KR20100099249A - 세포막 재봉합을 조절하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본원은 세포막을 복구하기 위한 조성물 및 이를 위한 방법을 기재한다. 또한, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 조합된 본 발명의 누클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 치료 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 세포막의 복구를 촉진한다. 또한, 본 발명은 세포막 손상과 관련된 병리 질환의 치료 및/또는 예방에 관한 것이다.
Description
관련 출원의 교차 참조
35 U.S.C. § 119(e) 하에서, 본 출원은 세포막 재봉합을 조절하기 위한 방법을 표제로 하는 2007년 12월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 제61/005,410호를 우선권으로 주장한다.
참고의 포함
37 C.F.R. § 1.52(e)(5)에 준수하에, 패턴트-인(Patent-In) 3.5 및 체커(Checker) 4.4.0을 이용하여 2008년 12월 2일에 생성된 57 KB 크기의 전자파일명 Ma_2008utility_ST25.txt에 함유된 서열 정보는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.
정부 지원 연구에 관한 진술
미국 정부는 미국 국립보건원(NIH)에 의해 지안지에 마(Jianjie Ma) 박사에 수여된 RO1-HL0691000의 권리부여에 따라 본 발명에서 특정한 권한을 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 세포막 복구의 조절을 위한 폴리펩티드 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
배경
세포 항상성을 유지하기 위해, 진핵생물 세포는 능동 재순환(active recycling)을 통한 형질막의 온전성 및 다양한 손상원에 대한 복구를 보존해야 한다. 예를 들어, 외부 손상 및 내부 변성에 대해, 신체의 세포는 세포의 기능 및 유기체의 건강을 유지시키기 위해 각각의 개별적 세포를 둘러싸는 막을 복구해야 한다.
형질막에 대한 손상의 복구는 형질막에 대한 급성 손상, 손상 부위에서의 세포내 소포의 핵형성 및 막 패치(patch) 형성을 가능케 하는 소포 융합체를 검출할 수 있는 분자 센서(들)의 관여를 포함하는 여러 단계를 필요로 하는 능동적이고 동적인 과정이다. 세포외 칼슘의 유입이 형질막에 대한 세포내 소포의 융합과 관련된 것이 입증되어 있으나, 손상된 막 신호 감지 및 복구-패치 형성을 위한 핵형성 과정과 관련된 분자 기구는 완전히 이해되지 않았다.
외부 막을 복구하는 세포 능력의 결함은 광범위한 질병 및 병리 질환, 예를 들어, 신경변성 질병(예를 들어, 파킨슨병, BSE 및 알츠하이머병), 심장 발작, 심부전, 근육퇴행위축, 욕창, 당뇨병성 궤양, 산화 손상, 및 조직 손상, 예를 들어, 화학요법제의 투여로부터의 부작용으로 발생하는 부비동염과 관련되어 있다. 또한, 다양한 질병 및 정상적인 노화 과정과 관련된 근무력 및 위축증은 변경된 막 복구와 관련이 있다. 급성 손상에 대해 세포가 이의 막을 복구하기 위해, 세포는 소포로 언급되는 세포 내의 막의 작은 패킷을 이용한다. 이러한 소포는 보통 세포 내에서 발견되나, 세포막에 대한 손상시, 이러한 소포는 손상된 부위로 이동하여 세포 온전성을 유지하기 위해 패치를 형성한다. 이러한 필수적인 기능이 없으면, 세포는 사멸하고, 이러한 세포 손상의 축적적인 효과는 결국에는 조직 또는 기관의 기능 이상을 발생시킨다.
따라서, 급성 및 만성 세포 및 조직 손상과 관련된 질환의 치료를 위한 세포막 복구 과정의 약학적 조절자를 개발할 필요가 계속 존재한다.
개요
본 발명은 세포막 손상의 복구와 관련된 단백질 및 방법의 놀랍고 예기치 않은 발견에 관한 것이다. 본 발명은 일반적으로 광범위한 세포 및 조직 유형에서 세포막 재봉합의 과정을 조절할 수 있는 단독이거나 다른 성분과 조합된 본 발명의 핵산 및 이러한 핵산으로부터 엔코딩된 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 조성물, 예를 들어, 폴리펩티드, 및 세포질 폴리펩티드, 핵 폴리펩티드, 막 결합 폴리펩티드 및 분비 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산; 뿐만 아니라 벡터, 숙주 세포, 항체, 재조합 단백질, 슈도펩티드(pseudopeptide), 융합 단백질, 화학적 화합물, 및 이를 생성하기 위한 방법에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본 발명은 또한 세포 및/또는 조직 손상과 관련된 질병 및 장애를 치료하고 예방하기 위한 치료제로서 유용한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 치료 조성물은 MG53 폴리펩티드, 및 MG53 폴리펩티드, 예를 들어, 서열 목록 번호:1의 단백질을 엔코딩하는 핵산 및 MG53 폴리펩티드 돌연변이, 동족체, 단편, 트렁케이션(truncation), 슈도펩티드(pseudopeptide), 펩티드 유사체, 및 펩티도미메틱(peptidomimetic)(본원에서, "MG53 폴리펩티드"), 뿐만 아니라 MG53의 활성, 또는 MG53와 다른 단백질, 예를 들어, CSN6, 키네신(kinesin), 카베올린-3(caveolin-3)(서열 목록 번호:8), 페리악신(periaxin) 및 수초 염기성 단백질(myelin-basic-protein)의 분자간 상호작용을 조절할 수 있는 화합물을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, MG53은 세포막에 대한 손상의 복구를 매개하고, 이에 따라, MG53 유전자 발현, 폴리펩티드 합성, 활성 또는 단백질-단백질 상호작용을 표적으로 하고 조절하는 것은 조직 복구를 위한 신규한 치료적 시술이 된다.
추가 양태에서, 본 발명은 세포막의 복구를 촉진할 수 있는 아미노산 성분 또는 도메인을 포함하는 폴리펩티드 조성물의 발견에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 상기 양태의 구체예는 RING 핑거(finger) 아연 결합 도메인, B-박스(B-box) 아연 결합 도메인, 류신 지퍼 코일드-코일(coiled-coil) 도메인, 인지질 결합 도메인, 산화환원 민감성 아미노산, E3-리가아제 도메인, 및 SPRY 도메인을 포함하는 특정 아미노산 성분을 포함하는 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 성분은 단일 폴리펩티드 내에서 연속적으로 공유 결합되고, 상기 폴리펩티드는 세포막 복구를 촉진한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 막 복구 활성을 상승작용적으로 조절하는 작용제와 조합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 조절제는, 예를 들어, 포스파티딜세린; 아연, 예를 들어, 아연염, 아연 담체 또는 아연 컨쥬게이트의 형태의 아연; 노토진싱(notoginsing); 및 산화제를 포함한다.
특정한 추가 양태에서, 본 발명은 조직 손상의 치료와 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정한 예시적 구체예에서, 본 발명은, 예를 들어, 세포막 손상의 예방 및/또는 치료; 상처 치유; 외과적 외상의 개선, 노화 과정의 자연적 부작용으로 발생하는 조직 복구에서의 연령 관련 결함의 치료 및/또는 예방; 심혈관병을 가진 피검체에서 발생하는 손상 및/또는 스포츠-관련 손상과 같은 임의의 유형의 근육 조직에 대한 손상의 치료 및/또는 예방; 근육퇴행위축, 심장 허혈, 심부전, 노화 변성, 신경변성, 패혈증, 세균 감염, 치은염, 치은퇴축, 치주병, 주름 보호, 피부 찰과상, UV 손상, 질소 머스터드(화학적 수포제), 궤양, COPD, 상처 치유, 노인 의학, 항염증제, 및 이의 임의의 조합의 치료 및/또는 예방; 뿐만 아니라 화장품 또는 생활 용품 사용을 통한 신체 조직의 복구 및 재생을 위한 유효량의 본 발명의 치료 조성물의 투여를 포함한다.
또한, 본 발명은 MG53 상호작용 단백질, 예를 들어, CSN6, 키네신, 카베올린-3(서열 목록 번호:8), 페리악신, 및 수초 염기성 단백질, 돌연변이, 트렁케이션, 단편, 동족체, 슈도펩티드 및 펩티도미메틱을 엔코딩하는 간섭 핵산을 포함하는 핵산 및 폴리펩티드, 뿐만 아니라 MG53 상호작용 단백질의 활성 또는 MG53과의 분자간 상호작용을 조절할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 피검체의 질병 또는 장애의 치료 및/또는 예방, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 조직 복구의 촉진을 위해 CSN6, 키네신, 카베올린-3(서열 목록 번호:8), 페리악신, 및 수초 염기성 단백질 유전자 발현, 활성 및/또는 분자간 상호작용을 표적으로 하는 방법을 포함한다.
상기 전반적 범위의 유용성은 단지 예시로 제공되며, 본 발명의 개시 및 첨부된 청구항의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 본 발명의 추가 목적 및 이점은 청구항, 상세한 설명 및 실시예에 비추어 당업자에 의해 인지될 것이다. 예를 들어, 다양한 본 발명의 다양한 양태 및 구체예는 다수의 조합으로 이용될 수 있으며, 이들 모두는 본 발명의 설명에 의해 명백히 고찰된다. 이러한 추가 목적 및 이점은 본 발명의 범위에 명백히 포함된다.
도면의 간단한 설명
본 명세서의 일부로 포함되고 이를 형성하는 수반된 도면은 본 발명의 여러 구체예를 예시하고, 본 발명의 기재와 함께 본 발명의 원리를 설명한다. 상기 도면은 단지 본 발명의 구체예를 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어선 안된다.
도 1: MG53은 TRIM 단백질 패밀리의 근육 특이적 일원이다. 다양한 유기체로부터의 MG53의 단백질 서열의 정렬(서열 목록 번호:1, 3, 5, 9-16)은 상기 단백질이 TRIM 패밀리의 일원인 것을 나타낸다. 기능성 도메인은 회색의 박스이고, 화살표는 도메인이 서열의 또 다른 라인에 연속적임을 나타낸다. 박스 내의 류신 잔기는 고도로 보존된 류신 지퍼 모티프의 위치를 나타낸다.
도 2는 MG53에 존재하는 하나 이상의 보존된 트리파타이트(tripartite) 모티프를 함유하는 약간의 상동성의 단백질의 예시적 도메인 비교를 예시한다. MG53은 다수의 형태의 손상 후에 세포막에서 손상 부위로 전위되고, 다른 나열된 TRIM 패밀리 단백질에 의해 나타나지 않는 기능인 손상된 막의 복구를 매개하는 능력에 있어서 독특하다. 이러한 TRIM 단백질은 모두 유사한 도메인을 함유하고/하거나 횡문근에서 발현되나, 이들은 모두 MG53의 도메인 조직화를 충분히 반복하지는 않는다.
도 3: MG53은 독특한 TRIM 및 SPRY 모티프를 함유하고, 이는 근육 세포에서 우선적으로 발현된다. A. MG53의 모티프 구조의 도표. cDNA 클로닝 및 상동성 조사의 결과로부터, 도시된 바와 같이 여러 모티프 서열이 MG53에서 검출된다. 래빗 및 마우스 MG53 cDNAs의 서열은 각각 등록 번호 AB231473 및 AB231474로 데이터베이스에 기탁되어 있다. B. 웨스턴 블롯 분석은 골격근 및 심근에서의 MG53의 특이적 발현을 나타낸다. 마우스 조직(폐, 신장, 골격근, 간, 심장, 뇌)으로부터의 용해질(레인당 20 μg 전체 단백질)이 항-마우스 MG53 폴리클로날 항체를 이용하여 분석되었다. C. 마우스 골격근 세포로부터의 경선 횡단면의 면역형광 염색. 축척 막대는 125 μm이다.
도 4: 세포막의 증가된 손상으로 인해 mg53 -/- 골격근에서 진행성 병변이 관찰된다. A. 헤마톡실린 및 에오신(H/E) 염색은 노화된 mg53 -/- 마우스(10m) 대 어린(3m) 야생형(wt) 또는 mg53 -/- 마우스에서의 중심핵(화살표)의 증가된 수를 예시한다. B. 노화된(8-10개월) mg53 -/- 마우스(청색, n=541)에서의 근섬유의 직경은 노화된(8-10개월) 야생형 대조군(흑색, n=562)에 비해 감소하였으나, 어린(3-5개월) 야생형(n=765) 대 mg53 -/- (n=673) 근육에서는 차이가 없다. mg53 -/- 골격근 내의 중심핵을 나타내는 근섬유의 백분율은 야생형과 비교하는 경우에 연령에 따라 증가한다. 데이터는 평균 ± s.e.m.이고, ANOVA에 의해 * p < 0.05이다. C. 30분의 내리막 운동 달리기에 적용된 마우스로부터 수득된 온전한 가자미근의 수축 성능의 추적 기록은 기재된 절차에 따른 시험관내 전압 자극 프로토콜을 이용하여 평가되었다. 흑색의 추적은 야생형 근육이고, 청색의 추적은 mg53 -/- 근육에 해당한다. D. 피로 자극 전( Pre , 빈 막대), g/mg 전체 단백질로 표준화된 최대 강축력(maximal tetanic force)은 야생형(흑색)에 비해 노화된 mg53 -/- 근육(청색)에서 현저하게 낮았다(n=4). 피로 자극 6분 후( After , 폐쇄 막대), 야생형 근육은 mg53-/- 근육보다 현저하게 회복되었다. ANOVA에 의해 * p < 0.05. E. 광범위한 에반스 블루(Evans blue) 염색은 야생형 근육에서의 최소 염색과 비교하는 경우 내리막 달리기에 적용된 mg53 -/- 골격근에서 중증 손상을 나타낸다. F. 운동 후의 노화 mg53 -/-(청색) 및 야생형(흑색) 골격근으로부터 포름알데히드에 의해 추출된 에반스 블루 염료의 양의 차트. 데이터는 근육 g 당 에반스 블루의 평균 값(ng) ± s.e.m이다. n=8-12, 스튜던츠 t-검정(Student's t-test)에 의해 * p < 0.005.
도 5: MG53의 제거는 결함이 있는 근육 막 복구 기능을 발생시킨다. (a) 손상 부위에서의 공동-국소화(co-localization)를 예시하기 위한 분리된 야생형 FDB 섬유에서의 MG53의 면역염색. 이는 분리 동안의 손상을 나타내는 20개를 초과하는 다양한 근섬유로부터의 대표적인 이미지이다. (b) 횡문근형질막의 레이저 유도 손상 후의 야생형 마우스로부터 분리된 FDB 근섬유에서의 막-불투과성 FM-143 형광 염료의 배제. (c) 레이저 유도 손상 후의 mg53 -/- 마우스로부터 분리된 FDB 근섬유로의 FM-143 형광 염료의 유입. 레이저 손상 후의 시간이 표시되어 있다. (d) 횡문근형질막의 레이저 손상에 의해 유도된 FDB 근섬유 내의 FM-143의 시간 의존적 축적. 데이터는 야생형 마우스로부터 수득된 n=30 섬유 및 mg53 -/- 마우스로부터의 n=18 섬유에 대해 평균±s.e.m.이다.
도 6: MG53 녹아웃(knockout) 마우스는 심장 손상에 민감하다. 운동을 하지 않은 야생형 마우스로부터의 심근의 파라핀 포매(embed)된 단면은 정상적인 형태를 나타내고(좌측), 에반스 블루 염색을 나타내지 않는다(우측). 대조적으로, mg53 -/- 마우스는 근세포로의 에반스 블루 침투를 나타내고, 이는 mg53 -/- 심장에서 막 온전성에 유의한 결합이 있는 것을 나타낸다.
도 7: MG53의 상실은 심장 허혈 재관류 손상에 대한 민감성을 증가시킨다. 야생형(WT) 및 mg53 -/- 마우스로부터의 심장이 분리되고, 랑겐도르프(Langendorff) 장치에서 관류되었다. 관류액 유동의 정지에 의해 30분 동안 전체적인 허혈이 유도되었다. 관류액 유동의 회복(시간 0) 후의 심장에서 발생된 손상이 (a) 크레아틴 키나아제(CK) 또는 (b) 락테이트 데히드로게나아제(LDH)에 대한 효소적 검정에 의해 측정되었다. mg53 -/- 마우스로부터의 심장(점선)은 야생형(실선) 보다 많은 손상을 나타낸다. 데이터는 각각의 나열된 시점에 대해 평균±S.D.로 제시된다.
도 8: MG53 함유 소포는 물리적 손상 후에 형질막에서 패치(patch)를 형성시킨다. a) 마이크로피펫을 이용한 C2C12 근육모세포막의 손상은 손상 부위에서의 GFP-MG53의 신속한 축적을 발생시킨다(화살표). 이미지는 n=40의 별개의 세포의 대표적 이미지이다. b) 중증 손상, 예를 들어, 세포막의 분리에 대한 성숙 C2C12 근관(myotube)의 회복은 치유 부위를 향한 GFP-MG53의 점증과 관련된다(n=28). c) 야생형 및 mg53 -/- 주요 골격 근관의 생존률 비교. 이러한 데이터는 MG53이 횡문근 세포에서의 막 재봉합에 필요함을 예시한다.
도 9: 근육 세포의 세포 표면 막으로의 MG53의 표적화에서의 TRIM 및 SPRY 도메인의 역할. A. N-말단 또는 C-말단에 융합된 GFP를 갖는 MG53 결실 융합 단백질 작제물의 도식. 서열 목록 번호:1을 참조로 하여, "TRIM"은 a.a. 1-287이고, "SPRY"는 a.a. 288-477이고, 이는 PRY 및 SPRY 둘 모두의 모티프를 포함한다. B. C2C12 세포에서의 각각의 결실 작제물의 세포내 국소화를 나타내는 대표적 공초점 이미지. 축척 막대는 5 μm이다. C. MG53은 TRIM 모티프를 통해 카베올린-3와 상호작용한다. GFP-MG53 또는 GFP-TRIM 및 pcDNA-Cav-3와 공동 트랜스펙션된 CHO 세포로부터의 세포 용해질이 항-카베올린-3(마우스 모노클로날 항체)와 함께 IP로 적용되었다. (레인 1, 양성 대조군으로서의 혼합된 세포 용해질; 레인 2, 음성 대조군으로서의 정상 마우스 IgG; 레인 3, GFP-MG53를 과발현하는 세포로부터의 용해질; 레인 4, GFP-TRIM을 과발현하는 세포로부터의 용해질).
도 10: 비-근육 CHO 세포에서의 세포 표면 막으로의 MG53의 표적화에서의 TRIM 및 SPRY 도메인의 역할. GFP-MG53이 세포내 소포, 막 표적화 및 출아(budding)를 나타내나, MG53-GFP가 사실상 주로 가용성이고(상부 패널); SPRY-GFP 및 GFP-SPRY가 세포질에 존재하고(중간 패널); TRIM-GFP 및 GFP-TRIM이 주로 세포내 소포에 존재하고, 형질막으로 표적화되지 않음(하부 패널)을 나타내는 대표적인 공초점 이미지. "TRIM"은 a.a. 1-287이고, "SPRY"는 a.a. 288-477이고, 이는 PRY 및 SPRY 모티프 둘 모두를 포함한다. 축척 막대는 5 μm이다.
도 11: MG53은 키네신 패밀리 일원 11(Kif11)과 상호작용할 수 있다. (a) 세포 용해질은 RFP(mRFP), RFP-MG53(MG53) 또는 C29L 돌연변이 RFP-MG53(C29L)의 FLAG-태깅(tagging)된 형태를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 분리되었다. 추출물은 항-FLAG 항체와 함께 공동 면역침전되었고, 이후 SDS-PAGE 젤에서 영동되었다. 쿠마시 염색은 상기 접근법에 의해 공동-IP(co-IP)인 특정 밴드를 나타내었다. 하나의 두드러진 밴드는 Kif11에 대한 것이었다(화살촉). (b) 상기 젤로부터 특정 밴드를 확인하기 위해 질량분광법을 사용하였다. 이러한 대표적인 질량분광법 추적은 MG53이 세포 용해질로부터 Kif11을 감소시킬 수 있는 것을 나타낸다.
도 12: MG53은 COP9 복합 동족체 서브유닛 6(CSN6)와 상호작용할 수 있다. HEK293 세포는 HA-태깅된 인간 MG53 및 myc-태깅된 CSN6로 일시적으로 트랜스펙션된 후, 재조합 태그에 대한 항체를 이용하는 공동-면역침전(IP)에 대해 사용되었다. 감소 후의 단백질의 존재가 웨스턴 면역블롯(IB)을 이용하여 확인되었다. MG53은 CSN6를 감소시킬 수 있고, 이러한 CSN6는 또한 MG53을 감소시킬 수 있다. 이는 상기 두 단백질이 세포 내에서 상호작용할 수 있는 증거를 제공한다. 레인 1 = HA-hMG53+hCSN6+DMSO, 레인 2 = HA-hMG53+hCSN6+MG132, 레인 3 = HA-mMG53+hCSN6+DMSO, 레인 4 = HA-mMG53+hCSN6+MG132.
도 13: MG53은 수초 염기성 단백질 또는 페리악신과 상호작용할 수 있다. (a) 야생형(WT) 또는 mg53 -/-(KO) 골격근으로부터의 소포 분획의 생화학적 분리를 위한 방법의 개략적 도표. (b) 상기 a에 제시된 방법으로 분리된 분획이 15%(좌측) 구배(우측) SDS-PAGE 젤을 이용하여 영동되었다. 브릴리언트 블루(Brilliant Blue, CBB) 염색은 WT 또는 KO 근육에 차별적으로 존재하는 특정 밴드를 나타내었다. 2개의 두드러진 밴드는 질량분광법에 의해 수초 염기성 단백질 또는 페리악신(화살표)으로 확인되었다.
도 14: MG53은 소포 이동(vesicular trafficking)을 매개하는 포스파티딜세린과의 결합을 통해 세포막과 상호작용한다. GFP-MG53이 상기 mg53 (-/-) 근관에서 발현되는 경우, 단백질은 형질막 및 세포내 소포에 적절하게 국소화될 것이다(상부). PIP2-스트립(PIP2-Strip) 지질 점 블롯 분석은 재조합 MG53(1 μg/ml)이 포스파티딜세린(PS)에 특이적으로 결합하고, 스핑고신-1-P(sphingosine-1-P), 포스파티드산, 포스포티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 및 다양한 포스파이노시톨 대사물을 포함하는 다른 막 지질에는 결합하지 않는 것을 나타낸다(B). 아넥신-V-GFP를 이용하여, 본 발명자는 C2C12 근육모세포 손상 부위에서 아넥신-V-GFP의 신속한 라벨링을 관찰하였다. C2C12 근육모세포로 트랜스펙션된 아넥신-V-GFP(PS에 결합하는 널리 규정된 능력을 갖는 분자)는 미소전극을 이용한 세포 손상 후에 최소 전위를 나타내는 반면(좌측), 아넥신-V-GFP와 RFP-MG53의 공동 발현(우측)은 아넥신-V-GFP의 가속화된 축적을 발생시킨다(C). 아넥신-V-GFP의 축적은 RFP-MG53의 공동 발현에 의해 가속화되었다(0.93±0.21 ΔF/F0 대조군; 2.9±0.63 ΔF/F0 +MG53). 손상된 형질막을 통한 세포외 Ca2 +의 유입은 PS로의 아넥신-V 결합을 가능케 하여, 세포 손상 전의 가용성 패턴으로부터 형질막 및 세포내 소포로의 명백한 국소화로의 전이를 발생시킨다(D). 세포외 용액으로부터의 Ca2 +의 제거는 손상 부위에서의 아넥신-V-GFP에 의한 PS의 라벨링을 파열시키고, 손상 부위로의 RFP-MG53의 전위는 유지되었다(E).
도 15: 형질막의 급성 파열은 세포 내부를 외부 산화 환경에 노출시킨다. (A 및 B) MG53은 디티오트레이톨(DTT)의 첨가에 의해 발생된 환원 환경에서 주로 단량체로 존재한다. (C) 세포외 용액 내의 5 mM DTT의 포함은 C2C12 세포에서 MG53-매개 막 복구 과정에 대해 강한 효과를 발생시켰다. 티메로살은 시스테인 잔기에서 술프히드릴 기를 산화시킨다. (E) 다수의 보존된 시스테인 잔기가 알라닌으로 돌연변이되었고 - 막 표적화가 유지되나, 막 손상 과정을 촉진하는 능력은 완전히 붕괴되었고; 즉, 손상 부위에서 C242A의 축적이 관찰되지 않았다.
도 16: (A) 환원된 세포외 환경(+DTT)하에서, 손상 부위로의 GFP-MG53의 전위는 대부분 붕괴되었다. 세포외 용액으로의 산화제(티메로살)의 첨가는 세포막에서 손상 부위로의 GFP-MG53의 전위를 증가시켰다. 이러한 실험은 C2C12 세포에서 수행되었다. (B) C242A 돌연변이를 갖는 MG53(GFP-C242A)는 형질막 상의 손상 부위로 전위할 수 없었다. 다양한 보존된 시스테인 돌연변이 C313A은 산화 조건하에서 올리고머화(oligomerization) 패턴을 유지하였고, 야생형 GFP-MG53과 유사한 전위 및 막 복구 기능을 나타내었다. 따라서, Cys242의 산화는 손상 부위에서 리페어좀(repairsome) 형성을 위한 핵형성 부위를 제공하는 MG53의 올리고머화를 유도하는 것으로 보인다. 이러한 실험은 C2C12 세포를 이용하여 수행되었다. (C) 세포외 산화환원 상태의 조절은 세포의 외부에 적용된 FM-143 염료의 유입의 증가에 의해 측정되는 바와 같이, 세포외 용액으로의 DTT의 첨가가 막 재봉합을 방지함에 따라 분리된 근섬유막의 재봉합에 영향을 줄 수 있다.
도 17: MG53 매개의 리페어좀 형성 및 급성 횡문근형질막 손상의 회복. FM1-43의 적색 편이(red-shifted) 변이체인 FM4-64의 유입이 GFP-MG53 및 GFP-C242A로 트랜스펙션된 mg53 -/- 근관에서의 막 복구 능력의 지표로 사용되었다. 녹색 형광의 UV-표백 후, 손상 부위에서 GFP-MG53의 신속한 전위가 발생한 반면, GFP-C242A는 이의 결함이 있는 올리고머화 특성으로 인해 정적으로 유지되었다. 유의하게, GFP-C242A에 비해 GFP-MG53으로 트랜스펙션된 세포에서 FM4-64의 유입이 덜 관찰되었으며, 이는 돌연변이가 손상 후에 막 온전성을 회복할 수 없음을 암시한다(B). 야생형의 골격근에서 발현된 GFP-C242A 돌연변이가 천연 MG53에 비해 우세한 음성적 기능을 나타냄에 따라 MG53의 올리고머화는 리페어좀 형성의 단계인 것으로 보인다(C). GFP-MG53과 비교하여, 성인의 야생형 근섬유에서의 GFP-C242A의 과발현은 횡문근형질막 복구 기능을 억제하였다(C).
도 18: MG53에 의해 촉매된 시험관내 유비퀴틴화. MG53에 대한 재조합 말토오스-결합 단백질(MBP) 융합 단백질이 ATP, 유비퀴틴, E1 및 E2 효소와 함께 인큐베이션되었고, 항-MBP 항체를 이용한 면역블로팅에 적용되었다. MBP-MG53이 E2로서 Ubc4 또는 UbcH5와 인큐베이션되는 경우에 유비퀴틴화로부터 유래된 고분자량의 래더(ladder)가 관찰되었다(a). MG53의 내재성 E3-리가아제 활성은 C29L 돌연변이에서 현저하게 감소되었다(b). (c) 웨스턴 블롯은 전장의 GFP-MG53 및 GFP-C29L 단백질이 분화된 C2C12 근관에 존재함에 따라, C29L 돌연변이가 안정적이고, 상기 융합 단백질의 분해가 GFP-C29L의 다양한 세포하 분포에 기여하는 것이 아님을 입증하였다.
GFP-C29L은 C2C12 근관에서 세포질 패턴을 우선적으로 나타낸다(d, 좌측). 웨스턴 블롯은 전장의 GFP-MG53 및 GFP-C29L 단백질이 분화된 C2C12 근관에 존재함에 따라(c), 상기 융합 단백질의 분해가 (d)에서 관찰된 GFP-C29L 및 GFP-MG53의 다양한 세포하 분포에 기여하는 것이 아님을 입증하였다. mg53 -/- 신생아로부터 유래된 일차 배양된 골격 근관으로의 상기 융합 단백질의 일시적 발현으로 유사한 현상이 관찰되었고, 횡문근형질막 및 세포내 소포로의 GFP-MG53의 표적화는 GFP-C29L 돌연변이에 대해 약화되었다(d, 우측). 급성 막 손상 후, C2C12 근육모세포에서 GFP-MG53의 신속한 축적이 관찰되는 반면, GFP-C29L은 고정되고 막 손상의 복구에서 효과가 없는 것으로 보인다(e, 좌측). GFP-C29L을 이용하여 유사한 결함이 C2C12 근관에서 관찰되었다(e, 중앙). 또한, GFP-MG53은 일차 배양된 mg53 -/- 근관에서의 손상 후 형질막으로 전위될 수 있는 반면, 상기 세포에서 발현된 GFP-C29L은 보통 급성 세포 손상에 대해 미반응인 채로 유지되었다(e, 우측).
도 19: GFP-MG53을 발현하는 C2C12 근육모세포의 손상 전의 세포외 용액으로부터의 아연(Zn) 제거의 효과. N,N,N,N-테트라키스(2-피리딜-메틸)에틸렌디아민(TPEN)을 이용한 Zn의 킬레이트화는 미소전극 침투의 부위로의 GFP-MG53의 전위를 방지할 수 있으며(A), 이는 Zn이 MG53 기능에 필요함을 나타낸다. Zn 이온운반체인 Zn-1-히드록시피리딘-2-틴(Zn-HPT)의 첨가는 C2C12 세포에서 GFP-MG53의 전위를 유도할 수 있었다(B). 야생형 FDB 근섬유: +Zn-HPT는 UV 레이저에 의해 유도된 손상 후에 근섬유로 유입할 수 있는 FM-1-43 염료의 양을 감소시킨다(C).
도 20: 막 복구에 대한 아연의 보호 효과는 mg53 -/- 골격근에서 상실된다. (a) 개별적 단지굴근(flexor digitorum brevis, FDB) 근섬유가 야생형(WT) 마우스(3-6개월)로부터 분리되었다. 강한 UV 레이저가 FDB 섬유에 적용되어, 근육에 대한 국소적 손상이 야기되었다(화살표). 막 복구 능력의 측정을 위한 지표로 FM1-43 형광 염료(2.5 μM)의 유입이 이용되었다. UV 조사 200초 후에 이미지가 획득되었다(대조군). 2 μM 아연-이온운반체(1-히드록시피리딘-2-티온)(+Zn-HPT)의 적용은 UV-손상 후의 FM1-43 염료 유입의 감소된 양에 의해 반영되는 바와 같이 막 복구 능력을 증가시켰다. 아연 이온에 특이적인 완충액인 40 μM의 TPEN(테트라키스-2-피리딜메틸렌디아민)의 첨가는 UV-손상 후의 FM1-43 염료 유입의 현저한 증가에 의해 반영되는 바와 같이 막 복구 능력을 절충(compromised)시켰다(+ TPEN). (b) mg53 -/- 마우스(3-6개월)로부터 분리된 FDB 근섬유는 UV-손상의 동일한 치료 후의 FM1-43 염료 유입의 증가된 양에 의해 나타난 바와 같이 결함이 있는 막 복구 기능을 나타내었다(대조군). (c) Ca-EDTA(100 μM)를 이용하여, 세포외 Ca 농도를 변경함이 없이 아연을 완충하는 시약은 또한 야생형 근육에서 절충 막 복구 능력을 야기하였다(좌측). Ca-EDTA를 이용한 치료는 mg53 -/- 마우스에서 막 복구 능력의 임의의 유의한 변화를 발생시키지 않았다. (d) MG53에서의 아연 결합 모티프의 개략적 도표. MG53의 아미노 말단은 2개의 잠정적 아연 결합 모티프를 함유하며: 이중 하나는 RING 모티프(a.a. 1-56, 인간 cDNA)에 위치하고, 다른 하나는 B-박스 모티프(a.a. 86-117, 인간 cDNA)에 위치한다. 아연 결합에 관여하는 특정 아미노산이 지정되어 있다.
도 21: 세포외 아연 유입은 급성 막 손상 부위로의 MG53-매개 소포 전위를 촉진한다. a) GFP-MG53 융합 단백질이 C2C12 근육모세포에서 발현되었다. GFP-MG53은 휴지 조건하의 형질막 및 세포내 소포에서 국소화를 나타내었다(좌측). 미소전극의 침투에 의해 발생된 세포의 급성 손상(화살표, 우측 패널). b) C2C12 세포와 40 μM Ca-EDTA의 인큐베이션. c) 세포외 용액으로의 20 μM TPEN의 첨가. d) GFP-MG53으로 일시적으로 트랜스펙션된 C2C12 세포는 20 μM Zn-HPT와 함께 인큐베이션되었다. 대조 조건(0분)하에서, Zn-HPT와의 연장된 인큐베이션(15분). e) C2C12 근육모세포에서의 GFP-MG53 매개 막 복구에 대한 Ca-EDTA 및 TPEN의 요약 데이터.
도 22: MG53의 RING 및 B-박스 모티프로의 Zn-결합. a) C2C12 근육모세포에서 일시적으로 발현된 MG53의 RING 및 B-박스 모티프에서의 부위 특이적 돌연변이. 트랜스펙션 24시간 후, 세포가 수거되었고, 다양한 GFP-MG53 돌연변이의 발현이 DTT의 부재하에서 MG53에 대한 특정 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 검정되었다(좌측 패널). 올리고머 패턴은 "이합체"로 표시된다. 10 mM DTT의 첨가와 함께, 모든 돌연변이 작제물은 ~75 kD(GFP-MG53의 예측 분자 크기)의 단량체 형태를 나타내었다.
