JP4726777B2 - 癌疾患修飾抗体 - Google Patents
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Description
癌細胞と正常細胞との有意な違いは、癌細胞が癌化した細胞に特異的な抗原を有するということを認識して、科学界は、モノクローナル抗体が、癌抗原に対して特異的に結合することによって、癌化細胞を特異的に標的とするように、設計可能であると長い間考えていた。このことが、モノクローナル抗体が癌細胞を退治するための「魔法の弾丸」として働き得るという考えを生んだ。
本発明により開示された技術に基づいて単離されたモノクローナル抗体は、患者にとって有益であるかたちで、例えば全身腫瘍組織量を減少させることにより、癌疾患の経過を改変することが示されており、本明細書では癌疾患修飾抗体(CDMAB)または「抗癌」抗体として様々に称されている。
このように、開業医が同じコホートの他の患者の腫瘍を独立して処置することを可能とする方法論が出されれば、このことはその人に合うように治療を調整する独特なアプローチを可能とするだろう。治療のそのようなコースは、理想的には、治癒率を増加させ、より良好な結果を生み出し、それによって長い間感じられてきた必要性を満たす。
固形腫瘍に対するモノクローナル抗体の臨床治験が数多くあった。1980年代では、少なくとも4種類のヒト乳癌臨床治験があったが、特定の抗原に対する抗体または組織選択性に基づく抗体を用いた、少なくとも47人の患者からたった一人の応答者が得られたのみである。シスプラチンと組み合わせたヒト化抗her2抗体による臨床試験の成功は、1998年までなかった。本治験では、37人の患者を処置し、その内約4分の1が部分的な反応を示し、もう半分が軽度または安定した疾患の進行を呈した。
米国特許第5,750,102号(特許文献1)は、患者の腫瘍から得た細胞が該患者から得た細胞または組織からクローン化されたMHC遺伝子を形質移入されるプロセスを開示している。その後、これらの形質移入細胞は、患者への予防接種に用いられる。
米国特許第4,816,581号(特許文献2)は、哺乳類の腫瘍細胞および正常細胞の細胞内構成要素(細胞外構成要素ではない)に特異的なモノクローナル抗体を得るステップと、そのモノクローナル抗体を標識するステップと、標識付けされた抗体と腫瘍細胞を殺す治療を受けた哺乳類の組織とを接触させるステップと、変性する腫瘍細胞の細胞内構成要素に対する上記標識付けされた抗体の結合を測定することで治療の効果を判定するステップとを有するプロセスを開示している。ヒト細胞内抗原に対する抗体の調製で、特許権者は悪性細胞がそのような抗原の好都合な供給源であることを認識している。
米国特許第5,171,665号(特許文献3)は、1つの新規の抗体とその生産方法とを提供する。具体的には、その特許はヒト腫瘍(例えば、大腸および肺の腫瘍)に随伴する1つのタンパク質抗原に強く結合し、正常細胞に対してはそれよりずっと少ない程度に結合する特性を持つモノクローナル抗体の形成を教示している。
米国特許第5,484,596号(特許文献4)は、外科的にヒト癌患者から腫瘍組織を除くステップと、腫瘍細胞を得るために腫瘍組織を処置するステップと、腫瘍細胞に放射線を照射し、生存可能ではあるが非腫瘍形成性にするステップと、該細胞を用いて、原発腫瘍の再発を抑制し、同時に転移を阻害するワクチンを調製するステップとを有する癌治療方法を提供する。この特許は、腫瘍細胞の表面の抗原と反応するモノクローナル抗体の開発を教示する。特許文献4の4段目45行に記載されているように、特許権者はヒト腫瘍で活発な特異的免疫治療を発現しているモノクローナル抗体の生成において、自己由来の腫瘍細胞を利用する。
米国特許第5,693,763号(特許文献5)は、ヒト癌腫に特有であり、元の上皮組織に依存しない糖タンパク質抗原を教示している。
米国特許第5,849,876号(特許文献7)は、腫瘍および非腫瘍組織から精製されたムチン抗原に対するモノクローナル抗体産生のための新規ハイブリドーマ細胞系を記載している。
米国特許第5,869,268号(特許文献8)は、所望の抗原に対して特異な抗体を産生するヒト・リンパ球を生成するための方法と、モノクローナル抗体を産生するための方法と、同様に該方法によって産生されたモノクローナル抗体とを開示している。この特許は、特に癌の診断および治療に有用な抗HDヒト・モノクローナル抗体の産生に関する。
米国特許第5,869,045号(特許文献9)は、ヒト癌腫細胞に活性の抗体、抗体フラグメント、抗体接合体、および単鎖免疫毒素に関する。分子がヒト癌腫細胞の表面上に存在する細胞膜抗原に対して反応し、さらに、上記抗体が癌腫細胞内に内在化する能力を有するという、抗体の機能が2重となるメカニズムは、結合後、特に抗体−薬物結合体および抗体−毒素結合体の形成にとって特に有用である。上記抗体は、非修飾形態では特定の濃度で細胞障害性を現す。
米国特許第5,780,033号(特許文献10)は、腫瘍の治療および予防のための自己抗体の使用を開示する。しかし、この抗体は、1つの老いた哺乳類に由来する抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は免疫系で見つかる、ある種の自然抗体であると言われる。自己抗体が「老いた哺乳類」に由来することから、処置されている患者から実際に由来する自己抗体であることを必要としない。また、この特許は老いた哺乳類由来の天然およびモノクローナル抗核自己抗体と、モノクローナル抗核自己抗体を産生する1つのハイブリドーマ細胞系とを開示する。
本願は、癌疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞系を単離するための米国特許6,180,357号に教示されたように、患者特異的抗癌抗体を産生するための方法を利用する。これらの抗体を、一つの腫瘍に対して特異的に作ることができるので、癌治療をカスタム化することが可能となる。
