JP2013522168A - 分子の膜通過送達のためのｐｔｅｎロングリーダー配列の使用 - Google Patents

分子の膜通過送達のためのｐｔｅｎロングリーダー配列の使用 Download PDF

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Abstract

（ｉ）生体膜を通過してカーゴ分子を輸送するための配列番号１に記載の配列を有する連続したアミノ酸残基を含むペプチドと、（ｉｉ）カーゴ分子とを含む、生体膜を通過してカーゴ分子を送達するための組成物であって、カーゴ分子が配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドではない、組成物が提供される。また、生体膜を通過してカーゴ分子を輸送するための方法が提供される。また、腫瘍、癌、代謝障害、および心血管疾患を治療するための方法が提供される。
【選択図】なし

Description

本出願は、２０１０年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／３３８，３７７号の優先権を主張し、その全内容が本明細書中に参照により援用される。
本明細書に開示された研究は、米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からの助成金番号ＣＡ０８２７８３による政府支援によりなされた。従って、米国政府は本発明に特定の権利を有する。
本出願の全体において、様々な刊行物が括弧内の著者名および西暦年により参照される。これら参考文献の完全な書誌的事項は、特許請求の範囲の直前の本明細書の最後に見出すことができる。これら刊行物の開示は、全体として、参照により本出願に援用され、本発明が属する技術の状況をより完全に記載する。
背景技術
ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子（参照により全体として本明細書に援用される国際公開第ＷＯ９８／３４６２４号を参照されたい）は、重要な二次メッセンジャーであるホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸を脱リン酸化する細胞質ホスファターゼである（ＭａｅｈａｍａおよびＤｉｘｏｎ １９９８年）。この活性は、抗アポトーシス経路、細胞周期の進行および細胞代謝の増加を含むＡｋｔのＰＩＰ３活性化により開始される多くの腫瘍形成性のシグナルを下方制御する（ＳｕｌｉｓおよびＰａｒｓｏｎｓ ２００３年）。癌におけるＰＴＥＮの役割は、多くの異なる腫瘍タイプにおいて遺伝的なまたは機能的な頻繁な欠損から明らかである（ＢｏｎｎｅａｕおよびＬｏｎｇｙ ２０００年）。最初にグリア癌において欠失していることが発見され、以後は前立腺、乳房、子宮内膜、メラノサイト、腎臓および肺の腫瘍形成と関係づけられてきた。また、ＰＴＥＮの生殖系列の変異は、カウデン症候群などの遺伝性の癌素因症候群とも関連した（Ｅｎｇ ２００３年）。ＰＴＥＮ欠損のマウスモデルは、多くの異なる組織タイプにおいてヘテロ接合性マウスおよび組織特異的ノックアウトの双方で腫瘍抑制因子としての役割を再現した（Ｄｉ Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｏ，Ｐｅｓｃｅら．１９９８年；Ｋｗａｂｉ−Ａｄｄｏ，Ｇｉｒｉら．２００１年；ＰｅｔｒｏｃｅｌｌｉおよびＳｌｉｎｇｅｒｌａｎｄ ２００１年；Ｙｏｕ，Ｃａｓｔｒｉｌｌｏｎら．２００２年；Ｆｒａｓｅｒ，Ｚｈｕら．２００４年）。
ＰＴＥＮタンパク質は、Ｎ末端の二重特異性ホスファターゼドメイン、およびＣ末端のＣ２リン脂質結合ドメイン、続いて、リン酸化部位が内部に見出されることにより、調節に重要な構造化されていない尾部を含む（Ｌｅｅ，Ｙａｎｇら．１９９９年；Ｖａｚｑｕｅｚ，Ｒａｍａｓｗａｍｙら．２０００年；ＴｏｒｒｅｓおよびＰｕｌｉｄｏ ２００１年；Ｖａｚｑｕｅｚ，Ｇｒｏｓｓｍａｎら．、２００１年）。ＰＴＥＮタンパク質は、大部分は細胞質性である。しかしながら、核にＰＴＥＮが存在するという証拠が増加しており、その局在化はＮＥＤＤ４−１によるタンパク質のモノユビキチン化により制御される（Ｂａｋｅｒ ２００７年；Ｗａｎｇ，Ｔｒｏｔｍａｎら．２００７年）。
５’ＵＴＲのリボソームスキャニングは、開始コドンであるＡＵＧで生じる翻訳開始に先行する。リボソームが適切な開始コドンを決定する実際の手段はいまだに完全には理解されないままである、ｍＲＮＡ自身と開始前複合体がどこでそのスキャニングを緩徐にし、翻訳を開始させるかを指令する配列との双方の特定の特性が存在する。古典的な「コザック配列」ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ（下線で示したＡＴＧが開始コドンである）は、開始に関して最も好都合な配列であることが示されている（Ｋｏｚａｋ １９９１年）。また、ｍＲＮＡの二次構造は、おそらくヘリカーゼを必要とし、リーディングの前に二次構造を融解する開始前複合体のスキャニングを事実上緩徐化することにより開始を促進する（Ｋｏｚａｋ １９９０年）。
特定の転写物において、翻訳開始は、非ＡＵＧコドンから生じ得る。通常、これは転写物から翻訳された総タンパク質のほんの僅かな割合を含み、結果はＮ端が様々に異なる混合種のタンパク質である。Ｋｏｚａｋは、非ＡＵＧコドンからの翻訳の開始の効率を明らかにし、ＧＵＧとＣＵＧとがともにインビトロで翻訳を開始する能力があるが、効率が非常に低いことを見出した（Ｋｏｚａｋ １９８９年）。さらなる研究によって、メチオニンの利用可能性により、いまだに不明確である機構を介して翻訳開始の乱雑性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）を変化させ得ることが示され、おそらく、４３Ｓ開始前複合体の成分であるｅＩＦ２の栄養分感受性キナーゼによるリン酸化が関与することが示された（Ｈｅｒｓｈｅｙ １９９１年；Ｈａｎｎ １９９４年）。
多数のタンパク質は、代替の開始コドンから翻訳されることが示されている。転写因子であるｃ−ｍｙｃは代替の上流ＣＵＧ開始コドンを有し、翻訳された場合に１４個のアミノ酸がタンパク質のＮ末端に付加される（ＨａｎｎおよびＥｉｓｅｎｍａｎ １９８４年）。この代替のアイソフォームが、選択的にバーキットリンパ腫において破壊されることが示されている（Ｈａｎｎ，Ｋｉｎｇら．１９８８年）。組織培養において、メチオニンが低濃度である場合、長い形態のｍｙｃが高い細胞密度で優先的に転写される（Ｈａｎｎ，Ｓｌｏａｎ−Ｂｒｏｗｎら．１９９２年）。さらなる研究によって、長い形態のｃ−ｍｙｃは成長阻害性であり、古典的なｃ−ｍｙｃタンパク質と異なるセットの転写標的を有することが明らかとされた（Ｈａｎｎ，Ｄｉｘｉｔら．１９９４年）（ＦｌｏｒｋｉｅｗｉｃｚおよびＳｏｍｍｅｒ １９８９年）（Ｐｒａｔｓ，Ｋａｇｈａｄら．１９８９年）。
さらに、タンパク質の実際の細胞内局在が代替の開始コドンにより決定できることが知られている。マウスの癌原遺伝子ｉｎｔ−２の場合、上流ＣＵＧコドンからの代替の開始は核局在化をコードするが、ＡＵＧコドンは分泌性経路に局在化するためのシグナルペプチドをコードする（Ａｃｌａｎｄ，Ｄｉｘｏｎら．１９９０年）。類似する現象はヒトＦＧＦ３において記載され、ＡＵＧから翻訳されたタンパク質は分泌経路に向かうが、上流ＣＵＧから翻訳されたタンパク質は核に局在する（Ｋｉｅｆｅｒ，Ａｃｌａｎｄら．１９９４年）。さらに、ＴＥＦ−１およびＰＲＰＳ−３などのいくつかの真核生物タンパク質においては、タンパク質は完全にＣＵＧコドンから開始される（Ｔａｉｒａ，Ｉｉｚａｓａら．１９９０年；Ｘｉａｏ，Ｄａｖｉｄｓｏｎら．１９９１年）。
分泌に向かうタンパク質は、シグナルペプチドと称される疎水性アミノ酸のストレッチにより小胞体を標的とする（Ｂｌｏｂｅｌ，Ｗａｌｔｅｒら．１９７９年）。通常、タンパク質のＮ端に認められるシグナルペプチドは、翻訳の際にシグナル識別粒子（ＳＲＰ）に結合し、リボソームを停止させ、粗面小胞体にトランスロケーションし、ここでＳＲＰレセプターと結合する。一旦リボソームがドッキングしたら、ＳＲＰ−ＳＲＰレセプター複合体が放出され、翻訳がＳｅｃ６１トランスロコンを通り、ＥＲの内腔を通り再開される。次に、シグナルペプチドが可溶性タンパク質のケースにおいては切断され、Ｓｅｃトランスロコンからタンパク質が放出される。膜を貫通するタンパク質の場合、膜貫通ヘリックスは、ＥＲトランスロケーションのためのシグナルペプチドとして貢献する。これらのタンパク質は、ゴルジにおけるグリコシル化により広範に修飾され、分泌ベシクル中で形質膜に往復輸送される（Ａｌｂｅｒｔｓ ２００２年）。
癌において重要であることが示されたいくつかの分泌タンパク質が存在する。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、肺癌において変更されることが示された。Ｗｎｔは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターのファミリーに対する分泌型リガンドである。ＦｒｉｚｚｌｅｄのＷｎｔ活性化により乱れを生じ、β−カテニン分解複合体（ＡＰＣを含む）が解離し、これによりβ−カテニンのレベルが上昇し、そして核にトランスロケーションし、核でＴＣＦ転写因子と相互作用し、トランス活性化が許容される。遺伝性と散発性（ｓｐｏｒａｄｉｃ）の双方の結腸癌でＡＰＣにおける変異を不活性化すること、またβ−カテニンにおける変異を活性化することが詳細に言及されている。さらに、いくつかの細胞外のリガンドアンタゴニスト（例えば、ＳＦＲＰおよびＷｎｔ−５ａ）は、Ｗｎｔと同じＦｒｉｚｚｌｅｄレセプターと競合する。双方とも腫瘍抑制因子であることが示されている；ＳＦＲＰノックアウトマウスは、リンパ様腫瘍を発生し、Ｗｎｔ−５ａのエピジェネティックなサイレンシングがメラノーマにおいて検出された。
本明細書に開示されるように、新規な特異的に翻訳されたタンパク質のリーダー配列は、ＰＴＥＮロングと命名され、ＨＩＶ ＴＡＴに同族である細胞透過性ペプチドとして機能を果たすことができる。
発明の概要
（ｉ）生体膜を通過してカーゴ分子（ｃａｒｇｏ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を輸送するための配列番号１に記載の配列の連続したアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドと、（ｉｉ）カーゴ分子とを含む組成物であって、カーゴ分子が配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドではない組成物。
細胞内にカーゴ分子を送達するための方法であって、細胞内へのカーゴ分子の侵入を許容する条件下で、細胞を、（ｉ）生体膜を通過してカーゴ分子を輸送するための配列番号１に記載の配列の連続したアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１に記載のアミノ酸残基の一部分を含むペプチドと、（ｉｉ）カーゴ分子とを含む組成物と接触させることを含む方法であって、カーゴ分子が配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドではない方法。
対象における腫瘍を治療するための方法であって、対象において腫瘍を治療するための有効量で、カーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物のある量を対象に投与することを含み、カーゴ分子は、配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドではない、方法。
対象における癌を治療するための方法であって、対象において癌を治療するための有効量で、カーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物のある量を対象に投与することを含み、カーゴ分子は、配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドではない、方法。
対象における代謝酵素の欠損によって特徴付けられる代謝障害を治療するための方法であって、対象において代謝障害を治療するための有効量で、代謝酵素にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物のある量を対象に投与することを含む、方法。
対象における糖尿病を治療するための方法であって、対象において糖尿病を治療するための有効量で、カーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物のある量を対象に投与することを含む、方法。
対象における心血管疾患を治療するための方法であって、対象において心血管疾患を治療するための有効量で、カーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物のある量を対象に投与することを含む、方法。
ＰＴＥＮロング構築物の概略図。内因性の開始部位または代替の開始部位のいずれかからＰＴＥＮの発現を刺激するため作出された組み合わせを示している発現構築物を示す図。標準のＰＴＥＮは黒色で示され、ＵＴＲにおける翻訳領域は灰色で示される。 ヒトＰＴＥＮ ｍＲＮＡの概略を示す図。ＰＴＥＮ ｍＲＮＡは、示された標準のＡＴＧ開始コドンとインフレームでありその上流の１７３アミノ酸（配列番号９）をコードする。翻訳は、標準のＡＴＧから上流でヌクレオチド−５１９のＣＴＧで開始される。 ＰＴＥＮ オルソログのＮ端のアラインメントを示す図。示された種のＰＴＥＮタンパク質配列をＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックスを用いてアラインさせた。ヒト（配列番号１５）とマウス（配列番号１３）の両方の拡張したＮ末端配列（アステリクス）は、標準のＡＵＧ開始コドンから−５１９（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）および−５２０（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）でのＣＵＧ 代替開始コドン用いて公開されたｍＲＮＡからＯＲＦｉｎｄｅｒ（ＮＣＢＩ）を用いて翻訳された。ヒト（ＮＭ＿０００３１４）およびマウス（ＮＭ＿００８９６０）のｍＲＮＡ配列。ミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）の配列（配列番号１０）は、ベイラー医科大学のミツバチゲノムプロジェクトから得られた。線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）のＰＴＥＮ（Ｄａｆ−１８）のタンパク質配列（配列番号１１）をＷｏｒｍｂａｓｅからダウンロードした。ウシ（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ）（ＸＭ＿６１３１２５）（配列番号１２）およびチンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）（配列番号１４）（ＸＰ＿５２１５４４）をＮＣＢＩからダウンロードした。コンセンサス配列は配列番号１６である。 ＰＴＥＮロングの存在の証拠を示す図。Ａ）異なる細胞株の２つの異なるＰＴＥＮ抗体での研究。ＭＣＦ１０ＡおよびＨＥＫ２９３は、ＰＴＥＮに関して野生型である。ＢＴ５４９およびＨＣＣ１９３７はＰＴＥＮヌルであり、ＺＲ−７５−１はＰＴＥＮに変異（Ｌ１３６）を有する；Ｂ）ＰＴＥＮとＰＴＥＮロングの両方を認識するＰＴＥＮに対するモノクローナル抗体での異なる細胞株のさらなる調査；Ｃ）Ｗｔ ＥＳ細胞は、大量のＰＴＥＮロングを発現する。ＰＴＥＮロングは、これらの細胞において安定的なＰＴＥＮ ｓｈＲＮＡ発現に感受性であり、ＰＴＥＮノックアウト細胞においては全く存在しない。大部分のｐＡｋｔレベルは、ＰＴＥＮのレベルに逆に従う；Ｄ）ＰＴＥＮ ｓｉＲＮＡは、ＨＥＫ２９３細胞においてＰＴＥＮとＰＴＥＮロングの両方のノックダウンを生じる。Ｅ）ＰＴＥＮヌルＰＣ３細胞株におけるプラスミドの外因性の発現。ＰＴＥＮｏｒｆは、単に開始コドンＡＵＧのＯＲＦのみをコードする（レーン２）。ＡＴＲ（ＡＴＲ＝代替の翻訳領域）の付加によって、ＰＴＥＮロングを弱く翻訳することができる（レーン３）。上流の開始部位のＡＴＧへの変異は、タンパク質の相補物を完全にＰＴＥＮロングにシフトした（レーン５および６）。ＡＴＧ開始コドンのＡＴＡへの変異は、５５ｋＤａバンドを無効にする（レーン４および６）。Ｅ）抗体は５’ＡＴＲによりコードされるアミノ酸に対して生じ、ＨＥＫ２９３、ならびにＰＴＥＮｏｒｆまたは５’ＡＴＲ（ＡＴＧ／ＡＴＧ）をコードしているプラスミドのいずれかを過剰発現しているＰＴＥＮヌルＵ８７細胞株の双方の細胞溶解産物に使用された。ＰＴＥＮロングは、５’ＡＴＲを過剰発現している細胞にのみ見られた。Ｕ８７細胞で観察されたバックグラウンドのバンドは、ブロットの下部に存在する。 シグナルペプチド予測を示す図。ＰＴＥＮ ５’ＵＴＲ配列を翻訳し、ＳｉｇｎａｌＩＰ３．０に入力した。真核生物シグナルペプチドのためのＨｉｄｄｅｎ ｍａｒｋｏｖモデルを予測のため使用した。Ｎ領域は、シグナルペプチドの陽性に荷電したＮ末端配列を示す。Ｈ領域は、シグナルペプチドの疎水性コアである。Ｃ領域は、通常疎水性コアのヘリックスを破壊するプロリンによりマークされる穏やかに極性の領域である。