도 23: MG53은 RING 모티프를 통해 Zn에 결합할 수 있다. (a) MG53은 Zn 결합 모티프(Ring) 및 B박스 모티프를 함유하는 정준(canonical) TRIM 도메인을 함유한다. (b) 세균 배양물이 초음파처리에 의해 용해되고, 원심분리되고, 4℃에서 밤새 동안 10 uM 아연을 함유하는 컬럼 완충액 중에서 아밀로오스 수지에 결합되었다. 이후 수지는 아연 비함유 컬럼 완충액으로 세척된 후, 0.3 mM 말토오스를 갖는 50ml의 아연 비함유 컬럼 완충액으로 세척되었다. 도시된 바와 같이 SDS-PAGE 젤에 의해 단백질 수준 및 안정성이 확인되었다. 레인 1(마커), 레인 2(mMG53), 레인 3(mC29L - MG53 돌연변이), 레인 4(mC29L/C105S 이중 돌연변이 DM 클론 1), 레인 5(mC29L/C105S 이중 돌연변이 DM 클론 2), 레인 6(10mg/ml BSA), 레인 7(5mg/ml BSA), 레인 8(2.5mg/ml BSA), 레인 9(1mg/ml BSA). (c) 비드 상의 단백질은 먼저 용액 중의 유리 아연의 존재(제조물에 따라 0.01 내지 0.1 uM 또는 ND)에 대해 시험되었다. 비드(분취량)는 아연 특이적 프로브 TSQ로 염색되고, 형광현미경 하에서 형광이 관찰되고, 상대 형광 강도가 수득되었다. 이후, 단백질은 5분 동안 56℃에서 변성되고, 볼텍싱되고, 원심분리되고, 용액으로부터 상기 측정이 다시 수행되었다. 상기 검정은 TSQ(Mol Probe) 및 교정을 위해 아연의 원자 표준 용액(Sigma)을 이용한다. 차트는 재조합 야생형(WT) MG53, C29L 돌연변이(C29L) 및 이중돌연변이(DM)로의 Zn 결합의 양을 나타낸다. 둘 모두의 돌연변이는 TRIM 도메인의 Ring 모티프에 위치된다. 데이터는 평균±S.D.로 제시된다. *P<0.05, 야생형에 비한 **P<0.001; n=4~5.
도 24: 야생형 마우스로부터 분리된 FDB 근섬유는 세포내 용액 내의 아연에 대한 특정한 형광 지표인 2 μM TSQ와 함께 로딩되었다(하부 패널). 국소 손상 부위에서의 FM4-64 형광 염료의 축적에 의해 반영되는 바와 같이 FDB 근섬유에 국소 손상을 야기시키기 위해 강한 UV-레이저가 사용되었다(상부 패널). 급성 손상 부위에서 TSQ 형광의 유의한 상승(및 이에 따른 보다 많은 아연)이 관찰되었음을 인지하라.
도 25: 하이브리도마(mAb 4A3F6F2)로부터 분리된 hMG53에 대한 모노클로날 항체는 웨스턴 블롯 상에서의 인간 (및 마우스) MG53 단백질의 검출에 매우 효과적이다.
도 26: MG53의 재조합 발현. (a) Ni-NTA 컬럼을 이용하여 Sf9 곤충 세포로부터 분리된 재조합 인간 MG53 단백질(화살표) 분획의 쿠마시 블루 염색된 젤. 투입= 세포 추출물, FT= 유통(flow through), M= 마커, E= 용리 수(number). (b) Sf9 곤충 세포로부터 분리된 재조합 인간 TAT-MG53(화살표)의 쿠마시 블루 염색된 젤. (c) 대장균(E.coli) 발효로부터 분리된 재조합 마우스 TAT-MG53(화살표)의 쿠마시 블루 염색된 젤.
도 27: hMG53의 아미노 말단의 신호-펩티드는 분비 단백질로서 재조합 MG53의 배출을 가능케 하는 것을 예시한다. 웨스턴 블롯은 공학처리된 hMG53 cDNA로 일시적으로 트랜스펙션된 CHO 세포로 조건화된 배지로부터 풍부한 MG53 단백질이 정제될 수 있음을 나타낸다.
도 28: Flag-MG53 융합 단백질 작제물 및 일련의 HA-MG53 융합 단백질 돌연변이로 트랜스펙션된 HEK293 세포에서의 공동-면역침전(Co-IP) 실험. (a) 전세포 추출물에 대한 항-Flag 항체를 이용하여 Co-IP를 수행한 후, 항-HA 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. (b) Co-IP 실험은 MG53 이합체의 형성이 코일드-코일 도메인의 존재를 필요로 하는 것을 나타낸다.
도 29: RFP-MG53을 발현하는 안정적인 HEK293(인간 배아 신장) 세포주. (a) 세포질 발현 패턴을 나타내는 RFP(적색 형광 단백질) 대조군 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주. (b) 미소전극만을 이용한 RFP를 발현하는 HEK293 세포의 손상은 손상 부위로의 RFP의 전위를 발생시키지 않는다(화살표). RFP 형광의 약간의 표백이 세포외 완충액의 과도한 유입으로부터 발생한다(*). (c) RFP-MG53을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포는 세포내 소포로의 국소화를 나타낸다. (d) RFP-MG53을 발현하는 HEK293 세포의 손상은 90초 미만에서 손상 부위로의 MG53의 대량의 전위를 발생시킨다(화살표).
도 30: C2C12 세포에서 발현된 후, 노토진셍(notoginseng)으로부터의 알코올 추출물로 관류된 GFP-MG53. 노토진싱의 적용은 관류 후 2분 이내에 형질막으로의 MG53 전위를 신속하게 유도할 수 있다.
도 31: 조직 복구 시약으로서의 재조합 MG53의 치료적 용도. RFP-MG53(적색 형광 단백질을 함유하는 MG53 융합 단백질)이 HEK293 세포에서 발현되고, 분리되고, 배양 중인 C2C12 근육모세포를 둘러싸는 외부 배지에 적용되었다. 세포는 미소전극으로 기계적으로 손상되었고, 융합 단백질의 국소화가 공초점 현미경에 의해 관찰되었다. RFP-MG53이 막 손상의 상기 부위로 전위되는 것이 관찰될 수 있다(원).
도 32: MG53의 유전적 과발현은 막 손상을 방지한다. 인간 배아 신장(HEK293) 세포가 RFP-MG53 또는 RFP로 트랜스펙션된 후, 다양한 강도의 자장(field)으로 전기천공되었다. 막 손상의 정도가 전기천공에 의해 생성된 형질막 내의 구멍 외부의 세포외 배지로 누출되는 락테이트 데히드로게나아제(LDH)의 양을 평가함으로써 측정되었다. 막에서 발생하는 손상이 클수록, LDH 검정에서 판독이 더 높을 것이다.
도 33: 전기천공 후의 막 손상을 측정하기 위해 사용된 형광 염료 유입. 인간 배아 구개 중간엽(HEPM) 세포(1x10^6)가 PTI 형광 시스템의 스피닝(spinning) 큐벳에 배치되었다. FM1-43 염료가 세포의 외부에 첨가되고, 479 nm의 여기 및 598 nm의 방출을 갖는 최소 형광을 나타내었다. 세포가 50 V/cm 또는 100 V/cm의 전계 강도로 전기천공되는 경우, 검출되는 형광의 용량 의존적 증가가 존재하였다. 전기천공은 염료가 존재하지 않는 세포에서 자가 형광을 발생시키지 않는다(대조군).
도 34: 기계적 손상 후 막 손상을 측정하기 위해 사용된 형광 염료 유입. 인간 배아 구개 중간엽(HEPM) 세포(1x10^6)가 PTI 형광 시스템의 스피닝 큐벳에 배치되었다. FM1-43 염료가 세포의 외부에 첨가되고, 479 nm의 여기 및 598 nm의 방출을 갖는 최소 형광을 나타내었다. 세포가 큐벳으로부터 분리되고(Pour), 28 게이지(gauge) 바늘로 전단되었고(Shear), FM1-43 형광이 증가하였다. 대조군으로서 상기 염료가 존재하지 않는 세포(염료 없음)에서 기계적 전단 스트레스는 자가-형광을 발생시키지 않는다.
도 35: 재조합 MG53은 세포막 손상으로부터 신장 세포를 보호한다. (a) HEK293 세포(8x10^4)가 10 ug/mL 재조합 인간 MG53 또는 비히클 대조군으로 처리된 후, 다양한 전계 강도로 전기천공되었다. 세포외 재조합 MG53은 전기천공으로부터의 손상을 방지할 수 있다. (b) MG53 또는 비히클 대조군이 재조합 LDH에 첨가되어 LDH 활성에 대한 표준 곡선이 생성되었다.
도 36: 재조합 MG53은 세포막 손상으로부터 잇몸 내막 세포를 보호한다. (a) HEPM 세포(5x10^4)가 10 ug/mL 재조합 인간 MG53 또는 비히클 대조군으로 처리된 후, 다양한 전계 강도로 전기천공되었다. 세포외 재조합 MG53은 전기천공으로부터의 손상을 방지할 수 있다. (b) MG53 또는 비히클 대조군이 재조합 LDH에 첨가되어 LDH 활성에 대한 표준 곡선이 생성되었다.
도 37: 재조합 MG53은 기계적 세포막 손상으로부터 신장 세포를 보호한다. HEK293 세포(8x10^4)가 유리 마이크로비드로 처리되어, 기계적 손상이 유도되었다. 유리 비드가 배지에 첨가되는 경우 다양한 용량의 재조합 인간 MG53 또는 비히클 대조군이 샘플에 적용되었다. 세포는 회전 진탕기(orbital shaker)에서 회전된 후, 상층액이 LDH 수준에 대해 분석되었다.
도 38: MG53의 효과는 단백질의 기능에 특이적이다. MG53은 유리 비드에 대한 노출로 생성된 Hela 자궁경부 상피세포에서의 손상을 재봉합하는데 효과적인 것으로 입증되었다. 재조합 단백질이 비등되는 경우, 단백질은 더 이상 막 재봉합을촉진할 수 없다.
도 39: MG53에 의해 방지된 질소 머스타드에 의해 유도된 인간 각질세포에 대한 막 손상. 다양한 용량의 피부 수포제인 질소 머스타드는 일차 인간 각질세포로부터의 LDH 방출을 발생시킬 수 있다. 삽입된 도면은 피부 수포제에 대한 노출의 효과를 예시한다.
도 40: 외부 적용되는 재조합 MG53은 손상된 막을 재봉합시키기 위해 포스파티딜세린(PS) 결합을 필요로 한다. HEK293 세포가 재조합 인간 MG53 또는 비히클로 처리된 후, 유리 마이크로비드의 존재하에서의 진탕에 의해 손상되었다(흑색 막대). 막 손상은 488 nm에서 기록되는 비색 검정에 의해 기록되는 세포로부터의 LDH 방출에 의해 측정된다. 포스파티딜세린(PS)을 이용한 세포의 동시 처리는 형질막의 재봉합을 방지할 수 있다. * p < 0.05
도 41: 또 다른 포스파티딜세린(PS) 결합 단백질과의 경쟁. HEK293 세포가 제조합 MG53 또는 비히클로 처리된 후, 유리 마이크로비드의 존재하에서의 진탕에 의해 손상되었다(흑색 막대). 막 손상은 488 nm에서 기록되는 비색 검정에 의해 기록되는 세포로부터의 LDH 방출에 의해 측정된다. 과량(5:1)의 포스파티딜세린(PS) 결합 단백질, 및 아넥신 V를 이용한 세포의 동시 처리. * p < 0.05
도 42: 인간 배아 구개 중간엽(HEPM) 치아 세포에서의 MG53의 발현. GFP-MG53은 상기 세포 유형에서 적절하게 국소화되고, 이는 또한 미소전극의 물리적 침투 또는 사포닌 세제를 이용한 처리에 의한 막 손상 후에 형질막으로 효과적으로 전위된다.
도 43: 인간 배아 구개 중간엽(HEPM) 치아 세포에서의 MG53의 발현. GFP-MG53은 상기 세포 유형에서 적절하게 국소화되고, 이는 또한 미소전극의 물리적 침투 또는 사포닌 세제를 이용한 처리에 의한 막 손상 후에 형질막으로 효과적으로 전위된다.
도 44: MG53에 대한 노출에 의해 방지된 HEPM 세포에서의 리포폴리사카라이드 유도 막 손상. HEPM 세포가 24시간 동안 LPS(1 mg/mL)로 처리되는 경우, LDH 방출이 관찰될 수 있고, 이는 막 손상이 발생한 것을 암시한다. MG53의 적용은 HEPM 세포로부터의 LDH 방출의 정상적인 수준을 방지할 수 있는 반면, LPS 및 MG53과의 공동 인큐베이션은 세포로부터의 LDH의 정상적인 방출을 나타낸다.
도 45: MG53은 위 세포에서 막 복구 부위로 전위된다. 인간 위 샘암종(AGS) 세포가 GFP-MG53으로 트랜스펙션된 후, 미소전극 바늘 침투(상부)에 의한 기계적 막 손상 또는 막을 투과화시키기 위한 0.005% 사포닌을 이용한 처리(하부)에 적용되었다. 손상 부위(화살표)로의 GFP-MG53의 전위가 살아있는 세포의 공초점 현미경에 의해 모니터되었다.
도 46: MG53은 신경 세포에서 막 복구 부위로 전위된다. 마우스 일차 별아교세포가 GFP-MG53으로 트랜스펙션된 후, 미소전극 바늘 침투(상부)에 의한 기계적 막 손상 또는 막을 투과화시키기 위한 0.005% 사포닌을 이용한 처리(하부)에 적용되었다. 손상 부위(화살표)로의 GFP-MG53의 전위가 살아있는 세포의 공초점 현미경에 의해 모니터되었다.
도 47: MG53은 기도 상피 세포에서 막 복구 부위로 전위된다. 인간 C38 기도 상피 세포가 GFP-MG53으로 트랜스펙션된 후, 미소전극 바늘 침투(상부)에 의한 기계적 막 손상 또는 막을 투과화시키기 위한 0.005% 사포닌을 이용한 처리(하부)에 적용되었다. 손상 부위(화살표)로의 GFP-MG53의 전위가 살아있는 세포의 공초점 현미경에 의해 모니터되었다.
도 48: 외부 MG53은 기도 상피 세포에서 막 손상을 재봉합한다. 인간 IB3 기도 상피 세포가 외부 재조합 인간 MG53 또는 비히클 대조군으로 처리된 후, 유리 비드에 의한 기계적 막 손상에 노출되었다. 막 손상이 488 nm에서 기록되는 비색 검정에 의해 기록되는 세포로부터의 LDH 방출에 의해 측정된다. * p < 0.05
도 49: MG53은 면역 세포에서 막 복구 부위로 전위된다. 마우스 백혈병 단핵구 대식세포(RAW 264.7)가 GFP-MG53으로 트랜스펙션된 후, 미소전극 바늘 침투(상부)에 의한 기계적 막 손상 또는 막을 투과화시키기 위한 0.005% 사포닌을 이용한 처리(하부)에 적용되었다. 손상 부위(화살표)로의 GFP-MG53의 전위가 살아있는 세포의 공초점 현미경에 의해 모니터되었다.
도 50: a) C2C12 세포에서 발현된 GFP-C29L 돌연변이(좌측 패널)는 명목(nominal) 유리 아연을 함유하는 세포외 용액 중에서 급성 손상 부위로의 결함이 있는 이동을 나타내었다(중앙 패널). 형질막을 통한 아연 유입을 위한 이온운반체로 작용하는 2 μM Zn-HPT의 첨가는 급성 손상 부위로의 GFP-C29L의 이동을 부분적으로 구제할 수 있다(우측 패널). 우측 패널에 제시된 이미지는 세포외 용액에 존재하는 2 μM Zn-HPT와 함께 미소전극을 이용한 침투 50초 후에 개별적 C2C12 세포로부터 수득되었다. b) C2C12 세포에서 발현된 GFP-C105S 돌연변이(좌측 패널)는 명목 유리 아연을 함유하는 세포외 용액 중에서 미소전극 침투 후에 급성 손상 부위로 이동할 수 없었다(중앙 패널). c) C2C12 세포에서 발현된 GFP-C29L/C105S 이중 돌연변이(좌측 패널)는 명목 유리 아연(중앙 패널)을 갖는 조건하 또는 2 μM Zn-HPT의 첨가(우측 패널) 후에 급성 막 손상의 복구에서 완전히 결함이 있었다.
도 51: C2C12 세포에서의 급성 막 손상의 복구에서의 아연 유입에 대한 C29L, C105S 및 C29L/C105S의 의존성에 대한 요약 데이터. MG53의 다른 돌연변이를 이용한 데이터가 표 1에 요약되어 있다.
도 52: MG53에 의해 매개되는 막 복구의 메커니즘에 대한 본 발명자의 현재의 가설을 입증하는 예시. 임의의 특정한 이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 실험적 증거는 MG53이 이의 포스파티딜세린 함유 소포와의 결합으로 인해 형질막의 내부 표면에 국소화되는 것을 나타낸다. 정상 조건하에서, MG53은 단량체인 것으로 보이며, 카베올린-3와의 결합으로 인해 막 표면에 인접하여 격리된다. 세포막에 대한 손상 후, 보통 환원형 형태로 존재하는 MG53은 이황화물 교차결합(cross-bridge)의 형성 및 분자간 MG53 올리고머화를 촉발시키는 국소화된 산화 환경에 노출된다. MG53의 올리고머화는 손상 부위에서 함께 포스파티딜세린 함유 소포를 발생시킨다.
상세한 설명
본 명세서는 모든 목적상 WO 2008/054561호; 문헌[Cai et al., MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nature Cell Biol ., 11 (1): p_ - _ (January 2009); 및 Cai et al., MG53 regulates membrane budding and exocytosis in muscle cells. Journal of Biological Chemistry ,, published online November 24, 2008]의 전체내용을 참조로서 본원에 포함한다.
본 발명은 부분적으로 세포막의 복구를 촉진할 수 있는 재조합 핵산 서열 및 관련 폴리펩티드(서열 목록 번호:1-15 참조)의 놀랍고도 예기치 않은 발견에 관한 것이다. 특히, 본 발명자는 급성 막 복구 동안의 소포 융합이 신규한 근육 특이적 트리파타이트(tri-partite) 모티프(TRIM) 패밀리 단백질인 mitsugumin53(MG53)(서열 목록 번호:1-15)에 의해 유도되는 것을 발견하였다. MG53 발현은 형질막으로의 세포내 소포 이동 및 형질막과의 융합을 촉진한다.
동적 막 복구는 세포 온전성의 장기간의 유지 뿐만 아니라 급성 세포 손상으로부터의 회복에 필수적이다. 세포막의 복구는 형질막에서의 소포의 축적과 관련된 세포내 소포 이동을 필요로 한다. 세포막의 급성 손상은 손상 부위에서 막을 패치(patch)시키기 위한 MG53-함유 소포의 점증을 야기시킨다. MG53가 존재하지 않는 세포는 레이저 유도 손상, 운동에 의해 유도된 근육 손상, 및 피로 후의 근육 수축 기능의 절충 회복(compromised recovery)을 포함하는 다양한 스트레스에 대한 반응에서 막 복구에 결함을 나타낸다. 따라서, MG53은 세포막의 급성 복구 및 리모델링에 기초가 되는 소포 이동 사건의 중요 구성요소이다.
본 발명에 의해 포함되는 생체중합체 조성물은 본원에서 "MG53 핵산" 또는 "MG53 폴리누클레오티드" 또는 "막 복구 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산" 또는 "막 복구 단백질 핵산"으로 집합적 및 상호교환적으로 언급되고, 상기 대응하여 엔코딩된 폴리펩티드는 "MG53 폴리펩티드" 또는 "MG53 단백질" 또는 "막 복구 폴리펩티드"로 언급된다. 달리 언급되지 않는 경우, "MG53"은 일반적으로 본원에 명백하거나, 암시적이거나, 본질적으로 기재된 바와 같이 임의의 MG53 관련 생체중합체 및/또는 MG53-유도 생체융합체를 의미하는 것으로 사용된다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같은 "막 복구 폴리펩티드" 및 "막 복구를 촉진하는 폴리펩티드"는 본 발명의 폴리펩티드 및 이의 생물학적 활성을 의미하는 것으로 상호교환적으로 사용된다.
달리 정의되지 않는 경우, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 양립되지 않는 경우, 정의를 포함하는 본 발명의 명세서가 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시이며, 제한하고자 함이 아니다.
외부 손상 및 내부 변성에 대해, 신체의 세포는 이의 기능 및 유기체의 건강을 유지하기 위해 각각의 개별적 세포를 둘러싸는 막을 복구해야 한다. 외부 막을 복구하는 세포의 능력의 결함은 많은 질병, 예를 들어, 신경변성 질병(파킨슨병), 심장 발작, 심부전 및 근육 퇴행위축과 관련이 있다. 또한, 다양한 질병 뿐만 아니라 일반적인 노화 과정과 관련된 근 무력 및 위축증이 변화된 막 복구와 관련이 있다. 또한, 막 손상은 만성 질병 외의 많은 다른 병리 상태에서 발생한다. 당뇨 및 다른 건강한 환자에서의 UV 노출, 약간의 상처, 피부 찰과상, 외과적 절제 및 궤양으로 인한 피부 노화는 모두 세포막에 대한 손상의 일부 구성요소를 수반한다. 상기 세포가 급성 손상에 대해 막을 복구하기 위해, 이들은 소포로 언급되는 세포의 내부에 존재하는 막의 작은 패킷을 이용한다. 이러한 소포는 일반적으로 세포 내에서 발견되나, 세포막에 대한 손상시, 이러한 소포는 손상 부위로 이동하고, 세포 온전성을 유지하기 위해 패치를 형성한다. 이러한 필수적인 기능 없이는, 세포는 사멸하고, 상기 세포 손상의 축적 효과는 결국 조직 또는 기관의 기능이상을 일으킨다. 본 발명이 세포 손상의 유해한 효과를 치료하고/하거나 방지하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이 계획된다.
상기 기재된 바와 같이, 특정 양태에서, 본 발명은 단독으로 또는 다른 성분과 조합하여 광범위한 세포 및 조직 유형에서 세포막 재봉합의 과정을 조절할 수 있는 본 발명의 핵산 및 이러한 핵산으로부터 엔코딩된 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 조성물, 예를 들어, 폴리펩티드, 세포질 폴리펩티드, 핵 폴리펩티드, 막 결합 폴리펩티드 및 분비 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산; 뿐만 아니라 벡터, 숙주 세포, 항체, 재조합 단백질, 슈도펩티드, 융합 단백질, 화학적 화합물, 및 이를 생성하기 위한 방법에 관한 것이다.
예를 들어, 특정 양태에서, 본 발명은 함께 조합되는 경우 본원에 기재된 바와 같은 막 복구 활성을 갖는 폴리펩티드를 발생시키는 아미노산 및/또는 펩티드 성분(즉, 구조적 성분 또는 아미노산 도메인)의 조합물을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산을 포함한다. 본 발명의 상기 양태의 한 구체예에서, 상기 성분은 RING 핑거 아연 결합 도메인, B-박스 도메인, 류신 지퍼 코일드-코일 도메인, 인지질 결합 도메인, 산화환원 민감성 아미노산, E3-리가아제 도메인, 및 SPRY 도메인을 포함하고, 여기서 상기 성분은 단일한 폴리펩티드에서 연속적으로 공유 결합되고, 상기 폴리펩티드는 세포막 복구를 촉진한다. 각각의 아미노산 또는 펩티드 도메인을 엔코딩하는 핵산은 임의의 요망되는 모(parental) 유전자로부터 클로닝될 수 있고, 표준 분자 생물학적 기술을 이용하여 단일하게 연속적으로 조합될 수 있다. 추가 구체예에서, 본 발명은 유전자를 발현시킴으로써 형성된 신규한 막 복구 폴리펩티드, 또는 TRIM 패밀리의 다른 일원, 예를 들어, (등록 번호) TRIM1(NM_012216, NM_052817); TRIM2(AF220018); TRIM3(AF045239); TRIM4(AF220023); TRIM5(AF220025); TRIM6(AF220030); TRIM7(AF220032); TRIM8(AF281046); TRIM9(AF220036); TRIM10(Y07829); TRIM11(AF220125); TRIM13(AF220127, NM_001007278); TRIM14(NM_014788, NM_033221); TRIM15(NM_033229); TRIM16(AF096870); TRIM17(AF156271); TRIM18(AF230976, AF230977); TRIM19(NM_033244, NM_033250, NM_033240, NM_033239, NM_033247, NM_002675, NM_033246, NM_033249, NM_033238); TRIM20(NM_000243); TRIM21(NM_003141); TRIM22(NM_006074); TRIM23(NM_033227, NM_001656, NM_033228); TRIM24(NM_003852, NM_015905); TRIM25(NM_005082), TRIM26(NM_003449); TRIM27(AF230394, AF230393); TRIM28(NM_005762); TRIM29(AF230388); TRIM31(AF230386); TRIM32(NM_012210); TRIM33(AF220136); TRIM34(NM_130390, NM_001003827, NM_130389, NM_001003819); TRIM35(AB029021); TRIM36(AJ272269); TRIM37(AB020705); TRIM38(U90547); TRIM39(NM_021253, NM_172016); TRIM40(AF489517); TRIM41(NM_033549, NM_201627); TRIM42(AF521868); TRIM43(NM_138800); TRIM44(NM_017583); TRIM45(NM_025188); TRIM46(NM_025058); TRIM47(AY026763); TRIM48(AF521869); TRIM49(NM_020358); TRIM50(AY081948); TRIM51(NM_032681); TRIM52(NM_032765); TRIM53(XR_016180); TRIM54(NM_032546, NM_187841); TRIM55(NM_184087, NM_184085, NM_184086, NM_033058); TRIM56(NM_030961); TRIM57(즉, TRIM59); TRIM58(NM_015431); TRIM59(NM_173084); TRIM60(NM_152620); TRIM61(XM_373038); TRIM62(NM_018207); TRIM63(NM_032588); TRIM64(XM_061890); TRIM65(NM_173547); TRIM66(XM_001716253); TRIM67(NM_001004342); TRIM68(NM_018073); TRIM69(AF302088); TRIM70(DQ232882, NM_001037330); TRIM71(NM_001039111); TRIM72(즉, MG53; NM_001008274); TRIM73 (AF498998); TRIM74(NM_198853); TRIM75(XM_939332)으로부터의 아미노산 또는 펩티드 성분을 엔코딩하는 누클레오티드를 조합시킴으로써 형성된 cDNA 작제물을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 RING 핑거 아연 결합 도메인, B-박스 도메인, 류신 지퍼 코일드-코일 도메인, 인지질 결합 도메인, 산화환원 민감성 아미노산, E3-리가아제 도메인, SPRY 도메인, 및 임의로 칼슘 결합 도메인을 갖는, 본 발명의 핵산에 의해 엔코딩된 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드를 포함하고, 상기 성분은 단일한 폴리펩티드에서 연속적으로 공유 결합되고, 상기 폴리펩티드는 세포막 복구를 촉진한다.
본 발명의 기재는 막 복구를 촉진할 수 있는 폴리펩티드를 생성시키기 위해 중요한 아미노산 구조 성분 또는 특징을 강조한다(즉, RING 핑거 아연 결합 도메인, B-박스 도메인, 류신 지퍼 코일드-코일 도메인, 인지질 결합 도메인, 산화환원 민감성 아미노산, E3-리가아제 도메인, SPRY 도메인). 비록 RING 핑거 아연 결합 도메인, B-박스 도메인, 류신 지퍼 코일드-코일 도메인, 인지질 결합 도메인, 산화환원 민감성 아미노산, E3-리가아제 도메인, SPRY 도메인, 및 칼슘 결합 도메인이 상기 기재된 바와 같이 진화적으로 관련된 단백질 뿐만 아니라 관련되지 않은 단백질 사이에서 다양할 수 있으나, 상기 구조적 성분 또는 도메인 중 하나 또는 전부를 함유하는 MG53을 포함하는 TRIM 패밀리에 속하는 다수의 유전자가 존재하는 것을 인지하는 것이 중요하다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 이러한 도메인은 신규한 단백질을 생성시키기 위해 분자생물학에서 널리 공지된 기술을 이용하여 TRIM 패밀리 일원의 유전자 또는 cDNA로부터 용이하게 클로닝되고, 또 다른 TRIM 패밀리 유전자(즉, MG53)의 프레임워크로 이식되거나 클로닝될 수 있다. 또한, 진화적으로 보존된 아미노산 서열이 유사하게 기능할 것이라는 것이 일반적으로 인지되므로, 즉각적인 교시내용에 따라 추가 단백질을 생성시키고, 과도한 실험 없이 막 복구를 촉진하는 재조합 단백질의 능력을 평가하는 것은 당업자의 능력에 속한다. 이와 같이, 예를 들어, 상기에서 확인된 것과 같은 TRIM 패밀리 일원의 도메인으로부터 어셈블리된 재조합 단백질이 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 명백히 간주된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 목록 번호:1, 3, 5, 7, 8, 9-15에 나열된 MG53 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산, 및/또는 이의 동족체 또는 단편을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 세포막 복구를 촉진한다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 막을 조절할 수 있는 하나 이상의 다른 작용제와 조합된 본 발명의 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 상기 작용제는 본 발명의 폴리펩티드와의 직접 또는 간접적인 상호작용을 통해 상승작용적으로 작용하여 세포막 복구를 촉진한다. 예를 들어, 본원에서 입증된 바와 같이, 작용제, 예를 들어, 포스파티딜세린, 아연, 산화제, 및 식물 추출물은 본 발명의 폴리펩티드의 막 복구 활성을 조절할 수 있다(실시예 참조). 따라서, 추가 구체예에서, 본 발명에 의해 포함되는 임의의 막 복구 폴리펩티드 함유 조성물은 또한 유효량의 인지질; 아연 함유 작용제; 산화제; 식물 추출물 또는 이의 조합물 중 하나 이상을 조합하여 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 인지질은 포스파티딜세린이다. 추가 구체예에서, 아연 함유 작용제는 아연 이온운반체, 예를 들어, Zn-1-히드록시피리딘-2-틴(Zn-HPT)이다. 다른 구체예에서, 산화제는 티메로살이다. 추가 구체예에서, 식물 추출물은 노토진싱 추출물이다.
특정 추가 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 조합된 본 발명의 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 추가 구체예에서, 조성물은 유효량의 인지질; 아연 함유 작용제; 산화제; 식물 추출물 또는 이의 조합물 중 하나 이상을 조합하여 추가로 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 인지질은 포스파티딜세린이다. 추가 구체예에서, 아연 함유 작용제는 아연 이온운반체, 예를 들어, Zn-1-히드록시피리딘-2-틴(Zn-HPT)이다. 다른 구체예에서, 산화제는 티메로살이다. 추가 구체예에서, 식물 추출물은 노토진싱 추출물이다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드가 많은 다양한 세포 유형 및 조직에서 막을 패치할 수 있다는 놀랍고도 예기치 않은 발견에 관한 것이다. 임의의 특정 이론으로 한정하고자 하는 바는 아니지만, 복구 메커니즘은 류신 지퍼 단백질-단백질 상호작용 모티프를 함유하는 단백질 내의 코일드-코일 도메인을 통한 폴리펩티드 올리고머, 예를 들어, 이합체의 형성에 의해 매개되는 것으로 생각된다.
가장 놀라운 발견 중 하나는 본 발명의 폴리펩티드의 막 복구 활성이 급성 막 손상 후에 세포외 칼슘의 유입에 단지 약간 의존한다는 것이다. 이는 세포외 칼슘 유입이 세포막 복구에 대한 유일한 신호라는 당 분야의 현재의 패러다임과 상반된다. 본 발명의 결과는 칼슘 유입이 아니라, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, MG53의 막 복구 활성이 주로 산화적 세포외 환경의 세포 구획 내의 환원 환경으로의 유입에 의해 유도되는 것을 나타낸다. 상기 메커니즘은 막 복구 폴리펩티드가 세포 산화환경 상태의 센서로 작용하고, 세포막의 특정 지질 성분과의 상호작용에 의해 형질막에서 상동성 복합체를 형성시키기 위해 올리고머화되는 것을 가능케 한다. 예를 들어, 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 아연(Zn)이 MG53-매개 막 재봉합에 필요하고, 추가 Zn의 존재는 MG53의 활성을 개선시킬 수 있고; 식물 노토진셍으로부터의 추출물이 또한 막 재봉합에서 MG53의 기능을 개선시킬 수 있고; MG53은 급성 손상 후 막 복구를 생성시키기 위해 내인성 E3-리가아제 활성을 필요로 한다.
본 발명의 추가 양태는 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53의 세포외 적용 또는 투여가 또한 막 재봉합을 촉진할 수 있다는 놀라운 발견에 관한 것으로, 이는 세포 침투 펩티드, 예를 들어, HIV-TAT 단백질(참조로서 본원에 포함되는 WO 2008/054561호 참조)와의 커플링이 재조합 MG53이 효과적인 치료제로 기능하는데 필요하지 않을 수 있다는 것을 암시한다. 이와 같이, 상기 양태의 특정 구체예는 약학적으로 허용되는 담체와 조합된 본 발명의 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53을 포함하는 치료 조성물을 포함하고, 여기서 상기 치료 조성물은 전신 투여되고, 상기 전신 투여된 조성물은 막 복구를 촉진하는데 있어서 효과적이다.
