 시그널링을 억제한 후 RTK 하향 조절 및 수용체의 내재화(internalisation)을 증가시킨다는 사실과 일치한다. 이것은 특정 항체가 표적 종양 세포 내부의 세포내 시그널링 패턴을 변경함으로써 종양 성장에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 미처리 세포와 비교할 때 Ab-처리 세포에서 유전자 발현의 전체적 변화의 분석에 의해 EphB4 관련 시르널링에 내포된 유전자를 동정할 수 있을 것이다.

실시예 6 - EphB4 항체-에피토프 맵핑:

Santa Cruz사로부터 H-200 다클론 Ab로서 상업적으로 입수할 수 있는 EphB4를 EphB4 인간 수용체의 SEQ ID NO:1의 아미노산 201-400에 대응하는 재조합 단백질에 대항하여 배양한다. 상기 서열은 시스테인 농후(cysteine-rich) 도메인 및 제1 피브로넥틴 타입 III 반복을 포함하며, 따라서 여러 개의 상이한 항원 영역(antigenic region)이 확인될 것으로 예상되었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 25 아미노산 중 6개의 블록킹 펩티드(5개의 아미노산 중첩, 20개의 아미노산 오프셋)을 EphB4 단백질(SEQ ID NO.1)의 특정 아미노산 잔기에 대항하여 지정했다. 상기 블록킹 펩티드는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

펩티드 1 SEQ ID NO:2 : TVNLTRFPETVPRELVVPVAGSCVV

펩티드 2 SEQ ID NO:3 : GSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQW

펩티드 3 SEQ ID NO:4 : EDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGN

펩티드 4 SEQ ID NO:5 : AAEGNTKCRACAQGTFKPLSGEGSC

펩티드 5 SEQ ID NO:6 : GEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCR

펩티드 6 SEQ ID NO:7 : VCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPS

EphB4(SEQ ID NO:1)의 세포외 도메인 아미노산 잔기 201 내지 400을 특이적으로 지향하는 EphB4 다클론 항체(H-200, Santa Cruz Biotechnology)와 함께 예비배양한 후 세포사를 방지하는 능력에 대해 펩타이드를 테스트했다. 초기에 모든 펩티드의 칵테일(cocktail)을 테스트한바, 트리판 블루 배제(도 12) 및 카스파아제-3 활성 분석(도 13)을 이용하여 측정한 바와 같이 세포사를 성공적으로 방지했다. 이어서, 펩티드를 별도로 테스트하였고, 펩티드 1(SEQ ID NO:2) 및 펩티드 2(SEQ ID NO:3)에 대해 부분적 구출이 관찰되었다(도 14 참조). 펩티드 1과 펩티드 2는 5개의 아미노산 잔기(SEQ ID NO:13으로 지정된 GSCVV)에 의해 중첩되고, 이것은 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 221 내지 225에 대응한 이러한 아미노산 서열이 반응성 에피토프의 코어일 수 있음을 나타낸다.

펩티드 칵테일을 이용한 초기 실험이 GSCVV(SEQ ID NO:13) 서열(즉 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 221 내지 225)의 2배 몰량을 효과적으로 함유하였으므로, 추가 블록킹 실험으로 펩티드 1(SEQ ID NO:2) 및 펩티드 2(SEQ ID NO:3)의 2배 양을 펩티드의 초기량과 함께 비교했다. 모든 처리는 EphB4 다클론 항체(H-200, Santa Cruz사제)에 의해 야기된 종양 세포사를 성공적으로 방지했다(도 15 참조).

