WO2007069795A1 - 腫瘍の抑制方法 - Google Patents

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WO2007069795A1
WO2007069795A1 PCT/JP2006/325679 JP2006325679W WO2007069795A1 WO 2007069795 A1 WO2007069795 A1 WO 2007069795A1 JP 2006325679 W JP2006325679 W JP 2006325679W WO 2007069795 A1 WO2007069795 A1 WO 2007069795A1
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Tomohiko Ohta
Ko Sato
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St. Marianna University School Of Medicine
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Definitions

  • the present invention relates to a method for suppressing a tumor, including suppressing HERC2 expression. Furthermore, the present invention relates to a method for suppressing a tumor and a method for inducing antitumor activity in a cell or tissue comprising inhibiting the binding of HERC2 and BRCA1. Background art
  • HERC2 (hect domain and RCC-like domain 2) is a gene found in the hot spot of the deletion breakpoint present on the No. 15 staining of humans (bands 15qll and 15ql3). Prader-Willi / Angelman syndrome (PWS / AS).
  • This duplication of HERC2 in the chromosomal region is considered to be a decisive factor that increases the incidence of homologous thread remodeling errors during spermatogenesis.
  • duplication of HERC2 resulted in deletion in the 4-Mb chromosomal region, and this deletion caused several deletions including UBE3A, a gene that codes for E6-AP (human papilloma virus E6-associated protein). This gene is excluded.
  • Maternal alleles that play a protective role against PWS are silenced during oogenesis or early embryonic development in a process known as genomic imprinting. PWS is triggered. In some PWS patients, HERC2 is mutated, but the HERC2 mutation itself is not the basis of PWS. This is because the HERC2 gene is not subject to genomic imprinting and expression of the maternal HERC2 allele alone is thought to be sufficient to avoid PWS symptoms 6 .
  • mice such as i ⁇ 's (renty jerkey sterile) and phenotypes similar to those of PWS.
  • jdf2 juvenile development and fertility 8 Male phenotypes include sterility, testicular dysplasia, spermatogenesis and sperm morphology Rarely, female phenotypes include uterus miniaturization, and ovaries with follicular overgrowth but little corpora hemorrhagica formation.
  • HERC2 gene is composed of 93 Ekuson and o de giant protein of 528kDa consisting 4834 amino acids' 1.2.
  • the base sequence of the HERC2 gene (AF071172) (SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence encoded by the gene (SEQ ID NO: 2) are evolutionarily highly conserved. , 3 has a 70% homology over 743 amino acids of the carboxy-terminal side. This homology suggests that the HERC2 gene has important cellular functions.
  • HERC2 has multiple functional domains including three RLDs (RCC-like domain), DOC domain, ⁇ domain, cytochrome b5-like region, ZZ-type zinc finger and C-terminal HECT domain. Based on these domain structures, the present inventors speculate that HERC2 is involved in protein transport and ubiquitin-mediated degradation.
  • BRCA1 a suppressor of breast and ovarian cancer
  • BRCA1 deficient cells exhibit genomic instability, this genome instability is believed to result from dysfunction of BRCA1 11.
  • Genomic instability results in reduced ability to repair DNA damage, reduced transcriptional regulatory mechanisms, induction of apoptosis, reduced S-phase or G2-M checkpoint function, and reduced regulation of centrosome replication.
  • BRCA1 after genotoxic Sudoresu, is phosphorylated by cinchona over peptidase of ATM / ATR family scratch. 12 '13. Then re-acidified-BRCA1!
  • An object of this invention is to provide the method of suppressing tumor growth. As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that tumor growth can be suppressed by suppressing the expression of HERC2 in cells, and the present invention has been completed. .
  • the present invention is as follows.
  • a method for suppressing a tumor characterized by suppressing the expression of HERC2 in a cell.
  • the suppression of HERC2 expression can be performed, for example, by siRNA against the HERC2 gene.
  • Inhibition of the interaction between HERC2 and BRCA1 can be performed, for example, by at least one selected from the group consisting of siRNA against HERC2 gene, HERC2 inhibitor and antibody against HERC2. ''
  • a screening method for an antitumor agent comprising measuring the expression level of HERC2 in a cell in the presence of a candidate substance, and selecting a substance having antitumor activity using the obtained measurement result as an index.
  • a screening method for an antitumor agent comprising measuring an interaction between HERC2 and BRCA1 in the presence of a candidate substance and selecting a substance having antitumor activity using the obtained measurement result as an index.
  • An antitumor agent comprising a substance that suppresses HERC2 expression in cells.
  • Examples of substances that suppress the expression of HERC2 include siRNA against the HERC2 gene.
  • An antitumor agent comprising a substance that inhibits the interaction between HERC2 and BRCA1 in cells.
  • Examples of the substance that inhibits the interaction between HERC2 and BRCA1 include at least one selected from the group consisting of siRNA against HERC2 gene, HERC2 inhibitor and antibody against HERC2. .
  • a method for treating a tumor characterized by inhibiting the interaction between HERC2 and BRCA1 in vivo.
  • HERC2 and BRCA1 The functional interaction between HERC2 and BRCA1 means that breast and ovarian cancer and Prader 'Willi Angelman's syndrome are connected in a molecular biological background.
  • Prader-Williangelman syndrome is thought to be one of the reasons that ubiquitin-mediated protein degradation is suppressed by the deletion of UBE3A (ubiquitin ligase ⁇ 3) contained in the structure of HERC2.
  • UBE3A ubiquitin ligase ⁇ 3
  • FIG. 1 shows that HERC2 was identified as a protein in the BRCA1 immune complex by mass spectrometry screening.
  • LC / MS / MS shows the predicted HERC2 protein and its predicted functional domain It is a figure shown with the position of 10 peptides identified by ". The position of HEflC2-CT (4254-4834) used in this test is also shown.
  • the 293T cells in the plOO plate were loaded with a FLAG-BRCA1 (1, -772) -encoded plate (lanes 1-4, 10pg) and increasing amounts of Myc-HERC2-CT (lane 2, lug; 3 and 2 pg; lanes 4 and 5 pg).
  • the total plasmid DNA amount was adjusted to '15ixg per plate by adding the parent pcDNA3 vector.
  • the steady state level of each protein was analyzed by immunoblotting using anti-FLAG antibody, anti-Myc antibody or anti-tubulin antibody.
  • 293T cells were transfected with either a plasmid encoding FLAG-BRCAli-772 and either the parent pc DNA3 vector or Myc-HERC2-CT. Incubate the cells with squeegee heximide ( ⁇ ) and track for a predetermined time. The cell lysate was then subjected to immunoblotting using an anti-FLAG antibody.
  • HeRC cells were transfected with siRNA specific for HERC2 (lane 1) or control siRNA (lane 2).
  • Cell lysates were analyzed by 3-8% gradient (top and middle panel) or 7.5% (bottom panel) SDS-PAGE followed by immunoblotting with the given antibodies.
  • Figure 3 shows the potential involvement of HERC2 ubiquitin ligase activity in the degradation of BRCA1.
  • ⁇ Treated 293 ⁇ cells transfected with the specified plasmid with ⁇ MG132 (lane 3) or DMSO solvent (lanes 1 and 2) for 14 hours, boiled in 1% SDS lysis buffer, and .0.1 It was diluted to% SDS 'and immunoprecipitated with anti-FLAG antibody framed beads. FLAG-RPB8 was eluted with FLAG peptide, subjected to 7,5% SDS-PAGE, and then analyzed by immunoblotting with anti-HA antibody.
  • Figure 4 shows that HERC2-CT overexpression results in: BRCA1 cytoplasmic localization. .
  • Figure 5 shows that BRCA1 degradation after DNA damage is restored by HERC2 knockdown.
  • T47D cells were incubated with epilubicin (0.2 pg / ml) for a predetermined time in the presence or absence of MG132 (50 ⁇ ).
  • Whole cell lysates were subjected to 7.5% SDS-PAGE and then analyzed by immunoplotting with the given antibodies.
  • FIG. 6A shows cell cycle synchronization.
  • FIG. 6B (Stage 1, 2) shows the results of immunoprecipitation using anti-BRCA1 antibody.
  • Figure 6B (3-6) shows the results of immunoblotting of whole cell lysates. ..
  • Figure 7 shows the change in the interaction between HERC2 and BRCA1 due to UV irradiation.
  • HERC2 is a large gene that is highly susceptible to mutation found in the hot spot of the deletion break in Prader-Willi / Angelman syndrome, and is present on human chromosome long arm 15all-ql3. Deletion of this gene is known to produce a wide variety of phenotypes in mice, such as and; jdf2.
  • jdf2 is; juvenile development and fertility, and has a phenotype of stunting and infertility. Both of these phenotypes are similar to the symptoms of PraderWilli / Angelman syndrome. ''
  • HERC2 has RLD and HECT domains ( Figure 1A). Domain This 1, GEF activity respectively since it is similar sequences and Interview bi chitin ligase RCC1 with (a GDP was removed from Ran, activity to be replaced RanGTP), respectively RLD and HECT force of HERC2, protein It is suggested to play a role in transport and degradation pathways. However, the exact cellular function is unknown.
  • the present invention has been completed based on the finding that HERC2 down-regulates BRCA1, which is a suppressor of breast cancer and ovarian cancer, in response to DNA damage, and prevents HERC2 from being down-regulated in BRCA1. It is characterized by suppressing the tumor while suppressing the expression or suppressing the interaction between HERC2 and BRCA1, thereby maintaining the activity of BRCA1.
  • screening by mass spectrometry was performed to obtain immune complex proteins that bind to BRCA1.
  • HERC2 was identified as a partner protein that specifically binds to BRCA1.
  • HERC2-CT A fragment consisting of amino acids 4254 to 4834 (SEQ ID NO: 3) in the amino acid sequence of HERC2 (SEQ ID NO: 2), and a C-terminal fragment containing the HECT domain in this fragment region (HERC2- CT)) and the interaction between HERC2-CT and BRCA1 was studied.
  • HERC2-CT interacted with BRCA1 in vivo and induced degradation of BRCA1.
  • siRNA siRNA
  • HERC2 is mainly localized in the cytoplasm, but excessive release of HERC2-CT induces the interest of Oshomi, especially BRCA1, in the cytoplasm. Because of this, HERC2 is thought to trap BRCA1 in the cytoplasm. .
  • HERC2 is a DNA damage responsive protein, and that the expression of HERC2 increases dramatically 3 to 6 hours after UV irradiation, and that the increase in HERC2 expression is BRCA1 It has been found that this occurs with protein regression.
  • a method of inhibiting HERC2 expression is employed.
  • RNA interference can be used.
  • siRNA small interfering RNA
  • RNAi is a phenomenon in which dsRNA (double-strand RNA) specifically and selectively binds to a target gene and cleaves the target gene to efficiently inhibit its expression. For example, when dsRNA is introduced into a cell, gene expression of the homologous sequence with that RNA is suppressed (knocked down).
