CN101961496A

CN101961496A - 癌症疾病改善抗体

Info

Publication number: CN101961496A
Application number: CN2009102636966A
Authority: CN
Inventors: 戴维·S·F·扬; 苏珊·E·哈恩; 海伦·P·芬德利
Original assignee: Arius Research Inc
Current assignee: Arius Research Inc
Priority date: 2003-01-21
Filing date: 2004-01-21
Publication date: 2011-02-02
Also published as: US7189825B2; JP2007523834A; NZ541366A; US7186808B2; NZ565077A; EP2163564A1; JP4726777B2; CN1761683A; US20090053215A1; US20050002940A1; US20040141913A1; US20040253653A1; US20080213171A1; US20080260635A1; US20040141979A1; NZ565076A; US7009040B2

Abstract

本发明涉及使用一种全新筛选方式来制备病人癌症疾病改善抗体的方法。该工艺使用癌症细胞毒性作为指标分离抗癌抗体，使得制备用于治疗和诊断目的的抗癌抗体成为可能。抗体可用于帮助进行癌症的定级和诊断，还可用于治疗原发肿瘤和肿瘤转移。抗癌抗体可以与毒素、酶、放射性化合物和造血细胞偶联。

Description

癌症疾病改善抗体

技术领域

本发明涉及癌症疾病改善抗体(CDMAB)的分离和制备方法以及这些CDMAB在治疗和诊断过程中的应用，优选地与一种或多种化疗药剂组合应用。本发明进一步涉及使用本发明的CDMAB的结合实验方法。

背景技术

每个患有癌症的个体是独特的，正如人的身份有所不同，其所患癌症不同于其它癌症。尽管如此，当前治疗采用相同的方法治疗患有同类癌症处于同样阶段的所有病人。这些病人中至少有30％在一线治疗(firstline treatment)中失败，由此造成更多轮次的治疗，增加了治疗失败、癌症转移和最终死亡的可能性。治疗的最佳方法是针对特定个体制定专门化疗法。当前唯一的专门化的疗法是外科手术。化疗和放疗不能针对病人进行设计，而手术本身在大多数病例中不足以治愈癌症。

伴随着单克隆抗体的出现，发展方法用于专门化治疗的可能性变得更加现实，因为各抗体可以导向单个抗原决定簇。进一步地，可以生产抗体组合来导向一群抗原决定簇，这些抗原决定簇唯一地定义了特定个体的癌症。

在认识到癌细胞和正常细胞之间的显著差异在于癌细胞含有转化细胞所特有的抗原后，科学界长期认为可以设计单克隆抗体通过与这些癌抗原专一性的结合专一地作用于转化细胞；由此产生信念认为单克隆抗体可以作为“魔术子弹”去除癌细胞。

根据本发明记载的方法分离出的单克隆抗体已经显示能够以有利于病人的方式改善癌症疾病的进程，例如通过降低肿瘤负荷。为了区别，这些单克隆抗体在此被称作癌症疾病改善抗体(CDMAB)或“抗癌”抗体。

当前，癌症病人的治疗选择通常很少。统一而严格的癌症治疗方法在整体存活率和发病率方面有所改善。然而，对于特定个体，这些改善了的统计数字和他们个人情况的改善没有必然关联。

因此，如果采用方法使得操作者能够在同组病人中独立于其他病人治疗每一例癌症，该方法将允许针对每个人进行独特设计的治疗。这样的治疗过程将理想地提高治愈率，产生更好的效果，由此满足长期需要。

历史上，多克隆抗体在人癌症的治疗中取得了有限的成功。已经采用人血浆对淋巴瘤和白血病进行了治疗，但是几乎没有长期的缓解或反应。进一步地，该方法缺乏可重复性，和化疗相比没有额外的益处。已经采用人全血、黑猩猩血清、人血浆和马血清对实体瘤如乳腺癌、黑素瘤和肾细胞癌进行了治疗，相应产生了无法预测和无效的结果。

已经进行了很多用单克隆抗体治疗实体瘤的临床实验。在80年代针对人乳腺癌进行了至少4次临床实验，用针对特定抗原或基于组织选择性的抗体在至少47名病人中只产生了1名应答者。直到1998年才使用人源化抗Her 2抗体结合顺铂进行了成功的临床实验。在该试验中对37名病人的反应进行了观察，其中大约四分之一有部分应答率，另一半具有较慢或稳定的疾病进程。

研究结直肠癌的临床实验采用了针对糖蛋白和糖脂靶点两者的抗体。诸如对腺癌有一定专一性的17-1A抗体，已经进入了二期临床，在60名病人中只有1名产生了部分应答。在其它实验中，在附加使用环磷酰胺的方法中，17-1A的使用在52名病人中只产生了一个完全应答和两个微弱应答。其它使用17-1A的实验产生的效果相似。最先被批准用来成像的人源化鼠单克隆抗体的使用同样不能引起肿瘤的消退。迄今为止还没有能够有效治疗结直肠癌的抗体。同样的，对于肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌的治疗效果均不能令人满意。用抗GD3单克隆抗体治疗黑素瘤已经取得了有限的成功。因此，可以看出尽管成功的小动物实验是进行人临床试验的前提，已试验的抗体对于大部分病例还是无效的。

现有专利

美国专利号5,750,102公开了一种用MHC基因转染病人肿瘤细胞的过程，MHC基因可以从病人的细胞或组织克隆。随后用这些转染的细胞对病人进行预防接种。

美国专利号4,861,581公开的过程包括的步骤有：获取对哺乳动物肿瘤和正常细胞的一种细胞内组分而非胞外组分具有专一性的单克隆抗体；标记单克隆抗体；将标记后的抗体与接受治疗的哺乳动物组织进行接触以杀死肿瘤细胞；以及通过测定标记抗体与降解的肿瘤细胞胞内组分的结合确定疗效。在制备针对人胞内抗原的抗体时，专利权人认识到恶性细胞代表了这类抗原的便捷来源。

美国专利号5,171,665提供了一种全新抗体及生产该抗体的方法。特别地，该专利对一种单克隆抗体的形成进行了指导，该单克隆抗体可以和人肿瘤，例如结肠癌和肺癌的相关蛋白抗原发生很强地结合，但和正常细胞的结合程度小得多。

美国专利号5,484,596提供了一种癌症治疗的方法，该方法包括：从癌症患者体内手术去除肿瘤组织；处理肿瘤组织获得肿瘤细胞；照射肿瘤细胞，使其可以存活但不再是致瘤的；以及采用这些细胞为病人制备疫苗，该疫苗能够抑制原发瘤的复发并同时抑制肿瘤转移。该专利对开发与肿瘤细胞表面抗原反应的单克隆抗体进行了指导。如第4列第45行及其以后所述，专利权人用内源性肿瘤细胞开发单克隆抗体，在人肿瘤形成中形成有活性的专一免疫疗法。

美国专利号5,693,763提供了以人癌症为特征的糖蛋白抗原，且其不依赖于其来源的上皮组织。

美国专利号5,783,186提出了诱导Her2表达细胞凋亡的抗Her2抗体，生成抗体的杂交瘤细胞系，用抗体和含有所述抗体的药物组合物治疗癌症的方法。

美国专利号5,849,876描述了新的杂交瘤细胞系，该细胞系可生成从肿瘤和非肿瘤组织源中纯化出的粘蛋白抗原的单克隆抗体。

美国专利号5,869,268提出了人淋巴细胞的生成方法，该淋巴细胞产生专一针对目标抗原的抗体，生产单克隆抗体的方法以及用这种方法生产的单克隆抗体。该专利特别提到一种抗-HD人单克隆抗体的生产，该抗体可用于癌症的诊断和治疗。

美国专利号5,869,045涉及与人体癌症细胞反应的抗体、抗体片段、抗体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体的功能机理是双重的，分子与人癌表面上的细胞膜抗原反应，进一步地抗体在结合之后能够内化进癌细胞，这种机理使它们特别适于形成抗体-药物和抗体-毒素偶联物。在特定浓度下未修饰的抗体同样具有明显的细胞毒性。

美国专利号5,780,033公开了自身抗体在肿瘤治疗和预防中的应用。但是，该抗体是源自老年哺乳动物的抗细胞核自身抗体。在该例中，自身抗体据称是免疫系统中发现的一类天然抗体。因为自身抗体来自“老年哺乳动物”，因此不要求自身抗体实际上来自接受治疗的病人。此外该专利公开了老年哺乳动物中的天然和单克隆抗核自身抗体，以及生产单克隆抗核自身抗体的杂交瘤细胞系。

发明内容

本发明的发明者此前已被授予名为“个性化的病人专一性抗癌抗体”的美国专利6,180,357。该专利提出了个性化定制的用于治疗癌症疾病的抗癌抗体的选择工艺。为了本文的目的，术语“抗体”和“单克隆抗体”(mAb)交替使用来指：杂交瘤(例如鼠或人的)生成的完整的免疫球蛋白、免疫偶联物和合适的由免疫球蛋白衍生出的免疫球蛋白片段和重组蛋白，如嵌合的和人源化免疫球蛋白、F(ab’)和F(ab’)₂片段、单链抗体、重组免疫球蛋白可变区(F_V)、融合蛋白等。在本领域中人们充分认识到改变多肽链中的某些氨基酸序列对蛋白的结构和功能不会产生显著影响。在抗体的分子重排中，对骨架区域的核酸或氨基酸序列的修饰一般是可以接受的。这些修饰包括但不限于替换(优选保守替换)、缺失或增加。进一步地，将标准的化疗模式例如放射核与本发明的CDMAB偶联由此关注所述化疗的使用也在本发明的范围内。CDMAB还可以与毒素、细胞毒成份或酶例如生物素偶联酶、或造血细胞偶联。

本申请使用‘357专利中生产病人专一性抗癌抗体的方法分离杂交瘤细胞系，这些细胞系编码癌症疾病改善单克隆抗体。这些抗体可以专一性地针对一种肿瘤制备，由此使得癌症治疗的个性化成为可能。

个性化抗癌治疗的前景将给病人的管理方式带来改变。可能出现的临床情景是在肿瘤出现时获取并储存肿瘤样品。通过这个样品，可以用一组既存的癌症疾病改善抗体检测肿瘤的类型。病人将会按常规定级但是适用的抗体可以用于对病人进一步的定级。可以用存在的抗体立即对病人进行治疗，一组肿瘤专一抗体可以使用在此概述的方法生产或通过噬菌体表面展示文库结合在此记载的筛选方法生产。将生成的所有抗体加入抗癌抗体文库，因为其它肿瘤可能与正在接受治疗的肿瘤存在部分相同的抗原决定簇。根据本方法生产的抗体可用于治疗任意数量病人的癌症疾病，如果这些病人的癌症可以与这些抗体结合。

基本按照美国专利6,180,357的工艺，在用病人乳腺癌活组织切片上的细胞使小鼠免疫之后，获得小鼠单克隆抗体7BD-33-11A、1A245.6和11BD-2E11-2。在本申请的全文中，具有杀死细胞(细胞毒性)或抑制细胞生长(抑制细胞生长的)性质的抗癌抗体将被称作细胞毒性。这些抗体可用于帮助对癌症进行定级和诊断，还可用于治疗肿瘤的转移。7BD-33-11A、1A245.6和11BD-2E11-2抗原在源自不同组织的广泛的人体细胞系的细胞表面表达。乳腺癌细胞系MCF-7和前列腺癌细胞系PC-3是测试中唯独的2个易受7BD-33-11A或1A245.6的细胞毒性作用影响的癌细胞系。乳腺癌细胞系MCF-7和卵巢癌细胞系OVCAR-3是测试中唯独的2个易受11BD-2E11-2的细胞毒性作用影响的癌细胞系。

