CN1694902B - 与EphB4多肽的表位结合的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使用与EphB4多肽的表位结合的抗体或其抗原结合部分抑制细胞的癌性生长的方法。本发明还提供了EphB4的纯化抗体。本发明还提供了预防或治疗癌症的方法。本发明还涉及鉴别可抑制细胞的癌性生长的药物的方法。

Description

与EphB4多肽的表位结合的抗体及其应用
发明领域 
本发明涉及调节癌症的方法。特别地，本发明涉及抑制细胞癌性生长的方法。本发明还提供了预防或治疗癌症的方法。本发明还涉及鉴别能抑制细胞癌性生长的药物的方法。 
发明背景 
癌症描述了由于机体细胞失调生长所致的一类疾病。恶性癌症可由于这种失调生长而产生并随后通过血流或淋巴系统分散于全身，这个过程称为转移。上皮组织的恶性肿瘤是癌症最常见的形式并且是西方工业化国家中多数癌症相关死亡的原因。根据澳大利亚健康与福利协会(Australian Institute of Health and Welfare，AIHW)的报告，平均每三个男性及平均四个女性中就有一人在75岁之前将发生癌症(1)。男性中最常见的是前列腺癌，肠癌和肺癌，女性中最常见的是乳腺癌，肠癌和黑素瘤。鉴别在肿瘤组织中特异性表达而在正常组织中不表达的基因并分析其作用，用于鉴别癌症治疗中的新的靶位。 
一些基因与许多癌症相关。例如，已知癌基因编码细胞生长因子如表皮生长因子的受体。ras基因是一种癌基因，确信其与直至90％的人胰腺癌，50％的人结肠癌，40％的肺癌和30％的白血病相关。突变的癌基因可以成为致癌基因。这种突变的癌基因编码触发失控的细胞生长的蛋白质如蛋白激酶和蛋白磷酸化酶。EphB4是已知最大的受体蛋白酪氨酸激酶家族的一个最近鉴别的成员。已经鉴别了Eph受体家族成员参与许多细胞过程，包括神经发育，血管发生及血管网汇集(vascular network assembly)(2-5)。作为与其配体ephrin相互作用 的结果，它们介导接触依赖性细胞相互作用，调节细胞功能如接触抑制，细胞骨架组构及细胞迁移(6，7)。 
尽管已经研发了许多抗癌药物包括生长抑制分子如细胞毒性化合物尝试治疗癌症，但仍需要调节癌症的有效方法。 
发明概述 
本发明基于令人惊奇地发现，即可结合EphB4蛋白一特定区域的抗体可通过引起癌细胞死亡而有利地抑制癌细胞癌性生长。 
因此，本发明第一个方面提供了一种抑制细胞癌性生长的方法，所述方法包括将细胞与至少一种抗体或其抗原结合部分接触，其中所述抗体或其抗原结合部分结合一个表位，该表位位于EphB4(SEQ IDNO：1)的第200-400位残基的区域内，或者位于与该区域有至少85％优选至少90％相同性的一个序列内。优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合一个表位，该表位位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基内，或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的一个序列内。优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合一个表位，该表位位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基内，或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的一个序列内。最优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合一个表位，该表位位于EphB4(SEQID NO：1)的第220-230位残基内，或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的一个序列内。优选地，该序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位残基的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
本发明第二个方面还提供了一种诱导癌细胞死亡的方法，所述方法包括将所述细胞与至少一种抗体或其抗原结合部分接触，其中所述抗体或其抗原结合部分结合一个表位，该表位位于EphB4(SEQ IDNO：1)的第200-400位残基内，或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的一个序列内。优选地，所述抗体或其抗原结合部分 结合一个表位，该表位位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基内，或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的一个序列内。优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合一个表位，该表位位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基内，或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的一个序列内。最优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合一个表位，该表位位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基内，或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的一个序列内。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位残基的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
本发明第三个方面提供了一种在患者中治疗或预防患者癌症的方法，所述方法包括给予患者有效量的至少一种抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分结合一个表位，该表位位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基内，或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的一个序列内。优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合一个表位，该表位位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基内，或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的一个序列内。优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合一个表位，该表位位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基内，或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的一个序列内。最优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合一个表位，该表位位于EphB4(SEQID NO：1)的第220-230位残基内，或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的一个序列内。优选地，所述序列在EphB4(SEQ IDNO：1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
本发明另一方面提供了一种鉴别抑制细胞癌性生长的药物的方法，所述方法包括评价所述药物与位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400残基的区域内或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的EphB4多肽的结合能力。优选地，所述方法包括评 价所述药物与位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245残基的区域内或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的EphB4多肽的结合能力。优选地，所述方法包括评价所述药物与位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244残基的区域内或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的EphB4多肽的结合能力。最优选地，所述方法包括评价所述药物与位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230残基的区域内或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的EphB4多肽的结合能力。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
