JPWO2007069795A1

JPWO2007069795A1 - 腫瘍の抑制方法

Info

Publication number: JPWO2007069795A1
Application number: JP2007550271A
Authority: JP
Inventors: 智彦太田; 佐藤　工; 工佐藤
Original assignee: St Marianna University School of Medicine
Current assignee: St Marianna University School of Medicine
Priority date: 2005-12-16
Filing date: 2006-12-18
Publication date: 2009-05-28
Also published as: US20100113557A1; WO2007069795A1

Abstract

本発明は、ＨＥＲＣ２発現を抑制することを含む、腫瘍を阻止する方法を提供する。本発明の１つの実施形態では、ＨＥＲＣ２の抑制はＨＥＲＣ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡによって行われ、それによってＨＥＲＣ２がＢＲＣＡ１に相互作用する機能が失われ、ＢＲＣＡ１の活性が維持され又は増加して抗腫瘍活性が誘導される。

Description

本発明は、ＨＥＲＣ２発現を抑制することを含む、腫瘍を抑制する方法に関する。さらに、本発明は、ＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１の結合を阻害することを含む、細胞又は組織において腫瘍を抑制する方法及び抗腫瘍活性を誘導する方法に関する。

ＨＥＲＣ２（ｈｅｃｔｄｏｍａｉｎａｎｄＲＣＣ−ｌｉｋｅｄｏｍａｉｎ２）は、ヒトの第１５番染色体長腕（バンド１５ｑ１１及び１５ｑ１３）上に存在する欠失切断点のホットスポットに認められる遺伝子であり、プラーダー・ウィリ／エンジェルマン（Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ／Ａｎｇｅｌｍａｎ）症候群（ＰＷＳ／ＡＳ）^１−５に関与する。この染色体領域におけるＨＥＲＣ２の重複は、精子形成の際に相同的組換えのエラーの発生率を上昇させる決定的な要因であると考えられる。また、ＨＥＲＣ２の重複によって４−Ｍｂの染色体領域に欠失が生じ、この欠失によりＥ６−ＡＰ（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓＥ６−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子であるＵＢＥ３Ａを含むいくつかの遺伝子が排除される。ＰＷＳに対して保護する役割を担う母系対立遺伝子は、ゲノムインプリンティングとして知られる過程で卵形成又は早期胚発生の間に沈黙化するため、父系染色体内に上記欠失が存在するだけでＰＷＳが引き起こされる。一部のＰＷＳ患者ではＨＥＲＣ２が変異しているが、ＨＥＲＣ２突然変異自体がＰＷＳの根底にあるのではない。なぜならばＨＥＲＣ２遺伝子はゲノムインプリンティングを受けず、母系ＨＥＲＣ２対立遺伝子の発現のみでＰＷＳの症状を回避するのに十分であると考えられているからである^６。
それにもかかわらず、この遺伝子のホモ接合突然変異はマウスにおいて多種多様な表現型を生じさせる^１。例えば、ＰＷＳの症状に類似した表現型として、ｒｊｓ（ｒｅｎｔｙ
ｊｅｒｋｅｙｓｔｅｒｉｌｅ）及びｊｄｆ２（ｊｕｖｅｎｉｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｆｅｒｔｉｌｉｔｙ^８）が知られている。雄性の表現型として、生殖不能、精巣形成不全、精子形成異常及び精子形態異常が含まれ、雌性の表現型として、子宮の小型化、及び卵胞は発育過多となるが黄体又は血体（ｃｏｒｐｏｒａｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃａ）はほとんど形成されない卵巣が含まれる。
ＨＥＲＣ２遺伝子は、９３エクソンから構成され、４８３４アミノ酸からなる５２８ｋＤａの巨大タンパク質をコードする^１，２。
ＨＥＲＣ２遺伝子（ＡＦ０７１１７２）の塩基配列（配列番号１）及び該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列（配列番号２）は進化的に高度に保存されており、ヒトとショウジョウバエのＨＥＲＣ２は、カルボキシ末端側の７４３アミノ酸にわたって７０％の相同性を有している^３。この相同性は、ＨＥＲＣ２遺伝子が重要な細胞機能を有することを示唆するものである。ＨＥＲＣ２は、３つのＲＬＤ（ＲＣＣ様ドメイン）、ＤＯＣドメイン、Ｍ−Ｈドメイン、シトクロムｂ５様領域、ＺＺ型ジンクフィンガー及びＣ末端ＨＥＣＴドメインを含む多数の機能性ドメインを有する。本発明者らは、これらのドメイン構造に基づき、ＨＥＲＣ２がタンパク質の輸送及びユビキチンを介した分解に関与すると推測している。
乳癌及び卵巣癌の抑制因子であるＢＲＣＡ１は、腫瘍進行を予防する多くの細胞経路と関連付けがなされてきた。例えば、ＢＲＣＡ１欠損細胞はゲノム不安定性を示すが、このゲノム不安定性はＢＲＣＡ１の機能不全から生じると考えられる^９−１１。ゲノム不安定性は、ＤＮＡ損傷修復能の低下、転写調節機構の低下、アポトーシス誘導、Ｓ期中又はＧ２−Ｍチェックポイント機能の低下、及び中心体の複製の調節低下などを引き起こす。ＢＲＣＡ１は、遺伝毒性ストレス後に、ＡＴＭ／ＡＴＲファミリーのキナーゼによってリン酸化される^{１２−１３}。その後、リン酸化−ＢＲＣＡ１は、ＤＮＡ修復タンパク質、例えばＲａｄ５１又はＲａｄ５０−Ｍｒｅ１１−Ｎｂｓ１と結合して協同することにより、ＤＮＡ損傷部位の相同組換え修復をする^{１４、１５}。他方で、ＢＲＣＡ１の発現は、ＤＮＡ損傷応答の後期にダウンレギュレートされる^{１６−１７}。このダウンレギュレーションの役割を担う１つの主要機構は、ｐ５３を介した転写抑制である^１６。
しかし、ｐ５３非依存性かつプロテアソーム依存性のタンパク質分解も、ＤＮＡ損傷によって誘導されるＢＲＣＡ１のダウンレギュレーションに関与する^１８。このダウンレギュレーションをもたらすメカニズムは、現在のところ明らかではない。

本発明は、腫瘍増殖を抑制する方法を提供することを目的とする。本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、細胞におけるＨＥＲＣ２の発現を抑制することによって腫瘍の増殖を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）細胞内におけるＨＥＲＣ２の発現を抑制することを特徴とする、腫瘍を抑制する方法。
本発明の方法において、ＨＥＲＣ２の発現の抑制は、例えばＨＥＲＣ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡにより行なうことができる。
（２）細胞内においてＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を阻害することを特徴とする、腫瘍を抑制する方法。
ＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用の阻害は、例えばＨＥＲＣ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ＨＥＲＣ２阻害剤及びＨＥＲＣ２に対する抗体からなる群から選択される少なくとも１つにより行なうことができる。
（３）候補物質の存在下で細胞内のＨＥＲＣ２の発現量を測定し、得られる測定結果を指標として抗腫瘍活性を有する物質を選択することを特徴とする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。