除了抗癌抗体，病人可以选择接受目前推荐的治疗方法作为多重模式治疗策略的一部分。通过本方法分离的抗体对于非癌症细胞相对无毒，这使得抗体混合物可以在高剂量下独立使用或与传统治疗结合使用。高的治疗指数还允许在短时间内进行再治疗，由此应当可以降低对治疗产生抗性的细胞出现的可能性。

通过证明其体内的抗癌活性，11BD-2E11-2对抗乳腺癌和卵巢癌细胞的体外效应得到延伸。通过将MCF-7乳腺癌细胞或OVCAR-3卵巢癌细胞移植到严重复合免疫缺陷(SCID)小鼠中建立人体癌症的体内模型，这些小鼠由于缺乏特定免疫细胞而无法抵抗人肿瘤细胞。在这类临床前异种移植肿瘤模型中测试的药物效应可作为疗效的有效预测。小鼠中的癌症异种移植物生长成实体瘤，以与天然发生癌症相同的方式形成实质、间质、中央坏死和新生血管。在SCID小鼠中已经对乳腺癌细胞系MCF-7和卵巢癌细胞系OVCAR-3进行了评估。MCF-7和OVCAR-3肿瘤的成功植入以及肿瘤对标准化疗试剂的敏感性说明它们是人体癌症药物测试的合适模型。MCF-7母细胞系及其变体以及OVCAR-3细胞系已被成功用于异种移植肿瘤模型对广泛的治疗试剂进行了评估，这些试剂已被用作临床化疗试剂。在人体乳腺癌的预防性体内模型中，11BD-2E11-2阻止肿瘤生长且降低肿瘤负荷。在治疗后连续监测280天，11BD-2E11-2治疗组中有40％在移植7.5个月后仍然存活。相反地，同型对照组在移植6.5个月后出现100％的死亡。在第51天(最后治疗后不久)，11BD-2E11-2治疗组中的肿瘤平均体积是同型对照的20％(p＝0.0098)。因此在公认的人乳腺癌模型中，11BD-2E11-2和对照治疗组相比提高了存活率并降低了肿瘤负荷。

除了在人体乳腺癌模型中的有益效果外，11BD-2E11-1还在卵巢癌模型中具有对抗OVCAR-3细胞的抗肿瘤活性。在该模型中采用体重作为肿瘤进展的替代测量手段。在肿瘤移植后的第80天(治疗结束后16天)，治疗组的小鼠的平均体重是对照组的87.6％(p＝0.015)。因此，11BD-2E11-2的治疗是有效的，因为在公认的人体卵巢癌模型中，该治疗和缓冲液对照治疗组相比延缓了癌症的进展。11BD-2E11-2在多种不同癌症模型中的抗肿瘤活性使其成为很有吸引力的抗癌治疗试剂。

本发明将11BD-2E11-2抗原用作治疗试剂的靶点，治疗试剂的给药可以降低哺乳动物体内表达该抗原的癌症的肿瘤负荷，且还能延长接受治疗的哺乳动物的寿命。本发明还利用CDMAB(11BD-2E11-2)及其衍生物通过靶向其抗原降低哺乳动物体内表达该抗原的癌症的肿瘤负荷，并且延长患有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的寿命。

通过证明体内的抗肿瘤活性，7BD-33-11A和1A245.6在细胞培养中对乳腺癌和前列腺癌细胞的细胞毒性结果得到了进一步地延伸。在人体癌症的体内模型中，MB-231乳腺癌或PC-3前列腺癌细胞被移植进严重复合免疫缺陷(SCID)小鼠后颈部的皮肤下，这些小鼠因为缺乏某些免疫细胞而无法抵抗人的肿瘤细胞。临床前异种移植肿瘤模型可作为治疗功效的有效预测。小鼠中的癌症异种移植物生长成实体瘤，以与天然发生癌症相同的方式形成间质、中央坏死和新生血管。哺乳动物肿瘤细胞系MB-231和前列腺肿瘤细胞系PC-3已被评为免疫缺陷小鼠的体内异种移植模型。MB-231和PC-3肿瘤的成功移植或“获取率”以及肿瘤对标准化疗试剂的敏感性说明它们是合适的模型。在异种移植肿瘤模型中，MB-231母细胞系及细胞系的变体以及PC-3雄性激素非依赖性细胞系已被成功地用于对广泛的治疗试剂进行评估，这些试剂已经用作临床化疗试剂。

同样地，在人乳腺癌预防性体内模型中7BD-33-11A和1A245.6阻止了肿瘤生长并降低了肿瘤负荷。对治疗后的150天进行连续监测，7BD-33-11A未发生肿瘤，7BD-33-11A治疗组中的87.5％在移植6个月后仍然存活。相反地，同型对照组在第72天(治疗后23天)100％死亡。1A245.6治疗过的小鼠在治疗后的第151天达到100％的死亡率，是同型对照治疗组的6倍多长。因此在乳腺癌模型中，1A245.6和7BD-33-11A提高了存活并降低了肿瘤负荷，7BD-33-11A作用程度更大。

此外，7BD-33-11A和1A245.6在成熟人体乳腺癌的体内模型中显著抑制肿瘤生长并降低了肿瘤负荷。在第80天(治疗后23天)，7BD-33-11A治疗后的小鼠与同型对照组相比其平均肿瘤体积减小了83％(p＝0.001)。1A245.6治疗在该天同样使肿瘤平均体积减小了35％(p＝0.135)。通过存活状况衡量抗体疗效，据估计7BD-33-11A治疗组在治疗大约60天后的死亡风险大约是同型对照组的16％(p＝0.0006)。同型对照组在治疗后50天的死亡率是100％。作为对比，1A245.6治疗后的小鼠在治疗后100天仍然存活，7BD-33-11A治疗组的60％在治疗后130天仍然存活。该数据证明了1A245.6和7BD-33-11A的治疗和对照治疗组相比具有延长存活和降低肿瘤负荷的益处。7BD-33-11A和1A245.6治疗似乎是安全的，因为治疗没有诱导毒性的任何迹象，包括体重降低和临床痛苦。因此，7BD-33-11A和1A245.6治疗是有效的，因为在公认的人乳腺癌模型中，该治疗和对照治疗组相比延缓了肿瘤的生长，提高了存活。

除了在乳腺癌体内成熟肿瘤模型中的有益效应，7BD-33-11A和1A245.6在前列腺癌的预防性体内模型中具有针对PC-3细胞的抗肿瘤活性。在该前列腺异种移植的模型中，在肿瘤移植前1天对小鼠分别注射7BD-33-11A和1A245.6，随后每周注射共7周。紧随治疗期后，7BD-33-1A和1A245.6治疗比同型对照抗体显著地更加有效地抑制肿瘤生长(p＝0.001和0.017)。在治疗期结束时，接受7BD-33-11A或1A245.6的小鼠的肿瘤生长分别只有同型对照组的31％和50％。

对于PC-3SCID异种移植模型，可使用体重作为疾病进展的替代指示。在第52天，7BD-33-11A和1A245.6和同型对照相比分别以54％和25％显著抑制了体重的减轻(p＝0.002和0.004)。对治疗后的小鼠存活进行了监控。在治疗后第11天，同型和缓冲液对照小鼠达到了100％的死亡率。相反地，7BD-33-11A和1A245.6在治疗后第38天达到100％死亡率，是对照组的3倍长。因此，7BD-33-11A和1A245.6治疗是有效的，因为和同型对照治疗组相比，在公认的人前列腺癌模型中，两个治疗均延缓了肿瘤的生长、防止了体重降低且延长了存活。

除了前列腺癌的预防性体内肿瘤模型，在体内成熟肿瘤模型中7BD-33-11A证实了其对PC-3细胞的抗肿瘤活性。在该异种移植模型中，将PC-3前列腺癌细胞皮下植入SCID小鼠，在抗体治疗之前肿瘤达到一定的尺寸。再一次将7BD-33-11A治疗和同型对照进行比较。紧随治疗后，7BD-33-11A治疗组和同型对照治疗组相比肿瘤平均体积显著减小(P＜0.024)。7BD-33-11A治疗与同型对照组相比的肿瘤抑制为36％。7BD-33-11A在数个不同的癌症模型中的抗肿瘤活性使其成为一种具有吸引力的抗肿瘤治疗试剂。

对7BD-33-11A和1A245.6与正常人体组织的结合已被确定。通过IHC染色，大部分组织不能表达7BD-33-11A抗原，包括重要器官，如肾脏、心脏和肺。7BD-33-11A在唾液腺、肝脏、胰腺、胃、前列腺和十二指肠发生了染色，扁桃腺的染色很强。组织染色结果意味着7BD-33-11A对多种细胞类型的结合是受到限制的，但与浸润性巨噬细胞、淋巴细胞和纤维原细胞发生结合。对于1A245.6，更广泛的组织被阳性染色。在大部分情况下，染色限于上皮细胞或浸润性巨噬细胞、淋巴细胞和纤维原细胞。但是，在心肌和肝细胞上均观察到了阳性染色。7BD-33-11A和1A245.6呈现出细胞膜和细胞质染色模式。

7BD-33-11A和1A245.6抗原的定位以及它们在乳腺癌病人体内的普遍存在对于评估免疫治疗的益处非常重要。为了研究抗原在癌症病人的乳腺肿瘤中的表达，在取自50个独立的乳腺癌患者的肿瘤组织样品中对7BD-33-11A或1A245.6抗原的表达进行了筛选。研究结果显示36％的组织样品呈现7BD-33-11A抗原阳性染色。患者样品中7BD-33-11A的表达对于癌细胞呈现专一性，因为染色局限于恶性细胞。此外，7BD-33-11A对于取自乳腺癌患者正常组织的10个样品没有发生染色。另一方面，1A245.6对于乳腺癌组织样品发生了98％的染色。1A245.6还对取自乳腺癌患者正常组织的10个样品中的8个发生了染色。然而，这些染色通常比在乳腺癌组织样品中观察到的染色要弱很多且通常仅限于浸润性纤维原细胞。根据乳腺肿瘤中雌激素和孕酮的受体表达，对7BD-33-11A和1A245.6的表达进行进一步的评估，这些受体在乳腺肿瘤的发展、治疗和预后中发挥重要作用。在1A245.6抗原的表达和雌激素或孕酮受体的表达之间没有明显关联。在雌激素或孕酮受体表达和7BD-33-11A的表达之间有微弱关联：表达受体的组织中7BD-33-11A的表达略高。在对肿瘤基于肿瘤阶段或癌症发展程度进行分析时，分析结果暗示在更高的肿瘤阶段7BD-33-11A阳性表达量更大以及在更高肿瘤阶段1A245.6的染色更强的趋势。但是，结果受到小的样本量的限制。