本发明还提供了通过上述方法鉴别的一种药物。 
本发明另一个方面提供了一种纯化的EphB4抗体，其结合具有与EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基有至少85％相同性，优选与EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基有至少90％相同性的序列的多肽。优选地，所述纯化的EphB4抗体结合具有与EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基有至少85％相同性，优选与EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基有至少90％相同性的序列的多肽。纯化的EphB4抗体优选结合具有与EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基有至少85％相同性，优选与EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基有至少90％相同性的序列的多肽。最优选地，本发明提供了一种纯化的EphB4抗体，其结合位于EphB4(SEQ IDNO：1)的第200-400位残基内一个表位。本发明的纯化的EphB4抗体优选结合在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位残基的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)的多肽。优选地，纯化的EphB4抗体是一种单克隆抗体。 
附图简述 
图1示出使用特异性针对EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨 基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa CruzBiotechnology)，在三种不同的结肠癌和匹配的正常粘膜中EphB4表达的免疫组织化学定位。来自生物素酰化的二级抗体的黑色染色表示EphB4蛋白。核用Harris苏木精染色。图中示出了三种不同的腺癌(高分化的，中等分化的及分化不良的)及其匹配的正常粘膜的高倍(100×)放大图像。针对每个样品组示出了肿瘤组织的强染色及正常组织的非常弱的弥漫染色。与单独的二级抗体无交叉反应性(结果未示出)。 
图2示出在5对肿瘤(T)/正常组(N)中EphB4(1187bp)和内在18SrRNA(489bp)的相对RT-PCR对比表达。LM-来自患者5的肝转移癌；NL-来自患者5的正常肝脏；C1-结肠癌细胞系LIM2405；C2-结肠癌细胞系SW480；RT-RT阴性对照；P-PCR阴性对照；M-pUC19/HpaII标记。 
图3示出于2ml DMEM中的铺满单层细胞用特异靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的1/500稀释的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)处理(0.4ng/μl终浓度)。将细胞与抗体保温在24-48小时之间产生明显应答。细胞以易碎片状脱离培养皿的底部，其通过轻轻搅动而易于破坏。培养基颜色的改变是由于死亡细胞的细胞内容物渗出所致的0.5pH单位的改变而引起的。 
图4示出特异靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)剂量的增加在48小时后在体外对MCF-7细胞生长的作用的图示。 
图5示出台盼蓝排除分析以确定特异靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)的剂量依赖性。在暴露于三种不同稀释的EphB4抗体48小时后(X-轴)，存活细胞数目降低(×100000)(Y- 轴)。在添加1μg/ml 72小时后及在添加2μg/ml 48小时后，无存活细胞残存。 
图6示出Caspase-3分析。在所有稀释的特异靶向EphB4(SEQID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)(X-轴)应用之后，每100000个细胞的caspase-3活性的相对量增加(Y-轴)。由于应用1/200稀释液(1μg/ml)72小时后及应用1/100(2μg/ml)稀释液48小时后无存活的细胞，因此未测定caspase-3活性。 
图7示出了在用如下5种不同的EphB4抗体处理65小时后，乳腺癌细胞的存活力百分率：(1)靶向小鼠EphB4的羧基末端第825-991位氨基酸残基的EphB4多克隆抗体(Swiss)(Dr Andrew Ziemiecki，University of Bern提供)；(2)靶向EphB4氨基酸序列的N末端前19个氨基酸的多克隆N末端EphB4抗体(N-19 Santa CruzBiotechnology)，所述19个氨基酸很可能是成熟EphB4(SEQ ID NO：1)的第16-34位氨基酸残基；(3)靶向相应于由EphB4(SEQ ID NO：1)的第615-874位氨基酸残基组成的酪氨酸激酶结构域的羧基末端的多克隆EphB4C末端抗体(C-16 Santa Cruz Biotechnology)；(4)特异靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)；及(5)特异靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200(old)-Santa Cruz Biotechnology-Lot number B141batch)。将细胞用1/100稀释的原种抗体(200μg/ml)处理，然后用台盼蓝染色(染色死亡的细胞)。对每种处理的4个不同等份计算未染色的(存活)与染色的(未存活的)细胞比率。对照-未加入抗体。CLM-补体限制培养基(complement limited medium)。FCS-10％胎牛血清加入培养基中。补体在特异靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)的细胞死亡作用中不起作用。这通过在具有正常蛋白质活性的培养基中生长的细胞中加入抗体后(FCS实验)与在其中补体蛋白通过加热至55℃30分钟而灭活的培养基中生长的细胞(CLM实验)对比存活力百分率而表明。 
图8示出所给出的正常人体组织及一种代表性的结肠肿瘤(肿瘤)的Western分析。(A)使用特异靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa CruzBiotechnology)鉴别EphB4蛋白。推定的野生型蛋白是120kDa，用箭头指示。(B)考马斯蓝染色的一式两份凝胶。指出了分子量标记的大小。 
图9示出野生型EphB4受体的结构域与剪接变体EphB4v1和EphB4v2的推定结构对比示意图。缺失的区域用*标示。 
图10示出用1/100稀释的特异靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa CruzBiotechnology)处理65小时(处理组)或者未加处理(对照组)的EphB4基因和PBGD(管家基因对照)在乳腺癌细胞系MDA-MB-231(231)、MDA-MB-468(468)、Hs578t、MCF7和T47D中的表达。RT-ve是仅作为对照的反转录试剂。标记1-Spp1/EcoR1，标记2-pUC19/Hpa11。 
图11示出设计为跨靶EphB4序列的前125个氨基酸(以黑体字示出)的6个重叠肽的序列[以SEQ ID NO：2(肽1)至SEQ ID NO：7(肽6)表示]。数字是指成熟EphB4蛋白(图18中示出的SEQ ID NO：1)中氨基酸的位置。 
图12示出台盼蓝排除分析，对比对照细胞(未处理的)，只用特异靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)处理的细胞(只用Ab)，或者用抗体和肽混合物(Ab+所有肽)处理的细胞的存活力。一式两份进行测试。 
图13示出在对照细胞(未处理的)，只用特异靶向EphB4(SEQ IDNO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)处理的细胞(只用Ab)，或者用抗体和肽混合物(Ab+所有肽)处理的细胞中caspase-3活性的相对水平对比分析。一式两份进行测试。 
图14示出在用有或无5μl的指定肽时用1/500稀释的特异靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)处理铺满的SW480单层细胞48小时后，进行的台盼蓝排除分析的结果。肽1和肽2呈现从Ab介导的细胞死亡中拯救大约50％的细胞。 
图15示出肽1(SEQ ID NO：2)或肽2(SEQ ID NO：3)的浓度增加(至10μl)能从特异靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)介导的细胞死亡中充分拯救细胞，并且肽1和2组合具有同样作用(每个5μl)。 
