CN114634551A - 多肽及其在制备拮抗野生型p53与MDM2结合的抗癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于鼻咽癌药物领域，具体公开了一种抗鼻咽癌的p53‑MDM2拮抗多肽药物，其是具有式1结构式的化合物。本发明还公开了所述的抗鼻咽癌多肽及其衍生多肽(具有式2结构式)作为抗鼻咽癌转移药物的应用。本发明中式1和式2化合物在抗鼻咽癌转移方面具有出人意料的效果，能够抑制鼻咽癌细胞在体内外转移和侵袭。

Description

多肽及其在制备拮抗野生型p53与MDM2结合的抗癌药物中的 应用

技术领域：

本发明涉及生物技术和生物医药领域，具体涉及抗肿瘤化疗药物。

背景技术：

鼻咽癌(NPC)是中国南方地区的主要癌症。在我国广东省成年人中，鼻咽癌是最常见的恶性肿瘤，因该地鼻咽癌的发病率每年达到80例/100000人，NPC也被称为“广东癌症”。NPC发生的解剖位置隐蔽且常无特定症状，因此患者多在初诊为NPC时就发现伴随转移。在确诊时，60％的患者伴有淋巴结转移，4.2％的患者有远处转移。鼻咽癌主要采用放射治疗，常根据疾病不同阶段联合化疗。尽管NPC对放化疗敏感，但放疗作用区域局限，而常规化疗药物(如顺铂、5-FU等)作用于所有细胞，对正常细胞也有很大损伤。伴有转移病灶的NPC病人接受常规治疗后不良反应明显，预后仍较差。

因此，发掘特异性靶向癌细胞独特分子特征，抗肿瘤功效更大且毒性更低的新药是鼻咽癌药物研究的主要目标。

NPC发病涉及多个基因及信号通路的变化，p53就是关键基因之一。p53基因位于17号染色体(17p13.1)上，翻译出具有393个氨基酸的蛋白质。野生型(wt)p53在保护细胞免于癌变方面具有重要的生物学作用。p53能维持基因组稳定性，以自然方式清除DNA受损细胞，调节细胞中G1-S期的转变并防止基因畸变。MDM2蛋白是p53蛋白稳定性和活性的主要调节因子，它通过E3-泛素连接酶活性调控p53,可拮抗p53的肿瘤抑制作用。细胞应激、DNA损伤或致癌基因的激活等可使p53-Mdm2复合物的解离，这导致p53从与Mdm2结合中游离出来，p53蛋白被激活。p53的降解受到抑制，导致其半衰期延长至数小时，并在细胞中累积。p53的突变会改变其DNA修复能力，从而导致癌症发展。在人类肺癌、结肠癌、头颈癌的早期阶段p53突变很常见，但在NPC中p53罕见突变，因此，可以通过恢复p53介导的肿瘤抑制作用来治疗NPC。

发明内容：

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的第一目的在于提供一种多肽，旨在提供一种能够特异性和MDM2结合的抗肿瘤的多肽。

本发明第二目的在于提供所述的多肽的应用以及包含所述多肽的药物。

一种多肽，为具有式1和/或式2结构的化合物及其溶剂化合物、药学上可接受的盐；

本发明式1所述的多肽也称为多肽LP8(本发明也简称LP8)，所述多肽LP8氨基酸残基序列为LPDWHIPV。式2所述的融合多肽也称为TAT-LP8，氨基酸残基序列为YGRKKRRQRRRLPDWHIPV。所述融合多肽TAT-LP8含有多肽Ⅰ和多肽Ⅱ，所述多肽Ⅰ为HIV-TAT蛋白转导域，其作用是跨膜传递；多肽Ⅰ的C-末端与多肽Ⅱ的N-末端的氨基酸缩合形成肽键。

本发明所述的多肽，其能够选择性与MDM2结合，例如可与p53竞争性结合MDM2使p53-MDM2复合物减少，促使细胞内游离p53蛋白增加，在靶向抑制肿瘤细胞例如鼻咽癌细胞转移、侵袭方面起着重要作用，在NPC靶向治疗方面具有巨大的应用价值。本发明所述的p53例如为野生型p53蛋白。

本发明所述的多肽，可基于现有的氨基酸合成方法制备，且其具有良好的溶解性能，例如，可采用PBS溶解，有利于其利用。

本发明还提供了所述的多肽的应用，将其用于制备和MDM2结合的药物。

本发明优选的应用，所述的多肽为p53-MDM2拮抗多肽，可将其用于制备与p53竞争性结合MDM2拮抗p53-MDM2的药物。

进一步优选的多肽应用，将其用于制备和MDM2选择性结合从而提高p53蛋白水平的药物。本发明所述的应用，所述的多肽相较于P53，具有和MDM2较强的竞争结合优势，可以拮抗p53和MDM2的结合，提高P53蛋白水平，从而达到抗癌效果。