为了进一步扩展7BD-33-11A和1A245.6潜在的治疗益处，测定了抗原在各种人体癌组织中的出现频率和定位。除了乳腺癌以外的一些癌症类型也表达7BD-33-11A抗原。阳性的人体癌症类型包括皮肤(1/2)、肺(3/4)、肝脏(2/3)、胃(4/5)、甲状腺(2/2)、前列腺(1/1)、子宫(4/4)和肾脏(3/3)。一些癌症不表达抗原；这些癌症包括卵巢(0/3)、睾丸(0/1)、大脑(0/2)和淋巴结(0/2)。对于1A245.6，如正常人体组织芯片一样，在各种人体组织类型的多种癌症中发生了阳性染色。在皮肤、肺、肝脏、子宫、肾脏、胃和膀胱的恶性细胞中观察到更强的染色。如同人体乳腺癌组织一样，7BD-33-11A和1A245.6的定位发生在这些肿瘤细胞的细胞膜上和细胞质内。因此，7BD-33-11A和1A245.6抗体除了在体外与癌细胞系结合，亦有证据证明抗原在人体及多种癌症类型中表达。

总之，这些数据证明7BD-33-11A和1A245.6抗原均是癌症相关抗原，均在人体内表达，且均是病理相关癌症靶点。此外，这些数据还证实7BD-33-11A和1A245.6抗体与人癌症组织的结合，这种结合可以适用于诊断、治疗的预测或预后实验。此外，抗原在细胞膜的定位使得该抗原可被利用，相应的抗原基因或衍生物、抗原蛋白或其变体也可用于诊断、治疗的预测或预后实验。

总而言之，本发明指出将7BD-33-11A或1A245.6抗原用作治疗试剂的靶点，这些试剂通过给药可以降低哺乳动物体内表达抗原的癌症的肿瘤负荷并且可以使被治疗的哺乳动物寿命延长。本发明还指出用CDMAB(7BD-33-11A/1A245.6)及其衍生物靶向抗原以降低哺乳动物体内表达抗原的癌症的肿瘤负荷并且延长患有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的寿命。此外，本发明还指出对于癌症细胞中7BD-33-11A或1A245.6抗原检测可用于对患有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物进行诊断、治疗的预测和预后。

如果病人的治疗起始阶段或转移发展难以控制，可以重复生成肿瘤专一性抗体的过程以进行再治疗。此外，抗癌抗体可以与患者的血红细胞偶联并重新注射入患者体内用于转移的治疗。对于转移型癌症几乎还没有有效的疗法且转移通常意味着很不理想的治疗效果并导致死亡。但是，转移型癌症通常高度血管化，通过血红细胞传递抗癌抗体可以在肿瘤位点聚集抗体。甚至在转移前，很多癌症细胞的存活依赖于宿主血液的供应，与血红细胞偶联的抗癌抗体也可以有效对抗原发肿瘤。可选择地，抗体也可以和其它造血细胞偶联，例如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、天然杀伤细胞等。

抗体分为五类，每一类抗体均由重链赋予其相关功能。通常认为裸抗体杀死癌细胞是由抗体依赖的细胞毒性或补体依赖的细胞毒性介导的。例如鼠的IgM和IgG2a可以通过与补体系统C-1组分的结合激活人体的补体，由此激活经典的补体激活通路并引起肿瘤的退化。对于人抗体而言，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgG1。鼠的IgG2a和IgG3同型抗体可以有效地募集具有Fc受体的细胞毒细胞，这些受体将导致细胞被单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞杀死。人的IgG1和IgG3同型抗体介导ADCC。

通过抗体介导杀死癌症的另一种可能的机制可能是通过使用能够催化细胞膜以及其相关糖蛋白或糖脂内多种化学键的水解的抗体，因此这些抗体被称作催化抗体。

抗体介导杀死癌细胞的另外两种机制被更为广泛地接受。第一种机制是使用抗体作为疫苗，诱导身体针对肿瘤细胞上的推定癌症抗原产生免疫反应。第二种机制是使用抗体靶向生长受体并干扰受体功能或下调受体的表达由此有效地造成受体功能丧失。

对于癌症药物的临床使用基于药物在对病人形成可接受的风险特征下所产生的益处。通常在癌症治疗中最主要追求的益处是存活，但是除了延长生命，还有其它一些公认的益处。在治疗不会对存活产生不利影响的情况下，这些益处包括减轻症状、防止有害事件、延长复发时间或无病存活时间以及延长疾病升级的时间。这些标准得到普遍地接受并且诸如美国食品药品管理局(F.D.A.)的管理机构批准通过能够产生这些益处的药品(Hirschfeld等，Critical Reviews inOncology/Hematolgy 42：137-1432002)。除了这些标准，人们充分认识到存在其它一些指针可以预示这些类型的受益。部分地，美国F.D.A.通过的加速批准程序承认存在可能预测病人受益的替代标准。在2003年年底，通过该程序已经批准了16种药物，其中4种已经得到完全批准，即随后的研究证实了替代指针所预测的直接的病人受益。确定药物在实体瘤中的效应的一个重要指针是通过测定治疗应答评估肿瘤负荷(Therasse等，Journal of the National Cancer Institute 92(3)：205-2162000)。该评估的临床标准(RECIST标准)已经在实体瘤工作组的反应评估标准中加以公布，该工作组由癌症方面的国际专家组成。与恰当的对照组比较，根据RECIST标准的客观应答显示，对于肿瘤负荷的效应得到证实的药物最终很可能对病人产生直接的益处。临床前的肿瘤负荷通常可以进行更加直接的评估和记录。由于临床前研究可以转化成临床条件，在临床前模型中延长存活的药物最有可能参与到临床的应用中。类比于临床治疗中产生正面效应，在临床前实验中能够降低肿瘤负荷的药物也可对疾病产生显著直接的影响。尽管延长存活是癌症药物治疗中最主要追求的临床结果，但仍有具有临床用途的其它益处，很明显地，肿瘤负荷的降低也可以产生直接的益处并具有临床影响(Eckhardt等，Developmental Therapeutics：Successes and Failuresof Clinical Trial Designs of Targeted Compounds；ASCO Educational Book，39th Annual Meeting，2003，209-219页)。

因此，本发明的目的是：利用通过从特定个体衍生出的细胞中制备癌症疾病改善抗体的方法，来分离杂交瘤细胞系以及相应的由所述杂交瘤细胞系编码的分离出的单克隆抗体和其抗原结合片段，该疾病改善抗体对癌症细胞有细胞毒性而同时对非癌症细胞相对无毒。

本发明的另一个目的是对癌症疾病改善抗体及其抗原结合片段进行指导。

本发明进一步的目的是生产癌症疾病改善抗体，该抗体的细胞毒性通过抗体依赖细胞毒性介导。

本发明的另一目的是生产癌症疾病改善抗体，该抗体的细胞毒性通过补体依赖细胞毒性介导。

本发明的进一步目的是生产癌症疾病改善抗体，该抗体的细胞毒性作为其催化细胞化学键水解能力的一种功能。

本发明的进一步的目的是生产癌症疾病改善抗体用于癌症诊断、预后和监测的结合实验。

本发明的其它目的和优势通过以下说明将是显而易见的，该说明通过本发明的图解和例证、特定具体实施方案进行。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一张彩色附图。通过申请并支付必要费用，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的复印本。

图1包含1A245.6抗体、两种抗体的同型对照抗体、抗EGFR抗体对数种癌细胞系和非癌细胞系的代表性FACS直方图。

图2包含7BD-33-11A抗体、1A245.6同型对照抗体、抗EGFR抗体、抗EGFR同型对照抗体对数种癌细胞系和非癌细胞系的代表性FACS直方图。

图3包含11BD-2E11-2抗体、两种抗体的同型对照抗体、抗EGFR抗体对数种癌细胞系和非癌细胞系的代表性FACS直方图。

图4是关于特定抗体治疗的肿瘤体积相对于时间的图表分析。

图5是对MB231人乳腺癌肿瘤体积的抗体效应相对于时间的图表分析。

图6是量化抗体治疗相对于时间的存活百分比的图表分析。

图7.在预防性MCF-7乳腺癌模型中11BD-2E11-2对肿瘤生长的影响，虚线标明抗体给药时期。数据点代表平均+/-SEM。

图8.在预防性MCF-7异种移植研究中经过11BD-2E11-2或同型对照抗体治疗后的患肿瘤小鼠的存活。监测小鼠存活直至治疗后的230多天。

图9.在预防性OVCAR-3卵巢癌模型中11BD-2E11-2对平均体重的影响。实线标明抗体给药时期。数据点代表平均+/-SEM。

图10.在预防性OVCAR-3研究中经过11BD-2E11-2或缓冲液对照抗体治疗的患肿瘤小鼠的存活。检测小鼠存活直至治疗后大约60天。

图11.在预防性MB-231异种移植研究中经过7BD-33-11A、1A245.6或同型对照抗体治疗后的患肿瘤小鼠的存活。监测小鼠存活直至治疗后的200多天。

图12.在预防性MB-231乳腺癌模型中7BD-33-11A和1A245.6对肿瘤生长的影响。虚线标明抗体给药时期。数据点代表平均+/-SEM。

图13.在成熟的MB-231异种移植研究中经过7BD-33-11A、1A245.6或同型对照抗体治疗后的患肿瘤小鼠的存活。监测小鼠存活直至治疗后的130多天。

图14.在预防性PC-3前列腺癌模型中7BD-33-11A和1A245.6对肿瘤生长的影响。虚线标明抗体给药时期。数据点代表平均+/-SEM。

图15.在预防性PC-3异种移植研究期间不同治疗组的平均体重的直方图。数据由各时间点每组的平均+/-SEM表示。

图16.在预防性PC-3异种移植研究中经过7BD-33-11A、1A245.6、同型或缓冲液对照抗体治疗后的患肿瘤小鼠的存活。监测小鼠存活直至治疗后的38天。

图17.在成熟的PC-3前列腺癌模型中7BD-33-11A和1A245.6对肿瘤生长的影响。虚线标明抗体给药时期。数据点代表平均+/-SEM。

图18.在成熟的PC-3异种移植研究期间不同治疗组的平均体重的直方图。数据由各时间点每组的平均+/-SEM表示。

图19A-C.正常人大脑A.7BD-33-11A。B.1A245.6。C.阴性同型对照。放大倍率为200X。

图20A-C.正常人心脏A.7BD-33-11A。B.1A245.6(箭头表明阳性染色)。C.阴性同型对照。放大倍率为200X。

图21A-C.正常人胃上皮A.7BD-33-11A(箭头表明胃腺上皮的阳性染色)。B.1A245.6(箭头表明胃腺上皮的阳性染色)。C.阴性同型对照。放大倍率为200X。

图22A-B.7BD-33-11A和人乳腺癌肿瘤(浸润型导管癌；图A；黑箭头：肿瘤细胞片层，黄箭头：肿瘤间质)和人正常乳腺结合(图B)的代表性显微图。放大倍率为200X。

图23A-B.1A245.6和人乳腺癌肿瘤(浸润型导管癌；图A；黑箭头：肿瘤细胞片层，黄箭头：肿瘤间质)和人正常乳腺结合(图B；黑箭头：纤维原细胞)的代表性显微图。放大倍率为200X。

图24A-C.肾细胞癌。A.7BD-33-11A(箭头标明肿瘤细胞片层中的阳性染色)。B.1A245.6(箭头标明肿瘤细胞片层中的阳性染色)。C.阴性同型对照。放大倍率为200X。