  • dsRNA double-strand RNA
  • siRNA can be designed as follows. '
  • a sequence beginning with AA is selected from the selected region, and the length of the sequence is 19 to 25 bases, preferably 1921 bases. For example, select a sequence whose GC content is 40-60%. .
  • siRNA synthesized in siw'ro can be linked to plasmid DNA and introduced into cells, or two RNAs can be annealed.
  • shRNA is called short hairpin RNA and is an RNA molecule having a stem loop structure in which a part of a single strand forms a complementary strand with another region.
  • shRNA can be designed so that part of it forms a stem-loop structure. For example, if the sequence of a certain region is set as sequence A and the complementary strand to sequence A is set as sequence B, these sequences are present in one RNA strand in the order of sequence A, spacer, sequence B. And design it to be 45-60 bases in total.
  • Sequence A is a sequence of a partial region of the target HERC2 gene (SEQ ID NO: 1), and the target region is not particularly limited, and any region can be a candidate.
  • the length of sequence A is 19 to 25 bases, preferably 19 to 21 bases.
  • the present invention provides an antitumor method characterized by inhibiting the interaction between HERC2 ′ and BRCA1 in cells.
  • siRNA against HERC2 gene For inhibition of the interaction with BRCA1, siRNA against HERC2 gene, HERC2 inhibitor, antibody against HERC2 and the like can be used. This results in the loss of the ability to interact with HERC2 force S BRCA1, maintaining or increasing BRCA1 activity and inducing antitumor activity.
  • SiRNA against the HERC2 gene can be designed as described above.
  • HERC2 inhibitors include ubiquitination inhibitors, but are not limited thereto.
  • An antibody against HERC2 refers to an immunoglobulin that recognizes all or part of HERC2, specifically binds to the recognition site, and reduces or eliminates HERC2 activity. Methods for producing antibodies are known to those skilled in the art.
  • the screening method of the present invention is characterized by measuring the expression level of HERC2 in cells in the presence of a candidate substance, and selecting a substance having antitumor activity using the obtained measurement result as an index.
  • the present invention is characterized in that the interaction between HERC2. And BRCA1 is measured in the presence of a candidate substance, and a substance having antitumor activity is selected using the obtained measurement result as an index.
  • a screening method is provided. 1
  • a candidate substance is a test substance subjected to screening for use as an antitumor lj, and any substance can be used.
  • the type of candidate substance is not particularly limited. Examples include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds (high molecular or low molecular compounds), and other natural products or extracts such as fermentation products, cell extracts, cell culture supernatants. Plant extracts, mammalian extracts (eg, mice, rats, pigs, tusks, hidges, monkeys, humans, etc.), tissue extracts, plasma, etc. can also be used as candidate substances. These compounds may be novel compounds or may be known compounds.
  • the candidate substance may form a salt.
  • Candidate salts include physiologically acceptable acids (eg, inorganic or organic acids) Nya salts with bases (eg, metal acids, etc.) are used. Furthermore, a compound library, a phage display library, a combinatorial real life rally may be used. The compound library can be constructed using a known method, and a commercially available compound library is used. You can also
  • the expression of HERC2 or the interaction between HERC2 and BRCA1 is measured in the presence of a candidate substance (test substance).
  • a candidate substance for an antitumor agent
  • the expression level of HERC2 in the cell or the binding between HERC and 'BRCA1 can be measured.
  • Contact means that a cell and a candidate substance are present in the same reaction system or culture system. For example, adding a candidate substance to a cell culture vessel, And culturing cells in the presence of a candidate substance. '
  • the method for measuring the expression level of HERC and the method for measuring the interaction between HERC2 and BRCA1 are not particularly limited.
  • the interaction itself may be measured directly, or the interaction may be measured indirectly by measuring the activity of BRCA1 or HERC2.
  • Examples of measurement methods include RT-PCR, Northern blotting, immunoprecipitation, pull-down assay, Western blotting, NMR, surface plasmon resonance (SPR), gel shift assay, and gel filtration.
  • the same Atsy system is performed in the absence of the candidate poor, and the expression level of HERC2 or the above interaction is measured both in the presence and absence of the candidate substance. It is preferable to determine whether the candidate substance inhibits HERC2 expression or the above interaction by comparing the two.
  • a substance that suppresses HERC2 expression in cells and a substance that inhibits the interaction between HERC2 and BRCA1 in cells can be used as an antitumor agent.
  • siRNAs and shRNAs prepared to suppress HERC2 expression, HERC inhibitors, or antibodies against HERC2 should be used as pharmaceutical compositions for tumor gene therapy, particularly to suppress HERC2 expression. Is possible.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as an antitumor agent by administering the pharmaceutical composition in vivo.
  • a substance that suppresses the expression of HERC2 in cells or a substance that inhibits the mutual action of HERC2 and BRCA1 in cells can be used.
  • Tumor application site is not particularly limited, brain tumor, tongue cancer, .pharyngeal cancer, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, stomach cancer, pancreas cancer, biliary tract cancer, gallbladder cancer, duodenal cancer, colon cancer, liver cancer, uterine cancer, ovary Cancer Prostatic cancer, renal cancer, bladder cancer, rhabdomyosarcoma, fibrosarcoma, osteosarcoma, chondrosarcoma, skin cancer, various leukemias (eg acute myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic. Lymphatic leukemia, adult T-cell leukemia, malignant lymphoma) and the like.
  • the tumor may be the primary lesion, metastasis, or other disease, and T. '
  • the pharmaceutical composition of the present invention can employ both oral and parenteral dosage forms. In the case of parenteral administration, it is also possible to administer directly to the tumor site.
  • These dosage forms can be formulated according to conventional methods, and may contain pharmaceutically acceptable carriers and additives.
  • Such carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxybule polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water soluble Sex Dextran, Carboxymethinorestarch Sodium, Pectin, Methylcellulose, Ethylcellulose, Xanthan Gum, Gum Arabic, Casein, Agar, Polyethylene Glycol, Diglycerin, Glycerin, Propylene Glycol, Vaseline, Paraffin, Stearyl Norenoreconole, Examples include stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose, and surfactants acceptable as
  • the above additives are selected from the above alone or in appropriate combination according to the dosage form of the antitumor agent of the present invention.
  • the dosage form in the case of oral administration, it can be administered as tablets, capsules, fine granules, powders, granules, liquids, syrups, etc., or in an appropriate dosage form.
  • examples include pulmonary dosage forms (for example, those using Nefryza), nasal dosage forms, transdermal dosage forms (for example, ointments, creams), injection dosage forms, etc. .
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, It can be administered systemically or locally by subcutaneous injection or the like.
  • a substance that suppresses the expression of HERC2 or a substance that inhibits the interaction between HERC2 and BRCA1 is dissolved in a solvent (eg, physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.).
  • a solvent eg, physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • ween 80, teen 20, gelatin, human serum albumin and the like can be used.
  • sugar alcohols and saccharides such as mannitol and glucose can be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on age, sex, symptom, administration route, administration frequency, and dosage form.
  • the administration method is appropriately selected according to the patient's age and symptoms. Effective doses are from 0.01 g / kg body weight to 1 000 mg / kg, preferably from 0.1 ⁇ g to 100 // g. However, the therapeutic agent is not limited to these doses.
  • the application site is not particularly limited, and the above-mentioned aneurysm site can be exemplified.
  • the tumor may be the primary tumor, 'metastasized' or co-occurring with other diseases.
  • a method of administering a vector in which a nucleic acid has been incorporated is given in addition to a method of directly administering the pharmaceutical composition of the present invention by injection.
  • the above vectors include adenovirus vectors, adeno-related violetless vector, henorepesuinoless vector, vaccinia vineless vector, retro vineless vector, lentiviral vector, etc. Therefore, it can administer efficiently.
  • a phospholipid vesicle such as a liposome
  • the vesicle retaining siRNA or shRNA is determined by the lipofussion method.
  • the resulting cells are then administered systemically, for example, intravenously, into an artery, etc. It can also be administered locally to a tumor site, etc.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the age, sex, symptoms, administration route, administration frequency, dosage form, for example, in the case of adenovirus, the dosage is 10 6 to 10 13 per day. Be administered at 1-8 week intervals.
  • transfected 293T cells were incubated for 10 hours in 50 nM MG132 with 120 ⁇ l volume of anti-FLAG antibody cross-linked beads (Sigma). Subsequently, proteins interacting with FLAG-BRCA1 were immunoprecipitated from transfected 293T cells in two pl50 plates. The protein was eluted from the beads in 60 ⁇ l 25 mM ammonium bicarbonate containing O.lmg / ml FLAG peptide and digested with 7.4 pg / ml trypsin at 30 ° C. for 20 hours. Were then subjected to LC / MS / MS analysis by a known how 19 peptidyl de fragment. Using the Mascot software program (Matrix Science, London, UK), we searched the protein database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and prayed for the obtained collisional dissociation spectrum. Plasmid
  • the 0 DNA corresponding to the C-terminus of human HERC2 (4254-4834) was amplified by PCR. Using cDNA library one MCF10A cells as ⁇ , it was used having the nucleotide sequence hereinafter as bra 1 timer scratch.
  • F primer TAGGATCCCCTTACCAAATCTGGAGC (underlined part: BamHl part) (SEQ ID NO: 4) and
  • reaction solution composition TAGCTCTCATCTCTCGAGGACGTTTC (underlined part: Xhol site) (SEQ ID NO: 5)
  • the composition of the reaction solution and the reaction conditions are as follows. (When following the manual) ⁇ Reaction solution composition>
  • dNTPs including AccuPrime TM protein, MgS0 4)
  • HeLa cells with 10% ⁇ shea calf serum and 1% antibiotic - antimycotic using (Life Technologies, Inc. or Invitrogen) added with Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), in 5% C0 2 Cultured at 37 ° C.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • a predetermined concentration of MG132 or the same volume of DMSO solvent was added to the cells for a predetermined time, and then the cells were collected.
  • DMSO solvent Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the amount of total plasmid DNA was adjusted by adding the parent pcDNA3 vector.
  • the cells are washed with PBS and irradiated with a predetermined dose, eg, 35 J / m 2 of UV light (254 nm; UVP Inc, Upland, Calif.). (3 hours) allowed to grow.
  • a predetermined dose eg, 35 J / m 2 of UV light (254 nm; UVP Inc, Upland, Calif.
  • Asynchronous HeLa cells were cultured for 18 hours in the presence of 2 mM thymidine, for 9 hours in thymidine-removed medium, and then for 17 hours in the presence of 2 mM thymidine. Thereafter, the cells were transferred to a fresh medium, and the cells were collected at a predetermined time. Cells were stained with Propidium iodide, and cell cycle progression was monitored using Flow cytometry using a FACSCalibur (Becton Dickinson). 'Antibodies
  • SMART pool® HERC2 siRNA mix and control siRNA mix were purchased from Dharmacon Research, Inc. Double-stranded RNA (final concentration ⁇ ) was transfected into cells using Oligofectamine® (Invitrogen) according to the instructions for use. Immunoprecipitation and immunoplotting
  • Lysis buffer with 0.5% NP-40 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5% Nonidet P'40, 50 mM Nat ⁇ ImM Dithiothreitol (DTT), ImM NaV0 3 , ImM PMSF and protein inhibitor mixed
  • DTT distyl transfer protein
  • the cells were lysed using the solution, and rotated and mixed at 4 ° C for 30 minutes, and then centrifuged at 16,000 g for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was collected as a cell lysate and used for immunoprecipitation and immunoblotting.