GSCVV(SEQ ID nNO:13) 코어 에피토프 서열에 걸친 상이한 길이를 가진 새로운 펩티드 3종(펩티드 7 내지 9)을 도 16에 나타낸 바와 같이 EphB4 단백질(SEQ ID NO,1)의 특정 아미노산 잔기를 기본으로 상업적으로 제조했다. 블록킹 펩티드는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

펩티드 7 SEQ ID NO:8 : AGSCVVDA

펩티드 8 SEQ ID NO:9 : VAGSCVVDAV

펩티드 9 SEQ ID NO:10 : LVVPVAGSCVVDAVPA

그러나, 펩티드 8과 9에서 소수성 아미노산의 수가 많기 때문에, 이들 펩티드는 세포에 적용할 수 있는 어느 용액에서도 용해되지 않아서 더 이상의 테스트를 할 수 없었다. 그러나, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 227에 대응하는 아미노산 서열을 가진 펩티드 7(SEQ ID NO.8)을 블록킹 실험에 사용하였고, EphB4-항체(Santa Cruz사제 H-200)를 단독으로 첨가함으로써 야기되는 세포사 효과로부터 세포를 구출할 수 있었다(도 17 참조).

앞에서 언급한 모든 문헌은 그 전체가 본 발명에 인용된다.

본 명세서에 포함된 문헌, 작용, 물질, 장치, 물체 등에 대한 모든 논의는 단지 본 발명을 위한 배경을 제공하기 위함이다. 이러한 사항의 일부 또는 모두가 종래 기술 기본의 일부를 형성함을 용인한다고 간주되거나, 본 출원의 각 청구항의 우선일 이전에 오스트레일리아 또는 다른 어느 나라에 이미 존재하는 것으로서 본 발명과 관련된 분야에서 공통의 일반적인 지식인 것으로 간주되어서는 안된다.

당업자는, 포괄적으로 설명한 본 발명의 사상이나 범위로부터 벗어나지 않고 특정 실시예에 나타낸 본 발명에 대해 여러 가지 변경 및/또는 변형을 이룰 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 실시예는 모든 측면에서 예시적인 것이며 제한적이 아닌 것으로 간주되어야 한다.

참고문헌:

