CN102844043B - 使用PTEN-Long前导序列进行分子的跨膜递送 - Google Patents

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Abstract

提供一种组合物，用于穿过生物膜而递送货物分子，所述组合物包含：（i）肽，包含具有SEQ ID NO:1中所述序列的连续氨基酸残基，用于穿过生物膜而运送货物分子，和（ii）货物分子，其中所述货物分子不是包含具有SEQ ID NO:4中所述序列的氨基酸残基的肽。还提供了穿过生物膜而递送货物分子的方法。还提供了治疗肿瘤、癌症、代谢障碍和心血管障碍的方法。

Description

使用PTEN-Long前导序列进行分子的跨膜递送
技术领域
本申请案主张2010年2月17日递交的第61/338,377号美国临时申请案的优先权，所述案以全文引用的方式并入本文中。
本文所揭示的工作是根据来自国家癌症研究所（National Cancer Institute）的批准号CA082783，在政府的支持下完成的。因此，美国政府享有本发明的某些权利。
在本申请案中，各种公开案在括号中以第一作者和年份来提及。这些参考的完整引用可在紧靠权利要求书前面的说明书结尾找到。这些公开案的揭示内容在此以全文引用的方式并入本申请案中，以更详细地描述本发明所涉及的技术现状。
背景技术
PTEN肿瘤抑制剂（参见WO98/34624，其以全文引用的方式并入本文中）是使重要的第二信使磷酯酰肌醇3,4,5-三磷酸（phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate）脱去磷酸的细胞质磷酸酶（马哈马（Maehama）和狄克逊（Dixon）  1998）。此活性下调了许多由PIP3激活Akt而起始的致瘤信号，这些信号包括抗细胞凋亡途径、细胞周期进程和渐增的细胞新陈代谢（苏黎世（Sulis）和帕森斯（Parsons）2003）。从许多不同肿瘤类型中PTEN在遗传上或功能上的频繁损失来看，PTEN在癌症中的作用是显而易见的（波奴（Bonneau）和隆基（Longy）2000）。起初在神经胶质癌中发现没有PTEN，从那以后，它已经在前列腺、乳房、子宫内膜、黑素细胞、肾和肺的肿瘤发生中有所涉及。PTEN中的种系突变也与遗传性癌症易感综合征，如考登氏综合征(Cowden's Syndrome）有关（英格（Eng）2003）。PTEN损失的小鼠模型简述了PTEN在杂合小鼠中和在许多不同组织类型中的组织特异性基因剔除中作为肿瘤抑制剂的作用（迪克里斯托夫（DiCristofano）,帕斯（Pesce）等人1998；垮比艾多（Kwabi-Addo）,吉利（Giri）等人2001；帕特克里（Petrocelli）和斯林格兰多（Slingerland）2001；尤（You）,凯斯特林（Castrillon）等人2002；弗瑞瑟（Fraser）,朱（Zhu）等人2004）。
PTEN蛋白含有N末端双特异性磷酸酶结构域和C末端C2磷脂结合域，接着是具有调节重要性的非结构化尾（unstructured tail），这种重要性是由于在其中发现了磷酸化部位（李（Lee）,杨（Yang）等人1999；瓦斯科斯（Vazquez）,拉马斯瓦米（Ramaswamy）等人2000；托雷斯（Torres）和普利多（Pulido）  2001；瓦斯科斯（Vazquez）,格罗斯曼（Grossman）等人2001）。PTEN蛋白主要在细胞质中，然而，越来越多的证据表明在细胞核中存在PTEN，细胞核是由通过NEDD4-1使蛋白质单泛素化而调节的位置（贝克（Baker）2007；王（Wang）,特罗特曼（Trotman）等人2007）。
在起始密码子AUG处发生的翻译起始之前进行5'UTR的核糖体扫描。尽管核糖体决定适当起始密码子的实际方式仍未完全被理解，但是mRNA本身和指示起始前复合物将在何处减慢扫描并且开始翻译的序列都具有某些特性。典型的“科扎克序列（Kozaksequence）”CCACCATGG（其中加下划线的ATG是起始密码子）已显示为对起始最有利的序列情形（科扎克（Kozak）1991）。mRNA二级结构有可能通过起始前复合物扫描的实际减慢也促进起始，这需要螺旋酶在读取之前溶解二级结构（科扎克（Kozak）1990）。
在某些转录物中，翻译起始可从非AUG密码子开始发生。这通常只包含从转录物翻译的总蛋白的较小部分并且结果是在N末端变化的混合种类的蛋白质。科扎克（Kozak）描述了从非AUG密码子开始的翻译起始效率并且发现了GUG和CUG都能在试管内起始翻译，但效率低得多（科扎克（Kozak）1989）。进一步研究已显示甲硫氨酸的有效性可通过一种尚不明朗的机制来改变翻译起始的混乱性，但是可能涉及由营养敏感性激酶使43S起始前复合物的成分eIF2磷酸化（荷西（Hershey）1991；汉恩（Hann）1994）。
许多蛋白质已显示从替代性的起始密码子开始翻译。转录因子c-myc具有替代性的上游CUG起始密码子，当所述起始密码子被翻译时，添加14个氨基酸到蛋白质的N末端（汉恩（Hann）和以色曼（Eisenman）1984）。这种替代性的同功体（isoform）已显示在伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)中选择性地被破坏(汉恩（Hann),金(King）等人1988）。在组织培养中，当甲硫氨酸处于低浓度时，较长形式的myc主要在高细胞密度下转录（汉恩（Hann）,斯隆布朗（Sloan-Brown）等人1992）。进一步研究已揭示较长形式的c-myc是生长抑制性的并且具有与典型的c-myc蛋白质不同组的转录目标（汉恩（Hann）,迪克斯特（Dixit）等人1994）。（弗洛尔凯维奇（Florkiewicz）和索玛（Sommer）1989）（普拉茨（Prats）,克伽德（Kaghad）等人1989。）
另外，已知蛋白质的实际亚细胞定位可由替代性的起始密码子来指示。在小鼠的情况下，从上游CUG密码子起始的原癌基因int-2替代物编码核定位，而AUG密码子编码信号肽以定位到分泌途径（阿克兰德（Acland）,狄克逊（Dixon）等人1990）。类似现象在人类FGF3中有描述，其中从AUG翻译的蛋白质以分泌途径为目的地，而从上游CUG翻译的蛋白质定位到细胞核（凯富（Kiefer）,艾克兰德（Acland）等人1994）。此外，在一些真核细胞蛋白质，如TEF-1和PRPS-3中，蛋白质完全从CUG密码子起始（泰勒（Taira）,艾扎瑟（Iizasa）等人1990；肖（Xiao）,大卫德森（Davidson）等人1991）。
以分泌为目的的蛋白质通过称为信号肽的一段疏水性氨基酸而靶向内质网（布罗布（Blobel）,沃特（Walter）等人1979）。通常在蛋白质的N末端处发现，信号肽在翻译时结合信号识别颗粒（SRP），并且使核糖体停止并易位到粗面内质网，在所述粗面内质网处核糖体结合SRP受体。一旦核糖体停泊，即释放SRP-SRP受体复合物，并且通过Sec61易位子穿过ER的内腔而重新开始翻译。然后，在可溶性蛋白质从Sec易位子释放蛋白质的情况下，裂解出信号肽。在蛋白质跨越膜的情况下，跨膜螺旋体充当ER易位的信号肽。这些蛋白质在高尔基体中通过糖基化而广泛地被修饰并且穿梭到分泌泡囊中的质膜（艾伯特（Alberts）2002）。
存在许多在癌症中已显示出重要性的分泌型蛋白质。举例来说，Wnt信号传导途径已显示在肺癌中有变化。Wnt是卷曲蛋白受体家族的分泌型配体。Wnt激活卷曲蛋白引起散乱，使得包含APC的□-连环蛋白（catenin）降解复合物离解，从而允许□-连环蛋白的水平上升并且易位到细胞核，在所述细胞核中□-连环蛋白可与TCF转录因子相互作用并且反式激活TCF转录因子。APC中的失活突变和□-连环蛋白中的激活突变在遗传性和偶发性结肠癌中已有详细描述。另外，许多细胞外配体拮抗剂（如SFRP和Wnt-5a）竞争相同的卷曲蛋白受体（如Wnt）。SFRP和Wnt-5a两者都显示是肿瘤抑制剂；SFRP基因剔除小鼠产生淋巴肿瘤并且在黑素瘤中已检测到Wnt-5a的后生沉默。
如本文所揭示，新颖的经差异性翻译的蛋白质的前导序列，即PTEN-long，能够类似于HIV TAT充当细胞穿透肽。
发明内容
一种组合物，其包含：（i）肽，包含SEQ ID NO:1中所述序列的连续氨基酸残基22-173，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分，用于穿过生物膜而运送货物分子，和（ii）货物分子，其中所述货物分子不是包含具有SEQ ID NO:4中所述序列的氨基酸残基的肽。
一种将货物分子递送到细胞中的方法，其包括使所述细胞与组合物接触，所述组合物包含：（i）肽，包含SEQ ID NO:1中所述序列的连续氨基酸残基22-173，或SEQ ID NO:1中所述氨基酸残基的一部分，用于穿过生物膜而运送货物分子，和（ii）货物分子，其中所述货物分子不是包含具有SEQ ID NO:4中所述序列的氨基酸残基的肽，所述接触在允许货物分子进入细胞中的条件下进行。
一种治疗个体的肿瘤的方法，其包括给予所述个体一定量的组合物，所述组合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分，所述肽结合到货物分子上，其中所述货物分子不是包含具有SEQ IDNO:4中所述序列的氨基酸残基的肽，所述货物分子的量能有效地治疗所述个体的肿瘤。
一种治疗个体的癌症的方法，其包括给予所述个体一定量的组合物，所述组合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分，所述肽结合到货物分子上，其中所述货物分子不是包含具有SEQ IDNO:4中所述序列的氨基酸残基的肽，所述货物分子的量能有效地治疗所述个体的癌症。
一种治疗个体的代谢障碍的方法，其中所述代谢障碍的特征在于代谢酶缺乏，所述方法包括给予所述个体一定量的组合物，所述组合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分，所述肽结合到所述代谢酶上，所述代谢酶的量能有效地治疗所述个体的代谢障碍。
一种治疗个体的糖尿病的方法，其包括给予所述个体一定量的组合物，所述组合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分，所述肽结合到货物分子上，所述货物分子的量能有效地治疗所述个体的糖尿病。
一种治疗个体的心血管疾病的方法，其包括给予所述个体一定量的组合物，所述组合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分，所述肽结合到货物分子上，所述货物分子的量能有效地治疗所述个体的心血管疾病。
附图说明
图1.PTEN-long构建体的图。表达构建体，其显示组合，产生所述组合以驱使PTEN从内生性起始部位或替代性起始部位开始表达。典型的PTEN用黑色显示，而UTR中翻译的区域用灰色显示。
图2.智人PTEN mRNA的图。PTEN mRNA编码所示的典型的ATG起始密码子框内和上游的173个氨基酸(SEQ ID NO:9）。翻译从典型的ATG上游，在CTG处核苷酸-519上开始。