특정한 추가 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물은 본 발명의 막 복구 폴리펩티드와 조합된, 본 발명의 폴리펩티드의 막 복구에 대한 상승작용적 효과를 갖는 인지질; 아연 함유 작용제; 산화제; 식물 추출물 또는 이의 조합물을 포함하는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함한다. 추가 구체예에서, 본 발명의 치료제는 진통제, 제산제, 항불안 약물, 항부정맥제, 항균제, 항생제, 항응고제 및 항혈전용해제, 항경련제, 항우울제, 지사제, 진토제, 항진균제, 항히스타민제, 항고혈압제, 항염증제, 항신생물제, 항정신병제, 해열제, 항바이러스제, 바르비튜레이트, 베타-차단제, 기관지확장제, 저온 경화제(Cold Cures), 코르티코스테로이드, 진해제, 세포독성제, 충혈제거제, 이뇨제, 거담제, 호르몬, 혈당강하제(경구), 면역억제제, 설사제, 근육이완제, 진정제, 성 호르몬, 수면성 약물, 신경안정제, 비타민 또는 이의 조합물과 같은 하나 이상의 생물학적 활성 성분을 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 세포의 세포막 손상을 치료하고/하거나 예방하기 위해 유효량의 막 복구 폴리페티드, 예를 들어, MG53을 엔코딩하는 핵산, 이의 동족체, 단편 및 유도체를 개체에 투여하는 방법에 관한 것이다. 본원에 입증된 바와 같이, 본 발명의 막 복구 폴리펩티드는 광범위한 세포 및 조직 유형에서 막 복구를 촉진할 수 있고, 절충 막 투과성과 관련된 다수의 장애에 대한 효과적인 치료 접근법을 제공할 수 있다. 특정 구체예에서, 세포는, 예를 들어, 섬유모세포, 다양한 기원의 상피 세포(난소, 신장 등), 신경 세포, 각질세포, 치아 세포, 위 세포, 면역세포, 골격근 및 심근 세포를 포함한다. 임의의 세포 및 조직 유형에서 실질적으로 세포막 복구를 촉진하는 능력은 본 발명의 교시내용에 따라 용이하게 결정된다. 또한, 당업자는 이러한 구체예가 본 발명자의 소유이며, 복구 활성에 대해 검정하는 능력이 본 발명의 교시내용에 비추어 당업자의 기술 범위 내에 속하며, 과도한 실험을 필요로 하지 않음을 인지할 것이다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 조합된 유효량의 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53을 엔코딩하는 핵산, 또는 이의 동족체, 단편 또는 유도체, 또는 막 복구 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하여 세포 또는 조직 손상과 관련된 질병 또는 병리 질환을 치료하고/하거나 예방하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 조성물은 세포 또는 조직 손상을 치료하고/하거나 예방하는데 효과적이다. 특정 구체예에서, 세포 또는 조직 손상과 관련된 질병 또는 병리 질환은 근육퇴행위축, 심장 허혈, 심부전, 노화 변성, 신경변성, 패혈증, 세균 감염, 치은염, 치은퇴축, 치주병, 주름 보호, 피부 찰과상, UV 손상, 질소 머스터드(화학적 수포제), 궤양, COPD, 상처 치유, 노인 의학, 항염증제, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드는 하기에 추가로 상세히 기재되는 바와 같이 임의의 약학적으로 허용되는 형태, 및 임의의 약학적으로 허용되는 경로로 전달되거나 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 전신 전달되거나, 세포막 손상의 치료 및/또는 예방을 위한 세포 또는 조직에 직접 투여될 수 있다. 특정 추가 구체예에서, 본 발명의 핵산 및/또는 폴리펩티드는 생체이용율을 개선시키거나, 약물 반감기를 증가시키거나, 특정 세포 또는 조직 유형에 치료제를 표적화시키거나, 이의 조합으로 작용하는 담체 부분을 포함한다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 분리된 막 복구 폴리펩티드 복합체 또는 재조합 막 복구 폴리펩티드 복합체에 관한 것이다. 하기에 상세히 제시되는 바와 같이, MG53 폴리펩티드는 다수의 다른 세포 단백질과 상호작용(예를 들어, 비공유적으로 결합)하고 복합체를 형성하는 능력을 입증한다. 상기 양태의 한 구체예에서, 본 발명은 CSN6, 키네신, 카베올린-3, 페리악신 및 수초 염기성 단백질 중 하나 이상과 조합된 분리된 막 복구 폴리펩티드 또는 재조합 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53, 또는 이의 동족체, 단편 및 유도체를 포함하고, 여기서 상기 조합물은 단백질 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 세포막 복구를 촉진할 수 있다. 본 발명은 CSN6, 키네신, 카베올린-3, 페리악신 및 수초 염기성 단백질 중 하나 이상과의 단백질 복합체 형태의 유효량의 분리된 막 복구 폴리펩티드 또는 재조합 막 복구 폴리펩티드를 세포에 투여하는 것을 포함하여 세포 손상을 치료하거나 예방하는 방법을 추가로 포함하고, 여기서 상기 복합체는 세포막 복구를 촉진할 수 있다. 또 다른 추가 구체예에서, 본 발명은 CSN6, 키네신, 카베올린-3, 페리악신 및 수초 염기성 단백질 중 하나 이상과의 단백질 복합체 형태의 유효량의 분리된 막 복구 폴리펩티드 또는 재조합 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53을 개체에 투여하는 것을 포함하여 세포 또는 조직 손상과 관련된 질병 또는 병리 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 포함하고, 여기서 상기 복합체는 상기 질병 또는 병리 질환의 결과를 개선시킬 수 있다.
MG53의 활성을 조절하는 방법은 CSN6, 키네신, 카베올린-3, 페리악신, 수초 염기성 단백질 또는 이의 조합물 중 하나 이상의 발현 수준 또는 활성 또는 발현 수준 및 활성 둘 모두를 조절하는 것을 포함한다.
또 다른 추가 양태에서, 본 발명은 MG53, CSN6, 키네신, 카베올린-3, 페리악신, 수초 염기성 단백질 또는 이의 조합물과 시험 화합물을 접촉시키고; 시험 화합물의 결합, 및/또는 CSN6, 키네신, 카베올린-3, 페리악신, 수초 염기성 단백질의 활성을 측정하고/하거나, 세포막 복구에 대한 효과를 측정함으로써 세포막 복구를 조절하는 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
하기 상세히 기재되고, 당업자에 의해 용이하게 인지되는 바와 같이, 재조합 막 복구 폴리펩티드는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포에서 생성된 후, 대량의 기능성 단백질을 생성시키는 접근법인 단백질 공학처리를 통해 세포외 용액으로 분비될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 또한 세포 및/또는 조직 손상과 관련된 질병 및 장애를 치료하고 예방하기 위한 치료제로서 유용한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 치료 조성물은 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 폴리펩티드, 및 MG53 폴리펩티드, 예를 들어, 서열 목록 번호:1의 단백질 및 MG53 폴리펩티드 돌연변이를 엔코딩하는 핵산, 및 이의 동족체, 단편, 트렁케이션, 슈도펩티드, 펩티드 유사체, 및 펩티도미메틱(본원에서, "MG53 폴리펩티드"), 뿐만 아니라 MG53의 활성 또는 MG53와 다른 단백질, 예를 들어, CSN6, 키네신, 카베올린-3(서열 목록 번호:8), 페리악신 및 수초 염기성 단백질의 분자간 상호작용을 조절할 수 있는 화합물을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, MG53은 세포막에 대한 손상의 복구를 매개하고, 이에 따라 MG53 유전자 발현, 폴리펩티드 합성, 활성 또는 단백질-단백질 상호작용을 표적화하고 조절하는 것은 조직 복구를 위한 신규한 치료적 시술이 된다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 세포막의 복구를 촉진할 수 있는 아미노산 성분 또는 도메인을 포함하는 폴리펩티드 조성물의 발견에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 이러한 양태의 구체예는 RING 핑거 아연-결합 도메인, B-박스 아연 결합 도메인, 류신 지퍼 코일드-코일 도메인, 인지질 결합 도메인, 산화환원 민감성 아미노산, E3-리가아제 도메인, SPRY 도메인, 및 칼슘 결합 도메인을 포함하는 특정 아미노산 성분을 포함하는 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 성분은 단일 폴리펩티드에서 연속적으로 공유 결합되고, 상기 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 막 복구 활성을 상승작용적으로 조절하는 작용제와 조합하여 세포막 복구를 촉진한다. 특정 구체예에서, 조절제는 인지질, 예를 들어, 포스파티딜세린; 아연, 예를 들어, 아연 염, 아연 담체 또는 아연 컨쥬게이트 형태의 아연; 노토진싱; 산화제 또는 이의 조합물을 포함한다.
특정 추가 양태에서, 본 발명은 조직 손상의 치료와 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정한 예시적 구체예에서, 본 발명은, 예를 들어, 세포막 손상의 예방 및/또는 치료; 상처 치유; 외과적 외상의 개선, 노화 과정의 자연적 부작용으로 발생하는 조직 복구에서의 연령 관련 결함의 치료 및/또는 예방; 심혈관병을 가진 피검체에서 발생하는 손상 및/또는 스포츠-관련 손상과 같은 임의의 유형의 근육 조직에 대한 손상의 치료 및/또는 예방; 근육퇴행위축, 심장 허혈, 심부전, 노화 변성, 신경변성, 패혈증, 세균 감염, 치은염, 치은퇴축, 치주병, 주름 보호, 피부 찰과상, UV 손상, 질소 머스터드(화학적 수포제), 궤양, COPD, 상처 치유, 노인 의학, 항염증제, 또는 이의 임의의 조합의 치료 및/또는 예방; 뿐만 아니라 화장품 또는 생활 용품 사용을 통한 신체 조직의 복구 및 재생을 위한 유효량의 본 발명의 치료 조성물의 투여를 포함한다.
또한, 본 발명은 MG53 상호작용 단백질, 예를 들어, CSN6, 키네신, 카베올린-3(서열 목록 번호:8), 페리악신, 및 수초 염기성 단백질, 돌연변이, 트렁케이션, 단편, 동족체, 슈도펩티드 및 펩티도미메틱을 엔코딩하는 간섭 핵산을 포함하는 핵산 및 폴리펩티드, 뿐만 아니라 MG53 상호작용 단백질의 활성 또는 MG53과의 분자간 상호작용을 조절할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 피검체의 질병 또는 장애의 치료 및/또는 예방, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 조직 복구의 촉진을 위해 CSN6, 키네신, 카베올린-3(서열 목록 번호:8), 페리악신, 및 수초 염기성 단백질 유전자 발현, 활성 및/또는 분자간 상호작용을 조절하는 방법을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 구체예에서, 치료 조성물은 본원에 기재되거나 당 분야에 통상적으로 공지된 바와 같은 임의의 적합한 약학적 형태로 투여될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 막 복구 폴리펩티드 분자를 엔코딩하는 분리된 핵산, 예를 들어, MG53 핵산 분자, 및 서열 목록 번호:2, 4 및 6에 기재된 핵산과 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 막 복구 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 엄격한 조건하에서 막 복구 핵산 서열의 단백질-코딩 서열을 포함하는 핵산 분자에 상보적인 핵산 서열에 하이브리드될 것이다. 본 발명은 또한 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산, 또는 이의 단편, 동족체, 유사체, 융합 단백질, 슈도펩티드, 펩티도미메틱 또는 유도체를 엔코딩하는 분리된 핵산을 포함한다. 예를 들어, 핵산은 서열 목록 번호:1, 3, 5, 7, 8 및 9-15의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 대해 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩할 수 있다. 핵산은, 예를 들어, 서열 목록 번호:2, 4 및 6 중 임의의 서열의 핵산 서열을 포함하는 유전체 DNA 단편 또는 cDNA 분자일 수 있다.
올리고누클레오티드, 예를 들어, 막 복구 핵산, 예를 들어, MG53 핵산(예를 들어, 서열 목록 번호:2, 4 및 6)의 6개 이상의 연속적인 누클레오티드를 포함하는 올리고누클레오티드 또는 이의 상보체가 또한 본 발명에 포함된다.
실질적으로 정제된 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 폴리펩티드(서열 목록 번호:1, 3, 5, 7, 8 및 9-15)가 본 발명에 또한 포함된다. 특정 구체예에서, 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 폴리펩티드는 인간 MG53 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열 목록 번호:1)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 폴리펩티드 또는 이의 단편, 동족체, 유사체, 슈도펩티드, 펩티도미메틱 또는 유도체에 면역선택적으로 결합하는 항체가 특징을 이룬다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료적 또는 예방적으로 효과적인 양의 치료적으로 허용되고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물을 포함한다. 치료제는 핵산, 예를 들어, MG53 핵산, 예를 들어, 펩티드 핵산, cDNA, 또는 RNA, 예를 들어, 작은 억제 RNA; 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53; 또는 MG53 폴리펩티드에 특이적인 항체일 수 있다. 한 추가 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 용기 내에 치료적 유효량 또는 예방적 유효량의 상기 약제 조성물을 포함한다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 DNA에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 발현을 가능케 하는 조건하에서 막 복구 폴리펩티드를 엔코딩하는 내인 또는 외인적으로 발현된 핵산, 예를 들어, MG53 핵산을 포함하는 세포를 배양함으로써 폴리펩티드를 생성하는 방법을 포함한다. 요망시, 폴리펩티드는 이후에 회수될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 외인성 프로모터의 업스트림 또는 다운스트림에 배치된 막 복구 폴리펩티드를 엔코딩하는 내인성 핵산, 예를 들어, MG53 핵산을 함유하는 세포를 배양함으로써 폴리펩티드를 생성하는 방법을 포함한다. 특정 구체예에서, 외인성 프로모터는 상동 재조합, 가닥 절단(strand break) 또는 미스매치 복구 메커니즘을 통해 숙주세포의 유전체로 통합된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 샘플 내에서 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 상기 방법에서, 샘플은 폴리펩티드와 화합물 사이에 복합체를 형성하게 하는 조건하에서 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 화합물과 접촉된다. 복합체는 존재시 검출됨으로써, 샘플 내에서 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 폴리펩티드가 확인된다.
본 발명은 또한 막 복구 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산, 예를 들어, MG53 핵산, 막 복구 폴리펩티드 또는 이의 관련 융합 폴리펩티드의 발현에 기초하여 특이적 세포 또는 조직 유형을 확인하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 본 발명은 "태그(tag)" 또는 인디케이터(indicator) 부분 및 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 부분을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 특정 양태에서, 태그 또는 인디케이터 부분은 정제 목적에 적합화된 펩티드, 예를 들어, FLAG 태그, 6xHis 태그, 말토오스-결합 단백질(MBP) 태그 등일 수 있다. 다른 양태에서, 태그 펩티드는 항체 에피토프 또는 형광 펩티드와 같은 신호를 제공하기에 적합화된 펩티드를 포함한다. 또 다른 양태는 세포막을 가로지르는 세포하 국소화 또는 전위를 매개하기에 적합화된 펩티드, 예를 들어, 세포 침투를 촉진시키는 HIV 바이러스로부터의 TAT 융합 단백질 또는 특정 세포 소기관으로 MG53를 커플링시키는 변형된 세포 국소화 태그와 MG53의 융합체를 포함한다.
샘플과 핵산 프로브 또는 프라이머를 접촉시키고, 이러한 핵산 프로브 또는 프라이머가 샘플 내의 막 복구 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산, 예를 들어, MG53 핵산 분자에 결합했는지의 여부를 검출함으로써 샘플 내의 본 발명의 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법이 또한 본 발명에 포함된다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 폴리펩티드의 활성을 조절하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 MG53 폴리펩티드를 포함하는 세포 샘플과 MG53 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 상기 폴리펩티드의 활성을 조절하는데 충분한 양으로 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 화합물은, 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같은, 예를 들어, 소분자, 예를 들어, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티도미메틱, 탄수화물, 지질 또는 기타 유기(탄소 함유) 또는 무기 분자일 수 있다.
또한 본 발명의 영역내에는 장애 또는 증후군, 예를 들어, 심혈관 질환, 심장근육병(cardiomyopathy), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압, 선천성심장병(congenital heart defects), 대동맥판협착증(aortic stenosis), 심방 중격 결손증(atrial septal defect, ASD), 심방심실 (A-V) 중격 결손증(atrioventricular (A-V) canal defect), 동맥관(ductus arteriosus), 폐동맥협착증(pulmonary stenosis), 대동맥하 협착증(subaortic stenosis), 심실중격결손(ventricular septal defect, VSD), 판막 질환(valve diseases), 고응고(hypercoagulation), 혈우병(hemophilia), 궤양(ulcers), 상처(wounds), 병변(lesions), 자상(cuts), 찰과상(abrasions), 산화적 손상(oxidative damage), 연령 관련 조직 변성(age-related tissue degeneration), 수술적으로 관련된 병변(surgically related lesions), 화상(burns), 근육 쇄약(muscle weakness), 근육 위축증(muscle atrophy), 결합 조직 장애(connective tissue disorders), 특발성 혈소판 감소성 자반병(idiopathic thrombocytopenic purpura), 심부전, 심부전과 고혈압증에 기인하는 부수적 건강이상(pathologies), 저혈압, 협심증(angina pectoris), 심근경색증, 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 피부경화증(scleroderma), 이식(transplantation), 자가 면역 질환, 홍반성 루푸스(lupus erythematosus), 바이러스/세균/기생충 감염증, 다발성 경화증, 자가 면역 질환, 알레르기, 면역 결핍, 이식편대숙주질환, 천식, 기종(emphysema), ARDS, 염증과 면역 반응의 변동(modulation), 바이러스성 발병(viral pathogeneis), 연령 관련 장애, Th1 염증성 질환, 예를 들어, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장질환, AIDS, 상처 회복, 심장 마비, 심부전, 근이영양증, 욕창(bed sores), 당뇨병성 궤양, 산화적 손상, 및 조직 손상, 예를 들어, 정맥동염(sinusitis) 또는 점막염(mucositis), 주름, 습진 또는 피부염, 건조한 피부, 비만, 당뇨병, 내분비 장애, 식욕 부진(anorexia), 대식증(bulimia), 신동맥 협착(renal artery stenosis), 간질성 신장염(interstitial nephritis), 사구체신염(glomerulonephritis), 다낭신 병(polycystic kidney disease), 전신성이고 신장의 관형 아시도시스(acidosis), IgA 신병증, 신장병(nephrological disesases), 고칼슘혈증(hypercalceimia), 레쉬나이한 증후군(Lesch-Nyhan Syndrome), VHL(Von Hippel-Lindau) 증후군, 외상, 재생(시험관내 및 생체내), 히르쉬스프룽(Hirschsprung) 질환, 크론병, 충수염(appendicitis), 자궁 내막증(endometriosis), 후두염(laryngitis), 건선, 자외선 각화증(actinic keratosis), 여드름, 모발 성장/손실, 탈모(allopecia), 색소침착증(pigmentation disorder), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 알파-만노시도시스(alpha-mannosidosis), 베타-만노시도시스(beta-mannosidosis), 다른 저장 장애, 퍼옥시좀(peroxisomal) 장애, 예를 들어, 젤웨거(zellweger) 증후군, 소아의 레프섬 질환(infantile refsum disease), 근형부 연골 형성부전(rhizomelic chondrodysplasia)(점상 연골 형성이상(chondrodysplasia punctata), rhizomelic), 및 고피페콜성 산혈증(hyperpipecolic acidemia), 골다공증(osteoporosis), 근육 장애, 요폐(urinary retention), 올브라이트 유전성 골형성이상(Albright Hereditary Ostoeodystrophy), 궤양, 알츠하이머병, 뇌졸중(stroke), 파킨슨병, 헌팅톤병, 뇌성마비(cerebral palsy), 간질(epilepsy), 레쉬-니아 증후군(Lesch-Nyhan syndrome), 다발성 경화증, 모세혈관 확장성 운동실조증(ataxia-telangiectasia), 행동 장애, 중독(addiction), 불안(anxiety), 통증(pain), 신경보호(neuroprotection), 뇌졸중(Stroke), 무수정체(Aphakia), 신경변성 장애, 신경학적 장애, 발달 결함(developmental defects), 뇌 및 케모카인 수용체의 조절에 있어서 GRK2의 역할과 연관된 질환, 뇌척수염(encephalomyelitis), 불안, 정신분열증, 조울병(manic depression), 섬망(delirium), 치매(dementia), 심각한 정신 지체(severe mental retardation) 및 운동이상증(dyskinesias), 투렛 증후군(Gilles de la Tourette Syndrome), 백질영양증(leukodystrophies), 암, 유방암, CNS 암, 결장암, 위암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 신장암, 대장암, 전립선암, 신경아세포종(neuroblastoma), 및 자궁경부암; 신생물(neoplasias); 선암(adenocarcinoma), 림프종(lymphoma); 자궁암, 양성 전립선 비대증(benign prostatic hypertrophy), 수정(fertility), 성장 및 발달/분화 관련 기능의 조절, 예를 들어, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 성숙, 젖분비(lactation) 및 사춘기(puberty), 생식 기능 부전(reproductive malfunction), 및/또는 기타 병리 및 기타 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 치료제의 용도가 포함된다.
본 발명의 치료 조성물은 특정 구체예에서, 예를 들어, 막 복구 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산, MG53 핵산; 막 복구 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산에 결합하는 핵산; MG53 엔코딩 핵산; MG53 폴리펩티드, 또는 이에 기반한 펩티드 유사체, 슈도펩티드 또는 펩티도미메틱; 막 복구 폴리펩티드, MG53 또는 막 복구 폴리펩티드 또는 MG35 단백질-단백질 상호작용의 소분자 조절제; 또는 MG53-특이적 항체 또는 이의 생물학적 활성 유도체 또는 단편을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, MG53은 세포막에 대한 손상의 복구를 매개한다. 따라서, 상기 핵산, 폴리펩티드, 및 이의 동족체의 발현 및/또는 활성을 표적화하는 것은 조직 손상과 관련된 다양한 급성 및 만성 질병 및 질환의 신규한 치료를 가능케 할 것이다.
다른 특정 양태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 조성물을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 조직 손상 및/또는 조직 손상과 관련된 장애를 치료하거나 개선시키는 방법을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 치료 조성물을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 조직 손상 또는 상처, 예를 들어, 자상(cut), 찰과상, 병변, 궤양, 화상, 욕창, 잇몸 질환, 점막염 등을 치료하는 방법을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 외과적 애쥬번트로서 유용한 치료 조성물을 포함한다. 본원에 기재된 구체예 중 임의의 구체예에서, 본 발명의 외과적 애쥬번트 조성물이 사용되거나, 외과적 부위로로의 직접적인 독립적 치료제로서 적용되거나, 외과적 또는 의학적 도구와 일체적으로 결합될 수 있고, 예를 들어, 본 발명의 치료제는 중합체 기반의 스텐트, 튜브 또는 다른 이식가능한 장치에 컨쥬게이션될 수 있어, 치료제는 치유를 가속화시키고/시키거나 침입성의 외과적 절차로부터 외상을 최소화시키기 위해 조절되는 방식으로 작용 부위에 확산된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물은, 예를 들어, 외과적 도구에 대한 필름 또는 코팅으로 적용되어, 치료제가 혈류 또는 주위 조직으로 확산되고/되거나 서서히 없어지고, 이에 따라 조직 손상의 부위에 직접 전달되고; 외과적 도구의 사용에 의해 발생하는 세포 손상의 양을 최소화시키거나 개선시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 노화 과정(예를 들어, 피부 회춘(skin rejuvenation), 치은 퇴축, 뼈 변성, 관절염, 알츠하이머, 파킨슨 등)의 자연적 부작용으로서 발생하는 조직 복구의 결함을 치료하고/하거나 예방하는 방법을 포함한다. 이러한 구체예의 특정 양태에서, 본 발명은 조직 복구 능력, 조직 온전성 및/또는 조직 탄력에서 연령 관련 결함을 가진 피검체에 유효량의 본 발명의 치료 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 연령 관련 결함은 주름, 눈가주름(crows feet), 안면 주름(facial line), 모공(pot mark), 반흔, 유섬유종(fibroid), 흑점(sun spot) 등에서 하나 이상, 또는 이의 조합이다.
또한, 내인성 MG53 유전자의 발현의 근육 특이적 특성으로 인해, 본 발명은 유효량의 본 발명의 치료제를 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여 근육 또는 혈관 세포/조직 손상의 임의의 유형, 예를 들어, 심혈관병, 예를 들어, 심근경색; 또는 심한 물리적 활동의 결과로 발생하는 조직 손상, 예를 들어, 스포츠 관련 손상을 치료하고/하거나 예방하는 방법을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 치료제 및 미용적으로 적합한 담체 또는 부형제를 포함하는, 신체 조직의 복구, 재생 또는 회복에 유용한 화장용 조성물을 포함한다. 상기 구체예의 한 양태에서, 본 발명은 화장품 중의 유효량의 본 발명의 치료 조성물을 피검체에 투여하는 것을 포함하여 피부의 외관을 향상시키는 방법을 포함한다.
본 발명의 임의의 양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 임의의 약학적으로 허용되는 형태일 수 있고, 임의의 약학적으로 허용되는 경로에 의해 투여될 수 있고, 예를 들어, 치료 조성물은 손상된 근육 조직의 재생 및 복구를 촉진시키기 위해 심근 경색, 경화성 병변, 또는 스포츠 관련 활동으로 인한 근육 파열로 인한 근육 손상의 치료를 위해 일일 단일 용량 또는 단일 투여량 형태로 경구 투여로서 투여될 수 있다. 이러한 약학적으로 허용되는 담체 및 부형체 및 투여 방법은 당업자에 의해 용이하게 명백할 것이고, 이는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 USP-NF 2008(United States Pharmacopeia/National Formulary)에 기재된 조성물 및 방법을 포함한다.
구 "약학적으로 또는 약리학적으로 허용되는"은 동물, 또는 적절한 경우 인간에 투여되는 경우에 부작용, 알레르기 반응 또는 다른 유해한 반응을 생성시키지 않는 분자 존재물 및 조성물을 의미한다. 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체"는 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등의 일부 또는 전부를 포함한다. 약학적 활성 물질에 대한 상기 매질 및 작용제의 용도는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 양립되지 않는 경우를 제외하곤, 치료 조성물에서의 사용이 고려된다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
활성 화합물은 일반적으로 비경구 투여를 위해 제형화되고, 예를 들어, 정맥내, 관절내, 수막강내, 근내, 피하, 병변내 또는 복막내 경로를 통한 주사를 위해 제형화될 것이다. 활성 구성요소 또는 성분으로서 암 마커 항체, 컨쥬게이트, 억제제 또는 다른 작용제를 함유하는 수성 조성물의 제조는 본 발명의 개시내용에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 통상적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 주사가능하게 제조될 수 있고; 주사 전에 액체의 첨가시 용액 또는 현탁액을 제조하는데 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있고, 제조물은 또한 에멀젼화될 수 있다.
또한, 본 발명은 막 복구 상호작용 단백질 및/또는 MG53 상호작용 단백질을 엔코딩하는 간섭 핵산을 포함하는 핵산, 및 폴리펩티드, 및 이의 동족체; 슈도펩티드 및 펩티도미메틱; 뿐만 아니라 막 복구 폴리펩티드 또는 MG53의 활성 또는 이의 분자간 상호작용을 조절할 수 있는 화합물에 관한 것이다.
예를 들어, 본 발명의 조성물은 상기 기재된 질병 및 장애 및/또는 다른 병변 및 장애를 가진 환자의 치료에 대해 효능을 가질 것이다. 상기 폴리펩티드는 본 발명에 특이적인 항체를 생성시키기 위한 면역원, 및 백신으로 사용될 수 있다. 이들은 또한 잠재적 효능제 및 길항제 화합물에 대한 스크리닝에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53을 엔코딩하는 cDNA는 이를 필요로 하는 피검체에 투여되는 경우 유전자 요법에 유용할 수 있다. 비제한적인 예로, 본 발명의 조성물은 상기 기재된 질병 및 장애 및/또는 다른 병변 및 장애 등을 가진 환자의 치료에서 효능을 가질 것이다.
본 발명은, 예를 들어, 상기 기재된 질병 및 장애 및/또는 다른 병변 및 장애 등을 포함하는 장애 또는 증후군의 조절제에 대해 스크리닝하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 시험 화합물과 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 폴리펩티드를 접촉시키고, 상기 시험 화합물이 상기 막 복구 폴리펩티드 또는 MG53 폴리펩티드에 결합하는지 결정하는 것을 포함한다. 막 복구 폴리펩티드 또는 MG53 폴리펩티드로의 시험 화합물의 결합은 상기 시험 화합물이 상기 언급된 장애 또는 증후군에 대한 활성, 또는 잠재성 또는 소인의 조절제임을 나타낸다.
또한, 시험 화합물을 상기 언급된 장애 또는 증후군에 대해 위험이 증가된 시험 동물에 투여함으로써 상기 기재된 질병 및 장애 및/또는 다른 병변 및 장애 등을 포함하는 장애 또는 증후군의 활성, 또는 잠재성 또는 소인의 조절제를 스크리닝하는 방법이 본 발명의 범위 내이다. 시험 동물은 본 발명의 핵산에 의해 엔코딩된 재조합 폴리펩티드를 발현한다. 본 발명의 폴리펩티드의 발현 또는 활성은 이후 본 발명의 폴리펩티드를 재조합적으로 발현하고, 장애 또는 증후군에 대해 위험이 증가되지 않은 대조 동물에서의 단백질의 발현 또는 활성에 비하여 시험 동물에서 측정된다. 다음으로, 시험 동물 및 대조 동물 둘 모두에서의 본 발명의 폴리펩티드의 발현이 비교된다. 대조 동물에 비한 시험 동물에서의 폴리펩티드의 활성에서의 변화는 시험 화합물이 장애 또는 증후군의 잠재성의 조절제임을 나타낸다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 피검체(예를 들어, 인간 피검체)에서 막 복구 폴리펩티드 또는 이를 엔코딩하는 핵산, 예를 들어, MG53 폴리펩티드, MG53 핵산, 또는 MG53 폴리펩티드 및 MG53 핵산 둘 모두의 변경된 수준과 관련된 질병의 존재 또는 이러한 질병에 대한 소인을 결정하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 피검체로부터의 시험 샘플에서 막 복구 폴리펩티드의 양을 측정하고, 시험 샘플에서의 폴리펩티드의 양을 대조 샘플에 존재하는 막 복구 폴리펩티드의 양과 비교하는 것을 포함한다. 대조 샘플에 비한 시험 샘플에서의 막 복구 폴리펩티드의 수준의 변화는 피검체에서의 질병의 존재 또는 이러한 질병에 대한 소인을 나타낸다. 바람직하게는, 상기 소인은, 예를 들어, 상기 기재된 질병 및 장애 및/또는 다른 병변 및 장애 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 신규한 폴리펩티드의 발현 수준은 다양한 장애를 스크리닝할 뿐만 아니라 특정 장애의 단계를 결정하기 위한 방법에 이용될 수 있다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 병리 질환을 완화시키거나 예방하기에 충분한 양의 막 복구 폴리펩티드, 막 복구 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 또는 막 복구 폴리펩티드 특이적 항체를 피검체(예를 들어, 인간 피검체)에 투여함으로써 포유동물에서 장애와 관련된 병리 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 장애는, 예를 들어, 상기 기재된 질병 및 장애 및/또는 다른 병변 및 장애를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 당 분야에서 통상적으로 사용되는 다수의 기술 중 어느 하나에 의해 본 발명의 세포 수용체 및 다운스트림 효과기(downstream effector)를 확인하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 이는 2-하이브리드 시스템, 친화성 정제, 항체 또는 다른 특정 상호작용 분자를 이용한 공동-침전을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "막 복구 폴리펩티드 길항제" 또는 "MG53 길항제" 또는 "막 복구 폴리펩티드의 길항제" 또는 "MG53의 길항제"는 일반적으로 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53의 발현, 번역, 및/또는 활성을 직접 또는 간접적으로 억제할 수 있는 작용제를 의미한다. 또한, 본원에서 사용되는 "막 복구 폴리펩티드 수용체" 또는 "MG53 수용체"는 일반적으로 MG53 단백질에 결합할 수 있는 임의의 단백질 또는 이의 단편을 의미한다.
특정 양태에서, 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 활성의 조절은, 예를 들어, 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 결합 파트너, 즉 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53에 결합하고 이의 생물학적 활성을 중화시키는 인자, 예를 들어, 항-MG53, 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 수용체(예를 들어, 또는 카베올린-3), 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 수용체 단편, 및 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 수용체 유사체를 중화시키는 인자의 사용 또는 조절; 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, MG53 수용체 길항제, 예를 들어, 막 복구 폴리펩티드-수용체에 결합하고 막 복구 폴리펩티드-수용체 상호작용을 붕괴시키는 항-카베올린-3 항체, 슈도펩티드, 펩티드 유사체 또는 펩티도미메틱; 막 복구 폴리펩티드 활성 또는 분자간 상호작용을 억제하거나, 막 복구 폴리펩티드의 정상적인 형태를 변경시키거나, 생산적 막 복구 폴리펩티드/막 복구 폴리펩티드-수용체 결합을 억제하는 소분자의 사용; 또는 예를 들어, 안티센스, 리보자임 및/또는 삼중 헬릭스 접근법에 의해 막 복구 폴리펩티드 발현을 방지하거나 감소시키기 위해 코딩, 비-코딩 및/또는 조절 서열을 포함하는 막 복구 폴리펩티드 유전자 및/또는 막 복구 폴리펩티드 수용체 유전자로부터 유래된 누클레오티드 서열의 사용에 의해 달성된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 막 복구 폴리펩티드, MG53 단백질, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질, MG53 결합 단백질, 막 복구 폴리펩티드 수용체 및/또는 MG53 수용체, 예를 들어, 카베올린-3를 엔코딩하는 서열의 발현을 하향조절하는 핵산 분자, 예를 들어, 데코이(decoy) RNA, dsRNA, siRNA, shRNA, 마이크로 RNA, 앱타머, 안티센스 핵산 분자를 특징으로 한다. 한 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 조직 손상을 치료하고/하거나 예방하고, 조직 복구를 촉진하기 위해 적합화된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 엔도누클레아제 활성을 갖거나, 이는 누클레아제 복합체의 성분이고, 막 복구 폴리펩티드 핵산 서열 또는 막 복구 폴리펩티드 수용체 핵산 서열을 갖는 RNA를 절단한다.
한 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 막 복구 또는 막 복구-수용체 핵산 서열을 갖는 RNA에 상보적인 12 내지 100개의 염기를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 막 복구 또는 막 복구-수용체 핵산 서열을 갖는 RNA에 상보적인 14 내지 24개의 염기를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 구체예에서, 핵산 분자는 당 분야에 널리 공지된 방법에 따라 화학적으로 합성될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 약학적으로 허용되는 형태의 막 복구 폴리펩티드 활성, 발현 또는 결합을 억제할 수 있는 활성제, 및 이의 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 막 복구 또는 막 복구 수용체 유전자 또는 단백질 또는 둘 모두의 발현 수준의 검출을 통해 질병과 관련된 막 복구 유전자, 예를 들어, MG53 유전자 내의 누클레오티드 다형성의 존재를 검출하는 것을 포함하여 장애 또는 질병 또는 진행을 진단하거나 모니터하는 방법에 관한 것이다.
질병 중증도와 관련된 다형성이 확인되었다(참조: Zhong et al., Simultaneous detection of microsatellite repeats and SNPs in the macrophage migration inhibitory factor gene by thin-film biosensor chips and application to rural field studies. Nucleic Acids Res . 2005 Aug 2;33(13):el21; Donn et al., A functional promoter haplotype of macrophage migration inhibitory factor is linked and associated with juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Rheum. 2004 May;50(5):1604-10; 이 모두는 모든 목적상 전체 내용이 참조로서 본원에 포함됨). 본원에서 사용되는 "막 복구 폴리펩티드" 또는 "막 복구 폴리펩티드 수용체 유전자" 또는 "MG53 또는 MG53 수용체 유전자" 또는 "MG53 또는 MG53 수용체 유전자"는 5' UTR, 3' UTR, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 유전자의 인트론 및 엑손 DNA 뿐만 아니라 mRNA 또는 cDNA 서열을 포함한다.
당업자가 이해할 것이지만, 조직 복구 장애와 관련되어, 이에 따라 본 발명의 방법에 따른 진단 마커로서 유용한 MG53 또는 MG53 수용체 유전자 다형성이 앞서 언급된 핵산 영역 중 임의의 영역에서 나타날 수 있다. 다형성을 확인하고 이를 모니터하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있으며 볼게무트(Wohlgemuth)에 의한 미국 특허출원 제6,905,827호에 상세히 논의되어 있으며, 상기 특허출원은 모든 목적을 위해 이의 전체내용이 참조로써 본원에 포함된다.