实施例1

杂交瘤的生成——杂交瘤细胞系7BD-33-11A、1A245.6、11BD-2E11-2杂交瘤：

根据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系7BD-33-11A和1A245.6在2003年1月8日保藏于美国典型菌种保藏中心(American Type CultureCollection)，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，其保藏号分别为PTA-4890和PTA-4889。根据37CFR1.808，保藏者保证在专利授权后将永久取消被保藏材料在公众使用方面的所有限制。

根据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系11BD-2E11-2在2003年11月11日保藏于美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection)，10801 Universifty Blvd.，Manassas，VA20110-2209，其保藏号为PTA-5643。根据CFR1.808，保藏者保证在专利授权后将永久取消被保藏材料在公众使用方面的所有限制。

为了生成产生抗癌抗体7BD-33-11A的杂交瘤，在冷PBS中制备抗原的单细胞悬浮液，即人乳腺癌细胞。通过向8-9周大的BALB/c小鼠皮下注射和腹膜内注射100微升的抗原-佐剂使小鼠免疫，佐剂使用Freund’s完全佐剂，每一剂中含有0.2-2.5百万个细胞。在初次免疫的3周后以相同方式使用新鲜制备的含有0.2-2.5百万个细胞的抗原-佐剂激活免疫后的小鼠，在前一次激活的两周后再次激活。在最后一次免疫至少两天后使用脾进行融合。通过融合分离出的脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞制备杂交瘤。融合物的上清液进行杂交瘤亚克隆检测。

为了生成产生抗癌抗体1A245.6的杂交瘤，在冷PBS中制备抗原的单细胞悬浮液，即人乳腺癌细胞。通过向8-9周大的BALB/c小鼠皮下注射和腹膜内注射100微升的抗原-佐剂使小鼠免疫，佐剂使用Freund’s完全佐剂，每一剂中含有2.5百万个细胞。在初次免疫3周后以相同方式使用新鲜制备的含有2.5百万个细胞的抗原-佐剂激活免疫后的小鼠，在上一次激活的两周、五周和三周后分别再次激活。在最后一次免疫至少三天后使用脾进行融合。通过融合分离出的脾细胞和NSO-1骨髓瘤细胞制备杂交瘤。融合物的上清液进行杂交瘤亚克隆检测。

为了生成产生抗癌抗体11BD-2E11-2的杂交瘤，在冷PBS中制备抗原的单细胞悬浮液，即人乳腺癌细胞。通过向8-9周大的BALB/c小鼠皮下注射和腹膜内注射100微升的抗原-佐剂使小鼠免疫，佐剂使用Freund’s完全佐剂，每一剂中含有0.2-2.5百万个细胞。在初次免疫的2-3周后以相同方式使用新鲜制备的含有0.2-2.5百万个细胞的抗原-佐剂激活免疫后的小鼠，在前一次激活的两周后再次激活。在最后一次免疫至少两天后使用脾进行融合。通过融合分离出的脾细胞和NSO-1骨髓瘤细胞制备杂交瘤。融合物的上清液进行杂交瘤亚克隆检测。

为了确定通过杂交瘤细胞分泌出的抗体是否是IgG或IgM同型抗体，进行了ELISA实验。将含有浓度为2.4mg/ml的羊抗鼠IgG+IgM(H+L)的包被缓冲液(0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.2-9.6)在4℃按100μl/孔加入ELISA板中过夜。用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween)将ELISA板洗3次。将封闭缓冲液(含有5％牛奶的洗涤缓冲液)按100μl/孔于室温加入板中1小时并随后用洗涤缓冲液洗涤三次。加入100μl/孔的杂交瘤细胞上清并将板在室温培养1小时。用洗涤缓冲液洗涤板3次后，按100μl/孔加入羊抗鼠IgG或IgM山葵过氧化物结合酶的1/5000稀释液(稀释于含有1％牛血清蛋白的PBS)。将板在室温培养1小时后，用洗涤缓冲液将盘洗涤3次。100μl/孔的TMB溶液在室温放置1-3分钟。通过加入100μl/孔的2M H₂SO₄中止显色反应并用Perkin-Elmer HTS7000平板读取器读取该板在450nm的吸收值。如表1中所示7BD-33-11A、1A245.6、11BD-2E11-2杂交瘤分泌的基本为IgG同型抗体。

在进行1-4轮限制性稀释后，在细胞ELISA实验中检测杂交瘤上清液中与目标细胞结合时抗体。测试使用3种乳腺癌细胞系：MDA-MB-231(亦称作MB-231)、MDA-MB-468(亦称作MB-468)和SKBR-3。在使用前先将板中细胞固定。用含有MgCl₂和CaCl₂的PBS在室温将板洗涤3次。将100μl含有2％多聚甲醛的PBS加入每孔中在室温放置10分钟后弃去。再次用含有MgCl₂和CaCl₂的PBS在室温将板洗涤3次。用100μl/孔含有5％牛奶的洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween)在室温进行1小时的封闭。用洗涤缓冲液将板洗涤3次并在室温将杂交瘤细胞上清以100μl/孔加入板中1小时。用洗涤缓冲液将板洗涤3次后按100μl/孔加入与山葵过氧化物酶偶联羊抗鼠IgG或IgM抗体的1/5000稀释液(稀释于含有1％牛血清蛋白的PBS)。在室温放置1小时后用洗涤缓冲液将盘洗涤3次并于室温加入100μl/孔的TMB放置1-3分钟。通过加入100μl/孔的2M H₂SO₄中止显色反应并用Perkin-Elmer HTS7000平板读取器读取板在450nm的吸收值。在表1中，实验结果用减去背景值后与IgG同型对照(3BD-27)相比的倍数值表示。来自7BD-33-11A和1A245.6杂交瘤细胞系的抗体与所有3种乳腺细胞系均发生很强的结合，其结合至少是背景的6倍。两种抗体与MDA-MB-231细胞系结合最强。来自11BD-2E11-2杂交瘤细胞系的抗体同样与MDA-MB-231细胞系的结合最强，但是和背景相比没有显示出与其它2种细胞系更强的结合。这些结果暗示该抗体识别的抗原决定簇在MDA-MB-468或SKBR-3细胞上没有出现，且该抗原决定簇与7BD-33-11A和1245.6识别的抗原决定簇不同。

与抗体结合测试相关联，用同样的乳腺癌细胞系对杂交瘤上清液的细胞毒性进行了测试：MDA-MB-231、MDA-MB-468和SKBR-3。活/死细胞毒性实验据自Molecular Probes(Eu，OR)。根据厂商说明书及以下变化进行实验。在试验前以事先确定的合适的细胞密度将细胞分板。2天后，将杂交瘤微量滴定板中的100μl上清液转移至细胞培养板中并在5％CO₂培养箱中培养5天。将作为阳性对照的孔吸空后加入100μl的叠氮化钠或环己酰亚胺。因为已知3BD-27单克隆抗体不会和待测的3种乳腺癌细胞系结合，因此同样加入该抗体作为同型对照。抗EGFR抗体(C225)用于实验作为参照。在处理5天后，通过倾倒和吸干将板清空。用多通道洗瓶将含有MgCl₂和CaCl₂的室温DPBS分配至各孔中，轻敲3次，通过倾倒和吸干将盘清空。在各孔中加入50μl稀释于含有MgCl₂和CaCl₂的DPBS中荧光活/死染料，并于37℃在5％CO₂培养箱中培养30分钟。在Perkin-Elmer HTS7000荧光平板读取器中读板，数据用Microsoft Excel进行分析。结果制成表1。

实验中观察到3种抗体不同的细胞毒性。11BD-2E11-2对SKBR-3细胞具有最高的细胞毒性，杀死了39-97％的细胞。1A245.6和7BD-33-11A对MDA-MB-231细胞有相似的细胞毒性，但是1A245.6对MDA-MB-468细胞同样有细胞毒性，而7BD-33-11A没有。

这些结果意味着杂交瘤细胞衍生出的抗体能够在癌症细胞中产生细胞毒性。在抗体结合程度和杂交瘤上清液产生的细胞毒性之间还普遍存在着关联。这种趋势存在一些例外，例如11BD-2E11-2在MB-468癌细胞中及在SKBR-3癌症中产生的细胞毒性程度，虽然只有极小量的结合。这些结果暗示抗体在这类细胞中产生介导的作用在细胞ELISA结合实验中观察不到，或者由于实验的局限诸如细胞固定，实验没有检测到结合。最后，还存在另一种可能，即实验对于结合的检测不够敏感，而这些结合在特定情形下足以介导细胞毒性。另一个例外是7BD-33-11A对MB-468细胞相对极小的细胞毒性，尽管该抗体减去背景值后的结合与同型对照相比增加了6倍。该结果指出可能性：结合未必能够预测抗体与其同类抗原连接的结果。已知的非特异性细胞毒性试剂环己酰亚胺和预期一样产生细胞毒性。

实施例2

抗体制备

在CL-1000烧瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)中培养杂交瘤7BD-33-11A、1A245.6、11BD-2E11-2，每周进行两次收集和再接种，用Protein G Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences，Baie d′Urfé，QC)的标准抗体纯化步骤制备单克隆抗体。使用人源化的、嵌合的或鼠的单克隆抗体在本发明的范围内。在细胞毒性实验中将7BD-33-11A、1A245.6、11BD-2E11-2与一些阳性对照(抗Fas(EOS9.1，IgM，kappa，20μg/ml，eBioscience，San Diego，CA)、抗Her2/neu(IgG1，kappa，10μg/ml，Inter Medico，Markham，ON)、抗EGFR(C225，IgG1，kappa，5μg/ml，Cedarlane，Hobby，ON)、环己酰亚胺(100微摩尔，Sigma，Oakville，ON)、NaN₃(0.1％，Sigma，Oakville，ON))和阴性对照(107.3(抗TNP，IgG1，kappa，20μg/ml，BD Biosciences，Oakville，ON)、G155-178(抗TNP，IgG2a，kappa，20μg/ml，BD Biosciences，Oakville，ON)、MPC-11(抗原特异性未知，IgG2b，kappa，20μg/ml)、J606(抗聚左旋糖，IgG3，kappa，20μg/ml)、IgG缓冲液(2％))对照组进行了比较(表2)。

对乳腺癌(MB-231、MB-468、MCF-7)、结肠癌(HT-29、SW1116、SW620)、肺癌(NCI H460)、卵巢癌(OVCAR)、前列腺癌(PC-3)和非癌(CCD27sk、Hs888Lu)细胞系进行了测试(所有细胞系均来自ATCC，Manassas，VA)。活/死细胞毒性实验据自Molecular Probes(Eugene，OR)。实验根据厂商的说明书和如下改动进行。在实验前以事先确定的合适的细胞密度将细胞分板。2天后，将100μl纯化的抗体稀释在培养基中并随后转移至细胞培养板中并在8％CO₂培养箱中培养5天。通过倾倒和吸干将板清空。用多通道洗瓶将含有MgCl₂和CaCl₂的室温DPBS分配至各孔中，轻敲3次，通过倾倒和吸干将板清空。在各孔中加入50μl稀释于含有MgCl₂和CaCl₂的DPBS中荧光活/死染料并于37℃在5％CO₂培养箱中培养30分钟。在Perkin-ElmerHTS7000荧光平板读取器中读取板的读数，数据用Microsoft Excel进行分析并将结果制成表2。数据代表了4个实验3次重复的平均值并用以下方式定性表示：4/4实验结果均大于极限细胞毒性(+++)，3/4实验大于极限细胞毒性(++)，2/4实验大于极限细胞毒性(+)。表2中未标记的细胞表示不一致的或小于极限细胞毒性的反应。7BD-33-11A和1A245.6抗体证实了在乳腺和前列腺肿瘤细胞系中的选择性细胞毒性，而对未转化的正常细胞没有影响。两个抗体呈现出比阳性对照抗Fas抗体大于25-50％的杀伤力。11BD-2E11-2对乳腺和卵巢癌细胞具有专一性细胞毒性且不影响正常细胞。细胞毒性化学试剂诱导了预期的细胞毒性，而考虑到生物细胞实验的局限性，使用的其它几个抗体同样实现了预期的效应。总而言之，实验显示3种抗体对数个癌细胞型均有细胞毒活性。抗体的活性具有选择性因为并不是所有的癌细胞类型都容易受到影响。此外，抗体证明了功能专一性因为它们对非癌细胞型不产生细胞毒性，这在治疗条件下是非常重要的因素。