切断可能性は、タンパク質がＥＲの内腔に放出されることを許容するシグナルペプチドを放出する切断部位の予測である。（ＤａｌｂｅｙおよびＨｅｉｊｎｅ，２００２年）。切断がポジション２１で発生することが予測される。示される配列は、配列番号１７である。 コンカナバリンＡプルダウンを示す図。ＨＥＫ２９３細胞を溶解し、コンカナバリンセファロースを用いてグリコシル化タンパク質をプルダウンした。溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＴＥＮ（６Ｈ２．１）で免疫ブロットした。ＰＴＥＮロングの濃縮は、プルダウン対インプットにより観察することができる。長いＰＴＥＮのバンドの濃縮に注意されたい。ＰＴＥＮは、複数の潜在的なＯ−グリコシル化部位を有するが、ただ１つのＮ−グリコシル化部位を有する。ＨＥＫ２９３細胞中でＰＴＥＮ相補物の一部がグリコシル化されるかどうかを決定するプルダウンアッセイにおいてレクチンコンカナバリン−Ａ（糖部分と結合する）を本発明者らは使用した。本発明者らはＰＴＥＮの混合物を精製することができ、これは、約５０％のＰＴＥＮロングであり、正常なＰＴＥＮを越えてＰＴＥＮロングが非常に濃縮された。これは、ＰＴＥＮロングがグリコシル化されること、およびＰＴＥＮの細胞質の５５ｋＤａ形態がグリコシル化されることまたはＰＴＥＮロングが細胞外で切断されることのいずれかを示す。 ＰＴＥＮおよびＰＴＥＮ−βがヘパランと結合することを示す図。マウスの肝臓抽出物を１ｍｌ ＨｉＴｒａｐヘパランセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）カラムに通過させた。そのカラムを５００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄し、タンパク質を連続的に１Ｍ ＮａＣｌのカラム容量で溶出した。フラクションをＰＴＥＮモノクローナル抗体を用いてＰＴＥＮに関してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＰＴＥＮは、以前に高度に陰性に荷電した種に親和性を有することが示され、ＰＴＥＮの特性により高度に陰イオン性のＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の選択性をもたらす（Ｄａｓ，Ｄｉｘｏｎら．２００３年）。ヘパランは最も陰性に荷電した生物学的分子の１つであるため、本発明者らは、ヘパランが実際にＰＴＥＮの細胞外基質への結合を媒介すると仮定した。マウスの肝臓からのタンパク質抽出物を用いて、本発明者らはＰＴＥＮがヘパランと高親和性に結合することを発見した。さらに、ヘパリンアガロースカラムから１Ｍ ＮａＣｌを用いたＰＴＥＮの連続的な溶出によって、ＰＴＥＮロングも溶出された。 プロテアーゼプロテクションアッセイを示す図。ＨＥＫ２９３細胞をプロテイナーゼＫの濃度を増加させて再懸濁した。終濃度０．２％でＴｒｉｔｏｎを、最高濃度のプロテイナーゼＫを含んでいる反応物に加えた。反応をＰＭＳＦで停止し、細胞溶解産物をｌａｅｍｌｌｉ緩衝剤において調製した。溶解産物を８％ポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＴＥＮ（６Ｈ２．１）、ＡＫＴ、Ｅ−カドヘリンに関して免疫ブロットした。ＰＴＥＮの免疫ブロットの大きなバンドが、ＰＴＥＮロングと指定された。これらのデータは、Ｅ−カドヘリンおよびＰＴＥＮロングが大部分は細胞表面にあることを示す。 馴化培地のヘパリン親和性精製からのＰＴＥＮおよびＰＴＥＮロングの高塩溶出を示す図。馴化培地からの親和性精製後、ＰＴＥＮおよびＰＴＥＮロングはＨｉＴｒａｐヘパリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）カラムから溶出することができる。ＰＴＥＮの尾部に対するモノクローナル抗体（上記）と５’ＡＴＲにおいて翻訳されたアミノ酸に特異的な抗体の両方は、質量にして約５５ｋＤａのバンドのタンパク質を認識する。 ヒト血清からのＰＴＥＮの精製を示す図。ＡＢ血液のヒト血清をプロテインＡ／Ｇで抗体を事前に清澄化してヘパリンセファロースに供した。溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＴＥＮに関してまたは重鎖混入のための対照に対する二次単独で免疫ブロットした。 図１１Ａ−図１１Ｃ。ＰＴＥＮロングの抗血管形成活性を示す図。（Ａ）ＰＴＥＮロングは、発生している網膜中の血管および毛細管のサブセットに発現する。この発現パターンは、ＰＴＥＮの標準形と明確に対照を成し、これらの領域に生じる血管退行の誘導におけるＰＴＥＮロングの役割と矛盾しない。この血管退行のプロセスが全網膜の溶解産物のウエスタンブロットの通り、高酸素により最上部右（Ｂ）、また低酸素条件下で内皮細胞におけるＰＴＥＮロングの欠損（Ｃ）により誘導される場合、この関係はＰＴＥＮロングの顕著な上方制御により強められる。これらの所見は、糖尿病性網膜症、ならびに高増殖性の血管障害などの抗血管新生治療としてのＰＴＥＮロングの有用性を示す。矢印は、ＣＤ３４およびＰＴＥＮロング陽性の組織（血管）を示す。 ＰＴＥＮロングのアポトーシス促進活性を示す図。指示される通り、アポトーシスは、精製ＰＴＥＮロングで２４時間処理されたＭＣＦ−１０Ａ乳房上皮細胞において誘導された。カスパーゼ３切断は、アポトーシス活性の指標であった。 ＰＴＥＮロングでのマウスの処理を示す図。ＰＴＥＮロングまたは空ベクター対照のいずれかで１０日処理し、キャリパー測定で測定した腫瘍サイズのグラフ。２９３細胞をｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｉｓ Ｖ５ベクターにおけるＡＴＧ／ＡＴＧ ＰＴＥＮロングでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞質溶解物を作出し、Ｖ５−抗体ビーズを通過させ、Ｖ５ペプチドで溶出した。Ｖ５−ビーズ精製溶出物のウエスタンブロットを下に示す。ＰＴＥＮロングが腫瘍を治療するため使用できるだろうとの最初の観察。異種移植片を、スキッドマウスの乳房の脂肪パッドに注射したＵ８７神経膠芽細胞腫細胞（１００万個）を用いて樹立した。治療を移植の約２週後に開始した。 ＰＴＥＮロングでのマウスの治療の結果を示す図。グラフは、１４日間の対照およびＰＴＥＮロングの注射で処理したマウスの生存率を示す（日数）。 ＰＴＥＮ（５’ＵＴＲを欠損しているＰＴＥＮｏｒｆ）、ＰＴＥＮロング、およびＧからＲへの変異をアミノ酸３０５に有するＰＴＥＮロング（ＰＴＥＮｏｒｆにおけるＧ１２９Ｒ変異に匹敵する）について示された構築物を２９３細胞にトランスフェクトしたことを示す図。これらの細胞からの精製タンパク質を用いて、ＰＴＥＮロングが活性なホスファターゼであること、またＰＴＥＮロングＧ３０５Ｒ変異（これはＰＴＥＮにおけるＧ１２９Ｒである）がホスファターゼ活性を低下させたことが示された。 ホスファターゼ活性がＰＴＥＮロング活性に必須であり、ＰＴＥＮロング（Ｇ３０５Ｒ）変異の実験で示されたことを示す図。ＰＴＥＮの文献に基づいて、Ｃ２ドメインの内側に作出された短縮体はタンパク質を不安定化することが知られている。また、ＰＴＥＮの結晶構造に基づいて、Ｃ２ドメインとホスファターゼドメインとの間の相互作用がホスファターゼ活性に重要であると考えられている。したがって、Ｃ末端でのＰＴＥＮロング活性のための最小ドメインは、Ｃ２ドメインを必要とするが、尾部を必要としない。Ｎ末端で、予測された切断部位は、アミノ酸２１である。したがって、タンパク質の機能領域はこの領域内にある。この点に関して、Ｕ８７腫瘍をＰＴＥＮまたはＰＴＥＮロングと対比して処理した場合、有意な効果はＰＴＥＮ治療では観察されず、ＰＴＥＮロング治療でのみ観察されることに注意することが重要である。 ＨｉｓおよびＶ５タグを有するｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター中のＡＴＧ／ＡＴＧ−ＰＴＥＮロングでトランスフェクトされた２９３細胞からのＰＴＥＮロングの精製を示す図。Ｎｉ＋カラム溶出後、溶出液をゲルろ過カラムで分離した。ＯＤ２８０を青線で示す。ＰＴＥＮロングは、フラクション７〜１８に濃縮された。本実験の収量は、約１ｍｇであった。矢印は、ＰＴＥＮロングおよび移動性が変化したＰＴＥＮロング産物を示す。 図１８Ａ−１８Ｂ。（Ａ）読み出した情報として細胞死を用いたＬＮＣａＰ前立腺癌細胞とＰＴＥＮロング精製タンパク質との用量反応（タンパク質はＡＲＶＹＳにより精製された）を示す図。１×は、０．３３マイクログラム／ｍｌに等しい。細胞を増殖因子不含の培地で処理した。２４時間後、細胞を血清不含培地で洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝剤で溶解した。示されたタンパク質に関してウエスタンブロットを行った。（Ｂ） ＰＴＥＮロング、ＰＴＥＮロング（Ｇ３０５Ｒ）またはＭｏｃｋ対照で処理したＵ８７神経膠芽細胞腫細胞は、ＰＡＲＰの切断およびセリン４７３でのｐＡＫＴシグナルのダウンレギュレーションにより示されるようなアポトーシスの誘導を示す図。これらのデータによって、ＰＴＥＮロングがアポトーシスを誘導し、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を減少できることがさらに確認される。 図１９Ａ−Ｃ。ＡＫＴＡ精製されたＰＴＥＮロングタンパク質は、キャリパーと、ｘｅｎｏｇｅｎ動物生体イメージングシステムと組み合わせたルシフェラーゼレポーター使用の両方により測定された通り、５日間にわたり腫瘍サイズを減少させることができたことを示す図。マウスは、約０．０５ｍｇ ＰＴＥＮロング／日を５日間与えられた。異種移植片は、ＦＵＷ−ルシフェラーゼ−ネオで感染させたため、ルシフェラーゼを発現する乳房の脂肪パッドに注射された１００万個のＵ８７神経膠芽細胞腫細胞で樹立された。マウスに、Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍによる撮像の１０分前に腹腔内にルシフェリンを注射した。（Ａ）治療前（左パネル）および５日治療時（右パネル）の４匹のマウスに関するルシフェラーゼ測定。（Ｂ）治療前と５日治療間のキャリパー測定（ｃｍ２）。（Ｃ）パネルに画像化され、Ｘｅｎｏｇｅｎシステムにより検出された光子。コホートの４匹のマウスに関する標準誤差が示される。０日から５日で検出された光子に関するスチューデントのｔ−検定。 独立した実験において、Ｕ８７腫瘍をＰＴＥＮ（ｏｒｆ−４０３アミノ酸；ｎ＝５）、ＰＴＥＮロング（Ｇ３０５Ｒ；ｎ＝５）または野生型ＰＴＥＮロング（ｎ＝４）での処理前に１．５ｃｍ２に増殖させた。処理の５日後、平均のルミネセンス変化は、ＰＴＥＮロング処理マウスで有意な減少を示すが、ＰＴＥＮまたはＰＴＥＮロング（Ｇ３０５Ｒ）処理されたコホートに関して減少しないことを示す。ルミネセンスの減少は、腫瘍サイズの減少と相関する。これらのデータによって、ＰＴＥＮロングは機能するために５’ＡＴＲおよびホスファターゼ活性を必要とすることが実証された。 図２１Ａ−２１Ｃ。ＰＴＥＮロング−処理されたＵ８７異種移植片の分析によって、アポトーシスの活性化およびＰＩ３Ｋシグナル伝達の阻害が実証されたことを示す図。腫瘍を上記の通り、５日処理した。（Ａ）ＰＴＥＮロングの野生型およびＧ３０５Ｒで処理した腫瘍を、示された処理の５日後に回収し、ウエスタン分析のために溶解した。ＰＴＥＮロングに関する野生型タンパク質は、ＦＯＸＯおよびＡＫＴのリン酸化が減少し、カスパーゼ−３切断を活性化することができた。（Ｂ）示された通り、５日処理した典型的な腫瘍をホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。切片を切断されたカスパーゼ−３（アポトーシスのマーカー）を検出する抗体で染色した。ＰＴＥＮロング処理細胞は、アポトーシス細胞のパーセントの有意な増加を有する（Ｐ＝０．０４１９、スチューデントのｔ−検定）。（Ｃ）切断されたカスパーゼ−３染色の典型的な画像。 図２２Ａ−２２Ｂ。５日間ＰＴＥＮロングで処理した同じ腫瘍において、血管の数は非常に減少したことを示す図。ＰＴＥＮロングの野生型およびＧ３０５Ｒで処理した腫瘍を示された処理の５日後に回収し、ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。切片をＣＤ３１（血管に沿って並ぶ内皮細胞のマーカー）を検出する抗体で染色した。（Ａ）ＰＴＥＮロング処理された細胞は、血管数／視野（４０倍対物）の有意な減少を有した（Ｐ＝０．００７５７９、スチューデントのｔ−検定）。（Ｂ）ＣＤ３１染色の典型的な画像。 図２３Ａ−２３Ｂ。Ｕ８７異種移植片は、６つの群（ｎ＝３／群）で樹立され、ＰＴＥＮロングを筋肉内（ＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、腫瘍内（ＩＴ）、皮下（ＳＣ）、静脈内（ＩＶ）注射で４日治療したことを示す図。（Ａ）キャリパーにより測定された０日〜４日の腫瘍サイズ（ＣＭ２）の変化の平均。（Ｂ）ｘｅｎｏｇｅｎ撮像からの典型的な画像を右に示す。このデータから、全ての注射法が無処置のマウスと比較して腫瘍成長に影響すること、またＩＭで処理したコホートのみが退行量の有意な減少を示したことを本発明者らは結論づけることができる。 図２４Ａ−２４Ｃ。異種移植実験を乳房、脳、および前立腺に由来する６つの細胞株で行ったことを示す図。上部は、４つの乳癌細胞株で記された変化である。（Ａ、ＢおよびＤ）。示された処置日にキャリパーで測定した腫瘍表面領域（ｃｍ２）のグラフ。（Ｃ）ＨＣＴ−１１４３細胞における変化は、僅かに処置の２４時間後に認められた。全ての４つの細胞株において、処置後に腫瘍サイズが明らかに減少する。 ＰＴＥＮロングは細胞に結合することを示す図。ＰＴＥＮロングタンパク質をＵ８７細胞培地に氷上で１０分間添加し、固定し、次に、ＰＴＥＮロングを認識する抗体でＰＴＥＮロングを染色した。 Ｍｉｌｅｓアッセイ：血管透過性の誘導はＰＴＥＮロングにより阻害されることを示す図。この阻害は、精製タンパク質をＰＴＥＮ抗体（６Ｈ２．１）とプレインキュベーションすることにより逆転させることができる。ＰＴＥＮロングは、ＶＥＧＦによる血管透過誘導を阻害することができる。この誘導は、ＰＴＥＮロングをＰＴＥＮに対して生じる抗体とプレインキュベーションすることにより回復することができるが、対照ＩｇＧではできない。 より効率的に翻訳された形態を生じさせるための、初期ロイシン（Ｌ）からメチオニン（Ｍ）への突然変異後のＰＴＥＮロングの５７６アミノ酸リーディングフレーム（一文字コード）（配列番号５）を示す図。ＰＴＥＮの最初に記載されているＰＴＥＮ４０３アミノ酸リーディングフレームは下線のコドンから開始する。 最初の２１アミノ酸が除去された、細菌において発現させるためのＰＴＥＮロングのＭＳＥＳバージョン（配列番号６）を示す図。Ｃ末端のＶ５−Ｈｉｓエピトープタグ（配列番号７）をＣ末端に融合した（イタリック）。一連のアルギニン（Ｒ）および１５３アミノ酸のＰＴＥＮロングリーダー配列の最後のアミノ酸に下線を付す。 細胞質（Ｃ）および核（Ｎ）のフラクションのウエスタンブロットは、ＭＳＥＳ ＰＴＥＮロングが細胞の両方のコンパートメントに侵入することを指示することを示す図。ＢＡＦ１８０およびチューブリンに対する抗体を用いて、細胞分画を調整した。Ｖ５エピトープを用いて、全てのＰＴＥＮ構築物の侵入を測定した。ＰＴＥＮロング抗体を用いて、ＰＴＥＮロングの侵入とＲ６欠失を測定した。 ＰＬ−ｐ５３の生成を示す図。ＰＬと呼ばれるＰＴＥＮロングＭＳＥＳの１５３アミノ酸リーダー配列（下線）をヒト５３の３９３アミノ酸配列（一文字コード）に融合した（配列番号８）。Ｖ５ ＨＩＳエピトープタグ（イタリック）（配列番号７）をｐ５３のＣ末端に付与した。 図３１Ａ−３１Ｄ。ＰＬ−ｐ５３は核に侵入し、腫瘍増殖を抑制することを示す図。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＨ１２９９細胞の培地（１ｍｇ／ｍｌ）のＰＬ−ｐ５３の添加は、核への取り込みをもたらす。核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）分離は、クロマチン再構築因子であるＢＡＦ１８０と細胞質因子であるチューブリンに対する抗体を用いてモニターされた。ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞について、ｐ５３抗体は、処理試料において増加した、疑似処理された試料中の内因性突然変異ｐ５３を検出した。Ｈ１２９９細胞について、ＰＬ−ｐ５３に融合されたＶ５エピトープは、処理試料においてのみ観察された。１０日間の０．０５ｍｇ／日でのＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の処理により、疑似処理されたＲＦＰ対照と比較して、腫瘍増殖の有意な減少をもたらしたことを示す図（図３１Ｃ）。経時的なＨ１２９９細胞へのＰＬ−ｐ５３の添加による、急激な取り込みと、その後の時間点でのＰＵＭＡおよびｐ２１の誘導を示す図（図３２Ｄ）。 細菌発現させたＭＳＥＳ ＰＴＥＮロング（Ｌｏｎｇ）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質疑似対照）、ＩｇＧ対照、および細胞内への取り込みをブロックする抗ＰＴＥＮ抗体１３８Ｇ６で処理されたマウスにおける耐糖能試験を示す図。