  • the cell lysate was reacted with anti-BRCA1 antibody for 1 hour at 4 ° C and then 1 ° C at 4 ° C using Protein A and G Sepharose (Invitrogen). A temple sedimentation reaction was performed. The precipitate is washed 3 times with 0.5% NP-40 buffer and reconstituted in SDS sample buffer (50 mM Tris-HCl pH 6.8, 0.2% bromophenol blue, 10% glycerol, 2% SDS, and lOOmM DTT). Suspended and boiled for 3 minutes. An equivalent amount of blocking peptide was added as a peptide competition controller.
  • HERC2 detection is 3-8 ° / by electrophoresis.
  • NuPAGE registered trademark
  • XCell II trademark
  • Blot Module Invitrogen
  • the membrane to which each protein was transferred was incubated with a predetermined antibody, imaged with an ECL Western blotting detection system (Amersham Biosciences), and imaged with a Fuji LAS-3000 CCD camera.
  • ECL Western blotting detection system Amersham Biosciences
  • the cells were fixed with 4% formalin for 15 minutes and permeabilized with 0.2% Triton X-100 for 5 minutes. Cells were washed with phosphate buffered saline (PBS), blocked with 0.5% BSA in PBS, and stained with the given antibody. The primary antibody was diluted with blocking buffer at the following concentration.
  • Anti-HERC2 antibody lpg / ml
  • Anti-BRCA1 antibody 2pg / ml
  • FITC or rhodamine-conjugated secondary antibody was used at a 1:50 dilution. Nuclei were counterstained with 0.5 ⁇ TO-PRO-3 (Molecular Probe). Cells were then encapsulated with fluorescent mounting medium (BioLad) and examined with a confocal laser scanning microscope (LSM510, Carl Zeiss).
  • HERC2 has a Mowse score of 8Q, with 10 peptides showing the highest potential.
  • 602-636 GLKVIDVACGSGDAQTLAVTENGQVWSWGDGDYGK (SEQ ID NO: 7).
  • HE might be a ubiquitin ligase involved in BRCAl degradation and focused on HERC2.
  • HERC2 is a very large protein consisting of 4834 amino acids ( Figure 1A). Therefore, the present inventors clicked HERC2-CT under the assumption that the C-terminal fragment region of HERC2 carrying the HECT domain (4254-4834) (HERC2-CT) force S plays a role in binding and degradation of BRCA1. I was rolling. 293T cells were co-transformed with FLAG-BRCA1 and Myc-HERC2-CT, and Myc_HEiRC2-CT was co-precipitated with FLAG BRCA1 (FIG. 1B, lane 5). FLAG-BRCA1 was detected in anti-Myc: HERC2-CT immunoprecipitates (lane 8). This result indicates that the C-terminus of HERC2 interacts with BRCA1.
  • Example 293T cells were co-transformed with FLAG-BRCA1 and Myc-HERC2-CT, and Myc_HEiRC2-CT was co-precipitated with FLAG BRCA1 (FIG. 1B, lane 5). FLAG
  • the present inventors have found that BRCA1 expression decreases dramatically upon co-expression of HERC2-CT (FIG. 1B, lanes 2 and 5). Therefore, the present inventors analyzed whether HERC2 destabilizes BRCAl in vivo. .
  • BRCA1 itself is clearly seen as a small but self-ubiquitinated amount in vivo (Fig. 3B ', gene 1). This self-ubiquitination is probably due to interaction with endogenous BAED1.
  • BRCA1 ubiquitination was dramatically reduced by co-expression of My HERC2 ( Figure 3B, lane 2), but recovered by MG132 ( Figure 3B, lane 3).
  • BRCA1 BARD1 The self-ubiquitination catalyzed by BRCA1 BARD1 is linked through Lys6 of ubiquitin and is not enhanced by the addition of proteasome inhibitors such as MG132 or LLnL 19 . Therefore, the co-occurrence of Myc-HERC2-CT and ubiquitination detected upon exposure to MG132 may not be Lys6-related ubiquitination. Rather, it suggests that HERC2 mediates BRCA1 polyubiquitination as a signal for the proteasome.
  • proteasome inhibitors such as MG132 or LLnL 19
  • BRCA1 is a force reciprocating between the nucleus and the cytoplasm. It is mainly localized in the nucleus during the interphase. “On the other hand, the present inventors have confirmed that HERC2 is predominantly localized in the cytoplasm (FIG. 4A). HERC2-CT that is P- transfected is also localized in the cytoplasm (FIGS. 4B and C). Since the transfected HERC2-CT interacts with BRCA1, we speculated that HERC2.-CT could influence the localization of BRCA1. To investigate, we transiently expressed HERC2-CT in 293T cells and then analyzed BRCA1 localization by immunofluorescence microscopy.
  • the change in BRCA1 localization is not due to direct action on BRCA1 ', but may be caused by general transport mechanisms such as the elimination of impotino exportin activity.
  • the present inventors have studied the effect of '11 £ 11_Rei_2-01 1 to p53, a known importin Z Ekusupochi emissions regulatory cell protein.
  • HERC2-CT expression did not affect p53 cell localization (Fig. 4C). Therefore, we conclude that HERC2-CT-dependent cellular localization of BRCA1 was not caused by a defect in the general transport mechanism.
  • the present inventors have confirmed that HERC2 is dramatically upregulated after UV irradiation (FIG. 5B). Based on these findings, the present inventors decided to investigate whether HERC2 is involved in UV-induced BRCA1 degradation.
  • HERC2 expression was lost from HeLa cells, and after 48 hours, the cells were irradiated with ultraviolet light (35 J / m 2 ), and then cells were collected at several time points.
  • HERC2 expression was successfully silenced (Figure 5B, upper panel, lanes 5-8).
  • HERC2 was upregulated 3 to 6 'hours after UV irradiation (lanes 3 and 4), and the suppression of BRCA1 was confirmed (center panel, lanes 1 to 4).
  • BRCA1 expression did not change after UV irradiation in cells in which HERC2 expression was suppressed (Leh, 5-8).
  • HERC2 knockdown makes cells insensitive to UV-induced DNA loss ⁇ !
  • HERC2 When BRCA1 is deficient, cell 2 o ⁇ 22 it is widely known to be hypersensitive to DNA damage. HERC2 induces BRCA1 down-regulation after irradiating cells with UV light. For this reason, knockdown of HERC2 may result in the opposite phenotype of UV insensitivity. To investigate this possibility, the present inventors examined whether removal of HERC2 affects cell viability after UV irradiation.
  • HeLa cells were transfected with HERC2-specific siRNA and irradiated with ultraviolet light. Cell viability was measured by trypan blue exclusion method 24 hours after irradiation. The cell viability of HERC2 knockdown cells after UV irradiation at 50 J / m2 The survival rate of the control cells was about 8.5%, compared to about 28% of the cells.
  • FIG. 5C shows' representative data for cells observed by phase contrast microscopy at 24 hours after UV irradiation (50 J / m 2 ). Thus, it was found that when HERC2 is deficient, cells become resistant to UV irradiation. Example 7.
  • Thymidine double blocking 3 ⁇ 4 was used to synchronize the cell cycle (Fig. 6A), and cells were collected at predetermined time intervals, and an attempt was made to detect the phase S action of BRCA1 and HERC2 by immunoprecipitation (Fig. 6B). ⁇
  • the cells correspond to G2-M phase after cell recovery.
  • HERC2 peaked at 2-4 hours, and BRCA1 signal was attenuated at the same time.
  • BRCA1 works with hub protein quality in tumor progression pathway by germline mutations in the key gene, lifetime risk of breast cancer is about 80% 23. Therefore, down the regulation Yoo configuration of BRCA1 protein by other mechanisms, 24 that can cause pull the sporadic breast it was proposed, 25. .
  • HERC2 force may be involved in a mechanism that downregulates BRCA1 protein by modulating cell localization and stability of BRCA1 in response to DNA damage. It is shown.
  • One possibility for the biological significance of this mechanism is that HERC2 may induce degradation of BRCA1 in a mechanism linked to nuclear export.
  • BRCA1 and cytoplasmic eighth nuclear export of BARD1 reported reveals that cause the degradation thereof, put back this concept 26.
  • Our data indicate that stabilizing BRCA1 by HERC2 knockdown results in cells that are resistant to DNA damage due to UV radiation. This suggests that the mutual balance between HERC2 and BRCA1 influences cell viability.
  • HERC2 Oncogene
  • BRCA1 and HERC2 may work together as a tumor suppressor for Husky.
  • Echirunitoroso urea (ENU) mutagenesis analysis HERC2 that has been suggested to be the most labile mouse loci in studied so far is worth mentioning 27.
  • the HERC2 large duplication is transcribed despite being considered a pseudogene with a high mutation rate.
  • Tumor suppressor p53 is required to modulate BRCAl expression. Mol Cell Biol 20, 7450-9 (2000).

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Description

明 細 書 腫瘍の抑制方法 技術分野 .