图3.PTEN直系同源物的N末端的比对。在维克特NTI（Vector NTI）（英杰生命科技有限公司（Invitrogen））上使用BLOSUM62得分矩阵比对来自指定物种的PTEN蛋白序列。使用ORFinder（NCBI），从典型的的AUG起始密码子开始，在-519（智人）和-520（小家鼠）处使用CUG替代性起始密码子而从公开的mRNA翻译智人（SEQ IDNO:15）和小家鼠（SEQ ID NO:13）的延长的N末端序列（阿斯泰里斯（asterix））。来自智人（NM_000314）和小家鼠（NM_008960）的mRNA序列。从贝勒医学院（BaylorCollege）的蜜蜂基因组计划（Honey Bee Genome Project）获得意蜂（Apis mellifera）序列（SEQ ID NO:10）。从线虫数据库（Wormbase）下载秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）PTEN的蛋白序列（SEQ ID NO:11）（Daf-18）。从NCBI下载黄牛(Bos Taurus）（XM_613125）（SEQ ID NO:12）和黑猩猩（Pan troglodytes）（SEQ ID NO:14）（XP_521544）。一致序列是SEQ ID NO:16。
图4.PTEN-long存在的证据。A）使用两种不同PTEN抗体对不同细胞系进行的调查。MCF10A和HEK293是PTEN的野生型。BT549和HCC1937是剔除PTEN的并且ZR-75-1在PTEN中有突变（L136）；B）使用PTEN的单克隆抗体对不同细胞系进行的进一步调查，所述单克隆抗体识别PTEN和PTEN-Long；C）Wt ES细胞表达大量的PTEN-Long。PTEN-Long在这些细胞中对稳定的PTEN shRNA表达敏感并且在PTEN基因剔除细胞中完全不存在。大部分的pAkt水平逆向地追随PTEN水平；D）PTEN siRNA在HEK293细胞中使PTEN和PTEN-Long的基因表达阻断（knockdown）。E）在剔除PTEN的PC3细胞系中质粒的外源表达。PTENorf从起始密码子AUG开始仅仅编码ORF（泳道2）。ATR（ATR=替代性翻译的区域）的添加能够微弱地翻译PTEN-Long（泳道3）。上游起始部位突变为ATG使蛋白质的补体转变成为完整的PTEN-Long（泳道5和6）。ATG起始密码子突变为ATA消除了55kDa色带(泳道4和6)。E）抗体增加到由5'ATR编码的氨基酸并且用于来自HEK293的细胞溶解产物以及剔除PTEN的U87细胞系中，所述细胞系过度表达PTENorf或编码5'ATR的质粒（ATG/ATG）。PTEN-Long在只过度表达5'ATR的细胞中可见。在U87细胞中观察到的背景色带出现在墨点的底部。
图5.信号肽预测。翻译PTEN 5'UTR序列并且输入到SignalIP3.0中。真核信号肽的隐马尔可夫模型（hidden markov model）用于预测。N区域表示信号肽的带正电荷的N末端序列。H区域是信号肽的疏水性核心。C区域是由脯氨酸标记的略带极性的区域，所述脯氨酸常破坏疏水性核心的螺旋结构。裂解可能性可预测释放信号肽的裂解部位，从而允许蛋白质释放到ER的内腔中（达尔贝（Dalbey）和海涅（Heijne）2002）。预测裂解在位置21处发生。所示序列是SEQ ID NO:17。
图6.伴刀豆球蛋白A（Concanavalin A）下拉。溶解HEK293细胞并且使用伴刀豆球蛋白琼脂糖来下拉糖基化蛋白。由SDS-PAGE解析洗脱液并且进行免疫墨点点渍而用于PTEN（6H2.1）分析。在下拉/输入中可观察到PTEN-long的富集。注意较长PTEN色带的富集。PTEN具有多个潜在的O-糖基化部位，但是只有一个N-糖基化部位。我们使用植物凝集素伴刀豆球蛋白A，其在下拉分析法中结合糖部分，以判定HEK293细胞中PTEN补体的一部分是否被糖基化。我们能够纯化PTEN的混合物，所述混合物有约50%的PTEN-long，PTEN-long的大量增浓超过正常PTEN。这显示了PTEN-Long被糖基化并且细胞质的55kDa形式的PTEN被糖基化或PTEN-Long在细胞外裂解。
图7.PTEN和PTEN-P结合类肝素。使小鼠的肝脏提取物穿过1ml HiTrap肝素琼脂糖（安玛西亚（Amersham））柱。用500mM NaCl洗涤所述柱，并且用1M NaCl的连续柱体积洗脱蛋白质。通过使用PTEN单克隆抗体针对PTEN进行SDS-PAGE来分析洗脱份（fraction）。先前已显示，PTEN对于带较高负电荷的物质具有亲和力，PTEN的这种特性使它偏好高度阴离子性的PtdIns(3,4,5)P3（达斯（Das）,狄克逊（Dixon）等人2003）。由于类肝素是带最大负电荷的生物分子之一，因此我们假设类肝素实际上介导PTEN与细胞外基质的结合。使用来自小鼠肝脏的蛋白质提取物，我们发现PTEN以高亲和力结合类肝素。此外，使用1M NaCl对来自肝素琼脂糖柱的PTEN进行连续洗脱，也洗脱PTEN-long。
图8.蛋白酶保护分析法。使HEK293细胞再悬浮于渐增浓度的蛋白酶K中。将最终浓度为0.2%的曲拉通（Triton）加入含有最高浓度的蛋白酶K的反应物中。用PMSF使反应停止，且在拉米利缓冲液（laemlli buffer）中制得细胞溶解产物。在8%聚丙烯酰胺凝胶上由SDS-PAGE解析溶解产物并且进行免疫墨点点渍而用于PTEN（6H2.1）、AKT、E-钙粘蛋白（E-cadherin）分析。PTEN免疫墨点的较大色带指定为PTEN-long。这些数据显示E-钙粘蛋白和PTEN-long主要在细胞表面上。
图9.来自条件培养基的肝素亲和纯化的PTEN和PTEN-long的高盐洗脱。可在条件培养基的亲和纯化之后，从HiTrap肝素（安玛西亚（Amersham））柱洗脱PTEN和PTEN-long。针对PTEN尾的单克隆抗体（如上）和对5'ATR中翻译的氨基酸具特异性的抗体都识别质量约为55KDa的蛋白质色带。
图10.来自人类血清的PTEN的纯化。用蛋白质A/G预先清除来自AB血液的人类血清的抗体并且对其进行肝素琼脂糖处理。由SDS-PAGE解析洗脱液并且进行免疫墨点点渍而用于PTEN分析或单独进行二次处理以控制重链污染。
图11A-11C.PTEN-long的抗血管生成活性。（A）在发育中的视网膜中在血管和毛细管的子组中表达PTEN-long。这种表达模式与典型形式的PTEN的表达模式形成鲜明对比，并且与在这些区域中发生的PTEN-long诱导血管退化的作用一致。当此血管退化过程按照右上方的全部视网膜溶解产物的西方墨点分析(western blot)由高氧诱导(B），以及通过在低氧条件下内皮细胞中PTEN-long的损失诱导（C）时，这种相关性由PTEN-long的标记上调而加强。这些发现指示PTEN-long例如在糖尿病性视网膜病变以及过度增生性血管病症中作为抗血管生成疗法的适用性。箭头指示CD34和PTEN-long阳性组织（血管）。
图12.PTEN-Long的促细胞凋亡活性。在MCF-10A乳腺上皮细胞中诱导细胞凋亡，如所指示，用纯化的PTEN-long处理所述细胞24小时。卡斯蛋白酶3（caspase 3）裂解指示细胞凋亡活性。
图13.用PTEN-Long处理小鼠。经过PTEN-long或空载体对照处理十天，由测径器测量而测定的肿瘤尺寸的图。在pcDNA3.1His V5载体中用ATG/ATG PTEN-long转染293细胞。在转染后48小时制成细胞质的溶解产物并且穿过V5抗体珠粒且用V5肽洗脱。下文显示V5珠粒纯化洗脱液的西方墨点分析。初始观察PTEN-long可用于治疗肿瘤。使用注射到scid小鼠的乳腺脂肪垫中的U87成胶质细胞瘤细胞（1百万个）来形成异种移植物。在移植后约两周起始处理。
图14.用PTEN-Long处理小鼠的结果。图显示了用对照和PTEN-long注射液处理14天的小鼠的存活分数（以天计）。
图15.将PTEN（缺乏5'UTR的PTENorf）、PTEN-long以及在氨基酸305处具有G-R突变（类似于PTENorf中的G129R突变）的PTEN-long的指定构建体转染到293细胞中。使用来自这些细胞的纯化蛋白质，显示了PTEN-long是活性磷酸酶并且PTEN-longG305R突变体（在PTEN中是G129R）降低磷酸酶活性。
图16.磷酸酶活性为PTEN-long活性所必需，这在使用PTEN-long(G305R)突变体的实验中有显示。基于PTEN文献，可知在C2结构域内部形成的截断使蛋白质不稳定；且基于PTEN晶体结构，可相信C2结构域与磷酸酶结构域之间的相互作用对磷酸酶活性至关重要。因此，在C末端针对PTEN-long活性的最小结构域需要C2结构域，但不需要尾。在N末端预测的裂解部位在氨基酸21处，且因此蛋白质的功能区域在此区域内。就此而言，重要的是应注意当用PTEN或用PTEN-long平行处理U87肿瘤时，PTEN处理观察不到显著效果，只有PTEN-long处理才观察到。
图17.在具有His和V5标签的pcDNA3.1表达载体中用ATG/ATG-PTEN long转染的293细胞的PTEN-long的纯化。在Ni+柱洗脱之后，在凝胶过滤柱中解析洗脱液。OD280用蓝线显示。在洗脱份7-18中增浓PTEN-long。此实验的产量大约是1mg。箭头指示PTEN-long和改变的迁移中的PTEN-long产物。
图18A-18B.（A）使用细胞死亡作为读出结果而显示的LNCaP前列腺癌细胞对PTEN-long纯化的蛋白质的剂量反应（蛋白质由ARVYS纯化）。1×等于每毫升0.33微克。在不含生长因子的培养基中处理细胞。24小时后，用无血清培养基洗涤细胞并且溶解于拉米利样品缓冲液中。对指定蛋白质进行西方墨点分析。（B）用PTEN-long、PTEN-long(G305R)或空白对照（Mock control）处理的U87成胶质细胞瘤细胞显示了诱导细胞凋亡，如PARP的裂解以及丝氨酸473处pAKT信号的下调所指示。这些数据进一步确认PTEN-long可诱导细胞凋亡并且减少PI3K/AKT信号传导。
图19A-19C.AKTA纯化的PTEN-long蛋白能够经五天的时段减小肿瘤尺寸，如通过使用测径器以及使用与精诺真（xenogen）动物活体成像系统相结合的荧光素酶指示器所测量。每天给予小鼠约0.05mg PTEN-long，持续5天。使用注射到乳腺脂肪垫中的1百万个U87成胶质细胞瘤细胞来形成异种移植物，所述细胞由于经FUW-荧光素酶-neo感染而表达荧光素酶。在用精诺真成像系统成像前10分钟，向小鼠腹膜内注射荧光素。（A）在处理前（左图）和处理第五天（右图）对4只小鼠进行荧光素酶测量。（B）在处理前和5天处理期间用测径器测量，以cm2为单位。（C）由精诺真系统检测光子，如图中所成像。显示群组中四只小鼠的标准误差。对第0天到第5天检测的光子进行史都登氏t检验（Student t-test）。
图20.在一项独立实验中，在用PTEN（orf-403氨基酸；n=5）、PTEN-long（G305R；n=5）或野生型PTEN-long（n=4）处理之前，使U87肿瘤生长到1.5cm2。在5天处理之后，平均变化发光对PTEN-long处理的小鼠而言显示显著减少，但对PTEN或PTEN-long(G305R)处理的群组而言没有减少。发光减少与肿瘤尺寸减小相关联。这些数据显示PTEN-long需要5'ATR和磷酸酶活性来发挥功能。