（ｉ）生体膜を通過してカーゴ分子を輸送するための配列番号１に記載の配列の連続したアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドと、（ｉｉ）カーゴ分子とを含む組成物であって、カーゴ分子が配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドではない組成物。
一実施形態において、上記ペプチドは、上記カーゴ分子に共有結合されている。一実施形態において、上記ペプチドは、ジスルフィド結合を介して上記カーゴ分子に共有結合されている。一実施形態において、上記ペプチドは、上記カーゴ分子に非共有結合されている。
一実施形態において、上記カーゴ分子は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ナノ粒子、リポソーム、ファージ、ウイルスベクター、プラスミドＤＮＡ、核酸、ペプチド核酸、またはモルホリノ化合物である。一実施形態において、上記カーゴ分子は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり、ここで、上記カーゴ分子を輸送するための上記ペプチドは、ペプチド結合を介して上記カーゴ分子に共有結合されている。一実施形態において、上記カーゴ分子は核酸であり、ＤＮＡである。一実施形態において、上記カーゴ分子は核酸であり、ＲＮＡである。一実施形態において、上記カーゴ分子は核酸であり、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一実施形態において、上記カーゴ分子は核酸であり、ヒトｐ５３タンパク質をコードする。一実施形態において、上記カーゴ分子は核酸であり、腫瘍抑制タンパク質をコードする。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はｐ１６である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＦである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＶＨＬである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＳＭＡＤ４である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＩＤ１Ａである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＡＦ１８０である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ１である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ２である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＲＢである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＬＫＢ１である。一実施形態において、上記カーゴ分子はタンパク質であり、ヒトｐ５３タンパク質である。一実施形態において、上記カーゴ分子はタンパク質であり、腫瘍抑制タンパク質である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はｐ１６である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＦである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＶＨＬである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＳＭＡＤ４である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＩＤ１Ａである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＡＦ１８０である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ１である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ２である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＲＢである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＬＫＢ１である。一実施形態において、上記カーゴ分子はタンパク質であり、酵素である。一実施形態において、上記酵素は代謝酵素である。一実施形態において、上記カーゴ分子はポリペプチドまたはタンパク質であり、抗原である。一実施形態において、上記カーゴ分子はボツリヌス毒素またはその断片である。一実施形態において、上記カーゴ分子はＢＣＬ２またはチオレドキシンである。
一実施形態において、上記カーゴ分子は診断用薬である。一実施形態において、上記診断用薬は、放射線不透過性造影剤、常磁性造影剤、超常磁性造影剤、蛍光体、またはコンピューター断層撮影造影剤である。
一実施形態において、上記カーゴ分子は治療薬である。一実施形態において、上記治療薬は生物学的に活性な小分子である。一実施形態において、上記治療薬は、細胞毒性分子または化学療法薬または放射線治療薬である。
一実施形態において、上記カーゴ分子は、高分子リンカーを介して、輸送するための上記ペプチドに結合されている。一実施形態において、上記高分子リンカーはポリエチレングリコールである。
一実施形態において、上記カーゴ分子は核酸である。一実施形態において、上記カーゴ分子はタンパク質であり、分子量が最大１６０ｋＤａである。
一実施形態において、生体膜を通過してカーゴ分子を輸送するための配列番号１に記載の配列を有する連続したアミノ酸残基を含むペプチドは誘導体化される。一実施形態において、上記ペプチドは、配列番号１に記載の配列を有する連続したアミノ酸残基を含む。
一実施形態において、上記組成物は、配列番号８に記載されている配列を有する連続したアミノ酸残基を含む。
細胞内へのカーゴ分子の侵入を許容する条件下で、細胞と、（ｉ）生体膜を通過してカーゴ分子を輸送するための配列番号１に記載の配列の連続したアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１に記載のアミノ酸残基の一部分を含むペプチドと、（ｉｉ）カーゴ分子とを含む組成物とを接触させることを含み、カーゴ分子が配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドではない、細胞内にカーゴ分子を送達するための方法。
一実施形態において、上記ペプチドは、上記カーゴ分子に共有結合されている。一実施形態において、上記ペプチドは、ペプチド結合を介して上記カーゴ分子に共有結合されている。一実施形態において、上記ペプチドは、ジスルフィド結合を介して上記カーゴ分子に共有結合されている。一実施形態において、上記ペプチドは、上記カーゴ分子に非共有結合されている。
一実施形態において、上記カーゴ分子は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ナノ粒子、リポソーム、ファージ、ウイルスベクター、プラスミドＤＮＡ、核酸、ペプチド核酸、またはモルホリノ化合物である。一実施形態において、上記カーゴ分子は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり、ここで、上記カーゴ分子を輸送するための上記ペプチドは、ペプチド結合を介して上記カーゴ分子に共有結合されている。一実施形態において、上記カーゴ分子は核酸であり、ＤＮＡである。一実施形態において、上記カーゴ分子は核酸であり、ＲＮＡである。一実施形態において、上記カーゴ分子は核酸であり、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一実施形態において、上記カーゴ分子は核酸であり、ヒトｐ５３タンパク質をコードする。一実施形態において、上記カーゴ分子は核酸であり、腫瘍抑制タンパク質をコードする。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はｐ１６である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＦである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＶＨＬである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＳＭＡＤ４である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＩＤ１Ａである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＡＦ１８０である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ１である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ２である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＲＢである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＬＫＢ１である。一実施形態において、上記カーゴ分子はタンパク質であり、ヒトｐ５３タンパク質である。一実施形態において、上記カーゴ分子はタンパク質であり、酵素である。一実施形態において、上記酵素は代謝酵素である。一実施形態において、上記カーゴ分子はタンパク質であり、腫瘍抑制タンパク質である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はｐ１６である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＦである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＶＨＬである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＳＭＡＤ４である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＩＤ１Ａである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＡＦ１８０である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ１である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ２である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＲＢである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＬＫＢ１である。一実施形態において、上記カーゴ分子はポリペプチドまたはタンパク質であり、抗原である。一実施形態において、上記カーゴ分子はボツリヌス毒素またはその断片である。一実施形態において、上記カーゴ分子はＢＣＬ２である。一実施形態において、上記カーゴ分子はチオレドキシンである。
一実施形態において、上記カーゴ分子は診断用薬である。一実施形態において、上記診断用薬は、放射線不透過性造影剤、常磁性造影剤、超常磁性造影剤、蛍光体、またはコンピューター断層撮影造影剤である。
一実施形態において、上記カーゴ分子が治療薬である。一実施形態において、上記治療薬は生物学的に活性な小分子である。一実施形態において、上記治療薬は、細胞毒性分子または化学療法薬または放射線治療薬である。
一実施形態において、上記ペプチドは、配列番号１に記載の配列を有する連続したアミノ酸残基を含む。一実施形態において、上記細胞は腫瘍細胞である。一実施形態において、上記細胞はヒト対象内にある。
一実施形態において、上記組成物は、配列番号８に記載されている配列を有する連続したアミノ酸残基を含む。
対象における腫瘍を治療するための方法であって、対象において腫瘍を治療するための有効量で、カーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物のある量を対象に投与することを含み、上記カーゴ分子が、配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドではない、方法。
対象における腫瘍を治療するための有効量の、対象において腫瘍を治療するための、カーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物であって、上記カーゴ分子が、配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドではない、組成物。
一実施形態において、上記カーゴ分子は腫瘍抑制タンパク質である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパクはｐ５３である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はｐ１６である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＦである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＶＨＬである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＳＭＡＤ４である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＩＤ１Ａである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＡＦ１８０である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ１である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ２である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＲＢである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＬＫＢ１である。
一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパクはｐ５３であり、上記組成物は連続したアミノ酸を含み、その配列は配列番号８に記載されている。
一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、上記カーゴ分子に共有結合されている。一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、ペプチド結合を介して上記カーゴ分子に共有結合されている。一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、ジスルフィド結合を介して上記カーゴ分子に共有結合されている。
一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、上記カーゴ分子に非共有結合されている。
対象における癌を治療するための方法であって、対象において癌を治療するための有効量で、カーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物のある量を対象に投与することを含み、上記カーゴ分子が、配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドではない、方法。
対象における腫瘍を治療するための有効量の、対象において癌を治療するための、カーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物であって、上記カーゴ分子が、配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドではない、組成物。
一実施形態において、上記カーゴ分子は腫瘍抑制タンパク質である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパクはｐ５３である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はｐ１６である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＦである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＶＨＬである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＳＭＡＤ４である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＩＤ１Ａである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＡＦ１８０である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ１である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ２である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＲＢである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＬＫＢ１である。