（４）候補物質の存在下でＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を測定し、得られる測定結果を指標として抗腫瘍活性を有する物質を選択することを特徴とする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。
（５）細胞内におけるＨＥＲＣ２の発現を抑制する物質を含む抗腫瘍剤。
ＨＥＲＣ２の発現を抑制する物質としては、例えばＨＥＲＣ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡが挙げられる。
（６）細胞内においてＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を阻害する物質を含む、抗腫瘍剤。
ＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を阻害する物質としては、例えばＨＥＲＣ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ＨＥＲＣ２阻害剤及びＨＥＲＣ２に対する抗体からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
（７）生体内におけるＨＥＲＣ２の発現を抑制することを特徴とする、腫瘍の治療方法。（８）生体内においてＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を阻害することを特徴とする、腫瘍の治療方法。
（９）腫瘍を治療する医薬を製造するための、細胞内におけるＨＥＲＣ２の発現を抑制する物質の使用。
（１０）腫瘍を治療する医薬を製造するための、細胞内においてＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を阻害する物質の使用。
本発明により、ＨＥＲＣ２タンパク質の機能が初めて示された。すなわち、ＨＥＲＣ２は、ＢＲＣＡ１と機能的に相互作用してＢＲＣＡ１の安定性を調節し、ＢＲＣＡ１の細胞局在を調節することが分かった。そして、ＨＥＲＣ２はＤＮＡ損傷に応答するタンパク質であるため、ＤＮＡ損傷が誘導されると、ＢＲＣＡ１タンパク質が抑制されることが見出された。このような結果は、ＤＮＡ損傷後にＢＲＣＡ１タンパク質分解が起こることを裏付けるメカニズムが明らかにされたことを示すものであり、このメカニズムは、細胞の運命を決定するために重要であると言える。ＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との機能的相互作用は、乳癌及び卵巣癌とプラーダー・ウィリ／エンジェルマン症候群が、分子生物学的な背景において結びついていることを意味する。すなわち、プラーダー・ウィリ／エンジェルマン症候群は、ＨＥＲＣ２の構造中に含まれるＵＢＥ３Ａ（ユビキチンリガーゼＥ３）の欠失により、ユビキチンを介したタンパク質分解が抑制されることが原因の一つと考えられる。一方、乳癌及び卵巣癌に関与すると考えられるＢＲＣＡ１タンパク質のダウンレギュレーションは、本発明においてＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１とが相互作用することが見出され、このダウンレギュレーションはｐ５３を介さないことが示された。したがって、ＰＷＳ／ＡＳは、ＨＥＲＣ２の構造中のＵＢＥ３Ａが関与することが考えられる。

図１は、ＨＥＲＣ２が質量分析スクリーニングによってＢＲＣＡ１免疫複合体中のタンパク質として同定されたことを示す図である。
Ａ：予測されたＨＥＲＣ２タンパク質とその予想機能性ドメインを、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって同定された１０個のペプチドの位置と共に示す図である。この試験で使用したＨＥＲＣ２−ＣＴ（４２５４−４８３４）の位置も合わせて示す。
Ｂ：トランスフェクトしたＨＥＲＣ２−ＣＴがＢＲＣＡ１と相互作用することを示す図である。２９３Ｔ細胞に所定のプラスミドをトランスフェクトした。全細胞溶解産物（レーン１から３）又は抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降物（レーン４から６）及び抗Ｍｙｃ抗体を用いた免疫沈降物（レーン７−９）を、所定の抗体による免疫ブロッティングに供した。ＩＰ：免疫沈降物、ＩＢ：免疫ブロッティング。
図２は、ＢＲＣＡ１はｉｎｖｉｖｏでＨＥＲＣ２によって不安定化されることを示す図である。
Ａ：ｐ１００プレート中の２９３Ｔ細胞に、ＦＬＡＧ−ＢＲＣＡ１（１−７７２）をコードするプラスミド（レーン１−４、１０μｇ）及び漸増量のＭｙｃ−ＨＥＲＣ２−ＣＴ（レーン２、１μｇ；レーン３、２μｇ；レーン４、５μｇ）をトランスフェクトした。親ｐｃＤＮＡ３ベクターを添加することによって全プラスミドＤＮＡ量をプレート当り１５μｇに調整した。各々のタンパク質の定常状態レベルを、抗ＦＬＡＧ抗体、抗Ｍｙｃ抗体又は抗チューブリン抗体を用いた免疫ブロッティングによって分析した。
Ｂ：ＦＬＡＧ−ＢＲＣＡ１の代わりに内因性ＢＲＣＡ１を分析したことを除いて、各々のタンパク質の定常状態レベルを（Ａ）と同様に分析した結果を示す図である。
Ｃ：２９３Ｔ細胞に、ＦＬＡＧ−ＢＲＣＡ１^{１−７７２}をコードするプラスミド及び親ｐｃＤＮＡ３ベクター又はＭｙｃ−ＨＥＲＣ２−ＣＴのいずれかをトランスフェクトした。細胞をシクロヘキシミド（１０μＭ）と共にインキュベートし、所定の時間追跡した。次に細胞溶解産物を抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。
Ｄ：ＨｅＬａ細胞に、ＨＥＲＣ２に特異的なｓｉＲＮＡ（レーン１）又は対照ｓｉＲＮＡ（レーン２）をトランスフェクトした。細胞溶解産物を、３−８％勾配（上と中央のパネル）又は７．５％（下のパネル）ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、次いで所定の抗体による免疫ブロッティングによって分析した。
図３は、ＢＲＣＡ１の分解におけるＨＥＲＣ２ユビキチンリガーゼ活性の潜在的関与を示す図である。
Ａ：２９３Ｔ細胞に、野生型（レーン２）又はＭｙｃ−ＨＥＲＣ２−ＣＴのＣ４３５２Ａ突然変異体のいずれかを発現するプラスミドをトランスフェクトした。全細胞溶解産物を所定の抗体による免疫ブロッティングに供した。
Ｂ：所定のプラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、１０μＭのＭＧ１３２（レーン３）又はＤＭＳＯ溶媒（レーン１及び２）で１４時間処理し、１％ＳＤＳ溶解緩衝液中で煮沸して、０．１％ＳＤＳに希釈し、抗ＦＬＡＧ抗体架橋ビーズで免疫沈降させた。ＦＬＡＧ−ＲＰＢ８をＦＬＡＧペプチドで溶出し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、次いで抗ＨＡ抗体による免疫ブロッティングによって分析した。
図４は、ＨＥＲＣ２−ＣＴの過剰発現により、ＢＲＣＡ１の細胞質局在が生じることを示す図である。
Ａ：増殖中のＨｅＬａ細胞を３％ホルマリンで固定し、所定の抗体を加え、次いでＦＩＴＣ（グリーン）又はローダミン（レッド）結合二次抗体で染色した。核はＴＯ−ＰＲＯ−３で染色した。Ｍｅｒｇｅは、２つのタンパク質の画像を重ね合わせたものを示す。
ＢおよびＣ：２９３Ｔ細胞にＭｙｃ−ＨＥＲＣ２−ＣＴ又は親ｐｃＤＮＡベクターのいずれかをトランスフェクトし、（Ａ）に記載された所定の抗体で染色した結果を示す図である。
図５は、ＤＮＡ損傷後のＢＲＣＡ１の分解がＨＥＲＣ２のノックダウンによって回復されることを示す図である。
Ａ：Ｔ４７Ｄ細胞を、ＭＧ１３２（５０μＭ）の存在下又は非存在下で、所定時間エピルビシン（０．２μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。全細胞溶解産物を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、次いで所定の抗体による免疫ブロッティングによって分析した。