本発明は、 HERC2発現を抑制することを含む、 腫瘍を抑制する方法に関する。 さらに、 本発明は、 HERC2と BRCA1の結合を阻害することを含む、 細胞又は組 織において腫瘍を抑制する方法及び抗腫瘍活性を誘導する方法に関する。 背景技術
HERC2 (hect domain and RCC-like domain 2) は、 ヒ トの第 15番染色 ί卒 長 Μ (バンド 15qll及び 15ql3) 上に存在する欠失切断点のホットスポットに認 め られる遺伝子であ り 、 プラーダー ， ウ イ リ エンジェルマン (Prader-Willi/Angelman)症候群 （PWS/AS) に ¾与する。 この染色体領域にお ける HERC2 の重複は、 精子形成の際に相同的糸且換えのエラーの発生率を上昇さ せる決定的な要因であると考えられる。 また、 HERC2の重複によって 4-Mb .の染 色体領域に欠失が生じ、 この欠失により E6-AP (human papilloma virus E6-associated protein)をコ一ドする遺伝子である UBE3Aを含むいくつかの遺 伝子が排除される。 PWSに対して保護する役割を担う母系対立遺伝子は、 ゲノム ィンプリ.ンティングとして知られる過程で卵形成又は早期胚発生め間に沈黙化す るため、 父系染色体内に上記欠失が存在するだけで PWSが引き起こされる。一部 の PWS患者では HERC2が変異しているが、 HERC2突然変異自体が PWSの根 底にあるのではない。 なぜならば HERC2遺伝子はゲノムインプリンティングを 受けず、母系 HERC2対立遺伝子の発現のみで PWSの症状を回避するのに十分で あると考えられているからである6。
それにもかかわらず、この遺伝子のホモ接合突然変異はマウスにぉレ、て多種多様 な表現型を生じさせる、例えば、 PWSの症状に類似した表現型として、 i^'s (renty jerkey sterile)及び jdf2 juvenile development and fertility 8)刀知られてレ、る。 雄 性の表現型として、 生殖不能、 精巣形成不全、精子形成異常及び精子形態異常が含 まれ、雌性の表現型として、 子宮の小型化、及び卵胞は発育過多となるが黄体又は 血体 (corpora hemorrhagica)はほとんど形成されない卵巣が含まれる。
HERC2遺伝子は、 93ェクソンから構成され、 4834アミノ酸からなる 528kDa の巨大タンパク質を ードする' 1.2。
HERC2遺伝子 （AF071172) の塩基配列 （配列番号 1 ) 及び該遺伝子によりコ —ドされるアミノ酸配列 （配列番号 2 ) は進化的に高度に保存されており、 ヒ，卜と ショウジョゥバエの HERC2は、カルボキシ末端側の 743アミノ酸にわたって 70% の相同性を有している3。 この相同性は、 HERC2遺伝子が重要な細胞機能を有す ることを示唆するものである。 HERC2は、 3つの RLD (RCC様ドメイン）、 DOC ドメイン、 ΜΉ ドメイン、 シトクロム b5様領域、 ZZ型ジンクフィンガー及び C 末端 HECT ドメインを含む多数の機能性ドメインを有する。 本発明者らは、 これ らのドメイン構造に基づき、 HERC2がタンパク質の輸送及びュビキチンを介した 分解に関与すると推測している。
乳癌及び卵巣癌の抑制因子である BRCA1は、腫瘍進行を予防する多くの細胞経 '、 路と関連付けがなされてきた。 例えば、 BRCA1欠損細胞はゲノム不安定性を示す が、 このゲノム不安定性は BRCA1の機能不全から生じると考えられる 11。 ゲノ ム不安定性は、 DNA損傷修復能の低下、転写調節機構の低下、アポトーシス誘導、 S期中又は G2-Mチェックポイント機能の低下、及び中心体の複製の調節低下など を引き起こす。 BRCA1は、 遺伝毒性スドレス後に、 ATM/ATRファミリ一のキナ ーゼによってリン酸化される.12'13。 その後、 リ.ン酸化- BRCA1は、！ DNA修復タン パク質、 例えば Rad51又は Rad50-Mrell-Nbslと結合して協同することにより、 DNA損傷部位の相同組換え修復をする "、15。 他方で、 BRCA1の発現は、 DNA損 傷応答の後期にダウンレギユレ一卜される 16、17。このダウンレギユレーションの役 割を担う 1つの主要機構は、 p53を介した転写抑制である
し力 し、 p53非依存性かつプロテアソーム依存性のタンパク質分解も、 DNA損 傷によって誘導される BRCA1のダウンレギュレーションに関与する is。このダウ ンレギュレーションをもたらすメカニズムは、 現在のところ明らかではない。 発明の開示 本発明は、腫瘍増殖を抑制する方法を提供することを目的とする。本発明者らは、 上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 細胞における HERC2 の発現を 抑制することによって腫瘍の増殖を抑制できることを見出し、本発明を完成するに 至った。.
すなわち、 本発明は以下の通りである。
( 1 ) 細胞内における HERC2 の発現を抑制することを特徴とする、 腫瘍を抑制 する方法。
本発明の方法にぉレ、て、 HERC2の発現の抑制は、例えば HERC2遺伝子に対す る siRNAにより行なうことができる。
( 2 )細胞内において HERC2と BRCA1との相互作用を阻害することを特徴とす る、.腫瘍を抑制する方法。
HERC2 と BRCA1 との相互作用の阻害は、 例えば HERC2 遺伝子に対する siRNA、 HERC2阻害剤及び HERC2に対する抗体からなる群から選択される少な くとも 1.つにより行なうことができ'る。 ' '
( 3 ) 候補物質の存在下で細胞内の HERC2 の発現量を測定し、 得られる測定結 果を指標として抗腫瘍活性を有する物質を選択することを特徴とする、抗腫瘍剤の スクリーユング方法。
( 4 )候補物質の存在下で HERC2と BRCA1との相互作用を測定し、得られる測 定結果を指標として抗腫瘍活性を有する物質を選択することを特徴とする、抗腫瘍 剤のスクリーニング方法。 '
' ( 5 ) 細胞内における HERC2の発現を抑制する物質を含む抗腫瘍剤。
HERC2の発現を抑制する物質としては、例えば HERC2遺伝子に対する siRNA が挙げられる。
( 6 )細胞内において HERC2と BRCA1との相互作用を阻害する物質を含む、抗 腫瘍剤。
HERC2と BRCA1との相互作用を阻害する物質としては、例えば HERC2遺伝 子に対する siRNA、 HERC2阻害剤及び HERC2に対する抗体からなる群から選 択される少なくとも 1つが挙げられる。 .
( 7 ) 生体内における HERC2 の発現を抑制することを特徴とする、 腫瘍の治療 方法。
( 8 )生体内において HERC2と BRCA1との相互作用を阻害するこ. ίを特徴とす る、 腫瘍の治療方法。
( 9 ) 重瘍を治療する医薬を製造するための、 細胞内における HERC2 の発現を 抑制する物質の使用。
( 1 0 )腫瘍を治療する医薬を製造するための、細胞内において HERC2と BR A1 との相互作用を阻害する物質の使用。 . '本発明により、 HERC2タンパク質の機能が初めて示された。すなわち、 HERC2 は、 BRCA1と機能的に相互作用して BRCA1の安定性を調節し、 BRCA1の細胞局 在を調節することが分かった。そして、 HERC2は DNA損傷に応答するタンパク 質であるため、 DNA損傷が誘導されると、 BRCA1タンパク質が抑制されること が見出された。 このような結果は、 DNA損傷後に BRCA1タンパク質分解が起こ ることを裏付けるメカニズムが明らかにされたこと'を示すものであり、このメカ二 ズムは、 細胞の運命を決定するために重要であると言える。 HERC2と BRCA1と の機能的相互作用は、乳癌及び卵巣癌とプラーダー '·ウイリ エンジェルマン症候 群力 分子生物学的な背景において結びついていることを意味する。 すなわち、 プ ラーダー.ウイリ エンジェルマン症候群は、 HERC2の構造中に含まれる UBE3A (ュビキチンリガーゼ Ε3) の欠失により、 ュビキチンを介したダンパク質分解が 抑制されることが原因の一つと考えられる。一方、乳癌及び卵巣癌に関与すると考 えら る BRCA 1タンパク質のダウンレギュレーションは、 本発明において HERC2と BRCA1とが相互作用することが見出され、 このダウンレギユレ一ショ ンは ρ53を介さないことが示された。 したがって、 PWS/ASは、 HERC2の構造 中の UBE3Aが関与することが考えられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 HERC2が質量分析スクリ一ユングによって BRCA1免疫複合体中のタ ンパク質として同定されたことを示す図である。
Α：予測された HERC2 タンパク質とその予想機能性ドメインを、 LC/MS/MS 「によって同定された 10個のぺプチ の位置と共に示す図である。 この試験で使用 した HEflC2-CT(4254-4834)の位置も合わせて示す。
B： トランスフエク卜した HERC2-CTが BRCA1と相互作用することを示す図 である。.293T細胞に所定のプラスミ ドをトランスフエク 卜した。 全細胞溶解産物 (レーン 1から 3) 又は抗 FLAG抗体を用いた免疫沈降物 （レーン 4から 6) 及 び抗 Myc抗体を用いた免疫沈降物 （レーン 7-9) を、 所定の抗体による免疫 '口 ッティングに供した。 IP :免疫沈降物、 IB：免疫ブロッテイング。
' 図 2は、 BRCA1は ώ 'roで HERC2によって不安定化されることを示す図であ .る。 .
A： plOOプレート中の 293T細胞に、 FLAG-BRCA1 (1,-772) をコードするプラ… ス ド （レーン l-4、10pg) 及び漸増量の Myc-HERC2-CT (レーン 2、 lug； レー ン 3、 2pg； レーン 4、. 5pg) をトランスフエクトした。 親 pcDNA3ベクターを添 加することによって全プラスミ ド DNA量をプレート当り' 15ixgに調整した。 各々 のタンパク質の定常状態レベルを、 抗 FLAG抗体、抗 Myc抗体又は抗チューブリ ' ン抗体を用いた免疫ブロッテイングによって分析した。
B： FLAG BRCA1の代わりに内因性 BRCA1 を分析したことを除いて、各々の ' タンパク質の定常状態レベルを (A)と同様に分析した結果を示す図である。
C： 293T細胞に、— FLAG-BRCAli-772をコードするプラスミ ド及び親 pcDNA3ベ クタ一又は Myc-HERC2-CTのいずれかをトランスフエク トした。 細胞をシク口 へキシミ ド （ΙΟμΜ) と共にインキュベートし、 所定の時間追跡し 。 次に細胞溶 • ' 解産物を抗 FLAG抗体を用いた免疫ブロッテイングに供した。
D ： HeLa細胞に、 HERC2に特異的な siRNA (レーン 1) 又は対照 siRNA (レ ーン 2) をトランスフエクトした。 細胞溶解産物を、 3-8%勾配 （上と中央のパネ ノレ） 又は 7.5% (下のパネル） SDS-PAGEを行レ、、 次いで所定の抗体による免疫ブ ロッテイングによって分析した。
図 3は、 BRCA1の分解における HERC2ュビキチンリガーゼ活性の潜在的関与 を示す図である。
A： 293T細胞に、 野生型 （レーン 2) 又は Myc-HERC2-CTの C4352A突然変 異体のいずれかを発現するプラスミ ドをトランスフエクトした。全細胞溶¾军産物を 所定の抗体による免疫ブロッテイングに供した。
Β：所定のプラスミ ドをトランスフエクトした 293Τ細胞を、 ΙΟμΜの MG132 (レーン 3) 又は DMSO溶媒 （レーン 1及び 2) で 14時間処理し、 1%SDS溶解 緩衝液中で煮沸して、 .0.1%SDS'に希釈し、抗 FLAG抗体架橘ビーズで免疫沈降さ せた。 FLAG-RPB8を FLAGペプチドで溶出し、 7,5%SDS-PAGEを行い、 次い で抗 HA抗体による免疫ブロッテイングによって分析した。
図 4は、 HERC2-CTの過剰発現により、： BRCA1の細胞質局在が生じることを示 す図である。 .