一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はｐ５３であり、上記組成物は連続したアミノ酸を含み、その配列は配列番号８に記載されている。
一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、上記カーゴ分子に共有結合されている。一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、ペプチド結合を介して上記カーゴ分子に共有結合されている。一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、ジスルフィド結合を介して上記カーゴ分子に共有結合されている。
一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、上記カーゴ分子に非共有結合されている。
対象における代謝酵素の欠損によって特徴付けられる代謝障害を治療するための方法であって、対象において代謝障害を治療するための有効量で、代謝酵素にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物のある量を対象に投与することを含む、方法。
対象における代謝酵素の欠損によって特徴付けられる代謝障害を治療するための代謝酵素にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物。
一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、上記代謝酵素に共有結合されている。一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、ペプチド結合を介して上記代謝酵素に共有結合されている。一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、ジスルフィド結合を介して上記代謝酵素に共有結合されている。
一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、上記代謝酵素に非共有結合されている。
対象における糖尿病を治療するための方法であって、対象において糖尿病を治療するための有効量で、カーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物のある量を対象に投与することを含む、方法。
対象における糖尿病を治療するためのカーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物。
一実施形態において、上記カーゴ分子は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ナノ粒子、リポソーム、ファージ、ウイルスベクター、プラスミドＤＮＡ、核酸、ペプチド核酸、またはモルホリノ化合物である。
一実施形態において、上記カーゴ分子は、配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドである。一実施形態において、上記組成物は連続したアミノ酸を含み、その配列は配列番号６に記載されている。
一実施形態において、上記カーゴ分子はタンパク質であり、上記タンパク質は腫瘍抑制タンパク質である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はｐ５３である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はｐ１６である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＦである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＶＨＬである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＳＭＡＤ４である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＩＤ１Ａである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＡＦ１８０である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ１である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ２である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＲＢである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＬＫＢ１である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はｐ５３であり、上記組成物は連続したアミノ酸を含み、その配列は配列番号８に記載されている。
一実施形態において、上記カーゴ分子はＢＣＬ２である。一実施形態において、上記カーゴ分子はチオレドキシンである。
一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、上記カーゴ分子に共有結合されている。一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、ペプチド結合を介して上記カーゴ分子に共有結合されている。一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、ジスルフィド結合を介して上記カーゴ分子に共有結合されている。
一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、上記カーゴ分子に非共有結合されている。
対象における心血管疾患を治療するための方法であって、対象において心血管疾患を治療するための有効量で、カーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物のある量を対象に投与することを含む、方法。
対象における心血管疾患を治療するためのカーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物。
一実施形態において、上記カーゴ分子は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ナノ粒子、リポソーム、ファージ、ウイルスベクター、プラスミドＤＮＡ、核酸、ペプチド核酸、またはモルホリノ化合物である。
一実施形態において、上記カーゴ分子は、配列番号４に記載されている配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドである。一実施形態において、上記組成物は連続したアミノ酸を含み、その配列は配列番号６に記載されている。
一実施形態において、上記カーゴ分子はタンパク質であり、上記タンパク質は腫瘍抑制タンパク質である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はｐ５３である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はｐ１６である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＦである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＶＨＬである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＳＭＡＤ４である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＡＲＩＤ１Ａである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＡＦ１８０である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ１である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＢＲＣＡ２である。
一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＲＢである。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はＬＫＢ１である。一実施形態において、上記腫瘍抑制タンパク質はｐ５３であり、上記組成物は連続したアミノ酸を含み、その配列は配列番号８に記載されている。
一実施形態において、上記カーゴ分子がＢＣＬ２である。一実施形態において、上記カーゴ分子はチオレドキシンである。
一実施形態において、上記心血管疾患は、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心筋症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、うっ血性心不全、心筋梗塞、および虚血再灌流障害からなる群から選択される。一実施形態において、上記心血管疾患はアテローム性動脈硬化症である。
一実施形態において、上記心血管疾患は心筋梗塞である。一実施形態において、上記心血管疾患は心筋梗塞であり、上記組成物は心筋梗塞中に投与される。一実施形態において、上記組成物は細胞死を妨げるのに有効な量で投与される。
一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、上記カーゴ分子に共有結合されている。一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、ペプチド結合を介して上記カーゴ分子に共有結合されている。一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、ジスルフィド結合を介して上記カーゴ分子に共有結合されている。
一実施形態において、上記配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドは、上記カーゴ分子に非共有結合されている。
「カーゴ分子を輸送するための」ペプチドとは、本明細書で使用するとき、細胞透過性ペプチドとして作用するペプチドであり、生体膜を通過して、そのペプチドに結合する分子（「カーゴ分子」）の輸送を媒介するペプチドである。
「カーゴ分子」とは、本明細書で使用するとき、本明細書に記載されている輸送ペプチドの１つに共有結合または非共有結合されている、生体膜を通過して、例えば、細胞外空間から細胞内空間に運ばれる対象とする分子である。上記カーゴ分子がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である一実施形態において、上記輸送ペプチドは、融合タンパク質を形成するように上記カーゴ分子にペプチド結合を介して共有結合され得る。配列番号４に記載されているＰＴＥＮポリペプチドは、カーゴ分子の定義から明確に除かれる。
本明細書で使用するとき、「ｓｉＲＮＡ」とは、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡであり、通常、約１９〜２５ヌクレオチド長であり、多くの場合、各末端に３’突出部（２ヌクレオチド）を有する。カーゴ分子を輸送するためのペプチドにｓｉＲＮＡを共有結合させる１つの方法は、ｓｉＲＮＡセンス鎖の５’末端でジスルフィド結合を介する。
本明細書で使用するとき、「心血管疾患」とは、哺乳動物の心臓の正常な生理学的機能および／または心血供給および／または他の血管成分に影響を及ぼす病理学的状態を意味し、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心筋症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、うっ血性心不全、心筋梗塞、および虚血再灌流障害が挙げられる。
「化学療法薬」は、本明細書で使用するとき、癌を治療するために、当該技術分野において使用されるアルキル化剤、抗代謝産物、アントラサイクリン、植物性アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、またはチロシンキナーゼ阻害剤である。
「放射線治療薬」は、本明細書で使用するとき、癌を治療するために、当該技術分野において使用される放射性同位体である。
「小分子」は、本明細書で使用するとき、高分子ではなく、分子量が１ｋＤａ未満であり、より通常には８００Ｄａ未満である低分子量有機化合物である。
いくつかの実施形態において、腫瘍は癌性細胞である。さらなる実施形態において、上記癌性腫瘍は、対象のグリア細胞、前立腺、卵巣、子宮、子宮内膜、乳房、メラニン細胞、腎臓、肺、結腸、頭部、頸部、または膵臓の腫瘍である。
一実施形態において、上記カーゴ分子は腫瘍抑制タンパク質である。「腫瘍抑制タンパク質」は、本明細書で使用するとき、細胞周期の調節に対して弱めるかもしくは抑制する効果を有し、またはアポトーシスを促進する、あるいはある場合にはその両方である、腫瘍抑制遺伝子によってコードされるタンパク質である。腫瘍抑制タンパク質の非制限的な例には、ｐ５３、ｐ１６、ＡＲＦ、ＶＨＬ、ＳＭＡＤ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＡＦ１８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＢおよびＬＫＢ１が含まれる。
一実施形態において、上記カーゴ分子はｐ５３タンパク質もしくはｐ５３をコードする核酸（ＴＰ５３腫瘍タンパク質ｐ５３、ホモサピエンス−Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＧｅｎｅＩＤ：７１５７）またはその活性な断片、あるいはその単一ヌクレオチド多型またはその断片である。
カーゴ分子を輸送するための本明細書に記載されているペプチド配列は、概して、細胞透過性ペプチドであるが、細胞透過性ペプチドは、典型的には３０アミノ酸またはそれ未満である。細胞透過性ペプチドを用いたＲＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）の細胞への送達は、全体として参照により本明細書に援用されるＭａｔｈｕｐａｌａら．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｌｉｅｒ Ｐａｔ．２００９年 Ｆｅｂｒｕａｒｙ；１９（２）：１３７−１４０に記載されている。細胞透過性ペプチドを用いたワクチンの送達は、全体として参照により本明細書に援用されるＢｒｏｏｋら，Ｂｉｃｃｈｉｒｎ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０１０年 Ｊａｎ；１８０５（１）：２５−３４に記載されている。ナノ粒子、リポソーム、および他のナノキャリアの送達の送達は、全体として参照により本明細書に援用されるＪｕｌｉａｎｏら．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ Ｎｃｍｏｍｅｄ Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｌｍｏｌ．２００９年 Ｍａｙ；１（３）：３２４−３５に記載されている。細胞透過性ペプチドを用いた化学療法薬および抗癌剤の送達は、全体として参照により本明細書に援用されるＢｉｔｌｅｒら．Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００９年 Ｄｅｃ ２．，Ｅｐｕｂに記載されている。
障害／疾患を「治療すること」とは、障害の進行を遅延させ、停止させ、もしくは逆転させ、および／または障害の症状を改善させ、減少させ、または除去することを意味する。したがって、障害を治療することには、障害の進行を逆転させることを包含し、障害自体の排除に至るまでの治療を含む。
本明細書に記載されている方法の一実施形態において、方法は、予防的に有効な量のカーゴ分子を対象に送達させるために用いられる。本明細書で使用するとき、物質の「予防的に有効な」量は、その物質が投与される対象において所定の病理学的状態の開始を妨げるかまたは遅延させるのに有効な量である。本明細書に記載されている方法の一実施形態において、方法は、治療的に有効な量のカーゴ分子を対象に送達させるために用いられる。本明細書で使用するとき、物質の「治療的に有効な」量は、その物質が投与される対象に、所定の病理学的状態を患っている対象において、その状態の症状または原因を治療し、改善しまたは減少するのに有用な量である。