图21A-21C.PTEN-long处理的U87异种移植物的分析显示激活细胞凋亡和抑制PI3K信号传导。如上所述，处理肿瘤5天。（A）在5天指定处理之后收集野生型PTEN-long和G305R处理的肿瘤并且溶解用于西方分析。PTEN-long的野生型蛋白质能够减少FOXO和AKT的磷酸化并且激活卡斯蛋白酶3的裂解。（B）将如所指示处理5天的代表性肿瘤固定于福尔马林（formalin）和包埋的石蜡中。将切片针对抗体进行染色，所述抗体检测裂解的卡斯蛋白酶3，即细胞凋亡标记物。PTEN-long处理的细胞的凋亡细胞百分比有显著增长，P=0.0419，史都登氏t检验。（C）裂解的卡斯蛋白酶3染色的代表性图像。
图22A-22B.在用PTEN-long处理5天的相同肿瘤中，血管数目大大减少。在5天指定处理之后收集野生型PTEN-long和G305R处理的肿瘤并且固定于福尔马林和包埋的石蜡中。将切片针对抗体进行染色，所述抗体检测CD31，即作为血管内衬的内皮细胞的标记物。（A）PTEN-long处理的细胞的每个视场（40×物镜）的血管数目有显著减少，P=0.007579，史都登氏t检验。（B）CD31染色的代表性图像。
图23A-23B.在6个组（每组n=3）中形成U87异种移植物，并且通过肌肉内（IM）、腹膜内（IP）、肿瘤内（IT）、皮下（SC）、静脉内（IV）注射而用PTEN-long处理4天。（A）由测径器测量从第0天到第4天肿瘤尺寸（CM2）的平均变化。（B）右侧显示精诺真成像的代表性图像。由此数据我们可以得出结论，与未经处理的小鼠相比，所有注射方法都引起肿瘤生长，并且只有IM处理的群组显示退化量显著减少。
图24A-24C.对来自乳房、大脑和前列腺的6个细胞系进行异种移植实验。以上是在4个乳癌细胞系中绘制的变化（A、B和D）。经过指定天数的处理，由测径器测量的肿瘤表面积(cm2)的图。（C）在只处理24小时之后即可看到HCT-1143细胞中的变化。在所有四个细胞系中，处理后肿瘤尺寸有明显减小。
图25.PTEN-long与细胞结合。将PTEN-long蛋白加入冰上的U87细胞培养基中持续10分钟，固定，随后用识别其的抗体染色用于PTEN-long分析。
图26.迈尔斯分析法（Miles Assay）：由PTEN-long抑制血管渗透性的诱导。这种抑制可通过预先培育纯化蛋白与PTEN抗体（6H2.1）而逆转。PTEN-long能够通过VEGF来抑制血管渗透性的诱导。这种诱导可通过预先培育PTEN-long与针对PTEN产生的抗体（但不是对照IgG）来恢复。
图27.在起始的白氨酸(L)突变为甲硫氨酸(M)以产生更有效翻译的形式之后，PTEN-Long的576氨基酸阅读框架（单字母编码）（SEQ ID NO:5）。起初描述的PTEN的403氨基酸阅读框架从加下划线的密码子起始。
图28.用于在细菌中表达的PTEN-long的MSES型式（SEQ ID NO:6），其中前21个氨基酸已被移除。C末端的V5-His抗原决定基标签(SEQ 10NO:7)与C末端融合（斜体）。精氨酸（R）系列和153氨基酸PTEN-Long前导序列的最后一个氨基酸加下划线。
图29.细胞质（C）和细胞核（N）部分的西方墨点分析指示MSES PTEN-long进入细胞的两个区室中。BAF180和微管蛋白的抗体用于控制细胞分部分离。V5抗原决定基用于测量所有PTEN构建体的进入。PTEN-long抗体用于测量PTEN long的进入和R6的缺失。
图30.PL-p53的产生。称为PL的PTEN long MSES 153氨基酸前导序列（加下划线）与人类p53393氨基酸序列（单字母编码）(SEQ ID NO:8)融合。添加V5HIS抗原决定基标签（斜体）(SEQ ID NO:7)到p53的C末端。
图31A-31D.PL-p53进入细胞核中并且抑制肿瘤生长。将PL-p53加入MDA-MB-468和H1299细胞的培养基中(1mg/ml)，从而被细胞核吸收（图31A和31B）。用染色质重塑因子BAF180和细胞质因子微管蛋白的抗体来监控细胞核（N）和细胞质（C）的分离。对于MDA-MB468细胞，p53抗体检测空白处理的样品中的内生突变体p53，所述内生突变体p53在处理的样品中增加。对于H1299细胞，只有在处理的样品中才看到与PL-p53融合的V5抗原决定基。相对于空白处理的RFP对照，用0.05毫克/天处理MDA-MB-468细胞10天显著减少肿瘤生长（图31C）。随着时间将PL-p53加入H1299细胞中显示在随后的时间点PUMA和p21的快速吸收和诱导（图32D）。
图32.用细菌表达的MSES PTEN-Long(Long)、RFP(红色荧光蛋白空白对照)、IgG对照以及阻断吸收到细胞中的抗PTEN抗体138G6处理的小鼠的葡萄糖耐量测试。
具体实施方式
一种组合物，其包含：（i）肽，包含SEQ ID NO:1中所述序列的连续氨基酸残基22-173，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分，用于穿过生物膜而运送货物分子，和（ii）货物分子，其中所述货物分子不是包含具有SEQ ID NO:4中所述序列的氨基酸残基的肽。
在一项实施例中，所述肽共价地连接到所述货物分子上。在一项实施例中，所述肽通过二硫键而共价地连接到所述货物分子上。在一项实施例中，所述肽非共价地连接到所述货物分子上。
在一项实施例中，货物分子是肽、多肽、蛋白质、纳米颗粒、脂质体、噬菌体、病毒载体、质粒DNA、核酸、肽核酸或吗啉代化合物。在一项实施例中，货物分子是肽、多肽或蛋白质并且其中用于运送货物分子的肽通过肽键而共价地连接到所述货物分子上。在一项实施例中，货物分子是核酸并且是DNA。在一项实施例中，货物分子是核酸并且是RNA。在一项实施例中，货物分子是核酸并且是siRNA或反义寡核苷酸。在一项实施例中，货物分子是核酸并且编码人类p53蛋白。在一项实施例中，货物分子是核酸并且编码肿瘤抑制蛋白。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p16。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARF。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是VHL。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是SMAD4。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARID1A。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BAF180。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA1。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA2。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是RB。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是LKB1。在一项实施例中，货物分子是蛋白质并且是人类p53蛋白。在一项实施例中，货物分子是蛋白质并且是肿瘤抑制蛋白。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p16。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARF。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是VHL。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是SMAD4。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARID1A。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BAF180。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA1。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA2。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是RB。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是LKB1。在一项实施例中，货物分子是蛋白质并且是酶。在一项实施例中，所述酶是代谢酶。在一项实施例中，货物分子是多肽或蛋白质并且是抗原。在一项实施例中，货物分子是肉毒杆菌毒素或其片段。在一项实施例中，货物分子是BCL2或硫氧还蛋白。
在一项实施例中，货物分子是诊断剂。在一项实施例中，所述诊断剂是不透辐射的造影剂、顺磁性造影剂、超顺磁性造影剂、荧光团或计算机断层摄影术造影剂。
在一项实施例中，货物分子是治疗剂。在一项实施例中，所述治疗剂是生物活性小分子。在一项实施例中，所述治疗剂是细胞毒性分子或化学治疗剂或放射治疗剂。
在一项实施例中，货物分子通过聚合连接子而连接到用于运送的所述肽上。在一项实施例中，所述聚合连接子是聚乙二醇。
在一项实施例中，货物分子是核酸。在一项实施例中，货物分子是蛋白质并且具有高达160kDa的分子量。
在一项实施例中，包含具有SEQ ID NO:1中所述序列的连续氨基酸残基的肽经过衍生化，所述肽用于穿过生物膜而运送货物分子。在一项实施例中，所述肽包含具有SEQID NO:1中所述序列的连续氨基酸残基。
在一项实施例中，组合物包含具有SEQ ID NO:8中所述序列的连续氨基酸残基。
一种将货物分子递送到细胞中的方法，其包括使所述细胞与组合物接触，所述组合物包含：（i）肽，包含SEQ ID NO:1中所述序列的连续氨基酸残基22-173，或SEQ ID NO:1中所述氨基酸残基的一部分，用于穿过生物膜而运送货物分子，和（ii）货物分子，其中所述货物分子不是包含具有SEQ ID NO:4中所述序列的氨基酸残基的肽，所述接触在允许货物分子进入细胞中的条件下进行。
在一项实施例中，所述肽共价地连接到所述货物分子上。在一项实施例中，所述肽通过肽键而共价地连接到所述货物分子上。在一项实施例中，所述肽通过二硫键而共价地连接到所述货物分子上。在一项实施例中，所述肽非共价地连接到所述货物分子上。
