CN109045290A - 基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于内皮细胞特异分子‑1的双靶标肿瘤疫苗及其制备方法，该肿瘤疫苗由内皮细胞特异分子‑1干扰重组真核表达质粒和肿瘤靶向多肽FD11与pH敏感型两亲性多肽分子的融合肽以非共价键结合而成；其制备方法是分别制得内皮细胞特异分子‑1干扰重组真核表达质粒和肿瘤靶向多肽FD11与pH敏感型两亲性多肽分子的融合肽，再将二者通过静电相互作用聚缩形成复合物；采用本发明所述方法制备的肿瘤疫苗既保留了多肽疫苗安全、易于制备纯化等优点，又克服了多肽分子小、免疫原性弱以及不易靶向肿瘤细胞等不足，可以发挥同时抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，大大提高肿瘤治疗的有效性和安全性，在肿瘤治疗领域具有良好的应用前景。

Description

基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种肿瘤疫苗，属于疫苗基因工程技术领域，具体地说是基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗及其制备方法。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率疾病。继手术、放射治疗和化学治疗后，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗的重要手段。有关人类肿瘤免疫反应研究结果显示，肿瘤细胞表达的抗原可引起特异性细胞与体液免疫反应，但具有能够通过内源性免疫机制自发清除肿瘤的能力者却极为罕见。当前，肿瘤生物治疗策略有肿瘤相关基因或肿瘤抑制基因的靶向治疗、肿瘤相关抗原的免疫治疗等，但均由于技术成熟性、有效性、安全性和经济性等问题，在实际应用中受到很大限制。

肿瘤生长具有明确的血管依赖性，肿瘤通过新生血管从宿主获取营养成分，又经过血管向宿主输送肿瘤细胞，增强肿瘤灶的远处转移能力。肿瘤的生长可分为无血管期和血管期。体积超过1-2mm的肿瘤即进入血管期，其继续生成需要新生血管维持营养供给和排泄代谢产物。如果没有新生血管长入，肿瘤就将保持休眠状态甚至退化。足够的血管形成以提供充分的营养及氧供是肿瘤生长的必要条件，而新生血管形成的过程依赖于对宿主脉管系统的刺激以生成新生毛细血管。肿瘤组织诱导的血管生成是复杂的多因素调节的过程。研究发现，与肿瘤血管生成有关的因子有30余种，如血管内皮细胞生长因子、血管抑素、纤维蛋白生长因子等。

人内皮细胞特异分子-1(endothelial cell specific molecule-1，ESM -1)是一种可溶性的蛋白聚糖，由一条硫酸皮肤素链和一个核心蛋白相连而成。其基因位于人第五号染色体5q11上，含3个外显子和2个内含子。它的表达受细胞因子、血管生长因子、转录因子等多种因素的复杂调控。内皮细胞特异分子-1与人类多种肿瘤关系密切，可以促进肿瘤形成、生长和转移。其相关机制主要有促进细胞增殖、引起免疫抑制、促进淋巴管和血管生成等。它在肿瘤的筛查、诊断、治疗、疗效检测、预后判断等应用方面有着巨大的潜力。

细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是一种由10-30个氨基酸残基组成的阳离子短肽。细胞穿膜肽能介导多种物质进入细胞,如DNA、蛋白质、抗体、显像剂、纳米粒和脂质体等。将CPPs与传统的抗肿瘤药物 (如紫杉醇、喜树碱和鬼臼毒素等)共价连接后,能明显提高这些药物的抗肿瘤活性,同时也增强了这些药物的水溶性、组织渗透力及在肿瘤组织中的分布。然而,由于细胞穿膜肽的选择性较差、正电荷多而引起的体内系统毒性、稳定性差等问题,使其在体内的应用受到了限制。如果能提高细胞穿膜肽的肿瘤靶向性,如将肿瘤特异性靶向配体与细胞穿膜肽结合,或制成肿瘤靶向配体与细胞穿膜肽共修饰纳米粒和脂质体将会带来理想结果。

pH敏感型两亲性多肽分子(RRRRRRKKGRGDS)作为抗肿瘤药物的载体。该多肽分子亲水端头部为KKGRGDS序列,其中两个赖氨酸残基能提供pH响应能力,并入RGD序列赋予两亲性多肽分子肿瘤靶向功能，疏水端尾部为RRRRRR序列。多肽FD11是通过噬菌体肽库筛选技术获得的小分子多肽，由11个氨基酸组成（YHWNVIYGYTPQ），与大分子天然配体相比，多肽配体的优点：相对分子质量小，免疫原性低；易扩散及靶向性高，可以满足靶向肿瘤的要求；对肿瘤细胞的生长没有影响。研究表明，FD11可以与EGFR特意性结合，并且FD11对细胞的生长没有影响。研究结果表明FD11修饰的脂质体对EGFR具有较高的靶向性。