优选的多肽应用，将其用于制备抗肿瘤的药物；

优选的多肽应用，将其用于制备抗鼻咽癌药物。

优选的多肽应用，将其用于制备治疗p53野生型的鼻咽癌的化疗药物；

本发明中，可以将所述的多肽，采用现有的制药手段制得需要的药物。例如，将其和药学上可接受的辅料联合，用于制备药学上可接受的治疗鼻咽癌的化疗药物剂型。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，含有药学有效量的所述的多肽。

作为优选，所述的抗肿瘤药物，还允许包括治疗剂；优选地，所述治疗剂为任意的具有抗肿瘤活性的物质；

优选地，所述的抗肿瘤药物，还含有一种以上药学上可接受的载体。优选地，所述载体为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

本发明所述的载体可以是行业内公知的药用辅料成分。

所述的药物剂型例如为片剂、粒剂、胶囊、口服液或注射剂等多种形式。各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。

优选的，所述抗肿瘤药物为抑制肿瘤细胞转移、侵袭的药物。实验表明，多肽LP8可通过抑制肿瘤细胞的转移及侵袭以实现抗肿瘤的作用。

本发明所述的抗肿瘤药物，为抗鼻咽癌药物。

有益效果

(1)本发明提供的p53蛋白拮抗多肽(式1)及其衍生物(式2)能够特异性地与MDM2结合，与p53蛋白竞争MDM2，抑制p53-MDM2蛋白酶体降解途径，使游离p53蛋白增多，从而抑制肿瘤细胞侵袭转移。

(2)本发明提供的多肽及其衍生物可以作为MDM2结合位点的生物类多肽药物，用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物，解决当前靶向药物的有效靶点较少，以及选择适宜的靶向治疗药物前需要对患者进行相应的分子靶点检测的问题，具有巨大的社会与经济效益。

附图说明

图1表示Fitc-Acp-LP8(所述的多肽N段修饰有Fitc标记因子)的高效液相(HPLC)检测图；

图2表示Fitc-Acp-LP8(所述的多肽N段修饰有Fitc标记因子)的质谱(MS)检测图；

图3表示TAT-LP8的高效液相(HPLC)检测图；

图4表示TAT-LP8的质谱(MS)检测图；

图5表示LP8对HONE1细胞转移能力的影响；

图6表示LP8对HONE1细胞p53与MDM2蛋白表达的影响；

图7表示TAT-LP8对HONE1细胞内p53与MDM2蛋白表达的影响；

图8表示TAT-LP8对HONE1和5-8F细胞转移能力的影响；

图9表示TAT-LP8对HONE1和5-8F细胞侵袭能力的影响；

图10表示TAT-LP8在尾静脉肺转移治疗模型中对鼻咽癌的治疗效果。

具体实施方式：

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

主要材料和仪器

多肽的合成：实验中所用多肽LP8及TAT-LP8均由生工生物工程上海股份有限公司合成，合成方法为固相合成法，纯度均在95％以上。

HONE1(人鼻咽癌细胞)、5-8F(人鼻咽癌细胞)细胞株均来自南方医科大学癌症研究所(中国广州)，所需实验材料为：RPMI-1640基础培养基；胎牛血清；氨苄青霉素和链霉菌素；DMSO；胰蛋白酶；PBS；高效RIPA组织/细胞裂解液；PMSF；蛋白定量(BCA)测试试剂盒；Invasion Chamer 24-Well Plate 8.0Micron；NOD-SCID 3周龄的小鼠10只，SPF级，雌性，体重12-15g，购自广州迪恩基因技术有限公司。

实施例1：

一种多肽LP8，其氨基酸序列为：LPDWHIPV，可应用于制备抗肿瘤药物。

式1和式2均采用Fmoc固相合成法合成(由生工生物工程上海股份有限公司合成)，合成后采用HPLC和MS检测。

图1为Fitc-Acp-LP8的高效液相(HPLC)检测图，结果表明合成的Fitc-Acp-LP8多肽纯度高达95.852％；图2为Fitc-Acp-LP8的质谱(MS)检测图，结果表明，合成的多肽的大小为1478.7Da，分子量大小与预测值一致。

图3为TAT-LP8的高效液相(HPLC)检测图，结果表明合成的TAT-LP8多肽纯度高达95.083％；图4为TAT-LP8的质谱(MS)检测图，结果表明，合成的多肽的大小为2517.9Da，分子量大小与预测值一致。