본 발명의 특정 양태는 하나 이상의 DNA 분자로 유전자 발현 또는 다형성을 검출하는 방법을 포함하는데, 여기서 상기 하나 이상의 DNA 분자는 서열목록에 기재된 올리고누클레오티드에 상응하는 유전자의 발현을 검출하는 누클레오티드 서열을 지닌다. 한 구성에서, 상기 올리고누클레오티드는 특이하게(differentially) 발현된 유전자의 발현을 검출한다. 상기 유전자 발현 시스템은 후보 라이브러리, 진단 작용제, 진단 올리고누클레오티드 세트 또는 진단 프로브 세트일 수 있다. DNA 분자는 유전체 DNA, RNA, 단백질 핵산(PNA), cDNA 또는 합성 올리고누클레오티드일 수 있다. 본원에 교시된 절차에 따라, 당업자는 유전자 발현 또는 다형성을 분석하기 위해 관심 서열을 확인할 수 있다. 이러한 서열은 질환 상태의 전조가 될 수 있다.
본 발명의 진단 올리고누클레오티드
본원에서 사용되는 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 유전체 DNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA), 누클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체, 및 이들의 유도체, 단편 및 동족체를 포함한다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중-가닥 DNA로 구성된다.
특정 양태에서, 본 발명은 개체의 건강 상태와 누클레오티드 서열에 상응하는 RNA 또는 단백질 생성물의 개체의 발현 사이에 존재하는 상관관계에 대한 진단 올리고누클레오티드 및 진단 올리고누클레오티드 세트(들)에 관한 것이다. 일부 예에서, 단지 한 올리고누클레오티드가 상기 검출을 위해 요구된다. 진단 올리고누클레오티드 세트의 일원은 본원에 추가로 기재되는 바와 같은, 차별 발현 스크리닝, PCR, RT-PCR, SAGE 분석, 고처리(high-throughput) 서열분석, 마이크로어레이, 액체 또는 기타 어레이, 단백질-기반 방법(예를 들어, 웨스턴 블로팅, 프로테오믹스, 질량-분광법, 및 본원에 기재된 기타 방법), 및 데이터 발굴 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는, RNA 또는 단백질 생성물의 발현 또는 다형성을 검출할 수 있는 임의의 수단에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 핵산 및/또는 단백질은 널리 공지된 분자 생물학 기술에 따라 조작될 수 있다. 이러한 수많은 기술을 위한 상세한 프로토콜은, 예를 들어, 하기 문헌들에 기재되어 있다: Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (supplemented through 2000) John Wiley & Sons, New York ("Ausubel"); Sambrook et al. Molecular Cloning-A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ("Sambrook"), and Berger and Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. ("Berger").
다양한 양태 및 구체예의 하기 기재가 본 발명의 예시적 핵산에 대한 참조로 제공된다. 그러나, 상기 다양한 양태 및 구체예는 또한 다른 막 복구 단백질, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질의 동족체, 올솔로그(ortholog) 및 파랄로그(paralog)를 엔코딩하는 유전자, 및 막 복구 폴리펩티드 수용체 유전자에 관한 것이고, 이는 모든 이소폼(isoform), 스플라이스 변이체, 및 다형태를 포함한다. 상기 추가 유전자는 막 복구 폴리펩티드, MG53 단백질, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질, MG53 결합 단백질, 막 복구 폴리펩티드 수용체 및/또는 MG53 수용체 유전자에 대해 기재된 방법을 이용하여 표적 부위에 대해 분석될 수 있다. 따라서, 다른 유전자의 억제 및 상기 억제의 효과가 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
"하향 조절"은, 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질을 엔코딩하는 RNA 또는 동등한 RNA의 수준, 또는 하나 이상의 단백질, 예를 들어, 막 복구 폴리펩티드, 및 막 복구 폴리펩티드 수용체 유전자의 활성이 본 발명의 핵산 분자의 부재하에서 관찰되는 것보다 낮게 감소되는 것을 의미한다. 한 구체예에서, 효소 핵산 분자를 이용한 억제 또는 하향 조절은 바람직하게는 표적 RNA 상의 동일한 부위에 결합할 수 있으나, 상기 RNA를 절단할 수 없는 효소적으로 비활성이거나 약화된 분자의 존재하에서 관찰되는 수준보다 낮다. 또 다른 구체예에서, 안티센스 올리고누클레오티드를 이용한 억제 또는 하향 조절은 바람직하게는, 예를 들어, 스크램블링(scrambling)된 서열 또는 미스매치를 갖는 올리고누클레오티드의 존재하에서 관찰되는 수준보다 낮다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자를 이용한 막 복구 폴리펩티드, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질 및 막 복구 폴리펩티드 수용체 유전자의 억제 또는 하향 조절은 핵산 분자의 부재하에서 보다 핵산 분자의 존재하에서 더 크다.
"상향 조절"은, 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질 서브유닛을 엔코딩하는 RNA 또는 동등한 RNA의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 서브유닛, 예를 들어, 막 복구 폴리펩티드, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질, 및 막 복구 폴리펩티드 수용체 유전자의 활성이 본 발명의 핵산 분자의 부재하에서 관찰되는 것 보다 큰 것을 의미한다. 예를 들어, 유전자, 예를 들어, 막 복구 폴리펩티드, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질, 및 막 복구 폴리펩티드 수용체 유전자의 발현이 유전자 발현의 부재 또는 낮은 수준에 의해 야기되거나 악화되는 병리 질환을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키거나, 조절하기 위해 증가될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 막 복구 폴리펩티드, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질, 및 막 복구 폴리펩티드 수용체 유전자의 발현, 방출 및/또는 활성을 상향조절함으로써 과활동성 방광을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
"조절하다"는, 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질을 엔코딩하는 RNA 또는 동등한 RNA의 수준, 또는 하나 이상의 단백질의 활성이 상향-조절 또는 하향-조절된다는 것을 의미하는데, 상기 발현, 수준, 또는 활성은 본 발명의 핵산 분자의 부재시에 관찰된 발현, 수준, 또는 활성을 초과하거나 이보다 작다.
"유전자"는, RNA를 엔코딩하는 핵산, 예를 들어, 비제한적인 예로 폴리펩티드를 엔코딩하는 세그먼트를 포함하는 핵산 서열을 의미한다.
"상보성"은, 전통적인 왓슨-크릭 또는 다른 비-전통적인 형태에 의해 또 다른 RNA 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 의미한다.
"RNA"는, 하나 이상의 리보누클레오티드 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. "리보누클레오티드" 또는 "2'-OH"는 D-리보-푸라노오스 부분의 2' 위치에 히드록실 기를 지니는 누클레오티드를 의미한다.
"누클레오티드"는, 인산화된 당을 지니는 N-글리코시드 결합 중의 이종고리(heterocyclic) 질소성(nitrogenous) 염기를 의미한다. 누클레오티드는 천연 염기(기본), 및 당업계에 잘 알려진 변형된 염기를 포함하는 것으로 당업계에 인지되어 있다. 이러한 염기는 일반적으로 누클레오티드 당 부분의 1' 위치에 위치되어 있다. 누클레오티드는 일반적으로 염기, 당 및 포스페이트 기를 포함한다. 누클레오티드는 당, 포스페이트 및/또는 염기 부분에서 비변형되거나 변형될 수 있다(또한 누클레오티드 유사체, 변형된 누클레오티드, 비천연 누클레오티드, 비-표준 누클레오티드 및 기타 등등으로서 상호교환적으로 언급됨; 예를 들어, 하기 문헌들 참조: Usman and McSwiggen, supra; Eckstein et al., International PCT Publication No. WO 92/07065; Usman et al., International PCT Publication No. WO 93/15187; Uhlman & Peyman, supra(상기 모든 문헌들은 본 명세서에서 참조로서 포함된다). 림바흐 등의 문헌[Limbach et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22, 2183]에 요약된 것과 같이 당업계에 공지된 변형된 핵산 염기의 몇몇 예들이 있다. 화학적으로 변형된 천연 핵산 염기 및 핵산 내로 도입될 수 있는 기타 천연 핵산 염기의 비제한적 예 중 일부는, 예를 들어, 이노신, 퓨린, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 슈도우라실, 2,4,6-트리메톡시 벤젠, 3-메틸 우라실, 디히드로우리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬시티딘(예를 들어, 5-메틸시티딘), 5-알킬우리딘 (예를 들어, 리보티미딘), 5-할로우리딘(예를 들어, 5-브로모우리딘) 또는 6-아자피리미딘 또는 6-알킬피리미딘(예를 들어, 6-메틸우리딘), 프로핀(propyne), 쿠에소신(quesosine), 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 위부토신(wybutosine), 위부톡소신(wybutoxosine), 4-아세틸티딘(acetyltidine), 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘, 5'-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 1-메틸아데노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메틸카르보닐메틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, 베타-D-만노실쿠에오신, 우리딘-5-옥시아세트산, 2-티오시티딘, 트레오닌 유도체 및 기타 염기를 포함한다(Burgin et al., 1996, Biochemistry, 35, 14090; Uhlman & Peyman, supra).
이 양태에서 "변형된 염기"는 1' 위치에 존재하는 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실 이외의 누클레오티드 염기 또는 이들의 동등체(equivalents)를 의미하고; 이러한 염기는 임의의 위치에서, 예를 들어, 효소 핵산 분자의 촉매 코어 내부 및/또는 핵산 분자의 기질-결합 영역내에서 사용될 수 있다.
"상동성"은 2개 이상의 핵산 분자의 누클레오티드 서열이 부분적으로 또는 완전히 동일한 것을 의미한다. 특정 구체예에서, 상동성 핵산은 막 복구 폴리펩티드, 예를 들어, 서열 목록 번호:1, 3, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16의 서열 중 하나 이상, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질, 및 막 복구 폴리펩티드 수용체 유전자에 대해 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 상동성을 갖는다.
"안티센스 핵산"은, RNA-RNA 또는 RNA-DNA 또는 RNA-PNA(protein nucleic acid; Egholm et al., 1993 Nature 365, 566) 상호작용에 의해 표적 RNA에 결합하고, 표적 RNA의 활성을 변경(리뷰를 위해서는, Stein and Cheng, 1993 Science 261, 1004 and Woolf et al., U.S. Pat. No. 5,849,902 참조)시키는 비-효소 핵산 분자를 의미한다. 통상적으로, 안티센스 분자는 안티센스 분자의 단일한 연속적 서열에 따라 표적 서열에 상보적이다. 그러나, 특정 구체예에서, 안티센스 분자는 기질에 결합하여 상기 기질 분자가 루프 또는 헤어핀을 형성할 수 있고/있거나, 안티센스 분자가 결합하여 상기 안티센스 분자가 루프 또는 헤어핀을 형성할 수 있다. 따라서, 안티센스 분자는 2개(또는 이 이상)의 비연속적 기질 서열에 상보적일 수 있거나, 안티센스 분자의 2개(또는 이 이상)의 비연속적 서열 부분은 표적 서열에 상보적일 수 있거나, 둘 모두일 수 있다. 현재의 안티센스 방법의 리뷰를 위해, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Schmajuk et al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 21783-21789, Delihas et al., 1997, Nature, 15, 751-753, Stein et al., 1997, Antisense N. A. Drug Dev., 7, 151, Crooke, 2000, Methods Enzymol., 313, 3-45; Crooke, 1998, Biotech. Genet. Eng. Rev., 15, 121-157, Crooke, 1997, Ad. Pharmacol, 40, 1-49]을 참조하라. 또한, 안티센스 DNA는 DNA-RNA 상호작용에 의해 RNA를 표적화함으로써 듀플렉스(duplex)의 표적 RNA를 절단하는 RNase H를 활성화시키는데 사용될 수 있다. 안티센스 올리고누클레오티드는 표적 RNA의 RNAse H 절단을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 RNAse H 활성화 영역을 포함할 수 있다. 안티센스 DNA는 화학적으로 합성될 수 있거나, 단일 가닥의 DNA 발현 벡터 또는 이의 동등체의 사용을 통해 발현될 수 있다.
긴 이중가닥 RNA(dsRNAs; 통상적으로, >200 nt)가 다양한 유기체 및 세포 유형(예를 들어, 벌레, 초파리 및 식물)에서 표적 유전자의 발현을 침묵시키기 위해 사용될 수 있다. 도입 시, 긴 dsRNA는 RNA 간섭(RNAi) 경로로 통상적으로 언급되는 세포 경로로 유입된다. 첫번째로, dsRNA는 Dicer로 언급되는 RNase Ⅲ-유사 효소에 의해 20-25 누클레오티드(nt)의 작은 간섭 RNA(siRNA)로 가공된다(개시 단계). 이후, siRNA는 상기 과정에서 풀리는 RNA-유도 사일런싱 복합체(RISC)로 공지된 엔도누클레아제 함유 복합체로 어셈블리된다. siRNA 가닥은 이후 상보적인 RNA 분자로 RISC를 유도하고, 여기서 이들은 인지체(cognate) RNA를 절단하고 파괴한다(효과기 단계). 인지체 RNA의 절단은 siRNA 가닥에 의해 결합된 영역의 중앙 근처에서 발생한다. 포유동물 세포에서, 긴 dsRNA(>30nt)의 도입은 효과있는 항바이러스 반응을 개시시키고, 이는 단백질 합성 및 RNA 분해의 비특이적인 억제에 의해 예시된다. 그러나, 포유동물 항바이러스 반응은 siRNA의 도입 또는 발현에 의해 회피될 수 있다.
세포 및 유기체로의 dsRNA의 주입 및 트랜스펙션은 siRNA 전달의 주요 방법이다. 사일런싱 효과는 수일 동안 지속되고, 딸세포로 전달되는 것으로 보이고, 이는 결국에는 감소된다. 그러나, 최근에 일시적 및 안정적으로 트랜스펙션된 포유동물 세포에서 siRNA를 지속적으로 발현시키기 위한 발현 벡터가 개발되었다(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Brummelkamp TR, Bernards R, and Agami R. (2002). A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296:550-553; Lee NS, Dohjima T, Bauer G, Li H, Li M-J, Ehsani A, Salvaterra P, and Rossi J. (2002). Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnol. 20:500-505; Miyagishi M, and Taira K. (2002). U6-promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nature Biotechnol. 20:497-500; Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, Hannon GJ, and Conklin DS. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes & Dev. 16:948-958; Paul CP, Good PD, Winer I, and Engelke DR. (2002). Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnol. 20:505-508; Sui G, Soohoo C, Affar E-B, Gay F, Shi Y, Forrester WC, and Shi Y. (2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc . Natl Acad . Sci . USA 99(6):5515-5520; Yu J-Y, DeRuiter SL, and Turner DL. (2002). RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 99(9): 6047-6052] 참조).
"벡터"는 요망되는 핵산을 운반하기 위해 사용되는 임의의 핵산 기반 기술, 예를 들어, 세균 플라스미드, 바이러스 핵산, HAC, BAC 등을 의미한다.
본 발명의 핵산 분자는, 개별적으로, 또는 기타 약물과 조합되어 또는 연계되어, 상기 논의된 질병 또는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 피검체가 치료될 수 있거나, 기타 적절한 세포가 치료될 수 있는데, 치료를 위한 적절한 조건하에서 개별적으로 또는 하나 이상의 약물과 조합되어 치료될 수 있다는 것은 당업자에게 명백하다.
"이중 가닥 RNA" 또는 "dsRNA"는 유전자의 해당 메신저 RNA 전사체를 분해하는 세포 효소를 활성화시킬 수 있는 소정의 유전자 서열과 일치하는 이중 가닥 RNA를 의미한다. 이러한 dsRNA는 짧은 개재 RNA(short intervening RNA, siRNA)로 언급되고, 이는 유전자 발현을 억제하는데 사용될 수 있다(예를 들어, Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498; and Bass, 2001, Nature, 411, 428-429 참조). 본원에서 사용되는 용어 "이중 가닥 RNA" 또는 "dsRNA"는 짧은 간섭 RNA "siRNA"를 포함하는 "RNAi"인 RNA를 간섭할 수 있는 이중 가닥 RNA 분자를 의미한다. 예를 들어, [Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498; and Kreutzer et al., International PCT Publication No. WO 00/44895; Zernicka-Goetz et al., International PCT Publication No. WO 01/36646; Fire, International PCT Publication No. WO 99/32619; Plaetinck et al., International PCT Publication No. WO 00/01846; Mello and Fire, International PCT Publication No. WO 01/29058; Deschamps-Depaillette, International PCT Publication No. WO 99/07409; and Li et al., International PCT Publication No. WO 00/44914] 참조.
본원에서 사용되는 "세포"는 이의 통상적인 생물학적 의미로 사용되며, 전체 다세포 유기체를 의미하진 않는다. 세포는, 예를 들어, 생체내(in vivo), 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo), 예를 들어, 세포 배양물 중에 존재하거나, 예를 들어, 새, 식물 및 포유동물, 예를 들어, 인간, 소, 양, 유인원, 원숭이, 돼지, 개, 및 고양이를 포함하는, 다세포 유기체에 존재할 수 있다. 세포는 원핵생물(예를 들어, 세균 세포) 또는 진핵생물(예를 들어, 포유동물 또는 식물 세포)일 수 있다.
"막 복구 폴리펩티드", "막 복구 폴리펩티드 결합 단백질" 및 "막 복구 폴리펩티드 수용체 유전자" 또는 "MG53," "MG53 결합 단백질" 및 "MG53 수용체" 단백질은 전장의 막 복구 폴리펩티드 및/또는 MG53, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질, 및/또는 MG53 결합 단백질, 또는 막 복구 폴리펩티드 수용체 단백질 및/또는 MG53 수용체 단백질을 포함하는 펩티드 또는 단백질, 또는 이의 도메인, 융합 단백질, 키메라 또는 단편을 의미한다.
올리고누클레오티드(예를 들어, 안티센스, GeneBlocs)는 하기 문헌들에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 프로토콜을 사용하여 합성된다: Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 211, 3 19, Thompson et al., International PCT Publication No. WO 99/54459, Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677 2684, Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, Brennan et al, 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33 45, 및 Brennan, U.S. Pat. No. 6,001,311. 상기 모든 참고문헌들은 참조로서 본원에 포함된다. 비제한적 예로, 소규모 합성은 394 어플라이드 바이오시스템즈 인크(Applied Biosystems, Inc.)사의 합성기로 수행된다. 대안적으로, 본 발명의 핵산 분자는 별개로 합성될 수 있으며 합성후, 예를 들어, 라이게이션에 의해 연결될 수 있다(Moore et al., 1992, Science 256, 9923; Draper et al., International PCT publication No. WO 93/23569; Shabarova et al., 1991, Nucleic Acids Research 19, 4247; Bellon et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204).
본 발명의 핵산 분자는 누클레아제 내성 기, 예를 들어, 2'-아미노, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-H를 이용한 변형으로 안정성을 향상시키기 위해 광범위하게 변형될 수 있다(검토를 위해 하기문헌을 참조하라: Usman and Cedergren, 1992, TIBS 17, 34; Usman et al., 1994, Nucleic Acids Symp. Ser. 31, 163).
포스포로티오에이트, 포스포로티오에이트, 및/또는 5'-메틸포스포네이트 결합으로 올리고누클레오티드 누클레오티드간 결합의 화학적 변형이 안정성을 개선시키지만, 너무 많은 변형은 약간의 독성을 초래할 수 있다. 따라서, 핵산 분자를 디자인할 때, 이러한 누클레오티드간 결합의 양은 최소화되어야 한다. 이러한 결합의 농도에서의 감소는 독성을 더 낮추어 결과적으로 이러한 분자의 효능을 증가시키고 특이성을 더 높인다.
활성을 유지하거나 향상시키는 화학적 변형을 지니는 핵산 분자가 제공된다. 이러한 핵산은 또한 일반적으로 비변형된 핵산보다 누클레아제에 대하여 더 내성이 있다. 핵산 분자는 바람직하게는 효과적인 세포내 치료 작용제로서 기능하기 위해 누클레아제에 대해 내성이다. RNA 및 DNA의 화학적 합성에서의 개선(Wincott et al., 1995 Nucleic Acids Res. 23, 2677; Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19 (본원에 참조로서 포함됨)은 누클레오티드 변형을 도입함으로써 핵산 분자를 변형시켜 상기한 바와 같이 이들의 누클레아제 안정성을 향상시키는 능력을 증대시켜 왔다. 본 발명의 핵산-기반 분자의 사용은 조합 요법의 가능성을 제공함으로써 질병 발달의 더 나은 치료를 야기할 수 있다(예를 들어, 상이한 유전자를 표적으로 삼는 다수의 안티센스 또는 효소 핵산 분자, 공지된 소분자 억제자와 커플링된 핵산 분자, 또는 분자의 조합물 및/또는 기타 화학적 또는 생물학적 분자를 이용한 간헐적 치료). 핵산 분자를 이용한 피검체의 치료는 또한 상이한 유형의 핵산 분자들의 배합물을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 모르폴리노, 아미데이트 카르바메이트, 카르복시메틸, 아세트아미데이트, 폴리아미드, 술포네이트, 술폰아미드, 술파메이트, 포르마세탈, 티오포르마세탈 및/또는 알킬실릴, 치환기를 포함하는 포스페이트 백본 변형을 갖는 변형된 핵산 분자를 특징으로 한다. 올리고누클레오티드 백본 변형의 리뷰를 위해, 문헌[Hunziker and Leumann, 1995, Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods, VCH, 331 417, and Mesmaeker et al., 1994, Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24 39]을 참조하라. 이러한 참조문헌은 참조로서 본원에 포함된다. 핵산(예를 들어, 안티센스 및 리보자임) 구조에 대한 다양한 변형이 상기 분자의 유용성을 향상시키기 위해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 이러한 변형은 저장 기간, 시험관내 반감기, 생체이용율, 안정성, 및 표적 부위로의 상기 올리고누클레오티드의 도입의 용이성을 향상시킬 수 있고, 예를 들어, 세포막으로의 침투를 향상시키고, 표적화된 세포를 인지하고 이에 결합하는 능력을 부여할 수 있다.
핵산 분자의 투여. 핵산 분자의 전달 방법은 하기 문헌에 기재되어 있다: Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; 및 Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995(상기 두 문헌은 참조로서 본원에 포함됨). 설리반 등의 국제 출원[Sullivan et al., PCT WO 94/02595]은 추가로 효소 RNA 분자의 전달을 위한 일반적 방법을 기재하고 있다. 이러한 프로토콜들은 사실상 임의의 핵산 분자의 전달을 위해 사용될 수 있다. 핵산 분자는 리포솜 내 캡슐화(encapsulation), 전리요법(iontophoresis), 또는 기타 비히클, 예를 들어, 하이드로겔, 시클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐, 및 생접착성 미세구로의 통합을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 세포에 투여될 수 있다. 대안적으로, 핵산/비히클 조합이 직접 주사 또는 주입 펌프의 사요에 의해 국소적으로 전달된다. 전달의 다른 경로는, 경구(정제 또는 알약 형태) 및/또는 경막내 전달(Gold, 1997, Neuroscience, 76, 1153-1158)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 접근법은 예를 들어, 컨쥬게이트 및 생분해성 중합체의 사용을 통한, 다양한 운반 및 담체 시스템의 사용을 포함한다. CNS 전달을 포함한 약물 전달 방법에 관한 종합적인 검토를 위해, 하기 문헌을 참조하라: Ho et al., 1999, Curr. Opin. Mol. Ther., 1, 336-343 및 Jain, Drug Delivery Systems: Technologies and Commercial Opportunities, Decision Resources, 1998 and Groothuis et al., 1997, J. NeuroVirol., 3, 387-400.
본 발명의 분자는 약제 작용제로서 사용될 수 있다. 약제 작용제는 피검체 내의 질병 상태를 예방하거나, 이의 발생을 억제하거나, 치료(일정 정도, 바람직하게는 모든 증상을 완화)한다.
본 발명의 음성으로 하전된 폴리누클레오티드(예를 들어, RNA, DNA 또는 단백질)는 약제 조성물을 형성하기 위하여, 안정화제, 완충제 등과 함께 또는 없이, 임의의 표준 수단에 의해 피검체에게 투여되고 도입될 수 있다. 리포솜 전달 메카니즘을 사용하는 것이 요망되는 경우, 리포솜의 형성을 위한 표준 프로토콜이 준수될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 경구 투여용 정제, 캡슐 또는 엘릭서(elixirs); 직장 투여용 좌제(suppositories); 멸균 용액; 주사 투여용 현탁액; 및 당업계에 공지된 다른 조성물로 제형화되고 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 기재된 화합물의 약제학적으로 허용되는 제형을 포함한다. 이들 제형은 상기 화합물의 염, 예를 들어, 산 부가 염, 예를 들어, 염산, 염화브롬산, 아세트산, 및 벤젠 술폰산의 염을 포함한다.
약리학 조성물 또는 제형은 세포 또는 피검체, 바람직하게는 인간으로 투여하기에, 예를 들어, 전신 투여에, 적절한 형태의 조성물 또는 제형을 의미한다. "전신 투여"는 생체 내에서 혈류 중의 약물의 전신 흡수 또는 축적에 후속하여 전신 곳곳에 분배되는 것을 의미한다. 적절한 형태는, 부분적으로, 용도 또는 유입 경로, 예를 들어, 경구, 경피, 또는 주사에 의해 좌우된다. 이러한 형태는 조성물 또는 제형이 표적 세포(즉, 음성으로 하전된 중합체가 전달되는 것이 요망되는 세포)에 도달하는 것을 방해하지 않아야 한다. 예를 들어, 혈류내로 주입된 약리학적 조성물은 가용성이어야 한다. 기타 요소들이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 독성 및 조성물 또는 제형이 이의 효과를 발휘하는 것을 방지하는 형태와 같은 고려사항을 포함한다.
전신 흡수를 야기하는 투여 경로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하기를 포함하다: 정맥내, 피하, 복강, 흡입, 구강, 폐내 및 근내. 약물의 순환내로의 유입 속도는 분자량 또는 크기의 함수인 것으로 드러났다. 본 발명의 화합물을 포함하는 리포솜 또는 기타 약물 담체의 사용은 잠재적으로 약물을, 예를 들어, 특정 유형의 조직, 예를 들어, 망상내피계(reticular endothelial system, RES)의 조직내로 국소화시킬 수 있다. 세포, 예를 들어, 림프구 및 대식세포의 표면에 약물의 결합을 촉진할 수 있는 리포솜 제형이 또한 유용하다.
약제학적으로 허용되는 제형은 본 발명의 핵산 분자의 요망되는 활성에 가장 적절한 물리적 위치로 상기 분자의 효과적인 분배를 가능케 하는 조성물 또는 제형을 의미한다. 본 발명의 핵산 분자를 이용한 제형에 적합한 작용제의 비제한적 예는 하기를 포함한다: PEG 컨쥬게이션된 핵산, 인지질 컨쥬게이션된 핵산, 친지성 부분을 함유한 핵산, 포스포로티오에이트, P-당단백질 억제제(예를 들어, Pluronic P85)(상기 물질들은 다양한 조직내로, 예를 들어, CNS(Jolliet-Riant and Tillement, 1999, Fundam. Clin. Pharmacol., 13, 16-26)로 약물의 유입을 향상시킬 수 있음); 생분해성 중합체, 예를 들어, 이식후 지연 방출 전달을 위한 폴리(DL-락티드-코글리콜리드) 미세구(Emerich, DF et al, 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.; 및 적하된 나노입자, 예를 들어, 혈 뇌 장벽을 가로질러 약물을 전달할 수 있으며 신경 흡수 메커니즘을 변화시킬 수 있는, 폴리부틸시아노아크릴레이트로 만들어진 나노입자(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999). 핵산 분자의 CNS 전달을 포함하는, 전달 방법의 다른 비제한적 예는 하기 문헌에 기재된 물질을 포함한다: Boado et al., 1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tyler et al, 1999, FEBS Lett., 421, 280-284; Pardridge et al., 1995, PNAS USA., 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15, 73-107; Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916; 및 Tyler et al., 1999, PNAS USA., 96, 7053-7058. 이들 참고문헌 모두는 참조로서 본원에 포함된다.
본 발명은 또한 폴리(에틸렌 글리콜) 지질을 함유하는 표면-변형 리포솜(PEG-변형, 또는 장기 순환 리포솜 또는 스텔스 리포솜)을 포함하는 조성물의 사용을 특징으로 한다. 본 발명의 핵산 분자는 또한 다양한 분자량의 공유적으로 부착된 PEG 분자를 포함할 수 있다. 이러한 제형은 표적 조직내 약물의 축적을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 이러한 부류의 약물 담체는 단핵 대식세포 시스템(MPS 또는 RES)에 의한 옵소닌화(opsonization) 및 제거에 내성을 나타내며, 이에 따라 혈류 순환 시간을 더 길게 할 수 있으며 캡슐화된 약물에 대한 조직 노출을 향상시킬 수 있다(Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011). 장기 순환 리포솜은 또한 양이온 리포솜에 비해 더 우수한 정도로 누클레아제 분해로부터 약물을 보호할 가능성이 있는데, 이는 대사적으로 공격적인 MPS 조직, 예를 들어, 간 및 비장 내 축적을 회피할 수 있는 이들의 능력에 기초한다. 상기 참고문헌들 모두 참조로서 본원에 포함된다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 중에 약제학적 유효량의 요망되는 화합물을 포함하는 저장용 또는 투여용으로 제조된 조성물을 포함한다. 치료 용도에 허용되는 담체 또는 희석제는 약제학 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 보존제, 안정화제, 염료 및 착향제가 제공될 수 있다. 이들은 소듐 벤조에이트, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 또한, 항산화제 및 현탁제가 사용될 수 있다.
유효량, 약제학적으로 유효한 용량, 치료적 유효량 또는 약제학적 유효량은 질병 상태 또는 병리 질환을 예방하거나, 이의 발생을 억제하거나, 치료(일정 정도, 바람직하게는 모든 증상을 경감)하기 위해 요구되는 용량이다. 유효량은 질병의 유형, 사용된 조성물, 투여 경로, 치료되는 포유동물의 유형, 고려중인 특정 포유동물의 신체적 특성, 동반 약물치료, 및 의약 분야의 당업자가 인지할 기타 요소들에 좌우된다. 일반적으로, 하루당 체중 kg당 0.1 mg 내지 1000 mg의 활성 성분의 양이 음성으로 하전된 중합체의 역가에 의존하여 투여된다. 또한, 본 발명의 조성물의 유효량은 의도되거나 요망되는 생물학적 효과를 촉진하기 위해 실시예에서 사용된 양을 포함한다.
상기 화합물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 대한 치사량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적 유효량)을 결정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50 비로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있으나, 치료는 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화시킴으로써 부작용을 감소시키기 위해 침범된 조직의 부위로 상기 화합물을 표적화시키는 전달 시스템이 계획되어야 한다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터가 인간에서 사용하기 위한 광범위한 투여량을 제형화시키는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 거의 독성이 없거나 독성이 없는 ED50을 포함하는 다양한 순환 농도 내에 속한다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료적 유효량은 먼저 세포 배양 검정으로부터 측정될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 결정되는 바에 따라 IC50(즉, 증상의 최대 억제의 반을 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위한 용량이 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확히 결정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장에서의 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
제형은 통상적인 약제학적으로 허용되는 무독성 담체, 애쥬번트 및 비히클을 함유한 투여 단위 제형으로 경구적으로, 국소적으로, 비경구적으로, 흡입 또는 스프레이에 의해 또는 직장으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 경피, 피하, 혈관내(예를 들어, 정맥내), 근내, 또는 경막내 주사 또는 주입 기술 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 핵산 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형이 제공된다. 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 무독성 담체 및/또는 희석제 및/또는 애쥬번트와 결합되어 제공될 수 있으며, 요망되는 경우, 다른 활성 성분과 결합되어 제공될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 사용에 적절한 형태로, 예를 들어, 정제, 트로키, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 분산가능한 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽 또는 엘리서로 존재할 수 있다.
경구 사용을 위해 의도된 조성물은 약제학적 조성물의 제조를 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 이러한 조성물은 약제학적으로 풍취 있고 맛 좋은 제조물을 제공하기 위해, 예를 들어, 감미제, 착향제, 착색제 또는 보존제를 하나 이상 함유할 수 있다. 정제는 정제의 제조에 적절한 약제학적으로 허용되는 무독성 부형제와 혼합하여 활성 성분을 함유한다. 이러한 부형제는, 예를 들어, 비활성 희석제, 예를 들어, 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 락토오스, 칼슘 포스페이트 또는 소듐 포스페이트; 과립화제 및 붕괴제, 예를 들어, 옥수수 전분, 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어, 전분, 젤라틴 또는 아카시아, 및 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 또는 활석일 수 있다. 정제는 비코팅될 수 있거나 이들은 공지 기술로 코팅될 수 있다. 일부 경우에서, 이러한 코팅은 위장관(gastrointestinal tract)에서 분해 및 흡수를 지연시켜 그 결과 더 긴 기간에 걸쳐 지연된 작용을 제공하기 위해 공지 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 시간 지연 물질, 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 사용될 수 있다. 경구 사용을 위한 제형은 또한 경질 젤라틴 캡슐(여기서 활성 성분은 비활성 고체 희석제, 예를 들어, 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트 또는 카오린(kaolin)과 혼합됨) 또는 연질 젤라틴 캡슐(여기서 활성 성분은 물 또는 유성 매질, 예를 들어, 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합됨)로 제공될 수 있다.
수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적절한 부형제와 혼합하여 활성 물질을 함유한다. 이러한 부형제는 현탁제, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드로프로필-메틸셀룰로오스, 소듐 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 검 트래거캔쓰 및 검 아카시아; 자연적으로 생성된 포스파티드일 수 있는 분산제 또는 습윤제, 예를 들어, 레시틴, 또는 지방산과 알킬렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 장쇄 지방족 알코올과 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세타놀, 또는 지방산 및 헥시톨에서 유래된 부분 에스테르과 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레이트, 또는 지방산 및 헥시톨 무수물에서 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트이다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들어, 에틸, 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 착향제, 및 하나 이상의 감미제, 예를 들어, 수크로오스 또는 사카린을 함유할 수 있다.
유성 현탁액은 식물성 오일, 예를 들어, 아라키스 오일, 올리브 오일, 참깨 오일 또는 코코넛 오일 중에, 또는 미네랄 오일, 예를 들어, 액체 파라핀 중에 활성 성분을 현탁시킴으로써 제형화될 수 있다. 유성 현탁액은 증점제(thickening agent), 예를 들어, 밀납(beeswax), 경질 파라핀 또는 세틸 알코올을 함유할 수있다. 감미제 및 착향제는 맛이 좋은 경구 제조물을 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 이러한 조성물은 항-산화제, 예를 들어, 아스코르브산의 첨가에 의해 보존될 수 있다.