一実施形態において、治療的にまたは予防的に有効な量は、投薬あたり約１ｍｇ薬剤／対象から約１ｇ薬剤／対象である。別の実施形態において、治療的にまたは予防的に有効な量は、約１０ｍｇ薬剤／対象から５００ｍｇ薬剤／対象である。さらなる実施形態において、治療的にまたは予防的に有効な量は、約５０ｍｇ薬剤／対象から２００ｍｇ薬剤／対象である。さらなる実施形態において、治療的にまたは予防的に有効な量は、約１００ｍｇ薬剤／対象である。なおさらなる実施形態において、治療的にまたは予防的に有効な量は、５０ｍｇ薬剤／対象、１００ｍｇ薬剤／対象、１５０ｍｇ薬剤／対象、２００ｍｇ薬剤／対象、２５０ｍｇ薬剤／対象、３００ｍｇ薬剤／対象、４００ｍｇ薬剤／対象、および５００ｍｇ薬剤／対象から選択される。
本明細書に記載されている方法の一実施形態において、ペプチドおよびカーゴ分子を含む組成物は、当業者に知られている種々の方法および送達システムのいずれかを用いて対象に投与される。上記投与は、例えば、静脈内、経口、鼻腔内、腹腔内、脳脊髄液経由、インプラント経由、経粘膜的、経皮、筋内、血管内、動脈内、冠動脈内、心筋内または皮下であってもよい。
本明細書に記載されている方法の一実施形態において、組成物は、腫瘍に直接導入することによって対象に投与される。本明細書に記載されている方法の一実施形態において、組成物は固形腫瘍に注射される。本明細書に記載されている方法の一実施形態において、組成物は、カテーテルによって腫瘍内に直接導入される。本明細書に記載されている方法の一実施形態において、組成物は、腫瘍に分布している血管内に直接導入することによって対象に投与される。本明細書に記載されている方法の一実施形態において、組成物は腫瘍に分布している血管内に注射される。本明細書に記載されている方法の一実施形態において、組成物は、腫瘍に分布している血管内にカテーテルによって直接導入される。本明細書に記載されている方法の一実施形態において、組成物は、対象に静脈内投与される。本明細書に記載されている方法の一実施形態において、組成物は、対象に皮下投与される。
ＰＴＥＮなる用語は、配列番号４によって定義されるポリペプチドを指す。
ＰＴＥＮロングは、他に、時々、ＰＴＥＮ−ベータ、ＰＴＥＮ−β、ＰＴＥＮ−Ｓと呼ばれている。
本明細書に記載されている組成物についての注射可能な薬物送達システムには、溶液、懸濁液、ゲル、微粒子および高分子注射物質が含まれ、賦形剤、例えば、可溶性改変剤（例えば、エタノール、プロピレングリコールおよびショ糖）およびポリマー（例えば、ポリカプリラクトンおよびＰＬＧＡ）が挙げられる。移植可能なシステムは、杆状体および円板を含み、非制限的な例としてＰＬＧＡおよびポリカプリラクトンなどの賦形剤を含むことができる。
本発明の組成物についての経口送達システムは、錠剤およびカプセル剤を含む。これらは、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、他のセルロース系材料およびスターチ）、希釈剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、スターチ、リン酸二カルシウムならびにセルロース系材料）、崩壊剤（例えば、スターチポリマーおよびセルロース系材料）、および潤滑剤（例えば、ステアリン酸塩およびタルク）などの賦形剤を含むことができる。
本発明の組成物についての経粘膜送達システムには、パッチ、錠剤、坐薬、ペッサリー、ゲルおよびクリームを含み、可溶化剤および増強剤（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩およびアミノ酸）および他のビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒアルロン酸などの親水性ポリマー）などの賦形剤を含むことができる。
本発明の組成物についての経皮送達システムは、例えば、水性および非水系のゲル、クリーム、多層エマルション、ミクロエマルション、リポソーム、軟膏、水性および非水系の溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素基材および粉末を含み、可溶化剤、浸透増強剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコールおよびアミノ酸）、および親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）などの賦形剤を含むことができる。一実施形態において、医薬として許容される担体は、リポソームまたは経皮増強剤である。
本発明の組成物についての再構成可能な送達システムのための溶液、懸濁液および粉末は、懸濁剤（たとえば、ゴム質、ザンタン、セルロース化合物および糖）、湿潤剤（たとえば、ソルビトール）、可溶化剤（たとえば、エタノール、水、ＰＥＧおよびプロピレングリコール）、界面活性物質（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、スパン、ツイーンおよびセチルピリジン）、防腐剤および抗酸化剤（たとえば、パラベン、ビタミンＥおよびＣおよびアスコルビン酸）、固化防止剤、被覆剤、ならびにキレート薬（たとえば、ＥＤＴＡ）などの媒体を含む。
本明細書で使用するとき、「５’ＡＴＲ」は、本明細書の以下の実験のセクションに記載されている５’代替の翻訳領域である。
一実施形態において、本明細書に記載される組成物は、薬学的な担体をさらに含む。本明細書で使用するとき、「薬学的な担体」は、動物またはヒトに対して本発明の組成物を送達するための医薬として許容される溶媒、懸濁剤またはビヒクルである。担体は、液体、エアロゾル、ゲルまたは固形であってもよく、計画された投与の様式を考慮して選択される。
本明細書に記載されている方法の一実施形態において、細胞は、固形腫瘍細胞である腫瘍細胞である。本明細書に使用されるように「固形腫瘍」は、癌性および非癌性の固形腫瘍を含む。癌性の固形腫瘍には、限定されないが、胆道癌；神経膠芽細胞腫および髄芽腫を含む脳癌；乳癌；子宮頚癌；絨毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；ボーエン病およびパジェット病を含む上皮内の新生物；肝臓癌；肺癌；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽腫；扁平上皮癌を含む口腔癌；上皮細胞、間質性細胞、胚細胞および間充織細胞から発生するものを含む卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；結腸直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫を含む肉腫；メラノーマ、カポジ肉腫、基底細胞癌および扁平上皮細胞癌を含む皮膚癌；胚腫瘍（セミノーマ、非セミノーマ［奇形腫、絨毛癌］）、間質腫瘍および胚細胞腫瘍を含む精巣癌；甲状腺癌および髄様癌を含む甲状腺癌；および腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎臓癌が含まれるが、非固形組織の腫瘍、例えば、急性のリンパ性および骨髄性の白血病；多発性骨髄腫；ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫を含む白血病および他の血液学的な新生物は除外される。
配列表に記載の配列番号１は、ＰＴＥＮロングタンパク質のリーダー配列とシグナル配列（残基１〜２１）である。
配列表の配列番号２は、ＰＴＥＮロングタンパク質のリーダー配列とシグナル配列（残基１〜２１）の類似体である。本明細書に記載されている方法および組成物の実施形態のいずれかにおいて、配列番号２は、配列番号１が記載されている場合、配列番号１に代えて用いることができる。
配列番号３は、ＰＴＥＮロング上のエピトープである。
配列番号４は、ＰＴＥＮのポリペプチドである（即ち、ＰＴＥＮロングではない）。
配列番号６は、ＭＳＥＳ ＰＴＥＮロングである。
配列番号８は、ＰＴＥＮロング−ｐ５３融合タンパク質である。本明細書に記載されている方法および組成物の実施形態のいずれかにおいて、配列番号８のアミノ酸１〜１５３は、配列番号１が記載されている場合、配列番号１に代えて用いることができる。
上述の方法のいずれかの実施形態において、配列番号１のアミノ酸２２〜１７３、または配列番号１の一部分を含むペプチドは、生体膜を横切るカーゴ分子を輸送する能力を保持している、配列番号１のアミノ酸２２〜１７３の一部分を含むペプチドである。
範囲が明細書中で与えられる場合、この範囲はその範囲の全ての整数とその範囲内の０．１単位、および任意の細分範囲を含むことが理解される。例えば、７７〜９０％の範囲は、７７．０％、７７．１％、７７．２％、７７．３％、７７．４％、７７．５％、７７．６％、７７．７％、７７．８％、７７．９％、８０．０％、８０．１％、８０．２％、８０．３％、８０．４％、８０．５％、８０．６％、８０．７％、８０．８％、８０．９％、および９０．０％、ならびに８０％〜８１．５％の範囲などを含む。
本明細書に記載されている種々の要素の全ての組み合わせは、本発明の範囲内である。
本発明は、以下の実験の詳細を参照することによってより良く理解されるが、当業者は、詳述される特定の実験が、以下に続く特許請求の範囲においてより十分に記載されている本発明の単なる例であることを容易に理解する。
実験の詳細
第１シリーズの実験
ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子は、癌において最も一般的に変更される遺伝子の１つである。ホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸の脂質ホスファターゼとして機能し、次にホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびＡｋｔからの腫瘍形成のシグナル伝達を抑制する。ＰＴＥＮ ｍＲＮＡを検査することによって、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）が７７０ｂｐについてＰＴＥＮのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とインフレームであることが明らかとされた。このＵＴＲ ＯＲＦ内に、標準のＡＵＧ開始コドンの５１３塩基対上流に弱いＫｏｚａｋ配列内に代替のＣＵＧ開始コドンが存在する。標準のＰＴＥＮ ＯＲＦの発現により約５５ｋＤａに移動するタンパク質が産生されるが、５’ＵＴＲを含んでいるＰＴＥＮ ｃＤＮＡの発現によりＰＴＥＮロングと称される７０ｋＤａの第二のタンパク質を産生することができる。開始部位の変異は、５５ｋＤａ ＰＴＥＮが標準の開始コドンでの翻訳から産生されるが、他方でＰＴＥＮロングは上流の代替の開始部位から開始されることを指示する。異なるＰＴＥＮ抗体での免疫ブロットによって、複数の細胞株にＰＴＥＮロングが内因性に存在することが実証された。マウスＥＳ細胞におけるノックダウンおよびノックアウト研究によって、この大きなタンパク質が実際にＰＴＥＮであることが確認された。付加されたＮ末端タンパク質配列がシグナルペプチドおよび切断部位をコードし、ＰＴＥＮロングが分泌経路に進入することを指示している。ＰＴＥＮロングは優先的にレクチンコンカナバリンＡと結合し、グリコシル化されることが示される。さらにまた、ＰＴＥＮロングは、ＰＴＥＮに対する抗体とヘパラン硫酸の両方を用いる親和性精製により馴化培地から精製できる。また、ＰＴＥＮロングは、インビボでのプロテアーゼ保護アッセイにおける分解に感受性であるが、正常なＰＴＥＮは感受性ではなく、ＰＴＥＮロングが細胞膜の外側に局在することを示している。
試薬、細胞株および抗体−プロテイナーゼＫおよびコンカナバリン−ＡをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ヘパリンセファロースおよびＨｉＴｒａｐヘパリンＨＰカラムをＡｍｅｒｓｈａｍ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。ＰＴＥＮに対する抗体をＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ ＭＡ）およびＣａｓｃａｄｅ（Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ ＭＡ）から購入した。Ａｋｔ抗体をＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ ＭＡ）から得て、Ｅ カドヘリン抗体をＵｐｓｔａｔｅ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａ）から得た。ＰＴＥＮの新規の翻訳において認められたエピトープＰＲＨＱＱＬＬＰＳＬＳＳＦＦＦＳＨＲＬＰＤ（配列番号３）に対して産生されたポリクローナル親和性精製抗体については、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ，ＣＡ）が行った。二次抗体をＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入した。ＨＥＫ２９３、ＺＲ−７５−１、ＳＫＢＲ−３、ＭＤＡＭＢ−３６１、ＢＴ５４９、およびＰＣ３をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得て、提供されたガイドラインに従い増殖させた。
プラスミドおよび構築物−ｐＣＥＰ４−ＰＴＥＮ（ＰＴＥＮの完全なオープンリーディングフレームおよび５’−非翻訳領域をコードしている）は、前に報告された通り、ＰＴＥＮ ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩにＵ９０３５１として寄託された）をｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｏｔＩ部位にクローニングすることにより作出された（Ｌｉ，Ｓｉｍｐｓｏｎら．１９９８年）。５’ＵＴＲは、このプラスミドにおいてクローニングのため使用されるオリジナルのＮｏｔＩ制限部位の上流の配列をコードしているアダプターをライゲーションすることによりさらに拡張された。上記アダプターは、標準の開始部位の−５１３に局在する第一の可能な代替のＣＴＧ開始コドンの１０塩基対上流までコードした。また、推定上の代替の開始部位をＡＴＧに変異させたアダプターを使用して、長い形態が効率的に発現されるだろう第二セットの発現構築物を作出し得た。さらに、標準の開始コドンのＡＴＡへの突然変異誘発も行い、トータルで４つの異なる構築物が生じた（図５．１）。これらの４つのバリエーション（同様に、オリジナルのＰＴＥＮのオープンリーディングフレーム）を、安定な発現のためＭＳＣＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，ＣＡ）レトロウイルスベクターに感染によりサブクローニングした。
プロテアーゼ保護アッセイ−ＨＥＫ２９３細胞をトリプシンなしで氷冷ＰＢＳに収集し、５×１０５の細胞の分割量を０．５ｕｇ／ｍｌ〜１０ｕｇ／ｍｌでプロテイナーゼＫの濃度を増加させて３０分間インキュベーションした。Ｔｒｉｔｏｎ ０．１％での対照を、示されたタンパク質を分解するプロテイナーゼＫの能力を検証するため含めた。反応を５ｍＭ ＰＭＳＦで停止した。細胞を２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝剤（１２５ｎＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、２０％グリセロール、０．０５％ブロモフェノールブルー、４％ＳＤＳ、１０％２−メルカプトエタノール）で溶解し、ＰＴＥＮ、ＡｋｔおよびＥカドヘリンに関して免疫ブロットした。
マウスの肝臓からのＰＴＥＮ精製−Ｃ５７ＢＬ６マウスの肝臓を液体窒素中で急速凍結し、粉砕し、ＴＮＮ緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、３％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、１×哺乳動物のプロテアーゼカクテルインヒビター［Ｓｉｇｍａ］）に再懸濁した。懸濁液を乳鉢でホモジナイズし、４０，０００ＲＰＭで４℃で１時間遠心分離した。上清を連続的に０．４５ミクロンおよび０．２２ミクロンのフィルターでろ過した。セファクリル２００サイズ排除カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をＴＮＮで事前に平衡化し、サンプルを０．３ｍｌ／時の速度で適用し、続いて緩衝液を適用した。２ｍｌの画分を回収し、低分子量のサンプルをプールし、事前に平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｉｎ ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に適用した。カラムを三カラム容量のＴＮＮで洗浄し、タンパク質を０．３Ｍ、０．５Ｍおよび１ＭのＮａＣｌ ＴＮＮ溶液の段階的な３×カラム容量で溶出した。０．５ｍｌの増加分のフラクションを回収し、ＰＴＥＮに関して免疫ブロットした。