Ｂ：対照ｓｉＲＮＡ（レーン１から４）又はＨＥＲＣ２に特異的なｓｉＲＮＡ（レーン５から８）をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞に紫外線照射し（３５Ｊ／ｍ^２）、照射後所定の時点で回収した。細胞溶解産物を、３−８％勾配（上のパネル）又は７．５％（中央及び下のパネル）ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、次いで図に示された抗ＨＥＲＣ２抗体、抗ＢＲＣＡ１抗体又は抗チューブリン抗体による免疫ブロッティングによって分析した。
Ｃ：ＨｅＬａ細胞に、対照ｓｉＲＮＡ（上のパネル）又はＨＥＲＣ２に特異的なｓｉＲＮＡ（下のパネル）をトランスフェクトした。紫外線照射（５０Ｊ／ｍ^２）の前（左のパネル）又は２４時間後（右のパネル）の細胞生存度を位相差顕微鏡検査法によって観察した。
図６Ａは、細胞周期の同調を示す図である。
図６Ｂ（１、２段）は、抗ＢＲＣＡ１抗体を用いた免疫沈降法の結果を示す図である。
図６Ｂ（３−６段）は、全細胞溶解産物の免疫ブロッティングの結果を示す図である。
図７は、ＵＶ照射によるＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用の変化を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。ここで引用する全ての特許出願、特許、文献及びウェブサイトは、それらの全体が参照としてここに組み込まれる。
１．概要
ＨＥＲＣ２は、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ／Ａｎｇｅｌｍａｎ症候群の欠失切断点のホットスポットに認められる高度に変異しやすい大型遺伝子であり、ヒト染色体長腕１５ｑ１１−ｑ１３上に存在する。この遺伝子が欠損すると、マウスにおける多種多様な表現型、例えばｒｊｓ及びｊｄｆ２が生じることが知られている。
ｒｊｓとは、ｒｕｎｔｙｊｅｒｋｙｓｔｅｒｉｌｅであり発育障害、振戦、無精子症の表現型を有する。一方、ｊｄｆ２はｊｕｖｅｎｉｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｆｅｒｔｉｌｉｔｙであり、発育障害と不妊の表現型を有している。これらの表現型はいずれもＰｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ／Ａｎｇｅｌｍａｎ症候群の症状に類似したものである。
ＨＥＲＣ２はＲＬＤ及びＨＥＣＴドメインを有している（図１Ａ）。このドメインは、それぞれＧＥＦ活性（ＲａｎからＧＤＰを除去し、ＲａｎＧＴＰに交換する活性）をもつＲＣＣ１に類似した配列とユビキチンリガーゼであることから、ＨＥＲＣ２のうちのＲＬＤ及びＨＥＣＴが、それぞれ、タンパク質輸送と分解経路において役割を果たすことが示唆される。しかし、その正確な細胞機能は不明である。
本発明は、ＤＮＡ損傷に応答してＨＥＲＣ２が乳癌及び卵巣癌の抑制因子であるＢＲＣＡ１をダウンレギュレートするという知見に基づき完成されたものであり、ＢＲＣＡ１のダウンレギュレーションが生じないようにＨＥＲＣ２の発現を抑制し、あるいはＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を抑制することで、ＢＲＣＡ１の活性を保持させて腫瘍を抑制することを特徴とする。
本発明において、ＢＲＣＡ１に結合する免疫複合体タンパク質を得るため、質量分析によるスクリーニングを行なった。その結果、ＢＲＣＡ１に特異的に結合するパートナータンパク質としてＨＥＲＣ２が同定された。ＨＥＲＣ２のアミノ酸配列（配列番号２）のうち第４２５４番−４８３４番のアミノ酸配列（配列番号３）からなるフラグメントであって、このフラグメント領域中にＨＥＣＴドメインを含むＣ末端フラグメント（ＨＥＲＣ２−ＣＴという。）を作製してＨＥＲＣ２−ＣＴとＢＲＣＡ１との相互作用を検討した。その結果、ＨＥＲＣ２−ＣＴは、ｉｎｖｉｖｏでＢＲＣＡ１と相互作用し、ＢＲＣＡ１の分解を誘導した。これに対し、ｓｉＲＮＡによりＨＥＲＣ２をノックダウンした場合はＢＲＣＡ１が安定化された。
ＨＥＲＣ２は主として細胞質に局在するが、ＨＥＲＣ２−ＣＴを過剰発現させると、興味深いことにＢＲＣＡ１の細胞質への局在が誘導された。このことから、ＨＥＲＣ２はＢＲＣＡ１を細胞質にトラップすると考られる。
さらに本発明者らは、ＨＥＲＣ２がＤＮＡ損傷応答性タンパク質であり、紫外線照射して３〜６時間後にＨＥＲＣ２の発現が劇的に上昇すること、そして、ＨＥＲＣ２の発現の上昇は、ＢＲＣＡ１タンパク質の退行に伴って起こることを見出した。
さらに、ＨＥＲＣ２をノックダウンすると、ＢＲＣＡ１は正常レベルに回復し、細胞は紫外線照射に対して抵抗性となった。この紫外線抵抗性は、ＢＲＣＡ１が欠損することにより誘導される紫外線過敏性とは対照的である。したがって、このような結果は、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ／Ａｎｇｅｌｍａｎ症候群関連の遺伝子産物であるＨＥＲＣ２に関する細胞機能を規定するものであり、その機能は分子生物学的な背景において乳癌及び卵巣癌に結びついているという概念を提起する。
２．ＨＥＲＣ２の発現阻害及び活性阻害
ＢＲＣＡ１の活性を高めるために、本発明においてはＨＥＲＣ２の発現を阻害する方法が採用される。
ＨＥＲＣ２の発現阻害には、特に限定されるものではないが、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することができる。ＨＥＲＣ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）を設計及び合成し、これを細胞内に導入させることによって、ＲＮＡｉを引き起こすことができる。
ＲＮＡｉとは、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄＲＮＡ）が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象である。例えば、ｄｓＲＮＡを細胞内に導入すると、そのＲＮＡと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。
ｓｉＲＮＡの設計は、以下の通り行なうことができる。
（ａ）ＨＥＲＣ２をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である。例えば、ヒトの場合では、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：ＡＦ０７１１７２（配列番号１）の任意の領域を候補にすることができる。
（ｂ）選択した領域から、ＡＡで始まる配列を選択し、その配列の長さは１９〜２５塩基、好ましくは１９〜２１塩基である。その配列のＧＣ含量は、例えば４０〜６０％となるものを選択するとよい。
ｓｉＲＮＡを細胞に導入するには、ｉｎｖｉｔｒｏで合成したｓｉＲＮＡをプラスミドＤＮＡに連結してこれを細胞に導入する方法、２本のＲＮＡをアニールする方法などを採用することができる。
また、本発明は、ＲＮＡｉ効果をもたらすためにｓｈＲＮＡを使用することもできる。ｓｈＲＮＡとは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。
ｓｈＲＮＡは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を配列Ａとし、配列Ａに対する相補鎖を配列Ｂとすると、配列Ａ、スペーサー、配列Ｂの順になるようにこれらの配列が一本のＲＮＡ鎖に存在するようにし、全体で４５〜６０塩基の長さとなるように設計する。配列Ａは、標的となるＨＥＲＣ２遺伝子（配列番号１）の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Ａの長さは１９〜２５塩基、好ましくは１９〜２１塩基である。