图16示出能阻断特异靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa CruzBiotechnology)对培养物细胞的作用的两个重叠肽的序列[以SEQ IDNO：2(肽1)和SEQ ID NO：3(肽2)表示]，及为进一步缩小反应序列而针对核心序列GSCVV设计的三个肽的序列[以SEQ ID NO：8(肽7)至SEQ ID NO：10(肽9)表示]。数字是指成熟EphB4蛋白中氨基酸的位置(黑体字示出的序列)。 
图17示出肽7(SEQ ID NO：8)能从Ab介导的细胞死亡中充分拯救细胞，并且与肽2(SEQ ID NO：3)的作用相同。将1μl特异靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)(0.2μg/ml)和10μl的10mg/ml肽原种一起在冰上预保温2小时，之后加入具有500μl DMEM 的24孔微滴定平板中的铺满单层细胞中。 
图18示出SEQ ID NO：1的氨基酸序列。SEQ ID NO：1是成熟人(Homo sapiens)Ephrin B型受体4(EphB4)的氨基酸序列。 
图19示出具有不同的多克隆抗体(N-19，H-200和C-16)所靶向的结构域区域(用黑括号标示)的EphB4受体的模型。球形结构域(ephrin受体配体结合结构域)相应于EphB4(SEQ ID NO：1)的残基29-197。半胱氨酸富集区域(Giardia变体特异性表面蛋白)相应于EphB4(SEQ ID NO：1)的残基255-313。纤连蛋白III型结构域1相应于EphB4(SEQ ID NO：1)的残基324-414。纤连蛋白III型结构域相应于EphB4(SEQ ID NO：1)的残基437-517。跨膜结构域相应于EphB4(SEQ ID NO：1)的残基540-560。酪氨酸激酶结构域相应于EphB4(SEQ ID NO：1)的残基615-874。SAM(无菌α基序)结构域相应于EphB4(SEQ ID NO：1)的残基904-971。PDZ结构域相应于EphB4(SEQ ID NO：1)的残基985-987。 
这些结构域相对于EphB4氨基酸序列的放置基于取自NCBI登记号NP004435的最近报道的信息。N-19抗体作图为很可能是成熟EphB4(SEQ ID NO：1)的第16-34位氨基酸残基的序列N末端前19个氨基酸。C-16抗体靶向酪氨酸激酶结构域。H-200抗体特异性靶向跨半胱氨酸富集区域和纤连蛋白结构域的胞外结构域中EphB4(SEQID NO：1)的残基201-400。 
图20示出被设计为包括提议的表位序列的肽11的序列(SEQ IDNO：12)，及肽10的序列(SEQ ID NO：11)，其中携带这个野生型序列中一个电荷的氨基酸天冬氨酸(D)被具有相似侧链结构的不带电荷的氨基酸天冬酰胺(N)取代。黑体字所示数字和序列是指成熟EphB4蛋白中氨基酸的位置。 
发明详述 
本发明第一方面提供了一种抑制细胞癌性生长的方法，所述方法包括将细胞与至少一种抗体或其抗原结合部分接触，其中所述抗体或其抗原结合部分结合位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基内或位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合位于EphB4(SEQ IDNO：1)的第201-245位残基内或位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。最优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基内或位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
所述抗体或其抗原结合部分优选特异性结合具有由EphB4(SEQID NO：1)的第200-400位残基组成的序列的一种多肽。优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合具有由EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基组成的序列或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的一种多肽。优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合具有由EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基组成的序列或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的一种多肽。最优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合具有由EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基组成的序列或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的一种多肽。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。最优选地，所述抗体或其抗原结合部分是多克隆或单克隆抗体。所述方法优选导致细胞死亡。 
所述抗体或其抗原结合部分优选特异性结合一种多肽，所述多肽具有与选自EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、EphB4(SEQ ID NO：1)的第220 -244位残基及EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列有至少85％，优选至少90％相同性的序列。具有与EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基或EphB4(SEQ IDNO：1)的第220-230位残基的序列有至少85％，优选至少90％相同性的序列的多肽优选包括具有特定氨基酸的至少一种取代、缺失或添加的多肽变体。这种多肽变体特别是如果它们保留抗原性性质则也适于本方法。例如，多肽变体可被设计为保留抗原性性质并改良多肽的产生和/或溶解性。 
例如，抗原性预测程序提示带电荷的氨基酸Asp(D)对表位功能也是重要的，因为这是序列中唯一的带电荷的残基。由EphB4蛋白(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基220-244组成的肽11如图20所示设计。在EphB4蛋白(SEQ ID NO：1)的第226位残基有一个Asn(N)取代的肽10也如图20所示设计。肽10和肽11的氨基酸序列如下： 
肽10SEQ ID NO：11：AGSCVVNAVPAPGPSPSLYCREDGQ 
肽11SEQ ID NO：12：AGSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQ 
Asp和Asn的侧链非常相似，Asp的羟基是Asn中的胺，并将其从负电荷氨基酸转变为中性氨基酸。 
本发明第二方面还提供了一种诱导癌细胞死亡的方法，所述方法包括将细胞与至少一种抗体或其抗原结合部分接触，其中所述抗体或其抗原结合部分结合位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。最优选地，所述抗体或 其抗原结合部分结合位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位残基的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
本发明的第三方面提供了一种在患者中治疗或预防患者癌症的方法，所述方法包括给予患者有效量的至少一种抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分结合位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。最优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位残基的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
所述癌症优选选自乳腺癌，前列腺癌，肠癌，膀胱癌，结肠癌，卵巢癌，肺癌，黑素瘤，淋巴瘤和白血病。所述方法优选导致患者体内癌细胞死亡。 
本发明的另一方面提供了一种鉴别抑制细胞癌性生长的药物的方法，所述方法包括评价该药物与位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400残基区域内或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内EphB4多肽的结合能力。 