培地からのＰＴＥＮのヘパリン精製−ＨＥＫ２９３細胞を１５ｃｍディッシュ中で１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭでコンフルエントになるまで増殖させた。細胞をＦＢＳ不含の１５ｍｌのＤＭＥＭで一晩インキュベーションした。２０プレートから培地を回収し、０．４５ミクロンのフィルターを通してろ過した。１ｍｌのヘパリンＨＰカラムをＡｋｔａＰｒｉｍｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて４ｍｌ／分の流速で４℃にてＤＭＥＭで平衡化した。馴化培地をカラムに１ｍｌ／分で通過させた。カラムを１０容量のＢＣ２００（２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭＴ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で洗浄した。タンパク質を５ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌで１ｍｌ／分で１ｍｌの画分に溶出した。各画分のタンパク質濃度を２８０ｎｍのＯＤで決定した。各画分の半分をトリクロロ酢酸の２０％で沈殿させ、冷アセトンで洗浄し、真空下で乾燥させた。タンパク質を２０ｕｌのＬａｅｍｍｌｉ溶解緩衝剤に再構成し、ＰＴＥＮおよびＰＴＥＮロングに対する抗体を用いて免疫ブロットした。
血清からのＰＴＥＮ精製−ＡＢ血漿からのヒト血清をＳｉｇｍａから得た。１ｍｌの血清を０．４５ミクロンのフィルターを通してろ過し、プロテインＡ／Ｇアガロースを用いて１時間インキュベーションして抗体を清澄化した。ヘパリン−アガロースをセファロースの対照と共に一晩、事前に清澄化した血清でインキュベーションし、翌日、ＢＣ１５０（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１％ＮＰ−４０、０．２５％Ｎａデオキシコール酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄した。タンパク質をｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝剤で溶出し、ＰＴＥＮに関してまたは重鎖の混入に関して二次のみで免疫ブロットした。
コンカナバリンＡプルダウン−ＨＥＫ２９３細胞をサブコンフルエンスでＢＣ５００（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．４、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１×プロテアーゼインヒビターカクテル）で溶解した。細胞溶解産物を遠心分離し、ろ過した。プルダウンを、２０マイクロリッターのコンカナバリンＡセファロース（Ｓｉｇｍａ）で１時間、４℃で行った。レジンをＢＣ５００で洗浄し、タンパク質をＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝剤で溶出した。
結果
ＰＴＥＮ ｍＲＮＡは上流に代替の開始部位を有する
ＮＣＢＩに寄託されたＰＴＥＮ ｍＲＮＡ（ＬｉおよびＳｕｎ １９９７年；Ｓｔｅｃｋ，Ｐｅｒｓｈｏｕｓｅら．１９９７年）は、広範囲にわたる５’ＵＴＲを含む。５’ＵＴＲ領域中の約７７０ｂｐの連続配列は、開始コドンとインフレームである。メチオニンは、この領域でコードされない；しかしながら、標準の開始コドンから−５１９で始まるいくつかの代替の開始ＣＵＧコドンが存在する。この配列の翻訳からｓｃａｎｓｉｔｅ（ｓｃａｎｓｉｔｅ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）およびｐｒｏｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｐｓｅａｒｃｈ）に従って同定可能なドメインは明らかとされなかった。この全体領域の翻訳によって、１７３アミノ酸がＰＴＥＮに加えられ、その分子量を約７０キロダルトンに増加させる（図２）。
他のＰＴＥＮオルソログのアラインメントによって、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＵＴＲの翻訳配列が様々な種のＰＴＥＮのオープンリーディングフレームに認められ得ることが明らかとされた。チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、ウシ（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ）、ミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）および線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）は、全てヒト５’ＵＴＲの翻訳産物と相同なタンパク質配列を含む（図３）。さらにまた、ヒト５’ＵＴＲおよびマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＰＴＥＮ ５’ＵＴＲのアラインメントは、広範囲にわたりヌクレオチド相同性を示した（結果は示さず）。マウス５’ＵＴＲは５２２塩基対にわたり標準の開始コドンとインフレームで翻訳され、ヒト５’ＵＴＲの翻訳と比較した場合に高度に相同なタンパク質配列であることが明らかとされた（図５．３）。５’ＵＴＲの相同性や他の種の翻訳されたタンパク質にヒト５’ＵＴＲから由来するアミノ酸配列が実際に存在することは、この配列が進化上重要であることを示している。
ＰＴＥＮ ｍＲＮＡは、代替の上流部位から翻訳を開始できる。ＰＴＥＮ ＯＲＦの過剰発現は、５５ｋＤａの単一のタンパク質バンドを生じた。５’ＵＴＲを含めることによって、約７０ｋＤａの二番目のより大きいタンパク質バンドを生じた。ＰＴＥＮ免疫ブロットにおけるより大きなタンパク質バンドは、いくつかの細胞株にも内因性に存在し、異なるモノクローナル抗体により検出可能であった（図４）。この大きいタンパク質バンドは、マウスの野生型ＥＳ細胞に存在し、ＰＴＥＮノックアウトマウスのＥＳ細胞には存在せず、ＰＴＥＮ ｓｈＲＮＡを安定に発現しているマウスＥＳクローンにおいて減少した（図４）。また、ＨＥＫ２９３細胞においてヒトＰＴＥＮタンパク質のｓｉＲＮＡを用いたノックダウンによって、７０ｋＤａタンパク質のノックダウンを生じる。
ＰＴＥＮヌルＰＣ３細胞株においてＰＴＥＮのＯＲＦをコードしているプラスミドの発現は、５５ｋＤａタンパク質の産生を生じる。５’ＵＴＲもコードするプラスミドが過剰発現された場合、７０ｋＤａタンパク質が産生された。ＣＴＧからＡＴＧへの上流の推定上の開始コドンの変異（図１、「ＡＴＧ／ＡＴＧ」）は、主に免疫ブロットパターンを７０ｋＤａの形態にシフトした（図４）。また、５５ｋＤａのバンドは、突然変異誘発によりＡＴＧ開始コドンに由来することが確認された（図４「ＣＴＧ／ＡＴＡ」）。
従って、５’ＵＴＲは、長い形態のＰＴＥＮの翻訳を開始するには十分であった。よって、５’ＵＴＲはＡｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎの５’ＡＴＲと命名され、検出されたより大きいタンパク質は「ＰＴＥＮロング」と命名された。
親和性精製したポリクローナル抗体は、５’ＡＴＲから翻訳されたアミノ酸に対し産生され、過剰発現研究において組換えＰＴＥＮロングの産生、ならびにＨＥＫ２９３細胞における内因性の形態を確認するため使用された（図４）。ＨＥＫ２９３細胞の全細胞溶解産物の免疫ブロットおよびＰＣ３細胞における過剰発現研究から、複数の形態のＰＴＥＮロングが認められ、潜在的な翻訳後修飾、記載されていないスプライス形態（ｕｎｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ ｓｐｌｉｃｅ ｆｏｒｍｓ）または５’ＡＴＲにおける代替の開始コドンのいずれかを指摘している。
ＰＴＥＮロングはＮ末端シグナルペプチドをコードする
ＰＴＥＮロングのＮ末端配列は、膜貫通配列またはシグナルペプチドのいずれかの指標であり得るアラニンの長いストレッチを含む。ＳｉｇｎａｌＩＰ ３．０を用いた翻訳配列の分析によって、高い確率（＞９５％）で前記配列がシグナルペプチドを含むことが予測された（図５）。シグナルペプチドは、特徴的に塩基性アミノ酸と続く疎水性のストレッチとから構成される。推定上の疎水性の膜貫通ヘリックスは、プロリンにより破壊され、やや極性の配列が続く。また、配列が切断されることも予測され、このタンパク質がＥＲの内腔に放出されることを指摘している。
分泌された細胞外のタンパク質の特徴の１つは、ゴルジ体における複合糖部分の付加である（グリコシル化として知られるプロセス）。糖はＮ−グリコシル化を介して共通配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（Ｘはプロリンではない）においてアスパラギンに付加できる（ＧｕｐｔａおよびＢｒｕｎａｋ ２００２年）；セリン、スレオニンおよびチロシンのヒドロキシル基はまたＯ−グリコシル化と称されたものの標的となりうる（Ｊｕｌｅｎｉｕｓ，Ｍｏｌｇａａｒｄら．２００５年）。ＰＴＥＮは、複数のＯ−グリコシル化部位を有するが、しかし、僅か１つのＮ−グリコシル化部位を有する。ＨＥＫ２９３細胞中でＰＴＥＮ相補物の部分がグリコシル化されたかどうかを決定するプルダウンアッセイにレクチンコンカナバリン−Ａ（糖部分と結合する）を使用した。約５０％のＰＴＥＮロングのＰＴＥＮの混合物をこれらの細胞から精製した（図６）。この事項は、ＰＴＥＮロングがグリコシル化されること、ＰＴＥＮの細胞質の５５ｋＤａ形態がグリコシル化されるかまたはＰＴＥＮロングが細胞外で切断されることを示す。
ＰＴＥＮロングはヘパランと結合し、細胞表面に見出される
ＰＴＥＮは、いくつかのプロテオグリカン（例えば、シンデカンおよびグリピカン）と結合し、膜の外側のリーフレット（ｌｅａｆｌｅｔ）に付着することが見出される。これらのプロテオグリカンは、最もヘパラン化した細胞外分子のうちの２つである（Ｂｌｅｒｏ，Ｚｈａｎｇら．２００５年）。ＰＴＥＮは、以前に高度に陰性に荷電した種に高い親和性を有することが示され、ＰＴＥＮの特性により高度に陰イオン性のＰＩＰ３を好むことが導かれる（Ｄａｓ，Ｄｉｘｏｎら．２００３年）。ヘパランは、最も陰性に荷電した生体分子の１つであるため、ヘパランがＰＴＥＮの細胞外基質への結合を媒介することが可能であった。マウスの肝臓からのタンパク質抽出物を用いて、ＰＴＥＮがヘパランと高親和性に結合することが発見された。さらにまた、ヘパリンアガロースカラムから１Ｍ ＮａＣｌを用いたＰＴＥＮの連続的な溶出によって、ＰＴＥＮロングも溶出された（図７）。
細胞膜の外面に突き出たＰＴＥＮロングは、プロテアーゼの分解に感受性であるべきである。プロテアーゼ保護アッセイにおいて、生細胞をプロテアーゼとインキュベーションし、細胞外のタンパク質のみが分解された。これは、脂質膜はプロテアーゼを不透過性であり、全ての細胞内タンパク質の防御に貢献するからである。ＨＥＫ２９３細胞を付着培養からＰＢＳで穏やかに撹拌して除去し、プロテイナーゼＫの濃度を増加させて懸濁した。反応をＰＭＳＦで停止し、細胞をｌａｅｍｌｌｉ緩衝剤で溶解した。ＰＴＥＮロングは、既知の細胞外タンパク質であるＥ−カドヘリンと共にプロテイナーゼＫでの処理に感受性を示した（図８）。一方、ＰＴＥＮは中等度のプロテアーゼ感受性を示し、５５ｋＤａ種のいくつかの部分はまた細胞外（グリコシル化されるため）であるか、またはいくらかの細胞溶解がアッセイの間に発生し、これにより細胞質のＰＴＥＮがプロテイナーゼＫに暴露されることを示している。プロテイナーゼＫに暴露された場合にＰＴＥＮが分解されることを証明するため、膜を透過するｔｒｉｔｏｎでの対照を含めた。これがＰＴＥＮ本来（ｐｒｏｐｅｒ）であるかまたは５５ｋＤａに移動し、ＰＴＥＮ抗体のＣ末端エピトープを保持するＰＴＥＮロングの切断形態であるかどうかはまだ分からない。このデータは、ＰＴＥＮロングが細胞表面にあることを指示している。
可溶性ＰＴＥＮロングは培地に分泌される
細胞表面上のＰＴＥＮロングの存在は、このタンパク質の部分が可溶性であり、細胞環境に放出される可能性は排除しない。ヘパリンセファロースをＨＥＫ２９３細胞で馴化した血清不含培地からＰＴＥＮロングを親和性精製するために使用した。カラムの溶出によって、培地中に５０ｋＤａの分子量に移動するＰＴＥＮの存在が明らかとされた（図９）。ＰＴＥＮロング特異的な抗体での免疫ブロットは同じ５０ｋＤａ種を明らかにし、このタンパク質が代替の開始部位から翻訳される配列およびＰＴＥＮモノクローナル抗体のＣ末端エピトープの配列を保持することを示している。これは、５５ｋＤａであることが観察されたＰＴＥＮの部分が実際に上流の開始コドンに由来する切断された翻訳産物であることを暗示する。
培地へのＰＴＥＮの分泌は、さらにＡＴＧ／ＡＴＧ構築物でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞においてＰＴＥＮロングを過剰発現することにより確認された。これらの細胞を使用して、血清不含の馴化培地で一晩産生させ、ＰＴＥＮモノクローナル抗体 ６Ｈ２．１を使用して、１ｍｌの培地からＰＴＥＮを免疫沈降した。大きいＰＴＥＮバンドが、より低い５５ｋＤａバンドと共に培地から良好に免疫沈降された。上記タンパク質が過剰発現されたため、上記タンパク質の適切なプロセシングはおそらく生じず、完全なサイズの７０ｋＤａ ＰＴＥＮの分泌が生じる。
ＰＴＥＮはヒト血清中に見出される
生理的な分泌物の最良の供給源の１つは血清である。ヘパリンセファロースを用いてヒト血清からＰＴＥＮを親和性精製した。ヒト血清を遠心分離し、ろ過して粒子状物質を除去した。次に、ＢＣ１５０に１：５に希釈し、広くプロテインＡ／Ｇで事前に清澄化してＩｇＧを除去した。血清を少量のヘパリンセファロースを用いてバッチでインキュベーションした。ヘパリンセファロースをｌａｅｍｍｌｉ緩衝剤で溶出し、溶出液をＰＴＥＮについてブロットし、重鎖の混入を排除するため二次抗体単独でブロットした。ＰＴＥＮおよびＰＴＥＮロングはともにヒト血清に見出された（図１０）。
ＰＴＥＮロングの抗血管形成活性
ＰＴＥＮロングの抗血管形成の役割を以下に示す：（１）ＰＴＥＮロングは、通常、マウスの発生している網膜において弱く発現するが、新生児の発生の間で退行／細胞死を経験している血管に高レベルの発現が認められる（図１１）；（２）ＰＴＥＮロングは、腫瘍中のアポトーシスしている血管に認められる。さらに、ＰＴＥＮロングで処理された上皮細胞は、トランスフェクトされた細胞から部分的に精製され、細胞の移動を阻害し、アポトーシスを誘導した（図１２）。また、精製されたＰＴＥＮロングは、カスパーゼ−３切断により測定された通り、培養においてＵ８７、ＨＵＶＥＣ内皮細胞、または２９３細胞のアポトーシスの活性化と関連する細胞死も誘導できる。
ＰＴＥＮロングのインビボでの抗腫瘍および抗血管形成活性
図１３は、ＰＴＥＮロングでのマウスの処理を示す。（Ａ）マウス（ｎ＝５）に神経膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７が注射され、異種移植片が乳房の脂肪パッドの２部位（左および右）に形成された。腫瘍移植後、１つの腫瘍にＰＴＥＮロングを直接注射し、反対側の腫瘍には注射されなかった（ｗ／ＰＴＥＮロング）。また、５匹のマウスの対照セットは、空ベクターでトランスフェクトされた細胞から由来する疑似の精製タンパク質の調製物を注射された（空ベクター）。再び、反対側の腫瘍は注射されなかった（ｗ／空ベクター）。マウスを１〜１１日および１３〜１４日に処理した。示された日にノギスで最大の直径（ｃｍ）を測定した。腫瘍容量が≧１ｃｍに達した時、マウスを屠殺した。（Ｂ）タンパク質をＰＴＥＮロング発現ベクターを２９３細胞にトランスフェクションすることにより調製し、Ｖ５親和性樹脂を用いて部分的に精製し、Ｖ５ペプチドで溶出した。図１４は、１４日間のＰＴＥＮロングの対照注射で処理したマウスの生存率を示す（日数）。
網膜染色
ｐ７のマウス網膜中のＰＴＥＮロングおよび血管の染色によって、ＰＴＥＮロングがこのポイントでマウスの網膜の血管発生において最初に退行する硝子体管を選択的に染色することが明らかとされた。ＰＴＥＮロングに対する抗体は、エピトープ：Ｎ−ＰＲＨＱＱＬＬＰＳＬＳＳＦＦＦＳＨＲＬＰＤ−Ｃ（配列番号３）に対するものである。血管の染色をＢＳ１−レクチンで行った。
精製
ＰＴＥＮロングの精製のための１つの方法において、２９３細胞をＡＴＧ／ＡＴＧ ＰＴＥＮロングでトランスフェクトし、細胞溶解産物をＮｉ＋アフィニティーカラムに通過させた。ＰＴＥＮロングをＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ上のＮｉ＋カラムによりイミダゾール溶出緩衝剤を用いて一貫して精製した。
腫瘍退行
ＰＴＥＮ（ｏｒｆ ４０３アミノ酸）またはＰＴＥＮロングのいずれかで注射前にトランスフェクトされたＵ８７細胞の異種移植片。注射７日後、ＰＴＥＮを過剰発現しているコホート（ｎ＝４のうち４）と比較してＰＴＥＮロングを過剰発現しているコホートにおいて乳房血管の減少が認められた。これはＰＴＥＮロングが腫瘍環境に影響し得ることを示唆する。
ＰＴＥＮロングリーダー配列による膜通過送達
図１８および２１は、無傷な細胞に適用された場合に、細胞内ＡＫＴリン酸化を減少する、ＰＴＥＮではなく、ＰＴＥＮロングの能力を示す。
［例］
カーゴ分子は、配列番号１の残基２２〜１７３に記載されている配列を有する連続したアミノ酸残基を含む第２のペプチドにペプチド結合を介して共有結合される。細胞膜にこの組成物を接触させると、カーゴ分子ペプチドは、細胞膜を通過して輸送され、細胞内に送達される。