抗癌抗体に加えて、患者は、多様な処置療法の一部として現在推奨された治療を受けることを選択することができる。本方法論によって単離された抗体が相対的に非癌細胞に対して非障害性であるという事実から、高濃度の抗体の組み合わせが、単独または従来の治療と併用して使用されうる。高い治療指数は、短い時間の再治療を可能にし、これは耐性細胞の出現の可能性を減少させる。
この発明は、治療薬の標的としての11BD−2E11−2の使用を教示するもので、投与された場倍、哺乳類で抗原を発現している癌の全身腫瘍組織量を減らすことができ、治療をうけている哺乳類の生存を延長させることもできる。この発明はまた、CDMAB(11BD−2E11−2)およびその誘導体の使用も教示しており、その抗原を標的にすることで、哺乳類で抗原を発現している癌の全身腫瘍組織量を減らし、またこの抗原を発現している腫瘍を持つ哺乳類の生存を延ばす。
また、7BD−33−11Aおよび1A245.6は、ヒト乳癌予防生体内モデルでの腫瘍増殖を抑制し、全身腫瘍組織量を減少させた。モニタリングは処置後150日以上続いた。7BD−33−11Aは、腫瘍を決して生ずることなく、7BD−33−11A処置群の87.5パーセントが移植後6ヶ月を過ぎても生存していた。
また、7BD−33−11Aおよび1A245.6は、ヒト乳癌予防生体内モデルでの腫瘍増殖を抑制し、全身腫瘍組織量を減少させた。モニタリングは処置後150日以上続いた。7BD−33−11Aは、腫瘍を決して生ずることなく、7BD−33−11A処置群の87.5パーセントが移植後6ヶ月を過ぎても生存していた。逆に言えば、イソタイプ対照群は、72日目(処理後23日)までに致死率100%に到達した。1A245.6処置マウスは処置後151日までに致死率100%に到達し、このことはイソタイプ対照処置群よりも6倍長い。したがって、1A245.6、さらにたいていの場合7BD−33−11Aは、乳癌細胞モデルでの生存を高め、全身腫瘍組織量を減少させた。
その上、7BD−33−11Aおよび1A245.6によって、確立された生体内ヒト乳癌モデルで、腫瘍増殖の抑制および全身腫瘍組織量の減少が有意に達成された。80日目(後処理23日)までに、7BD−33−11A処置マウスではイソタイプ対照群と比較して82%低い平均腫瘍容積であった(p=0.001)。1A245.6処理もまた、この日に、より低い平均腫瘍容積、35パーセント(p=0.135)を達成した。生存を抗体有効性の基準として用いることで、7BD−33−11A処置群での致死のリスクは、処置後約60日目でイソタイプ対照群の約16パーセント(p=0.0006)であった。処置後50日までに100%のイソタイプ対照群が致死した。相対的に、1A245.6処置マウスは処置後100日まで生存し、7BD−33−11A処置群の60%が処置後130日目であっても生存していた。このデータは、対照処置群と比較した場合に、1A245.6および7BD−33−1A処置によって生存および全身腫瘍組織量の減少という利点が与えられたことを示している。体重減少および臨床苦痛等、いかなる障害性の兆候も誘導しなかったことから、7B−33−11Aおよび1A245.6処置が安全であることが明らかであった。したがって、7BD−33−11Aおよび1A245.6処置は、ヒト乳癌の十分に確立されたモデルで、対照処置群と比較して、腫瘍増殖を遅らせ、生存を高めたことから、効果的であった。
全体として、この発明は治療薬の標的として7BD−33−11Aまたは1A245.6抗原の使用を教示するもので、それが投与された場合に、哺乳類でその抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減らすことができ、また治療を受けている哺乳類の生存延長をもたらすことができる。この発明はまた、CDMAB(7BD−33−11A/1A245.6)およびその誘導体を用いて、哺乳類で抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減らし、この抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳類の生存を延ばすために、その抗原を標的化することも、教示する。さらに、この発明は癌細胞における7BD−33−11Aまたは1A245.6抗原の検出を用いることも教示するもので、その抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳類の診断、治療の予測、および予後診断に有用である。
抗体には5つの種類があり、各々がその重鎖によって与えられる機能と関連している。裸の抗体によって癌細胞を殺すことは、抗体依存型細胞障害性または補体依存型細胞障害性のいずれかによって媒介されると、一般に思われている。例えば、マウスIgMおよびIgG2a抗体は補体系のC−1成分が結合することでヒト補体型を活性化させることができ、それによって腫瘍細胞溶解をもたらすことができる補体活性という古典的な経路が活性化される。ヒト抗体のために、最も効果的に補体活性化させている抗体は、一般にIgMおよびIgG1である。IgG2aおよびIgG3イソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球、および特定のリンパ球によって細胞消滅をもたらすFcレセプターを持つ細胞傷害性細胞の補充に効果的である。IgG1およびIgG3イソタイプのヒト抗体は、ADCCを媒介する。
抗体が媒介する癌消滅のもう一つの可能な機構は、細胞膜およびそれに付随する糖タンパク質または糖脂質において種々の化学結合の加水分解を触媒する抗体(いわゆる触媒抗体)の使用である。
抗体が媒介する癌細胞消滅に関しより広く認められる2つの機構がさらに存在する。第1は、腫瘍細胞にある仮想の癌抗原に対して、身体に免疫反応を産生させるワクチンとしての抗体の使用である。第2は、増殖受容体を標的とし機能に干渉する、あるいは効果的にその機能が失われるようにその受容体を減少させる、抗体の使用である。
本発明の別の目的は、癌疾患修飾抗体とその抗原結合フラグメントとを教示することである。
本発明のさらなる目的は、細胞障害性が抗体依存型細胞障害性を通して媒介される癌疾患修飾抗体を産生することである。