在本发明的一个优选实施方案中，所述药物结合包含在EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基内或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，所述药物结合包含在 EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基内或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基内或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。最优选地，所述药物结合包含在EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基内或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位残基的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
本发明还提供了通过上述方法鉴别的一种药物。 
在本说明书中，术语“抗体”以其最广泛含义应用，并特别包括单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双重特异性抗体)，及抗体片段。术语“表位”是指由抗体或其抗原结合部分识别的多肽的表位区域。 
抗体是指由4个多肽链组成的免疫球蛋白分子，这4个链是由二硫键内在连接的两个重链(H)和两个轻链(L)。每个重链均由一个重链可变区(HCVR或VH)和一个重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链均由一个轻链可变区(LCVR或VL)和一个轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步再分为高度可变区，称为互补决定区(CDR)，中间散布着更保守的称为构架区(FR)的区域。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，以如下顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。 
本文所用术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体部分”)是指保留特异性结合抗原能力的一或多个抗体片段。已经示出抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。术语抗体的“抗原结合部分”涵盖的结合片段的实例包括(I)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含在铰链区通过二硫键 连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的一个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域，或者VL结构域(9)组成的dAb片段(8)；及(vi)分离的互补决定区(CDR)。另外，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH是由独立的基因编码的，但可以使用重组方法通过一个合成接头将它们连接，使它们成为一个单一的蛋白质链，其中VL和VH区组对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)(10)，(11)。这种单链抗体也涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中。其它形式的单链抗体如二抗体(diabody)或三抗体(triabodys)也涵盖在其中。二抗体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域在多肽单链上表达，但使用一个接头，该接头太短以至于使得同一链上的两个结构域之间不能配对，从而使得该结构域与另一个链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点(12，13)。优选地，抗体是EphB4(H-200)兔多克隆Ig G抗体，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，California。 
更优选地，抗体是单克隆抗体或其片段，并且特别选自结合位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基内或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位的单克隆抗体或其片段。优选地，所述单克隆抗体或其片段结合位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基内或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，所述单克隆抗体或其片段结合位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基内或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。最优选地，所述单克隆抗体或其片段结合位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基内或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位残基的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
本发明的另一方面提供了一种纯化的EphB4抗体，其结合具有 与EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基有至少85％相同性，优选与EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基有至少90％相同性的序列的多肽。优选地，所述纯化的EphB4抗体结合具有与EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基有至少85％相同性，优选与EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基有至少90％相同性的序列的多肽。纯化的EphB4抗体优选结合具有与EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基有至少85％相同性，优选与EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基有至少90％相同性的序列的多肽。更优选地，本发明提供了一种纯化的EphB4抗体，其结合位于EphB4(SEQ IDNO：1)的第200-400位残基内的一个表位。本发明的纯化的EphB4抗体优选结合在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)的多肽。更优选地，纯化的EphB4抗体是一种单克隆抗体。 
本文所用术语“单克隆抗体”是指得自一群基本同源的抗体的抗体，即这群中的各个抗体除了可能天然发生的突变之外是相同的，突变可以是少量存在的。单克隆抗体是高度特异性的，靶向单一的抗原性位点。另外，与典型包括靶向不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相反，每个单克隆抗体均靶向抗原上的一个单一决定簇。修饰语“单克隆”表明抗体的特征，其得自基本同源的抗体群，并且不是通过任何特殊方法根据抗体的所需产生而构建的。例如，本发明中应用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法生产，分离自噬菌体抗体文库，或者可以通过重组DNA方法产生。这种技术包括但非限于杂交瘤技术(14)，三瘤(trioma)技术，人B细胞杂交瘤技术(15)，及EBV杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(16)。另外，人源化的单克隆抗体可以根据美国专利6,090,382所述方法产生，该专利的全文及所引用的参考文献在此均并入参考。该文献提供了表达重组人抗体的合适的宿主细胞及合成重组人抗体的方法。另外，合适的人抗体 可以使用转基因动物产生，使用例如Oncology 29(Supp 4)47-50(2002)所述技术进行。本发明的抗体也可以得自商业来源。 
也可以使用本领域已知的多种方法产生结合一种多肽的多克隆抗体，该多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400残基的序列或者与其有至少85％相同性，优选至少90％相同性的序列。为产生抗体，多种宿主动物可以通过注射与一种合适的载体结合的EphB4蛋白质或EphB4多肽片段而免疫。合适的载体可包括但非限于BSA(牛血清白蛋白)，KLH(匙孔血蓝蛋白)，OVA(卵清蛋白)，THY(甲状腺球蛋白)和RSA(兔血清白蛋白)。宿主动物优选用包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的EphB4多肽免疫。优选地，宿主动物可通过注射包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的EphB4蛋白或多肽而免疫。优选地，宿主动物可通过注射包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的EphB4蛋白或多肽而免疫。最优选地，宿主动物可通过注射包含EphB4(SEQID NO：1)的第220-230位残基或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的EphB4蛋白或多肽而免疫。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位残基的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