３．ＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用の阻害
本発明は、細胞内においてＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を阻害することを特徴とする、抗腫瘍方法を提供する。
ＢＲＣＡ１との相互作用の阻害は、ＨＥＲＣ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ＨＥＲＣ２阻害剤、ＨＥＲＣ２に対する抗体などを利用することができる。これにより、ＨＥＲＣ２がＢＲＣＡ１に相互作用する機能が失われ、ＢＲＣＡ１の活性が維持され又は増加して抗腫瘍活性が誘導される。
ＨＥＲＣ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、前記の通り設計することができる。
ＨＥＲＣ２阻害剤としては、例えばユビキチン化阻害剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ＨＥＲＣ２に対する抗体は、ＨＥＲＣ２の全部又は一部を認識して認識部位に特異的に結合し、ＨＥＲＣ２の活性を低下又は消失させる免疫グロブリンをいう。抗体の作製法は、当業者に公知である。
４．スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、候補物質の存在下で細胞内のＨＥＲＣ２の発現量を測定し、得られる測定結果を指標として抗腫瘍活性を有する物質を選択することを特徴とする。
また、本発明は、候補物質の存在下でＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を測定し、得られる測定結果を指標として抗腫瘍活性を有する物質を選択することを特徴とする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法を提供する。
候補物質とは、抗腫瘍剤として使用するためにスクリーニングに供される被験物質であり、任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されるものではない。例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物（高分子又は低分子化合物）などが挙げられ、これらのほかに、天然物又は抽出物、例えば発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出液、血漿なども候補物質として使用することができる。これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。また、候補物質は塩を形成していてもよい。候補物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例えば、無機酸や有機酸など）や塩基（例えば、金属酸など）などとの塩が用いられる。さらには、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーは、公知手法を用いて構築することが可能であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
本発明のスクリーニング方法では、候補物質（被験物質）の存在下において、ＨＥＲＣ２の発現、あるいはＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を測定する。例えば、細胞に抗腫瘍剤の候補物質を接触させることにより、細胞内のＨＥＲＣ２の発現量、あるいはＨＥＲＣとＢＲＣＡ１との結合を測定することができる。「接触」とは、細胞と候補物質とを同一の反応系又は培養系に存在させることを意味し、例えば、細胞培養容器に候補物質を添加すること、細胞と候補物質とを混合すること、細胞を候補物質の存在下で培養することなどが含まれる。
ＨＥＲＣ２の発現量の測定方法、及びＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用の測定方法は特に限定されるものではない。上記相互作用それ自体を直接的に測定してもよいし、ＢＲＣＡ１又はＨＥＲＣ２の活性を測定することにより、上記相互作用を間接的に測定することもできる。相互作用の測定方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング、免疫沈降法、プルダウンアッセイ法、ウェスタンブロッティング、ＮＭＲ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ゲルシフトアッセイ、ゲルろ過などが挙げられる。一般的には、同一のアッセイ系を候補物質の非存在下でも行い、候補物質の存在下の場合と非存在下の場合の両者におけるＨＥＲＣ２の発現量又は上記相互作用を測定し、両者を比較することにより、候補物質がＨＥＲＣ２の発現又は上記相互作用を阻害しているかどうかを判別することが好ましい。
５．医薬組成物
本発明において、細胞内におけるＨＥＲＣ２の発現を抑制する物質、および、細胞内においてＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を阻害する物質は、抗腫瘍剤として使用することができる。特に、ＨＥＲＣ２の発現を抑制するために作製されたｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡ、さらにはＨＥＲＣ阻害剤、あるいはＨＥＲＣ２に対する抗体は、ＨＥＲＣ２の発現を抑制するため、特に腫瘍の遺伝子治療用医薬組成物として使用することができる。
本発明の医薬組成物は、当該医薬組成物を生体内に投与することにより、抗腫瘍剤として使用することができる。また、上記医薬組成物を製造するため、細胞内におけるＨＥＲＣ２の発現を抑制する物質、あるいは細胞内においてＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を阻害する物質を使用することができる。
腫瘍の適用部位は特に限定されず、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、皮膚癌、各種白血病（例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫）等が挙げられる。上記腫瘍は、原発巣であっても、転移したものであっても、他の疾患と併発したものであってもよい。
本発明の医薬組成物は、経口投与及び非経口投与のいずれの剤形をも採用することができる。非経口投与の場合は、上記腫瘍部位に直接投与することも可能である。
これらの剤形は常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
上記添加物は、本発明の抗腫瘍剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。剤形としては、経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤等として、または適当な剤型により投与が可能である。非経口投与の場合は、経肺剤型（例えばネフライザーなどを用いたもの）、経鼻投与剤型、経皮投与剤型（例えば軟膏、クリーム剤）、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。