在一项实施例中，货物分子是肽、多肽、蛋白质、纳米颗粒、脂质体、噬菌体、病毒载体、质粒DNA、核酸、肽核酸或吗啉代化合物。在一项实施例中，货物分子是肽、多肽或蛋白质并且其中用于运送货物分子的肽通过肽键而共价地连接到所述货物分子上。在一项实施例中，货物分子是核酸并且是DNA。在一项实施例中，货物分子是核酸并且是RNA。在一项实施例中，货物分子是核酸并且是siRNA或反义寡核苷酸。在一项实施例中，货物分子是核酸并且编码人类p53蛋白。在一项实施例中，货物分子是核酸并且编码肿瘤抑制蛋白。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p16。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARF。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是VHL。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是SMAD4。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARID1A。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BAF180。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA1。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA2。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是RB。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是LKB1。在一项实施例中，货物分子是蛋白质并且是人类p53蛋白。在一项实施例中，货物分子是蛋白质并且是酶。在一项实施例中，所述酶是代谢酶。在一项实施例中，货物分子是蛋白质并且是肿瘤抑制蛋白。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p16。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARF。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是VHL。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是SMAD4。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARID1A。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BAF180。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA1。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA2。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是RB。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是LKB1。在一项实施例中，货物分子是多肽或蛋白质并且是抗原。在一项实施例中，货物分子是肉毒杆菌毒素或其片段。在一项实施例中，货物分子是BCL2。在一项实施例中，货物分子是硫氧还蛋白。
在一项实施例中，货物分子是诊断剂。在一项实施例中，所述诊断剂是不透辐射的造影剂、顺磁性造影剂、超顺磁性造影剂、荧光团或计算机断层摄影术造影剂。
在一项实施例中，货物分子是治疗剂。在一项实施例中，所述治疗剂是生物活性小分子。在一项实施例中，所述治疗剂是细胞毒性分子或化学治疗剂或放射治疗剂。
在一项实施例中，所述肽包含具有SEQ ID NO:1中所述序列的连续氨基酸残基。在一项实施例中，所述细胞是肿瘤细胞。在一项实施例中，所述细胞是在人类个体中。
在一项实施例中，组合物包含具有SEQ ID NO:8中所述序列的连续氨基酸残基。
一种治疗个体的肿瘤的方法，其包括给予所述个体一定量的组合物，所述组合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分，所述肽结合到货物分子上，其中所述货物分子不是包含具有SEQ IDNO:4中所述序列的氨基酸残基的肽，所述货物分子的量能有效地治疗所述个体的肿瘤。
一种组合物，其包含肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173，或SEQ IDNO:1的氨基酸残基22-173的一部分，所述肽结合到货物分子上，所述货物分子用于治疗个体的肿瘤，其中所述货物分子不是包含具有SEQ ID NO:4中所述序列的氨基酸残基的肽，所述货物分子的量能有效地治疗所述个体的肿瘤。
在一项实施例中，货物分子是肿瘤抑制蛋白。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p53。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p16。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARF。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是VHL。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是SMAD4。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARID1A。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BAF180。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA1。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA2。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是RB。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是LKB1。
在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p53并且组合物包含连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO:8中所述。
在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽共价地连接到货物分子上。在一项实施例中，包含SEQ IDNO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽通过肽键而共价地连接到货物分子上。在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽通过二硫键而共价地连接到货物分子上。
在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽非共价地连接到货物分子上。
一种治疗个体的癌症的方法，其包括给予所述个体一定量的组合物，所述组合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分，所述肽结合到货物分子上，其中所述货物分子不是包含具有SEQ IDNO:4中所述序列的氨基酸残基的肽，所述货物分子的量能有效地治疗所述个体的癌症。
一种组合物，其包含肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173，或SEQ IDNO:1的氨基酸残基22-173的一部分，所述肽结合到货物分子上，所述货物分子用于治疗个体的癌症，其中所述货物分子不是包含具有SEQ ID NO:4中所述序列的氨基酸残基的肽，所述货物分子的量能有效地治疗所述个体的肿瘤。
在一项实施例中，货物分子是肿瘤抑制蛋白。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p53。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p16。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARF。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是VHL。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是SMAD4。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARID1A。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BAF180。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA1。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA2。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是RB。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是LKB1。
在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p53并且组合物包含连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO:8中所述。
在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽共价地连接到货物分子上。在一项实施例中，包含SEQ IDNO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽通过肽键而共价地连接到货物分子上。在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽通过二硫键而共价地连接到货物分子上。
在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽非共价地连接到货物分子上。
一种治疗个体的代谢障碍的方法，其中所述代谢障碍的特征在于代谢酶缺乏，所述方法包括给予所述个体一定量的组合物，所述组合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分，所述肽结合到所述代谢酶上，所述代谢酶的量能有效地治疗所述个体的代谢障碍。
一种组合物，其包含肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173，或SEQ IDNO:1的氨基酸残基22-173的一部分，所述肽结合到代谢酶上，所述代谢酶用于治疗个体的代谢障碍，其中所述代谢障碍的特征在于代谢酶缺乏。
在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽共价地连接到代谢酶上。在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽通过肽键而共价地连接到代谢酶上。在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽通过二硫键而共价地连接到代谢酶上。
在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽非共价地连接到代谢酶上。
一种治疗个体的糖尿病的方法，其包括给予所述个体一定量的组合物，所述组合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分，所述肽结合到货物分子上，所述货物分子的量能有效地治疗所述个体的糖尿病。