本発明のさらに別の目的は、細胞障害性が補体依存型細胞障害性を通して媒介される癌疾患修飾抗体を産生することである。
本発明のさらなる目的は、細胞障害性が、細胞化学結合の加水分解を触媒する能力の1つの関数である、癌疾患修飾抗体を産生することである。
本発明のさらなる目的は、癌の診断、予後、およびモニタリングのための結合検定法に有用である癌疾患修飾抗体を産生することである。
この明細書の他の目的および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。ここで、例証および例示を目的として、本発明のいくつかの実施形態を説明する。
図1は、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する、1A245.6抗体、両抗体のイソタイプ対照抗体、抗EGFR抗体の典型的なFACSヒストグラムである。
図2は、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する、7BD−33−11A抗体、1A245.6のイソタイプ対照抗体、抗EGFR抗体、抗EGFRのイソタイプ対照抗体の典型的なFACSヒストグラムである。
図3は、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する、11BD−2E11−2抗体、両抗体のイソタイプ対照抗体、抗EGFR抗体のFACSヒストグラムである。
図4は、特定の抗体処置に関する腫瘍容積の時間経過のグラフ解析である。
図5は、時間経過に伴うMB231ヒト乳癌腫瘍容積に対する抗体効果のグラフ解析である。
図6は、 抗体療法に対して時間経過に伴う生存率を定量化するグラフ解析である。
図7は、 MCF−7乳癌モデルでの腫瘍増殖に対する11BD−2E11−2の効果を示す図である。図中、破線は抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは平均値±SEMを表す。
図8は、予防的MCF−7異種移植研究での11BD−2E11−2またはイソタイプ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後230日を超えた生存についてマウスをモニターした。
図9は、予防的OVCAR−3卵巣癌モデルの平均体重に対する11BD−2E11−2の効果を示す図である。実勢は、抗体が訪うよされた器官を示す。データ・ポイントは、平均値±標準誤差を表す。
図10は、予防的OVCAR−3研究での11BD−2E11−1またはバッファ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。マウスは、処置後約60日間生存に関してモニターされた。
図11は、予防的MB−241異種移植研究での7BD−33−11A、1A245.6、およびイソタイプ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。マウスは、処置後200日間生存に関してモニターされた。
図12は、予防的MB−231乳癌モデルでの腫瘍増殖に対する7BD−33−11Aおよび1A245.6の効果を示す図である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは、平均値±標準誤差を表す。
図13は、確立したMB−231異種移植研究での7BD−33−11A、1A2425.6、およびイソタイプ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。マウスは、処置後130日間生存に関してモニターされた。
図14は、予防的前立腺癌モデルでの腫瘍増殖に対する7BD−33−11Aおよび1A245.6の効果を示す。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは、平均値±SEMを表す。
図15は、予防的PC−3異種移植研究の継続期間に対する異なる処置を受けた群の平均体重を示すヒストグラムである。データ・ポイントは各時点での各群についての平均値±標準誤差を表す。
図16は、予防的PC−3異種移植研究での7BD−33−11A、1A2425.6、イソタイプおよび緩衝対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す。マウスは、処置後38日間生存に関してモニターされた。
図17は、確立したPC3前立腺癌モデルでの腫瘍増殖に対する7BD−33−11Aおよび1A245.6の効果を示す。破線は抗体が投与される期間を示す。データ・ポイントは、平均値±標準誤差を表す。
図18は、確立したPC−3異種移植研究の持続期間にわたる異なる処置群の平均体重を示すヒストグラムである。データは、各時点での各群の平均値±標準誤差として表されている。
図19A〜Cは、正常ヒト脳であり、Aが7BD−33−11、Bが1A245.6、およびCが陰性イソタイプ対照を示す。倍率は200倍である。
図20A〜Cは、正常ヒト心臓であり、Aが7BD−33−11A、Bが1A245.6(矢印は陽性染色を示す)、およびCが陰性イソタイプ対照を示す。倍率は200倍である。
図21A〜Cは、正常ヒト胃洞であり、Aが7BD−33−11A(矢印は胃腺上皮の陽性染色を示す)、Bが1A245.6(矢印は胃腺上皮の陽性染色を示す)、Cが陰性イソタイプ対照を示す。倍率は200倍である。
図22A〜Bは、ヒト乳癌腫瘍(浸潤性導管癌:パネルA、黒色矢印:腫瘍細胞シート、黄色矢印:腫瘍間質)およびヒト正常乳房(パネルB)に対する7BD−33−11A結合の典型的な顕微鏡写真を示す。倍率は200倍である。
図23A〜Bは、ヒト乳癌腫瘍(浸潤性導管癌:パネルA、黒色矢印:腫瘍細胞シート、黄色矢印:腫瘍間質)およびヒト正常乳房(パネルB、黒色矢印:線維芽細胞)に対する1A245.6結合の典型的な顕微鏡写真を示す。倍率は200倍である。
図24A〜Cは、腎細胞癌であり、Aは7BD−33−11A(矢印は腫瘍細胞シートでの陽性染色を示す)、Bは1A245.6(矢印は腫瘍細胞シードでの陽性染色を示す)、およびCは陰性イソタイプ対照である。倍率は200倍である。