. A：增殖中の HeLa細胞を 3%ホルマリンで固定し、 所定の抗体を加え、 次いで FITC (グリーン） 又はローダミン （レッ ド） 結合二次抗体で染色した。 核は TO PRO-3で染色した。 Mergeは、 2つのタンパク質の画像を重ね合わせたもの を す。 ノ
Bおよび C： 293T細胞に Myc-HERC2-CT又は親 pcDNAベクターのいずれか をトランスフエクトし、 (A)に記载ざれた所定の抗体で染色した結果を示す図であ る。
図 5は、 DNA損傷後の BRCA1の分解が HERC2のノックダウンによって回復 されることを示す図である。
A : T47D細胞を、 MG132 (50μΜ) の存在下又は非存在下で、 所定時間ェピル ビシン（0.2pg/ml)と共にィンキュベートした。全細胞溶解産物を、 7.5%SDS-PAGE に供し、 次い 所定の抗体による免疫プロッティングによって分析した。
B：対照、 siRNA (レーン 1から 4) 又は HERC2に特異的な siRNA (レーン 5 から 8) をトランスフエクトした HeLa細胞に紫外線照射し (35J/m2)、照射後所定 の時点で回収した。 細胞溶解産物を、 3-8%勾配 （上のパネル） 又は 7.5% (中央及 び下のパネル) SDS-PAGEに供し、次レ、で図に示された抗 HERC2抗体、抗 BRCA1 抗体又は抗チューブリン抗体による免疫プロッティングによって分析した。
C： HeLa細胞に、対照 siRNA (上のパネル）又は HERC2に特異的な siRNA (下 のパネル） を トランスフエク 卜した。 紫外線照射 （50J/m2) の前 （左のパネル） 又は 24時間後 （右のパネル） の細胞生存度を位相差顕微鏡検査法によつて観察し た。 図 6Aは、 細胞周期の同調を示す図である。 '
図 6B.(1、 2段）は、抗 BRCA1抗体を用いた免疫沈降法の結果を示す図である。 図 6B (3-6段） は、 全細胞溶解産物の免疫ブロッテイングの結果を示す図であ る。 . . '
図 7は、 UV照射による HERC2と BRCA1との相互作用の変化を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。 ここで引用する全ての特許出願、 特許、 文献及 ひ 'ウェブサイ トは、 それらの全体が参照としてここに組み込まれる。
1 概要
HERC2は、 Prader-Willi/Angelman症候群の欠失切断点のホットスポットに認 められる高度に変異しやすい大型遺伝子であり、 ヒ ト染色体長腕 15all-ql3上に 存在する。 この遺伝子が欠損すると、 マウスにおける多種多様な表現型、 例えば 及び; jdf2が生じることが知られている。
とは、 runty jerky sterileであり 発育障害、 振戦、 無精子症の表現型を有す る。 一方、 jdf2は; juvenile development and fertilityであり、 発育障害と不妊の 表現型を有している。 これらの表現型はいずれも PraderWilli/Angelman症候群 の症状に類似したものである。 ' '
HERC2は RLD及び HECT ドメインを有している（図 1 A)。こ1のドメインは、 それぞれ GEF活性 (Ranから GDPを除去し、 RanGTPに交換する活性） をもつ RCC1 に類似した配列とュビキチンリガーゼであることから、 HERC2 のうちの RLD及び HECT力 それぞれ、 タンパク質輸送と分解経路において役割を果たす ことが示唆される。 しカゝし、 その正確な細胞機能は不明である。
本発明は、 DNA損傷に応答して HERC2 が乳癌及び卵巣癌の抑制因子である BRCA1 をダウンレギュレー卜するという知見に基づき完成されたものであり、 BRCA1のダウンレギュレーシヨンが生じないように HERC2の発現を抑制し、あ るいは HERC2と BRCA1との相互作用を抑制することで、 BRCA1の活性を保持 させて腫瘍を抑制することを特徴とする。 本発 において、 BRCA1に結合する免疫複合体タンパク質を得るため、 質量分 析によるスクリーニングを行なった。 その結果、 BRCA1に特異的に結合するパ一 トナータンパク質として HERC2が同定された。 HERC2のアミノ酸配列（配列番 号 2 ) のうち第 4254番 -4834番のアミノ酸配列 （配列番号 3 ) からなるフラグメ ントであって、 このフラグメント領域中に HECT ドメインを含む C末端フラグメ ント （HERC2-CTという。） を作製して HERC2-CTと BRCA1との相互作用を検 討した。 その結果、 HERC2-CTは、 in w oで BRCA1と相互作用し、 BRCA1の 分解を誘導した。 これに対し、 siRNAにより HERC2をノックダウンした場合は BRCArが安定ィ匕された。
HERC2は主として細胞質に局在するが、 HERC2-CTを過剰発 させると、 興 味滦レ、ことに BRCA1の細胞質への局在が誘導された。このこと力、ら、 HERC2は BRCA1を細胞質にトラップすると考られる。 .
さらに本発明者らは、 HERC2が' DNA損傷応答性タンパク質であり、 紫外線照 射して 3〜6時間後に HERC2の発現が劇的に上昇すること、 そして、 HERC2の 発 ¾の上昇は、 BRCA1タンパク質の退行に伴って起こることを見出した。
さらに、 HERC2をノックダウンすると、 BRCA1は正常レベルに回復し、 細胞 は紫外線照射に対して抵抗性となった。 この紫外線抵抗性は、 BRCA1が欠損する ことにより誘導される紫外線過敏性とは対照的である。'したがって、 このような結 果は、 Prader-Willi/Angelman症候群関連の遺伝子産物である HERC2に関する細 胞機 tkを規定するものであり、その機能は分子生物学的な背景において乳癌及び卵 巣癌に結びついているという概念を提起する。
2 . HERC2の発現阻害及び活性阻害
BRCA1の活性を高めるために、本発明においては HERC2の発現を阻害する方 法が採用される。
HERC2 の発現阻害には、 特に限定されるものではないが、 例えば RNA干渉 ( RNAi) を利用することができる。 HERC2 遺伝子に対する siRNA(small interfering RNA)を設計及び合成し、 これを細胞内に導入させることによって、 RNAiを引き起こすことができる。 '
RNAiとは、 dsRNA(double-strand RNA)が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結 合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象であ る。 例えば、 dsRNA .を細胞内に導入す.ると、 その RNAと相同配列の遺伝子の発 現が抑制 （ノックダウン） される。
siRNAの設計は、 以下の通り行なうことができる。 '
(a) HERC2をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、 任意の 領域を全て候補にすることが可能である。 例えば、 ヒ 卜の場合では、 GenBank
, Accession number： AF071172 (配列番号 1 ) の任意の領域を候補にすることがで きる。 '
(b) 選択した領域から、 AAで始まる配列を選択し、 その配列の長さは 19〜25 塩 ¾、 好ましくは 19 21塩基である。 その配列の GC含量は、 例えば 40〜60% となるものを選択するとよレヽ。 . ■ . · ■
siRNAを細胞に導入するには、 ώ w' roで合成した siRNAをプラスミ ド DNA に連結してこれを細胞に導入する方法、 2本の RNAをァニールする方法などを採 用することができる。
- また、本発明は、 RNAi効果をもたらすために shRNAを使用することもできる。 shRNA とは、 ショートヘアピン RNA(short hairpin RNA)と呼ばれ、 一本鎖の一 部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムル一プ構造を有する RNA分 子である。 1
shRNAは、 その一部がステムループ構造を形成するように設計することができ る。 例えば、 ある領域の配列を配列 Aとし、 配列 Aに対する相補鎖を配列 Bとす ると、 配列 A、 スぺ一サー、 配列 Bの順になるようにこれらの配列が一本の RNA 鎖に存在するようにし、 全体で 45〜60塩基の長さとなるように設計する。 配列 A は、 標的となる HERC2遺伝子 （配列番号 1 ) の一部の領域の配列であり、 標的 領域は特に限定されるものではなく、 任意の領域を候補にすることが可能である。 そして配列 Aの長さは 19〜25塩基、 好ましくは 19〜21塩基である。
3 . HERC2と BRCA1との相互作用の阻害 本発明は、細胞内において HERC2'と BRCA1との相互作用を阻害することを特 徴とする、 抗腫瘍方法を提供する。
BRCA1との相互作用の阻害は、 HERC2遺伝子に対する siRNA、 HERC2阻害 剤、 HERC2に対する抗体などを利用することができる。 これにより、 HERC2力 S BRCA1に相互作用する機能が失われ、 BRCA1の活性が維持され又は増加して抗 腫瘍活性が誘導される。 . HERC2遺伝子に対する siRNAは、 前記の通り設計することができる。
HERC2阻害剤としては、例えばュビキチン化阻害剤などが挙げられるが、 これ ,らに限定されるものではない。
： HERC2に対する抗体は、 HERC2の全部又は一部を認識して認識部位に特異的 に褚合し、 HERC2の活性を低下又は消失させる免疫グロブリンをいう。 抗体の作 製法は、 当業者に公知である。
4 . スクリーニング方法 ' ―
本発明のスクリーニング方法は、 候補物質の存在下で細胞内の HERC2 の発現 量を測定し、得られる測定結果を指標として抗腫瘍活性を有する物質を選択するこ とを特徴とする。
また、本発明は、候補物質の存在下で HERC2.と BRCA1との相互作用を測定し、. 得られる測定結果を指標として抗腫瘍活性を有する物質を選択することを特徴と する、 腫瘍剤のスクリーニング方法を提供する。 1
候補物質とは、抗腫餘 ljとして使用するためにスクリーニングに供される被験物 質であり、任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定される ものではない。 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物 (高分子又は低分子化合物）などが挙げられ、これらのほかに、天然物又は抽出物、 例えば発酵生産物、 細胞抽出液、 細胞培養上清、 植物抽出液、 哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ブタ、 ゥシ、 ヒッジ、 サル、 ヒ トなど） の組織抽出液、 血漿など も候補物質として使用することができる。これら化合物は新規な化合物であっても よレ、し、公知の化合物であってもよレ、。また、候補物質は塩を形成していてもよレ、。 候補物質の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例えば、 無機酸や有機酸など） ゃ塩基 （例えば、. 金属酸など） などとの塩が用いられる。 さらには、 化合物ライブ ラリー、.ファージディスプレーライブラリ—、 コンビナ卜リアルライフ "ラリーでも よい。'化合物ライブラリ一は、公知手法を用いて構築することが可能であり、 また 市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
本発明のスクリーニング方法では、 候補物質 （被験物質） の存在下において、 HERC2の発現、 あるいは HERC2と BRCA1との相互作用を測定する。 例えば、 細胞に抗腫瘍剤の候補物質を接触させることにより、細胞内の HERC2の発現量、 あるいは HERCと' BRCA1との結合を測定することができる。 「接触」 とは、 細 . 胞と候補物質とを同一の反応系又は培養系に存在さ'せることを意味し、例えば、細 胞培養容器に候補物質を添加すること、細胞と候補物質とを混合すること、細胞を 候補物質の存在下で培養することなどが含まれる。 '