SEQUENCE LISTING <110> The Queen Elizabeth Hospital <120> Methods for regulating cancer <130> 03 1348 7262 <160> 13 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 984 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Leu Arg Val Leu Leu Cys Trp Ala Ser Leu Ala Ala Ala Leu 1 5 10 15 Glu Glu Thr Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Thr Ala Asp Leu Lys Trp 　　　　　　　20 25 30 Val Thr Phe Pro Gln Val Asp Gly Trp Glu Glu Leu Ser Gly Leu Asp 　　　　35 40 45 Glu Glu Gln His Ser Val Arg Thr Tyr Glu Val Cys Asp Val Gln Arg 50 55 60 Ala Pro Gly Gln Ala His Trp Leu Arg Thr Gly Trp Val Pro Arg Arg 65 70 75 80 Gly Ala Val His Val Tyr Ala Thr Leu Arg Phe Thr Met Leu Glu Cys 85 90 95 Leu Ser Leu Pro Arg Ala Gly Arg Ser Cys Lys Glu Thr Phe Thr Val 　　　　　　100 105 110 Phe Tyr Tyr Glu Ser Asp Ala Asp Thr Ala Thr Ala Leu Thr Pro Ala 　　　　115 120 125 Trp Met Glu Asn Pro Tyr Ile Lys Val Asp Thr Val Ala Ala Glu His 130 135 140 Leu Thr Arg Lys Arg Pro Gly Ala Glu Ala Thr Gly Lys Val Asn Val 145 150 155 160 Lys Thr Leu Arg Leu Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr Leu Ala 165 170 175 Phe Gln Asp Gln Gly Ala Cys Met Ala Leu Leu Ser Leu His Leu Phe 180 185 190 Tyr Lys Lys Cys Ala Gln Leu Thr Val Asn Leu Thr Arg Phe Pro Glu 195 200 205 Thr Val Pro Arg Glu Leu Val Val Pro Val Ala Gly Ser Cys Val Val 210 215 220 Asp Ala Val Pro Ala Pro Gly Pro Ser Pro Ser Leu Tyr Cys Arg Glu 225 230 235 240 Asp Gly Gln Trp Ala Glu Gln Pro Val Thr Gly Cys Ser Cys Ala Pro 245 250 255 Gly Phe Glu Ala Ala Glu Gly Asn Thr Lys Cys Arg Ala Cys Ala Gln 260 265 270 Gly Thr Phe Lys Pro Leu Ser Gly Glu Gly Ser Cys Gln Pro Cys Pro 275 280 285 Ala Asn Ser His Ser Asn Thr Ile Gly Ser Ala Val Cys Gln Cys Arg 290 295 300 Val Gly Tyr Phe Arg Ala Arg Thr Asp Pro Arg Gly Ala Pro Cys Thr 305 310 315 320 Thr Pro Pro Ser Ala Pro Arg Ser Val Val Ser Arg Leu Asn Gly Ser 325 330 335 Ser Leu His Leu Glu Trp Ser Ala Pro Leu Glu Ser Gly Gly Arg Glu 340 345 350 Asp Leu Thr Tyr Ala Leu Arg Cys Arg Glu Cys Arg Pro Gly Gly Ser 355 360 365 Cys Ala Pro Cys Gly Gly Asp Leu Thr Phe Asp Pro Gly Pro Arg Asp 370 375 380 Leu Val Glu Pro Trp Val Val Val Arg Gly Leu Arg Pro Asp Phe Thr 385 390 395 400 Tyr Thr Phe Glu Val Thr Ala Leu Asn Gly Val Ser Ser Leu Ala Thr 405 410 415 Gly Pro Val Pro Phe Glu Pro Val Asn Val Thr Thr Asp Arg Glu Val 420 425 430 Pro Pro Ala Val Ser Asp Ile Arg Val Thr Arg Ser Ser Pro Ser Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ala Trp Ala Val Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala Val Leu 450 455 460 Asp Tyr Glu Val Lys His Glu Lys Gly Ala Glu Gly Pro Ser Ser Val 465 470 475 480 Arg Phe Leu Lys Thr Ser Glu Asn Arg Ala Glu Leu Arg Gly Leu Lys 485 490 495 Arg Gly Ala Ser Tyr Leu Val Gln Val Arg Ala Arg Ser Glu Ala Gly 500 505 510 Tyr Gly Pro Phe Gly Gln Glu His His Ser Gln Thr Gln Leu Asp Glu 515 520 525 Ser Glu Gly Trp Arg Glu Gln Leu Ala Leu Ile Ala Gly Thr Ala Val 530 535 540 Val Gly Val Val Leu Val Leu Val Val Ile Val Val Ala Val Leu Cys 545 550 555 560 Leu Arg Lys Gln Ser Asn Gly Arg Glu Ala Glu Tyr Ser Asp Lys His 565 570 575 Gly Gln Tyr Leu Ile Gly His Gly Thr Lys Val Tyr Ile Asp Pro Phe 580 585 590 Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Glu Ala Val Arg Glu Phe Ala Lys Glu Ile 595 600 605 Asp Val Ser Tyr Val Lys Ile Glu Glu Val Ile Gly Ala Gly Glu Phc 610 615 620 Gly Glu Val Cys Arg Gly Arg Leu Lys Ala Pro Gly Lys Lys Glu Ser 625 630 635 640 Cys Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Gly Gly Tyr Thr Glu Arg Glu Arg 645 