ハイブリドーマ細胞系統7BD−33−11Aおよび1A245.6を、ブタベスト条約に従って、それぞれ受託番号PTA−4890およびPTA−4889として2003年1月8日、米国菌培養収集所(ATCC)(米国20110−2209バージニア州マナッサス大学通り10801)に寄託した。37CFR1.808にもとづいて、寄託者は、寄託材料の公開に対する有効性にかかるすべての制限が特許の付与によって即座に取り除かれることを確信する。
このことは、ハイブリドーマ細胞由来の抗体が癌細胞で細胞障害性を生じ得ることを示した。抗体結合の度合いと、ハイブリドーマによって生ずる細胞障害性とのあいだに一般的な関係もあった。この傾向にはいくつかの例外(例えば結合不足にもかかわらずMB−468癌細胞およびSKBR−3癌細胞で11BD−2E11−2によって生ずる細胞障害性の量)があった。このことは、この細胞種での細胞ELISA結合検定法によっては検出できない媒介作用を上記抗体が有すること、またはその検定法が結合を検出しないこと(細胞固定等の検定法の制約によるかもしれない)を示唆した。最後に、さらに別の可能性が存在しており、すなわち、この検定法がこの特定の状況下で細胞障害性を媒介するのに十分である結合を検出するには感度が乏しかった。他の例外は、イソタイプ対照と比較してバックグラウンドよりも結合が6倍増加したにも関わらず、MB−468細胞に対する7BD−33−11Aの細胞障害性の相対的な不足であった。このことは、結合がその同族の抗体リゲーションの結果を必ずしも予示するものではないという可能性を示した。既知の非特異的細胞障害性因子であるシクロヘキシミドは予想通りに細胞障害性を生じた。
モノクローナル抗体の産生は、ハイブリドーマ7BD−33−11A、1A245.6、およびBD−2E11−2を収集によりCL−1000フラスコ(BDバイオサイエンス(Biosciences)(オークビル(Oakville)、ON)で培養し、週に2回再播種し、プロテインGセファローズ4ファースト・フロー(アマシャム・バイオサイエンス(Amersham Biosciences)、ベイ・ド・ウルフェ(Baie d‘Urfe)、QC)による標準的抗体精製手順でおこなった。ヒト化、キメラ化、またはマウス抗体であるモノクローナル抗体を利用することは、本発明の範囲内である。7BD−33−11A、1A245.6、およびBD−2E11−2を細胞障害性検定法で、多数の陽性対照群(抗Fas(EOS9.1、IgM、カッパ、20マイクログラム/ml、イー・バイオサイエンス(eBioscience)、サンディエゴ(San Diego)、CA)、抗Her2/neu(IgG1、カッパ、10マイクログラム/ml、インター・メディコ(Inter Medico)、マークハム(Markham)、ON)、抗EGFR(C225、IgG1、カッパ、5マイクログラム/ml、シーダーレーン(Cedarlane)、ホーンビー(Hrnby)、ON)、シクロヘキシミド(100マイクロモル、シグマ(Sigma)、オークビル(Oakville)、ON)、NaN3(0.1%、シグマ(Sigma)、オークビル(Oakville)、ON))および陰性対照群107.3(抗TNP、IgG1、カッパ、20マイクログラム/ml、BD バイオサイエンス(Biosciences)、オークビル(Oakville)、ON)、G155−178(抗TNP、IgG2a、カッパ、20マイクログラム/ml、BD バイオサイエンス(Biosciences)、オークビル(Oakville)、ON)、MPC−11(抗原特異性未知、IgG2b、カッパ、20マイクログラム/ml)、J606(抗フルクトサン 、IgG3、カッパ、20マイクログラム/ml)、IgG緩衝液(2%))と比較した(表2)。
ここで、図5および図6に示したデータに関連して、週齢4ないし8週のメスSCIDマウスに対して、500万個のNDA−MB−231ヒト乳癌細胞を含む100マイクロリットルをマウスの首筋に皮下注射することで、該細胞を移植した。マウスを無作為に、10匹からなる処置群4つに分けた。移植に先立つ日に、20mg/kgの11BD2E−11−2、7BD−33−11A、1A245.6試験抗体または3BD−27イソタイプ対照抗体(MDA−MB−231細胞に結合しないことが知られている)を、2.7 mM KCI、1 mMKH2PO4、137mMNaCl、および20 mMNa2HP04を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量300マイクロリットルで腹腔内投与した。抗体を次に週に1回、同じ様式で7週間にわたって投与した。
全体で、細胞障害性抗体処置は、ヒト癌疾患のよく認識されたモデルでの対照抗体と比較して、全身腫瘍組織量を減少させるとともに生存率を高めた。このことは、他の哺乳類(ヒトを含む)での治療にとって、これらの抗体(7BD−33−11A、1A245.6、およびBD−2E11−2)の薬理学的および製薬学的利点があることを示唆している。
週齢5ないし6週のメスSCIDマウスに対して、500万個のMDA−MB−231乳癌細胞を含む100マイクロリットルをマウスの首筋に皮下注射することによって、該細胞の移植をおこなった。腫瘍増殖の測定は、カリパスを用いて毎週おこなった。移植後34日で大部分のコホートが100mm3(範囲50〜200mm3)の腫瘍容積に達したとき、8〜10匹のマウスを無作為に3つの処置群の各々に割り当てた。7BD−33−11A、1A245.6試験抗体または3BD−37イソタイプ対照抗体(MDA−MB−231細胞に結合しないことが知られている)を、2.7mM KCI、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HP04を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量150マイクロリットルで抗体(15mg/kg)とともに腹腔内投与した。抗体を次に週に3回、合計で10用量、同じ様式で移植後56日目まで投与した。腫瘍増殖の測定は、ほぼ7日目毎にカリパスを用いて、移植後59日目まで、または動物がカナダ動物飼育評議会(Canadian Council for Animal Care; CCAC)エンド・ポイントに達するまで測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、CCACガイドラインに従って安楽死させた。