HERC の発現量の測定方法、及び HERC2と BRCA1との相互作用の測定方法 は特に限定されるものではない。上記相互作用それ自体を直接的に測定してもよい し、 BRCA1又は HERC2の活 1"生を測定することに'より、 上記相互作用を間接的に '. 測定することもできる。 相互作用の測定方法としては、 例えば、 RT-PCR法、 ノ一 ザンブロッテイング、免疫沈降法、 プルダウンアツセィ法、 ウェスタンブロッティ ング、 NMR、 表面プラズモン共鳴 （SPR)、 ゲルシフトアツセィ、 ゲルろ過などが 挙げられる。 一般的には、 同一のアツセィ系を候補物貧の非存在下でも行い、候補 物質の存在下の場合と非存在下の場合の両者における HERC2 の発現量又は上記 相互作用を測定し、 両者を比較することにより、 候補物質が HERC2 の発現又は 上記相互作用を阻害しているかどうかを判別することが好ましい。
5 . 医薬組成物
本発明において、 細胞内における HERC2 の発現を抑制する物質、 および、 細 胞内において HERC2と BRCA1との相互作用を阻害する物質は、抗腫瘍剤として 使用することができる。特に、 HERC2の発現を抑制するために作製された siRNA や shRNA、 さらには HERC阻害剤、 あるいは HERC2に対する抗体は、 HERC2 の発現を抑制するため、特に腫瘍の遺伝子治療用医薬組成物として使用することが できる。 ' 本発明の医薬組成物は、 当該医薬組成物を生体内に投与することにより、抗腫瘍 剤として使用することができる。 また、 上記医薬組成物を製造するため、 細胞内に おける HERC2 の発現を抑制する物質、 あるいは細胞内において HERC2 と BRCA1との相互作甩を阻害する物質を.使用することができる。
腫瘍の適用部位は特に限定されず、脳腫瘍、舌癌、 .咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、 胃癌、 滕臓癌、 胆道癌、 胆嚢癌、 十二指腸癌、 大腸癌、 肝癌、 子宮癌、 卵巣癌 前 立腺癌、 腎癌、 膀胱癌、 横紋筋肉腫、 線維肉腫、 骨肉腫、 軟骨肉腫、 皮膚癌、 各種 白血病 （例えば急性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性骨髄性白血病、 慢性 . リンパ性白血病、 成人型 T細胞白血病、 悪性リンパ腫） 等が挙げられる。 上記腫 瘍は、原発巣であっても、 転移したものであっても、他の,疾患と併発したものであ つ Tもよレ、。 '
本発明の医薬組成物は、経口投与及び非経口投与のいずれの剤形をも採用するこ とができる。非経口投与の場合は、上記腫瘍部位に直接投与することも可能である。 これらの剤形は常法にしたがって製剤化するこどができ、医薬的に許容される担 体や添加物を含むものであってもよい。 このような担体及び添加物として、 水、 医 薬的に許容される有機溶剤、 コラーゲン、 ポリ ビニルアルコール、 ポリビニノレピロ リ ドン、 カルボキシビュルポリマー、 カルボキシメチルセル 0ースナトリウム、 ポ リアクリル酸ナトリウム、 アルギン酸ナトリウム、 水溶性デキストラン、 カルボキ シメチノレスターチナトリウム、 ぺクチン、.メチルセルロース、 ェチルセルロース、 キサンタンガム、 アラビアゴム、 カゼイン、 寒天、 ポリエチレングリコール、 ジグ リセリン、 グリセリン、 プロピレングリコール、 ワセリン、 パラフィン、 ステアリ ノレアノレコーノレ、ステアリン酸、 ヒ ト血清アルブミン、マンニトール、 ソルビ I ^一ル、 ラクト一ス、 医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
上記添加物は、本発明の抗腫瘍剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組 み合わせて選ばれる。 剤形としては、 経口投与の場合は、 錠剤、 カプセル剤、 細粒 剤、 粉末剤、 顆粒剤、 液剤、 シロップ剤等として、 または適当な剤型により投与が 可能である。 非経口投与の場合は、 経肺剤型 (例えばネフライザ一などを用いたも の)、 経鼻投与剤型、 経皮投与剤型 (例えば軟膏、 クリーム剤)、 注射剤型等が挙げら れる。 注射剤型の場合は、 例えば点滴等の静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。
例えば、 注射用製剤として使用する場合、 HERC2の発現を抑制する物質、 又は HERC2 と. BRCA1 との相互作用を阻害する物質を溶剤 (例えば生理食塩水、 '緩衝 液、 ブドウ糖溶液等)に溶解し、 これに ween 80、 T een 20、 ゼラチン、 ヒ ト血 清アルブミン等を加えたものを使用することができ ¾。 あるいは、使用前に溶解す る剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、 例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。 本発明の医薬組成物の投与量は、 年齢、 性別、 症状、 投与経路、 投与回数、 剤型 によって異なる。 投与方法は、 患者の年齢、 症状により適宜選択する。 有効投与量 は、 一回につき体重 1kgあたり 0.01 g〜： I000mg、 好ましくは 0·1 μ g〜100// g である。 但し、 上記治療剤はこれらの投与量に制限されるものではなレ、。 ： 本発明の医薬組成物を腫瘍の遺伝子治療剤として使用する場合は、適用部位は特 に限定されず、 上記暉瘍部位を例示することができる。.上記腫瘍は、原発巣であつ ても、'転移したものであっても、 他の疾患と併発したものであってもよい。
本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の医薬組成物 を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたべクターを投与する方法 が挙げられる。 上記ベクターとしては、 アデノウイルスベクター、 アデノ関連ウイ ノレスべクタ一、へノレぺスゥイノレスベクター、 ワクシニアウイノレスべグター、 レトロ ウイノレスベクター、 レンチウィルスベクター等が挙げられ、 これらのウイノレスベタ タ一を用いることにより効率よく投与することができる。 I
ま /"こ、本発明の医薬組成物をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小 胞体を投与することも可能である。 siRNAや shRNAを保持させた小胞体をリポ フエクシヨン法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈 内、 動脈内等に全身投与する。 腫瘍部等に局所投与することもできる。
本発明の医薬組成物の投与量は、 年齢、 性別、 症状、 投与経路、 投与回数、 剤型 によって異なるが、 例えばアデノウイルスの場合の投与量は 1 日 1回あたり 106 〜： 1013個程度であり、 1週〜 8週間隔で投与される。
siRNA又は shRNAを目的の組織又は器官に導入するために、 市販の遺伝子導 入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。 以下、 実施例により本発明をきらに具体的に説明する。 但し、'本発明はこれら実 施例に限定されるものではない。. 実施例 '
質量分析 , トランスフエクトされた 293T細胞を、 120μ1容量の抗 FLAG抗体架橋ビーズ (Sigma) と共に 50nM MG132中で 10時間インキュベートした。 その後、 2つ の pl50プレート中のトランスフエクトされた 293T細胞から FLAG-BRCA1と相 互作用するタンパク質を免疫沈降させた。 タンパク質は、 , O.lmg/mlの FLAGぺプ チドを含む 25mM重炭酸アンモニゥム 60μ1中でビーズから溶出し、 7.4pg/ml の トリプシンにより 30°Cで 20時間消化した。 次に、ぺプチドフラグメントを公知方 法19により LC/MS/MS分析に供した。 Mascotソフ卜ウェアプログラム （Matrix Science, London, UK) を用いて、'米国国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) のタンパク質データべ一スを検索し、 獲得した衝突解離スぺク トルを解 祈した。 プラスミ ド
ヒ ト HERC2の C末端 （4254-4834) に対応する 0DNAは PCR.によって増幅し た。铸型として MCF10A細胞の cDNAライブラリ一を用い、ブラ1イマ一として以 下の塩基配列を有するものを使用した。
Fプライマ一： TAGGATCCCCTTACCAAATCTGGAGC (下線部： BamHl部 位） （配列番号 4 ) 及び
Rプライマ一： TAGCTCTCATCTCTCGAGGACGTTTC (下線部： Xhol部位） (配列番号 5 ) 反応液組成及び反応条件は以下の通りである。 （マニュアルに従った場合) <反応液組成〉
テンプレート （50ng/ l) ： Ι μ ΐ
Ρ&用 buffer : 2 μ \
(dNTP、 AccuPrime™ protein, MgS04を含む）
P£xポリメラ一ゼ （Stratagene) ： ΟΛ μ Ι
Fプライマー （lOOpmol/ 1 ) : 0.6 ^ 1
Rプライマー（lOOpmol/ μ 1 )： 0.6 ^ 1
滅菌水： : ： 15.4 1
合計： 20 μ \
• く反応条件〉
95°Cで 2分間加熱後、 95°Cで 15秒の熱変性、 50°Cで 30秒のアニーリング及 び 68°Cで 1分の伸長反応を 1サイクルとして計 25サイクル行い、 72°Cで i0分 . 間保温した後 4°Cで冷却した。 増幅後の断片は、 N末端 Mycタグと共に pcDNA3ベクタ一にィンフレームでサ ,ブクローニングした。 BRCA1、 BARD1 及びュビキチンに対する哺乳動物発現プ ラスミ ドは公知のものを使用し 19、29、 FLAG BRCA1 は Richard Baer 博士 (Columbia University) により提供された。 HERC2突然変異体である C4352A は、 部位特異的突然変異誘発キット (Stratagene)によって作製した。 使用した全て のプラスミ ドは DNAシークェンシングによって確認した。 細胞培養及びトランスフエクシヨン
細胞 （HeLa 細胞等） は、 10% ゥシ胎仔血清及び 1% 抗菌-抗真菌剤 （Life Technologies, Inc.又は Invitrogen) を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) を用いて、 5%C02中 37°Cで培養した。 プロテアソ一ムによるタンパ ク質代謝回転の調節を測定するため、所定の濃度の MG132又は同じ容量の DMSO 溶媒を所定時間細胞に添加し、 その後細胞を回収した。 in oでのタンパク質の 半減期を検討するため、 細胞を 10pg/mlのシクロへキシミ ド （Wako) と共に所定 時間ィンキュベートした。標準リン酸カルシウム沈殿法を用いて 293T細胞をトラ ンスフェク トした。 各々のトランスフエクシヨンに関して、 親 pcDNA3ベクター を添加することによって全プラスミ ド DNA量を調整した。紫外線照射試験につい ては、細胞を PBSで洗浄し、所定の線量、例えば 35J/m2の紫外線（254nm； UVP Inc, Upland, CA) で照射して、'新鮮培地中で種々の時間 （例えば 3時間） 増殖さ せた。細胞生存率は.、位相差顕微鏡検査法又はトリパンブルー排除測定法のいずれ かによつて分析した。 . 細胞同調 .