制备用于FACS的细胞时，首先用DPBS(不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺)洗涤单层细胞。随后在37℃使用细胞消化液(Invitrogen)将细胞从细胞培养板上解离。在经过离心和收集后，用含有MgCl₂、CaCl₂和25％胎牛血清的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(洗涤培养基)在4℃将细胞重悬并计数、分至合适的细胞密度、离心沉淀细胞并以20μg/ml将细胞重悬于含有7BD-33-11A、1A245.6、11BD-2E11-2或对照抗体(同型对照或抗EGFR)的染色培养基中(含有MgCl₂和CaCl₂的DPBS)，在冰上放置30分钟。在加入Alexa Fluor 488一偶联二级抗体之前，用洗涤培养基洗涤细胞一次。随后将染色培养基中的Alexa Fluor 488-偶联抗体加入20分钟。最后一次洗涤细胞并将其重悬于含有1μg/ml的碘化丙啶的染色培养基中。使用CellQuest软件(BD Biosciences)在FACScan上运行样品进行细胞的流式细胞计数。通过调节FSC和SSC检测仪的电压和振幅增益设置细胞的前散射光(FSC)和侧散射光(SSC)。运行用纯的同型对照抗体及随后用Alexa Fluor 488-偶联二级抗体染色的细胞对3个荧光通道(FL1、FL2和FL3)的检测仪进行校准使得细胞具有均一的峰且荧光强度的中值大约为1-5个单位。通过FSC选通和碘化丙啶排除获得活细胞。对于每个样品，大约获得10,000个活细胞用于分析，分析结果在表3中呈现。表3中列出了超过同型对照的平均荧光强度增加倍数且定性地表示如下：小于5(-)；5到50(+)；50到100(++)；100以上(+++)，括号中是染色细胞的百分比。

7BD-33-11A抗体的示意性柱状图总结在图1中，1A245.6抗体的总结在图2中，11BD-2E11-2的总结在图3中，证实了结合的特征包括某些情况下示意性的双峰。11BD-2E11-2对乳腺肿瘤细胞系MDA-MB-231呈现专一的肿瘤结合。7BD-33-11A和1A245.6对乳腺(MDA-MB-231和MCF-7)、结肠、肺、卵巢和前列腺癌细胞系呈现相似的结合而与乳腺癌细胞系的一种(MDA-MB-468)呈现不同的结合能力。所有3种抗体均与非癌细胞发生结合，但是该结合没有产生细胞毒性。这成为进一步的证据，说明结合未必能够预测抗体与同类抗原的连接结果且结合是一种非显而易见的发现。该结果暗示发生抗体连接的不同细胞环境中对细胞毒性是决定性的而不仅是抗体的结合。

实施例3

体内实验

现在参考图5和6中显示的数据，以100μl的体积将5百万个MDA-MB-231人乳腺癌细胞皮下注射至小鼠后颈部从而移植进4-8周大的SCID雌性小鼠体内。小鼠随机分成4个治疗组，每组10只。在移植前一天，以20mg/kg将11BD2E-11-2、7BD-33-11A、1A245.6测试抗体或3BD-27同型对照抗体(已知不和MDA-MB-231细胞结合)以300μl的体积腹膜内给药，抗体由含有2.7mM KCl、1mM KH₂PO₄、137mM NaCl、20mM Na₂HPO₄的稀释液从储存浓度稀释。在随后的7周内抗体以相同的方式每周给药一次。

大约每7天用测径器测量肿瘤的生长，测量持续10周或直至动物个体达到加拿大动物保护委员会(CCAC)规定的终点。研究期间记录动物的体重。根据CCAC的条款所有动物在试验结束时均处以安乐死。在整个实验中没有毒性的临床迹象。每周测量的体重是健康和衰亡的替代指标。在用同型对照、3BD-27和7BD-33-11A、1A245.6或11BD-2E11-2进行治疗的组之间在体重上存在微小的差异。在第60天(治疗中止后11天)1A245.6治疗组的肿瘤体积是对照组的5.2％(p＝0.0002)且证实了抗体治疗降低肿瘤负荷的有效性。那些用7BD-33-11A抗体治疗的患有癌症的小鼠没有疾病及肿瘤负荷。在第67天肿瘤体积比11BD-2E11-2治疗组小(对照组的45％)(p＝0.08)。这也证实了用细胞毒性抗体治疗与对照抗体相比产生了更小的肿瘤负荷。7BD-33-11A、1A245.6和11BA-2E11-2细胞毒性抗体的治疗还具有相应的存活益处(图6)。用3BD-27抗体治疗的对照组在移植后第74天达到100％死亡率。与之形成对比的是，7BD-33-11A治疗组没有疾病，1A245.6治疗动物实现100％存活，11BD-2E11-2治疗组有24％的存活。

总之，在公认的人癌症疾病模型中，和对照抗体相比，细胞毒性抗体治疗降低肿瘤负荷且提高存活，暗示着这些抗体(7BD-33-11A、1A245.6、11BD-2E11-2)在治疗包括人在内的其它哺乳动物时的药理学和制药学上的益处。

实施例4

体内成熟肿瘤实验

将5百万个MDA-MB-231乳腺癌细胞以100μl的体积皮下注射进小鼠后颈移植入5至6周大的雌性SCID小鼠体内。每周用测径器测量肿瘤生长。当大部分小鼠的肿瘤体积在移植后的34天达到100mm³(范围在50-200mm³)时，分别随机指定8-10只小鼠至每3个治疗组。7BD-33-11A、1A245.6测试抗体或3BD-27同型对照抗体(已知不和MDA-MB-231细胞结合)按15mg/kg以150μl的体积腹膜内给药，其中抗体用含有2.7mM KCl、1mM KH₂PO₄、137mM NaCl、20mMNa₂HPO₄的稀释液从储存浓度稀释。随后以同样的方式每周进行3次抗体给药，共给药10剂直至移植后第56天。大约每7天用测径器测量肿瘤生长直至移植后第59天或直至动物个体达到加拿大动物保护委员会(CCAC)的终点。在研究期间记录动物的体重。根据CCAC条款在研究结束时对所有动物施行安乐死。

整个实验中没有毒性的临床迹象。每周测量体重。在用同型对照和7BD-33-11A或1A245.6抗体治疗组之间没有显著的体重上的差异。从图4中可以看出，在移植后第59天(治疗中止后第二天)，7BD-33-11A治疗组的肿瘤体积是对照组的29.5％(p＝0.0003)。在该组中，比较第59天和第52天的平均肿瘤体积值，没有退行的趋势(p＝0.25)。同样地，1A245.6抗体的治疗也显著地抑制了肿瘤生长且降低了肿瘤负荷。用该抗体治疗的患肿瘤动物的肿瘤体积是同型治疗对照组的56.3％(p＝0.017)。

总之，在公认的人癌症疾病模型中用7BD-33-11A或1A245.6抗体进行治疗和对照抗体相比显著降低了成熟肿瘤的肿瘤负荷，暗示着这些抗体在对包括人在内的其它哺乳动物治疗中的药理学和制药学益处。

实施例5

体内MB-231预防性存活肿瘤实验

按照专利申请号10/348,284中所述并参考图11，以体积为100μl的盐溶液将5百万个MB-231人乳腺癌细胞皮下注射至小鼠后颈部从而移植进4-8周大的SCID雌性小鼠体内。小鼠随机分成3组，每组10只。在移植前一天，按20mg/kg将7BD-33-11A、1A245.6测试抗体或同型对照抗体(已知不和MB-231或PC-3细胞结合)以300μl的体积腹膜内给药，抗体由含有2.7mM KCl、1mM KH₂PO₄、137mM NaCl、20mM Na₂HPO₄的稀释液从储存浓度稀释。在随后的7周内抗体以相同的方式每周给药一次。大约每7天用测径器测量肿瘤的生长，测量持续10周或直至动物个体达到加拿大动物保护委员会(CCAC)规定的终点。研究期间记录动物的体重。根据CCAC的条款所有动物在试验结束时均处以安乐死。

延续专利申请号10/348,284，7BD-33-11A或1A245.6的治疗还具有相关的治疗后存活的益处(图11)。7BD-33-11A没有发展肿瘤且只有1只小鼠在第200天(治疗后第151天)死亡。与之形成对比的是，所有的同型对照小鼠在治疗后第23天均死亡。1A245.6治疗组直至治疗后第151天才达到100％死亡率，与同型对照治疗组相比延长了6倍多。总之1A245.6和7BD-33-11A在人体癌症的乳腺肿瘤模型中提高了存活并降低了肿瘤负荷。

实施例6

体内MB-231成熟肿瘤实验

如专利申请号10/348,284所述并参考图12和13，将5百万个MB-231人体乳腺癌细胞通过100μl的盐溶液皮下注射进小鼠后颈部从而移植入5至6周大的雌性SCID小鼠体内。每周用测径器测量肿瘤生长。当大部分小鼠的肿瘤体积在移植后的34天达到100mm³(范围在50-200mm³)时，分别随机指定8-10只小鼠至3个治疗组。7BD-33-11A、1A245.6测试抗体或同型对照抗体按15mg/kg以150μl的体积腹膜内给药。抗体用含有2.7mM KCl、1mM KH₂PO₄、137mMNaCl、20mM Na₂HPO₄的稀释液从储存浓度稀释。随后以同样的方式每周进行3次抗体给药，共给药10剂直至移植后第56天。大约每7天用测径器测量肿瘤生长直至移植后第59天或直至动物个体达到CCAC的终点。在研究期间记录动物的体重。根据CCAC条款在研究结束时对所有动物施行安乐死。

延续专利申请号10/348,284，7BD-33-11A或1A245.6的治疗还具有相关的治疗后降低肿瘤负荷(图12)和延长存活(图13)的益处。在第80天(治疗后第23天)7BD-33-11A和1A245.6和同型对照治疗相比均降低了肿瘤的平均体积；分别降低了83％(p＝0.001)和35％(p＝0.135)。用Cox比例模型比较了不同组的危险(风险)率。在该模型中，将每组的风险率与同型对照组的风险进行了比较。在治疗后大约60天，7BD-33-11A组的死亡风险和同型对照治疗组相比为16％(p＝0.0006)。7BD-33-11A相关的存活益处在治疗后第100天后仍然呈现很好地持续。在治疗后第130天，7BD-33-11A有60％的存活而同型对照小鼠在治疗后第50天全部死亡。1A245.6的存活时间是同型对照的2倍：治疗后100天对50天。因此在公认的人乳腺癌疾病模型中7BD-33-11A和1A245.6与对照抗体相比均降低了肿瘤负荷并提高了存活，暗示着这些抗体在治疗包括人在内的其它哺乳动物时的药理学和制药学益处。