例えば、注射用製剤として使用する場合、ＨＥＲＣ２の発現を抑制する物質、又はＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を阻害する物質を溶剤（例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等）に溶解し、これにＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１μｇ〜１００μｇである。但し、上記治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明の医薬組成物を腫瘍の遺伝子治療剤として使用する場合は、適用部位は特に限定されず、上記腫瘍部位を例示することができる。上記腫瘍は、原発巣であっても、転移したものであっても、他の疾患と併発したものであってもよい。
本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の医薬組成物を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
また、本発明の医薬組成物をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。腫瘍部等に局所投与することもできる。
本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は１日１回あたり１０^６〜１０^１３個程度であり、１週〜８週間隔で投与される。
ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを目的の組織又は器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

質量分析
トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、１２０μｌ容量の抗ＦＬＡＧ抗体架橋ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と共に５０μＭＭＧ１３２中で１０時間インキュベートした。その後、２つのｐ１５０プレート中のトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からＦＬＡＧ−ＢＲＣＡ１と相互作用するタンパク質を免疫沈降させた。タンパク質は、０．１ｍｇ／ｍｌのＦＬＡＧペプチドを含む２５ｍＭ重炭酸アンモニウム６０μｌ中でビーズから溶出し、７．４μｇ／ｍｌのトリプシンにより３０℃で２０時間消化した。次に、ペプチドフラグメントを公知方法^１９によりＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に供した。Ｍａｓｃｏｔソフトウエアプログラム（ＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を用いて、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のタンパク質データベースを検索し、獲得した衝突解離スペクトルを解析した。
プラスミド
ヒトＨＥＲＣ２のＣ末端（４２５４−４８３４）に対応するｃＤＮＡはＰＣＲによって増幅した。鋳型としてＭＣＦ１０Ａ細胞のｃＤＮＡライブラリーを用い、プライマーとして以下の塩基配列を有するものを使用した。
Ｆプライマー：ＴＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＴＡＣＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣ（下線部：ＢａｍＨ１部位）（配列番号４）及び
Ｒプライマー：ＴＡＧＣＴＣＴＣＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＧＡＣＧＴＴＴＣ（下線部：Ｘｈｏ１部位）（配列番号５）
反応液組成及び反応条件は以下の通りである。（マニュアルに従った場合）
＜反応液組成＞
テンプレート（５０ｎｇ／μｌ）：１μｌ
Ｐｆｘ用ｂｕｆｆｅｒ：２μｌ
（ｄＮＴＰ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ^ＴＭｐｒｏｔｅｉｎ、ＭｇＳＯ_４を含む）
Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）：０．４μｌ
Ｆプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）：０．６μｌ
Ｒプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）：０．６μｌ
滅菌水：１５．４μｌ
合計：２０μｌ
＜反応条件＞
９５℃で２分間加熱後、９５℃で１５秒の熱変性、５０℃で３０秒のアニーリング及び６８℃で１分の伸長反応を１サイクルとして計２５サイクル行い、７２℃で１０分間保温した後４℃で冷却した。
増幅後の断片は、Ｎ末端Ｍｙｃタグと共にｐｃＤＮＡ３ベクターにインフレームでサブクローニングした。ＢＲＣＡ１、ＢＡＲＤ１及びユビキチンに対する哺乳動物発現プラスミドは公知のものを使用し^{１９、２９}、ＦＬＡＧ−ＢＲＣＡ１はＲｉｃｈａｒｄＢａｅｒ博士（ＣｏｌｕｍｂｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により提供された。ＨＥＲＣ２突然変異体であるＣ４３５２Ａは、部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって作製した。使用した全てのプラスミドはＤＮＡシークエンシングによって確認した。
細胞培養及びトランスフェクション
細胞（ＨｅＬａ細胞等）は、１０％ウシ胎仔血清及び１％抗菌−抗真菌剤（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、５％ＣＯ_２中３７℃で培養した。プロテアソームによるタンパク質代謝回転の調節を測定するため、所定の濃度のＭＧ１３２又は同じ容量のＤＭＳＯ溶媒を所定時間細胞に添加し、その後細胞を回収した。ｉｎｖｉｖｏでのタンパク質の半減期を検討するため、細胞を１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（Ｗａｋｏ）と共に所定時間インキュベートした。標準リン酸カルシウム沈殿法を用いて２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。各々のトランスフェクションに関して、親ｐｃＤＮＡ３ベクターを添加することによって全プラスミドＤＮＡ量を調整した。紫外線照射試験については、細胞をＰＢＳで洗浄し、所定の線量、例えば３５Ｊ／ｍ^２の紫外線（２５４ｎｍ；ＵＶＰＩｎｃ，Ｕｐｌａｎｄ，ＣＡ）で照射して、新鮮培地中で種々の時間（例えば３時間）増殖させた。細胞生存率は、位相差顕微鏡検査法又はトリパンブルー排除測定法のいずれかによって分析した。
細胞同調
細胞同調はｄｏｕｂｌｅｔｈｙｍｉｄｉｎｅｂｌｏｃｋ法により実施した。
非同期的なＨｅＬａ細胞を２ｍＭのチミジン存在下で１８時間、チミジン除去培地で９時間培養後、２ｍＭチミジン存在下で１７時間培養した。その後、細胞を新鮮培地に移し、所定時間に細胞回収を行なった。細胞をＰｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅで染色し、細胞周期の進行をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いたＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いモニターした。
抗体