发明内容

针对背景技术中存在的技术现状，本发明的目的之一是在于提供一种基于ESM -1干扰基因的双靶标肿瘤疫苗，该疫苗既保留了多肽，还具有疫苗安全、易于制备纯化的优点，又克服了多肽分子小、免疫原性弱、在体内不易被抗原递呈细胞（APC）摄取等不足，可在体内激发有效的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答，同时发挥抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。本发明的目的之二是在于提供一种制备所述基于ESM-1干扰基因的双靶标肿瘤疫苗的方法，具体地说是基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗，由内皮细胞特异分子-1干扰重组真核表达质粒和肿瘤靶向多肽FD11与pH敏感型两亲性多肽分子的融合肽以非共价键结合而成。

进一步地，本发明所述的基于内皮细胞特异分子-1干扰的双靶标肿瘤疫苗，其中所述内皮细胞特异分子-1干扰重组真核表达质粒由内皮细胞特异分子-1和真核表达载体组成，所述内皮细胞特异分子-1干扰序列具有如SEQ ID No.2所述的核苷数序列。

进一步地，本发明所述的基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗，其中所述真核表达载体为pEGFP-N1。

进一步地，本发明所述的基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗，其中所述肿瘤靶向多肽FD11与pH敏感型两亲性多肽分子的融合肽具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，还提供了一种制备所述基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

a、构建内皮细胞特异分子-1干扰重组真核表达质粒；

b、肿瘤靶向多肽FD11与pH敏感型两亲性多肽分子的融合肽；

c、肿瘤疫苗的制备：于低温、混旋条件下，向含有内皮细胞特异分子-1干扰重组真核表达质粒的5%葡萄糖中，滴加肿瘤靶向多肽FD11与pH敏感型两亲性多肽分子的融合肽溶液，滴加完毕后，在室温下继续混旋10分钟，再静置10分钟，即得肿瘤疫苗。

进一步地，本发明所述基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗的制备方法，其中所述步骤a是先克隆得到内皮细胞特异分子-1干扰全长编码基因，再将其插入真核表达载体pEGFP-N1的HindⅢ和xho1多克隆位点之间，构建内皮细胞特异分子-1重组真核表达质粒pEGFP-N1/ESM-1；所述内皮细胞特异分子-1具有如SEQ ID No.2所述的核苷数序列。

进一步地，本发明所述基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗的制备方法，其中所述步骤b是用固相合成法制备肿瘤靶向多肽FD11与pH敏感型两亲性多肽分子的融合肽，所述肿瘤靶向多肽FD11与pH敏感型两亲性多肽分子的融合肽具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列。

进一步地，本发明所述基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗的制备方法，其中所述步骤c是于低温、混旋条件下，向1体积份含有浓度为5mg/ml的pEGFP-N1/ESM-1和浓度为5%葡萄糖中的水溶液中，滴加1体积份浓度为2mg/ml的融合肽YHWNVIYGYTPQ-RRRRRRKKGRGDS溶液，滴加完毕后，继续混旋10分钟，再静置10分钟，即得肿瘤疫苗。

采用本发明所述的基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗及其制备方法，与现有技术相比，其有效效果在于：由于肿瘤靶向多肽FD11与pH敏感型两亲性多肽分子的融合肽带正电荷，可以与带负电荷的ESM -1干扰基因重组真核表达质粒通过静电相互作用聚缩形成与天然病毒大小相近的致密颗粒。因其具有颗粒性和RRRRRR的穿膜活性，YHWNVIYGYTPQ在体内易于被肿瘤细胞摄取，ESM -1干扰基因重组真核表达质粒在肿瘤细胞内表达ESM-1干扰分子，抑制肿瘤血管内皮生长。同时，其表面的RRRRRRKKGRGDS肽可以被肿瘤细胞表面的整合素受体介导摄取，促进Caspase-3及Csapase级联系统，促进肿瘤细胞的凋亡。因此，采用本发明所述方法制备的肿瘤疫苗，肿瘤疫苗既保留了多肽疫苗安全、易于制备纯化等优点，又克服了多肽分子小、免疫原性弱以及不易被肿瘤细胞靶向等不足，可以发挥同时抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，大大提高肿瘤治疗的有效性和安全性，在肿瘤治疗领域具有良好的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细说明，其中：