全体で、ヒト癌疾患のよく認識されたモデルでの対照抗体と比較して、7BD−33−11Aおよび1A245.6抗体による処置が有意に定着腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させた。このことは、他の哺乳類(ヒトを含む)での治療にとって、これらの抗体の薬理学的および製薬学的利点があることを示唆している。
SN.10/348,284に概説されているように、また図11を参照すると、週齢4ないし8週のメスSCIDマウスに対する500万個のMB−231ヒト乳癌細胞の移植を、該ヒト乳癌細胞を含む100マイクロリットル生理食塩液をマウスの首筋に皮下注射することによって行った。マウスを無作為に、10匹からなる処置群4つに分けた。移植に先立つ日に、20mg/kgの7BD−33−11A、1A245.6試験抗体またはイソタイプ対照抗体(MB−231もしくはPC−3細胞に結合することが知られている)を、2.7mM KCI、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HP04を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量300マイクロリットルで腹腔内投与した。抗体を次に週に1回、同じ様式で7週間にわたって投与した。腫瘍増殖の測定は、ほぼ7日目毎にカリパスを用いて、最大10週間あるいは動物がカナダ動物飼育評議会(Canadian Council for Animal Care; CCAC)エンド・ポイントに達するまで測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、CCACガイドラインに従って安楽死させた。
SN.10/348,284に概説されているように、また図12および図13を参照すると、週齢5ないし6週のオスSCIDマウスに対する500万個のMB−231ヒト乳癌細胞の移植を、該ヒト乳癌細胞を含む100マイクロリットル生理食塩液をマウスの首筋に皮下注射することによって行った。腫瘍の増殖をカリバーで毎週測定した。移植後34日で大部分のコホートが100mm3(範囲50〜200mm3)の腫瘍容積に達したとき、マウスを無作為に3つの処置群の各々に割り当てた。7BD−33−11Aおよび1A245.6試験抗体またはイソタイプ対照抗体を、2.7mM KCI、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HP04を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量150マイクロリットルで抗体(15mg/kg)とともに腹腔内投与した。つぎに、抗体を週に3回合計で10用量の投薬を、移植後56日目までおこなった。腫瘍増殖を、移植後59日目まで、あるいは個々の動物がCCACエンド・ポイントに達するまで、約7日ごとにカリパスを用いて測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、CCACガイドラインに従って安楽死させた。
図14および図15を参照すると、週齢4ないし8週のオスSCIDマウスに対する100万個のPC−3ヒト乳癌細胞の移植を、該ヒト乳癌細胞を含む100マイクロリットル生理食塩液をマウスの首筋に皮下注射することによっておこなった。マウスを無作為に、それぞれ8匹からなる4つの処置群に割り当てた。移植に先立つ日に、20mg/kgの7BD−33−11Aまたは1A245.6試験抗体またはイソタイプ対照抗体もしくは緩衝対照を、2.7mM KCI、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HP04を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量300マイクロリットルで腹腔内投与した。抗体および緩衝対照を次に週に1回、同じ様式で7週間にわたって投与した。腫瘍増殖の測定は、ほぼ7日目毎にカリパスを用いて、最大10週間あるいは動物がCCACエンド・ポイントに達するまで、もしくは52日目まで、測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、CCACガイドラインに従って安楽死させた。
まとめると、ヒト前立腺癌の十分に認識されたモデルでイソタイプ対照抗体および緩衝対照と比較して、7BD−33−11Aおよび1A245.6抗体処置は、全身腫瘍組織量を減少させ、疾患の進行を遅らせ、さらに生存を延ばした。これらの結果は、乳癌を越えた治療としてこれらの抗体(7BD−33−11Aおよび1A245.6)の潜在的な薬理学的および製薬学的利点を示唆する。
週齢4ないし8週のオスSCIDマウスに対して、100万個のPC−3前立腺癌細胞を含む100マイクロリットルをマウスの首筋に皮下注射することによって、該細胞の移植をおこなった。腫瘍増殖の測定は、カリパスを用いて毎週おこなった。移植後21日目で大部分のコホートが275mm3(範囲144〜406mm3)の腫瘍容積に達したとき、9〜10匹のマウスを無作為に4つの処置群の各々に割り当てた。7BD−33−11Aまたは1A245.6またはイソタイプ対照抗体を、2.7mM KCI、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HP04を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量300マイクロリットルで20mg/kg/用量で、腹腔内投与した。つぎに、抗体を週に3回合計で10用量の投薬を、移植後43日目までおこなった。腫瘍増殖を、研究期間中または個々の動物がCCACエンド・ポイントに達するまで、約7日毎にカリパスを用いて測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、CCACガイドラインに従って安楽死させた。