一种组合物，其包含肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173，或SEQ IDNO:1的氨基酸残基22-173的一部分，所述肽结合到货物分子上，所述货物分子用于治疗个体的糖尿病。
在一项实施例中，货物分子是肽、多肽、蛋白质、纳米颗粒、脂质体、噬菌体、病毒载体、质粒DNA、核酸、肽核酸或吗啉代化合物。
在一项实施例中，货物分子是肽，所述肽包含具有SEQ ID NO:4中所述序列的氨基酸残基。在一项实施例中，组合物包含连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO:6中所述。
在一项实施例中，货物分子是蛋白质并且所述蛋白质是肿瘤抑制蛋白。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p53。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p16。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARF。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是VHL。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是SMAD4。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARID1A。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BAF180。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA1。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA2。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是RB。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是LKB1。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p53并且组合物包含连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO:8中所述。
在一项实施例中，货物分子是BCL2。在一项实施例中，货物分子是硫氧还蛋白。
在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽共价地连接到货物分子上。在一项实施例中，包含SEQ IDNO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽通过肽键而共价地连接到货物分子上。在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽通过二硫键而共价地连接到货物分子上。
在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽非共价地连接到货物分子上。
一种治疗个体的心血管疾病的方法，其包括给予所述个体一定量的组合物，所述组合物包含肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分，所述肽结合到货物分子上，所述货物分子的量能有效地治疗所述个体的心血管疾病。
一种组合物，其包含肽，所述肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173，或SEQ IDNO:1的氨基酸残基22-173的一部分，所述肽结合到货物分子上，所述货物分子用于治疗个体的心血管疾病。
在一项实施例中，货物分子是肽、多肽、蛋白质、纳米颗粒、脂质体、噬菌体、病毒载体、质粒DNA、核酸、肽核酸或吗啉代化合物。
在一项实施例中，货物分子是肽，所述肽包含具有SEQ ID NO:4中所述序列的氨基酸残基。在一项实施例中，组合物包含连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO:6中所述。
在一项实施例中，货物分子是蛋白质并且所述蛋白质是肿瘤抑制蛋白。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p53。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p16。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARF。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是VHL。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是SMAD4。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是ARID1A。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BAF180。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA1。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是BRCA2。
在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是RB。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是LKB1。在一项实施例中，肿瘤抑制蛋白是p53并且组合物包含连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO:8中所述。
在一项实施例中，货物分子是BCL2。在一项实施例中，货物分子是硫氧还蛋白。
在一项实施例中，心血管疾病从动脉硬化、动脉粥样硬化、心肌病、冠状动脉疾病、末梢血管病、充血性心力衰竭、心肌梗死和局部缺血/再灌注损伤组成的组中选择。在一项实施例中，心血管疾病是动脉粥样硬化。
在一项实施例中，心血管疾病是心肌梗死。在一项实施例中，心血管疾病是心肌梗死并且在心肌梗死期间给予组合物。在一项实施例中，组合物以可有效地防止细胞死亡的量给予。
在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽共价地连接到货物分子上。在一项实施例中，包含SEQ IDNO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸22-173的一部分的肽通过肽键而共价地连接到货物分子上。在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽通过二硫键而共价地连接到货物分子上。
在一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173或SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-173的一部分的肽非共价地连接到货物分子上。
如本文所使用的“用于运送货物分子”的肽是充当细胞穿透肽的肽，即，介导连接到那里（“货物分子”）的分子穿过生物膜而运送的肽。
如本文所使用的“货物分子”是穿过生物膜而运送的相关分子，例如，从细胞外空间运送到细胞内空间，所述货物分子共价地或非共价地连接到本文所描述的运送肽中的一个。在货物分子是肽、多肽或蛋白质的实施例中，运送肽可通过肽键而共价地连接到所述货物分子上，从而形成融合蛋白。特定而言，SEQ ID NO:4中所述的PTEN多肽从货物分子的定义中排除。
如本文所使用的“siRNA”是双链（ds）RNA，通常约19-25个核苷酸的长度，通常在每个末端具有3'突出物（overhang）（2个核苷酸）。一种将siRNA共价地连接到用于运送货物分子的肽上的方法是通过在siRNA有义链的5'末端处的二硫键来完成。
如本文所使用的“心血管疾病”意谓影响哺乳动物心脏和/或心脏供血和/或其他血管组分的正常生理功能的病理状态，包括动脉硬化、动脉粥样硬化、心肌病、冠状动脉疾病、末梢血管病、充血性心力衰竭、心肌梗死和局部缺血/再灌注损伤。
如本文所使用的“化学治疗剂”是在所属领域中用于治疗癌症的烷化剂、抗代谢物、蒽环类药物（anthracycline）、植物碱、拓扑异构酶抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂。
如本文所使用的“放射治疗剂”是在所属领域中用于治疗癌症的放射性同位素。
如本文所使用的“小分子”是低分子量有机化合物，所述化合物不是聚合物并且具有小于1KDa并且更通常是小于800Da的分子量。
在实施例中，肿瘤是癌细胞。在其他实施例中，癌细胞是个体的神经胶质细胞、前列腺、卵巢、子宫、子宫内膜、乳房、黑素细胞、肾、肺、结肠、头、颈或胰脏的肿瘤。
在一项实施例中，货物分子是肿瘤抑制蛋白。如本文所使用的“肿瘤抑制蛋白”是由肿瘤抑制基因编码的蛋白质，所述蛋白质对细胞周期的调节具有阻抑或抑制效果或促进细胞凋亡，或者有时两种都有。肿瘤抑制蛋白的非限制性实例包括p53、p16、ARF、VHL、SMAD4、ARID1A、BAF180、BRCA1、BRCA2、RB和LKB1。
在一项实施例中，货物分子是p53蛋白或编码p53的核酸（TP53肿瘤蛋白p53，智人-安卓基因（Entrez Gene），基因ID：7157）或其活性片段，或其单核苷酸多形体或其片段。
本文所描述的用于运送货物分子的肽序列就属性而言是细胞穿透肽，但是细胞穿透肽通常具有30个或少于30个氨基酸。使用细胞穿透肽将RNA（包括siRNA）递送到细胞中在马度帕拉（Mathupala）等人,治疗专利专家观点（Expert Opin Ther Pat.）2009年2月;19(2):137-140中有描述，所述文献以全文引用的方式并入本文中。使用细胞穿透肽递送疫苗在布鲁克（Brook）等人,生物化学与生物物理学报（Biochim Biophys Acta.）2010年1月;1805(1):25-34中有描述，所述文献以全文引用的方式并入本文中。纳米颗粒、脂质体和其他纳米载体的递送在朱利安娜（Juliano）等人,纳米医学与纳米生物技术的威利跨学科评论（Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol.）2009年5月;1(3):324-35中有描述，所述文献以全文引用的方式并入本文中。使用细胞穿透肽递送化学治疗剂和抗癌剂在巴特勒（Bitler）等人,抗癌药物发明的最新专利（Recent PatAnticancer Drug Discov.）2009年12月2日,Epub中有描述，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
“治疗”障碍或疾病应意谓减慢、停止或逆转障碍的进程和/或改善、减轻或移除障碍的症状。因此，治疗障碍涵盖了逆转障碍的进程，包括直到障碍本身消除的点。