물의 첨가에 의한 수성 현탁액의 제조에 적절한 분산가능한 분말 및 과립은 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 보존제와 혼합하여 활성 성분을 제공한다. 적절한 현탁제 또는 습윤제 또는 현탁제는 위에 이미 언급된 작용제들에 의해 예시된다. 또한 추가 부형제, 예를 들어, 감미제, 착향제 및 착색제가 제공될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 수중유(oil-in-water) 에멀젼의 형태일 수 있다. 유성상은 식물성 오일 또는 미네랄 오일 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적절한 에멀젼화제는 자연적으로 생성된 검, 예를 들어, 검 아카시아 또는 검 트래거캔쓰, 자연적으로 생성된 포스파티드, 예를 들어, 대두, 레시틴, 및 지방산과 헥시톨에서 유래된 에스테르 또는 부분 에스테르, 무수물, 예를 들어, 소르비탄 모노올레이트, 및 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트일 수 있다. 에멀젼은 또한 감미제 및 착향제를 함유할 수 있다.
시럽 및 엘릭시르는 감미제, 예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 글루코오스 또는 수크로오스로 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 또한 점활제(demulcent), 보존제 및 착향제 및 착색제를 함유할 수 있다. 약제학적 조성물은 멸균된 주사가능한 수성 또는 유성(oleaginous) 현탁액의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 위에 언급된 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균된 주사가능한 제조물은 또한 비경구적으로 허용가능한 무독성 희석제 또는 용매 중의 멸균된 주사가능 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 이용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 소듐 클로라이드 용액이 있다. 또한, 멸균된, 고정유(fixed oil)는 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 자극이 적은 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 지방산, 예를 들어, 올레산이 주사가능한 제조물 중에 사용된다.
본 발명의 핵산 분자는, 예를 들어, 약물의 직장 투여를 위해 좌제의 형태로, 또는 카테터를 통해 방광에 그 자체로 직접적으로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 약물과 보통의 온도에서 고체이나 직장 온도에서 액체가 되며 직장내에서 용해되어 약물을 방출시킬 무자극성 부형제를 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 물질은 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 멸균 매질로 비경구적으로 투여될 수 있다. 사용되는 비히클 및 농도에 의존하여, 약물은 비히클 중에 현탁되거나 용해될 수 있다. 유리하게는, 애쥬번트, 예를 들어, 국소 마취제, 보존제 및 완충제가 비히클 중에 용해될 수 있다. 단일 투여량 형태를 생성시키기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 좌우되어 달라진다. 투여량 단위 형태는 일반적으로 약 1 mg 내지 약 5000 mg의 활성 성분을 함유한다. 임의의 특정 환자 또는 피검체에 대한 특정 용량 수준은 사용되는 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로, 및 배설 속도, 약물 조합 및 치료 중인 특정 질환의 중증도를 포함하는 다양한 요인들에 좌우된다는 것이 이해된다.
인간이 아닌 동물에게 투여를 위해, 조성물은 또한 동물 사료 또는 음료수에 첨가될 수 있다. 동물 사료 및 음료수 조성물을 제형화시켜 동물이 이의 식이와 함께 치료학적으로 적절한 양의 조성물을 섭취하도록 하는 것이 편리할 수 있다. 또한 사료 또는 음료수에 첨가를 위한 프리믹스로서 조성물을 제공하는 것이 편리할 수 있다. 조성물은 또한 전반적인 치료 효과를 증가시키기 위해 다른 치료 화합물과 조합하여 피검체에게 투여될 수 있다. 증상을 치료하기 위해 다수의 화합물을 사용하는 것은 존재하는 부작용을 감소시키면서 유익한 효과를 증가시킬 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 특정 핵산 분자는 진핵생물 프로모터로부터 세포 내에서 발현될 수 있다(예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Izant and Weintraub, 1985, Science, 229, 345; McGarry and Lindquist, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83, 399; Scanlon et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10591 5; Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3 15; Dropulic et al., 1992, J. Virol., 66, 1432 41; Weerasinghe et al., 1991, J. Virol., 65, 5531 4; Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802 6; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581 9; Sarver et al., 1990 Science, 247, 1222 1225; Thompson et al, 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Good et al., 1997, Gene Therapy, 4, 45(상기 모든 참고문헌들은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다). 당업자는 임의의 핵산이 적절한 DNA/RNA 벡터로부터 진핵생물 세포내에서 발현될 수 있다는 것을 알고 있다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 중 하나 이상을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 특징으로 한다. 본 발명의 핵산 분자를 엔코딩하는 핵산 서열은 이러한 핵산 분자의 발현이 가능케 하는 방식으로 작동가능하게 연결된다.
핵산 분자 서열의 전사는 진핵생물 RNA 중합효소 I(pol I), RNA 중합효소 II(pol II), 또는 RNA 중합효소 III(pol III)를 위한 프로모터로부터 유도된다. pol II 또는 pol III 프로모터로부터의 전사체는 모든 세포내에서 높은 수준으로 발현된다; 제공된 세포 유형내 제공된 pol II 프로모터의 수준은 근처에 존재하는 유전자 조절 서열(인핸서, 사일렌서 등)의 특성에 좌우된다. 원핵생물 RNA 중합효소 프로모터가 또한 사용되는데, 원핵생물 RNA 중합효소는 적절한 세포내에서 발현된다(Elroy-Stein and Moss, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6743 7; Gao and Huang 1993, Nucleic Acids Res., 21, 2867 72; Lieber et al., 1993, Methods Enzymol., 217, 47 66; Zhou et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 4529 37). 상기 참고문헌 모두는 본원에 참조로서 포함된다. 몇몇 연구자들은 핵산 분자, 예를 들어, 상기 프로모터들로부터 발현된 리보자임이 포유동물 세포에서 기능할 수 있다는 것을 입증하였다(예를 들어, 하기 문헌들을 참조하라: Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3 15; Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802 6; Chen et al, 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581 9; Yu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6340 4; L'Huillier et al., 1992, EMBO J., 11, 4411 8; Lisziewicz et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 90, 8000 4; Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Sullenger & Cech, 1993, Science, 262, 1566).
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자의 발현을 가능케 하는 방식으로 본 발명의 핵산 분자 중 하나 이상을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 특징으로 한다. 발현 벡터는 한 구체예로 하기의 것들을 포함한다; a) 전사 개시 영역; b) 전사 종결 영역; c) 하나 이상의 상기 핵산 분자를 엔코딩하는 핵산 서열; 여기서, 상기 서열은 상기 핵산 분자의 발현 및/또는 전달을 가능케 하는 방식으로 상기 개시 영역 및 상기 종결 영역에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 추가 목적은 적절한 용기, 상기 용기내에 배치된 약제학적으로 허용되는 형태의 본 발명의 치료제, 및 이의 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 막 복구 폴리펩티드, MG53, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질, MG53 결합 단백질, 막 복구 폴리펩티드 수용체, 및/또는 MG53 수용체의 누클레오티드 서열의 상보체인 핵산 분자를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "상보적"은 핵산 분자의 누클레오티드 단위들 간의 왓슨-크릭 또는 후그스틴(Hoogsteen) 염기 짝지음을 의미하며, 용어 "결합"은 2개의 폴리펩티드 또는 화합물 또는 관련된 폴리펩티드 또는 화합물 또는 이들의 조합물 간의 물리적 또는 화학적 상호작용을 의미한다. 결합은 이온, 비이온, 반 데르 발스, 소수성 상호작용 등을 포함한다. 물리적 상호작용은 직접적이거나 간접적일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단편"은 6개 이상의 (연속된) 핵산 또는 4개 이상의 (연속된) 아미노산의 서열로 정의되는데, 핵산의 경우 특이적인 하이브리드화를 가능케 하는데 충분한 길이이고, 아미노산의 경우 에피토프의 특이적 인식을 가능케 하는데 충분한 길이이며, 전장 길이 서열보다 기껏해야 일정 부분 더 짧다.
용어, "숙주 세포"는 이종성 핵산을 지니거나, 이종성 핵산에 의해 엔코딩된 펩티드 또는 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있는 세포를 포함한다. 숙주 세포는 천연(비-재조합) 형태의 세포 내에서 발견되지 않는 유전자, 천연 형태의 세포에서 발견되는 유전자(여기서 유전자는 인공적인 수단에 의해 변형되고 세포내로 재도입됨), 또는 세포로부터 핵산을 제거하지 않은 채 인공적으로 변형된 세포에서 내생성인 핵산을 함유할 수 있다. 숙주 세포는 진핵생물 또는 원핵생물일 수 있다. 세균의 배양을 위해 필요한 일반적인 성장 조건은 문헌[BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, Vol. 1, N. R. Krieg, ed., Williams and Wilkins, Baltimore/London (1984)]과 같은 교재에서 찾아볼 수 있다. "숙주 세포"는 또한 내생성 유전자 또는 프로모터 또는 상기 둘 모두가 변형되어 본 발명의 복합체의 하나 이상의 폴리펩티드 성분을 생성하는 세포일 수 있다.
"유도체"는 직접적으로, 변형에 의해, 또는 부분적 치환에 의해 천연 화합물로부터 형성된 구성물(compositions)이다.
"유사체"는 천연 화합물과 유사하나, 동일하지 않은 구조를 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열이다.
본 발명의 핵산 또는 단백질의 유도체 또는 유사체는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 다양한 구체예에서, 동일한 크기의 핵산 또는 아미노산 서열에 걸쳐서 또는 당업계에 공지된 컴퓨터 상동성 프로그램에 의해 수행된 정렬로 정렬된 서열과 비교할 때, 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 동일성(80-95%의 바람직한 동일성)으로, 본 발명의 핵산 또는 단백질에 대해 실질적으로 상동성이 있는 영역을 포함하는 분자를 포함하거나, 이를 엔코딩하는 핵산은 엄격한 조건, 적당히 엄격한 조건, 또는 낮은 엄격한 조건하에서 본 발명의 단백질을 엔코딩하는 서열의 상보체에 하이브리드화될 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1993. 핵산 유도체 및 변형은 유전자 대체, 위치-특이적 돌연변이, 결실, 삽입, 재조합, 복구, 셔플링, 엔도누클레아제 절단, PCR, 서브클로닝, 및 관련 기술에 의해 수득된 것들을 포함한다.
"동족체"는 자연적으로 생성되거나, 관련 서열을 지니는 하나 이상의 핵산의 인공적 합성에 의해 생성되거나, 관련 핵산을 생성하기 위한 하나 이상의 핵산의 변형에 의해 생성될 수 있다. 핵산은 이들이 공통 조상 서열로부터 자연적으로 또는 인공적으로 유래되는 경우 상동성이다(예를 들어, 올솔로그 또는 파랄로그). 2개의 핵산들 간의 상동성이 의도적으로 기재되지 않는 경우, 상동성은 2개 이상의 서열들 간의 핵산 비교에 의해 추론될 수 있다. 서열들이 소정 정도의 서열 유사성을 나타내는 경우(예를 들어, 일차 아미노산 구조 수준에서 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과하는 수준으로), 이들 서열들은 공통 조상을 공유한다고 결론지어 진다. 본 발명의 목적을 위해, 유전자는 핵산 서열들이 충분히 유사하여 엄격도가 낮은 조건하에서 재조합 및/또는 하이브리드화가 가능한 경우 상동성이다.
본원에서 사용되는 용어 "하이브리드화"는 소정 분자가, 서열이 복합 혼합물(예를 들어, 전체 세포) DNA 또는 RNA로 존재하는 경우를 포함하는, 저도, 중간, 고도의 엄격한 조건하에서 특정 누클레오티드 서열에만 결합하거나, 듀플렉싱되거나, 또는 하이브리드화되는 것을 의미한다.
또한, 당업자는 "보존적 돌연변이"가 또한 코딩 서열내 단일 아미노산 또는 소수의 아미노산을 변형, 부가 또는 결실시키는 핵산의 치환, 결실 또는 첨가를 포함한다는 것을 인지하며, 여기서 핵산 변경은 결과적으로 화학적으로 유사한 아미노산의 치환을 초래한다. 서로에 대한 보존적 치환으로 역할할 수 있는 아미노산은 하기와 같은 아미노산들을 포함한다: 염기성: 아르기닌(R), 리신(K), 히스티딘(H); 산성: 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 친수성: 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I); 소수성: 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 황-함유: 메티오닌(M), 시스테인(C). 또한, 보존적 변이에 의해 달라지는 서열은 일반적으로 상동성이다.
돌연변이유발, PCR, 클로닝 등을 포함하는 본 발명의 실시에 유용한 분자 생물학적 기술의 상세한 설명은 하기 문헌에서 찾아 볼 수 있다: Berger and Kimmel, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, METHODS IN ENZYMOLOGY, volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING--A LABORATORY MANUAL (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989, and CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.; Berger, Sambrook, and Ausubel, as well as Mullis et al., 미국 특허 출원 제4,683,202호(1987); PCR PROTOCOLS A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS (Innis et al. eds), Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (Oct. 1, 1990) C&EN 36-47.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산은 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에서 발현된다. 원핵생물 및 진핵생물 세포 둘 모두를 위한 적절한 발현 시스템에 관하여, 예를 들어, 샘브룩 등의 저서인, 분자 클로닝, 실험 매뉴얼 제 2판, 제 16장 및 제 17장(Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)을 참조하라.
폴리누클레오티드는 DNA 분자, cDNA 분자, 유전체 DNA 분자, 또는 RNA 분자일 수 있다. DNA 또는 RNA로서 폴리누클레오티드는 T(티미딘)이 또한 U(우라실)일 수 있는 서열을 포함한다. 폴리누클레오티드의 특정 위치에 존재하는 누클레오티드는 역-평행(anti-parallel) DNA 또는 RNA 가닥 내의 동일한 위치에 존재하는 누클레오티드와 왓슨-크릭 짝지음을 형성할 수 있는 경우, 상기 폴리누클레오티드 및 DNA 또는 RNA 분자는 상기 위치에서 서로 상보적이다. 상기 폴리누클레오티드 및 DNA 또는 RNA 분자는 각 분자내 충분한 수의 상응하는 위치가 요망되는 과정을 실행하기 위해 서로 하이브리드화될 수 있는 누클레오티드에 의해 점유되는 경우에 서로에 대해 실질적으로 상보적이다.
재조합 DNA를 이용한 숙주 세포의 형질전환은 당업자에게 널리 공지된 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. "형질전환"은 새로운 DNA(즉, 세포에 대해 외생성인 DNA)의 통합 후 세포내에서 유도된 영구적 또는 일시적인 유전자적 변화를 의미한다.
또 다른 구체예에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 특정 세포 유형내에서 우선적으로 핵산의 발현을 유도할 수 있다(예를 들어, 조직 특이적 조절 엘리먼트들이 핵산 발현을 위해 사용됨). 조직 특이적 조절 엘리먼트들은 당업계에 공지되어 있다. 적절한 조직 특이적 프로모터의 비제한적 예는 알부민 프로모터(간 특이적 프로모터; Pinkert, et al., 1987. Gene Dev. 1: 268-277), 림프구(lymphoid) 특이적 프로모터(Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275), T 세포 수용체(Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733) 및 면역글로불린(Banerji, et al., 1983. 세포 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748)의 특정 프로모터, 뉴런 특이적 프로모터(예를 들어, 신경미세섬유 프로모터; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), 췌장 특이적 프로모터(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916), 및 젖샘 특이적 프로모터(예를 들어, 유선(milk whey) 프로모터; 미국 특허 제4,873,316호 및 유럽 공개특허 제264,166호)를 포함한다. 또한 발달상 조절되는(Developmentally-regulated) 프로모터, 예를 들어, 뮤린 hox 프로모터(Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379) 및 알파-태아단백 프로모터(Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)가 포함된다.
구체예들 중 임의의 구체예에서, 막 복구 폴리펩티드, MG53, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질, MG53 결합 단백질, 막 복구 폴리펩티드 수용체 및/또는 MG53 수용체를 엔코딩하는 핵산는 하기한 것으로 제공될 수 있다: 하나 이상의 나출형(naked) DNA; 적절한 발현 벡터 내에 배치되고 에피솜으로 유지되는 하나 이상의 핵산; 숙주 세포의 유전체 내로 통합된 하나 이상의 핵산; 복합체의 성분들을 엔코딩하는 내생성 유전자의 변형된 형태; 하나 이상의 조절 핵산 서열과 조합된 하나 이상의 핵산; 또는 이들의 조합물. 핵산은 5' 말단, 3' 말단, 또는 ORF내부의 임의 위치에 링커 펩티드 또는 융합 단백질 성분, 예를 들어, His-태그, FLAG-태그, 말토오스 결합 단백질(MBP)-태그, 형광 단백질, GST, TAT, 항체 일부분, 신호 펩티드 등을 임의로 포함할 수 있다.
한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 핵산은 막 복구 폴리펩티드 수용체 또는 MG53 수용체의 가용성(즉, 세포외) 부분을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함한다. 본원에 기재된 구체예들 중 임의의 구체예는 당업자에게 널리 공지된 표준 분자생물학 및 유전자적 접근법을 사용하여 달성될 수 있다.
숙주가 원핵생물, 예를 들어, 대장균(E. coli)인 경우, DNA 흡수가 가능한 적격(competent) 세포가 지수적 성장기 후에 수거되고 후속하여 당업계에 널리 공지된 절차에 의해 CaCl2 방법으로 처리된 세포로부터 제조될 수 있다. 대안적으로, MgCl2, RbCl, 리포솜 또는 리포솜-단백질 컨쥬게이트가 사용될 수 있다. 형질전환은 또한 숙주 세포의 원형질체 형성후 또는 전자천공에 의해 수행될 수 있다. 이러한 예들은 본 발명을 제한하지 않는다; 당업자에게 널리 공지되어 있고 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 고려되는, 숙주 세포를 트랜스펙션시키기 위한 수많은 기술들이 존재한다.
숙주가 진행생물인 경우, DNA를 이용하여 트랜스펙션시키는 상기 방법들은 칼슘 포스페이트 공동-침전(co-precipitates), 통상적인 기계적 절차, 예를 들어, 미세주입, 전자천공, 리포솜에 넣어진 플라스미드의 삽입 또는 바이러스 벡터를 비롯한, 당업계에 알려진 기타 방법이 사용될 수 있다. 진핵생물 세포는 효모 세포(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae))이거나 인간 세포를 포함하는 포유동물 세포일 수 있다. 재조합 단백질의 장기간의, 고수율 생성을 위해, 안정적인 발현이 선호된다.
폴리펩티드
다른 구체예에서, 본 발명은 막 복구 폴리펩티드, MG53, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질, MG53 결합 단백질, 막 복구 폴리펩티드 수용체, 및/또는 MG53 수용체 폴리펩티드, 항체 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적 활성 부분을 엔코딩하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 복합체의 폴리펩티드들은, 예를 들어, 표준 방법에 따라 펩티드 합성기를 사용하거나; 세포 또는 세포 추출물 중에서 각각의 폴리펩티드를 별개로 발현시킨 후, 폴리펩티드를 분리하고 정제함으로써 형성될 수 있다.
항체
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린(Ig) 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉, 하나 이상, 바람직하게는 2개의 중쇄(H) 가변 영역(본원에서, VH로 축약됨), 및 하나 이상, 바람직하게는 2개의 경쇄(L) 가변 영역(본원에서, VL로 축약됨)을 포함하는, 항원과 특이적으로 결합하는(항원과 면역반응하는) 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 의미한다. 이러한 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 단쇄, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편, 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. VH 및 VL 영역은 "프레임워크 영역"(FR)으로 칭해지는 더 보존되어 있는 영역이 산재된, "상보성 결정 영역"("CDR")으로 칭해지는 과가변 영역들로 더 세분될 수 있다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위는 정확하게 규정되어 있다(하기 문헌을 참조하라: Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, and Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)(상기 문헌들을 참조로서 본원에 포함된다). 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되는데, 하기 순서로 아미노-말단에서부터 카르복시-말단까지 정렬된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 일반적으로, 인간으로부터 수득된 항체 분자는 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 클래스 중 임의의 클래스와 관련이 있는데, 상기 클래스들은 분자내에 존재하는 중쇄의 특성에 의해 서로 구별된다. 특정 클래스는 또한 서브클래스, 예를 들어, IgG1, IgG2, 및 기타 서브클래스를 갖는다. 더욱이, 인간에서, 경쇄는 카파 쇄 또는 람다 쇄일 수 있다. 본원에서 항체에 대한 참고문헌은 상기 모든 클래스, 서브클래스 및 여러 유형의 인간 항체 종(species)에 대한 참고문헌을 포함한다.
항체는 면역화 작용제로서 관심있는 펩티드를 함유하는 온전한 폴리펩티드 또는 단편으로부터 제조될 수 있다. 바람직한 항원 폴리펩티드 단편은 15-100개 연속 아미노산의 막 복구 폴리펩티드, MG53, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질, MG53 결합 단백질, 막 복구 폴리펩티드 수용체, 및/또는 MG53 수용체 단백질이다. 한 구체예에서, 펩티드는, 예를 들어, 세포외 또는 세포내 도메인 중의 폴리펩티드의 비-막횡단 도메인내에 위치한다. 예시적인 항체 또는 항체 단편은 세포외 환경으로부터 접근가능하며 단백질의 기능성을 변경시키는 에피토프에 결합한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 막 복구 폴리펩티드, MG53, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질, MG53 결합 단백질, 막 복구 폴리펩티드 수용체, 및/또는 MG53 수용체 단백질, 또는 이의 변이체, 부분 및/또는 조합물의 하나 이상의 에피토프를 인지하며 이에 특이적인 항체를 포함한다. 대안적인 구체예에서, 본 발명의 항체는 MG53/MG53 수용체 상호작용을 표적으로 삼고 이를 방해하여 신호전달을 억제할 수 있다.
모노클로날 항체의 제조법은 당업계에 잘 알려져 있다; 예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, page 726 (Cold Spring Harbor Pub. 1988). 모노클로날 항체는 마우스 또는 래빗에게 항원을 포함하는 조성물을 주입하고, 혈청 샘플을 제거함으로써 항체 생성물의 존재를 확인하고, B 림프구를 획득하기 위해 비장을 적출하고, 하이브리도마를 생성시키기 위해 림프구와 골수종 세포를 융합시키고, 하이브리도마를 클로닝하고, 항원에 대한 항체를 생성하는 양성 클론을 선별하고, 하이브리도마 배양물로부터 항체를 분리함으로써 수득될 수 있다. 모노클로날 항체는 당업계에 널리 공지된 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 분리 및 정제될 수 있다.
다른 구체예에서, 항체는 재조합적으로 생성될 수 있는데, 예를 들어, 파지 디스플레이에 의해 또는 조합(combinatorial) 방법에 의해 생성될 수 있다. 파지 디스플레이 및 조합 방법을 사용하여 막 복구 폴리펩티드, MG53, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질, MG53 결합 단백질, 막 복구 폴리펩티드 수용체, 및/또는 MG53 수용체 단백질 또는 이의 단편에 결합하는 재조합 항체를 분리할 수 있다(예를 들어, 하기 문헌에 기재된 바와 같이 분리가능하다: Ladner et al. 미국 특허 제5,223,409호; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580. 인간 모노클로날 항체는 또한 마우스 시스템보다 인간 면역글로불린 유전자를 가지는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 관심 항원으로 면역화시킨 이러한 트랜스제닉 마우스로부터의 비장세포(splenocytes)를 사용하여 인간 단백질로부터의 에피토프에 대해 특이적 친화성을 지니는 인간 mAb를 분비하는 하이브리도마를 생성한다(예를 들어, 하기 문헌들을 참조하라: Wood et al. International Application WO 91/00906; Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368:856-859; Green, L. L. et al. 1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S. L. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855). 본 발명의 복합체 구성요소 또는 복합체 그 자체에 대한 치료학적으로 유용한 항체는 "인간화" 모노클로날 항체에서 유래될 수 있다. 인간화 모노클로날 항체는 마우스 면역글로불린의 가변 중쇄 및 가변 경쇄로부터의 마우스 상보성 결정 영역(CDR)을 인간 가변 도메인으로 옮긴 후, 뮤린 대응부(counterparts)의 프레임워크 영역을 인간 잔기로 대체함으로써 생성된다.
인간화 모노클로날 항체에서 유래된 항체 구성요소들의 사용은 뮤린 불변 영역의 면역원성과 연관된 잠재적 문제점을 미연에 방지한다. 인간화 모노클로날 항체를 생성하기 위한 기술들은 하기 문헌들에서 찾아볼 수 있다: Jones et al., Nature 321: 522, 1986 및 Singer et al., J. Immunol . 150: 2844, 1993; Wu T.T. and Kabat,E.A. (1970) J. Exp. Med., 132:, 211-250; and Johnson G., Wu, T.T. and Kabat,E.A. (1995) In Paul,S. (ed.), Antibody Engineering Protocols. Humana Press, pp.1-15, 이는 참조로서 본원에 포함됨. 항체는 또한 조합 면역글로불린 라이브러리에서 분리된 인간 항체 단편들에서 유래될 수 있다; 예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Barbas et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2, 119, 1991. 또한, 키메라 항체가 적절한 생물학적 특이성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 적절한 항원 특이성을 지니는 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 스플라이싱함으로써 수득될 수 있다; 예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Takeda et al., Nature 314: 544-546, 1985. 키메라 항체는 상이한 동물 종들에서 유래된 상이한 부분들이 있는 항체이다.
항-이디오타입(anti-idiotype) 기술이 에피토프를 모방하는 모노클로날 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 제 1 모노클로날 항체에 대해 제조된 항-이디오타입 모노클로날 항체는 상기 제 1 모노클로날 항체에 의해 결합된 에피토프의 "이미지(image)"인 과가변 영역내 결합 도메인을 지닐 것이다. 대안적으로, 단일쇄 항체를 생성하기 위해 사용되는 기술들이 단일쇄 항체를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 단일쇄 항체는 아미노산 브릿지(bridge)를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결시킴으로써 형성되는데, 그 결과 단일쇄 폴리펩티드가 형성된다. 특이적인 에피토프, 예를 들어, 세포외 에피토프를 인지하는 항체 단편이 당업계에 널리 공지된 기술들에 의해 생성될 수 있다. 이러한 단편은 단백질가수분해 절단에 의해 생성된 Fab 단편, 및 이황화 브릿지를 환원시킴으로써 생성된 Fab 단편을 포함한다. 면역요법에 관해 사용되는 경우, 모노클로날 항체, 이의 단편, 또는 상기 둘 모두가 치료 작용제로 라벨링되거나 라벨링되지 않을 수 있다. 이러한 작용제는 당업계에 널리 공지된 기술들에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 모노클로날 항체에 커플링될 수 있으며, 약물, 방사성동위원소, 렉틴 및 독소와 같은 작용제를 포함한다.
모노클로날 항체의 투여를 위한 투여량 범위는 충분히 커서 요망되는 효과를 생성시키며, 연령, 질환, 체중, 성별, 연령, 및 치료될 질환의 정도에 따라 달라질 것이고, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 2000 mg/kg일 수 있다. 모노클로날 항체는 정맥내로, 복강내로, 근내로, 및/또는 피하로 투여될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 항원 펩티드에 의해 포함되는 하나 이상의 에피토프는 단백질의 표면, 예를 들어, 친수성 영역 상에 위치한 막 복구 폴리펩티드, MG53, 막 복구 폴리펩티드 결합 단백질, MG53 결합 단백질, 막 복구 폴리펩티드 수용체, 및/또는 MG53 수용체의 영역이다. 단백질 서열의 소수성 분석은 폴리펩티드의 영역이 특히 친수성이고, 따라서 항체 생성을 표적화하는데 유용한 표면 잔기를 엔코딩할 가능성이 있다는 것을 제시할 것이다. 항체 생성을 표적화하기 위한 수단으로써, 친수성 및 소수성 영역을 나타내는 수치요법 도표(hydropathy plots)는, 예를 들어, 푸리어(Fourier) 변형을 수반하거나 수반하지 않는, 카이트 둘리틀(Kyte Doolittle) 또는 홉 우드(Hopp Woods) 방법을 포함하는, 당업계에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌들을 참조하라: Hopp and Woods, 1981, Proc . Nat . Acad . Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol . Biol. 157: 105-142(상기 각각의 문헌은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다). 항원 단백질, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 동족체 내부의 하나 이상의 도메인에 대해 특이적인 항체가 또한 본원에 제공된다. 본 발명의 단백질, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체, 동족체 또는 올솔로그는 이들 단백질 구성요소에 면역특이적으로 결합하는 항체의 생성에 있어서 면역원으로 이용될 수 있다.
인간 항체
완전한 인간 항체는 본질적으로 CDR을 포함하는, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 전체 서열이 인간 유전자에서 유래된 항체 분자이다. 이러한 항체는 본원에서 "인간 항체", 또는 "완전한 인간 항체"로 명명된다. 인간 모노클로날 항체는 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 트리오마(trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(하기 문헌 참조: Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72) 및 EBV 하이브리도마 기술(참조: Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)로 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체는 본 발명의 실시에 이용될 수 있으며 인간 하이브리도마를 사용하거나(하기 문헌 참조: Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) 또는 시험관내에서 인간 B-세포를 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스로 형질전환시킴으로써(하기 문헌 참조: Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) 생성될 수 있다.
또한, 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는, 추가 기술들을 사용하여 생성될 수 있다(Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol., 222:581 (1991)). 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 내생성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전하게 비활성화된 마우스에 도입함으로써 제조될 수 있다. 공격시, 사함 항체 생성이 관찰되는데, 이 항체는 유전자 재배열(rearrangement), 조립 및 항체 레퍼토리(repertoire)를 포함하는, 모든 측면에서 인간에서 나타나는 항체와 매우 유사하다. 이러한 접근법은, 예를 들어, 하기 문헌들에 기재되어 있다: 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, 및 Marks et al. (Bio / Technology, 10:779-783 (1992)); Lonberg et al. (Nature, 368:856-859 (1994)); Morrison (Nature, 368:812-13 (1994)); Fishwild et al,(Nature Biotechnology, 14:845-51 (1996)); Neuberger (Nature Biotechnology, 14:826 (1996)); 및 Lonberg and Huszar (Intern. Rev . Immunol., 13:65-93 (1995)).
인간 항체는 추가적으로 인간이 아닌 트랜스제닉 동물을 사용하여 생성될 수 있는데, 상기 동물은 항원에 의한 공격에 반응하여 동물의 내생성 항체 보다 완전한 인간 항체를 생성하도록 변형된다. 인간이 아닌 숙주에서 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 내생성 유전자가 무력화되고, 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 활성있는 유전자좌가 숙주의 유전체 내로 삽입된다. 인간 유전자는, 예를 들어, 필수적인 인간 DNA 세그먼트를 함유하는 효모 인공 염색체를 사용하여 통합된다. 이후 완전히 보완된 변형보다 더 적게 함유하는 중간 트랜스제닉 동물을 교차교배함으로써 요망되는 모든 변형을 제공하는 동물이 자손으로 획득된다. 이러한 인간이 아닌 동물의 바람직한 구체예는 마우스이고, PCT 공개공보 WO 96/33735 및 WO 96/34096에 개시된 바와 같이 제노마우스(XenomouseTM)로 명명된다.
치료학적 유효량의 본 발명의 항체는 일반적으로 치료 목적을 달성하기 위해 요구되는 양이다. 위에 언급된 바와 같이, 이것은 항체와 이의 표적 항원 사이의 결합 상호작용일 수 있는데, 상기 상호작용은 특정 경우에 있어서, 표적의 기능을 방해하고, 다른 경우에 있어서, 생리학적 반응을 촉진한다. 또한, 투여될 필요가 있는 양은 특정 항원에 대한 항체의 결합 친화성에 좌우될 것이고, 또한 투여되는 항체가 투여되는 자유 부피의 다른 피검체로부터 제거되는 속도에 좌우될 것이다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 치료학적으로 유효한 투여량에 대한 통상적인 범위는, 비제한적인 예로, 약 0.1 mg/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중일 것이다. 통상적인 투여 빈도는, 예를 들어, 1일 2회 내지 1주당 1회의 범위일 수 있다.
본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 뿐만 아니라, 본원에 개시된 스크리닝 검정법에 의해 확인된 기타 분자가, 약제학적 조성물의 형태로 다양한 장애의 치료를 위해 투여될 수 있다. 이러한 조성물을 제조하는데 포함되는 원리 및 고려사항을 비롯한, 구성요소 선택에서의 지침은, 예를 들어, 하기 문헌들에 제공되어 있다: Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; 및 Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York. 활성 성분은 또한 액적형성(coacervation) 기술 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노-입자, 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼 중의 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각에 포획(entrapment)될 수 있다. 생체내 투여를 위해 사용되는 제형은 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
지연 방출 제조물이 제조될 수 있다. 지연 방출 제조물의 적절한 예는 항체를 함유한 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하는데, 상기 매트릭스는 성형된 제품의 형태, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐이다. 지연 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리탁티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어, 루프론 데포(LUPRON DEPOTTM)(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드(leuprolide) 아세테이트로 구성된 주사가능한 미세구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예를 들어, 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 이상 동안 분자를 방출할 수 있는 반면, 특정 하이드로겔은 더 짧은 시간 기간 동안 단백질을 방출한다.
ELISA 검정
분석대상물 단백질을 검출하기 위한 작용제는 분석대상물 단백질, 바람직하게는 검출가능한 라벨을 지니는 항체에 결합할 수 있는 항체이다. 항체는, 폴리클로날, 또는 더 바람직하게는, 모노클로날 항체일 수 있다. 온전한 항체, 또는 이의 단편(예를 들어, Fab 또는 F(ab)2)이 사용될 수 있다. 프로브 또는 항체와 관련하여, 용어 "라벨링된"은 검출가능한 물질의 프로브 또는 항체로의 커플링(즉, 물리적으로 연결)에 의한 프로브 또는 항체의 직접적 라벨링을 비롯한, 직접적으로 라벨링된 또 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적 라벨링을 포함한다. 간접적 라벨링의 예는 형광적으로 라벨링된 2차 항체를 이용한 일차 항체의 검출 및 형광적으로 라벨링된 스트렙트아비딘으로 검출될 수 있도록 하는 비오틴을 이용한 DNA 프로브의 말단-라벨링을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 피검체로부터 분리된 조직, 세포 및 생물학적 유체를 비롯한, 피검체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함한다. 따라서, 용어 "생물학적 샘플"의 사용에는, 혈액, 및 혈청, 혈장, 또는 림프액을 포함하는 혈액의 분획 또는 성분이 포함된다. 즉, 본 발명의 검출 방법은 시험관내 뿐만 아니라 생체내에서 생물학적 샘플 내의 분석대상물 mRNA, 단백질, 또는 유전체 DNA을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 분석대상물 mRNA의 검출을 위한 시험관내 기술은 노던 하이브리드화 및 인 시츄(in situ) 하이브리드화를 포함한다. 분석대상물 단백질의 검출을 위한 시험관내 기술은 효소 면역 측정법(ELISA), 웨스턴 블롯, 면역침전, 및 면역형광을 포함한다. 분석대상물 유전체 DNA의 검출을 위한 시험관내 기술은 서던 하이브리드화를 포함한다. 면역검정을 수행하기 위한 절차는, 예를 들어, 하기 문헌들에 기재되어 있다: "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, N.J., 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1996; 및 "Practice and Thory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. 또한, 분석대상물 단백질의 검출을 위한 생체내 기술은 피검체 내로 라벨링된 항-분석대상물 단백질 항체를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체는 방사능 마커로 라벨링될 수 있는데, 피검체내 항체의 존재 및 위치가 강내 표준 이미지화 기술(imaging techniques intracavity)에 의해, 또는 경피적으로, 단독으로 또는 효과기 세포를 이용하여 검출될 수 있다.