無作為化の際、平均の腫瘍容積と各群の標準偏差とが同程度だった。統計学的に群間の体重差はなかった。このことは、真の無作為化が起こったことを示した。図17に示すように、抗体7BD−33−11Aは、3週間の処置期間の終わりに、イソタイプ対照と比較して、36パーセント(p=0.24)まで腫瘍増殖を有意に抑制することが可能であった。イソタイプまたは投与群と比較した場合、1A245.6は有意差を示さなかった。同様に、7BD−33−11Aまたは1A245.6は、体重(図18)に関して、イソタイプまたは緩衝対照処置群と比較して、いくらかの有意差を示した。全ての群は、本研究(p<0.001)の全体を通じて、体重損失が同程度の有意量を示した。
要約すれば、7BD−33−11Aは、SCIDマウスにおいて前立腺癌の定着腫異種移植モデルでの腫瘍増殖を抑制する点で、イソタイプ対照抗体よりも有意に優れた効果を示す。したがって、7BD−33−11Aによる処置は、ヒト癌疾患(乳房および前立腺)の2つのよく認識されたモデルで、有意に定着腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させた。このことは、ヒトを含む他の哺乳類での処置に対するこの抗体の薬理学的および製薬学的利点を示唆している。
IHC研究を実施して、ヒト体内での7BD−33−11Aおよび1A245.6抗原の分布を特徴づけた。IHC最適化研究は、さらなる実験のための条件を決定するために、前もって実施した。7BD−33−11Aおよび1A245.6モノクローナル抗体は、すでに述べたようにして、生産および精製した。
組織切片をオーブンで58℃、1時間乾燥させることで、脱パラフィン化し、コプリン・ジャーでキシレンに5回(各々4分)浸すことで脱ワックス化した。一連の段階的なエタノール洗浄(100%−75%)を通しての処置の後で、切片を水中で再水和させた。スライドを10mMのクエン酸緩衝液(pH6)(ダコ(Dako)、トロント(Toronto)、オンタリオ(Ontario))に浸し、次に各々5分間で高、中、および低パワー設定でマイクロ波処理し、最終的に冷PBSに浸した。次にスライドを3%過酸化水素水に6分間浸し、PBSで3回、各々5分間洗浄し、乾燥し、ユニバーサル(Universal)ブロッキング溶液(ダコ(Dako)、トロント(Toronto)、オンタリオ(Ontario))とともにインキュベート(5分間、室温)した。7BD−33−11A、1A245.6、モノクローナル・マウス抗ビメンチン(ダコ(Dako)、トロント(Toronto)、オンタリオ(Ontario))、またはイソタイプ対照抗体(黒色アスペルギルス(Aspergillus niger)グルコース・オキシダーゼ(哺乳類組織内には存在せず、また誘導不可の酵素)(ダコ(Dako)、トロント(Toronto)、オンタリオ(Ontario))を抗体希釈緩衝液(ダコ(Dako)、トロント(Toronto)、オンタリオ(Ontario))によって希釈して作用濃度(各抗体について5μg/ml)にし、室温で1時間、一晩インキュベートした。スライドをPBSで3回(各回5分)洗浄した。一次抗体の免疫反応性の検出/視覚化を、室温で30分間にわたり供給(ダコ・エンビジョン・システム(Dako Envison System)、トロント(Toronto)、オンタリオ(Ontario)))されるHRP結合二次抗体によっておこなった。このステップの後に、スライドをPBSで3回(各回5分)洗浄し、室温で10分間にわたる免疫ペルオキシダーゼ染色のためにDAB(3,3−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド、ダコ(Dako)、トロント(Toronto)、オンタリオ(Ontario))クロモゲン基質溶液を添加することで、呈色反応が生じた。このスライドを水道水で洗うことで、クロモゲン反応を停止させた。マイヤー・ヘマトキシリン(Meyer‘s Hematoxylin)(シグマ・ダイアグノスティックス(Sigma Diagnostics)、オークビル(Oakville)、ON)による対比染色を行った後、スライドを段階的エタノール(75〜100%)で脱水し、キシレンでクリアにした。マウンティング・メディア(ダコ・ファラマウント(Dako Faramount)、トロント(Toronto)、オンタリオ(Ontario)))を使用することで、スライドにカバースリップを置いた。アキソバート(Axiovert)200(ツアイス(Zeiss)、カナダ、トロント(Toronto)、ON)を用いて、スライドを顕微鏡的に調べ、デジタル画像を獲得し、ノーザン・エクリプス・イメージング・ソフトウエア(Northern Eclipse Imaging Software)(ミシサーガ(Mississauga)、ON)を用いて格納した。結果に対して、読み取り、記録、さらに病理学者による解釈がおこなわれた。
IHC研究を実施して、7BD−33−11Aおよび1A245.6抗原とヒト乳癌との癌関連性を決定し、いずれの抗体もヒト癌を認識する可能性があるかどうかを決定した。比較は、ビメチン(陽性対照)と、黒色アスペルギルス(Aspergillus niger)グルコース・オキシダーゼ(哺乳類組織では存在せず、また誘導不可能である酵素)(負の対照)とに対しておこなった。50人の乳癌患者に由来する乳癌組織配列と乳癌患者の非腫瘍性乳房組織に由来する10種類の試料とを用いたインジェネックス(Imgenex)、サンディエゴ(San Diego)、CA)。各患者に対して以下の情報が提供される。すなわち、年齢、性別、および診断である。実施例9からのIHCに対する手順は以下の通り。全ての抗体を作用濃度5μg/mlで使用した。