在本文所描述的方法的一项实施例中，所述方法用于将预防有效量的货物分子递送给个体。如本文所使用的物质的“预防有效”量是有效预防或推迟所述物质所给予的个体的指定病理学病状发作的量。在本文所描述的方法的一项实施例中，所述方法用于将治疗有效量的货物分子递送给个体。如本文所使用的物质的“治疗有效”量是有效治疗、改善或减轻所述物质所给予的患病个体的指定病理学病状的症状或病因的量。
在一项实施例中，治疗或预防有效量是从每次给药约1毫克药剂/个体到约1克药剂/个体。在另一实施例中，治疗或预防有效量是从约10毫克药剂/个体到500毫克药剂/个体。在另一实施例中，治疗或预防有效量是从约50毫克药剂/个体到200毫克药剂/个体。在另一实施例中，治疗或预防有效量是约100毫克药剂/个体。在另一实施例中，治疗或预防有效量从50毫克药剂/个体、100毫克药剂/个体、150毫克药剂/个体、200毫克药剂/个体、250毫克药剂/个体、300毫克药剂/个体、400毫克药剂/个体和500毫克药剂/个体中选择。
在本文所描述的方法的一项实施例中，使用所属领域中的技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种来给予个体包含肽和货物分子的组合物。举例来说，可以静脉内、经口、经鼻、腹膜内、通过脑脊髓液、通过移植物、经粘膜、经皮、肌肉内、血管内、动脉内、冠状动脉内、心肌内或皮下给药。
在本文所描述的方法的一项实施例中，组合物通过直接引入肿瘤中而给予个体。在本文所描述的方法的一项实施例中，将组合物注射到实体肿瘤中。在本文所描述的方法的一项实施例中，组合物通过导管而直接引入肿瘤中。在本文所描述的方法的一项实施例中，组合物通过直接引入供给肿瘤的血管中而给予个体。在本文所描述的方法的一项实施例中，将组合物注射到供给肿瘤的血管中。在本文所描述的方法的一项实施例中，组合物通过导管而直接引入供给肿瘤的血管中。在本文所描述的方法的一项实施例中，将组合物静脉内给予个体。在本文所描述的方法的一项实施例中，将组合物皮下给予个体。
术语PTEN指代由SEQ ID NO:4定义的多肽。
PTEN-long有时另外称为PTEN-beta、PTEN-β、PTEN-S。
用于本文所描述的组合物的可注射药物递送系统包括溶液、悬浮液、凝胶、微球体和聚合可注射液，并且可包含赋形剂，如改变溶解度的试剂（例如乙醇、丙二醇和蔗糖）和聚合物（例如聚己内酯和PLGA）。可植入系统包括杆状物和盘状物，并且可含有赋形剂，如非限制性实例PLGA和聚己内酯。
用于本发明组合物的口服递送系统包括药片和胶囊。这些系统可含有赋形剂，如粘合剂（例如羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、其他纤维素材料和淀粉）、稀释剂（例如乳糖和其他糖、淀粉、磷酸二钙和纤维素材料）、崩解剂（例如淀粉聚合物和纤维素材料）以及润滑剂（例如硬脂酸盐和滑石）。
用于本发明组合物的经粘膜递送系统包括贴片、药片、栓剂、子宫环、凝胶和乳膏，并且可含有赋形剂，如增溶剂和增强剂（例如丙二醇、胆汁盐和氨基酸）以及其他媒剂（例如聚乙二醇、脂肪酸酯和衍生物，以及亲水性聚合物，如羟丙基甲基纤维素和透明质酸）。
举例来说，用于本发明组合物的经皮递送系统包括水性和非水性凝胶、乳膏、多重乳液、微乳液、脂质体、软膏、水性和非水性溶液、洗剂、气雾剂、烃类基质和粉末，并且可含有赋形剂，如增溶剂、渗透增强剂（例如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸）以及亲水性聚合物（如聚卡波菲（polycarbophil）和聚乙烯吡咯烷酮）。在一项实施例中，医药学上可接受的载剂是脂质体或经皮增强剂。
用于本发明组合物的可重构递送系统的溶液、悬浮液和粉末包括媒剂，如悬浮剂（例如胶、黄原胶（zanthan）、纤维素和糖）、保湿剂（例如山梨糖醇）、增溶剂（例如乙醇、水、PEG和丙二醇）、表面活性剂（例如月桂基硫酸钠、斯潘（Span）、吐温（Tween）和十六烷基吡啶）、防腐剂和抗氧化剂（例如对羟基苯甲酸酯、维生素E和C以及抗坏血酸）、防结块剂、涂布剂以及螯合剂（例如EDTA）。
如本文所使用的“5'ATR”是5'替代性翻译的区域，如下文实验部分中所描述。
在一项实施例中，本文所描述的组合物另外包含医药载剂。如本文所使用的“医药载剂”是医药学上可接受的溶剂、悬浮剂或媒剂，用于将本发明组合物递送给动物或人类。载剂可以是液体、气雾剂、凝胶或固体并且按脑中所计划的给药方式来选择。
在本文所描述的方法的一项实施例中，细胞是肿瘤细胞并且是实体肿瘤细胞。如本文所使用的“实体肿瘤”包括癌性和非癌性实体肿瘤。癌性实体肿瘤包括（但不限于）胆道癌；脑癌，包括成胶质细胞瘤和成髓细胞瘤；乳癌；子宫颈癌；绒膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内赘瘤，包括鲍温氏病（Bowen's disease）和帕哲氏病（Paget's disease）；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏病（Hodgkin's disease）和淋巴细胞性淋巴瘤；成神经细胞瘤；口腔癌，包括鳞状细胞癌；卵巢癌，包括由上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间质细胞产生的卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；结肠直肠癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤；皮肤癌，包括黑素瘤、卡波西氏肉瘤（Kaposi's sarcoma）、基底細胞癌和鳞状细胞癌；睾丸癌，包括胚组织肿瘤（精原细胞瘤、非精原细胞瘤[畸胎瘤、绒膜癌]）、基质肿瘤和生殖细胞肿瘤；甲状腺癌，包括甲状腺腺癌和髓质癌；以及肾癌，包括腺癌和威尔氏肿瘤（Wilms tumor）；但不包括非实体组织的肿瘤，如白血病和其他血液科赘瘤，包括急性淋巴细胞性白血病和骨髓性白血病；多发性骨髓瘤；AIDS相关白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤。
序列表的SEQ ID NO:1是PTEN-long蛋白的前导序列和信号序列（残基1-21）。
序列表的SEQ ID NO:2是PTEN-long蛋白的前导序列和信号序列(残基1-21）的类似物。在本文所描述的方法和组合物的任一实施例中，可使用SEQ ID NO:2在叙述SEQID NO:1的地方代替SEQ ID NO:1。
SED ID NO:3是PTEN-long上的抗原决定基。
SEQ ID NO:4是PTEN（即，不是PTEN-long）的多肽。
SED ID NO:6是MSES PTEN-long。
SEQ ID NO:8是PTEN-long-p53融合蛋白。在本文所描述的方法和组合物的任一实施例中，可使用SEQ ID NO:8的氨基酸1-153在叙述SEQ ID NO:1的地方代替SEQ IDNO:1。
在以上描述的任一方法的一项实施例中，包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-173或SEQID NO:1的一部分的肽是包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-173的一部分的肽，所述肽保留穿过生物膜而运送货物分子的能力。
当本说明书中提供范围时，应了解，所述范围包括在那个范围内的所有整数和0.1个单位，以及其任何子范围。举例来说，范围77%到90%包括77.0%、77.1%、77.2%、77.3%、77.4%、77.5%、77.6%、77.7%、77.8%、77.9%、80.0%、80.1%、80.2%、80.3%、80.4%、80.5%、80.6%、80.7%、80.8%、80.9%和90.0%，以及范围80%到81.5%等。
本文所描述的各种要素的所有组合都在本发明的范围内。
参考以下实验详情来更好地理解本发明，但所属领域中的技术人员将容易认识到，详细描述的具体实验只是用来说明如上文的权利要求书中更详细描述的本发明内容。
实验详情
第一系列实验
PTEN肿瘤抑制剂是癌症中最常改变的基因之一。它发挥磷酯酰肌醇3,4,5-三磷酸的脂质磷酸酶的功能，继而抑制从磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)和Akt进行致癌基因信号传导。对PTENmRNA的检查揭示5'未翻译区域（UTR）在770bp的PTEN的开放阅读框架（ORF）内。在此UTR ORF内，在典型的AUG起始密码子上游的513个碱基对的弱科扎克序列内有替代性的CUG起始密码子。尽管典型的PTEN ORF的表达产生以约55kDa迁移的蛋白质，但是含有5'UTR的PTEN cDNA的表达能产生称为PTEN-long的70kDa的第二蛋白质。起始部位的突变指示55KDa PTEN由典型的的起始密码子翻译而产生，而PTEN-long从上游替代性的起始密码子起始。具有不同PTEN抗体的免疫墨点分析显示了在多个细胞系中PTEN-long的内生性存在。小鼠ES细胞中的基因表达阻断和基因剔除研究确认了此较大蛋白质确实是PTEN。添加的N末端蛋白序列编码信号肽和裂解部位，从而指示PTEN-long进入分泌途径中。PTEN-long优先结合植物凝集素伴刀豆球蛋白A，从而显示它被糖基化。此外，PTEN-long可通过使用PTEN抗体和硫酸类肝素两者进行亲和纯化而从条件培养基中纯化。PTEN-long在活体内蛋白酶保护分析法中也对降解敏感，而正常的PTEN并不如此，从而指示PTEN-long位于细胞膜的外部。
试剂、细胞系和抗体-蛋白酶K和伴刀豆球蛋白A从希格玛公司（Sigma）（密苏里州，圣路易斯）购买。肝素琼脂糖和HiTrap肝素HP柱从安玛西亚公司（Amersham）（新泽西州，皮斯卡塔韦）购买。PTEN抗体从赛信通公司（Cell Signaling）（马萨诸塞州，丹弗斯）和加德公司（Cascade）（马萨诸塞州，温彻斯特）购买。Akt抗体从赛信通公司（Cell Signaling）（马萨诸塞州，丹弗斯）获得，并且E钙粘蛋白抗体从密理博公司（Upstate Millipore）（马萨诸塞州，比尔里卡）获得。由莱贸生物科技公司（ZymedLaboratories）（加利福尼亚州，南旧金山）产生针对抗原决定基PRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD（SEQ ID NO:3）（在PTEN的新翻译中发现）的多克隆亲和纯化的抗体。二级抗体从皮亚斯公司（Pierce）（伊利诺伊州，罗克福德）购买。HEK293、ZR-75-1、SKBR-3、MDAMB-361、BT549和PC3从ATCC（弗吉尼亚洲，马纳萨斯）获得并且根据所提供的指南来培养。
质粒和构建体-如先前所报导，通过将PTEN cDNA(作为U90351而存放在NCBI）克隆到pCEP4（英杰生命科技有限公司（Invitrogen））的NotI部位来产生编码PTEN和5'未翻译区域的完整开放阅读框架的pCEP4-PTEN（李（Li）,辛普森（Simpson）等人1998）。通过接合编码在用于克隆的最初NotI限制部位上游的序列的适体而在此质粒上进一步延伸5'UTR。所述适体编码位于典型的起始部位的-513处第一个可能替代性CTG起始密码子上游至多10个碱基对。假定的替代性起始部位突变为ATG的适体也用于产生第二组表达构建体，在所述构建体中将有效地表达较长形式。此外，还使典型的起始密码子突变为ATA，从而产生总共4种不同构建体（图5.1）。这4种变种，以及最初PTEN的开放阅读框架也亚克隆到MSCV（加利福尼亚州，山景城，宝日医生物技术有限公司（Clontech））逆转录病毒载体中，用于通过感染而稳定地表达。