650 655 Arg Glu Phe Leu Ser Glu Ala Ser Ile Met Gly Gln Phe Glu His Pro 660 665 670 Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gly Val Val Thr Asn Ser Met Pro Val Met 675 680 685 Ile Leu Thr Glu Phe Met Glu Asn Gly Ala Leu Asp Ser Phe Leu Arg 690 695 700 Leu Asn Asp Gly Gln Phe Thr Val Ile Gln Leu Val Gly Met Leu Arg 705 710 715 720 Gly Ile Ala Ser Gly Met Arg Tyr Leu Ala Glu Met Ser Tyr Val His 725 730 735 Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu Val Cys 740 745 750 Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Phe Leu Glu Glu Asn Ser Ser 755 760 765 Asp Pro Thr Tyr Thr Ser Ser Leu Gly Gly Lys Ile Pro Ile Arg Trp 770 775 780 Thr Ala Pro Glu Ala Ile Ala Phe Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp 785 790 795 800 Ala Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met Ser Phe Gly Glu 805 810 815 Arg Pro Tyr Trp Asp Met Ser Asn Gln Asp Val Ile Asn Ala Ile Glu 820 825 830 Gln Asp Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Pro Asp Cys Pro Thr Ser Leu His 835 840 845 Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln Lys Asp Arg Asn Ala Arg Pro Arg 850 855 860 Phe Pro Gln Val Val Ser Ala Leu Asp Lys Met Ile Arg Asn Pro Ala 865 870 875 880 Ser Leu Lys Ile Val Ala Arg Glu Gly Gly Ala Ser His Pro Leu Leu 885 890 895 Asp Gln Arg Gln Pro His Tyr Ser Ala Phe Gly Ser Val Gly Glu Trp 900 905 910 Leu Arg Ala Ile Lys Met Gly Arg Tyr Glu Glu Ser Phe Ala Ala Ala 915 920 925 Gly Phe Gly Ser Phe Glu Leu Val Ser Gln Ile Ser Ala Glu Asp Leu 930 935 940 Leu Arg Ile Gly Val Thr Leu Ala Gly His Gln Lys Lys Ile Leu Ala 945 950 955 960 Ser Val Gln His Met Lys Ser Gln Ala Lys Pro Gly Thr Pro Gly Gly 965 970 975 Thr Gly Gly Pro Ala Pro Gln Tyr 980 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Val Asn Leu Thr Arg Phe Pro Glu Thr Val Pro Arg Glu Leu Val 1 5 10 15 Val Pro Val Ala Gly Ser Cys Val Val 20 25 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Ser Cys Val Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Gly Pro Ser Pro Ser 1 5 10 15 Leu Tyr Cys Arg Glu Asp Gly Gln Trp 20 25 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Asp Gly Gln Trp Ala Glu Gln Pro Val Thr Gly Cys Ser Cys Ala 1 5 10 15 Pro Gly Phe Glu Ala Ala Glu Gly Asn 20 25 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Ala Glu Gly Asn Thr Lys Cys Arg Ala Cys Ala Gln Gly Thr Phe 1 5 10 15 Lys Pro Leu Ser Gly Glu Gly Ser Cys 20 25 <210> 6 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gly Glu Gly Ser Cys Gln Pro Cys Pro Ala Asn Ser His Ser Asn Thr 1 5 10 15 Ile Gly Ser Ala Val Cys Gln Cys Arg 20 25 <210> 7 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Val Cys Gln Cys Arg Val Gly Tyr Phe Arg Ala Arg Thr Asp Pro Arg 1 5 10 15 Gly Ala Pro Cys Thr Thr Pro Pro Ser 20 25 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Gly Ser Cys Val VaL Asp Ala 1 5 <210> 9 　<211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Val Ala Gly Ser Cys Val Val Asp Ala Val 1 5 10 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Val Val Pro Val Ala Gly Ser Cys Val Val Asp Ala Val Pro Ala 1 5 10 15 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ala Gly Ser Cys Val Val Asn Ala Val Pro Ala Pro Gly Pro Ser Pro 1 5 10 15 Ser Leu Tyr Cys Aag Glu Asp Gly Gln 20 25 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Gly Ser Cys Val Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Gly Pro Ser Pro 1 5 10 15 Ser Leu Tyr Cys Arg Glu Asp Gly Gln 20 25 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gly Ser Cys Val Val 1 5