图1为肿瘤疫苗的透射电镜鉴定图；

图2为融合肽YHWNVIYGYTPQ-RRRRRRKKGRGDS的高效液相色谱鉴定图；

图3为融合肽YHWNVIYGYTPQ-RRRRRRKKGRGDS的质谱鉴定图；

图4为荷瘤裸鼠使用本发明肿瘤疫苗后60天的生存率变化图；

图5为荷瘤裸鼠使用本发明肿瘤疫苗后60天的肿瘤生长曲线图；

图6为荷瘤裸鼠使用本发明肿瘤疫苗后60天的肿瘤细胞凋亡活性曲线图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、肿瘤疫苗的制备

1、ESM-1干扰基因重组真核表达质粒pEGFP-N1/ESM-1的制备

ESM-1干扰基因重组真核表达载体的制备：根据ESM-1干扰基因编码序列和真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点，设计并合成ESM-1干扰基因包含5’端HindⅢ切位点和3’端xho1酶切位点的cDNA片段；pEGFP-N1为模板进行PCR，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，用限制性内切酶HindⅢ和xho1进行双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经HindⅢ和xho双酶切的pEGFP-N1在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，用含有Amp/IPTG/X-GAL的培养基进行蓝白斑筛选，挑取白斑培养，提取质粒，用HindⅢ和xho1进行双酶切鉴定，并委托上海生工公司测定基因序列，将序列和阅读框架正确的阳性克隆质粒命名为pEGFP-N1/ESM-1。其序列为YHWNVIYGYTPQ-RRRRRRKKGRGDS。

2、融合肽YHWNVIYGYTPQ-RRRRRRKKGRGDS的制备

融合肽由多肽FD11的羧基端与pH敏感型两亲性多肽的氨基端直接连接而成，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。其序列为正义链siRNA:5′-CUC UCA CGG AGC AUG ACA UTT-3′;反义链siRNA: 5′-AUG UCA UGA UCC GUG AGA GTT-3′。

融合肽在AB-431A型多肽合成仪上固相合成，采用标准芴甲氧羰基（Fmoc）方案，以0.25mmol的对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯（HMP）树脂为起始树脂，按照YHWNVIYGYTPQ-RRRRRRKKGRGDS的氨基酸序列，使肽链自羧基端向氨基端逐个延伸，肽链合成完毕后，将含有肽链的树脂转移至切割液（由酒石酸乙二胺0.25mL、三氟乙酸9.5mL和去离子水0.25mL组成）中，室温下搅拌反应使肽链从树脂上裂解下来，反应液用G6玻砂漏斗过滤，收集滤液，室温下低压蒸干，残余物用去离子水溶解后，用ÄKTA explorer 100型中压液相色谱仪进行纯化，色谱柱为C18柱，流动相A为质量分数为0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为质量分数为0.1%的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在0～15分钟内由10%上升至50%，流速为1mL/min，收集RRMKWRQI-AVPI的洗脱液，冷冻干燥，即得RRMKWRQI-AVPI，用去离子水溶解制成浓度为3mg/ml的溶液，用孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤除菌，-70℃冻存备用。

YHWNVIYGYTPQ-RRRRRRKKGRGDS的洗脱液用Delta 600型反相高压液相色谱仪进行纯度鉴定，色谱柱为Symmetry C18柱，流动相A为质量分数为0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为质量分数为0.1%的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在0～15分钟内由10%上升至60%，流速为1mL/min，所得高效液相色谱鉴定图如图3所示，经峰面积归一化法计算，YHWNVIYGYTPQ-RRRRRRKKGRGDS的纯度为99%。

YHWNVIYGYTPQ-RRRRRRKKGRGDS的洗脱液用API 2000 LC/MS/MS型质谱仪进行分子量鉴定，所得质谱鉴定图如图3所示YHWNVIYGYTPQ-RRRRRRKKGRGDS的分子量测定值与理论值相符。

3、肿瘤疫苗的制备

于低温、混旋条件下，向1体积份含有浓度为5mg/ml的pEGFP-N1/ESM-1和浓度为5%葡萄糖中的水溶液中，滴加1体积份浓度为2mg/ml的融合肽YHWNVIYGYTPQ-RRRRRRKKGRGDS溶液，滴加完毕后，继续混旋10分钟，再静置10分钟，即得肿瘤疫苗。