合适的宿主动物包括但非限于兔，小鼠，大鼠等。根据宿主物种可以使用不同佐剂以增加免疫应答，佐剂包括但非限于Freud′s(完全和不完全)佐剂，矿物质凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂，多聚醇，聚阴离子，肽，油乳状液，二硝基苯酚，和潜在用于人体的佐剂如卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。抗体和抗体片段可以通过标准技术大量生产(例如在组织培养物或者无血清使用发酵器进行)并使用亲和柱 如蛋白A(例如针对鼠Mab)、蛋白G(例如针对大鼠Mab)或MEPHYPERCEL(例如针对IgM和IgG Mab)纯化。 
合适的抗体可包括抗体片段，包括可结合具有EphB4(SEQ IDNO：1)的第200-400位残基序列或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的多肽的抗原结合部分。抗体的抗原结合部分优选包括EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的独特型。优选地，抗体片段包括可结合具有EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基序列或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的多肽的抗原结合部分。优选地，抗体片段包括可结合具有EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基序列或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的多肽的抗原结合部分。最优选地，抗体片段包括可结合具有EphB4(SEQID NO：1)的第220-230位残基序列或与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的多肽的抗原结合部分。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位残基的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
这种抗体片段可通过本领域已知的技术产生。例如，这种片段包括但非限于F(ab′)2片段，其可以通过胃蛋白酶消化抗体分子而产生；Fab′片段，其可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键而产生；Fab片段，其可以通过用木瓜蛋白酶和一种还原剂处理抗体而产生；及Fv片段。在进一步的技术中，特异于一种多肽的重组抗体可以被工程化并在广泛的细胞类型中异位表达，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基，优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基，优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基，更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位残基发氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
本发明方法中使用的抗体可包括“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体，其是免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其片段(如抗体的Fv，Fab，Fab′，F(ab′).sub.2片段或者其它抗原结合亚序列)，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小限度的氨基酸残基。就其大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体(recipient)抗体)，其中来自接受体的互补决定区(CDR)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和容量的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基置换。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人FR残基置换。此外，人源化抗体可包含在接受体抗体和输入的CDR或构架序列中均未发现的残基。可以进行这些修饰以进一步改进和最佳化抗体性能。 
本文所用术语“EphB4蛋白”包括全长EphB4蛋白或包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的多肽片段。优选地，EphB4蛋白包括包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的多肽片段。优选地，EphB4蛋白包括包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的多肽片段。最优选地，EphB4蛋白包括包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的多肽片段。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
EphB4变体蛋白可以在氨基酸水平修饰，并可以包括不影响蛋白质功能性的氨基酸添加或缺失或置换，如保守氨基酸取代。EphB4蛋白也可以包括一种截短的EphB4蛋白。EphB4蛋白可以是天然的或重组的。EphB4蛋白可以来自任何动物物种，优选EphB4蛋白来自人。 
适于本发明方法的抗体或其抗原结合部分优选能通过抑制EphB4蛋白的活性而抑制细胞的癌性生长。在本说明书中，术语“癌性生长”是指细胞的异常和不可控制的分裂和生长。典型地，这种细胞被鉴定为癌细胞，其能侵入并破坏其它组织并具有波及到机体其它部位的潜力。细胞的癌性生长可导致肿瘤形成，这个肿瘤可以是良性或恶性的。 
在本说明书中，术语“细胞”是指包括任何细胞。优选地，所述细胞衍生自哺乳动物物种，例如但非限于人，小鼠，牛，绵羊或家畜。优选所述细胞选自但非限于前列腺细胞，乳腺细胞，结肠细胞，成纤维细胞，表皮细胞，胎盘，肝，肾，胰，心，神经细胞或肌细胞，或者癌细胞或肿瘤细胞。所述细胞可以是正常细胞，患病细胞，成年细胞或胚胎细胞。所述细胞可以是单个细胞，培养细胞或组织的一部分。所述细胞可以是遗产修饰的重组细胞，如转基因细胞。优选地，所述细胞表达EphB4。所述细胞可以是整个动物的一部分。所述细胞还可以衍生自一种细胞系。优选地，来自细胞系的细胞衍生自但非限于前列腺，乳腺，结肠或卵巢细胞系。所述细胞系优选选自结肠SW480，结肠SW620，结肠LIM1215，乳腺MCF7，乳腺T47-D，乳腺MDA-MB-231，乳腺MDA-MB-453，膀胱J82，膀胱T24，膀胱RT119和膀胱5637。更优选地，细胞系选自乳腺癌细胞系MCF-7和结肠癌细胞系SW480。 
本发明的抗体或其抗原结合部分优选可抑制一或或种癌细胞的癌性生长，所述癌细胞选自乳腺癌细胞，前列腺癌细胞，肠癌细胞，膀胱癌细胞，结肠癌细胞，卵巢癌细胞，肺癌细胞，黑素瘤细胞，淋巴瘤细胞和白血病细胞。 
抗体或其抗原结合部分优选特异性结合一种多肽，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第 220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列。在本发明一个优选的实施方案中，至少一种抗体或其抗原结合部分特异性结合一个表位，该表位包含于EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ IDNO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内。 
本说明书中术语“特异性结合”应理解为是指抗体或其抗原结合部分独特地结合一种多肽的结合特性，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列。抗体或其抗原结合部分优选是多克隆或单克隆抗体，其特异性结合一种多肽，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ IDNO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列。优选地，所述抗体是特异性靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400位的EphB4多克隆抗体(H-200-SantaCruz Biotechnology)。 