市販のＨＡ（１２ＣＡ５，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｍｙｃ（９Ｅ１０，ＢａｂＣｏ）、ＦＬＡＧ（Ｍ２，Ｓｉｇｍａ）、α−及びβ−チューブリン（ＤＭＩＡ＋ＢＭＩＢ，Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）、並びにＨＥＲＣ２（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対するマウスモノクローナル抗体、ＢＲＣＡ１（Ｃ２０またはｓｃ−６４２，ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、ｐ５３（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＨＥＲＣ２（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対するウサギポリクローナル抗体、並びにＢＲＣＡ１のブロッキングペプチド（ｓｃ−６４２Ｐ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を購入した。
ｓｉＲＮＡ
ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（登録商標）ＨＥＲＣ２ｓｉＲＮＡ混合物及び対照ｓｉＲＮＡ混合物はＤｈａｒｍａｃｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．から購入した。二本鎖ＲＮＡ（最終濃度１００ｎＭ）は、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、使用説明書に従って細胞にトランスフェクトした。
免疫沈降法及び免疫ブロッティング
煮沸１％ＳＤＳ含有緩衝液を用いたｉｎｖｉｖｏでのユビキチン化基質の検出は、公知の免疫沈降法及び免疫ブロッティングにより行なった^{１９、３０}。
０．５％ＮＰ−４０を加えた溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、５０ｍＭＮａＦ、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭＮａＶＯ_３、１ｍＭＰＭＳＦおよびプロテインインヒビター混合液）を用いて細胞を溶解し、４℃で３０分間回転混合させ、その後、１６，０００ｇで４℃、１０分間遠心分離した。上清を細胞溶解液として回収し、免疫沈降と免疫ブロッティングに使用した。
ＢＲＣＡ１複合体の免疫沈降のために、細胞溶解液を抗ＢＲＣＡ１抗体と４℃で１時間反応させ、その後、ＰｒｏｔｅｉｎＡとＧセファロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて４℃で１時間沈降反応を行った。沈降物は０．５％ＮＰ−４０緩衝液で３回洗浄を行い、ＳＤＳサンプル緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６．８、０．２％ブロモフェノールブルー、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、及び１００ｍＭＤＴＴ）に再懸濁し、３分間煮沸した。ペプチド競合コントロールとして、等量のブロッキングペプチドを加えた。
ＨＥＲＣ２の検出は、電気泳動によって３〜８％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内でサンプルを分離後、使用説明書に従いＸＣｅｌｌＩＩ（商標）ＢｌｏｔＭｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いニトロセルロース膜に転写して行った。ＢＲＣＡ１とα−、β−チューブリンの検出は、７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでサンプルを分離し、Ｓｅｍｉ−ｄｒｙ転写ユニット（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いニトロセルロース膜に転写して行った。
それぞれのタンパク質を転写した膜は、所定の抗体を用いてインキュベートし、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により現像し、ＦｕｊｉＬＡＳ−３０００ＣＣＤカメラで映像化した。
間接免疫細胞化学
細胞を４％ホルマリンで１５分間固定し、０．２％トリトンＸ−１００で５分間透過処理した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗い、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡでブロックして、所定の抗体で染色した。一次抗体は、ブロッキング緩衝液を用いて以下の濃度で希釈した。
抗ＨＥＲＣ２抗体：１μｇ／ｍｌ
抗Ｍｙｃ抗体：２μｇ／ｍｌ
抗ＢＲＣＡ１抗体：２μｇ／ｍｌ
ＦＩＴＣ又はローダミン結合二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）は１：５０希釈で使用した。核は０．５μＭＴＯ−ＰＲＯ−３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ）で対比染色した。次に細胞を蛍光封入剤（ＢｉｏＬａｄ）で封入し、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ５１０，ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）で検査した。
［実施例１］
ＢＲＣＡ１と相互作用するタンパク質としてのＨＥＲＣ２の同定
ＢＲＣＡ１の安定性に影響を及ぼすタンパク質を探索するため、本発明者らは、ナノスケールキャピラリー液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析
（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２で処理した細胞から得たＢＲＣＡ１免疫複合体を分析した。同定されたタンパク質のうち、ＨＥＲＣ２はＭｏｗｓｅスコア８０であり、１０種類のペプチドが最も高い可能性を示した。
この１０種類のペプチドを以下に示す（図１Ａ）。
１．３５２−３７５：ＤＡＰＨＳＥＧＤＭＨＬＬＳＧＰＬＳＰＮＥＳＦＬＲ（配列番号６）
２．６０２−６３６：ＧＬＫＶＩＤＶＡＣＧＳＧＤＡＱＴＬＡＶＴＥＮＧＱＶＷＳＷＧＤＧＤＹＧＫ（配列番号７）
３．１６９９−１７２５：ＬＩＰＥＧＩＤＩＧＥＰＬＴＤＣＬＫＤＶＤＬＩＰＰＦＮＲ（配列番号８）
４．１８２０−１８４９：ＬＩＧＰＳＣＤＮＶＥＥＤＭＮＡＳＡＱＧＡＳＡＴＶＬＥＥＴＲＫ（配列番号９）
５．２３０５−２３２２：ＱＡＦＡＧＱＶＤＬＤＬＬＲＣＱＱＬＫ（配列番号１０）
６．２６００−２６１４：ＤＧＬＨＤＬＮＶＱＣＤＷＱＱＫ（配列番号１１）
７．３３９４−３４１０：ＱＱＡＬＳＨＩＬＴＡＬＱＩＭＹＡＲ（配列番号１２）
８．４２２４−４２３８：ＧＤＹＨＲＬＧＨＧＳＤＤＨＶＲ（配列番号１３）
９．４２３９−４２４９：ＲＰＲＱＶＱＧＬＱＧＫ（配列番号１４）
１０．４５１６−４５３４：ＤＣＹＬＬＳＰＡＡＲＡＰＶＨＳＳＭＦＲ（配列番号１５）
ＨＥＲＣ２はそのＣ末端にＨＥＣＴドメインを有するため、本発明者らは、ＨＥＲＣ２がＢＲＣＡ１の分解に関与するユビキチンリガーゼであろうという仮説を立て、ＨＥＲＣ２に焦点を合わせてさらに分析を行なった。
ｉｎｖｉｖｏでのＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用は、一過性トランスフェクションとそれに続く免疫沈降（ＩＰ）−ウエスタン分析によって確認した。ＨＥＲＣ２は、４８３４アミノ酸から成る、極めて大型のタンパク質である（図１Ａ）。そこで本発明者らは、ＨＥＣＴドメインを保持するＨＥＲＣ２のＣ末端フラグメント領域（４２５４−４８３４）（ＨＥＲＣ２−ＣＴ）がＢＲＣＡ１の結合と分解の役割を担うという仮定の下に、ＨＥＲＣ２−ＣＴをクローニングした。２９３Ｔ細胞をＦＬＡＧ−ＢＲＣＡ１及びＭｙｃ−ＨＥＲＣ２−ＣＴでコトランスフェクトし、Ｍｙｃ−ＨＥＲＣ２−ＣＴをＦＬＡＧ−ＢＲＣＡ１と共沈させた（図１Ｂ、レーン５）。ＦＬＡＧ−ＢＲＣＡ１は抗Ｍｙｃ−ＨＥＲＣ２−ＣＴ免疫沈降物において検出された（レーン８）。この結果は、ＨＥＲＣ２のＣ末端がＢＲＣＡ１と相互作用することを示すものである。