二、肿瘤疫苗的活性检测

1、抑制肿瘤血管生成活性的检测

将荷瘤裸鼠随机分为三组：对照组Ⅰ、对照组Ⅱ和实验组，对照组Ⅰ尾静脉注射生理盐水；对照组Ⅱ尾静脉注射融合肽与pEGFP-N1/ESM -1的复合物；实验组尾静脉注射本发明所述肿瘤疫苗；观察60天内各组小鼠的生存率和肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；60天后，取小鼠体内肿瘤组织进行病理切片检查，并用免疫组化法检测肿瘤新生血管密度（以抗CD31单克隆抗体为一抗）。

结果：与对照组Ⅰ和对照组Ⅱ相比，实验组小鼠生存率高，肿瘤生长缓慢且肿瘤新生血管密度降低，如图4和图5所示。

2、诱导肿瘤细胞凋亡活性的检测

实验随机分为三组：对照组Ⅰ、对照组Ⅱ和实验组，对照组Ⅰ用PBS处理CT-26细胞（小鼠结肠癌细胞）；对照组Ⅱ用融合肽与pEGFP-N1/ESM -1的复合物的复合物处理CT-26细胞；实验组用本发明所述肿瘤疫苗处理CT-26细胞，共培养48小时后，PBS洗涤，再加入浓度为250μg/mL的异硫氰酸荧光素（FITC）标记的磷脂结合蛋白V（Annexin V）5μL和浓度为250μg/mL的碘化丙啶（PI）5μL，冰浴避光孵育10分钟，PBS洗涤，用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡情况：正常活细胞Annexin V和PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染而PI低染；坏死细胞Annexin V和PI均高染。

结果：对照组Ⅰ的细胞凋亡率为7.2%，对照组Ⅱ的细胞凋亡率为8.1%，实验组的细胞凋亡率为54.9%，表明本发明所述肿瘤疫苗能够有效诱导肿瘤细胞的凋亡，如图6所示。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，凡依据本发明的技术方案所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (8)

1.基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗，其特征在于：由内皮细胞特异分子-1干扰重组真核表达质粒和肿瘤靶向多肽FD11与pH敏感型两亲性多肽分子的融合肽以非共价键结合而成。

2.根据权利要求1所述的基于内皮细胞特异分子-1干扰的双靶标肿瘤疫苗，其特征在于：所述内皮细胞特异分子-1干扰重组真核表达质粒由内皮细胞特异分子-1和真核表达载体组成，所述内皮细胞特异分子-1干扰序列具有如SEQ ID No.2所述的核苷数序列。

3.根据权利要求2所述的基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗，其特征在于：所述真核表达载体为pEGFP-N1。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗，其特征在于：所述肿瘤靶向多肽FD11与pH敏感型两亲性多肽分子的融合肽具有如SEQ IDNo.1所述的氨基酸序列。

5.一种制备如权利要求1所述的基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

a、构建内皮细胞特异分子-1干扰重组真核表达质粒；

b、肿瘤靶向多肽FD11与pH敏感型两亲性多肽分子的融合肽；

c、肿瘤疫苗的制备：于低温、混旋条件下，向含有内皮细胞特异分子-1干扰重组真核表达质粒的5%葡萄糖中，滴加肿瘤靶向多肽FD11与pH敏感型两亲性多肽分子的融合肽溶液，滴加完毕后，在室温下继续混旋10分钟，再静置10分钟，即得肿瘤疫苗。

6.根据权利要求5所述的基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤a是先克隆得到内皮细胞特异分子-1干扰全长编码基因，再将其插入真核表达载体pEGFP-N1的HindⅢ和xho1多克隆位点之间，构建内皮细胞特异分子-1重组真核表达质粒pEGFP-N1/ESM-1；所述内皮细胞特异分子-1具有如SEQ ID No.2所述的核苷数序列。

7.根据权利要求5所述的基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤b是用固相合成法制备肿瘤靶向多肽FD11与pH敏感型两亲性多肽分子的融合肽，所述肿瘤靶向多肽FD11与pH敏感型两亲性多肽分子的融合肽具有如SEQ IDNo.1所述的氨基酸序列。

8.根据权利要求5所述的基于内皮细胞特异分子-1的双靶标肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤c是于低温、混旋条件下，向1体积份含有浓度为5mg/ml的pEGFP-N1/ESM-1和浓度为5%葡萄糖中的水溶液中，滴加1体积份浓度为2mg/ml的融合肽YHWNVIYGYTPQ-RRRRRRKKGRGDS溶液，滴加完毕后，继续混旋10分钟，再静置10分钟，即得肿瘤疫苗。