实施例7

体内PC-3预防性肿瘤实验

参考图14和15的数据，以体积为100μl的盐溶液将1百万个PC-3人前列腺癌细胞皮下注射至小鼠后颈部从而移植进4-8周大的SCID雄性小鼠体内。小鼠随机分成4组，每组8只。在移植前一天，按20mg/kg将7BD-33-11A或1A245.6测试抗体或同型对照抗体或缓冲液对照以300μl的体积腹膜内给药，抗体由含有2.7mM KCl、1mMKH₂PO₄、137mM NaCl和20mM Na₂HPO₄的稀释液从储存浓度稀释。在随后的7周内抗体和缓冲液对照以相同的方式每周给药一次。大约每7天用测径器测量肿瘤的生长，测量持续10周或直至动物个体达到CCAC规定的终点或第52天。研究期间记录动物的体重。根据CCAC的条款所有动物在试验结束时均处以安乐死。

使用最小显著差异方法(LSD)详细描述不同的组，可以明显看出7BD-33-11A和1A245.6和对照相比显著降低治疗小鼠中的肿瘤负荷(图14)。在治疗后(第52天)，7BD-33-11A和同型对照相比以69％阻止肿瘤生长(p＝0.001)，1A245.6和同型对照相比也以50％阻止肿瘤生长(p＝0.017)。当与缓冲液对照作比较时发现相似的结果。在PC-3前列腺癌异种移植模型中，可以使用体重作为疾病进程的替代指标(图15)。重复的方差分析(Rep.ANOVA)显示在同型和缓冲液对照组之间没有体重上的显著差异。方差分析确定在第52天，7BD-33-11A比两个对照组和1A245.6治疗组的体重均显著增高(p＜0.03)。总之，和同型对照组相比，7BD-33-11A以54％防止体重降低(p＝0.002)而1A245.6以25％防止体重降低(p＝0.004)。对小鼠治疗后的存活进行了监测(图16)。接受7BD-33-11A和1A245.6治疗的小鼠在治疗后第38天达到100％死亡率，是同型和缓冲液对照治疗组的3倍多长，后两者在治疗后11天达到100％死亡率。

总之，在人前列腺癌的公认模型中，7BD-33-11A和1A245.6抗体治疗和同型对照抗体以及缓冲液对照相比降低了肿瘤负荷、延缓了疾病进程并延长了存活。这些结果暗示这些抗体(7BD-33-11A和1A245.6)除了治疗乳腺癌以外的潜在的药理学和制药学益处。

实施例8

体内PC-3成熟肿瘤实验

以体积为100μl的盐溶液将1百万个PC-3前列腺癌细胞皮下注射至小鼠后颈部从而移植进4-8周大的SCID雄性小鼠体内。每周用测径器测量肿瘤生长。当大部分小鼠的肿瘤体积在移植后的21天达到275mm³(范围在144-406mm³)时，分别随机指定9-10只小鼠至4个治疗组。7BD-33-11A或1A245.6或同型对照抗体按20mg/kg/剂以300μl的体积腹膜内给药。抗体用含有2.7mM KCl、1mM KH₂PO₄、137mM NaCl和20mM Na₂HPO₄的稀释液从储存浓度稀释。随后以同样的方式每周进行3次抗体给药，共给药10剂直至移植后第43天。研究期间大约每7天用测径器测量肿瘤生长或直至动物个体达到CCAC规定的终点。在研究期间记录动物的体重。根据CCAC条款在研究结束时对所有动物施行安乐死。

在随机化时，各组的平均肿瘤体积和标准方差相似。各组的体重之间没有统计学上的差异。这表明发生的是真实的随机化。如图17中所示，在3周治疗期结束时抗体7BD-33-11A和同型对照相比能够以36％显著抑制肿瘤生长(p＝0.024)。1A245.6和同型或缓冲液对照治疗组相比没有显著差异。同样地，就体重而言，7BD-33-11A及1A245.6和同型或缓中液对照治疗组相比没有任何显著差异(图18)。在整个研究中所有组都呈现了相同显著的体重降低(p＜0.001)。

总之，在SCID小鼠的前列腺癌的成熟肿瘤异种移植模型中，7BD-33-11A比同型对照抗体显著有效地抑制肿瘤生长。因此，在人体癌症疾病的两个公认模型(乳腺和前列腺)中7BD-33-11A治疗显著降低成熟肿瘤的肿瘤负荷，暗示该抗体在治疗包括人在内的其它哺乳动物上的药理学和制药学益处。

实施例9

正常人体组织染色

进行IHC研究描述7BD-33-11A和1A245.6抗原在人体的分布。预先进行IHC最优化研究以确定进一步实验的条件。按上述方法制备和纯化7BD-33-11A和1A245.6单克隆抗体。

组织切片在58℃烘箱中干燥1小时脱腊，通过将切片5次浸泡于Coplin罐中的二甲苯进行脱腊，每次浸泡4分钟。在经过一系列梯度乙醇清洗(100％-75％)处理后，切片在水中重新水合。将切片浸泡于pH 6的10mM柠檬酸缓冲液(Dako，Toronto，Ontario)中，随后用高、中、低强度的微波分别照射切片5分钟并最终将其浸没在冷的PBS中。随后将切片浸没在3％的过氧化氢溶液中6分钟，用PBS冲洗3次，每次5分钟，干燥，在室温将切片用Universal封闭液(Dako，Toronto，Ontario)孵育5分钟。用抗体稀释缓冲液(Dako，Toronto，Ontario)将7BD-33-11A、1A245.6、小鼠抗波形蛋白单克隆抗体(Dako，Toronto，Ontario)或同型对照抗体(针对黑曲霉葡萄糖氧化酶的抗体，该酶在哺乳动物组织中不存在或无法诱导，Dako，Toronto，Ontario)稀释至工作浓度(每种抗体5μg/ml)并在室温过夜放置1小时。切片用PBS冲洗3次，每次5分钟。通过与提供的HRP偶联二级抗体(Dako，Toronto，Ontario)在室温放置30分钟观察/显现一级抗体的免疫活性。在该步骤之后用PBS冲洗切片3次，每次5分钟，随后加入DAB(3，3’-二氨基联苯胺四盐酸，Dako，Toronto，Ontario)免疫过氧化物酶染色显色底物溶液在室温放置10分钟进行显色反应。用自来水冲洗切片中止显色反应。用Meyer’s苏木精(Sigma Diagnostics，Oakville，ON)复染后，切片用梯度乙醇(75-100％)脱水并用二甲苯清洗。用封片胶在切片上盖上盖玻片。使用Axiovert 200(Zeiss Canada，Toronto，ON)对切片进行显微观察，使用Northern Eclipse成像软件(Mississauga，ON)获取并存储数字图像。由病理学家对结果进行读取、评价和解释。

在人正常器官组织芯片(Imgenex，San Diego，CA)上进行抗体与59个正常人体组织的结合。表4总结了7BD-33-11A和1A245.6对正常人体组织芯片染色的结果。在表中，组织染色分为3类。1组组织完全阴性。对于7BD-33-11A，这些组织包括正常皮肤、大脑(图19A)、卵巢、胸腺、甲状腺、小肠、食道、心脏(图20A)、胆囊和淋巴结。对于1A245.6，完全阴性组织包括皮肤、皮下脂肪、食道和大脑(图19B)。第二组组织包括显示出阳性染色的组织。对于7BD-33-11A，这些组织包括肝脏和胰腺。该抗体对扁桃腺的染色最强。对于1A245.6，阳性染色发生在肝脏、心脏(图20B)、睾丸、甲状腺、肾上腺和子宫肌层。与7BD-33-11A一样，1A245.6对扁桃腺的染色最强。第三组组织包括的组织在组织切片中发生阳性染色，但是染色限于浸润性巨噬细胞、淋巴细胞、纤维原细胞或表皮细胞，例如7BD-33-11A和1A245.6对胃的染色(分别见图21A和21B)。应当注意的是在数个重要器官的细胞上没有7BD-33-11A抗原，包括肾脏、心脏(图20A)和肺。总的说来，和1A245.6相比7BD-33-11A与相对小部分的正常人体组织结合，在阳性组织中产生微弱至中度的结合。1A245.6的染色尽管更加广泛，但结合强度同样仍是微弱至中度的，且在大部分例子中染色限于染色组织的上皮细胞。这些结果暗示7BD-33-11A的抗原在正常组织中没有广泛的表达，抗体特异性地与人体中有限数量的组织结合。此外，除了在心脏和肝脏中存在，1A245.6的抗原仅限于上皮细胞和浸润性淋巴细胞、巨噬细胞和纤维原细胞。

表4：人体正常组织的IHC

切片号	器官	1A245.6	7BD-33-11A	波形蛋白
					1	*皮肤	-	-	+++纤维原细胞
2	*皮肤	-	-	+++纤维原细胞
					3	皮下脂肪	-	-	+++脂肪细胞
4	乳腺	+/-纤维原细胞	-	++血管上皮、平滑肌
					5	乳腺	+++小叶上皮	+/-纤维原细胞	++血管基质
6	脾脏	++淋巴细胞	+/-淋巴细胞	+++窦内皮，淋巴细胞
					7	脾脏	+++淋巴细胞	+/-淋巴细胞	+++窦内皮，淋巴细胞
8	淋巴结	++血管内皮，淋巴细胞	-	+++淋巴细胞
					9	淋巴结	+血管内皮	-	++血管内皮、淋巴细胞
10	骨骼肌	+/-血管内皮	-	+/-血管
					11	鼻黏膜	-NR	-NR	-NR
12	肺	+/-间质细胞(巨噬细胞)	-	++Alevolar上皮，巨噬细胞
					13	肺	+/-支气管上皮，++巨噬细胞	+巨噬细胞	++Alevolar上皮，巨噬细胞，淋巴细胞
14	支气管	-NR	-NR	++软骨细胞
					15	心脏	++心肌	**-	+++血管
16	唾液腺	++腺泡上皮	+腺泡上皮	+++血管，周边神经
					17	肝脏	+++肝细胞	++肝细胞	++血管
18	肝脏	+++肝细胞	+肝细胞	+++血管，巨噬细胞
					19	肝脏	+肝细胞	+/-肝细胞	+/-血管
20	胆囊		-	+++淋巴细胞
					21	胰腺	+++腺泡上皮，兰氏小岛	+腺泡上皮	+++腺泡上皮，血管
22	胰腺	++腺泡上皮，兰氏小岛	++腺泡上皮，兰氏小岛	++腺泡上皮，血管
					23	扁桃腺	+++角蛋白，+淋巴细胞	+++角蛋白，+/-淋巴细胞	+++淋巴细胞
24	食道	-	-	++血管
					25	食道	-	-	+++血管
26	***胃体	+/-胃腺上皮，++固有层淋巴细胞	++胃腺上皮	+++血管&纤维原细胞
					27	***胃体	+++胃腺上皮，+固有层淋巴细胞	++胃腺上皮	+++淋巴细胞，血管，纤维原细胞
28	胃窦	+/-胃腺上皮，+淋巴细胞	++胃腹上皮	+++淋巴细胞
					29	胃，平滑肌	-	-	+++淋巴细胞，血管