［実施例２］
ＨＥＲＣ２によるＢＲＣＡ１のｉｎｖｉｖｏでの不安定化
本発明者らは、ＨＥＲＣ２−ＣＴの共発現時にＢＲＣＡ１発現が劇的に低下することを見出した（図１Ｂ、レーン２及び５）。そこで本発明者らは、ＨＥＲＣ２がｉｎｖｉｖｏでＢＲＣＡ１を不安定化するかどうかを分析した。
ＢＲＣＡ１の定常状態レベルおよびタンパク質半減期を、Ｍｙｃ−ＨＥＲＣ２−ＣＴ共発現の存在下および不在下で検討した。ＦＬＡＧ−ＢＲＣＡ１（図２Ａ）及び内因性ＢＲＣＡ１（図２Ｂ）の定常状態レベルは、ＨＥＲＣ２−ＣＴの共発現時に用量依存的に低下した。細胞をシクロへキシミドにより処理した場合も、ｉｎｖｉｖｏでのＢＲＣＡ１タンパク質半減期がＨＥＲＣ２−ＣＴによって低下することが示された（図２Ｃ）。さらに、ＨＥＲＣ２ｓｉＲＮＡを導入したときは内因性ＢＲＣＡ１タンパク質のレベルが上昇した（図２Ｄ）。以上より、ＨＥＲＣ２はｉｎｖｉｖｏでＢＲＣＡ１を不安定化することが判明した。これらの結果は、ＨＥＲＣ２の発現を抑制するとＢＲＣＡ１が活性化して癌を抑制できることを示すものである。
［実施例３］
ＨＥＲＣ２を介したＢＲＣＡ１の分解に対するユビキチンリガーゼ活性の潜在的関与
ＨＥＲＣ２−ＣＴはＨＥＣＴドメインを含むため、本発明者らは、ＢＲＣＡ１タンパク質分解がこのモチーフのユビキチンリガーゼ活性によるものであろうと推測した。この可能性を調べるため、２９３Ｔ細胞に野生型ＨＥＲＣ２−ＣＴ又はＣ４３５２Ａのいずれかをトランスフェクトした。Ｃ４３５２Ａは、ＨＥＲＣ２のアミノ酸配列のうち第４３５２番目のシステインをアラニンに変異させた変異体であり、Ｅ２がＨＥＣＴモチーフに結合するのを妨げるが、ＢＲＣＡ１との相互作用は妨げないという特徴を有する。
内因性ＢＲＣＡ１発現レベルに関し、野生型ＨＥＲＣ２−ＣＴ又はＣ４３５２Ａの作用を検討した。その結果、野生型ＨＥＲＣ２−ＣＴはＢＲＣＡ１発現を低下させたのに対し、Ｃ４３５２Ａ変異体は低下させなかった（図３Ａ）。このことから、本発明者らは次に、ＨＥＲＣ２によりＢＲＣＡ１がｉｎｖｉｖｏでユビキチン化されることを確認することとした。
２９３Ｔ細胞にＦＬＡＧ−ＢＲＣＡ１（１−７７２）、Ｍｙｃ−ＨＥＲＣ２−ＣＴ及びＨＡ−ユビキチンをコトランスフェクトした。ＢＲＣＡ１自体は、ｉｎｖｉｖｏにおいてわずかではあるが自己ユビキチン化された量として明確に分かる（図３Ｂ、レーン１）。この自己ユビキチン化は、おそらく内因性ＢＡＲＤ１との相互作用から生じると考えられる。興味深いことに、ＢＲＣＡ１のユビキチン化はＭｙｃ−ＨＥＲＣ２の共発現によって劇的に低下したが（図３Ｂ、レーン２）、ＭＧ１３２によって回復した（図３Ｂ、レーン３）。ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によって触媒される自己ユビキチン化はユビキチンのＬｙｓ６を通して結びついており、プロテアソーム阻害剤、例えばＭＧ１３２又はＬＬｎＬの添加によってｉｎｖｉｖｏで増強されることはない^１９。したがって、Ｍｙｃ−ＨＥＲＣ２−ＣＴの共発現及びＭＧ１３２への暴露時に検出されるユビキチン化は、Ｌｙｓ６関連のユビキチン化ではないと考えられる。むしろ、ＨＥＲＣ２がプロテアソーム分解のためのシグナルとしてＢＲＣＡ１のポリユビキチン化を媒介することを示唆する。
［実施例４］
ＨＥＲＣ２−ＣＴ発現によるＢＲＣＡ１の細胞質局在化の誘導
ＢＲＣＡ１は核と細胞質との間を往復するが、分裂間期の間は主として核に局在する。他方で、本発明者らは、ＨＥＲＣ２は細胞質に優勢的に局在することを確認した（図４Ａ）。トランスフェクトしたＨＥＲＣ２−ＣＴも細胞質に局在する（図４Ｂ及びＣ）。トランスフェクトしたＨＥＲＣ２−ＣＴはＢＲＣＡ１と相互作用するため、本発明者らは、ＨＥＲＣ２−ＣＴがＢＲＣＡ１の局在化に影響を及ぼし得ると推測した。そこで本発明者らはこの可能性を検討するため、２９３Ｔ細胞においてＨＥＲＣ２−ＣＴを一過性発現させ、その後免疫蛍光顕微鏡検査によってＢＲＣＡ１の局在化を分析した。
その結果、親ｐｃＤＮＡベクターでトランスフェクトしたほとんど全ての細胞は核内ＢＲＣＡ１を有していたのに対し（図４Ｂ、下パネル）、ＨＥＲＣ２−ＣＴを過剰発現する細胞はＢＲＣＡ１が核と細胞質の両方に存在することが示された（図４Ｂ、上パネルに見られる６細胞）。これらの結果は、ＨＥＲＣ２−ＣＴがＢＲＣＡ１の核外輸送シグナルを増強し得ることを示すものである。あるいは、ＨＥＲＣ２−ＣＴはＢＲＣＡ１の核内輸送シグナルを抑えると考えられる。
ここで、ＢＲＣＡ１局在の変化は、ＢＲＣＡ１に対する直接的作用によるものではなく、一般的輸送機構、例えばインポーチン／エクスポーチン活性の排除の結果生じた可能性が考えられる。そこで本発明者らは、公知のインポーチン／エクスポーチン調節性細胞タンパク質であるｐ５３に対するＨＥＲＣ２−ＣＴの作用を検討した。
その結果、ＨＥＲＣ２−ＣＴの発現はｐ５３の細胞局在化に影響を及ぼさなかった（図４Ｃ）。よって、本発明者らは、ＢＲＣＡ１のＨＥＲＣ２−ＣＴ依存性細胞質局在化は一般的輸送機構の欠陥によって引き起こされたものではないと結論づけた。
［実施例５］
紫外線照射後のＢＲＣＡ１のＨＥＲＣ２依存性ダウンレギュレーション
本発明者らは次に、ＢＲＣＡ１のＨＥＲＣ２媒介性ダウンレギュレーションが生理的影響を及ぼすかどうかを検討した。細胞がＤＮＡ損傷を受けた後にＢＲＣＡ１の発現が低下することは広く確認されている。この低下は、主としてＢＲＣＡ１のｐ５３依存性転写抑制によるものである^{１６、１７}。しかし、ＢＲＣＡ１タンパク質の分解も、観察される低下に寄与することが提案されてきた^{１６−１８}。これまでの報告では、ｐ５３依存性のＢＲＣＡ１分解が示されているが、本実施例では、Ｔ４７Ｄ又はＨｅＬａ細胞などのｐ５３の機能が失われている細胞においても、ＤＮＡ損傷後にＢＲＣＡ１タンパク質レベルがダウンレギュレートされることを確認した（図５Ａ及びＢ）。このダウンレギュレーションは、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２によって抑えられることから、プロテアソームによる分解は、部分的にＢＲＣＡ１が低下する原因であることが示唆された（図５Ａ）。
興味深いことに、本発明者らは、紫外線照射後にＨＥＲＣ２が劇的にアップレギュレートされることを確認した（図５Ｂ）。これらの所見から、本発明者らは、ＨＥＲＣ２が紫外線誘導性ＢＲＣＡ１分解に関与するかどうかを検討することにした。
ｓｉＲＮＡを用いて、ＨｅＬａ細胞からＨＥＲＣ２の発現を失わせ、４８時間後、細胞に紫外線（３５Ｊ／ｍ^２）を照射し、その後いくつかの時点で細胞を回収した。ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞では、ＨＥＲＣ２の発現を沈黙化することに成功した（図５Ｂ、上のパネル、レーン５から８）。対照細胞では、紫外線照射の３から６時間後にＨＥＲＣ２がアップレギュレートされ（レーン３及び４）、それに伴いＢＲＣＡ１の抑制が確認された（中央のパネル、レーン１から４）。重要な点として、ＨＥＲＣ２の発現が抑制された細胞では、紫外線照射後にＢＲＣＡ１発現は変化しなかった（レーン５から８）。これらの結果は、ＢＲＣＡ１が紫外線照射後にＨＥＲＣ２依存的に分解されることを強く示唆するものである。
［実施例６］
ＨＥＲＣ２ノックダウンによる、紫外線によるＤＮＡ損傷に対する細胞の非感受性化
ＢＲＣＡ１が欠損すると、細胞はＤＮＡ損傷に対して過敏性になることは広く知られている^{２０−２２}。ＨＥＲＣ２は、細胞に紫外線を照射した後にＢＲＣＡ１のダウンレギュレーションを誘導する。このため、ＨＥＲＣ２のノックダウンは紫外線非感受性という逆の表現型を生じさせ得る可能性がある。この可能性を調べるため、本発明者らは、ＨＥＲＣ２の除去が紫外線照射後の細胞生存率に影響を及ぼすかどうかを検討した。