蛋白酶保护分析法-在不含胰蛋白酶的冰冷PBS中收集HEK293细胞，并且将5×105个细胞的等分试样与渐增浓度（0.5μg/ml到10μg/ml）的蛋白酶K  一起培育30分钟。将含0.1%曲拉通的对照包括在内，以验证蛋白酶K使指定蛋白质降解的能力。用5mM PMSF使反应停止。将细胞溶解于2×拉米利样品缓冲液（125nM Tris pH 6.8，20%甘油，0.05%溴酚蓝，4%SDS，10%2-巯基乙醇）中并且进行免疫墨点点渍而用于PTEN、Akt和E钙粘蛋白分析。
从小鼠肝脏中纯化PTEN-将来自C57BL6小鼠的肝脏在液氮中迅速冰冻，弄碎并且再悬浮于TNN缓冲液（50mM Tris pH 7.4，150mM NaCl，0.5%NP-40，5mM EDTA，3%甘油，1mM DTT，l×哺乳动物蛋白酶混合抑制剂[希格玛公司（Sigma）]）中。将悬浮液用研钵均化并且在4℃下以40.000RPM离心1小时。用0.45微米和0.22微米过滤器相继过滤上清液。用TNN预先平衡丙烯葡聚糖凝胶（sephacryl）200尺寸排斥柱（安玛西亚公司（Amersham））并且以0.3ml/h的速率施加此样本，接着施加缓冲液。收集2ml洗脱份并且汇集低分子量样品并施加到预先平衡的HiTrap肝素HP柱（安玛西亚公司(Amersham))上。用3柱床体积的TNN洗涤所述柱并且逐步用3×柱床体积的0.3M、0.5M和1M NaCl TNN溶液洗脱蛋白质。以0.5ml增量收集洗脱份并且进行免疫墨点点渍而用于PTEN分析。
从培养基中纯化PTEN肝素-在15cm培养皿中的10%FBS DMEM中使HEK293细胞生长达到汇合。将所述细胞与15ml不含FBS的DMEM一起培育整夜。从20个培养盘中收集培养基并且通过0.45微米过滤器过滤。在4℃下使用4ml/min的流速用AktaPrime（安玛西亚生物科学公司（AmershamBioscience））以DMEM平衡1ml肝素HP柱。随后使条件培养基以1ml/min穿过所述柱。用10体积的BC200（200mM NaCl，50mM Tris pH 7.4，1mM EDTA，0.2%曲拉通X-100）洗涤所述柱。用5ml的1MNaCl以1ml/min洗脱1ml洗脱份中的蛋白质。由280nm下的OD来确定各洗脱份的蛋白质浓度。用20%三氯乙酸使各洗脱份的一半沉淀，用真空干燥的冷丙酮洗涤。在20μl拉米利溶解缓冲液中重构蛋白质并且使用PTEN和PTEN-long的抗体进行免疫墨点点渍。
从血清中纯化PTEN-来自AB血浆的人类血清从希格玛公司（Sigma）获得。通过0.45微米过滤器过滤1ml血清并且使用蛋白质A/G琼脂糖预先清除抗体而用于1小时培育。将肝素-琼脂糖与预先清除的血清以及琼脂糖对照一起培育整夜并且在第二天用BC150（150mM NaCl，25mM Tris pH 7.4，1%NP-40，0.25%脱氧胆酸钠，1mM EDTA）洗涤。用拉米利样品缓冲液洗脱蛋白质并且进行免疫墨点点渍而用于PTEN分析或二次处理（只对于重链污染）。
伴刀豆球蛋白A下拉-用BC500（500mM NaCl，20mM Tris pH 7.4，1%曲拉通X-100，1mM MnCl2，1mM CaCl2，l×蛋白酶抑制剂混合物）溶解次汇合的HEK293细胞。使细胞溶解产物离心并且过滤。在4℃下用20微升伴刀豆球蛋白A琼脂糖（希格玛公司（Sigma））进行下拉，持续1小时。用BC500洗涤树脂并且用拉米利样品缓冲液洗脱蛋白质。
结果
PTEN mRNA具有上游替代性起始部位
存放在NCBI中的PTEN mRNA（李（Li）和孙（Sun）1997；斯泰克（Steck）,波斯豪斯（Pershouse）等人1997）含有外延的5'UTR。5'UTR区域中约770bp的相连序列在起始密码子的框内。在此区域中没有甲硫氨酸被编码，但是，有在典型的起始密码子的-519处开始的若干个替代性的起始CUG密码子。根据scansite（scansite.mit.edu）和prosite（www.ebi.ac.uk/ppsearch），此序列的翻译没有揭示可鉴别的结构域。此完整区域的翻译将添加173个氨基酸到PTEN中，从而使它的分子量增加到约70,000道尔顿（图2）。
其他PTEN直系同源物的比对揭示智人UTR的翻译序列可在来自各种物种的PTEN的开放阅读框架中找到。黑猩猩、黄牛、意蜂和秀丽隐杆线虫都含有与智人5'UTR的翻译产物同源的蛋白序列（图3）。此外，智人5'UTR和小家鼠PTEN 5'UTR的比对显示了广泛的核苷酸同源性（未图示）。与智人5'UTR的翻译相比，小家鼠5'UTR对于522个碱基对在典型起始密码子的框内翻译并且揭示了高度同源的蛋白序列（图5.3）。5'UTR的同源性和来源于智人5'UTR的氨基酸序列在其他物种的翻译蛋白质中的实际存在指示了此序列的进化重要性。
PTEN mRNA可从替代性的上游部位起始翻译。PTEN ORF的过度表达产生了55kDa的单个蛋白质色带。包含5'UTR产生了约70kDa的第二个较大蛋白质色带。PTEN免疫墨点中的较大蛋白质色带也内生地存在于许多细胞系中并且可由不同单克隆抗体检测（图4）。此较大蛋白质色带也存在于小鼠野生型ES细胞中并且在PTEN基因剔除小鼠ES细胞中不存在并且在稳定地表达PTEN shRNA的小鼠ES克隆体中减少（图4）。使用siRNA在HEK293细胞中使人类PTEN蛋白的基因表达阻断还引起70kDa蛋白质的基因表达阻断。
在剔除PTEN的PC3细胞系中编码PTEN的ORF的质粒的表达使得55kDa蛋白质产生。当也编码5'UTR的质粒被过度表达时，产生70kDa蛋白质。上游假定的起始密码子从CTG突变为ATG（图1，“ATG/ATG”）主要使免疫墨点模式转变成70kDa形式（图4）。55kDa色带也被确认为通过突变而源于ATG起始密码子（图4，“CTG/ATA”）。
因此，5'UTR足以起始较长形式的PTEN的翻译。因此，5'UTR被称为替代性翻译的区域的5'ATR并且检测到的较大蛋白质被称为“PTEN-long”。
产生针对从5'ATR翻译的氨基酸的经亲和纯化的多克隆抗体并且所述多克隆抗体用于确认过度表达研究中重组PTEN-long的产生，以及HEK293细胞中内生形式的产生（图4）。从HEK293细胞的全细胞溶解产物免疫墨点分析和PC3细胞的过度表达研究中，似乎存在多种形式的PTEN-long，从而指示了潜在的翻译后修饰、无文献记载的剪接形式或甚至是5'ATR中的替代性起始密码子。
PTEN-long编码N末端信号肽
PTEN-long的N末端序列含有一段较长的丙胺酸，所述丙胺酸可指示跨膜序列或信号肽。使用SignalIP 3.0对翻译序列进行的分析以高度可能性(>95%)预测所述序列含有信号肽（图5）。信号肽在特征方面包含碱性氨基酸，接着是疏水段。假定的疏水性跨膜螺旋体被脯氨酸破坏并且接着被略带极性的序列破坏。所述序列也预测被裂解，从而指示蛋白质应释放到ER的内腔中。
分泌蛋白质和细胞外蛋白质的特点之一是添加复合糖部分到高尔基体中，一种称为糖基化的过程。糖可通过N-糖基化而在一致序列N-X-S/T（X不能是脯氨酸）处添加到天冬酰胺中（古帕塔（Gupta）和布鲁纳克（Brunak）2002）；丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基组还可以是O-糖基化的目标（尤莱纽斯（Julenius）,摩尔加德（Molgaard）等人2005）。PTEN具有多个O-糖基化部位，但是只有一个N-糖基化部位。在下拉分析法中使用结合糖部分的植物凝集素伴刀豆球蛋白A，以判定HEK293细胞中PTEN补体的一部分是否被糖基化。从这些细胞中纯化PTEN-long约为50%的PTEN混合物（图6）。这显示了PTEN-Long被糖基化并且细胞质的55kDa形式的PTEN被糖基化或PTEN-Long在细胞外裂解。
PTEN-long结合类肝素并且在细胞表面上被发现
PTEN结合许多蛋白聚糖，如多配体蛋白聚糖（syndecan）和磷脂酰肌醇蛋白聚糖（glypican），所述蛋白聚糖被发现连接到膜的外叶上。这些蛋白聚糖是两种类肝素化程度最高的细胞外分子（布来诺（Blero）,张（Zhang）等人2005）。先前已显示，PTEN对带较高负电荷的物质具有高亲和力，PTEN的这种特性使它偏好高度阴离子性的PIP3（达斯（Das）,狄克逊（Dixon）等人2003）。由于类肝素是带最大负电荷的生物分子之一，因此有可能的是，类肝素可介导PTEN与细胞外基质的结合。使用来自小鼠肝脏的蛋白质提取物，发现PTEN以高亲和力结合类肝素。此外，使用1M NaCl对来自肝素琼脂糖柱的PTEN进行连续洗脱，也洗脱PTEN-long（图7）。
粘着于细胞膜外表面上的PTEN-long应对蛋白酶降解敏感。在蛋白酶保护分析法中，将活细胞与蛋白酶一起培育并且只有细胞外蛋白质被降解，这是因为脂质膜对蛋白酶是不可渗透的并且用以保护所有细胞内蛋白质。通过与PBS一起轻轻搅动而从附着培养物中移除HEK293细胞并且使所述细胞与渐增浓度的蛋白酶K一起悬浮。用PMSF使反应停止并且用拉米利缓冲液溶解细胞。PTEN-long显示了对蛋白酶K和E-钙粘蛋白（一种已知细胞外蛋白质）处理的敏感性（图8）。另一方面，PTEN显示适度的蛋白酶敏感性，这指示了55kDa物质的某个部分也在细胞外（因为它被糖基化）或在使细胞质PTEN暴露于蛋白酶K的分析法期间发生了一定程度的细胞溶解。包括使用膜渗透性曲拉通的对照来证实PTEN在暴露于蛋白酶K时可降解。有待了解的是，这是PTEN所特有的还是以55kDa迁移并且保留PTEN抗体的C末端抗原决定基的PTEN-long裂解形式。此资料指示PTEN-long在细胞表面上。
可溶性PTEN-long分泌到培养基中
细胞表面上PTEN-long的存在不排除一部分蛋白质是可溶的并且释放到细胞环境中的可能性。使用肝素琼脂糖从针对HEK293细胞调节的无血清培养基中亲和纯化PTEN-long。柱洗脱揭示培养基中存在以50kDa分子量迁移的PTEN（图9）。使用PTEN-long特异性抗体的免疫墨点分析揭示相同的50kDa物质，从而指示这种蛋白质保留从替代性起始部位翻译的序列和来自PTEN单克隆抗体的C末端抗原决定基的序列。这强有力地暗示了所观察到的55kDa的PTEN部分实际上是从上游起始密码子处开始裂解的翻译产物。
通过在用ATG/ATG构建体转染的HEK293细胞中过度表达PTEN-long来进一步确认PTEN分泌到培养基中。使用这些细胞来产生无血清条件培养基整夜并且使用PTEN单克隆抗体6H2.1使PTEN从1ml培养基中免疫沉淀。较大PTEN色带和较低的55kDa色带成功地从培养基中免疫沉淀。由于蛋白质被过度表达，因此对蛋白质的适当处理可能不会发生，这使得完整大小的70kDa PTEN分泌出。
PTEN在人类血清中被发现
生理分泌物质的最佳来源之一是血清。肝素琼脂糖用于对来自人类血清的PTEN进行亲和纯化。使人类血清短暂离心并且过滤以移除颗粒物质。随后用BC150以1:5稀释所述血清并且用蛋白质A/G充分地预先清除以移除IgG。将所述血清与少量肝素琼脂糖一起分批培育。用拉米利缓冲液洗脱肝素琼脂糖并且对洗脱液进行墨点点渍而用于PTEN分析并且只用于二级抗体处理以排除重链污染。PTEN和PTEN-long都在人类血清中被发现（图10）。