본 발명의 치료제의 투여를 위한 제조물은 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들어, 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레이트를 포함한다. 수성 담체는 염수 및 완충된 매질을 포함하는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비히클은 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 소듐 클로라이드, 유체 및 영양 보충액(replenishers), 전해질 보충액 등을 포함하는 락테이트화된 링거 정맥내 비히클을 포함한다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제 및 비활성 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제가 또한 첨가될 수 있다.
본 발명의 화합물, 핵산 분자, 폴리펩티드, 및 항체(본 명세서에서 "활성 화합물"로도 지칭됨) 및 이의 유도체, 단편, 유사체 및 동족체가 투여하기에 적절한 약제학적 조성물로 통합될 수 있다. 이러한 조성물은 통상적으로 핵산 분자, 단백질, 또는 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"는, 약제학적 투여와 양립가능한, 임의의 용매 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 적절한 담체는 당해 분야의 표준 참고 교과서인 레밍톤의 약제 과학의 가장 최신판에 기재되어 있는데, 상기 문헌은 참조로서 본원에 포함된다. 이러한 담체 또는 희석제의 바람직한 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 물, 염수, 링거 용액, 덱스트로오스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함한다. 리포솜 및 비수성 비히클, 예를 들어, 비휘발성 오일이 또한 사용될 수 있다. 약제학적 활성 물질을 위한 상기 매질 및 제제의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 지금까지의 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립불가능한 경우를 제외하고, 조성물내에서 이의 사용이 고려된다. 보조 활성 화합물이 또한 조성물내에 통합될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구(예를 들어, 흡입), 경피(즉, 국소), 경점막(transmucosal), 복막내, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내, 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어, 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제, 예를 들어, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 또는 소듐 비술파이트; 킬레이트화제, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 긴장성(tonicity)의 조정을 위한 제제, 예를 들어, 소듐 클로라이드 또는 덱스트로오스. pH는 산 또는 염기, 예를 들어, 염산 또는 소듐 히드록사이드로 조정될 수 있다. 비경구 제조물은 앰풀, 유리 또는 플라스틱으로 제조된 1회용 주사기 또는 복수 용량 바이얼내에 담겨질 수 있다.
주사용으로 사용하기에 적절한 약제학적 조성물은 멸균된 수성 용액(수 가용성) 또는 현탁액 및 멸균된 주사가능 용액 또는 현탁액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적절한 담체는 생리 염수, 정균성(bacteriostatic) 물, 크레모포르(CremophorTM)(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에 있어서, 조성물은 멸균되어야 하며 유동성이 있어서 간편한 주사능(syringeability)이 존재하여야 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정하여야 하며 미생물, 예를 들어, 세균 및 진균의 오염 활동에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 용매 또는 현탁 매질, 및 이의 적절한 혼합물일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예를 들어, 레시틴을 사용함으로써, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지함으로써, 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 미생물의 활동의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살(thimerosal) 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 조성물내에 등장성제, 예를 들어, 당, 다가알코올, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 소듐 클로라이드를 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
경구 투여의 경우, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어, 결합제(예를 들어, 미리젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충전제(예를 들어, 락토오스, 미세결정성 셀룰로오스 또는 칼슘 하이드로젠 포스페이트); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 또는 실리카); 붕괴제(예를 들어, 감자 전분 또는 소듐 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제(예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트)로 통상적인 수단에 의해 제조된, 예를 들어, 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 경구 투여용 액체 제조물은, 예를 들어, 용액, 시럽, 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 이들은 사용하기에 앞서 물 또는 기타 적절한 비히클로 구성하기 위한 건조 생성물로 제공될 수 있다. 이러한 액체 제조물은 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예를 들어, 현탁제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 먹을 수 있는 지방); 에멀젼화제(예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클(예를 들어, 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알코올 또는 분획화된 식물성 오일); 및 보존제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)로 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 제조물은 또한 적절한 경우, 완충 염, 착향제, 착색제, 및 감미제를 함유할 수 있다. 경구 투여용 제조물은 활성 화합물의 조절된 방출을 부여하기 위해 적절하게 제형화될 수 있다. 협측(buccal) 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다. 흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 적절한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적절한 기체의 사용과 함께, 가압된 팩 또는 연무기(nebuliser)로부터 제공되는 에어로졸 스프레이 형태로 간편하게 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우에 있어서, 투여량 단위는 계측량(metered amount)을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로서 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기(insufflator)로 사용하기 위한, 예를 들어, 젤라티의 캡슐 및 카트리지는 화합물의 분말 믹스 및 적절한 분말 기재, 예를 들어, 락토오스 또는 전분을 함유하여 제형화될 수 있다. 화합물은 주사, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속된 주입에 의해 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 첨가된 보존제와 함께, 단위 투여량 형태로, 예를 들어, 앰풀로 또는 복수-용량 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액, 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 제형화제(formulatory agents), 예를 들어, 현탁제, 안정화제, 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용하기 전에, 적절한 비히클, 예를 들어, 멸균된 발열원 비함유(pyrogen-free) 물로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다. 화합물은 또한 예를 들어, 통상적인 좌제 기재, 예를 들어, 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드르 함유하는, 직장 조성물, 예를 들어, 좌제 또는 체류 관장제로 제형화될 수 있다. 앞서 기재한 제형 이외에, 화합물은 또한 데포(depot) 제조물로 제형화될 수 있다. 이러한 장기 작용 제형은 이식(implantation)에 의해(예를 들어, 피하로 또는 근내로) 또는 근내 주사로 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 화합물은 적절한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용가능한 오일 중의 에멀젼으로) 또는 이온 교환 수지로 제형화되거나, 극소량으로 용해될 수 있는(sparingly soluble) 유도체, 예를 들어, 극소량으로 용해될 수 있는 염으로 제형화될 수 있다.
한 구체예에서, 활성 화합물은 신체로부터의 급속한 제거에 대해 화합물을 보호할 담체로, 예를 들어, 임플란트 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는, 조절 방출 제형으로 제조된다. 생분해가능, 생적합성 중합체, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르쏘에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조를 위한 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation)사 및 노바 파마슈티칼즈, 인크(Nova Pharmaceuticals, Inc.)사로부터 구입할 수 있다. 리포솜 현탁액(바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체로 감염된 세포에 표적화되는 리포솜을 포함함)이 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같이, 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여의 용이 및 투여량의 균일성을 위하여 투여량 단위 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제형화시키는 것이 특히 유익하다. 본원에서 사용된 투여량 단위 형태는 치료되는 환자를 위한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 이산된 단위를 의미한다; 사전결정된 양의 활성 화합물을 함유하는 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 연관되어 요망되는 치료 효과를 생성하도록 계산된다. 본 발명의 투여량 단위 형태를 위한 명세는 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성되는 특정 치료 효과, 및 개체의 치료를 위한 활성 화합물을 화합시키는 당업계의 고유한 제한사항에 의해 지시되며 이에 직접적으로 좌우된다.
본 발명의 핵산 분자는 벡터내로 삽입되고 유전자 요법 벡터로서 사용될 수 있다. 유전자 요법 벡터는, 예를 들어, 정맥내 주사, 국소 투여에 의해(예를 들어, 미국 특허 제5,328,470호 참조) 또는 정위(stereotactic) 주사에 의해(예를 들어, 다음 문헌 참조: Chen, et al., 1994. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91: 3054-3057) 피검체에 전달될 수 있다. 유전자 요법 벡터의 약제학적 제조물은 허용가능한 희석제 중에 유전자 요법 벡터를 포함할 수 있으며, 유전자 전달 비히클이 포매된(imbedded) 서방(slow release) 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 유전자 전달 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터가 재조합 세포로부터 온전하게 생성될 수 있는 경우, 약제학적 제조물은 유전자 전달 시스템을 생성하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 투여를 위한 사용설명서와 함께 용기, 팩, 또는 분배기내에 포함될 수 있다.
본 발명에 따라 본원에 기재된 방법, 선별 전략, 물질, 또는 구성요소들 중 임의의 것을 활용한 키트 또는 시스템이 또한 개시된다. 본 발명의 교시에 따른 대표적인 키트는, 선택적으로, 방법 또는 검정 실행, 물질 패키징, 검정, 장치 또는 시스템 구성요소를 포함하는 하나 이상의 용기, 또는 기타 사항에 관한 사용설명서를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 추가적인 목적 및 이점은 본 발명의 상세한 설명 및 바람직한 구체예들의 실시예의 견지에서 당업자에 의해 이해될 것이고, 본 발명의 영역내에 명백히 포함된다.
실시예
근육 특이적 TRIM 패밀리 단백질인 MG53 의 발견. 근육발생, Ca2 - 신호전달 및 횡문근 세포에서의 막 온전성의 유지와 관련된 신규한 단백질의 확인을 가능케 하는 기존에 확립된 면역-단백체(immuno-proteomic) 접근법을 이용하여 MG53을 분리시켰다. 간단하게, 이러한 접근법은 래빗 골격근으로부터의 트리어드 농화된(triad-enriched) 막으로 면역화된 마우스로부터 발생된 ~6500개의 클론을 함유하는 모노클로날 항체 라이브러리를 이용한다. 면역형광 현미경 하에서 관찰된 횡문근 섹션의 z-선(z-line) 염색 패턴에 기초하여 관심 항체를 선택하였다. 항체-친화성 컬럼을 통해 표적-단백질을 정제하고, 정제된 단백질의 부분적 아미노산 서열을 수득하였다. 부분적 아미노산 서열에 기초하여, 표적 유전자를 코딩하는 완전한 cDNA를 골격근 cDNA 라이브러리로부터 분리시켰다. 이후, 다른 피자극성 조직 내의 확인된 유전자의 다양한 이소폼(isoform)의 존재를 검사하기 위해 상동성 유전자 스크리닝을 이용하였다. 최종적으로, 관심 유전자의 생체내 생리학적 기능을 연구하기 위해 트랜스제닉 또는 녹아웃 마우스 모델을 발생시켰다.
근육 특이적 단백질에 대한 상기 면역-단백체 라이브러리의 스크리닝은 특별히 횡문근 조직을 갖는 53 킬로달톤(kDa)의 분자 크기를 갖는 mAb5259에 의해 인지되는 항원의 확인을 야기하였다(도 3B). mAb5259 면역친화성 컬럼에 의해 래빗 골격근으로부터 단백질 "MG53"을 부분적으로 정제하고, 아미노산 서열분석에 적용시켰다. 골격근 cDNA 라이브러리 스크리닝 및 유전체 데이터베이스 연구로 MG53에 대한 예측 아미노산 서열 및 인간 16 p11 .2 유전자좌 상의 해당 mg53 유전자를 확인하였다. mg53 mRNA에 대한 노던 블로팅(Nothern blotting)으로 골격근 및 심근을 이용한 특이적 발현을 확인하였다(도 3C). 도메인 상동성 분석은 MG53이 Ring, B-박스 및 코일드-코일(RBCC) 부분을 포함하는 원형의 트리파타이트 모티프, 뿐만 아니라 카르복실 말단에서 SPRY 도메인을 함유하는 것을 나타내었다(도 1, 2 및 3A). SPRY 도메인은 피자극성 세포의 근소포체 내의 리아노딘(ryanodine) 수용체 Ca2 + 방출 채널에서 첫번째로 관찰된 보존된 서열이다. 다양한 포유동물 유전체에서 지금까지 확인된 약 60개의 TRIM 패밀리 일원에서, 15개의 일원이 RBCC 도메인 뒤에 유사한 SPRY 도메인을 지니고, MG53은 상기 TRIM 서브패밀리 단백질을 갖는 보존된 일차 구조를 나타낸다.
MG53 은 근육 세포에서 소포 이동을 매개한다. 일차 구조 내에서는 막 스패닝 세그먼트(membrane-spanning segment) 또는 지질 변형 모티프가 존재하지 않지만, MG53은 골격근 내의 막 구조에 주로 제한되는 것으로 보인다. 면역조직화학 분석은 횡문근형질막 및 세포내 소포 내에서의 MG53에 대한 특이적 라벨링을 나타내었다(도 3D). MG53 은 TRIM 및 SPRY 모티프를 함유하는 근육 특이적 단백질이다. 기존의 연구에서, 본 발명자는 골격근 내의 트라이어드 정션(triad junction)과 관련된 단백질을 표적으로 하는 모노클로날 항체(mAb) 라이브러리를 확립하였다. 근육 특이적 단백질에 대한 상기 면역-단백체 라이브러리의 스크리닝은 mAb5259에 의해 인지되는 53 킬로달톤(kDa)의 분자 크기를 갖는 MG53으로 명명된 항원의 확인을 야기하였다. MG53을 mAb5259로 컨쥬게이션된 면역친화성 컬럼에 의해 래빗 골격근으로부터 부분적으로 정제시키고, 아미노산 서열분석에 적용시켰다. 수득된 부분적 아미노산 서열에 기초하여, MG53을 엔코딩하는 cDNA를 래빗 및 마우스 골격근 라이브러리로부터 분리시켰다. 유전체 라이브러리 연구로 인간 16p11.2 유전자좌 상의 상응하는 MG53 유전자를 확인하였다. 여러 종에서의 MG53에 대한 예측 아미노산 서열이 도 1에 제시되어 있다.
도메인 상동성 분석은 MG53이 RBCC의 원형 TRIM 서명 서열 및 카르복실 말단에서의 SPRY 도메인을 함유하고, 이에 따라 TRIM/RBCC 패밀리에 속하는 것을 나타내었다(도 1). 포유동물 유전체에서 지금까지 확인된 약 60개의 TRIM 패밀리 일원에서, 15개의 일원이 RBCC 도메인 뒤에 유사한 SPRY 도메인을 지니고, MG53은 상기 TRIM 서브패밀리 단백질을 갖는 보존된 일차 구조를 나타낸다(도 2). 그러나, 놀랍고도 예기치 않게, 본 연구는 MG53이 막 복구 기능을 입증하는, 도 2의 TRIM 패밀리 단백질 중 유일한 TRIM 패밀리 단백질임을 나타낸다.
웨스턴 블롯 검정은 마우스 조직에서의 MG53의 근육 특이적 발현을 입증한다(도 3B). 일차 구조 내에서는 막 스패닝 세그먼트 또는 지질 변형 모티프가 존재하지 않지만, MG53은 골격근 내의 막 구조에 주로 제한되는 것으로 보인다. mAb5259를 이용한 면역조직화학 분석은 골격근 섬유의 횡단면 내의 횡문근형질막 및 TT 막에서 MG53에 대한 특이적 라벨링을 나타내었다(도 3C). 또한, 횡단면은 횡문근형질막 근처의 MG53의 국소화된 농도를 나타내었고, 횡문근형질막의 온전한 막 단백질에 대해 통상적으로 관찰되는 것보다 광범위한 염색 패턴이 있었다. 따라서, MG53은 TRIM 패밀리 단백질에 대한 독특한 세포하 분포 패턴을 나타내는 근육 특이적 TRIM 패밀리 단백질이다.
MG53 은 세포 손상 후의 골격근 섬유에서의 급성 막 복구를 매개한다. 근육 막 복구에서 MG53의 생리학적 기능을 추가로 규정하기 위해, MG53이 존재하지 않는 마우스 모델을 발생시켰다. mg53 -/- 마우스는 스트레스가 없는 조건에서 11개월의 연령까지 생존한다. 생체내 스트레스 시험은 mg53 -/- 근육의 막 복구 기능에서 여러 결함을 나타내었다. 도 4C에 도시된 바와 같이, 내리막 달리기 운동에 의해 유도된 막 손상은 mg53 -/- 마우스로부터의 가자미근의 심각한 절충 수축 기능을 나타내었다. 격렬한 운동 없이, mg53 -/- 가자미근은 야생형(wt) 대조군에 비해 생체외 피로 누적 후에 수축 기능의 회복에 약간의 어려움을 나타내었다(나타내지 않음). 이러한 차이는 8-10개월의 연령에서 운동 유도 손상 후에 크게 악화될 수 있다. 명백히, mg53 -/- 근육에서 보다 심각한 손상이 발견될 수 있었고, wt 근육에 비해 약하고 변동적인 수축 기능이 관찰되었다(도 4D).
마우스의 복막내 공간으로의 에반스 블루 염료의 주입은 내리막 운동 유도 근육 손상 후의 횡문근형질막 온전성을 직접 모니터한다. 도 4E에 도시된 바와 같이, mg53 -/- 마우스로부터 분리된 근섬유는 wt 근육보다 현저하게 많은 에반스 블루 염색을 나타내었고, 이는 광대한 범위의 운동 유도 근육 손상을 나타낸다. 이는 어린 mg53 -/- 마우스에 비한 나이든 mg53 -/- 마우스에서 증가되는, mg53 -/- 근육에서의 증가된 퇴행위축을 나타낸 H/E 염색에 의해 확인되었다(도 4A). 근다발로부터 추출된 에반스 블루의 전체 흡광도의 정량적 검정은 내리막 달리기 후의 mg53-/- 마우스에서의 증가된 근육 손상을 직접적으로 지지한다(도 4F).
막 복구에서의 MG53의 역할과 일치하게, 분리 동안 손상된 개별적 단지굴근(FDB) 근섬유의 면역염색을 이용하여 MG53의 상승된 농도가 손상 부위에서 관찰되었다(도 5A). 이러한 막 패치는 디스퍼린(dysferlin)에 대한 염색을 이용하여 종종 공동 국소화될 것이다. 본 발명자는 개별적 FDB 근섬유에 대한 레이저 유도 막 손상 후의 FM-143 형광 염료 유입의 측정을 통하여 MG53-매개 막 복구 기능을 직접 평가하였다. wt 근섬유는 FM-143 형광 염료의 효과적인 배제를 나타냄에 따라, 내재성 막 복구 기능을 함유하였고, 횡문근형질막의 레이저 유도 손상에 대해 상당히 내성이 있었다(도 5B). mg53 -/- FDB 근섬유로의 FM-143 형광 염료의 유의한 유입이 레이저 유도 손상 후에 관찰되었다(도 5C). 횡문근형질막의 레이저 손상 후의 FDB 근섬유 내의 FM-143의 시간 의존성 축적은 mg53 -/- 근육의 결함이 있는 막 복구 기능을 직접적으로 지지한다(도 5D).
MG53 의 발현은 정상적인 심장 막 온전성을 유지하는데 필수적이다. mg53 -/- 마우스에서의 결함은 골격근 섬유에 제한되지 않는다. 에반스 블루 염료의 주입 동안, 주입된 야생형 동물이 아무도 사망하지 않은 것에 비해 mg53 -/- 마우스의 ~50%가 주입 16시간 이내에 사망하였다. mg53 -/- 심장의 시체해부검사는 운동 스트레스의 부재하에서도 에반스 블루를 이용한 심근섬유의 광범위한 라벨링을 나타내었다(도 6). 본 발명자는 또한 운동이 mg53 -/- 심장에서 에반스 블루 염색의 범위를 크게 악화시키는 것을 발견하였다.
MG53 의 손실은 심장 허혈 재관류 손상에 대한 민감성을 증가시킨다(도 7). 야생형(WT) 및 mg53 -/-(mg53KO) 마우스로부터 심장을 분리시키고, 랑겐도르프(Langendorff) 장치에서 관류시켰다. 관류액 유동의 정지에 의해 30분 동안 전체적인 허혈을 유도시켰다. 관류액 유동의 회복 후에 심장에서 발생된 손상(시간 0)을 (a) 크레아틴 키나아제(CK) 또는 (b) 락테이트 데히드로게나아제(LDH)에 대한 효소 검정에 의해 측정하였다. mg53 -/- 마우스(점선)로부터의 심장은 야생형(실선)보다 많은 손상을 나타낸다. 데이터는 각각의 나열된 시점에 대한 평균±S.D.로 제시된다.
막 복구에 대해 형질막과의 소포 융합이 필요하고, 기존의 연구는 골격근 막 온전성의 유지에서의 디스퍼린의 역할을 나타낸다. 본 발명의 발견은 MG53이 아마 막 붕괴 후의 복구 과정을 매개하는, 형질막으로의 소포의 이동을 유도할 수 있음을 나타낸다. 미소전극을 이용한 형질막의 물리적 침투에 의해 발생된 급성 세포 손상은 손상 부위로의 GFP-MG53 소포의 신속한 점증을 야기시킨다(도 8A). 세포의 분쇄를 발생시키는 보다 심각한 손상이 발생하는 경우, 복구 부위는 GFP-MG53으로 밀집하여 라벨링된다(도 8B). 또한, 성숙 C2C12 근관에서 상기 급성 막 복구가 또한 관찰되었다. 이러한 데이터는 MG53-매개 소포 이동이 세포막의 급성 복구에서 능동적 역할을 함을 나타낸다.
MG53의 기능은 손상 후에 근육 세포의 막 패칭(patching) 및 생존을 가능케 하는데 필수적으로 보인다. 근육모세포가 야생형 및 mg53 녹아웃(mg53 -/- ) 마우스로부터 분리되고, 분화되어 근관을 형성하는 경우, mg53 -/- 근관은 미소전극 침투에 의해 유도된 기계적 손상으로부터 회복될 수 없다(도 8). 이는 MG53이 근육에서 막 재봉합 및 세포 생존에 필수적임을 나타내는데, 이는 야생형 근관이 이의 막을 재봉합할 수 있고, mg53 -/- 근관이 손상되는 경우에 생존할 수 없기 때문이다(도 8C). 이는 막 재봉합에서 MG53의 기능적 역할을 입증하고, MG53이 횡문근에서의 막 재봉합에 필수적임을 나타낸다.
MG53 기능에서의 TRIM 및 SPRY 모티프의 역할. MG53의 도메인의 구조/기능 평가(도 9)는 MG53의 세포내 분포에서 MG53으로의 GFP 융합체의 현저한 극성을 나타내었다. 특히, MG53의 카르복실 말단으로의 GFP의 융합은 소포 구획으로의 분배 및 횡문근형질막으로 표적화시키는 MG53의 능력을 변경시킨다. MG53의 막-융합체 기능의 촉진에서의 TRIM 및 SPRY 도메인의 기능을 추가로 시험하기 위해, GFP에 커플링된 일련의 결실 돌연변이(도 9A)를 발생시켰다.
MG53의 상기 돌연변이 작제물의 세포하 국소화를 분석하기 위해, 일시적 발현 후에 C2C12 근육모세포에 공초점현미경 이미지화를 적용하였다. 도 9B에 도시된 바와 같이(우측 패널), GFP-TRIM 또는 TRIM-GFP는 횡문근형질막의 명백한 라벨링 없이 세포내 소포에 우선적으로 국소화되었다. 이러한 결과는 GFP-TRIM 또는 TRIM-GFP가 부재하는 SPRY 도메인이 횡문근형질막으로의 MG53의 표적화에 필요함을 암시한다. MG53-GFP가 우선적으로 세포질 분포를 나타낸다는 사실(도 9B, 좌측 패널)은 세포 표면막으로의 MG53의 표적화에서의 SPRY의 역할을 추가로 지지한다.
흥미롭게도, GFP-SPRY 또는 SPRY-GFP는 우선적으로 세포질 패턴의 분포를 나타내었으나, 이들은 세포내 소포로부터 명백하게 배제된다(도 9B, 중앙 패널). GFP-SPRY 및 SPRY-GFP의 세포내 소포에서의 국소화의 배제와 커플링된 세포질 분포 패턴은 TRIM의 역할을 반영하는 것으로 보인다. 아마, TRIM 모티프는 세포내 소포로의 MG53의 부착을 매개할 수 있을 것이다(도 9B, 우측 패널). SPRY 도메인은 단독으로 횡문근형질막으로의 표적화에 불충분하므로, TRIM 도메인은 횡문근형질막으로의 MG53의 적절한 이동을 위해 SPRY 도메인과 세로로 1열이 되어 존재해야 한다.
MG53 캡은 카베올린 -3( Cav -3)과 상호작용한다. 또한, 본 발명의 공동-면역침전 데이터는 카베올린-3이 MG53의 TRIM 모티프와 상호작용하는 것을 나타낸다(도 9C). 따라서, MG53과 카베올린-3 사이의 기능성 상호작용이 C2C12 근육모세포에서 GFP-SPRY 및 SPRY-GFP의 확산된 패턴에 기여하는 세포 인자 중 일부에 기초가 되는 것이 가능하다. 전체적으로, 세포 표면 및 세포내 구획으로의 MG53의 조절된 분포는 TRIM과 SPRY 도메인 사이의 협동된 작용으로부터 발생할 수 있다. 적절한 MG53 세포하 국소화에 대한 TRIM 및 SPRY 둘 모두에 대한 상기 필요조건은 또한 명백한 기능적 중요성을 가지는데, 이는 상기 결실 돌연변이 중 어느 것도 전장 MG53의 과발현으로부터 관찰되는 필라포디아(filapodia)-유사 구조 또는 강한 소포 출아 사건을 나타내지 않기 때문이다.
MG53 은 비-근육 세포 유형에서 충분히 작용할 수 있다. 근육성 C2C12 세포 및 분리된 골격근 섬유에서 MG53 기능의 분석은 횡문근에서 소포 이동 및 막 복구에서 MG53의 필수적인 역할을 나타낸다. 막 복구가 세포 항상성을 유지하는데 필수적임을 고려할 때, 다른 비-근육 세포 유형에서 유사한 복구 메커니즘이 상기 과정을 촉진시키기 위해 유사한 분자 기구를 사용할 수 있는 것으로 보인다. 상기 가능성을 시험하기 위해, C2C12 근육 세포로 수행된 상기 실험 중 여러 실험을 비-근육 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포로 반복하였다. 이러한 세포에서, C2C12 세포에서 관찰된 것과 매우 유사한 표현형이 발견되었다. 첫번째로, GFP-MG53은 형질막의 필라포디아-유사 돌출을 생성시키고, 세포내 소포 및 형질막 둘 모두로 국소화될 수 있다. 두번째로, MG53 결실 단백질은 C2C12 세포에서 관찰된 것과 동일한 방식으로 거동하였다. 최종적으로, 카베올린-3은 또한 CHO 세포에서 발현된 MG53의 활성을 조절할 수 있다. 결과로서, 상기 연구는 MG53이 근육 외에 다른 세포 유형에 존재하는 보존된 분자 메커니즘을 통해 작용하는 것을 나타낸다.
MG53 은 비-근육 세포 유형에서 충분히 기능할 수 있다. 근육 C2C12 세포 및 분리된 골격근 섬유에서 MG53 기능의 분석은 횡문근에서 소포 이동 및 막 복구에서 MG53의 필수적인 역할을 나타낸다. 막 복구가 세포 항상성을 유지하는데 필수적임을 고려할 때, 다른 비-근육 세포 유형에서 유사한 복구 메커니즘이 상기 과정을 촉진시키기 위해 유사한 분자 기구를 사용할 수 있는 것으로 보인다. 상기 가능성을 시험하기 위해, C2C12 근육 세포로 수행된 상기 실험 중 여러 실험을 비-근육 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포로 반복하였다. 이러한 세포에서, C2C12 세포에서 관찰된 것과 매우 유사한 표현형이 발견되었다. 첫번째로, GFP-MG53은 형질막의 필라포디아-유사 돌출을 생성시키고, 세포내 소포 및 형질막 둘 모두로 국소화될 수 있다(도 10). 두번째로, MG53 결실 단백질은 C2C12 세포에서 관찰된 것과 동일한 방식으로 거동하였다. 최종적으로, 카베올린-3은 또한 CHO 세포에서 발현된 MG53의 활성을 조절할 수 있다(도 10). 결과로서, 상기 연구는 MG53이 근육 외에 다른 세포 유형에 존재하는 보존된 분자 메커니즘을 통해 작용하는 것을 나타낸다.
MG53 은 키네신 패밀리 일원 11( Kif11 )과 상호작용할 수 있다. 세포 용해질을 RFP(mRFP), RFP-MG53(MG53) 또는 C29L 돌연변이 RFP-MG53(C29L)의 FLAG-태깅된 형태를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 분리시켰다. 추출물을 항-FLAG 항체와 함께 공동면역침전화시킨 후, SDS-PAGE 젤 상에서 영동시켰다. 쿠마시 염색은 상기 접근법에 의해 본 발명자가 공동면역침전시킨 특정 밴드를 나타내었다. 하나의 두드러진 밴드는 Kif11(화살촉 모양)에 대한 것이었다(도 11a). 상기 젤로부터의 특정 밴드를 확인하기 위해 질량분광법을 이용하였다. 이러한 대표적인 질량분광법 추적은 MG53이 세포 용해질로부터 Kif11을 감소시킬 수 있는 것을 나타낸다(도 11b).
MG53 은 COP9 복합 동족체 서브유닛 6(CSN6)와 상호작용할 수 있다. HEK293 세포를 HA-태깅된 인간 MG53 및 myc-태깅된 CSN6로 일시적으로 트랜스펙션시킨 후, 재조합 태그에 대한 항체를 이용하는 공동-면역침전(IP)에 사용하였다(도 12). 감소 후의 단백질의 존재를 웨스턴 면역블롯(IB)을 이용하여 확인하였다. 몇몇 경우에, 프로테오솜 억제제 MG132를 또한 단백질 과발현 동안 단백질 안정성을 유지시키기 위해 첨가하였다. 본 발명자는 MG53이 CSN6을 감소시킬 수 있고, CSN6가 또한 MG53을 감소시킬 수 있는 것을 발견하였다. 이는 상기 2개의 단백질이 세포 내에서 상호작용할 수 있는 증거를 제공한다. 레인 1 = HA-hMG53+hCSN6+DMSO, 레인 2 = HA-hMG53+hCSN6+MG132, 레인 3 = HA-mMG53+hCSN6+DMSO, 레인 A = HA-mMG53+hCSN6+MG132.
MG53 은 수초 염기성 단백질 또는 페리악신과 상호작용할 수 있다. 야생형(WT) 또는 mg53 -/-(KO) 골격근으로부터의 소포 분획의 생화학적 분리를 위한 방법의 개략도(도 13a). 제시된 방법으로 분리된 분획을 15%(좌측)의 구배(우측)의 SDS-PAGE 젤 상에서 영동시켰다. 브릴리언트 블루(CBB) 염색은 WT 또는 KO 근육에 차별적으로 존재하는 특정한 밴드를 나타내었다(도 13b). 2개의 두드러진 밴드는 질량분광법에 의해 수초 염기성 단백질 또는 페리악신(화살표)으로 확인되었다.
MG53 은 소포 이동을 매개하기 위해 포스파티딜세린과의 결합을 통해 세포막과 상호작용한다. GFP-MG53이 상기 mg53 (-/-) 근관에서 발현되는 경우, 단백질은 형질막 및 세포내 소포에 적절하게 국소화될 것이다(도 14A, 상부). 상기 mg53 (-/-) 근관이 손상되는 경우, GFP-MG53은 손상 부위로 국소화될 수 있다(도 14A, 하부). 지질 프로파일링(22)은 정제된 재조합 MG53이 형질막의 내엽 및 세포내 소포의 형질막 면에서 우선적으로 출현하는 지질인 포스파티딜세린(PS)과 상호작용할 수 있는 것을 나타내었다. PIP2-스트립 지질 도트 블롯 분석은 재조합 MG53(1 μg/ml)이 포스파티딜세린(PS)에 특이적으로 결합하고, 스핑고신-1-P, 포스파티드산, 포스포티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 및 다양한 포스파이노시톨 대사물을 포함하는 다른 막 지질에는 결합하지 않는 것을 나타낸다(도 14B). 아넥신-V-GFP를 이용하여, 본 발명자는 C2C12 근육모세포 손상 부위에서 아넥신-V-GFP의 신속한 라벨링을 관찰하였다. C2C12 근육모세포로 트랜스펙션된 아넥신-V-GFP(PS에 결합하는 널리 규정된 능력을 갖는 분자)는 미소전극을 이용한 세포 손상 후에 최소 전위를 나타내는 반면(좌측), 아넥신-V-GFP와 RFP-MG53의 공동 발현(우측)은 아넥신-V-GFP의 가속화된 축적을 발생시킨다(도 14C). 아넥신-V-GFP의 축적을 RFP-MG53(0.93±0.21 ΔF/F0 대조군; 2.9±0.63 ΔF/F0 +MG53)의 공동 발현에 의해 가속화시켰고, 이는 손상 부위에서의 리페어좀(repairsome) 형성의 매개에서의 MG53의 역할과 일치한다. 손상된 형질막을 통한 세포외 Ca2 +의 유입은 PS로의 아넥신-V 결합을 가능케 하였고, 이는 세포 손상 전의 가용성 패턴으로부터 형질막 및 세포내 소포로의 명백한 국소화로의 전이를 발생시킨다(도 14D). 세포외 용액으로부터의 Ca2 +의 제거는 손상 부위에서 아넥신-V-GFP에 의한 PS의 라벨링을 붕괴시켰고, 손상 부위로의 RFP-MG53의 전좌가 유지되었다(도 14E).