本发明提供了一种抑制细胞癌性生长的方法，所述方法包括将细胞与至少一种抗体或其抗原结合部分接触，其中所述抗体或其抗原结合部分结合一个表位，该表位位于EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基内，或者位于与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
优选地，至少一种抗体或其抗原结合部分结合一种多肽，该多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-400位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列。优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合一种EphB4蛋白，该蛋白具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列。优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合一种EphB4蛋白，该蛋白具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列。更优选地，所述抗体或其抗原结合部分结合一种EphB4蛋白，该蛋白具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位的氨基酸Asp(D)被被取代为Asn(N)。 
本文所用术语“抑制细胞的癌性生长”是指细胞的癌性生长基本上被降低或预防。在本发明中，将细胞与结合一种多肽的至少一种抗体或其抗原结合部分接触，以导致与未处理的细胞相比抑制细胞的癌性生长，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列。所述方法优选导致细胞死亡。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
本发明还提供了一种诱导癌细胞死亡的方法，所述方法包括将细 胞与至少一种抗体或其抗原结合部分接触，所述抗体或其抗原结合部分结合具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的多肽。在本发明的一个优选的实施方案中，至少一种抗体或其抗原结合部分结合包含于EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基内或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，至少一种抗体或其抗原结合部分结合包含于EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基内或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。更优选地，至少一种抗体或其抗原结合部分结合包含于EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基内或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位残基的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。 
短语“诱导癌细胞死亡”是指癌细胞与至少一种抗体或其抗原结合部分接触导致细胞死亡，所述抗体或其抗原结合部分结合具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ IDNO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的多肽。优选地，所述抗体是特异性靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa CruzBiotechnology)。 
癌细胞的死亡可以通过许多分析加以评估。例如认为caspase-3激活在细胞死亡期间起始细胞事件中起关键作用。量化caspase-3活性的许多不同的试剂盒是可商购的。线粒体膜去极化通常与细胞死亡的早期阶段相关。推测膜电势的改变是由于线粒体通透性转换孔(transition pore)的开放所致，这也许在编程性细胞死亡中起关键作 用。去极化可以通过许多不同的分析检测，包括使用罗丹明123，在活性线粒体中积累的绿色荧光阳离子染料，其具有高膜电势，使得可以快速及易于检测细胞的破坏。乳酸脱氢酶(LDH)是存在于所有细胞中一种稳定的细胞质酶。当细胞质膜破坏时，其快速释放入细胞培养上清中。LDH活性可以使用可商购试剂盒用分光光度平板读数器通过单点(single point)分析在培养上清中测定。培养基中LDH增加表明细胞坏死(死亡)。 
可以分析细胞的形态以评价细胞死亡情况。例如，编程性细胞死亡是程序化细胞死亡，其特征在于一系列典型的形态学事件，如细胞皱缩及片段化为膜结合的凋亡小体(17)。这些可以使用光学显微镜观测到。另外，可以检测细胞对与细胞死亡相关的基因的表达。另外，对比EphB4抗体处理的和未处理的来自4种不同乳腺癌细胞系的细胞的RT-PCR分析示出在处理的细胞中EphB4基因表达被下调。 
本发明的另一方面提供了一种治疗或预防患者癌症的方法，所述方法包括给予患者有效量的至少一种抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分结合具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的多肽。优选地，所述序列在EphB4(SEQ IDNO：1)的第226位的氨基酸残基Asp(D)被取代为Asn(N)。所述方法优选导致患者体内癌细胞死亡。 
所述癌症优选选自乳腺癌，前列腺癌，肠癌，膀胱癌，结肠癌，卵巢癌，肺癌，黑素瘤，淋巴瘤和白血病。 
通过本发明的方法治疗的患者可以选自但非限于人，绵羊，家畜，马，牛，猪，家禽，狗和猫。 
在本发明方法中，给予患者有效量的至少一种抗体或其抗原结合 部分，所述抗体或其抗原结合部分结合具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的多肽。在本发明的一个优选实施方案中，至少一种抗体或其抗原结合部分结合包含于EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基内，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。所述抗体或其抗原结合部分优选特异性结合具有包含EphB4(SEQ IDNO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的多肽。最优选地，所述抗体或其抗原结合部分是多克隆抗体或单克隆抗体。 
术语“有效量”是指足以治疗或预防要被治疗或预防的癌症的剂量。这根据患者及癌症的类型加以变化。本发明方法中应用的至少一种抗体或其抗原结合部分的有效量可以根据给予方式，治疗动物的状况加以变化，最后由主治学者，医生或兽医确定。用于治疗或预防患者的抗体或其抗原结合部分的量也根据特定抗体或其抗原结合部分的性质和特性加以变化。 
抗体或其抗原结合部分优选通过本领域技术人员已知的合适方式给予患者。优选地，抗体或其抗原结合部分可通过许多方式与细胞接触，包括例如通过静脉内给予。 
优选地，本发明的抗体或其抗原结合部分与一种合适的药物可接受的载体或稀释剂组合，形成可适于给予人或动物患者的药物组合 物。合适的载体或稀释剂包括等渗盐溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。包括至少一种抗体或其抗原结合部分的药物组合物可以针对非肠道、肌内、静脉内、皮下、眼内、口服或经皮给予而配制。抗体可以根据患者的体重以合适剂量给予。然而，应理解所述给予途径和剂量仅是作为指导，因为本领域技术人员能易于确定针对任何特定患者和癌症的最佳给予途径和剂量。 
本发明方法中应用的抗体或其抗原结合部分可以与合适的赋形剂组合，所述赋形剂如乳化剂，表面活性剂，稳定剂，染料，渗透增强剂，抗氧化剂，水，盐溶液，醇，聚乙二醇，明胶，乳糖，硬脂酸镁和硅酸。抗体或其抗原结合部分优选配制为无菌水溶液。抗体或其抗原结合部分可以与抗体活性相容的佐剂成分组合。本发明方法中应用的抗体或其抗原结合部分可以优选用于互补现有的癌症治疗方法。例如，本发明的方法也用于与传统的癌症治疗方法组合，如组合放疗，化疗(例如使用蒽环类(anthracycline)，5FU，拓扑异构酶抑制剂，顺铂(Cisplatin)和卡铂(Carboplatin))，或者激素治疗或者利用激素修饰剂(例如Catamoxifen)治疗。 
本发明的另一方面提供了一种鉴别抑制细胞癌性生长的药物的方法，所述方法包括评估该药物结合一种多肽的能力，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列。在本发明的一个优选实施方案中，所述药物结合包含于EphB4(SEQ IDNO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基内，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列内的一个表位。优选地，所 述药物结合一种EphB4蛋白，该蛋白具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列。 