ＨｅＬａ細胞にＨＥＲＣ２特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、紫外線を照射した。照射の２４時間後にトリパンブルー排除法によって細胞生存率を測定した。５０Ｊ／ｍ ^２の紫外線照射後のＨＥＲＣ２ノックダウン細胞の細胞生存率は、０時間目で未処置細胞の約２８％であったのに対し、対照細胞の生存率は約８．５％であった。図５Ｃは、紫外線照射（５０Ｊ／ｍ^２）後２４時間目に位相差顕微鏡検査によって観察した細胞についての代表的データを示す。このように、ＨＥＲＣ２が欠損すると、細胞は紫外線照射に対して抵抗性になることが判明した。
［実施例７］
細胞周期に依存したＢＲＣＡ１とＨＥＲＣ２の発現の検出
本実施例では、ＢＲＣＡ１とＨＥＲＣ２の相互作用が細胞周期に依存して起こるのか否かの検討を行った。Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｄｏｕｂｌｅｂｌｏｃｋｉｎｇ法を用い、細胞周期を同調させ（図６Ａ）、所定時間毎に細胞を回収し、免疫沈降法によりＢＲＣＡ１とＨＥＲＣ２の相互作用の検出を試みた（図６Ｂ）。
抗ＢＲＣＡ１抗体で免疫沈降を行い、抗ＨＥＲＣ２抗体（図６Ｂ最上段）及び抗ＢＲＣＡ１抗体（図６Ｂ第２段）により検出を行った結果、細胞回収後、Ｇ２−Ｍ期に相当すると考えられる２−４時間でＨＥＲＣ２がピークとなり、同時間ではＢＲＣＡ１のシグナルは減弱した。
また、全細胞溶解液中のＨＥＲＣ２及びＢＲＣＡ１量の変化について、免疫沈降を行わず、免疫ブロッティングを用い検討した結果、ＨＥＲＣ２のタンパク量の変化は殆ど見られないものの、ＢＲＣＡ１の減少が確認された。この結果は、細胞周期に依存したＨＥＲＣ２−ＢＲＣＡ１の相互作用と、その結果生じる、ＨＥＲＣ２によるＢＲＣＡ１の分解を示唆する。
［実施例８］
ＵＶ照射によるＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１の相互作用の変化
本実施例では、ＢＲＣＡ１とＨＥＲＣ２の相互作用はＵＶ照射によって変化するか否かを検討した（図７）。
上記ＵＶ照射実験の手法で、一定時間ＵＶ照射後、抗ＢＲＣＡ１抗体を用い免疫沈降を行った後、抗ＨＥＲＣ２抗体によりＢＲＣＡ１とＨＥＲＣ２の相互作用（図７上段）を、及び、コントロールとして抗ＢＲＣＡ１抗体によるＢＲＣＡ１の検出（図７下段）を行った。
その結果、ＵＶ照射後の細胞では、ＢＲＣＡ１タンパク質の増加及び、ＢＲＣＡ１とＨＥＲＣ２との相互作用の減少が確認された。
考察
ＢＲＣＡ１は腫瘍進行経路におけるハブタンパク質として働き、このキー遺伝子の生殖細胞系突然変異により、乳癌の生涯危険度が約８０％となる^２３。したがって、他の機構によるＢＲＣＡ１タンパク質のダウンレギュレーションが、散発性乳癌を引き起こし得ることが提唱された^{２４、２５}。
本明細書に提示する結果は、ＨＥＲＣ２が、ＤＮＡ損傷に応答してＢＲＣＡ１の細胞局在化及び安定性を調節することによって、ＢＲＣＡ１タンパク質をダウンレギュレートするという機構に関与し得ることを示すものである。この機構の生物学的重要性の１つの可能性としては、ＨＥＲＣ２が核外輸送とリンクした機構においてＢＲＣＡ１の分解を誘導し得ることが考えられる。ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１の細胞質への核外輸送がそれらの分解を引き起こすことを明らかにする報告は、この概念を裏付ける^２６。本発明者らのデータは、ＨＥＲＣ２ノックダウンによりＢＲＣＡ１を安定化させると、紫外線によるＤＮＡ損傷に対して抵抗性を有する細胞を生じることを示す。これは、ＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１の相互バランスが細胞の生存率を左右することを示唆する。
ＨＥＲＣ２をノックダウンすることにより、細胞が、ＤＮＡ損傷誘導性細胞死から救済されることを示すデータは、ＨＥＲＣ２が腫瘍抑制因子であると考えることができる。しかし、ＨＥＲＣ２はＢＲＣＡ１という腫瘍抑制因子を阻害することから、ＨＥＲＣ２は癌遺伝子であると考えるほうがより妥当である。あるいは、ＢＲＣＡ１とＨＥＲＣ２はハウスキーパーの腫瘍抑制因子として協同すると考えられる。
エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）突然変異誘発分析により、ＨＥＲＣ２がこれまでに研究された中で最も易変性のマウス遺伝子座であることが示唆されたことは言及に値する^２７。ＨＥＲＣ２巨大複製領域（ｄｕｐｌｉｃｏｎ）は、高い突然変異率を有する偽遺伝子とみなされているにもかかわらず、転写される。一部のｒｊｓ突然変異体は、インタクトなＨＥＣＴドメインを有するＨＥＲＣ２タンパク質を含むが、野生型ＨＥＲＣ２タンパク質アミノ酸配列のうち第３７１６番から第３７６８番までの５３アミノ酸（３７１６−３７６８）を欠損している。
参考文献
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配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
［配列表］

Claims

細胞内におけるＨＥＲＣ２の発現を抑制することを特徴とする、腫瘍を抑制する方法。
細胞内においてＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を阻害することを特徴とする、腫瘍を抑制する方法。
ＨＥＲＣ２の発現の抑制が、ＨＥＲＣ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡである請求項１に記載の方法。
ＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用の阻害力が、ＨＥＲＣ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ＨＥＲＣ２に対するアンタゴニスト及びＨＥＲＣ２に対する抗体からなる群から選択される少なくとも１つによるものである請求項２に記載の方法。
候補物質の存在下で細胞内のＨＥＲＣ２の発現量を測定し、得られる測定結果を指標として抗腫瘍活性を有する物質を選択することを特徴とする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。
候補物質の存在下でＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を測定し、得られる測定結果を指標として抗腫瘍活性を有する物質を選択することを特徴とする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。
細胞内におけるＨＥＲＣ２の発現を抑制する物質を含む抗腫瘍剤。
ＨＥＲＣ２の発現を抑制する物質が、ＨＥＲＣ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡである請求項７に記載の抗腫瘍剤。
細胞内においてＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を阻害する物質を含む、抗腫瘍剤。
ＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を阻害する物質が、ＨＥＲＣ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ＨＥＲＣ２に対するアンタゴニスト及びＨＥＲＣ２に対する抗体からなる群から選択される少なくとも１つである請求項９に記載の抗腫瘍剤。
生体内におけるＨＥＲＣ２の発現を抑制することを特徴とする、腫瘍の治療方法。
生体内においてＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を阻害することを特徴とする、腫瘍の治療方法。
腫瘍を治療する医薬を製造するための、細胞内におけるＨＥＲＣ２の発現を抑制する物質の使用。
腫瘍を治療する医薬を製造するための、細胞内においてＨＥＲＣ２とＢＲＣＡ１との相互作用を阻害する物質の使用。