, . 細胞同調は double thymidine block法により実施した。
非同期的な HeLa細胞を 2mMのチミジン存在下で 18時間、 チミジン除去培地で 9哼間培養後、 2mMチミジン存在下で 17.時間培養した。 その後、 細胞を新鮮培 地に移し、 所定時間に細胞回収を行なった。 細胞を Propidium iodideで染色し、 細胞周期の進行を FACSCalibur (Becton Dickinson)を用いた Flow cytometryを 用いモニターした。 . ' 抗体
市販の HA(12CA5, Boehringer, Mannheim)、 Myc (9E10, BabCo)、 FLAG (M2, Sigma)、 a -及び j3 'チューブリン （DMIA+BMIB, Neomarkers)、 並びに HERC2 (BD Bioscience)に対するマウスモノクローナル抗体、 BRCA1 (C20または s 642, Santa Cruz) , p53 (CeU Signaling Technology) 及び HERC2 (BD Bioscience) に対+るゥサギポリクローナル抗体、 並びに BRCA1 のブロッキングぺプチド (sc-642P, Santa Cruz)を購入した。 siRNA
SMART pool (登録商標） HERC2 siRNA 混合物及び対照 siRNA 混合物は Dharmacon Research, Inc.から購入した。 二本鎖 RNA (最終濃度 ΙΟΟηΜ) は、 Oligofectamine (登録商標） （Invitrogen) を用いて、 使用説明書に従って細胞に トランスフエクトした。 免疫沈降法及び免疫プロッティング
煮沸 1% SDS含有緩衝液を用いた in vivoでのュビキチン化基質の検出は、公知 の免疫沈降法及び免疫ブロッテイングにより行なつた 19、 3()。
0.5% NP-40を加えた溶解緩衝液 （50mM Tris-HCl pH7.5、 150mM NaCl、 0.5% Nonidet P'40、 50mM Nat\ ImM ジチォスレイ トール（DTT)、 ImM NaV03、 ImM PMSFおよびプロティンインヒビター混合液） を用いて細胞を溶解し、 4°C で 30分間回転混合させ、 その後、 16,000gで 4°C、 10分間遠心分離した。 上清を 細胞溶解液として回収し、 免疫沈降と免疫ブロッティングに使用した。
, , BRCA1複合体の免疫沈降のために、 細胞溶解液を抗 BRCA1抗体と 4°Cで 1時 間反応させ、 その後、 ProteinAと Gセファロ一ス （Invitrogen) を用いて 4°Cで 1曰寺間沈降反応を行った。 沈降物は 0.5% NP-40緩衝液で 3回洗浄を行い、 SDS サンプル緩衝液 （50mM Tris-HCl pH6.8、 0.2% ブロモフエノールブルー、 10% グリセロール、 2% SDS、 及び lOOmM DTT) に再懸濁し、 3分間煮沸した。 ぺプ チド競合コントローノレとして、 等量'のブロッキングぺプチドを加えた。
HERC2 の検出は、 電気泳動によって 3〜8°/。の NuPAGE (登録商標） ゲル (Inyitrogen) 内でサンプルを分離後、 使用説明書に従い XCell II (商標） Blot Module (Invitrogen) を用いュトロセルロース膜に転写して行った。 BRCA1と α -、 /3 -チューブリンの検出は、 7.5% SDS-ポリアクリルアミ ドゲルでサンプルを分 離し、 Semi.dry ュニッ ト (Amersha.ni Biosciences) を用レ、二トロセノレロー ス膜に転写して行った。 . 1
それぞれのタンパク質を転写した膜は、 所定の抗体を用いてインキュベートし、 ECLゥエスタンブロッテイング検出システム （Amersham Biosciences) により現 像し、 Fuji LAS-3000CCDカメラで映像化した。 間接免疫細胞化学
細胞を 4%ホルマリンで 15分間固定し、 0.2% トリ トン X-100で 5分間透過処 理した。 細胞をリン酸緩衝生理食塩水 （PBS) で洗い、 PBS中 0.5% BSAでブロ ックして、所定の抗体で染色した。 一次抗体は、 ブロッキング緩衝液を用いて以下 の濃度で希釈した。 ,一 抗 HERC2抗体： lpg/ml
饥 Myc f几体： 2pg/ml
抗 BRCA1抗体： 2pg/ml
FITC又はローダミン結合二次抗体（Jackson Immunoresearch) は 1:50希釈で 使用した。 核は 0.5μ TO-PRO-3 (Molecular Probe) で対比染色した。 次に細胞 を蛍光封入剤 (BioLad) で封入し、 共焦点レーザー走査型顕微鏡 (LSM510, Carl Zeiss) で検査した。
,実施例 1
BRCA1と相互作用するタンパク質としての HERC2の同定
BRCA1の安定性に影響を及ぼすタンパク質を探索するため、 本発明者らは、 ナ ノスケールキヤビラ リ一液体クロマ トグラフィ——タンデム質量分析 (LC/MS/MS) によって、プロテアクーム阻害剤である MG132で処理した細胞か ら得た BRCA1免疫複合体を分析し'た。 同定されたタンパク質のうち： HERC2は Mowseスコア 8Qであり、 10種類のぺプチドが最も高レ、可能性を示した。
この 10種類のペプチドを以下に示す （図 1A)。 ' .
1. 352-375： DAPHSEGDMHLLSGPLSPNESFLR (配列番号 6 )
2. 602-636： GLKVIDVACGSGDAQTLAVTENGQVWSWGDGDYGK (配列番 号 7 ) .
3. 1699 1725： LIPEQIDIGEPLTDCLKDVDLIPPFNR (配列 号 8 )
4. 1820-1849： LIGPSCDNVEEDMNASAQGASATVLEETRK (配列番号 9 )
5. 2305-2322： QAFAGQVDLDLLRCQQLK (配列番号 1 0 )
6. 2600-2614： DGLHDLNVQCDWQQK (配列番号 1 1 )
7. 3394-3410： QQALSHILTALQIMYAR (配列番号 1 2 )
8. 4224-4238： GDYHRLGHGSDDHVK (配列番号 1 3 )
9. 4239-4249： RPRQVQGLQGK (配列番号 1 4 )
10. 4516-4534： DCYLLSPAARAPVHSSMFR (配列番号 1 5 )
HERC2はその C末端に HECT ドメインを有するため、本発明者らは、 HERC2 が BRCAl の分解に関与するュビキチンリガ一ゼであろうという仮説を立て、 . HERC2に焦点を合わせてさらに分析を行なった。
in vivoでの HERC2と BRCA1との相互作用は、 一過性トランスフエクシヨン とそれに続く免疫沈降（IP) -ウェスタン.分析によって確認した。 HERC2は、 4834 アミノ酸から成る、極めて大型のタンパク質である（図 1A)。そこで本発明者らは、 HECT ドメインを保持する HERC2 の C 末端フラグメント領域 （4254-4834) (HERC2-CT) 力 S BRCA1 の結合と分解の役割を担うという仮定の下に、 HERC2-CT をク ロー ニ ングした。 293T 細胞を FLAG-BRCA1 及び Myc-HERC2-CTでコトランスフエタ トし、 Myc_HEiRC2-CTを FLAG BRCA1と 共沈させた （図 1B、 レーン 5)。 FLAG-BRCA1は抗 Myc:HERC2-CT免疫沈降物 において検出された （レーン 8)。 この結果は、 HERC2の C末端が BRCA1と相 互作用することを示すものである。 実施例 2. '
HERC2による. BRCA1の ώ oでの不安定化
本発明者らは、 HERC2-CTの共発現時に BRCA1発現が劇的に低下することを 見出した （図 1B、 レーン 2及び 5)。 そこで本発明者らは、 HERC2が ώ vivoで BRCAlを不安定ィヒするかどうかを分析した。 . '
BRCA1の定常状態レベルおよびタンパク質半減期を、 Myc-HERC2-CT共発現 の存在下および不在下で.検討した。 FLAG-BRCA1 (図 2A) 及び^)因性 BRCA1 (図 ^Β) の定常状態レベルは、 HERC2-CTの共発現時に用量依存的に低下した。 細胞をシクロへキシミドにより処理した場合も、 in oでの BRCAlタンパク質 半減期が HERC2-CTによって低下することが示された（図 2C)。 さらに、 HERC2 siRNAを導入したときは内因性 BRCA1タンパク質のレベルが上昇した（図 2D)。 以上より、 HERC2は in vivoで BRCAlを不安定化することが判明した。 これら の結果は、 HERC2の発現を抑制すると BRCA1が活性化して癌を抑制できること を示すものである。 実施例 3 ,― HERC2を介した BRCA1の分解に対チるュビキチンリガーゼ活性の潜在的関与 HERC2-CTは HECT ドメインを含むため、 本発明者らは、 BRCA1タンパク質 分解がこのモチーフのュビキチンリガ一ゼ活性によるものであろうと推測した。こ の可能性を調べるため、 293Τ細胞に野生型 HERC2-CT又は C4352Aのいずれか をトランスフエクトした。 C4352Aは、 HERC2のアミノ酸配列のうち第 4352番 目のシスティンをァラニンに変異させた変異体であり、 Ε2が HECTモチーフに結 合するのを妨げるが、 BRCA1との相互作用は妨げないという特 i [を有する。
内因性 BRCA1発現レベルに関し、野生型 HERC2-CT又は C4352Aの作用を検 ,討した。 その結果、 野生型 HERC2-CT は BRCA1 発現を低下させたのに対し、 C4352A変異体は低下させなかった （図 3A)。 このことから、 本発明者らは次に、 HERC2により BRCA1が in vivoでュビキチン化されることを確認することとし た。 · . ■ . '
293T細胞に FLAQ-BRCA1 (1-772)、 Myc-HERC2-CT及び HA-ュビキチシを、 コトランスフエタ トし 。 BRCA1自体は、 in w oにおいてわずかではあるが自己 ュビキチン化された量として明確に分かる （図 3B'、 ーン 1)。 この自己ュビキチ ■ ン化は、おそらく内因性 BAED1との相互作用から生じると考えられる。興味深い ことに、 BRCA1のュビキチン化は My HERC2の共発現によって劇的に低下レ たが （図 3B、 レーン 2)、 MG132 によって回復した （図 3B、 レーン 3)。 BRCA1 BARD1によって触媒される自己ュビキチン化はュビキチンの Lys6を通' して結びづぃており、プロテアソーム阻害剤、例えば MG132又は LLnLの添加に よって ώ w oで増強されることはない19。 したがって、 Myc-HERC2-CTの共発 現及び MG132への暴露時に検出されるュビキチン化は、 Lys6関連のュビキチン 化ではないと考えられる。 むしろ、 HERC2がプロテアソ一ム分 のためのシグナ ルとして BRCA1のポリュビキチン化を媒介することを示唆する。 実施例 4
HERC2-CT発現による BRCA1の細胞質局在化の誘導
BRCA1は核と細胞質との間を往復する力 分裂間期の間は主として核に局在す 「る。 他方で、 本発明者らは、 HERC2は細胞質に優勢的に局在することを確認した (図 4A) P トランスフエクトしだ HERC2-CTも細胞質に局在する（図 4B及び C)。 トランスフエクトした HERC2-CTは BRCA1と相互作用するため、本発明者らは、 HERC2.-CTが BRCA1の局在化に影響を及ぼし得ると推測した。 そこで本発明者 らはこの可能性を検討するため、 293T細胞において HERC2-CTを一過性発現さ せ、 その後免疫蛍光顕微鏡検査によって BRCA1の局在化を分析した。 .