PTEN-long的抗血管生成活性
PTEN-long的抗血管生成作用显示如下：（1）PTEN-long通常在小鼠的发育中的视网膜中较弱地表达但在新生仔发育期间在经历衰退/细胞死亡的血管中有高水平的表达（图11）；（2）PTEN-long在肿瘤的凋亡性血管中被发现。此外，用部分地从转染细胞纯化的PTEN-long处理上皮细胞，抑制细胞迁移并且诱导细胞凋亡（图12）。纯化的PTEN-long也可诱导与U87、HUVEC内皮细胞或培养中的293细胞的细胞凋亡的激活相关的细胞死亡，如由卡斯蛋白酶3裂解所测量。
PTEN-long的活体内抗肿瘤和抗血管生成活性
图13显示了用PTEN-long处理小鼠。（A）用成胶质细胞瘤细胞系U87注射小鼠（n=5）以在乳腺脂肪垫的2个部位（左侧和右侧）处形成异种移植物。在肿瘤移植之后，用PTEN-long直接注射一个肿瘤并且不注射对侧肿瘤（w/PTEN-long）。也用来源于空载体转染的细胞的空白纯化蛋白质的制剂（空载体）注射5只小鼠的对照组。再次，不注射对侧肿瘤（w/空载体）。第1-11天和第13-14天处理小鼠。在指定天数用测径器测量最大直径（cm）。当肿瘤体积≥1cm时，处死小鼠。（B）通过将PTEN-long表达载体转染到293细胞中来制备蛋白质并且使用V5亲和树脂部分地纯化，接着用V5肽洗脱。图14显示了用PTEN-long对照注射液处理14天的小鼠的存活分数（以天计）。
视网膜染色
在p7鼠类视网膜中对PTEN-long和血管的染色揭示PTEN-long选择性地染色玻璃体血管，所述玻璃体血管在鼠类视网膜血管发育中的此时刻开始退化。PTEN-long抗体针对以下抗原决定基：N-PRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD-C（SEQ ID NO:3）。用BS1-植物凝集素进行血管染色。
纯化
在一种纯化PTEN-long的方法中，用ATG/ATG PTEN-long转染293细胞并且使细胞溶解产物穿过Ni+亲和柱。在使用咪唑洗脱缓冲液的AKTA纯化器上使用Ni+柱一致地纯化PTEN-long。
肿瘤退化
在用PTEN（orf403氨基酸）或PTEN-long注射之前转染U87细胞的异种移植物。在注射后7天，与过度表达PTEN的群组（n=4，总数是4）相比，过度表达PTEN-long的群组中的乳腺血管减少。这表明PTEN-long可影响肿瘤环境。
通过PTEN-long前导序列的跨膜递送
图18和图21显示了PTEN-long（而非PTEN）当应用于完整细胞时减少细胞内AKT磷酸化的能力。
实例
货物分子肽通过肽键而共价地连接到第二肽上，所述第二肽包含连续氨基酸残基，所述连续氨基酸残基具有SEQ ID NO:1的残基22-173中所述序列。当使细胞膜与此组合物接触时，货物分子肽穿过细胞膜而运送并且递送到细胞中。
货物分子蛋白通过肽键而共价地连接到肽上，所述肽包含连续氨基酸残基，所述连续氨基酸残基具有SEQ ID NO:1的残基22-173中所述序列。当使细胞膜与此组合物接触时，货物分子蛋白穿过细胞膜而运送并且递送到细胞中。货物分子蛋白可以是人类p53，或其活性片段或活性变体。
货物分子肽共价地连接到核酸上，所述核酸包含连续氨基酸残基，所述连续氨基酸残基具有SEQ ID NO:1的残基22-173中所述序列。当使细胞膜与此组合物接触时，货物分子核酸穿过细胞膜而运送并且递送到细胞中。核酸可通过二硫键而共价地连接到肽。核酸可以是siRNA。
讨论
有规律地观察到来自细胞溶解产物和组织的PTEN免疫墨点中的第二个较大蛋白质色带。确认较大色带是PTEN的证据包括：较大蛋白质色带由不同PTEN单克隆抗体检测到；当用针对PTEN的siRNA处理细胞或在小鼠中基因剔除PTEN基因座时不存在较大蛋白质。观察到PTEN的5'UTR对于超过700个碱基对在PTEN的典型起始密码子的框内。此外，在PTEN上游有CUG密码子522个碱基对，这些碱基对如果被翻译，则可计入PTEN免疫墨点中的较大蛋白质色带的尺寸中。尽管与强科扎克序列无关，但是它保留-1胞嘧啶和+1鸟嘌呤核苷序列。当被翻译并且添加到PTEN ORF中时，应产生约70kDa的蛋白质，这是观察到的较大PTEN色带的分子量。
此序列的翻译已存在于其实际编码序列内的许多PTEN直系同源物中。也检查小鼠5'UTR，因为已观察到小鼠组织溶解产物中的类似色带。小鼠5'UTR核苷酸序列与智人5'UTR高度同源并且类似地在起始密码子的框内。两个潜在的替代性起始密码子存在于-522和-516处，并且从那些部位开始的此序列的翻译揭示氨基酸序列90%以上与智人序列同源。此假定蛋白的保守性是显著的并且显示了对此序列的进化重要性。为了更好地描述此序列，将其重新命名为5'ATR或PTEN的替代性翻译的区域，以描述其翻译潜力。
构建质粒，其中PTEN的开放阅读框架与5'ATR一起克隆，并且将此重组PTEN的表达与单独的典型的产生403个氨基酸的开放阅读框架进行比较。与只含有PTEN的典型ORF的表达质粒（产生以55kDa迁移的单个色带）相比，包含5'ATR会产生以约70kDa迁移的第二个较高PTEN蛋白质色带。较大蛋白质只占翻译的总蛋白质的较小部分；然而，假定起始部位突变为ATG使蛋白质比率向主要的较大形式转变。
来自5'ATR的蛋白序列的保守性指示它不只是进化的人造品。N末端含有一段脂肪族氨基酸，预测所述脂肪族氨基酸为跨膜序列。使用Prosite和Signal 3.0IP预测PTEN-long的N末端是具有紧随其后的蛋白酶裂解部位的信号肽。
活体内蛋白酶保护分析法用于测试PTEN-long是否位于细胞的细胞外表面上。随着细胞外蛋白酶的量逐渐增加，PTEN-long显示不断降解，而PTEN并不如此，从而指示至少一些PTEN-long在细胞外并且至少部分连接到细胞膜的外叶上。考虑牵涉到在细胞膜外叶上的活性脂质磷酸酶，这是最令人感兴趣的结果。结合外膜的蛋白聚糖的两个家族（磷脂酰肌醇蛋白聚糖和多配体蛋白聚糖）先前在PTEN蛋白复合物中识别。
PTEN存在于细胞表面上不排除可溶的分泌型PTEN的可能性。多配体蛋白聚糖和磷脂酰肌醇蛋白聚糖是两种类肝素化程度最高的蛋白聚糖。类肝素是带较高负电荷的葡糖胺聚糖并且PTEN已显示对阴离子具有亲和力，从而部分地解释了选择带较高负电荷的PIP3作为其受质。从小鼠肝脏中纯化PTEN的优化实验揭示PTEN和PTEN-long都可以使用肝素琼脂糖柱来纯化。此外，使用肝素琼脂糖柱，从针对HEK293细胞调节的无血清培养基中纯化约50kDa的蛋白质。由对PTEN具特异性的单克隆抗体和针对PTEN-long中存在的独特氨基酸残基的多克隆抗体来识别纯化蛋白。先前PTEN-long抗体只识别约70kDa的蛋白质色带。两种抗体都可以识别这一个色带的观察结果指示蛋白水解处理可能发生并且通过免疫墨点观察到的蛋白质是保留两种抗体的抗原决定基的PTEN片段。PTEN和PTEN-long也可以使用肝素亲和纯化而从人类血清中纯化。
在过去10年内积累了大量呈现PTEN序列的文献。此处证实PTEN新形式的存在，所述新形式从替代性部位开始翻译并且分泌到外叶和细胞外空间中。
活体内结果显示PTEN-long是新的抗肿瘤化合物，所述化合物通常存在于人类血清中并且具有抗血管生成和促细胞凋亡特性。
第二系列实验
产生MSES PTEN-Long
出于在大肠杆菌中纯化的目的，改变PTEN-Long开放阅读框架以删除前21个氨基酸，从而移除真核信号肽序列，所述真核信号肽序列基于其前四个氨基酸而被称为MSES型式（图28）。在大肠杆菌中使用具有IPTG的可诱导性表达载体来诱导具有PTEN-Long所特有的替代性翻译区域的153个氨基酸和PTEN-Long与PTEN之间共享的403个氨基酸的此蛋白质，并且使用镍和肝素亲和柱从提取物中纯化。出于检查六个精氨酸重复对于细胞进入的重要性的目的，框内删除此序列（R6）并且如上纯化蛋白质。
MSES PTEN-Long进入细胞中
将纯化的MSES PTEN-Long野生型或R6突变型蛋白质加入在培养中以1微克/毫升的浓度生长的MDA-MB-468人类细胞的培养基中。在平行的相同条件下，还用缺少替代性翻译区域的最初403氨基酸PTEN或从只表达RFP蛋白的细胞制备的空白处理试剂来处理细胞。在分离细胞以用于细胞分部分离之前，在37℃下培育细胞30分钟。我们分离细胞质和细胞核部分。通过使用分别控制细胞质和细胞核部分的微管蛋白和BAF180进行西方墨点分析来测量分部分离的有效性。只有野生型PTEN-Long进入细胞中并且存在于细胞质和细胞核中。重要的是，删除R6的PTEN和PTEN-Long都不能进入细胞中。这些资料指示有效的细胞进入需要R6序列，而并不需要初始21个氨基酸。
产生PTEN-Long-p53融合蛋白
以上研究表明图2中的构建体的前153个氨基酸可用于将另一蛋白序列递送到细胞中。为提出这个问题，MSES PTEN-Long构建体的初始153个氨基酸（称为Pten-Long前导子的PL）与人类p53的393个氨基酸融合，以产生PL-p53融合蛋白（图30）。V5-His抗原决定基标签与C末端融合以用于纯化和检测的目的。
P L -p53进入细胞中，激活基因表达并且抑制肿瘤生长
在大肠杆菌中使用IPTG诱导PL-p53融合蛋白并且使用镍和肝素亲和柱从细菌溶解产物中纯化。在收集细胞用于分部分离之前，将PL-p53蛋白与MDA-MB-468或H1299人类癌细胞一起培育1小时，以判定融合蛋白是否可进入细胞中。可在经处理而非空白处理的H1299细胞和MDA-MB-468细胞的细胞核中检测到增加的p53并且与PUMA和p21（p53转录因子的两个目标）的表达增加相关联（图31）。MDA-MB-468异种移植物的每日处理使得经过10天肿瘤体积减小，但是从表达RFP（红色荧光蛋白）的大肠杆菌制备的空白处理对照并不如此。
用细菌表达的MSES PTEN-Long处理的小鼠的葡萄糖耐量测试
用细菌表达的MSES PTEN-Long（Long）、RFP（红色荧光蛋白空白对照）、IgG对照和阻断吸收到细胞中的抗PTEN抗体138G6处理小鼠。PTEN-long相对于其他处理降低葡萄糖水平，而抗PTEN抗体138G6相对于IgG对照增加葡萄糖（图32）。此资料显示PTEN-long可减少血糖。在用葡萄糖处理之前腹膜内注射小鼠。
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Claims (5)

1.一种融合蛋白，该融合蛋白包括在其氨基末端的序列是SEQ ID NO:1的氨基酸22-173序列的连续氨基酸，该连续氨基酸通过肽键结合到序列是非PTEN肿瘤抑制蛋白序列的连续氨基酸上，所述非PTEN肿瘤抑制蛋白选自人类P53、p16、ARF、VHL、SMAD4、ARID1A、BAF180、BRCA1、BRCA2、RB和LKB1组成的组。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述非PTEN肿瘤抑制蛋白是人类p53蛋白。
3.一种融合蛋白，其特征在于，其序列如SEQ ID NO:8中所述。
4.如权利要求1或2所述的融合蛋白在制备用于将所述非PTEN肿瘤抑制蛋白递送到细胞中的药物中的用途。
5.如权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
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