カーゴ分子タンパク質は、配列番号１の残基２２〜１７３に記載されている配列を有する連続したアミノ酸残基を含むペプチドにペプチド結合を介して共有結合される。細胞膜にこの組成物を接触させると、カーゴ分子タンパク質は、細胞膜を通過して輸送され、細胞内に送達される。カーゴ分子タンパク質はヒトｐ５３、またはその活性な断片もしくはその活性な改変体であり得る。
カーゴ分子ペプチドは、配列番号１の残基２２〜１７３に記載されている配列を有する連続したアミノ酸残基を含む核酸に共有結合される。細胞膜にこの組成物を接触させると、カーゴ分子核酸は、細胞膜を通過して輸送され、細胞内に送達される。核酸は、ジスルフィド結合を介してペプチドに共有結合され得る。核酸はｓｉＲＮＡであってもよい。
考察
細胞溶解産物および組織からのＰＴＥＮ免疫ブロットにおいて二番目のより大きいタンパク質バンドを定期的に観察した。より大きなバンドがＰＴＥＮであることが確認される証拠には、次の事項が含まれる：大きなタンパク質バンドは、異なるＰＴＥＮモノクローナル抗体により検出された；細胞がＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡで処理されるまたはＰＴＥＮ遺伝子座がマウスにおいてノックアウトされる場合、大きなタンパク質は存在しない。ＰＴＥＮの５’ＵＴＲは、ＰＴＥＮの古典的な開始コドンと７００塩基対以上にわたりインフレームであることが観察された。さらに、ＰＴＥＮの５２２塩基対上流のＣＵＧコドンが存在し、翻訳される場合にＰＴＥＮ免疫ブロットにおける大きなタンパク質のバンドのサイズを説明することができた。強いコザック配列とは関連しないが、−１シトシンおよび＋１グアノシン配列が保持される。翻訳され、ＰＴＥＮ ＯＲＦに付加される場合、約７０ｋＤａのタンパク質が産生されるはずであり、その分子量は観察された大きなＰＴＥＮバンドの分子量である。
この配列の翻訳は、実際のコード配列内のいくつかのＰＴＥＮオルソログに既に存在する。マウスの組織溶解産物において類似するバンドが観察されたので、マウスの５’ＵＴＲも調査した。マウスの５’ＵＴＲヌクレオチド配列は、ヒトの５’ＵＴＲと高度に相同的であり、同様に開始コドンとインフレームである。２つの潜在的な代替の開始コドンが−５２２および−５１６に存在し、これらの部位からのこの配列の翻訳はヒト配列と９０％＋相同的なアミノ酸配列を示す。この推定上のタンパク質の保存は著しく、この配列の進化上の重要性が示された。この配列をよりよく記載するため、ＰＴＥＮの５’ＡＴＲまたは代替の翻訳領域と改名して翻訳の潜在性を記載した。
ＰＴＥＮのオープンリーディングフレームを５’ＡＴＲと共にクローニングしてプラスミドを構築し、この組換えＰＴＥＮの発現を標準の４０３アミノ酸を産生するオープンリーディングフレーム単独と比較した。５’ＡＴＲを含めることにより二番目の大きなＰＴＥＮタンパク質バンドが生じ、このバンドは５５ｋＤａに移動する単一のバンドを作るＰＴＥＮのまさに標準のＯＲＦを含んでいる発現プラスミドと比べて約７０ｋＤａに移動する。大きなタンパク質は、翻訳されたトータルのタンパク質の僅か小部分を占める；しかしながら、推定上の開始部位のＡＴＧへの変異によって、タンパク質比は主に大きな形態にシフトした。
５’ＡＴＲのタンパク質配列の保存は、進化のアーティファクト以上であることを示す。Ｎ−末端は脂肪族アミノ酸のストレッチを含み、これが膜貫通配列であることが予測された。ＰｒｏｓｉｔｅおよびＳｉｇｎａｌ ３．０ＩＰの使用によって、ＰＴＥＮロングのＮ−末端がシグナルペプチドであり、それに直接続くプロテアーゼ切断部位を有することが予測された。
ＰＴＥＮロングが細胞の細胞外表面に局在するかどうかをインビボでのプロテアーゼ保護アッセイを使用して試験した。ＰＴＥＮロングは、細胞外のプロテアーゼの量を増加させることにより進行性の分解を示したが、ＰＴＥＮは示さなかった。これは、少なくともいくらかのＰＴＥＮロングが細胞外にあり、少なくとも部分的に細胞膜の外側のリーフレットに付着することを示している。これは、最も魅力的な結果であり、細胞膜の外側のリーフレットにおける活性な脂質ホスファターゼの意味が提起された。外膜結合性のプロテオグリカンの２つのファミリーであるグリピカンおよびシンデカンは、以前にＰＴＥＮタンパク質複合体中に同定された。
細胞表面におけるＰＴＥＮの存在は、可溶性の分泌されるＰＴＥＮの可能性を排除しない。シンデカンおよびグリピカンは、最も多量にヘパラン化したプロテオグリカンのうちの２つである。ヘパランは、高度に陰性に荷電したグリコサミノグリカンであり、またＰＴＥＮは、陰イオンへの親和性を有することが示されており、高度に陰性に荷電したＰＩＰ３を基質として選択することを部分的に説明している。マウス肝臓からのＰＴＥＮ精製を最適化する実験によって、ＰＴＥＮとＰＴＥＮロングの両方がヘパリンセファロースカラムを用いて精製できることが明らかとされた。さらに、約５０ｋＤａのタンパク質をＨＥＫ２９３細胞で馴化した血清不含培地からヘパリンセファロースカラムを用いて精製した。精製されたタンパク質は、ＰＴＥＮに特異的なモノクローナル抗体およびＰＴＥＮロングに存在する独特なアミノ酸残基に対するポリクローナル抗体により認識された。以前に、ＰＴＥＮロング抗体は７０ｋＤａ付近のタンパク質バンドのみを認識した。両方の抗体が一つのバンドを認識できたという観察によって、タンパク分解プロセシングがおそらく発生すること、免疫ブロットで観察されたタンパク質が双方の抗体のエピトープを保持するＰＴＥＮの断片であることが示される。また、ＰＴＥＮとＰＴＥＮロングの両方は、ヒト血清からヘパリン親和性精製を用いて精製できた。
過去１０年の文献によって、ＰＴＥＮの配列の想定が蓄積されてきた。代替の部位から翻訳され、外側のリーフレットと細胞外間隙の両方に分泌されるＰＴＥＮの新規の形態が存在するとの証拠をここに示す。
インビボの結果は、ＰＴＥＮロングがヒト血清に通常存在する新規の抗腫瘍化合物であり、抗血管形成およびアポトーシス促進特性を有することを示す。
第２シリーズの実験
ＭＳＥＳ ＰＴＥＮロングの生成
大腸菌（ｅ．ｃｏｌｉ）における精製を目的として、ＰＴＥＮロングのオープンリーディングフレームを改変し、最初の２１個のアミノ酸を欠失させ、真核生物のシグナルペプチド配列を除き、これを最初の４つのアミノ酸に基づいてＭＳＥＳバージョンと称した（図２８）。このタンパク質は、ＰＴＥＮロングに独特の代替の翻訳領域の１５３アミノ酸と、ＰＴＥＮロングとＰＴＥＮの間で共有される４０３アミノ酸を有し、ＩＰＴＧを含む誘導性発現ベクターを用いて大腸菌に導入され、ニッケルおよびヘパリン親和性カラムを用いて抽出物から精製された。細胞侵入のための６個のアルギニンリピートの重要性を調べることを目的として、この配列はインフレーム（Ｒ６）で欠失させ、このタンパク質を上記の通り精製した。
ＭＳＥＳ ＰＴＥＮロングは細胞に侵入する
精製されたＭＳＥＳ ＰＴＥＮロング野生型またはＲ６突然変異タンパク質は、１マイクログラム／ｍｌの濃度で、培養中の増殖されたＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト細胞の培地に添加された。並行した同一条件下で、細胞はまた、代替の翻訳領域を欠損しているオリジナルの４０３アミノ酸のＰＴＥＮ、またはＲＦＰタンパク質のみを発現する細胞から調製される疑似処理を用いて処理された。細胞は、細胞分画のために細胞を単離する前に、３７℃にて３０分間インキュベートされた。本発明者らは、細胞質および核画分を単離した。分画の有効性は、細胞質および核画分に対して、それぞれ対照のためチューブリンおよびＢＡＦ１８０を用いたウエスタンブロットによって測定された。野生型ＰＴＥＮロングだけが細胞に侵入し、細胞質および核に存在していた。重要なことには、ＰＴＥＮおよびＲ６について欠失されたＰＴＥＮロングはいずれも細胞に侵入することができなかった。これらのデータは、Ｒ６配列が効率的な細胞侵入に必要とされ、最初の２１アミノ酸は必要とされないことを指示する。
ＰＴＥＮロング−ｐ５３融合タンパク質の生成
上記研究は、図２中の構築物の最初の１５３アミノ酸が細胞内に別のタンパク質配列を送達するために使用され得ることを示唆した。この質問に答えるために、ＭＳＥＳ ＰＴＥＮロング構築物の最初の１５３アミノ酸は、Ｐｔｅｎ−Ｌｏｎｇ ＬｅａｄｅｒについてＰＬと呼ばれ、ヒトｐ５３の３９３アミノ酸に融合され、ＰＬ−ｐ５３融合タンパク質を生成した（図３０）。Ｖ５−Ｈｉｓエピトープタグは、精製および検出の目的で使用するためにＣ末端に融合された。
ＰＬ−ｐ５３は細胞に侵入し、遺伝子発現を活性化し、腫瘍増殖を抑制する
ＰＬ−ｐ５３融合タンパク質は、ＩＰＴＧを用いて大腸菌に導入され、ニッケルおよびヘパリン親和性カラムを用いて細菌溶解物から精製された。ＰＬ−ｐ５３タンパク質は、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８またはＨ１２９９ヒト癌細胞とともに１時間インキュベートし、その後、分画のために細胞を回収し、融合タンパク質が細胞に侵入するかどうかを決定した。増加したｐ５３が、処理されたＨ１２９９細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の核において検出され得たが、疑似処理されたこれらの細胞では検出されず、ＰＵＭＡおよびｐ２１（両者ともにｐ５３転写因子の標的である）の発現における増加と関連付けられた（図３１）。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８異種移植片の毎日の処理によって、１０日間にわたって腫瘍体積が減少したが、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）を発現する大腸菌由来の疑似処理された対照では減少しなかった。
細菌発現されたＭＳＥＳ ＰＴＥＮロングで処理されたマウスにおける耐糖能試験
マウスは、細菌発現させたＭＳＥＳ ＰＴＥＮロング（Ｌｏｎｇ）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質疑似対照）、ＩｇＧ対照、および細胞内への取り込みをブロックする抗ＰＴＥＮ抗体１３８Ｇ６で処理された。ＰＴＥＮロングは他の処理と比べて血糖値を減少させたが、抗ＰＴＥＮ抗体１３８Ｇ６はＩｇＧ対照と比較してグルコースを増加させた（図３２）。このデータは、ＰＴＥＮロングが血糖値を減少させ得ることを実証している。マウスは、グルコースで処理する前にＩＰ注射された。
参考資料
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Claims (114)

  1. （ｉ）生体膜を通過してカーゴ分子を輸送するための配列番号１に記載の配列の連続したアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドと、（ｉｉ）カーゴ分子とを含む組成物であって、前記カーゴ分子が配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドではない組成物。
  2. 前記ペプチドが、前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ペプチドが、ジスルフィド結合を介して前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記ペプチドが、前記カーゴ分子に非共有結合されている、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記カーゴ分子が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ナノ粒子、リポソーム、ファージ、ウイルスベクター、プラスミドＤＮＡ、核酸、ペプチド核酸、またはモルホリノ化合物である、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記カーゴ分子が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり、前記カーゴ分子を輸送するための前記ペプチドが、ペプチド結合を介して前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記カーゴ分子が核酸であり、ＤＮＡである、請求項５に記載の組成物。
  8. 前記カーゴ分子が核酸であり、ＲＮＡである、請求項５に記載の組成物。
  9. 前記カーゴ分子が核酸であり、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５に記載の組成物。
  10. 前記カーゴ分子が核酸であり、ヒトｐ５３タンパク質をコードする、請求項５に記載の組成物。
  11. 前記カーゴ分子がタンパク質であり、ヒトｐ５３タンパク質である、請求項５に記載の組成物。
  12. 前記カーゴ分子が核酸であり、腫瘍抑制タンパク質をコードする、請求項５に記載の組成物。
  13. 前記腫瘍抑制タンパク質が、ｐ１６、ＡＲＦ、ＶＨＬ、ＳＭＡＤ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＡＦ１８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＢおよびＬＫＢ１からなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記カーゴ分子がタンパク質であり、腫瘍抑制タンパク質である、請求項５に記載の組成物。
  15. 前記腫瘍抑制タンパク質が、ｐ１６、ＡＲＦ、ＶＨＬ、ＳＭＡＤ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＡＦ１８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＢおよびＬＫＢ１からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記カーゴ分子がタンパク質であり、酵素である、請求項５に記載の組成物。
  17. 前記酵素が代謝酵素である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記カーゴ分子がポリペプチドまたはタンパク質であり、抗原である、請求項５に記載の組成物。
  19. 前記カーゴ分子がボツリヌス毒素またはその断片である、請求項１に記載の組成物。
  20. 前記カーゴ分子が診断用薬である、請求項１に記載の組成物。
  21. 前記診断用薬が、放射線不透過性造影剤、常磁性造影剤、超常磁性造影剤、蛍光体、またはコンピューター断層撮影造影剤である、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記カーゴ分子が治療薬である、請求項１に記載の組成物。
  23. 前記治療薬が生物学的に活性な小分子である、請求項１に記載の組成物。
  24. 前記治療薬が、細胞毒性分子または化学療法薬または放射線治療薬である、請求項１に記載の組成物。
  25. 前記カーゴ分子が、高分子リンカーを介して、輸送するための前記ペプチドに結合されている、請求項１に記載の組成物。
  26. 前記高分子リンカーがポリエチレングリコールである、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記カーゴ分子が核酸である、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記カーゴ分子がタンパク質であり、分子量が最大１６０ｋＤａである、請求項６に記載の組成物。
  29. 生体膜を通過してカーゴ分子を輸送するための配列番号１に記載の配列を有する連続したアミノ酸残基を含む前記ペプチドが誘導体化されている、請求項１に記載の組成物。
  30. 前記ペプチドが、配列番号１に記載の配列を有する連続したアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の組成物。
  31. 細胞内にカーゴ分子を送達するための方法であって、前記細胞内への前記カーゴ分子の侵入を許容する条件下で、前記細胞を、（ｉ）生体膜を通過して前記カーゴ分子を輸送するための配列番号１に記載の配列の連続したアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１に記載のアミノ酸残基の一部分を含むペプチドと、（ｉｉ）カーゴ分子とを含む組成物に接触させることを含み、前記カーゴ分子が配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドではない、方法。
  32. 前記ペプチドが、前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ペプチドが、ペプチド結合を介して前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記ペプチドが、ジスルフィド結合を介して前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項３１に記載の方法。
  35. 前記ペプチドが、前記カーゴ分子に非共有結合されている、請求項３１に記載の方法。