30	十二指肠	+++淋巴细胞	+肠腺上皮	++纤维原细胞，血管
					31	小肠	+/-固有层淋巴细胞	-	+淋巴细胞，血管
32	小肠	+/-固有层淋巴细胞	-	+++固有层淋巴细胞
					33	阑尾	+++黏膜上皮，淋巴细胞	++淋巴细胞	+++淋巴细胞，血管
34	结肠	+/-淋巴细胞	+/-固有层巨噬细胞	++淋巴细胞
					35	结肠	+淋巴细胞	-	++淋巴细胞，血管
36	直肠	+/-淋巴细胞，血管	-	++淋巴细胞，血管
					37	肾脏皮质	++小管上皮	-	+++肾小球毛细血管，血管
38	肾脏皮质	+++小管上皮	+小管上皮	+++小管上皮，肾小球毛细血管，血管
					39	肾脏髓质	++小管上皮	-	++肾小管上皮，脂肪细胞，纤维原细胞
40	膀胱	++移行上皮	/-移行上皮	++血管
					41	前列腺	+++腺上皮	++腺上皮	+++腺上皮，血管
42	前列腺	+++腺上皮	++腺上皮	+++腺上皮，血管
					43	精囊	+黏膜上皮	+/-黏膜上皮	+/-
44	辜丸	++生殖上皮，+Leydig细胞	+/-Leydig细胞	+++生殖上皮
					45	子宫内膜增生期	+++腺上皮，+基质	-	++子宫内膜腺，基质
46	子宫内膜分泌期	++腺上皮，基质	-	++腺上皮，+++血管
					47	子宫肌肉层	+平滑肌纤维	+/-纤维原细胞	++平滑肌纤维，血管
48	子宫颈	+/-纤维原细胞	-	+++纤维原细胞
					49	输卵管	+黏膜上皮，血管	-	+/-黏膜上皮，+++血管
50	****卵巢	++间质细胞	-	+++间质细胞
					51	胎盘绒毛	+滋养膜细胞	-	++血管
52	胎盘绒毛	++滋养膜细胞	-	++血管
					53	脐带	-	-	++纤维原细胞
54	肾上腺	++内分泌细胞	**+/-	**+/-
					55	甲状腺	+/-滤泡细胞	-	++滤泡细胞，血管
56	胸腺	+淋巴细胞	-	+++淋巴细胞
					57	脑白质	-	-	++星形胶质细胞
58	脑灰质	-	-	++血管
					59	小脑	-	-	++小脑皮质

缩写：*：原始着色的基底层；**：内源性细胞质色素/背景染色；***：胃窦(不是胃体)；****：仅为卵巢间质；NR：切片没有代表性；CS：切片完全脱落。

实施例10

人体肿瘤组织染色

进行IHC研究确定7BD-33-11A和1A245.6抗原与乳腺癌的癌症相关性以及两个抗体是否可能识别人体癌症。对比实验采用波形蛋白(阳性对照)和黑曲霉葡萄糖氧化酶的抗体，该酶在哺乳动物组织中不存在也无法诱导(阴性对照)。使用来自50名乳腺癌患者的乳腺癌组织芯片和取自乳腺癌患者的非癌症乳腺组织的10个样品(Imgenex公司，San Diego，CA)。每名患者提供了以下信息：年龄、性别和诊断。按照实施例9的IHC步骤进行。使用的所有抗体的工作浓度是5μg/ml。

表5提供了7BD-33-11A和1A245.6抗体对乳腺癌组织芯片染色结合的总结。每个芯片含有取自50个独立患者的肿瘤样品。总体上，测试的50名患者中有36％对7BD-33-11A抗原呈阳性染色(图22A)而对1A245.6的阳性染色率达到98％(图23A)。对于7BD-33-11A，取自乳腺癌患者正常乳腺组织的10个样品中没有一个呈现阳性(图22B)。相反地，10个正常乳腺组织中有9个对1A245.6呈现阳性。但是在大部分实例中的染色是由于浸润性纤维原细胞造成的(图23B)。对于1A245.6，雌激素和孕酮受体状况之间没有明显关联(表6)。稍多数量的阳性7BD-33-11A抗原组织也是雌激素和孕酮受体的表达者(表7)。对7BD-33-11A抗原，更高的肿瘤阶段似乎有更多的阳性表达的趋势(表7)，对于1A245.6，组织染色的强度似乎与更高的肿瘤阶段相关(表6)。7BD-33-11A和1A245.6染色均对癌细胞具有专一性且染色在细胞膜和细胞质均发生。7BD-33-11A和1A245.6的染色模式在病人样品中均呈现出抗体对恶性细胞的高度专一性，且相应抗原存在于细胞膜上，由此使其成为具有吸引力的药物靶点。

表5：人乳腺肿瘤组织的IHC

切片号	性别	年龄	诊断	1A245.6	7BD-33-11A
						1	女	28	浸润型导管癌	+++MC	++MC
2	女	71	乳突状实体癌	+++MC	+/-
						3	女	26	浸润型导管癌	++MC	-
4	女	43	浸润型导管癌	++MC	+/-
						5	女	39	浸润型导管癌	+MC肿瘤，+++坏死区域	+/-
6	女	46	原位腺管癌	++MC	+/-
						7	女	47	浸润型导管癌	+++MC肿瘤，++基质	+MC
8	男	67	浸润型导管癌	+++MC	+MC
						9	女	33	浸润型导管癌	++MC	-
10	女	47	浸润型导管癌	++MC	-
						11	女	49	侵犯性小叶癌	-肿瘤，+/-纤维原细胞	-
12	女	46	浸润型导管癌	+++MC	-
						13	女	39	浸润型导管癌	++MC	-
14	女	43	浸润型小叶癌	+++MC	+/-
						15	女	54	浸润型小叶癌	++MC	+/-

16	女	58	浸润型导管癌	++MC肿瘤，基质，+++坏死区域	+/-
						17	女	37	浸润型导管癌	+++MC	-
18	女	43	浸润型导管癌	+++MC肿瘤，基质	+++MC
						19	女	51	浸润型导管癌	+++MC	+MC
20	女	80	髓样癌	++MC	-
						21	女	36	浸润型导管癌	++MC肿瘤，基质	-
22	女	59	浸润型导管癌	+MC	+/-血管
						23	女	34	原位腹管癌	++MC肿瘤，基质，+++坏死区域	+肿瘤，++坏死区域
24	女	54	浸润型导管癌	++MC	+/-
						25	女	47	浸润型导管癌	+++MC	++MC
26	女	53	浸润型导管癌	++MC	-
						27	女	59	浸润型导管癌	+MC肿瘤，基质，血管内皮	+/-坏死区域
28	女	60	印戒细胞癌	+++MC	-
						29	女	37	浸润型导管癌	+++MC	++MC
30	女	46	浸润型导管癌	++MC	+/-
						31	女	35	浸润型导管癌	+/-	-

32	女	47	浸润型导管癌	+肿瘤，+++坏死区域	-
						33	女	54	浸润型导管癌	++MC	-
34	女	47	浸润型导管癌	+MC肿瘤，基质	-
						35	女	41	浸润型导管癌	+++MC	-
36	女	38	浸润型导管癌	+++MC	-
						37	女	55	浸润型导管癌	+MC肿瘤，基质	-
38	女	65	浸润型导管癌	++MC肿瘤，基质	-
						39	男	66	浸润型导管癌	+MC肿瘤，基质	-
40	女	44	浸润型导管癌	++MC	-
						41	女	52	淋巴结转移癌	++MC	-
42	女	32	淋巴结转移癌	++MC	-
						43	女	58	淋巴结转移癌	+++MC	+/-
44	女	52	淋巴结转移癌	++MC	-
						45	女	58	淋巴结转移癌	+MC	-
46	女	38	淋巴结转移癌	+++MC	-
						47	女	45	淋巴结转移癌	+/-	-

48	女	45	淋巴结转移癌	++MC	-
						49	女	29	淋巴结转移癌	++MC	-
50	女	61	淋巴结转移癌	++MC	-
						*51	女	46	乳头	++皮脂腺	-
*52	女	47	乳头	++MC	-
						*53	女	40	正常胸腺	-	-
*54	女	43	正常胸腺	+/-纤维原细胞	-
						*55	女	40	正常胸腺	++小叶上皮，纤维原细胞，内皮	-
*56	女	40	正常胸腺	+/-纤维原细胞	-
						*57	女	45	正常胸腺	+/-纤维原细胞	-
*58	女	44	正常胸腺	+/-纤维原细胞	-
						*59	女	37	正常胸腺	++小叶上皮，纤维原细胞	-
*60	女	51	正常胸腺	+/-纤维原细胞	-

缩写：PS：切片部分脱落；*：乳腺癌患者的非癌症乳腺组织。

表6：对于1A245.6的IHC相关性总结

表7：对于7BD-33-11A的IHC相关性总结

为了确定7BD-33-11A或1A245.6抗原是否在除了乳腺癌以外的其它人体癌症组织中表达，两个抗体分别在多种人体肿瘤组织芯片(Imgenex，San Diego，CA)上进行了测试。关于每名患者提供下列信息：年龄、性别、器官和诊断。染色程序和实施例9中叙述的程序相同。波形蛋白作为阳性对照抗体，使用与人乳腺肿瘤组织芯片中相同的阴性对照抗体。使用的所有抗体的工作浓度为5μg/ml。

如表8所呈现，除了乳腺，7BD-33-11A还对数种不同的人体癌症染色。下列肿瘤类型对7BD-33-11A呈现阳性：皮肤(1/2)、肺(3/4)、肝脏(2/3)、胃(4/5)、甲状腺(2/2)、前列腺(1/1)、子宫(4/4)和肾脏(3/3)(图24A)。一些其它肿瘤类型也偶尔出现染色阳性。其它肿瘤组织对7BD-33-11A的表达呈现阴性：卵巢(0/3)、睾丸(0/1)、大脑(0/2)和淋巴结(0/2)。相反地，1A245.6对所有测试的肿瘤组织类型发生了染色。但是，一些最强的染色发生在皮肤、肺、肝脏、子宫、肾脏(图24B)、胃和膀胱的恶性细胞上。和乳腺癌中观察到的一样，7BD-33-11A和1A245.6染色在癌细胞的细胞膜上和细胞质内发生。

因此，7BD-33-11A和1A245.6抗原似乎不但在乳腺癌的细胞膜上出现而且在多种肿瘤类型的细胞膜上出现，包括前列腺。这些结果表明除了乳腺癌和前列腺癌，7BD-33-11A和1A245.6对广泛的肿瘤类型均有作为治疗药物的潜力。