Cys242 는 MG53 이 세포 산화환원 상태의 센서로 작용하는 것을 가능케 하고, 세포막을 재봉합시킨다. 티메로살은 MG53의 산화 매개 올리고머화의 기초가 되는 특정한 아미노산을 확인하기 위한 돌연변이유발 표적을 제공하는 시스테인 잔기에서 술프히드릴기를 산화시킨다. 다수의 보존된 시스테인 잔기를 알라닌으로 돌연변이시켰다. 한 특정 돌연변이 C242A는 MG53 올리고머화 특성의 완전한 상실을 야기시켰다(도 15A). 이러한 돌연변이는 막 표적화를 유지하였으나, 막 복구 과정을 촉진하는 능력을 완전히 붕괴시켰고(도 15E), 즉 손상 부위에서 C242A의 축적이 관찰되지 않았다. 각각의 보존된 시스테인 돌연변이 C313A는 산화 조건하에서 올리고머화 패턴을 유지시켰고, 야생형 GFP-MG53과 유사한 전위 및 막 복구 기능을 나타내었다(도 16). 환원된 세포외 환경하에서(+DTT), 손상 부위로의 GFP-MG53의 전위가 대부분 붕괴되었다. 세포외 용액으로의 산화제(티메로살)의 첨가는 세포막 상에서 손상 부위로의 GFP-MG53의 증가된 전위를 발생시켰다. 상기 실험을 C2C12 세포에서 수행하였다. C242A 돌연변이를 갖는 MG53(GFP-C242A)은 형질막 상의 손상 부위로 전위할 수 없다. 다양한 보존된 시스테인 돌연변이 C313A는 산화된 조건하에서 올리고머화 패턴을 유지하였고, 야생형 GFP-MG53과 유사한 전위 및 막-복구 기능을 나타내었다. 따라서, Cys242의 산화는 MG53의 올리고머화를 유도하는 것으로 보이고, 이는 손상 부위에서 리페어좀 형성을 위한 핵형성 부위를 제공한다. 상기 실험을 C2C12 세포로 수행하였다. 세포외 산화환원 상태의 조절은 세포의 외부에 적용된 FM-143 염료의 유입의 증가에 의해 측정되는 바와 같이 세포외 용액으로의 DTT의 첨가가 막 재봉합을 방지함에 따라 분리된 근섬유막의 재봉합에 영향을 줄 수 있다. 따라서, Cys242의 산화는 MG53의 올리고머화를 유도하는 것으로 보이고, 이는 손상 부위에서 리페어좀 형성을 위한 핵형성 부위를 제공한다.
MG53 -매개 리페어좀 형성 및 급성 횡문근형질막 손상의 회복이 도 17 에 도시되어 있다. FM1-43의 적색편이(red-shifted) 변이체인 FM4-64의 유입을 GFP-MG53 및 GFP-C242A로 트랜스펙션된 mg53 -/- 근관에서의 막 복구 능력의 지표로 사용하였다. 녹색 형광의 UV-표백 후, 손상 부위에서 GFP-MG53의 신속한 전위가 발생한 반면, GFP-C242A는 이의 결함이 있는 올리고머화 특성으로 인해 정지 상태를 유지하였다(도 16E, 17A). 유의하게는, GFP-C242A에 비해 GFP-MG53으로 트랜스펙션된 세포에서 FM4-64의 보다 적은 유입이 관찰되었는데, 이는 상기 돌연변이가 손상 후에 막 온전성을 회복할 수 없었던 것을 암시한다(도 17B). 이러한 데이터는 손상 부위로의 MG53 전위가 막 재봉합을 발생시키는 것을 직접적으로 지지한다. 야생형 골격근에서 발현된 GFP-C242A 돌연변이가 천연 MG53에 비해 우세한 음성 기능을 나타내었으므로, MG53의 올리고머화가 리페어좀 형성에서 필수적인 단계인 것으로 보인다(도 17C). GFP-MG53에 비한, 성체 야생형 근섬유에서의 GFP-C242A의 과발현은 횡문근형질막 복구 기능을 억제하였다(도 17C).
보존된 Ring - 핑거 모티프를 함유하는 다양한 세포 기능을 갖는 여러 TRIM - 패 밀리 단백질은 E3 - 리가아제 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. MG53이 시험관내에서 유비퀴틴화를 촉매할 수 있는지의 여부를 시험하기 위해, 본 발명자는 MG53에 대한 재조합 말토오스-결합 단백질(MBP) 융합 단백질을 제조하였다. MBP-MG53을 ATP, 유비퀴틴, E1 및 E2 효소와 함께 인큐베이션시키고, 항-MBP 항체를 이용한 면역블로팅에 적용시켰다. MBP-MG53이 E2로서 UbcH5 또는 Ubc4와 인큐베이션되는 경우에 유비퀴틴화로부터 유래된 고분자량 래더가 관찰되었다(도 18a, 및 데이터는 나타내지 않음). 상기 검정으로부터의 유비퀴틴, E1 또는 E2(UbcH5)의 배재는 상기 래더의 출현을 폐지시켰고, 이는 MBP-MG53에 의해 획득된 변형이 확실히 자가-유비퀴틴화였음을 입증한다. MG53의 Ring-핑거 모티프에서의 보존된 시스테인 잔기(Cys-29)가 류신으로 대체(C29L)된 경우, MG53의 내인성 E3-리가아제 활성이 현저히 감소하였다(도 18b). 따라서, MG53은 E2 효소의 Ubc4/5 서브패밀리와 커플링된 Ring-핑거 유형의 유비퀴틴 리가아제이다.
MG53에서 C29L 돌연변이의 기능적 영향을 시험하기 위해, 본 발명자는 C2C12 근관에서 발현된 GFP-MG53 및 GFP-C29L의 세포하 분포를 비교하였다. 놀랍게도, GFP-MG53의 독특한 막-구획 및 소포 테터링(tethering)이 GFP-C29L에서 상실되었고, 돌연변이 단백질은 C2C12 근관에서 세포질 패턴을 우선적으로 나타내었다(도 18d, 좌측). 웨스턴 블롯은 전장의 GFP-MG53 및 GFP-C29L 단백질이 분화된 C2C12 근관에 존재하고(도 18c), 이에 따라 상기 융합 단백질의 분해가 도 18d에서 관찰된 GFP-C29L 및 GFP-MG53의 다양한 세포하 분포에 기여하는 것 같지 않음을 입증하였다. 또한, mg53 -/- 신생아로부터 유래된 일차 배양된 골격 근관으로의 상기 융합 단백질의 일시적 발현으로 유사한 현상이 관찰되었고, 여기서 횡문근형질막 및 세포내 소포로의 GFP-MG53의 표적화가 GFP-C29L 돌연변이에 대해 감소되었다(도 18d, 우측). 결함이 있는 막 복구 기능을 나타낸 성체 mg53 -/- 근섬유와 유사하게(이전에 도시됨), 일차 배양된 mg53 -/- 근관 또한 야생형 대조군에 비해 막 복구에 결함이 있었고, 이에 따라 MG53의 세포 기능을 시험하기 위한 상동성 재구성 시스템을 제공하였다.
추가 연구는 GFP-C29L의 막 이동 및 막 구획 특성에 대한 변경이 MG53의 결함이 있는 막 복구 기능을 발생시키는 것을 나타내었다. 급성 막 손상 후, C2C12 근육모세포에서 GFP-MG53의 신속한 축적이 관찰된 반면, GFP-C29L은 고정되고, 막 손상의 복구에서 효과가 없는 것으로 보였다(도 18e, 좌측). GFP-C29L을 이용한 유사한 결함이 또한 C2C12 근관에서 관찰되었다(도 18e, 중앙). 또한, GFP-MG53은 일차 배양된 mg53 -/- 근관에서의 손상 후에 형질막으로 전위될 수 있으나, 상기 세포에서 발현된 GFP-C29L은 일반적으로 급성 세포 손상에 대해 무반응인 채로 남아 있었다(도 18e, 우측). 동시에, 상기 결과는 C29L 돌연변이와 관련된 E3-리가아제 활성의 상실이 MG53의 결함이 있는 막 복구 기능에 기초가 되는 MG53의 결함이 있는 이동을 야기시킬 수 있음을 나타낸다.
MG53 의 Ring 도메인은 또한 Zn 에 결합하여 다수의 단백질에서 효소 작용을 촉진하는 것으로 공지된 아연 핑거 모티프를 함유한다. Zn이 막 복구에서 MG53 기능에 기여할 수 있는지 시험하기 위해, 본 발명자는 GFP-MG53을 발현하는 C2C12 근육모세포의 손상 전에 세포외 용액으로부터 Zn을 제거하는 것의 효과를 연구하였다. 본 발명자는 N,N,N,N-테트라키스(2-피리딜-메틸)에틸렌디아민(TPEN)을 이용한 Zn의 킬레이트화가 미소전극 침투 부위로의 GFP-MG53의 전위를 방지할 수 있는 것을 발견하였고(도 19A), 이는 Zn이 MG53 기능에 필요한 것을 나타낸다. Zn 이온운반체 Zn-1-히드록시피리딘-2-틴(Zn-HPT)의 첨가는 C2C12 세포에서 GFP-MG53의 전위를 유도할 수 있었고(도 19B), 이는 추가 Zn이 증가된 MG53 기능을 유도할 수 있음을 암시한다. 이러한 관찰을 야생형 FDB 근섬유에서 확인하였고, 상기 세포로의 Zn-HPT의 첨가는 UV 레이저에 의해 유도된 손상 후에 근섬유로 유입할 수 있는 FM-1-43 염료의 양을 감소시켰다(도 19C). 이러한 결과는 Zn의 존재가 MG53의 기능에 필수적임을 나타내고, 추가의 Zn을 제공하는 것이 막 재봉합에서 MG53의 기능을 증가시킬 수 있는 것을 암시한다. 상기 결과의 의미는 치료 적용을 위해 사용된 재조합 MG53 단백질의 기능이 MG53 단백질에 대한 제형으로의 Zn의 첨가에 의해 증가될 수 있다는 점이다.
막 복구에서의 아연의 보호 효과는 mg53 -/- 골격근에서 상실된다. 막 복구 능력에 접근하기 위해, 개별적 단지굴근(FDB) 근섬유를 야생형(WT) 마우스(3-6개월)로부터 분리시켰다(도 20a). 강한 UV 레이저를 FDB 섬유에 적용시켜 근육에 대해 국소 손상을 야기시켰다(화살표). FM1-43 형광 염료(2.5 μM)의 유입을 막 복구 능력의 측정을 위한 지표로 사용하였다. UV 조사 200초 후에 이미지를 획득하였다(대조군). 2 μM 아연-이온운반체(1-히드록시피리딘-2-티온)(+Zn-HPT)의 적용은 UV-손상 후의 FM1-43 염료 유입의 감소된 양에 의해 반영되는 바와 같이 막 복구 능력을 증가시켰다. 아연 이온에 대한 특이적 완충제인 40 μM TPEN(테트라키스-2-피리딜메틸렌디아민)의 첨가는 UV 손상(+TPEN) 후의 FM1-43 염료 유입에서의 유의한 증가에 의해 반영되는 바와 같이 절충 막 복구 능력을 야기시켰다. mg53 -/- 마우스(3-6개월)로부터 분리된 FDB 근섬유는 UV 손상의 동일한 치료 후에 FM1-43 염료 유입의 증가된 양에 의해 나타나는 바와 같이 결함이 있는 막 복구 기능을 나타내었다(대조군)(도 20b). WT 근섬유와는 달리, mg53 -/- 근섬유로 관찰된 막 복구 능력은 형질막을 가로지르는 아연 이동 변화에 의존성을 나타내지 않았고, 예를 들어, Zn-HPT의 첨가(+Zn-HPT)는 막 복구에 대한 보호 효과를 발생시키지 않았고, TPEN을 이용(+TPEN)한 세포외 아연의 완충은 UV 손상 후에 FM1-43 염료의 보다 많은 유입을 발생시키지 않았다. 패널 a 및 b에 대한 요약 데이터(도 20c). 세포외 Ca 농도를 변경시키지 않고 아연을 완충시키는 시약인 Ca-EDTA(100 μM)를 이용한 추가 데이터는 또한 WT 근육에서 절충 막 복구 능력을 야기시켰다(좌측). Ca-EDTA를 이용한 처리는 mg53 -/- 근육에서 막 복구 능력에서 임의의 유의한 변화를 발생시키지 않았다. 종합적으로, 상기 데이터는 형질막을 가로지르는 아연 유입이 WT 골격근에 대한 급성 UV-레이저 유도 손상의 복구에서 중요한 역할을 하는 것을 암시한다. 막 복구에 대한 아연의 보호 효과는 mg53 -/- 근섬유에서 상실되고, 이는 MG53이 아마 급성 막 복구 과정 동안 아연에 대한 수용체 또는 표적으로 기능하는 것을 나타낸다. MG53에서의 아연 결합 모티프의 개략도. MG53의 아미노 말단은 2개의 잠정적 아연 결합 모티프를 함유하며: 이중 하나는 RING 모티프에 위치(a.a. 1-56, 인간 cDNA)하고, 나머지 하나는 B-박스 모티프에 위치(a.a. 86-117, 인간 cDNA)한다. 아연 결합에 참여하는 특정 아미노산이 표시되어 있다(도 20d).
세포외 아연 유입은 급성 막 손상 부위로의 MG53 매개 소포 전위에 필수적이다. 급성 막 손상의 복구와 관련된 세포내 소포 전위의 과정을 추적하기 위해, GFP-MG53 융합 단백질을 C2C12 근육모세포에서 발현시켰다(도 21a). GFP-MG53은 휴지 조건하에서 세포내 소포 및 형질막에서의 국소화를 나타내었다(좌측). 미소전극의 침투에 의해 발생된 세포의 급성 손상은 손상 부위에서 MG53 함유 소포의 신속한 전위를 야기시켰다(화살표, 우측 팬널). C2C12 세포와 40 μM Ca-EDTA의 인큐베이션은 급성 손상 부위에서 GFP-MG53 함유 소포의 전위를 방지하였다(도 21b). 세포외 용액으로의 20 μM TPEN의 첨가는 또한 기계적 손상 부위로의 GFP-MG53 함유 소포의 전위를 완전히 폐지시켰다(도 21c). GFP-MG53으로 일시적으로 트랜스펙션된 C2C12 세포를 20 μM Zn-HPT와 함께 인큐베이션하였다. 대조 조건(0분) 하에서, GFP-MG53은 세포질 뿐만 아니라 세포내 소포에 분포하였다(도 21d). Zn-HPT를 이용한 연장된 인큐베이션은 세포 표면막 및 세포내 막 구획으로의 GFP-MG53의 재분포를 야기시켰다(15 분). C2C12 근육모세포에서의 GFP-MG53 매개 막 복구에 대한 Ca-EDTA 및 TPEN 이용의 요약 데이터(도 21e). 결과는 Ca-EDTA 또는 TPEN을 이용한 세포외 아연의 킬레이트화가 세포에 대한 급성 손상의 복구에서 유의하게 결함을 발생시키는 것을 나타낸다.
MG53 의 RING 및 B-박스 모티프로의 Zn 결합은 막 복구에 중요하다. 세포막에 대한 급성 손상의 복구에서 MG53으로의 아연 결합의 역할에 기초가 되는 분자 메커니즘의 이해를 위해, 본 발명자는 MG53의 RING 및 B-박스 모티프에서 여러 부위 특이적 돌연변이를 발생시켰다. 이러한 돌연변이 작제물을 C2C12 근육모세포에서 일시적으로 발현시켰다(도 22). 트랜스펙션 24시간 후, 세포를 수거하고, 다양한 GFP-MG53 돌연변이의 발현을 MG53에 대한 특정 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 검정하였다. DTT의 부재(좌측 패널)하에서, C242A 돌연변이를 제외하고, 모든 다른 작제물은 올리고머 패턴을 나타내었고(표시된 이합체), 이는 MG53의 디술파이드-가교가 상기 돌연변이 작제물을 이용하여 유지된 것을 나타낸다. 10 mM DTT의 첨가와 함께, 모든 돌연변이 작제물은 ~75 kD(GFP-MG53의 예측된 분자 크기)의 단량체 형태를 나타내었다.
C2C12 세포에서 발현된 GFP-C29L 돌연변이는 명목 유리 아연을 함유하는 세포외 용액에서 급성 손상 부위로의 결함이 있는 이동을 나타내었다(도 50a). 형질막을 가로지르는 아연 유입을 위한 이온운반체로 작용하는 2 μM Zn-HPT의 첨가는 급성 손상 부위로의 GFP-C29L의 이동을 부분적으로 구제할 수 있었다. C2C12 세포에서 발현된 GFP-C105S 돌연변이는 명목 유리 아연을 함유하는 세포외 용액에서 미소전극 침투 후에 급성 손상 부위로 이동할 수 없었다. GFP-C29L과 유사하게, 2 μM Zn-HPT의 첨가는 GFP-C105S 돌연변이의 막 복구 능력(예를 들어, 손상 부위로의 이동)을 부분적으로 구제할 수 있었다(도 50b, 우측 패널). C2C12 세포에서 발현된 GFP-C29L/C105S 이중 돌연변이는 명목 유리 아연을 갖는 조건하 또는 2 μM Zn-HPT의 첨가 후에 급성 막 손상의 복구에 완전히 결함이 있다(도 50c). RING 모티프(C29L) 또는 B-박스 모티프(C105S)의 단일 돌연변이는 명목 유리 아연을 갖는 세포외 용액에서 막 복구 능력에 유의한 결함을 발생시켰다(도 51). Zn-HPT 이온운반체의 첨가는 상기 단일 시스테인 돌연변이의 막 복구 능력을 부분적으로 회복시킬 수 있었다. C29L/C105S 이중 돌연변이의 막 복구 기능은 완전히 상실되고, 이는 형질막을 가로지르는 아연의 이동과는 독립적이다. MG53의 다른 돌연변이를 이용한 데이터가 하기 표 1에 요약되어 있다. 종합적으로, 상기 결과는 MG53의 RING 및 B-박스 모티프로의 아연 결합이 막 손상의 복구와 관련된 세포내 소포 전위 과정에서 중요한 역할을 하는 것을 암시한다.
표 1.
MG53
돌연변이의 특징.
MG53 은 RING 모티프를 통해 Zn 에 결합할 수 있다. MG53은 Zn 결합 모티프(Ring) 및 B박스 모티프를 함유하는 정준 TRIM 도메인을 함유한다(도 23a). 세균 배양물을 초음파분쇄에 의해 용해시키고, 원심분리시키고, 4℃에서 밤새 10uM 아연을 함유하는 컬럼 완충액 중에서 아밀로오스 수지에 결합시켰다(도 23b). 이후, 수지를 0.3mM 말토오스를 갖는 50ml의 아연 비함유 컬럼 완충액으로 세척한 후, 아연 비함유 컬럼 완충액으로 세척하였다. 도시된 바와 같이 단백질 수준 및 안정성을 SDS-PAGE 겔에 의해 확인하였다. 레인 1(마커), 레인 2(mMG53), 레인 3(mC29L - MG53 돌연변이), 레인 4 (mC29L/C105S 이중 돌연변이 DM 클론 1), 레인 5(mC29L/C105S 이중 돌연변이 DM 클론 2), 레인 6(10mg/ml BSA), 레인 7(5mg/ml BSA), 레인 8(2.5mg/ml BSA), 레인 9(1mg/ml BSA). 비드 상의 단백질을 먼저 용액(제제에 따라 0.01 내지 0.1 uM 또는 ND) 내의 유리 아연의 존재에 대해 시험하였다(도 23c). 비드(분취량)를 아연-특이적 프로브 TSQ로 염색시키고, 현광현미경 하에서 형광을 관찰하고, 상대 형광 강도를 수득하였다. 이후, 단백질을 5분 동안 56℃에서 변성시키고, 볼텍싱(vortexing)시키고, 원심분리시키고, 상기 용액으로부터 다시 측정하였다. 상기 검정은 TSQ(Mol Probe) 및 교정을 위한 아연의 원자 표준 용액(Sigma)을 이용한다. 차트는 재조합 야생형(WT) MG53, C29L 돌연변이(C29L) 및 이중 돌연변이(DM)에 결합하는 Zn의 양을 나타낸다. 둘 모두의 돌연변이는 TRIM 도메인의 Ring 모티프에 위치된다. 데이터는 평균±S.D.로 제시된다. *P<0.05, **야생형에 비해 P<0.001; n=4~5.
MG53 으로의 Zn 결합의 붕괴는 급성 막 손상의 MG53 매개 복구에서의 결함과 관련이 있다. 막 복구에서의 아연의 참여를 직접 모니터하기 위해, 야생형 마우스로부터 분리된 FDB 근섬유를 세포내 용액 내의 아연에 대한 특정 형광 지표인 2 μM TSQ와 함께 로딩시켰다(하단 패널)(도 24). 국소 손상 부위에서의 FM4-64 형광 염료의 축적에 의해 반영되는 바와 같이, FDB 근섬유에 대한 국소 손상을 야기시키기 위해 강한 UV-레이저를 사용하였다(상부 패널). 급성 손상 부위에서 TSQ 형광의 유의한 상승(및 이에 따른 보다 많은 아연)이 관찰되었음을 유의하라.
배양된 세포로부터의 분비에 의한 재조합 MG53 단백질의 생성. 본 발명자의 기존의 방법은 실험적 사용을 위한 수준으로 재조합 단백질을 생성시키기 위해 대장균(E. coli) 세균을 사용하였다. 이러한 벤치(bench) 수준의 제조물은 본 발명자의 생화학적 및 시험관내 세포 배양 검정을 위한 최초의 시약을 제공하였다. hMG53 제조물의 양 및 순도를 개선시키기 위해, 본 발명자는 면역-친화성 크로마토그래피를 포함하는 Ni-컬럼에 대한 추가 단계를 추가함으로써 정제 프로토콜을 최적화시키려 계획하였다. 본 발명자의 래빗 MG53 단백질에 대해 생성된 최초의 모노클로날 항체는 인간 MG53에 결합하지 않았고, 본 발명자는 hMG53에 대한 mAb를 생성하는 하이브리도마를 최근에 발생시켰다. 이러한 모노클로날 항체(mAb 4A3F6F2)는 웨스턴 블롯에서 인간(및 마우스) MG53 단백질을 검출하는데 매우 효과적이다(도 25). 이러한 항체는 본 발명의 단백질 정제를 개선시키기 위한 면역-친화성 컬럼을 발생시키는데 매우 유용해야 한다. 대장균으로부터 정제된 단백질은 2개의 잠재적인 불이익을 가지며, 이중 하나는 세균으로부터의 내독소로 인한 오염의 가능성이고, 다른 하나는 원핵생물에서의 번역후 변형, 예를 들어, 당화 및 인산화의 결핍이 완전한 기능을 가진 재조합 단백질을 방해할 수 있는 가능성이다. 따라서, 본 발명자는 배양된 포유동물 세포로부터 재조합 MG53을 생성하는 추가의 방법을 개발하였다. 이를 달성하기 위해, 본 발명자는 또한 다른 시판되는 단백질 치료제, 예를 들어, 공학처리된 CHO 세포로부터의 배양 배지로부터의 분비된 단백질의 정제를 포함하는 암 치료를 위한 인간화된 모노클로날 항체의 생성에 사용되는 방법을 적합화시켰다. hGM53의 아미노 말단에서의 신호-펩티드는 분비 단백질로서의 재조합 MG53의 배출을 가능케 한다. 웨스턴 블롯은 풍부한 MG53 단백질이 공학처리된 hMG53 cDNA로 일시적으로 트랜스펙션된 CHO 세포를 갖는 적응용 배지로부터 정제될 수 있음을 나타내었다. 이러한 방법은 일반적으로 FDA에 의해 승인되었다. 본 발명자는 피부, 심장 및 근육 세포의 손상에 대해 보호하기 위한 치료에서 광범위하게 사용되는 재조합 MG53을 생성시키기 위해, 분비 생성물로서 MG53을 발현하는 안정적인 CHO 세포주를 확립하는 방법을 진행중이다.
재조합 MG53 의 발현은 진핵생물 또는 원핵생물 세포에서 수행될 수 있다. 도 26은 재조합 MG53이 진핵생물 또는 원핵생물 시스템에서 발현될 수 있음을 예시한다. 간략히, 재조합 MG53은 TAT 펩티드 부분 및 6-히스티딘 태그(6-HIS tag) 둘 모두를 함유하는 융합 단백질로서 Sf9 세포에서 발현된다. 이러한 히스티딘 태그는 당 분야에 널리 공지된 여과 크로마토그래피 기술을 이용하여 재조합 단백질을 분리시키고 정제시키기 위해 사용될 수 있다. 패널(A)는 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 Sf9 세포로부터 분리된 재조합 인간 MG53 단백질(화살표) 분획의 쿠마시 블루 염색된 젤을 나타낸다. 투입 = 세포 추출물, FT = 유통(flow through), M = 마커, E = 용리수. (B) Sf9 세포로부터 분리된 재조합 인간 TAT-MG53(화살표)의 쿠마시 블루 염색된 젤. (C)에서 쿠마스 블루 염색된 젤은 대장균으로부터 발현되고 분리된 재조합 마우스 TAT-MG53(화살표)을 나타낸다.
도 27은 hMG53의 아미노 말단의 단일 펩티드가 분비 단백질로서 재조합 MG53의 배출을 가능케 하는 것을 예시한다. 웨스턴 블롯은 풍부한 MG53 단백질이 공학처리된 hMG53 cDNA로 일시적으로 트랜스펙션된 CHO 세포를 갖는 적응용 배지로부터 정제될 수 있음을 나타낸다.
Flag - MG53 융합 단백질 작제물 및 일련의 HA - MG53 융합 단백질 돌연변이로 트랜스펙션된 HEK293 세포에서의 공동-면역침전( Co - IP ) 실험. 전체 세포 추추물 상에서의 항-Flag 항체, 이후 항-HA 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 Co-IP를 수행하였다(도 28a). 항-Flag 항체는 야생형 MG53 및 HA로 태깅된 모든 보존된 시스테인 잔기 MG53 돌연변이를 감소시킬 수 있고, 이는 MG53 단백질이 결합하여 이합체를 형성하고, 상기 결합이 시스테인 잔기의 산화에 의존적이지 않음을 나타낸다. Co-IP 실험은 MG53 이합체의 형성이 코일드-코일 도메인의 존재를 필요로 함을 나타낸다(도 28a). HEK293 세포를 HA-MG53 융합 단백질 작제물, 및 GFP에 연결된 MG53의 코일드-코일 도메인만을 함유하는 작제물(GFP- CC)을 포함하는 일련의 GFP-MG53 융합 단백질 돌연변이와 함께 공동 트랜스펙션시켰다. 전체 세포 추출물로부터의 Co-IP를 위해 항-HA 항체를 사용하였고, 생성된 단백질을 항-GFP 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
인간 세포주에서의 MG53 의 이종성 발현은 급성 손상에 대한 반응에서 막 복구를 발생시킨다. 도 29는 재조합 MG53이 이종성 발현 시스템에서 발현될 수 있고, 추가 단백질의 발현 없이 세포막 손상을 복구하는 능력을 보유할 수 있음을 입증한다. 특히, MG53을 적색 형광 단백질(RFP)을 갖는 융합 단백질로서 발현 벡터에 클로닝시켰다. 상기 융합 단백질을 인간 배아 신장 세포주(HEK293 섬유모세포 세포주)에서 발현시키고, 막 손상을 복구하는 세포의 능력을 RFP만을 발현하는 세포와 비교하였다. 패널 (a)는 RFP(적색 형광 단백질) 대조 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주가 세포질 발현 패턴을 나타냄을 입증한다. 그러나, RFP만을 발현하는 HEK293 세포(도 29a)에서, 미소전극을 이용한 손상은 손상 부위로의 RFP의 전위를 발생시키지 않았다(화살표). RFP 형광의 일부 표백이 세포외 완충액의 과도한 유입으로부터 발생하였다(*). 대조적으로, RFP-MG53을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포(도 29c)는 세포내 소포로의 국소화를 나타낸다. RFP-MG53을 발현하는 HEK293 세포의 미소전극 손상(도 29d)은 90초 미만에서 손상 부위로의 MG53의 대량의 전위(화살표)를 발생시켰다. 이러한 결과는 재조합 MG53이 임의의 세포 환경에서 세포 및/또는 조직 손상을 복구하는데 유용할 수 있음을 입증한다. 재조합 MG53이 이종성 시스템에서 발현되는 경우에 세포막에 대한 손상을 복구할 수 있으나, 본 발명은 이에 제한되지는 않는다. 특정 구체예에서, 본 발명은 조직 손상을 치료하거나 예방하기 위한 막 복구를 촉진하기 위한 MG53 및 카베올린-3의 공동 발현 방법을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 TAT-MG53 폴리펩티드 및 TAT-카베올린-3 폴리펩티드를 포함하거나; 또 다른 단백질 태그가 연결되거나 연결되지 않은 MG53 및 카베올린-3 폴리펩티드를 포함하는 치료 조성물에 관한 것이다.
노토진셍(notoginseng)으로부터의 활성 성분은 MG53 -막 복구 기능을 촉진할 수 있다. GFP-MG53을 C2C12 세포에서 발현시킨 후, 상기 세포를 노토진셍으로부터의 알코올 추출물로 관류시켰다. 도 30에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 상기 활성 성분의 적용은 관류 2분 이내에 형질막으로의 MG53 전위를 신속하게 유도시킬 수 있다. 담체 대조군을 이용하여 상기와 같은 신속한 반응이 관찰되지 않았고, 이는 노토진셍이 MG53 막 복구 기능을 잠재적으로 촉진할 수 있음을 암시한다. 상기 관찰에 기초하여, 본 발명자는 MG53과 노토진셍의 조합물을 이용한 치료 접근법이 세포에 대한 염증 및 막 손상 둘 모두의 예방에서 추가의 보호 효과를 제공할 수 있고, 이에 따라 재조합 MG53 단백질과 협력하여 적용되거나 약학적 보충물로서 단독으로 적용되는 경우에 MG53의 기능을 개선시킬 수 있는 것으로 추론하였다.
노토진셍(Panax notoginseng)은 다수의 다양한 장애의 치료에 광범위하게 사용되는 전통적인 중국의 한방약의 중요한 성분이다. 이러한 한방약은 과실이 익은 후에 수거되는 식물의 뿌리를 종종 사용한다. 이러한 약초의 자연 서식지는 서남아시아, 주로 중국의 운남 지방이다. 전통 의약의 중요성은 노토진셍을 "황금보다 더욱 가치있는" 것으로 언급하는 문헌[Materia Medica by Li Shi-zhen (1518-1593 AD)]에서 강조되어 있다. 치료제에서의 노토진셍 용도의 오랜 역사는 이러한 초본 화합물의 증명된 안전성 및 효능을 강조한다.
노토진셍은 내부 및 외부 출혈 둘 모두를 조절하는 능력으로 인해 상처 치료에 특히 높이 평가되어 왔다(J Nat Med. 2006 60: 135). 노토진셍 추출물은 위약 대조군보다 효과적으로 출혈 시간을 감소시키고 지혈작용을 개선시킬 수 있다. 다른 연구는 혈압을 감소시키고, 혈액 공급을 개선시키고, 쇼크에 대한 보호를 제공함으로써 심혈관계에 대한 유리한 효과를 나타내었다. 많은 연구에서 또한 노토진셍이 다수의 조직에서 염증의 광범위한 억제제로 작용하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견으로 인해, 보완대체의학(CAM)에서 노토진셍에 대한 연구 포커스가 증가하고 있다. 본 발명자는 MG53의 막 복구 기능에 대한 노토진셍의 효과를 시험하였다. GFP-MG53을 C2C12 세포에서 발현시킨 후, 이러한 세포를 노토진셍으로부터의 알코올 추출물로 관류시켰다. 도 30에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 이러한 활성 성분의 적용은 관류후 2시간 이내에 형질막으로의 MG53 전위를 신속하게 유도할 수 있다. 이러한 신속한 반응이 담체 대조군에서는 관찰되지 않았고, 이는 노토진셍이 MG53 막 복구 기능을 잠재적으로 촉진할 수 있음을 암시한다. 이러한 관찰을 기초로 하여, 본 발명자는 MG53과 노토진셍의 조합물을 이용한 치료 접근법이 세포에 대한 염증 및 막 손상 둘 모두의 예방에서 추가의 보호 효과를 제공할 수 있고, 이에 따라 재조합 MG53 단백질과 협력하여 적용되거나 약학적 보충물로서 단독으로 적용되는 경우에 MG53의 기능을 개선시킬 수 있는 것으로 추론하였다.
MG53 의 외부 적용에 의한 형질막의 패칭 ( patching ). 조직 복구 시약으로서의 재조합 MG53의 치료적 용도는 도 31에 설명되어 있다. 본 발명자의 이전의 연구에서 세포 내에서 발현된 MG53이 세포 손상에 대한 내성을 증가시킬 수 있는 것으로 밝혀졌으나, 본 발명자는 외부 적용된 단백질이 손상후 형질막을 재봉합시킬 수 있는지는 밝혀내지 못했다. 이러한 것이 사실임을 확립하기 위해, 본 발명자는 HEK293 세포에서 발현된 RFP-MG53(적색 형광 단백질을 함유하는 MG53 융합 단백질)을 분리시키고, 이러한 단백질 추출물을 배양 중인 C2C12 근육모세포 주위의 외부 배지에 적용시켰다. 세포를 미소전극으로 기계적으로 손상시키고, 융합 단백질의 국소화를 공초점 현미경으로 관찰하였다. 손상 부위에서 RFP-MG53의 명백한 축적이 있었고, 여기에서 재봉합이 발생하였다(도 31). 이러한 결과는 MG53 단백질이 세포에 외부적으로 적용될 수 있고, 손상된 막의 재봉합에 효과적인 채로 유지되는 것을 나타낸다. 이러한 발견은 치료 단백질로서의 MG53의 적용에 대한 유의한 중요성을 갖는다. 손상시에 세포 외부에 단지 단백질을 제공함으로써, MG53은 막의 재봉합을 촉진시킬 수 있고, 세포 손상을 방지할 수 있다. 이러한 접근법은 효과적인 화합물로의 MG53의 제형을 유의하게 간소화시킬 것이다.
MG53 의 유전적 과발현은 막 손상을 방지할 수 있다. 인간 배아 신장(HEK293) 세포를 RFP-MG53 또는 RFP로 트랜스펙션시킨 후, 다양한 강도의 자장으로 전기천공시켰다(도 32). 막 손상의 양을 전기천공에 의해 생성된 형질막 내의 구멍 외부의 세포외 배지로 유출되는 락테이트 데히드로게나아제(LDH)의 양을 평가함으로써 측정하였다. 막에 대해 발생하는 손상이 클수록, LDH 검정에서 판독이 높아질 것이다. 본 발명자는 RFP-MG53으로 트랜스펙션된 HEK293 세포가 전기천공후 막을 더욱 효과적으로 재봉합할 수 있고, 세포외 용액으로의 LDH의 유출을 방지할 수 있음을 관찰하였다. 따라서, 비-근육 세포에서의 외인성 MG53의 발현은 상기 비-근육 세포에서 세포막 복구에 대한 능력을 증가시킬 수 있다.
전기천공 후에 막 손상을 측정하기 위해 형광 염료 유입이 사용될 수 있다. 인간 배아 구개 중간엽(HEPM) 세포(1x10^6)를 PTI 형광 시스템의 스피닝 큐벳에 배치하였다(도 33). FM1-43 염료를 세포의 외부에 첨가하였고, 479 nm의 여기 및 598 nm의 방출을 갖는 최소 형광을 나타내었다. 세포를 50 V/cm 또는 100 V/cm의 전계 강도로 전기천공시켰고, 검출되는 형광의 용량 의존적 증가가 존재하였다. 전기천공은 염료가 존재하지 않는 세포(대조군)에서 자가 형광을 발생시키지 않는다.