  36. 前記カーゴ分子が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ナノ粒子、リポソーム、ファージ、ウイルスベクター、プラスミドＤＮＡ、核酸、ペプチド核酸、またはモルホリノ化合物である、請求項３１に記載の方法。
  37. 前記カーゴ分子が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり、前記カーゴ分子を輸送するための前記ペプチドがペプチド結合を介して前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記カーゴ分子が核酸であり、ＤＮＡである、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記カーゴ分子が核酸であり、ＲＮＡである、請求項３６に記載の方法。
  40. 前記カーゴ分子が核酸であり、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３６に記載の方法。
  41. 前記カーゴ分子が核酸であり、ヒトｐ５３タンパク質をコードする、請求項３６に記載の方法。
  42. 前記カーゴ分子がタンパク質であり、ヒトｐ５３タンパク質である、請求項３６に記載の方法。
  43. 前記カーゴ分子が核酸であり、腫瘍抑制タンパク質をコードする、請求項３６に記載の方法。
  44. 前記腫瘍抑制タンパク質が、ｐ１６、ＡＲＦ、ＶＨＬ、ＳＭＡＤ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＡＦ１８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＢおよびＬＫＢ１からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記カーゴ分子がタンパク質であり、腫瘍抑制タンパク質である、請求項３６に記載の方法。
  46. 前記腫瘍抑制タンパク質が、ｐ１６、ＡＲＦ、ＶＨＬ、ＳＭＡＤ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＡＦ１８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＢおよびＬＫＢ１からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記カーゴ分子がタンパク質であり、酵素である、請求項３６に記載の方法。
  48. 前記酵素が代謝酵素である、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記カーゴ分子がポリペプチドまたはタンパク質であり、抗原である、請求項３６に記載の方法。
  50. 前記カーゴ分子がボツリヌス毒素またはその断片である、請求項３１に記載の方法。
  51. 前記カーゴ分子が診断用薬である、請求項３１に記載の方法。
  52. 前記診断用薬が、放射線不透過性造影剤、常磁性造影剤、超常磁性造影剤、蛍光体、またはコンピューター断層撮影造影剤である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記カーゴ分子が治療薬である、請求項３１に記載の方法。
  54. 前記治療薬が生物学的に活性な小分子である、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記治療薬が、細胞毒性分子または化学療法薬または放射線治療薬である、請求項５３に記載の方法。
  56. 前記ペプチドが、配列番号１に記載の配列を有する連続したアミノ酸残基を含む、請求項３１に記載の方法。
  57. 前記細胞が腫瘍細胞である、請求項３１に記載の方法。
  58. 前記細胞がヒト対象内にある、請求項５７に記載の方法。
  59. 対象における腫瘍を治療するための方法であって、前記対象において前記腫瘍を治療するための有効量で、カーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物のある量を前記対象に投与することを含み、前記カーゴ分子は、配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドではない、方法。
  60. 前記カーゴ分子が腫瘍抑制タンパク質である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記腫瘍抑制タンパク質が、ｐ５３、ｐ１６、ＡＲＦ、ＶＨＬ、ＳＭＡＤ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＡＦ１８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＢおよびＬＫＢ１からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記腫瘍抑制タンパク質がｐ５３である、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記組成物が連続したアミノ酸を含み、その配列が配列番号８に記載されている、請求項６２に記載の方法。
  64. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項５９から６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、ペプチド結合を介して前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項６４に記載の方法。
  66. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、ジスルフィド結合を介して前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項５９から６３のいずれか一項に記載の方法。
  67. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、前記カーゴ分子に非共有結合されている、請求項５９から６３のいずれか一項に記載の方法。
  68. 対象における癌を治療するための方法であって、前記対象において前記癌を治療するための有効量で、カーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物のある量を前記対象に投与することを含み、前記カーゴ分子は、配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドではない、前記方法。
  69. 前記カーゴ分子が腫瘍抑制タンパク質である、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記腫瘍抑制タンパク質が、ｐ５３、ｐ１６、ＡＲＦ、ＶＨＬ、ＳＭＡＤ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＡＦ１８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＢおよびＬＫＢ１からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記腫瘍抑制タンパク質がｐ５３である、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記組成物が連続したアミノ酸を含み、その配列が配列番号８に記載されている、請求項７１に記載の方法。
  73. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項６９から７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、ペプチド結合を介して前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項７３に記載の方法。
  75. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、ジスルフィド結合を介して前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項７３のいずれか一項に記載の方法。
  76. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、前記カーゴ分子に非共有結合されている、請求項６９から７２のいずれか一項に記載の方法。
  77. 代謝障害を治療するための方法であって、前記代謝障害が代謝酵素の欠損によって特徴付けられ、前記対象における前記代謝障害を治療するための有効量で、前記代謝酵素にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物のある量を前記対象に投与することを含む、方法。
  78. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、前記代謝酵素に共有結合されている、請求項７７に記載の方法。
  79. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、ペプチド結合を介して前記代謝酵素に共有結合されている、請求項７８に記載の方法。
  80. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、ジスルフィド結合を介して前記代謝酵素に共有結合されている、請求項７８に記載の方法。
  81. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、前記代謝酵素に非共有結合されている、請求項７８に記載の方法。
  82. 対象における糖尿病を治療するための方法であって、前記対象において前記糖尿病を治療するための有効量で、カーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物のある量を前記対象に投与することを含む、方法。
  83. 前記カーゴ分子が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ナノ粒子、リポソーム、ファージ、ウイルスベクター、プラスミドＤＮＡ、核酸、ペプチド核酸、またはモルホリノ化合物である、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記カーゴ分子が、配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドである、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記組成物が連続したアミノ酸を含み、その配列が配列番号６に記載されている、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記カーゴ分子がタンパク質であり、前記タンパク質が腫瘍抑制タンパク質である、請求項８３に記載の方法。
  87. 前記腫瘍抑制タンパク質が、ｐ５３、ｐ１６、ＡＲＦ、ＶＨＬ、ＳＭＡＤ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＡＦ１８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＢおよびＬＫＢ１からなる群から選択される、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記腫瘍抑制タンパク質がｐ５３である、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記組成物が連続したアミノ酸を含み、その配列が配列番号８に記載されている、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記カーゴ分子がＢＣＬ２である、請求項８２に記載の方法。
  91. 前記カーゴ分子がチオレドキシンである、請求項８２に記載の方法。
  92. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項８２から９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、ペプチド結合を介して前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項９２に記載の方法。
  94. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、ジスルフィド結合を介して前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項９２のいずれか一項に記載の方法。
  95. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、前記カーゴ分子に非共有結合されている、請求項８２から８９のいずれか一項に記載の方法。
  96. 対象における心血管疾患を治療するための方法であって、前記対象において前記心血管疾患を治療するための有効量で、カーゴ分子にコンジュゲートされている、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含むペプチドを含む組成物のある量を前記対象に投与することを含む、方法。
  97. 前記カーゴ分子が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ナノ粒子、リポソーム、ファージ、ウイルスベクター、プラスミドＤＮＡ、核酸、ペプチド核酸、またはモルホリノ化合物である、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記カーゴ分子が、配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸残基を含むペプチドである、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記組成物が連続したアミノ酸を含み、その配列が配列番号６に記載されている、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記カーゴ分子がタンパク質であり、前記タンパク質が腫瘍抑制タンパク質である、請求項９７に記載の方法。
  101. 前記腫瘍抑制タンパク質が、ｐ５３、ｐ１６、ＡＲＦ、ＶＨＬ、ＳＭＡＤ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＡＦ１８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＢおよびＬＫＢ１からなる群から選択される、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記腫瘍抑制タンパク質がｐ５３である、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記組成物が連続したアミノ酸を含み、その配列が配列番号８に記載されている、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記カーゴ分子がＢＣＬ２である、請求項９６に記載の方法。
  105. 前記カーゴ分子がチオレドキシンである、請求項９６に記載の方法。
  106. 前記心血管疾患が、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心筋症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、うっ血性心不全、心筋梗塞、および虚血再灌流障害からなる群から選択される、請求項９６に記載の方法。
  107. 前記心血管疾患がアテローム性動脈硬化症である、請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記心血管疾患が心筋梗塞である、請求項１０６に記載の方法。
  109. 前記組成物が前記心筋梗塞中に投与される、請求項１０６に記載の方法。
  110. 前記組成物が細胞死を妨げるのに有効な量で投与される、請求項１０９に記載の方法。
  111. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項９６から１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、ペプチド結合を介して前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項１１１に記載の方法。
  113. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、ジスルフィド結合を介して前記カーゴ分子に共有結合されている、請求項１１１のいずれか一項に記載の方法。
  114. 配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３、または配列番号１のアミノ酸残基２２〜１７３の一部分を含む前記ペプチドが、前記カーゴ分子に非共有結合されている、請求項９６から１１０のいずれか一項に記載の方法。
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