表8：人体多种肿瘤组织芯片上的IHC

切片号

年龄

性别

器官

论断

1A245.6

7BD-33-11A

1

59

M

皮肤

恶性黑素瘤

++M/C

2

25

F

皮肤

SSC

++M/C

-

3

5O

F

乳腺

浸润型导管癌

++M/C

4

57

F

乳腺

侵犯性乳突状癌

+M/C

-

5

35

F

乳腺

浸润型小叶癌

+M/C

F

6

40

M

淋巴结

恶性淋巴瘤，immunoplastic

+M/C

-

7

58

M

淋巴结

源自胃的转移型腺癌

+M/C

-

8

53

F

骨骼

骨肉瘤

++M/C

9

26

M

骨骼

巨细胞瘤

++M/C

-

10

40

M

骨骼

软骨肉瘤

CS

11

51

F

软组织

脂肉瘤

+/-

-

12

47

F

软组织

神经纤维瘤

+/-

-

13

74

M

鼻腔

内翻式乳头状瘤

+M/C

+/-

14

57

M

喉

SCC

+肿瘤，++淋巴细胞，基质

+/-

15

60

M

肺

腺癌

+++M/C

++M/C

16

51

F

肺

SCC

++M/C

+M/C

17

68

F

肺

腺癌

+M/C

-

18

60

M

肺

小细胞癌

++M/C

+M/C

19

88

F

舌

SCC

+M/C

+/-

20

34

F

腮腺

多形性腺瘤

+/-粘蛋白

-

21

50

F

腮腺

腮腺囊状腺淋巴瘤

+++M/C

22

40

F

腮腺

多形性腺瘤

+M/C

+/-

23

56

M

下颌下腺

唾管瘤

+M/C

-

24

69

F

肝脏

胆管细胞癌

+++M/C

++M/C

25

51

M

肝脏

转移型胃癌

++M/C

-

26

64

M

肝脏

HCC

+++M/C

++M/C

27

62

F

胆管

腺瘤

++M/C

+M/C

28

64

F

胰腺

腺瘤

++M/C

29

68

M

食道

SCC

+M/C

+/-

30

73

M

胃

腺癌(不良分化)

++M/C

+M/C

31

63

M

胃

腺癌(适度分化)

++M/C

+/-

32

59

F

胃

印戒细胞瘤

++M/C

+/-

33

62

M

胃

恶性淋巴瘤

+M/C

+血管

34

51

M

胃

交界性基质瘤

+++M/C

+M/C

35

42

M

小肠

恶性基质瘤

++M/C

-

36

52

F

阑尾

类腹膜黏液瘤

-PS

-

37

53

M

结肠

腺癌

+M/C

+/-

38

67

M

直肠

腺癌(不良分化)

++M/C

-

39

75

F

肾脏

移行性细胞癌

+++M/C

++M/C

40

54

F

肾脏

肾细胞癌

++M/C

+/-

41

75

F

肾脏

肾细胞癌

+++M/C

++M/C

42

65

M

膀胱

癌(不良分化)

++M/C

-

43

67

M

膀胱

移行性细胞癌(高度性)

+++M/C

44

62

M

前列腺

腺癌

+M/C

+/-

45

30

M

睾丸

精原细胞瘤

+M/C

-

46

68

F

子宫

子宫内膜癌

+++M/C

++M/C

47

57

F

子宫

平滑肌肉瘤

+C

+/-

48

45

F

子宫

子宫肌瘤

++C

+/-

49

63

F

子宫颈

SCC

+肿瘤，++基质，淋巴细胞

+/-

50

12

F

卵巢

内胚层窦瘤

++M/C

-

51

33

F

卵巢

粘液腺癌

+M/C

-

52

70

F

卵巢

纤维卵囊膜细胞瘤

++M/C

-

53

67

F

肾上腺

皮质癌

++M/C

+M/C

54

61

F

肾上腺

pheohromcytoma

+++M/C

-

55

54

M

甲状腺

乳突状癌

+++M/C

++M/C

56

58

F

甲状腺

微浸润滤泡癌

++M/C

+M/C

57

74

M

胸腺

胸腺癌

+C

+/-

58

66

F

大脑

脑膜瘤

++M/C

-

59

62

M

大脑

多形性神经胶母细胞瘤

+M/C

-

缩写：M：细胞膜染色；C：细胞质染色；M/C：膜-质染色；CS：切片完全脱落；PS：切片部分脱落；F：切片发生折叠；SSC：鳞状细胞癌；HCC：肝细胞癌。

实施例11

体内MCF-7预防性存活肿瘤实验

参考图7和8，以体积为100μl的盐溶液将5百万个MCF-7人乳腺癌细胞皮下注射至小鼠后颈部从而移植进4-8周大的SCID雌性小鼠体内。小鼠随机分成2个治疗组，每组11-13只。在移植后一天，按20mg/kg将7BD-2E11-2测试抗体或同型对照抗体(已知和MCF-7或OVCAR-3细胞没有结合)以300μl的体积腹膜内给药，抗体由含有2.7mM KCl、1mM KH₂PO₄、137mM NaCl和20mM Na₂HPO₄的稀释液由储存浓度稀释。在随后的7周内抗体以相同的方式每周给药一次。大约每7天用测径器测量肿瘤的生长，测量持续8周或直至动物个体达到加拿大动物保护委员会(CCAC)规定的终点。研究期间记录动物的体重。根据CCAC的条款所有动物在试验结束时均处以安乐死。

11BD-2E11-2和对照相比显著降低了治疗小鼠的肿瘤负荷(图7)。在治疗后(第51天)，和同型对照抗体治疗的小鼠相比，11BD-2E11-2阻止肿瘤生长达80％(p＝0.0098)。与11BD-2E11-2给药相关的还有治疗后存活的益处(图8)。同型对照抗体治疗组在治疗后第197天达到100％死亡率而11BD-2E11-2治疗组在第233天仍有40％存活。总而言之，11BD-2E11-2在公认的人乳腺癌模型中延长了存活且降低了肿瘤负荷(Blakey等，Clinical Cancer Research 8：1974-1983 2002；Klement等，Clinical Cancer Research 8：221-2322002；Waud等，Relevanceof Tumor Models for Anticancer Drug Development，Fiebig and Burger，eds.54：305-3151999；Karpanen等，Cancer Research 61：1786-1790 2001)。

实施例12

体内OVCAR-3预防性肿瘤实验

参考图9和10所示的数据，以体积为1000μl的盐溶液将5百万个OVCAR-3人卵巢癌细胞腹膜内注射移植进4-8周大的SCID雌性小鼠体内。小鼠随机分成2个治疗组，每组10只。在移植后一天，按20mg/kg将11BD-2E11-2测试抗体或缓冲液对照抗体以300μl的体积腹膜内给药，抗体由含有2.7mM KCl、1mM KH₂PO₄、137mM NaCl和20mM Na₂HPO₄的稀释液由储存浓度稀释。在随后的9周内抗体以相同的方式每周给药一次。研究期间记录动物的体重。根据CCAC的条款所有动物在试验结束时均处以安乐死。

在OVCAR-3卵巢癌异种移植模型中，增加的体重可被用作疾病进程的替代指标，因为体重的增加反映了升高的肿瘤负荷造成的腹水的聚集(图9)。在移植后第80天(治疗结束第16天)，和缓冲液对照组相比，11BD-2E11-2的给药以12.4％阻止体重的增加(p＝0.015)。对小鼠治疗后的存活进行监测(图10)。到第87天，缓冲液对照组的死亡率达到90％而11BD-2E11-2治疗组仍然有80％的存活率。11BD-2E11-2治疗组直到第125天才达到90％的死亡率。总而言之，在公认的人卵巢癌模型中，和缓冲液对照抗体相比，11BD-2E11-2抗体治疗降低了肿瘤负荷，延缓了疾病进程并提高了存活。因此，11BD-2E11-2的治疗在两个人体癌症疾病(乳腺和卵巢癌)的公认模型中均显著降低了成熟肿瘤的肿瘤负荷，暗示了该抗体在治疗包括人在内的其它哺乳动物上的药理学和制药学益处(Smith等，The Prostate48：47-53 2001；Olson等，International Journal of Cancer 98：923-929 2002；Guilbaud等，Clinical Cancer Research 7：2573-25802001；Von Gruenigen等，International Journal of Gynecologic Cancer 9：365-372 1999；Guichard等，Clinical Cancer Research 7：3222-3228 2001；Xiao等，ProteinExpression and Purification 19：12-21 2000)。

本说明书中的所有专利和公开物对于本发明所属技术领域的技术人员具有说明性。所有的专利和公开物在此以相同程度被引为参考，就如同各独立的公开物被专门且个别地说明在此引作参考一样。

应当明白的是尽管说明了本发明的特定形式，发明不限于在此描述和显示的特定形式或各部分的排列。对于本领域的技术人员而言，显然可以在不背离本发明的范围的情况下进行各种修改，并且不应当认为本发明限于本说明书中显示和描述的内容。

本领域的技术人员将容易地认识到当前发明非常适于实现目标并获得所述的及发明本身所固有的结果和益处。在此描述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物学相关化合物、方法、步骤和技术是当前优选具体实施方案的代表，可以被效仿而不应对范围发生限制。遵照本发明的精神和所附权利要求书的范围定义，本领域技术人员可以对发明进行修改和其它使用。虽然本发明结合特定的优选具体实施例进行了说明，应当明白如同权利要求中一样，发明不应不恰当地受到这些特定具体实施方案的限制。事实上，对于本领域的技术人员显而易见的对实现此发明的上述模式的各种修改都应该包含在随后的权利要求书的范围内。

Claims

1.单克隆抗体或其抗原结合片段在制备药物中的应用，所述药物用于在哺乳动物中延长存活和/或延缓人肿瘤疾病进程，所述单克隆抗体由保藏于ATCC、保藏号为PTA-5643的克隆编码，其中所述肿瘤表达与以下单克隆抗体特异性结合的抗原：该单克隆抗体具有由保藏于ATCC、保藏号为PTA-5643的克隆编码的单克隆抗体的识别特征。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述抗体与细胞毒成分相偶联。

3.根据权利要求2所述的应用，其中所述细胞毒成分是一种放射性同位素。

4.根据权利要求1所述的应用，其中所述抗体激活补体。

5.根据权利要求1所述的应用，其中所述抗体介导抗体依赖性细胞毒性。

6.根据权利要求1所述的应用，其中所述抗体是鼠抗体。

7.根据权利要求1所述的应用，其中所述抗体是人源化抗体。

8.根据权利要求1所述的应用，其中所述抗体是嵌合抗体。

9.一种由保藏于ATCC、保藏号为PTA-5643的克隆编码的分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段。

10.如权利要求9所述的分离出的抗体或抗原结合片段，其中所述分离出的抗体或其抗原结合片段是人源化的。

11.如权利要求9所述的分离出的抗体或抗原结合片段，其与选自细胞毒成份、酶、放射性化合物和造血细胞中的一种偶联。

12.如权利要求9所述的分离出的抗体或抗原结合片段，其中所述分离出的抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体。

13.如权利要求9所述的分离出的抗体或抗原结合片段，其中所述分离出的抗体或其抗原结合片段是鼠抗体。

14.保藏于ATCC、保藏号为PTA-5643的分离出的克隆。

15.一种确定癌细胞在选自人肿瘤的组织样品中的存在的结合实验方法，包括：

提供所述人肿瘤的组织样品；

提供由保藏于ATCC、保藏号为PTA-5643的克隆编码的分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段；

将所述分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述组织样品接触；以及

确定所述分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述组织样品的结合；

由此表明在所述组织样品中所述癌细胞的存在。

16.如权利要求15所述的结合实验方法，其中人肿瘤组织样品获自源于组织中的肿瘤，所述组织选自结肠、卵巢、肺和胸腺组织。

17.一种在选自人肿瘤的组织样品中分离或筛选癌细胞的工艺，包括：

提供所述人肿瘤的组织样品；

由此所述癌细胞通过所述结合得到分离并肯定了它们在所述组织样品中的存在。

18.如权利要求17所述的工艺，其中人肿瘤组织样品获自源于组织中的肿瘤，所述组织选自结肠、卵巢、肺和胸腺组织。