기계적 손상 후의 막 손상을 측정하기 위해 형광 염료 유입이 사용될 수 있다. 인간 배아 구개 중간엽(HEPM) 세포(1x10^6)를 PTI 형광 시스템의 스피닝 큐벳에 배치하였다(도 34). FM1-43 염료를 세포의 외부에 첨가하였고, 479 nm의 여기 및 598 nm의 방출을 갖는 최소 형광을 나타내었다. 세포를 큐벳으로부터 분리시키고(Pour), 28 게이지(gauge) 바늘로 전단시키고(Shear), FM1-43 형광이 증가하였다. 상기 염료가 존재하지 않는 세포(대조군)에서 기계적 전단 스트레스는 자가-형광을 발생시키지 않는다.
재조합 MG53 은 세포막 손상으로부터 신장 세포를 보호할 수 있다. (a) HEK293 세포(8x10^4)를 10 ug/mL 재조합 인간 MG53 또는 비히클 대조군으로 처리한 후, 다양한 전계 강도로 전기천공시켰다(도 35). 세포외 재조합 MG53은 전기천공으로부터의 손상을 방지할 수 있다. (b) MG53 또는 비히클 대조군을 재조합 LDH에 첨가하여 LDH 활성에 대한 표준 곡선을 생성시켰다. MG53이 LDH 반응에 영향을 미치지 않으므로, LDH 검정은 상기 조건하에서 막 손상을 측정하는데 유효하다.
재조합 MG53 은 세포막 손상으로부터 잇몸 내막 세포를 보호할 수 있다. (a) HEPM 세포(5x10^4)를 10 ug/mL 재조합 인간 MG53 또는 비히클 대조군으로 처리한 후, 다양한 전계 강도로 전기천공하였다(도 36). 세포외 재조합 MG53은 전기천공으로부터의 손상을 방지할 수 있다. (b) MG53 또는 비히클 대조군을 재조합 LDH에 첨가하여 LDH 활성에 대한 표준 곡선을 생성시켰다. MG53이 LDH 반응에 영향을 미치지 않으므로, LDH 검정은 상기 조건하에서 막 손상을 측정하는데 유효하다.
재조합 MG53 은 기계적 세포막 손상으로부터 신장 세포를 보호할 수 있다. HEK293 세포(8x10^4)를 유리 마이크로비드로 처리하여, 기계적 손상을 유도하였다(도 37). 유리 비드가 배지에 첨가되는 경우 다양한 용량의 재조합 인간 MG53 또는 비히클 대조군을 샘플에 적용하였다. 세포를 회전 진탕기(orbital shaker)에서 회전시킨 후, 상층액을 LDH 수준에 대해 분석하였다. 본 발명자는 MG53이 기계적 막 손상을 방지할 수 있고, 10 ug/mL이 단백질의 포화 용량인 것을 발견하였다.
MG53 의 효과는 단백질의 기능에 특이적이다. MG53은 유리 비드에 대한 노출로 생성된 Hela 자궁경부 상피세포에서의 손상을 재봉합하는데 효과적인 것으로 입증되었다(도 38). 재조합 단백질이 비등되는 경우, 단백질은 더 이상 막 재봉합을촉진할 수 없다. 이는 재봉합 활성이 단백질의 적절한 형태에 따라 MG53 단백질의 기능에 특이적임을 나타낸다.
질소 머스타드에 의해 유도된 인간 각질세포에 대한 막 손상이 MG53 에 의해 방지될 수 있다. 다양한 용량의 피부 수포제인 질소 머스타드는 일차 인간 각질세포로부터의 LDH 방출을 발생시킬 수 있다(도 39). 이러한 손상 중 일부는 노출 후의 재조합 단백질의 적용 및 질소 머스타드의 제거에 의해 방지될 수 있다. 삽입된 도면은 피부 수포제에 대한 노출의 효과를 예시한다.
외부 적용되는 재조합 MG53 은 손상된 막을 재봉합시키기 위해 포스파티딜세린( PS ) 결합을 필요로 한다. HEK293 세포를 재조합 인간 MG53 또는 비히클로 처리한 후, 유리 마이크로비드의 존재하에서의 진탕에 의해 손상시켰다(흑색 막대)(도 40). 막 손상은 488 nm에서 기록되는 비색 검정에 의해 기록되는 세포로부터의 LDH 방출에 의해 측정된다. 포스파티딜세린(PS)을 이용한 세포의 동시 처리는 형질막의 재봉합을 방지할 수 있다. 따라서, MG53은 막 복구를 촉진시키기 위해 손상된 세포 상의 노출된 PS에 결합할 수 있어야 한다. * p < 0.05
또 다른 포스파티딜세린(PS) 결합 단백질과의 경쟁은 외부 적용된 재조합 MG53이 손상된 막을 재봉합시키기 위한 PS 결합을 필요로 하는 것을 나타낸다. HEK293 세포를 제조합 인간 MG53 또는 비히클로 처리한 후, 유리 마이크로비드의 존재하에서의 진탕에 의해 손상시켰다(흑색 막대)(도 41). 막 손상은 488 nm에서 기록되는 비색 검정에 의해 기록되는 세포로부터의 LDH 방출에 의해 측정된다. 과량(5:1)의 포스파티딜세린(PS) 결합 단백질인 아넥신 V를 이용한 세포의 동시 처리는 형질막의 재봉합을 방지할 수 있다. 따라서, MG53은 막 복구를 촉진시키기 위해 손상된 세포 상의 노출된 PS에 결합할 수 있어야 한다. * p < 0.05
MG53 은 많은 다양한 인간 세포 유형에서 형질막을 패치시킬 수 있고, 세포 사망을 방지할 수 있다. 외인성 MG53이 비-근육 세포 유형에서 막 재봉합 기능을 반복할 수 있는지 시험하기 위해, 본 발명자는 다수의 다양한 세포 유형에서 GFP-MG53을 발현시키기 위해 아데노바이러스 또는 리포솜 기반의 트랜스펙션 방법을 사용하였다. 시험된 모든 세포 유형에서, MG53은 근육 세포에서 관찰되는 것과 유사한 방식으로 수행하였다. 여기에서, 본 발명자는 HEK293(나타내지 않음) 및 인간 배아 구개 중간엽(HEPM) 치아 세포(도 43)를 포함하는 무한증식 인간 세포주, 뿐만 아니라 인간 각질세포의 일차 배양물(도 42)에서의 상기 효과를 예시한다. 상기 세포 유형에서 GFP-MG53이 적절하게 국소화될 뿐만 아니라, 미소전극의 물리적 침투 또는 사포닌 세제를 이용한 처리에 의한 막 손상 후에 형질막으로 효과적으로 전위되었다. MG53의 기능은 손상 후의 막 패칭 및 근육 세포의 생존에 필수적인 것으로 보인다. 따라서, 다양한 세포 유형에 MG53을 제공하는 것은 막 재봉합에서 MG53 기능을 반복할 수 있고, 이는 MG53이 근골격계 및 심혈관계의 많은 다양한 조직에 대해 치료적 잠재성을 가짐을 나타낸다.
리포폴리사카라이드는 HEPM 세포에서 막 손상을 유도할 수 있고, 이는 MG53 에 대한 노출에 의해 방지될 수 있다. HEPM 세포가 24시간 동안 LPS(1 mg/mL)로 처리되는 경우, LDH 방출이 관찰될 수 있고, 이는 막 손상이 발생한 것을 암시한다(도 44). MG53의 적용은 HEPM 세포로부터의 LDH 방출의 정상적인 수준을 방지할 수 있는 반면, LPS 및 MG53과의 공동 인큐베이션은 세포로부터의 LDH의 정상적인 방출을 나타낸다. 이는 MG53이 LPS에 의해 생성된 HEPM 세포에 대한 손상을 방지할 수 있음을 암시한다.
MG53 은 위 세포에서 막 복구 부위로 전위될 수 있다. 인간 위 샘암종(AGS) 세포를 GFP-MG53으로 트랜스펙션시킨 후, 미소전극 바늘 침투(상부) 또는 막을 투과화시키기 위한 0.005% 사포닌을 이용한 처리(하부)에 의한 기계적 막 손상에 적용시켰다(도 45). 손상 부위(화살표)로의 GFP-MG53의 전위를 살아있는 세포의 공초점 현미경에 의해 모니터하였다. 둘 모두의 경우에서, 세포막 손상은 형질막으로의 MG53의 전위를 발생시켰다.
MG53 은 신경 세포에서 막 복구 부위로 전위될 수 있다. 마우스 일차 별아교세포를 GFP-MG53으로 트랜스펙션시킨 후, 미소전극 바늘 침투(상부) 또는 막을 투과화시키기 위한 0.005% 사포닌을 이용한 처리(하부)에 의한 기계적 막 손상에 적용시켰다(도 46). 손상 부위(화살표)로의 GFP-MG53의 전위를 살아있는 세포의 공초점 현미경에 의해 모니터하였다. 둘 모두의 경우에서, 세포막 손상은 형질막으로의 MG53의 전위를 발생시켰다.
MG53 은 기도 상피 세포에서 막 복구 부위로 전위될 수 있다. 인간 C38 기도 상피 세포를 GFP-MG53으로 트랜스펙션시킨 후, 미소전극 바늘 침투(상부) 또는 막을 투과화시키기 위한 0.005% 사포닌을 이용한 처리(하부)에 의한 기계적 막 손상에 적용시켰다(도 47). 손상 부위(화살표)로의 GFP-MG53의 전위를 살아있는 세포의 공초점 현미경에 의해 모니터하였다. 둘 모두의 경우에서, 세포막 손상은 형질막으로의 MG53의 전위를 발생시켰다.
외부 MG53 은 기도 상피 세포에서 막 손상을 재봉합시킬 수 있다. 인간 IB3 기도 상피 세포를 외부 재조합 인간 MG53 또는 비히클 대조군으로 처리한 후, 유리 비드에 의한 기계적 막 손상에 노출시켰다(도 48). 막 손상은 488 nm에서 기록되는 비색 검정에 의해 기록되는 세포로부터의 LDH 방출에 의해 측정된다. MG53은 기계적 손상으로 인한 세포막 손상을 방지할 수 있었다. * p < 0.05
MG53 은 면역 세포에서 막 복구 부위로 전위될 수 있다. 마우스 백혈병 단핵구 대식세포(RAW 264.7)를 GFP-MG53으로 트랜스펙션시킨 후, 미소전극 바늘 침투(상부) 또는 막을 투과화시키기 위한 0.005% 사포닌을 이용한 처리(하부)에 의한 기계적 막 손상에 적용시켰다(도 49). 손상 부위(화살표)로의 GFP-MG53의 전위를 살아있는 세포의 공초점 현미경에 의해 모니터하였다. 둘 모두의 경우에서, 세포막 손상은 형질막으로의 MG53의 전위를 발생시켰다.
도 50 은 MG53 에 의해 매개된 막 복구의 메커니즘에 대한 본 발명자의 현재의 가설을 예시한다. 임의의 특정 이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 실험적 증거는 MG53이 이의 포스파티딜세린 함유 소포와의 결합으로 인해 형질막의 내부 표면에 국소화되는 것을 나타낸다. 명목 조건하에서, MG53은 단량체인 것으로 보이며, 다른 단백질과의 결합으로 인해 막 표면에 인접하여 격리된다. 세포막에 대한 손상 후, 보통 환원형으로 존재하는 MG53은 이황화물 교차결합의 형성 및 분자간 MG53 올리고머화를 촉발시키는 국소화된 산화 환경에 노출된다. MG53의 올리고머화는 손상 부위에서 함께 포스파티딜세린 함유 소포를 발생시킨다.
이들 연구는 MG53가 세포막 복구 기구의 중요한 구성요소임을 입증하며, 이는 mg53 -/- 근육의 막 복구 기능의 유의한 결핍에 의해 예시된다. MG53-매개 막 패칭의 반응은 신속하고, 손상 후 수초 이내에 발생하고, 따라서 MG53은 급성 복구 반응을 매개하는 것으로 보인다. 막 복구에서 작용하는 MG53에 대해, 이는 세포외 Ca2+의 유입이 아니라 단백질의 산화에 따른 과정으로 올리고머화되어야 한다. 세포외 Ca2 +는 MG53의 산화 활성화 전위를 통해 형질막으로 이동된 후에 소포의 융합을 촉진하는 작용을 하는 것으로 보인다. PS와의 상호작용을 통해, MG53 올리고머화는 손상 부위로의 세포내 소포의 점증을 위한 핵형성 부위를 제공한다(도 50). 이러한 두 단계 과정은 세포 온전성의 유지에 필수적이다. 따라서, 세포를 둘러싸는 세포외 산화 상태의 조절 또는 막 재봉합에 이용가능한 Ca2 +가 잠재적으로 세포의 막 복구 능력을 개선시키는 방법을 구성할 것이다.
예시적 방법
MG53 의 확인 및 클로닝 - 래빗 골격근의 미세소체 단백질에 대한 mAb 라이브러리의 제조 및 스크리닝이 이전에 기재되었다. mAb5259(IgG1 서브클래스)의 제조 및 면역친화성 정제를 이전에 기재(21)된 바와 같이 수행하였다. 정제된 MG53을 아미노산 서열 분석에 적용시키고, 결정된 모든 서열을 래빗 MG53 cDNA에서 엔코딩시켰다(데이터는 나타내지 않음). 래빗의 부분적인 아미노산 서열을 이용한 데이터베이스의 상동성 연구로 마우스 및 인간 MG53을 발견하였다. 마우스 MG53 유전자의 엑손 영역을 마우스 유전체 DNA로부터 증폭시키고, 래빗 및 마우스 골격근 라이브러리를 32P-라벨링된 엑손 단편을 이용하여 스크리닝하여 전장 cDNA를 생성시켰다.
면역조직화학 및 면역염색 분석 - mAb5259를 이용한 면역화학 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 15 nm 금 입자와 컨쥬게이션된 이차 항체를 이용한 면역전자현미경법을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다.
세포 배양 - 모든 연구에 사용된 C2C12 뮤린 근육모세포 세포주를 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection)(Manassas, VA)에서 입수하였다. 세포를 10% 우태아 혈청, 100 units/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신이 보충된 CHO 세포를 위한 햄스(Ham's) F12 배지 또는 C2C12를 위한 DMEM 배지 중에서 37℃ 및 5% CO2에서 가습화된 환경에서 성장시켰다. 근관 분화를 유도하기 위해, C2C12 근육모세포를 컨플루언스(confluence)로 성장시키고, 배지를 2% 말 혈청, 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신(100 μg/ml)을 함유하는 DMEM으로 교환하였다. 일시적 트랜스펙션을 위해, C2C12 근육모세포 또는 CHO 세포를 유리 바닥 접시에서 70% 컨플루언스로 플레이팅시켰다. 24시간 후, 세포를 진재머(GeneJammer) 시약(Stratagene)을 이용하여 상기 기재된 바와 같은 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 24-48시간 후 또는 개별적 실험을 위해 지정된 시간에 살아있는 세포의 공초점 이미지화에 의해 세포를 시각화시켰다. 몇몇 실험에서, C2C12 근육모세포를 관찰 전에 지정된 시간에 근관으로 분화시켰다.
플라스미드 작제물 - 전장 마우스 MG53 cDNA 및 관련 트렁케이션 돌연변이를 보충 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 생성시켰다. pCMS-MG53의 작제를 위해, 적절한 제한 효소에 의한 절단 후에 PCR-증폭된 cDNA를 NheⅠ/XbaⅠ 부위에서 pCMS-EGFP 벡터(Invitrogen)로 삽입하였다. GFP-MG53, GFP-TRIM, GFP-SPRY, MG53-GFP, TRTM-GFP 및 SPRY-GFP 작제를 위해, PCR 생성물을 XhoⅠ/XbaⅠ 부위에서 pEGFP-C1에 삽입하거나, XhoⅠ/KpnⅠ 부위에서 pEGFP-N1에 삽입하였다.
살아있는 세포 이미지화 - GFP-MG53의 세포내 이동을 모니터하기 위해, CHO 또는 C2C12 세포를 유리 바닥 접시(Bioptechs Inc.)에서 배양하고, 상기 기재된 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 63X 1.3NA 오일 침지 대물렌즈를 갖는 바이오래드 2100 래디언스 레이저 스캐닝(BioRad 2100 Radiance laser scanning) 공초점 현미경을 이용하여 3.18s/프레임으로 형광 이미지(512x512)를 포착하였다.
RNAi 검정 - MG53의 shRNA 녹다운을 위한 표적 서열은 마우스 MG53 cDNA 내의 위치 622-642(GAG CTG TCA AGC CTG AAC TCT)에 존재한다. 카베올린-3에 대해, 표적 서열은 위치 363-380(GAC ATT CAC TGC AAG GAG ATA)에 존재한다. 상보적 센스 및 안티센스 올리고누클레오티드를 합성하였다. MG53 shRNA 및 대조군 플라스미드를 작제하기 위해, 어닐링된 올리고누클레오티드를 Acc 65Ⅰ/HindⅢ 제한 효소 부위에서 psiRNA-hHlGFPzeo G2(InvivoGene)로 삽입하였다. 카베올린-3 shRNA 및 대조 플라스미드를 위해, 어닐링된 올리고누클레오티드를 EcoRⅠ/BamHⅠ 제한 효소 부위에서 pRNAiDsRed 벡터(BD Biosciences)로 삽입하였다. 각각의 벡터는 세포 트랜스펙션의 마커로 작용하는 독립적인 형광 단백질 발현 카세트(녹색 또는 적색)을 갖는다. 모든 플라스미드를 플랭킹 프라이머를 이용한 직접 서열분석에 의해 확인하였고, MG53 및 카베올린-3 단백질 발현의 하향조절을 웨스턴 블롯 분석에 의해 시험하였다.
웨스턴 블롯 및 공동면역침전 - 면역블롯은 이용되고 있는 표준 기술이다. 간략히, C2C12 또는 CHO 세포를 수거하고, 프로테아제 억제제의 칵테일(Sigma)의 존재하에서 얼음 냉각된 변형 RIPA 완충액(150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5)으로 용해시켰다. 20 μg의 전체 단백질을 4-12% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 분리시켰다. MG53 및 상호작용 단백질, 예를 들어, 카베올린-3의 공동면역침전 연구를 위해 표준 프로토콜을 이용하였다. 간략히, 골격근 조직 또는 C2C12 근관을 0.5 ml 변형 RIPA 완충액에서 용해시켰다. 전체 세포 용해질(500 μg)을 5 μg 폴리클로날 항-MG53(폴리클로날 항체), 또는 항-카베올린-3 항체(mAb)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 음성 대조군으로서, 500 μg의 전체 세포 용해질을 5 μg 정상 래빗 및 마우스 IgG와 인큐베이션시키고, 상기 기재된 바와 같이 처리하였다. 면역 복합체를 2시간 동안 인큐베이션시켜 단백질 G-세파로오스 비드 상에서 수거하고, RIPA 완충액을 이용하여 4회 세척하였다.
본 명세서에 기재된 상세한 실시예 및 구체예는 단지 예시적 목적을 위한 예로서 주어진 것이고 어떠한 식으로든 본 발명을 제한하기 위한 것으로 간주되어서는 아니된다. 이러한 견지에서 다양한 수정 또는 변형이 당업자에게 제안될 것이고 본원의 사상 및 영역내에 포함되며 첨부된 특허청구범위의 영역내에서 고려된다. 예를 들어, 성분들의 상대적인 분량이 요망되는 효과를 최적화하기 위해 달라질 수 있고, 추가 성분들이 첨가되고/거나 유사한 성분들이 기재된 하나 이상의 성분들을 대체할 것이다. 본 발명의 시스템, 방법, 및 공정과 관련된 추가적인 유익한 특징 및 기능성은 첨부된 특허청구범위로부터 자명할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Ma, Jianjie
<120> Compositions and Methods of Modulating Cell Membrane Resealing
<130> 115442.00008
<140> TBD
<141> 2008-12-02
<150> 60/005,410
<151> 2007-12-04
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 477
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
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<223> Human MG53 Polypeptide
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gtgatcgcgg ccgaggcccc ccgccgcggg cgcctgcacg cggtgccctc gcagggcctg 1140
tggctgctgg ggctgcgcga gggcaagatc ctggaggcac acgtggaggc caaggagccg 1200
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<210> 3
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<212> PRT
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<220>
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<211> 1434
<212> DNA
<213> Mus musculus
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<223> Mouse MG53 cDNA
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<223> Rabbit MG53
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<212> DNA
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ctggacatcc agctgcccat catttcagat gacttcaaat tccaggtgtg gaggaagatg 840
ttccgggctc tgatgccagc gctggaggag ctgacctttg acccgagctc cgcgcacccg 900
agcctcgtgg tgtcacccac gggccgccga gtggagtgct cggagcagaa ggcgccgccc 960
gccggggacg acgcgcgcca gttcgacaag gctgtggccg tggtggcgca gcagctgctg 1020
tccgacggcg agcactactg ggaggtggag gtgggcgaca agccgcgctg ggcgctgggc 1080
gtgatggcct ccgaggcgag ccgccgtggc cggctgcacg ccgtgccctc acagggtttg 1140
tggctgctgg ggctgcgcga cggcaagacc ctggaggcgc acgtggaggc caaggagccg 1200
cgcgcgctgc gcaccccgga gcggcggccc acgcgcctcg gcctctacct cagcttcggc 1260
gatggcgtgc tcgccttcta cgacgccagc gacgccgacg cgctcgagct gctgtttgct 1320
ttccgcgagc gcctgcccgg gcccgtgtac cccttcttcg acgtgtgctg gcatgacaag 1380
ggcaagaatg cgcagccgct gctgctcgtg gggccggatg gccaggaggc ctga 1434
<210> 7
<211> 477
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (29)..(29)
<223> C29L/C242A
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (242)..(242)
<223> C29L/C242A
<400> 7
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Leu Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Gly Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Val Leu Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Cys
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Tyr Ala Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu
275 280 285
Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300
Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335
His Gln Gln Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Asp Val Gly
340 345 350
Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ala Ala Glu Ala Pro Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
420 425 430
Asp Ala Leu Val Pro Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Arg Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gly Ala Glu Ala
465 470 475
<210> 8
<211> 477
<212> PRT
<213> Didelphis sp.
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(477)
<223> Opossum MG53
<400> 8
Met Ser Gly Ala Pro Ala Leu Met Gln Gly Met Tyr Gln Asp Leu Ser
1 5 10 15
Cys Pro Leu Cys Leu Lys Leu Phe Asp Ala Pro Ile Thr Ala Glu Cys
20 25 30
Gly His Ser Phe Cys Arg Asn Cys Leu Leu Arg Leu Ala Pro Asp Pro
35 40 45
Gln Ala Gly Thr Val Leu Cys Pro Ser Cys Gln Ala Pro Thr Lys Pro
50 55 60
Asp Gly Leu Asn Thr Asn Gln Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Ser Leu
65 70 75 80
Ala Gln Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser
85 90 95
Val Tyr Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Ile Cys Gly Val Cys Ala Ser
100 105 110
Leu Gly Lys His Arg Gly His Ser Val Val Thr Ala Ala Glu Ala His
115 120 125
Gln Arg Met Lys Lys Gln Leu Pro Gln Gln Arg Leu Gln Leu Gln Glu
130 135 140
Ala Cys Met Arg Lys Glu Lys Thr Val Ala Leu Leu Asp Arg Gln Leu
145 150 155 160
Ala Glu Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Gln Arg Ala Val Gly Glu
165 170 175
Gln Leu Gly Val Met Arg Ala Phe Leu Ala Ala Leu Glu Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Lys Glu Ala Glu Arg Val Thr Gly Glu Ala Gly Thr Ala Leu Lys
195 200 205
Ala Glu Arg Arg Ile Val Thr Ser Tyr Leu Asp Gln Leu Gln Gln Met
210 215 220
Glu Lys Val Leu Asp Glu Val Thr Asp Gln Pro Gln Thr Glu Phe Leu
225 230 235 240
Arg Lys Tyr Cys Leu Val Ile Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu
245 250 255
Ser Pro Pro Ala Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp
260 265 270
Asp Phe Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro
275 280 285
Gly Met Glu Val Leu Thr Phe Asp Pro Ala Ser Ala His Pro Ser Leu
290 295 300
Leu Val Ser Pro Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Val Glu Gln Lys Ala
305 310 315 320
Pro Pro Ala Gly Asp Asp Pro Gln Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Leu
325 330 335
Val Ala Lys Gln Gln Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu
340 345 350
Val Gly Asp Lys Pro Arg Trp Gly Leu Gly Leu Ile Ser Ala Asp Val
355 360 365
Ser Arg Arg Gly Lys Leu His Pro Thr Pro Ser Gln Gly Phe Trp Met
370 375 380
Leu Gly Leu Arg Glu Gly Lys Val Tyr Glu Ala His Val Glu Ser Lys
385 390 395 400
Glu Pro Lys Val Leu Lys Val Asp Gly Arg Pro Ser Arg Ile Gly Leu
405 410 415
Tyr Leu Ser Phe Arg Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp
420 425 430
Leu Asp Asn Leu Leu Pro Leu Tyr Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Gly
435 440 445
Pro Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn
450 455 460
Ala Gln Pro Leu Leu Leu Leu Gly Pro Asp Gly Glu Gln
465 470 475
<210> 9
<211> 477
<212> PRT
<213> Canis sp.
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(477)
<223> Dog MG53
<400> 9
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ser Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Val Pro Cys Pro Cys Cys Gln Ala Leu Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Gln Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Leu Leu Glu His Gln Leu Met Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Met Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Val Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Val Thr
275 280 285
Lys Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Leu
290 295 300
Ser Pro Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Asp Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Glu Asp Pro Cys Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335
Gln Gln Val Leu Ser Asp Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Gln Val Gly
340 345 350
Glu Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ala Ala Gln Ala Ser Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Asp Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Ile Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Pro
420 425 430
Asp Ala Leu Glu Leu Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Asp Gly Glu Glu Ala
465 470 475
<210> 10
<211> 477
<212> PRT
<213> Pan troglodytes
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(477)
<223> Chimpanzee MG53
<400> 10
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Gly Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Val Leu Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu
275 280 285
Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300
Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335
His Gln Gln Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Asp Val Gly
340 345 350
Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ala Ala Glu Ala Pro Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
420 425 430
Asp Ala Leu Val Pro Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Arg Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gly Ala Glu Ala
465 470 475
<210> 11
<211> 477
<212> PRT
<213> Macaca mulatta
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(477)
<223> Rhesus Monkey MG53
<400> 11
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Gly Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Val Leu Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu
275 280 285
Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300
Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335
His Gln Gln Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly
340 345 350
Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ala Ala Glu Gly Pro Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
420 425 430
Asp Ala Leu Val Pro Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ser
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Ser Glu Gly Ala Glu Ala
465 470 475
<210> 12
<211> 482
<212> PRT
<213> Bos sp.
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(482)
<223> Bovine MG53
<400> 12
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ser Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Val Leu Cys Pro Ser Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Met Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Leu Leu Glu His Gln Leu Leu Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Leu Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Arg
275 280 285
Gln Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Thr Ala His Pro Ser Leu Val Leu
290 295 300
Ser Asn Ser Gly Arg Cys Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Thr
325 330 335
His Gln Leu Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly
340 345 350
Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Gly Ala Gln Ala Gly Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Asp Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Ile Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Pro
420 425 430
Asp Ala Leu Glu Leu Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Val Ser Gly Gly Ser Gly Ser
465 470 475 480
Glu Ala
<210> 13
<211> 477
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(477)
<223> Rat MG53
<400> 13
Met Ser Thr Ala Pro Gly Leu Leu Arg Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ile Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Asp Asp
35 40 45
Gly Thr Val Ala Cys Pro Cys Cys Gln Ala Ser Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Thr Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Ala Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Met Phe Leu Ala Ala Leu Glu Ser Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Phe Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ser Glu Ser Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Val Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Lys Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Glu Leu
275 280 285
Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300
Ser Ala Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Glu Asp Thr Cys Gln Phe Asp Lys Thr Val Ala Val Val Ala
325 330 335
Lys Gln Leu Leu Ser Gln Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly
340 345 350
Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Met Ala Ala Asp Ala Ser Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Asp Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Pro Pro Ala Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Ala Asp Gly Val Leu Thr Phe Tyr Asp Ala Ser Asn Thr
420 425 430
Asp Ala Leu Thr Pro Leu Phe Ser Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Met Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ser
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Asp Ser Glu Gln Ala
465 470 475
<210> 14
<211> 477
<212> PRT
<213> Xenopus laevis
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(477)
<223> Xenopus laevis
<400> 14
Met Ser Thr Pro Gln Leu Met Gln Gly Met Gln Lys Asp Leu Thr Cys
1 5 10 15
Gln Leu Cys Leu Glu Leu Phe Arg Ala Pro Val Thr Pro Glu Cys Gly
20 25 30
His Thr Phe Cys Gln Gly Cys Leu Thr Gly Val Pro Lys Asn Gln Asp
35 40 45
Gln Asn Gly Ser Thr Pro Cys Pro Thr Cys Gln Ser Pro Ser Arg Pro
50 55 60
Glu Thr Leu Gln Ile Asn Arg Gln Leu Glu His Leu Val Gln Ser Phe
65 70 75 80
Lys Gln Val Pro Gln Gly His Cys Leu Glu His Met Asp Pro Leu Ser
85 90 95
Val Tyr Cys Glu Gln Asp Lys Glu Leu Ile Cys Gly Val Cys Ala Ser
100 105 110
Leu Gly Lys His Lys Gly His Asn Ile Ile Thr Ala Ser Glu Ala Phe
115 120 125
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100
Claims (33)
- RING 핑거(finger) 아연 결합 도메인, B-박스(B-box) 도메인, 류신 지퍼 코일드-코일(Leucine zipper coiled-coil) 도메인, 인지질 결합 도메인, 산화환원 민감성 아미노산, E3-리가아제 도메인, SPRY 도메인을 포함하는 아미노산 구성요소들의 조합물을 포함하는 분리된 폴리펩티드 조성물 또는 재조합 폴리펩티드 조성물로서, 상기 구성요소들이 단일 폴리펩티드 내에서 연속적으로 공유 결합되고, 상기 폴리펩티드가 세포막 복구를 촉진하는, 분리된 폴리펩티드 조성물 또는 재조합 폴리펩티드 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 인지질 결합 도메인이 포스포티딜세린에 결합하는 분리된 폴리펩티드 조성물 또는 재조합 폴리펩티드 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드가 CSN6, 키네신(kinesin), 카베올린-3(caveolin-3), 페리악신(periaxin) 및 수초 염기성 단백질(myelin-basic-protein)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원에 결합하거나 이와 복합체를 이루며, 상기 복합체가 세포막 복구를 촉진하는, 분리된 폴리펩티드 조성물 또는 재조합 폴리펩티드 조성물.
- 유효량의 제 1항의 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하여 세포막 손상과 관련된 병리 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 조성물이 상기 병리 질환의 결과를 개선시키는데 효과적인 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 복합체가 CSN6를 포함하는 단백질 복합체.
- 제 3항에 있어서, 상기 복합체가 키네신을 포함하는 단백질 복합체.
- 제 3항에 있어서, 상기 복합체가 카베올린-3를 포함하는 단백질 복합체.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 포스포티딜세린을 추가로 포함하는 분리된 폴리펩티드 조성물 또는 재조합 폴리펩티드 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 복합체가 페리악신을 포함하는 단백질 복합체.
- 제 3항에 있어서, 상기 복합체가 수초 염기성 단백질을 포함하는 단백질 복합체.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 아연을 추가로 포함하는 분리된 폴리펩티드 조성물 또는 재조합 폴리펩티드 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 노토진싱(notoginsing)을 추가로 포함하는 분리된 폴리펩티드 조성물 또는 재조합 폴리펩티드 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 산화제를 추가로 포함하는 분리된 폴리펩티드 조성물 또는 재조합 폴리펩티드 조성물.
- RING 핑거 아연 결합 도메인, B-박스 도메인, 류신 지퍼 코일드-코일 도메인, 인지질 결합 도메인, 산화환원 민감성 아미노산, E3-리가아제 도메인, SPRY 도메인을 포함하는 기능성 구성요소들을 포함하는 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드로서, 상기 구성요소들이 단일 폴리펩티드 내에서 연속적으로 공유 결합되고, 상기 폴리펩티드가 CSN6, 키네신, 카베올린-3, 페리악신 및 수초 염기성 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원에 결합하거나 이와 복합체를 이루고, 상기 복합체가 세포막 복구를 촉진할 수 있는 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
- 약학적으로 허용되는 담체와 조합된 유효량의 제 1항의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 세포외적으로 투여하는 것을 포함하여 세포막 손상을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 조성물이 세포막 손상을 치료하거나 예방하는데 효과적인 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 아연을 추가로 포함하는 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 노토진싱을 추가로 포함하는 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 산화제를 추가로 포함하는 방법.
- 제 1항의 분리된 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산.
- 약학적으로 허용되는 담체와 조합된 서열 목록 번호:1, 3, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16에 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 갖는 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물이 세포막 복구를 촉진할 수 있는 조성물.
- 제 20항에 있어서, 상기 조성물이 아연을 추가로 포함하는 조성물.
- 제 20항에 있어서, 상기 조성물이 노토진싱을 추가로 포함하는 조성물.
- 제 20항에 있어서, 상기 조성물이 산화제를 추가로 포함하는 조성물.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 시험관내 세포에 투여되는 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 생체내 세포에 투여되는 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 세포가 섬유모세포, 상피 세포, 난소 세포, 신장 세포, 신경 세포, 각질세포, 치아 세포, 위 세포, 면역 세포, 골격근, 심근 세포 또는 이의 조합물 중 하나 이상인 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 병리 질환이 근육 또는 혈관 세포/조직 손상, 심혈관병, 심근경색 또는 심한 물리적 활동, 스포츠 관련 손상, 근육퇴행위축, 심장 허혈, 심부전, 노화 변성, 신경변성, 패혈증, 세균 감염, 치은염, 치은퇴축, 치주병, 주름 보호, 피부 찰과상, UV 손상, 질소 머스터드(화학적 수포제), 궤양, COPD, 상처 치유, 노인 의학, 항염증제의 결과로서 발생하는 조직 손상, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 조성물이 아연 효능제를 추가로 포함하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 조성물이 노토진싱을 추가로 포함하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 조성물이 산화제를 추가로 포함하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 조성물이 로션, 스프레이, 젤, 스와브(suave), 액체, 페이스트, 에어로졸, 분말, 주사가능물질 및 경피 도포제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형태로 투여되는 방법.
- 제 31항에 있어서, 상기 형태가 국소 투여에 적합화된 것인 방법.
- 서열 목록 번호: 1, 3, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16에 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 갖는 재조합 폴리펩티드, 및 아연, 노토진싱의 추출물, 산화제 또는 약학적으로 허용되는 담체 중 하나 이상을 포함하는 조성물.
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