在本说明书中，术语“药物(agent)”包括可结合(相互作用)EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ IDNO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的任何分子，化合物或蛋白质。合适的药物可优选包括结合一种多肽的抗体或其抗原结合部分，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列。最优选地，所述药物是一种多克隆或单克隆抗体的抗体或其抗原结合部分。所述方法优选包括评估所述药物诱导癌细胞死亡的能力。所述药物优选是EphB4配体，如优选特异于EphB4蛋白的抗体或其抗原结合部分，并可以商业研发或获得以在体外或体内系统中测试其抑制细胞癌性生长的能力。 
例如，可以测试靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的特异性表位的抗体或其抗原结合部分抑制细胞癌性生长及优选诱导细胞死亡的能力。可以绘制评估抗体的IC50的剂量应答曲线以测试每个抗体的效力。另外，可以进行抗体/受体-配体 结合研究以评估抗体预防配体结合的能力。在抗体结合后EphB4受体的酪氨酸磷酸化可以通过受体与各自的抗体的免疫沉淀而评估，随后通过用抗磷酸酪氨酸抗体进行Western分析以证实EphB4受体被失活。可以选择在最低50％抑制浓度(IC50)抑制酪氨酸磷酸化和体外细胞生长并预防配体与EphB4受体结合方面具有最佳中和活性的抗体进行另外的体内测试。 
例如，可以使用免疫缺陷的NOD-SCID(非肥胖性糖尿病的组合免疫缺陷)小鼠转移和肿瘤生长的体内模型测试推定的药物作为抗癌药物的效力，所述推定的试剂可结合具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列的多肽。优选地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO：1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。另外，可获得的许多不同的肿瘤细胞系可用于体外测试，其中大多数可以作为异种移植物生长，这些包括人乳腺癌细胞系MCF-7和结肠癌细胞系HT29。异种移植肿瘤在皮下注入(在此其以块状生长)或者在注入尾静脉后使得模拟转移的血源传播导致在其它器官中继发性沉积(secondary deposits)而可以在小鼠模型中生长。一旦确定针对每个细胞系的合适的移入时期和接种剂量，可使用该模型测试结合一种多肽的多种药物，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO：1)的第200-400位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第201-245位残基、优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-244位残基、更优选EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-230位残基的序列，或者与其有至少85％，优选至少90％相同性的序列。细胞也可以用等同于IC50和IC75的亚致死剂量的选择的EphB4抗体处理以评价与未处理的细胞相比处理的细胞的移入。这样将评价EphB4的功能性表达降低对肿瘤细胞系 的建立和转移的作用。 
也可以使用体内模型在前临床阶段评价治疗EphB4阳性肿瘤细胞系的新疗法的潜力。皮下注入的应用使得可以检测已经存在不同时期的肿瘤。这可以用于确定一种药物，如抗体或其抗原结合部分，与载体对照相比消除新发生的及完全建立的肿瘤的能力。尾静脉注入的应用可用于确定用抗体或其抗原结合部分处理是否减少由于血源传播所致的转移形成的数目。通过本发明的方法鉴别的药物可用于治疗或预防癌症。本发明还提供了通过上述方法鉴别的一种药物。 
在本说明书中，术语“包含”应理解为包括指定的元素、整体或步骤，或元素、整体或步骤组，但不排除任何其它元素、整体或步骤或元素、整体或步骤组。 
本发明通过如下非限制性附图和实施例在下文进一步描述 
实施例1：EphB4的免疫化学定位 
使用特异性靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)分析EphB4蛋白在肿瘤和正常组织中的定位。当与匹配的正常组织对比时，结肠和乳腺组织示出这个蛋白质在肿瘤上皮细胞中的水平明显增加(如图1所示)。EphB4在两种最常见的癌症中在肿瘤上皮细胞上高度表达的实证提示EphB4对这些肿瘤的进展很关键。 
实施例2：EphB4的RT-PCR表达 
使用逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)对比EphB4(1187bp)和内部18S rRNA(489bp)在5对肿瘤(T)/正常组织(N)中的表达(结果示于图2)。分析来自60个患者的63个结肠癌表明EphB4在80％的患者的肿瘤组织中过表达，提示可广泛用作治疗靶位(图2)。在肿瘤细胞和正常组织中的不同表达提示抗EphB4肿瘤治疗对结肠(及其它) 肿瘤具有优先作用。 
对比EphB4与已经在临床试验中被靶向的其它受体蛋白酪氨酸激酶(HER2，EGFR和VEGFR)的表达谱提示EphB4在正常组织中表达程度较低。来自EST数据库的信息提示EphB4在肾，卵巢和胎盘中低水平表达，在心，肺，外周神经和血管组织中极低水平表达。因此期望靶向EphB4治疗与靶向其它受体酪氨酸激酶的治疗相比产生较少的副作用。 
实施例3：EphB4特异性抗体研究 
在体外论证了特异性靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa CruzBiotechnology)的直接杀肿瘤作用。将完全铺满单层的结肠癌细胞系SW480和SW620与1/500稀释的EphB4抗体H-200(Santa CruzBiotechnology-Lot numbers B141和F182)温育导致细胞脱离培养瓶底部并死亡(图3)。这是当处理结肠癌细胞系包括SW480，SW620，LIM1215，乳腺癌细胞系MCF-7，T47-D，MDA-MB-453，MDA-MB-231和Hs578t，膀胱癌细胞系J82，RT119，5637和T24时观测到的常见应答。 
将乳腺癌细胞系MCF-7和结肠癌细胞系SW480与三种不同浓度的抗体(2μg/ml，1μg/ml和0.2μg/ml)一起保温导致剂量依赖形式的细胞死亡(见图4和图5)。这种作用在将内皮细胞系HUVEC-C暴露于EphB4抗体时未观测到。对caspase-3活性进行分析提示细胞死亡不是通过编程性细胞死亡(图6)。这些结果提示通过与膜受体交联或结合，抗体可以模拟或调节受体活性，而且这些抗体产生的跨膜信号可导致编程性细胞死亡或生长抑制(18)。诱导细胞死亡的另外可能机制包括ras介导的非编程性细胞死亡或间隙连接胞内通讯(GJIC)的恢复，GJIC是已知通过Eph受体信号化防止的直接细胞-细胞通讯途径 (19)。 
特异于EphB4的多克隆抗体已经揭示并可商购，以在体外和体内系统中测试这些抗体。图7示出在用如下述5种EphB4抗体处理后，乳腺癌细胞的存活百分率： 
(1)靶向小鼠EphB4的羧基末端氨基酸残基825-991的EphB4多克隆抗体(Swiss)； 
(2)靶向EphB4氨基酸序列N末端前19个氨基酸的多克隆N末端EphB4抗体(N-19 Santa Cruz Biotechnology)，该前19个氨基酸可能是成熟EphB4(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基16-34； 
(3)靶向相应于由EphB4(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基615-874组成的酪氨酸激酶结构域的羧基末端的多克隆EphB4C末端抗体(C-16 Santa Cruz Biotechnology)； 
(4)特异性靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)； 
(5)特异性靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200(old)-Santa CruzBiotechnology-Lot number B141 batch)。 
在用特异性靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的H-200抗体处理中观测到细胞死亡作用。细胞在有或无活性补体蛋白的培养基中的生长对比示出补体在Ab介导的细胞死亡中不起作用(见图7)。 
细胞死亡的机制可通过使用微阵列技术，在与亚致死剂量的H-200EphB4抗体保温后，通过体外癌细胞中诱导的基因表达的改变而进一步分析。 
实施例4：EphB4在人体组织中的表达 