表5は、乳房癌組織配列の7BD−33−11Aおよび1A245.6の結合概要を提供する。各々の配列は50人の固体患者から得た腫瘍試料を含んだ。全体として、1A245.6に対しての98パーセント(図23A)と比較して、7BD−33−11A抗原については試験した50人の患者のうち36パーセントが陽性であった(図22A)。7BD−33−11Aについては、乳癌患者から得た10個の正常乳房組織試料のうち、陽性であったものはゼロであった(図22B).逆に言えば、10個の正常乳房組織試料のうち9個が1A245.6に対して陽性であった。しかし、染色は大部分の実例では浸潤線維芽細胞によるものであった(図23B).エストロゲンとプロゲステロン受容体状態とのあいだの相互関係は、1A245.6にとって明白なものではなかった(表6)。エストロゲンおよびプロゲステロン受容体を発現するものでもある陽性の7BD−33−1A抗原組織の数がわずかに高かった(表7)。7BD−33−1A抗原に対しては、より高い腫瘍病期によりいっそう陽性に発現するようにも見え(表7)、1A245.6に関しては組織染色の強度がより高い腫瘍病期に相関しているように見える(表6)。7BD−33−11Aおよび1A2425.6による染色は、癌細胞組織特異性があり、染色は膜上および細胞質内の両方で生じた。7BD−33−11Aおよび1A2425.6の両方に由来する染色パターンは、患者試料内で、該抗体が悪性細胞に対してかなり特異的であり、各々の抗原が細胞膜上に存在することから、それによって魅了的な薬物となりうる標的が作られる。
したがって、7BD−33−11Aおよび1A2456抗原が単に乳房癌の膜上で見つかるだけではなく、前立腺を含むかなり多様な腫瘍型の膜上でも見いだされるように見える。これらの結果は、7BD−33−11Aおよび1A245には乳房および前立腺癌に加えて広範囲の腫瘍型における治療薬としての可能性があることを示している。
図7および図8を参照すると、週齢4ないし8週のメスSCIDマウスに対する500万個のMCF−7ヒト乳癌細胞の移植を、該ヒト乳癌細胞を含む100マイクロリットル生理食塩液をマウスの首筋に皮下注射することによっておこなった。マウスを無作為に11〜13匹のマウスからなる2つの処置群に分けた。移植後の日に、20mg/kgの11BD−2E11−2試験抗体またはイソタイプ対照抗体(MCF−7またはOVCAR−3細胞に結合しないことが知られている)を、2.7mM KCI、1mMKH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HP04を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量300マイクロリットルで腹腔内投与した。次に、抗体を週に1回、同じ様式で7週間にわたって投与した。腫瘍増殖の測定は、ほぼ7日目毎にカリパスを用いて、最大8週間あるいは動物がカナダ動物飼育評議会(Canadian Council for Animal Care; CCAC)エンド・ポイントに達するまで、測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、CCACガイドラインに従って安楽死させた。
11BD−2E11−2は、対照群と比較して処置マウスの全身腫瘍組織量を有意に減少させた(図7)。処置後(51日目)、11BD−2E11−2は、イソタイプ対照抗体で処置されたマウスと比較して80パーセント(p=0.0098)まで腫瘍増殖を抑えた。また、11BD−2E11−2投与に関連した後処置生存利点(図8)も存在する。イソタイプ対照抗体処置群は、処置後197日目によって致死率100パーセントに達し、一方11BD−2E11−2処置群の40%が233日目でも生存している。まとめると、ヒト乳癌の十分に確立されたモデルで、11BD−2E11−2は生存を高め、また全身腫瘍組織量を減少させる(ブラッキー(Blakey)他。臨床癌研究(Clinical Cancer Research) 8:1974−1983 2002;クレメント(Klement)他。臨床癌研究(Clinical Cancer Research) 8: 221−232 2002;ワウンド(Waud)他。抗癌性の薬剤開発のための腫瘍モデルの関連(Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development)、フィービグ(Fiebig)およびバンガー(Bunger)編集、54:305−315 1999;カーパネン(Karpanen)他。癌研究(Cancer Research) 61: 1790−2001))。
図9および図10を参照すると、週齢4ないし8週のメスSCIDマウスに対する500万個のOVCAR−3ヒト卵巣癌細胞の移植を、該ヒト卵巣癌細胞を含む100マイクロリットル生理食塩液を腹腔内注射することによって、おこなった。マウスを無作為に10匹のマウスからなる2つの処置群に分けた。移植後の日に、20mg/kgの11BD−2E11−2試験抗体または緩衝対照抗体を、2.7mM KCI、1mMKH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HP04を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量300マイクロリットルで腹腔内投与した。次に、抗体を週に1回、同じ様式で9週間にわたって投与した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、CCACガイドラインに従って安楽死させた。