その結果、親 pcDNAベクタ一でトランスフエクトしたほとんど全ての細胞は核 内 BRCA1を有していたのに対し （図 4B、 下パネル）、 HERC2-CTを過剰発現す ,る'細胞は BRCA1が核と細胞質の両方に存在するこ'とが示された （図 4B、 上パネ ルに見られる 6細胞)。 これらの結果は、 HERC2-CT力 BRCA1の核外輸送シグ ナルを増強し得ることを示すものである。 あるいは、 . HERC2 CTは BRCA1の核 内輸送シグナルを抑えると考えられる。
ここで、 BRCA1局在の変化は、 BRCA1'に対する直接的作用によるものではな. く、一般的輸送機構、例えばインポ チンノエクスポーチン活性の排除の結果生じ た可能^ tが考えられる。そこで本発明者らは、公知のインポーチン Zェクスポーチ ン調節性細胞タンパク質である p53に対する'11£11〇2-011の作用を検討した。
その結果、 HERC2-CTの発現は p53の細胞局在化に影響を及ぼさなかった （図 4C)。 よって、 本発明者らは、 BRCA1の HERC2-CT依存性細 質局在化は一般 的輸送機構の欠陥によって引き起こされたものではないと結論づけた。
. ' '
■ 実施例 5 . .
紫外線照射後の BRCA1の HERC2依存性ダゥンレギュレーション
本発明者らは次に、 BRCA1の HERC2媒介性ダウンレギュレ一ションが生理的 影響を及ぼすかどうかを検討した。細胞が DNA損傷を受けた後に BRCA1の発現 が低下することは広く確認されている。 この低下は、 主として BRCA1の p53依 存性転写抑制によるものである 16'17。 し力 し、 BRCA1タンパク質の分解も、 観察 される低下に寄与することが提案されてきた16 ·18。 これまでの報告では、 ρ53依存 性の BRCA1分解が示されている力 本実施例では、 T47D又は HeLa細胞などの p53の機能が失われている細胞においても、 DNA損傷後に BRCA1タンパク質レ ベルがダウンレギユレ一卜されることを確認した （図 5A及び B)。 このダウンレ ギュレ一シヨンは、プロテアソーム阻害剤である MG132によって ¾えられること 力 ら、'プロテアソームによる分解は、部分的に BRCA1が低下する原因であること が示唆された （図 5A)：。 '
興味深いことに、 本発明者らは、 紫外線照射後に HERC2 が劇的にアップレギ ユレ一トされることを確認した（図 5B)。これらの所見から、本発明者らは、 HERC2 が紫外線誘導性 BRCA1分解に関与するかどうカゝを検討することにした。
siRNAを用いて、' HeLa細胞から HERC2の発現を失わせ、 48時間後、 細胞に ,紫外線 （35J/m2) を照射し、 その後いくつかの時点で細胞を回収した。 siRNAを トランスフエク トした細胞では、 HERC2の発現を沈黙化することに成功した （図 5B、 上のパネル、 レーン 5から 8)。 対照細胞では、 紫外線照射の 3から 6'時間後 に HERC2がアップレギユレ 卜され (レーン 3及び 4)、 それに伴い BRCA1の抑 制が確認された （中央のパネル、 レーン 1から 4)。 重要な点どして、 HERC2の 発現が抑制された細胞では、紫外線照射後に BRCA1発現は変化しなかった （レー ， ン 5から 8)。 これらの結果は、 BRCA1が紫外線照射後に HERC2依存的に分解 されることを強ぐ示唆するもので る。 ■ . . 実施例 6 .
HERC2ノックダウンによる、 紫外線による DNA損^!に対する細胞の非感受性 ィ匕 ί
BRCA1が欠損すると、 細胞は DNA損傷に対して過敏性になることは広く知ら れている 2ο·22。 HERC2は、 細胞に紫外線を照射した後に BRCA1のダウンレギュ レーシヨンを誘導する。 このため、 HERC2のノックダウンは紫外線非感受性とレ、 う逆の表現型を生じさせ得る可能性がある。 この可能性を調べるため、本発明者ら は、 HERC2の除去が紫外線照射後の細胞生存率に影響を及ぼすかどうかを検討し た。
HeLa細胞に HERC2特異的 siRNAをトランスフエク トし、紫外線を照射した。 照射の 24時間後にトリパンブル一排除法によって細胞生存率を測定した。 50J/m2 の紫外線照射後の HERC2ノックダゥン細胞の細胞生存率は、 0時間目で未処置細 胞の約 28%であったのに対し、 対照細胞の生存率は約 8.5%であった。 図 5 Cは、 紫外線照射 （50J/m2) 後 24時間目に位相差顕微鏡検査によって観察した細胞につ いての'代表的データを示す。 このように、 HERC2が欠損すると、 細胞は紫外線照 射に対して抵抗性になることが判明した。 実施例 7.
細胞周期に依存した BRCA1と HERC2の発現の検出
本実施例では、 BRCA1と HERC2の相互作用が細胞周期に依存して起こるのか ,否かの検討を行った。 Thymidine double blocking ¾を用い、 細胞周期を同調させ (図 6A)、 所定時間毎に細胞を回収し、 免疫沈降法により BRCA1 と HERC2の 相 S作用の検出を試みた (図 6B)。 ■
抗 BRCA1抗体で免疫沈降を行レ、、抗 tiERC2抗体（図 6B最上段)及び抗 BRCA1 抗体 （図 6B第 2段） により検出を行った結果、 細胞回収後、 G2-M期に相当する と考えられる 2-4時間で HERC2がピークとなり、同時間では BRCA1のシグナル は減弱した。
また、全細胞溶解液中の HERC2及び BRCA1量の変化について、免疫沈降を行 わず、免疫ブロッテイングを用い検討した結果、 HERC2のタンパク量の変化は殆 ど見られないものの、 BRCA1の減少が確認された。 こめ結果は、 細胞周期に依存 した HERC2-BRCA1の相互作用と、 その結果生じる、 HERC2による BRCA1の 分解を示唆する。 . ! 実施例 8
UV照射による HERC2と BRCA1の相互作用の変化
本実施例では、 BRCA1と HERC2の相互作用は UV照射によって変化するか否 かを検討した （図 7)。
上記 UV照射実験の手法で、 一定時間 UV照射後、 抗 BRCA1抗体を用い免疫 沈降を行った後、 抗 HERC2抗体により BRCA1と HERC2の相互作用 （図 7上 段） を、 及び、 コントロールとして抗 BRCA1抗体による BRCA1 の検出 （図 7 下段） を行った。 その結果、 UV.照射後の細胞では、 BRGA1タンパク質の増加及び、 BRCA1 と HERC2との相互作用の減少が確認された。 考察 .
BRCA1は腫瘍進行経路におけるハブタンパク質 して働き、 このキー遺伝子の 生殖細胞系突然変異により、 乳癌の生涯危険度が約 80%となる 23。 したがって、 他の機構による BRCA1タンパク質のダウンレギユレーションが、散発性乳癌を引 き起こし得ることが提唱された24、25。 .
, , '本明細書に提示する結果は、 HERC2力 DNA損傷に応答して BRCA1の細胞 局在化及び安定性を調節することによって、 BRCA1タンパク質をダウンレギユレ ートするという機構に関与し得ることを示すものである。この機構の生物学的重要 性の 1つの可能性と.しては； HERC2 が核外輸送とリンクした機構において BRCA1の分解を誘導し得ることが考えられる。 BRCA1及び BARD1の細胞質八 の核外輸送がそれらの分解を引き起こすことを明らかにする報告は、この概念を裏 付ける 26。 本発明者らのデータは、 HERC2ノックダウンにより BRCA1を安定ィ匕 させると、紫外線による DNA損傷に対して抵抗性を有する細胞を生じることを示 す。. これは、 HERC2と BRCA1の相互バランスが細胞の生存率を左右することを 示唆する。 HERC2をノックダゥンすることにより、 細胞が、 DNA損傷誘 W性細胞死から ' 救済 έれることを示すデータは、 HERC2が腫瘍抑制因子であると考えることがで きる。し力 し、 HERC2は BRCA1という腫瘍抑制因子を阻害すること力 ら、 HERC2 は癌遺伝子であると考えるほうがより妥当である。 あるいは、 BRCA1と HERC2 はハゥスキーパーの腫瘍抑制因子として協同すると考えられる。 ェチルニトロソ尿素 （ENU) 突然変異誘発分析により、 HERC2 がこれまでに 研究された中で最も易変性のマウス遺伝子座であることが示唆されたことは言及 に値する27。 HERC2巨大複製領域 （duplicon) は、 高い突然変異率を有する偽遺 伝子とみなされているにもかかわらず、 転写される。 一部の 突然変異体は、 ィ ンタク 卜な HECTドメインを有する HERC2タンパク質を含む;^、野生型 HERC2 タンパク質アミノ酸配列のうち第 3716番から第 3768 番までの 53 アミノ酸 (3716-3768) を欠損している。 参考文献
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配列番号 4 ：合成 DNA
配列番号 5 ：合成 DNA

Claims

請求 の 範 囲
I . 細胞内における HERC2 の発現を抑制することを特徴とする、 腫瘍を抑制す る方法。
2 .細胞内にぉレ、て HERC2と BRCA1との相互作用を阻害することを特徴とする、 腫瘍を抑制する方法。
3 . HERC2の発現の抑制が、 HERC2遺伝子に対する siRNAである請求項 1に 記載の方法。.
,
4 . HERC2と BRCA1との相互作用の阻害が、 HERC2遺伝子に対する siRNA、 HERC2に対するアンタゴニスト及び HERC2に対する抗体からなる群から選 尺される少なくとも 1つによるものである請求項 2に記載の方法。
5 . 候補物質の存在下で細胞内の HERC2 の発現量を測定し、 得られる測定結果 を指標として抗肆瘍活性を有する物質を選択することを特徴とする、 抗腫瘍剤 のスクリーニング方法。 '
6 .候補物質の存在下で HERC2と BRCA1との相互作用を測定し、得られる測定 結果を指標として抗腫瘍活性を有する物質を選択することを特徴とする、 抗腫 瘍剤のスクリーニング方法。
7 . 細胞内における HERC2の発現を抑制する物質を含む抗月重瘍剤。
8 . HERC2の発現を抑制する物質が、 HERC2遺伝子に対する siRNAである請 求項 7に記載の抗腫瘍剤。 ！
9 . 細胞内において HERC2と BRCA1との相互作用を阻害する物質を含む、抗腫 瘍剤
1 0 . HERC2と BRCA1との相互作用を阻害する物質が、 HERC2遺伝子に対す る siRNA、 HERC2に対するアンタゴニスト及び HERC2に対する抗体からな る群から選択される少なくとも 1つである請求項 9に記載の抗月 fil¾。
I I . 生体内における HERC2 の発現を抑制することを特徴とする、 腫瘍の治療 方法。
1 2 .生体内において HERC2と BRCA1との相互作用を阻害することを特徴とす る、 腫瘍の治療方法。
3 . 腫瘍を治療する医薬を製造するための、 細胞内における HERC2 の発現を 抑制する物質の使用。
4. '腫瘍を治療する医薬を製造するための、 細胞内において HERC2と BRCA1 との相互作用を阻害する物質の使用。
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