Claims

세포의 암성 성장을 억제하는 방법으로서,

상기 세포를 적어도 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 접촉시키는 단계를 포함하며,

상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400 내에 위치하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245 내에 위치한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 항체 또는 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 내에 위치한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항체 또는 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230 내에 위치한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
세포의 암성 성장을 억제하는 방법으로서,

상기 세포를 적어도 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 결합시키는 단계를 포함하고,

상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 및 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기와 적어도 85% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서,

상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 및 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기와 적어도 90% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 서열이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 Asp(D)가 Asn(N)로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
암 세포의 세포사를 유도하는 방법으로서,

상기 세포를 적어도 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 접촉시키는 단계를 포함하고,

상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400 내에 위치하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서,

상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245 내에 위치한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서,

상기 항체 또는 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 내에 위치한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항체 또는 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230 내에 위치한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
암 세포의 세포사를 유도하는 방법으로서,

상기 세포를 적어도 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 결합시키는 단계를 포함하고,

상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 및 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기와 적어도 85% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서,

상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 및 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기와 적어도 90% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 서열이 EphB4(SEQ ID NO:10의 잔기 226에서 아미노산 Asp(D)가 Asn(N)로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
대상에서 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서,

상기 대상에게 적어도 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하고,

상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400 내에 위치하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서,

상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245 내에 위치한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서,

상기 항체 또는 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 내에 위치한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항체 또는 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230 내에 위치한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
대상에서 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서,

상기 대상에게 적어도 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하고,

상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 및 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기와 적어도 85% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서,

상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 및 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기와 적어도 90% 상동인 서열 내에 위치하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 서열이 EphB4(SEQ ID NO:10의 잔기 226에서 아미노산 Asp(D)이 Asn(N)로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
세포의 암성 성장을 억제하는 제제를 확인하는 방법으로서,

상기 제제가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400의 영역 내에서 EphB4 폴리펩티드에 결합하는 능력을 평가하는 단계를 포함하는 방법.
제22항에 있어서,

상기 방법은 상기 제제가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245 영역 내에서 EphB4 폴리펩티드에 결합하는 능력을 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제22항 또는 제23항에 있어서,

상기 방법은 상기 제제가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 영역 내에서 EphB4 폴리펩티드에 결합하는 능력을 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 방법은 상기 제제가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230 영역 내에서 EphB4 폴리펩티드에 결합하는 능력을 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
세포의 암성 성장을 억제하는 제제를 확인하는 방법으로서,

상기 제제가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, 및 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기와 적어도 85% 상동인 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 능력을 평가하는 단계를 포함하는 방법.
제26항에 있어서,

상기 방법은 상기 제제가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245, EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244 및 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기와 적어도 90% 상동인 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 능력을 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 서열이 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 Asp(D)가 Asn(N)으로 치환된 것을 특징으로 하는 방법.
제22항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 확인된, 세포의 암성 성장을 억제하는 제제.
EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245에 적어도 85% 상동인 서열을 가지는 폴리펩티드에 결합하는 정제된 EphB4 항체.
제30항에 있어서,

상기 폴리펩티드가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 201 내지 245에 적어도 90% 상동인 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 정제된 EphB4 항체.
EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244에 적어도 85% 상동인 서열을 가지는 폴리펩티드에 결합하는 정제된 EphB4 항체.
제32항에 있어서,

상기 폴리펩티드가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 244에 적어도 90% 상동인 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 정제된 EphB4 항체.
EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230에 적어도 85% 상동인 서열을 가지는 폴리펩티드에 결합하는 정제된 EphB4 항체.
제34항에 있어서,

상기 폴리펩티드가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 220 내지 230에 적어도 90% 상동인 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 정제된 EphB4 항체.
제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항체가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 200 내지 400 내에 위치하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 정제된 EphB4 항체.
제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항체가 EphB4(SEQ ID NO:1)의 잔기 226에서 아미노산 Aps(D)이 Asn(N)으로 치환된 폴리펩티드에 결합하는 것을 특징으로 하는 정제된 EphB4 항체.
제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항체가 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 정제된 EphB4 항체.