OVCAR−3卵巣癌異種移植では、体重の増加を疾患進行の代用指標として用いることができる。なぜなら、増加した全身腫瘍組織量は腹水の蓄積を反映するからである(図9)。移植後80日目(処置終了後16日)に、緩衝対照群と比較して、11BD−2E11−2投与によって12.4パーセント(p=0.015)まで体重増加を予防した。マウスを、処置後の生存についてモニターした(図10)。87日目までに、緩衝対照群は致死率90パーセントを達成したが、11BD−2E11−2処置群ではその時点で80パーセントが生存していた。11BD−2E11−2処置群は、125日目まで致死率90パーセントを達成することができなかった。要約すると、11BD−2E11−2抗体処置は、ヒト卵巣癌のよく認識されたモデルで緩衝液対処抗体と比較して、全身腫瘍組織量を減少させ、疾患進行を遅延させ、さらに生存を高めた。したがって、11BD−2E11−2による処置は、ヒト癌疾患の十分に認識された2つのモデル(乳癌および卵巣癌)で、定着腫瘍の全身腫瘍組織量を有意に減少させたことから、ヒトを含む他の哺乳類での治療に対して、薬理学的および製薬学的利点を有することが示唆される (スミス(Smith)等、前立腺(The Prostate) 48: 47−53 2001; オルソン(Olson)等、国際癌雑誌(International Journal of Cancer) 98: 923−929 2002; ギルバウンド(Guilbaud)他、臨床癌研究(Clinical Cancer Research) 7: 2573−2580 2001; ボン・グルニゲン(Von Gruenigen)他、国際婦人科癌雑誌(International Journal of Gynecologic Cancer) 9: 365−372 1999; ギチャード(Guichard)他、臨床癌研究(Clinical Cancer Research) 7: 3222−32282001 ; キシアオ(Xiao)他、タンパク質発現および精製(Protein Expression and Purification) 19: 12−21 2000)。
当業者は、本発明が目的を達成し、本質的に内在されるものと同様に、言及される結果および利点を得ることに十分適していることを、容易に認めるだろう。本明細書中に記載されるいかなるオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した化合物、方法、手順、および技術は、現在のところ好ましい実施形態を代表するものであって、例示することを目的としたものであり、本発明の範囲を制限することを意図したものではない。本発明の精神の範囲内に含まれ、添付された特許請求の範囲の範囲によって定義される変更および他の用途を、当業者は想到することができるだろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明されているが、クレームされた本発明はそのような特定の実施形態によって不必要に制限されるものであってはならない。実際、当業者にとって明らかである本発明を実行する上での記載された態様の種々の修飾は、特許請求の範囲が意図するところの範囲内である。
Claims (13)
- 受託番号PTA−5643としてATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生される、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1に記載の前記単離モノクローナル抗体をヒト化した抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 細胞障害性部分、酵素および放射性同位体からなる群から選択される1つと接合することを特徴とする請求項1または2に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1に記載の前記単離モノクローナル抗体をキメラ化した抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 受託番号PTA−5643としてATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系。
- ヒト腫瘍から選ばれた組織試料内の癌細胞の存在を判定するための結合検定法であって、
受託番号PTA−5643としてATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生される、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記ヒト腫瘍から得られた前記組織試料と接触させるステップと、
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、
からなり、それによって前記組織試料内の前記癌細胞が示されることを特徴とする検定法。 - 前記ヒト腫瘍の組織試料は、卵巣および乳房組織の群から選択される組織に由来する腫瘍から得られたものであることを特徴とする請求項6に記載の結合検定法。
- ヒト腫瘍から選択された組織試料内の癌細胞を単離またはスクリーニングする方法であって、
受託番号PTA−5643としてATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生される単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記ヒト腫瘍から得られた前記組織試料と接触させるステップと、
前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を判定するステップと、
からなり、
それにより前記結合によって前記癌細胞が単離され、前記組織試料内での前記癌細胞の存在が確認されることを特徴とする方法。 - 前記ヒト腫瘍の組織試料は、卵巣および乳房組織の群から選択される1つの組織に由来する腫瘍から得られたものであることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 請求項1または2に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを有する、癌疾患の治療のための医薬組成物。
- 前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが細胞障害性部分に接合されることを特徴とする請求項10に記載の組成物。
- 前記細胞障害性部分が放射性同位体であることを特徴とする請求項11に記載の組成物。
- 前記癌疾患の部位が、卵巣および乳房組織の群から選択されることを特徴とする請求項10−12のいずれかに記載の組成物。
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