来自EST数据库的信息和正常人体组织的Northern分析(20)提示 EphB4在肾，卵巢和胎盘中低水平表达，在心，肺，外周神经和血管组织中极低水平表达，在脑中不表达。为确定基因表达与实际翻译的蛋白质水平是否相关，使用这些组织利用特异性靶向EphB4(SEQ IDNO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)进行Western分析。通过对比单一结肠肿瘤样品，示出基因表达水平与这些组织中产生的EphB4蛋白的量不相关(图8)。在肿瘤细胞与正常组织之间不同的表达提示抗EphB4肿瘤治疗对结肠肿瘤具有优先作用。 
使用Western印迹分析获得一些杂交条带(数据未示出)。然而，特异于肿瘤样品及为所有测试的肿瘤样品所共有的这些蛋白质条带的特性仍需确定，但可以相应于剪接变化。鉴别了两种EphB4剪接变体(称为EphB4v1和EphB4v2)。EphB4基因结构的确定示出EphB4v1得自缺少由完整外显子16编码的53个氨基酸(图9)。如果EphB4v1被翻译，则所得蛋白质缺少激酶和SAM这两个结构域的一部分，这两个蛋白质结构域已知在将信号传输至胞内靶位中起作用。EphB4v2是通过框内缺失完整外显子6而产生，这导致缺少111个氨基酸。EphB4v2编码缺少第一个纤连蛋白III型重复的蛋白质。纤连蛋白III型重复的作用还未知，同时除去这些重复之一的作用也未知。 
实施例5：EphB4的RT-PCR分析 
由于EphB4在血管发生中的可能作用，因此使用RT-PCR在内皮细胞中进行EphB4表达。观测到EphB4的低水平表达。然而，当这些细胞在存在特异性靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)的情况中生长时，甚至在最高浓度的抗体情况中细胞生长或形态学也没有明显改变。也测试了EphB4抗体对NIH3T3细胞的生长和形态的作用。没有形态学或生长应答(数据未示出)。对从36岁的患有乳 腺纤维囊性病(fibrocystic breast disease)的高加索患者的乳腺组织建立的非致肿瘤性乳腺细胞系MCF10A(21)也加以了测试，观测到低水平表达EphB4，但对抗EphB4抗体无应答(数据未示出)。当与从人体正常组织的Western分析获得的结果(实施例5)一起考虑时，这些结果提示示出高水平EphB4表达的组织将受到EphB4抗体的负面影响。 
这些结果表明在用特异性靶向EphB4(SEQ ID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400的EphB4多克隆抗体(H-200-Santa CruzBiotechnology)处理后，EphB4基因被下调(图10)。这与大多数抗体在阻断配体-受体相互作用并抑制配体诱导的RTK信号化之后增加RTK下调及受体的内在化(internalisation)的发现一致。这是因为某些抗体可通过改变所靶向的肿瘤细胞内部胞内信号化模式而影响肿瘤生长。分析Ab处理的细胞与未处理的细胞中基因表达的整体改变可鉴别参与EphB4相关信号化的基因。 
实施例6：EphB4抗体-表位作图 
来自Santa Cruz的可商购的EphB4H-200多克隆Ab是对抗相应于EphB4人受体(SEQ ID NO：1)的第201-400位氨基酸的重组蛋白而产生的。该序列包括半胱氨酸富集结构域和第一个纤连蛋白III型重复，并因此期望可识别一些不同的抗原性区域。针对EphB4蛋白(SEQ ID NO：1)的特异性氨基酸残基设计6种25个氨基酸的阻断肽(重叠5个氨基酸，20个氨基酸不重叠)，如图11所示。阻断肽具有如下氨基酸序列： 
肽1 SEQ ID NO：2：TVNLTRFPETVPRELVVPVAGSCVV 
肽2 SEQ ID NO：3：GSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQW 
肽3 SEQ ID NO：4：EDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGN 
肽4 SEQ ID NO：5：AAEGNTKCRACAQGTFKPLSGEGSC 
肽5 SEQ ID NO：6：GEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCR 
肽6 SEQ ID NO：7：VCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPS 
测试肽在与EphB4多克隆抗体(H-200-Santa Cruz Biotechnology)预先保温后防止细胞死亡的能力，所述抗体特异性靶向EphB4(SEQID NO：1)的胞外结构域氨基酸残基201-400。开始时测试所有肽的混合物，使用台盼蓝排除(图12)和caspase-3活性分析(图13)确定其成功地防止细胞死亡。然后单独测试肽，观测到肽1(SEQ ID NO：2)和肽2(SEQ ID NO：3)部分拯救(见图14)。肽1和肽2重叠5个氨基酸残基(GSCVV，指定为SEQ ID NO：13)，表明这个相应于EphB4(SEQ ID NO：1)的第221-225位残基的氨基酸序列可能是反应性表位的核心。 
由于最初用肽混合物进行的实验有效地含有两倍摩尔量的GSCVV(SEQ ID NO：13)序列(即EphB4(SEQ ID NO：1)的第221-225位残基)，将另一个阻断实验(其中肽1(SEQ ID NO：2)和肽2(SEQID NO：3)均为两倍量)与起始量的肽进行对比。所有处理均通过EphB4多克隆抗体(H-200，来自Santa Cruz)而成功地防止肿瘤细胞死亡(见图15)。 
基于EphB4蛋白(SEQ ID NO.1)的特异性氨基酸残基商业性产生跨GSCVV(SEQ ID NO：13)核心表位序列的不同长度的三种新肽(肽7-9)，如图16所示。阻断肽具有如下氨基酸序列： 
肽7：SEQ ID NO：8    AGSCVVDA 
肽8：SEQ ID NO：9    VAGSCVVDAV 
肽9：SEQ ID NO：10   LVVPVAGSCVVDAVPA 
然而，由于肽8和9中疏水性氨基酸的数目较多，因此这些肽在可用于细胞的任何溶液中均不可溶，因此阻碍进一步测试。然而，肽7(SEQ ID NO.8)具有相应于EphB4(SEQ ID NO：1)的第220-227位残基的氨基酸序列，可用于阻断实验中并能从通过只加入EphB4 抗体(H-200，来自Santa Cruz)所致细胞死亡作用中拯救细胞(见图17)。 
上述所有出版物在此均以全文并入参考。 
本说明书中包括的文献，法案，材料，设备，论文等的任何讨论仅是为本发明提供上下文的联系。其不应被认为是承认这些资料的任一或全部构成了现有技术的一部分，或者在本申请每一权利要求的优先权日之前在澳大利亚或任何其它国家存在的与本发明相关领域的公知常识。 
本领域技术人员意识到在不偏离广泛描述的本发明的精神或范围的前提下，可对本发明进行多种改变和/或修改。因此现有的实施方案仅是例证了本发明而无限制之意。 
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Figure IYZ000006082878200021
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Claims (10)

1.一种抗体或其抗原结合部分在制备用于在患者中治疗或预防癌症方法中所用的药物中的应用，所述方法包括给予患者有效量的至少一种抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与位于选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5的一或多个序列中的EphB4表位结合。
2.权利要求1的应用，其中所述抗体或其抗原结合部分与位于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3序列之一或二者中的表位结合。
3.权利要求1或2的应用，其中所述抗体或其抗原结合部分与位于SEQ ID NO：8中的或者包括SEQ ID NO：8至少一部分的表位结合。
4.权利要求1-3任一项的应用，其中所述抗体或其抗原结合部分与位于SEQ ID NO：13中的或者包括SEQ ID NO：13至少一部分的表位结合。
5.权利要求1-4任一项的应用，其中SEQ ID NO：3的第6位或者SEQ ID NO：8的第7位具有的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。
6.一种鉴别抑制细胞的癌性生长的药物的方法，所述方法包括评估该药物与位于选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5的一或多个EphB4序列中的表位结合的能力。
7.权利要求6的方法，其中所述方法包括评估该药物与位于SEQID NO：2和SEQ ID NO：3序列之一或二者中的表位结合的能力。
8.权利要求6或7的方法，其中所述方法包括评估该药物与位于SEQ ID NO：8中的或者包括SEQ ID NO：8的表位结合的能力。
9.权利要求6-8任一项的方法，其中所述方法包括评估该药物与位于SEQ ID NO：13中的或者包括SEQ ID NO：13的表位结合的能力。
10.权利要求6-9任一项的方法，其中SEQ ID NO：3的第6位或者SEQ ID NO：8的第7位具有的氨基酸Asp(D)被取代为Asn(N)。
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