实施例2：

划痕实验检测LP8对鼻咽癌细胞转移能力的影响

细胞复苏：将HONE1细胞株冻存管于液氮罐中取出，并放置于37℃水浴锅摇晃至融解。将融化后的细胞株于无菌超净台中吸出至15mL规格的无菌离心管中，1000r/min离心5min，去上清；在HONE1中加入5mL新鲜的RPMI-1640完全培养基。最后转移至规格为25cm2的无菌培养瓶，于5％CO2、37℃条件下培养。

细胞传代：用显微镜观察细胞，细胞形态正常，且生长密度达到90％左右时进行细胞传代。首先把含细胞的培养瓶取出放入超净台中，吸出原培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞2次，吸净PBS后加入600μL胰酶，使其能完全覆盖培养瓶瓶底，拧紧瓶盖后置于37℃培养箱中进行消化。消化完毕后用新鲜的完全培养基沿瓶壁吹下细胞，接着把细胞悬液吸至15mL无菌离心管中以1000r/min条件离心5min，去除上清，加入新鲜完全培养基重悬细胞并以1:3的比例进行细胞传代。

细胞冻存：按上述细胞传代的过程离心去除上清后，加入冻存液(基础培养基:胎牛血清:DMSO＝5:4:1)重悬细胞，并将其悬液分别加入到1.5mL的细胞冻存管中(每管细胞悬液中大约为1×106个细胞)，做好标记后进行梯度降温法冻存。

本实验中，在6孔板中培养HONE1细胞株，待细胞密度接近100％时，用含LP8的Opti-MEM培养基处理24h，LP8浓度分别为0、100和150μM。弃去培养基，用200ul枪头垂直划痕(每个孔的痕大小一样)，用PBS洗涤一次，除去下划的细胞。继续用含LP8的Opti-MEM培养基培养，分别在划痕后0、24和48h时对划痕固定位置拍照。

检测和探究LP8对鼻咽癌细胞转移能力的影响，实验结果如图5所示。结果显示，不同浓度的LP8多肽可以显著抑制鼻咽癌细胞HONE1细胞转移，并且随着作用时间的增加，短肽抑制鼻咽癌细胞HONE1细胞转移的作用也更为显著。

实施例3：

LP8在细胞内对p53和MDM2表达的影响

将适量对数生长期的HONE1细胞株均分为3份，分别培养在6孔板上3个孔里，待细胞贴壁后用含LP8的Opti-MEM培养基处理24h，LP8浓度分别为0、100和150μM。作用24小时后收取细胞沉淀进行WB实验。实验结果如图6所示。western blot实验结果，证实了LP8显著抑制了MDM2对p53蛋白表达的负向调节作用，增加了细胞内p53蛋白的表达，同时MDM2蛋白水平也提高。

实施例4：

TAT-LP8对HONE1细胞内p53与MDM2蛋白表达的影响

将适量对数生长期的HONE1细胞株等量培养在2块6孔板上(各4个孔)。待细胞贴壁后，其中一块板作为对照组，用含0、5、10和20μM TAT多肽的Opti-MEM培养基处理；另一块板用含相同浓度梯度TAT-LP8多肽的Opti-MEM培养基处理。作用24小时后收取细胞沉淀进行WB实验。实验结果如图7所示。结果表明对照多肽TAT对p53与MDM2蛋白表达无明显影响；TAT-LP8多肽能同时提高p53和MDM2蛋白水平，且蛋白增加量与TAT-LP8剂量正相关。

实施例5：

检测TAT-LP8对HONE1和5-8F细胞转移能力的影响

本实验与实施例2方法一致，在6孔板中分别培养HONE1和5-8F细胞株，每个细胞株各分为两组(TAT处理组和TAT-LP8处理组)。待细胞密度接近100％时，用含20μM的TAT或TAT-LP8的Opti-MEM培养基处理24h。弃去培养基，用200ul枪头垂直划痕(每个孔的痕大小一样)，用PBS洗涤一次，除去下划的细胞。继续用含TAT或TAT-LP8的Opti-MEM培养基培养，分别在划痕后0、24和48h时对划痕固定位置拍照。

检测和探究TAT-LP8对鼻咽癌细胞转移能力的影响，实验结果如图8所示。结果显示，20μM的TAT-LP8肽可以显著抑制鼻咽癌细胞转移。

实施例6：

检测TAT-LP8对HONE1和5-8F细胞侵袭能力的影响

在6孔板中分别培养HONE1和5-8F细胞株，每个细胞株各分为两组(TAT处理组和TAT-LP8处理组)。待细胞密度适宜时，用含20μM的TAT或TAT-LP8的Opti-MEM培养基处理细胞24h。

PBS洗涤两次各处理组的细胞，用0.25％胰酶消化，1000rpm离心5min,用2％血清培养基重悬细胞，制成单细胞悬液。

经细胞计数后，各组的细胞浓度调整为1×106个/ml,24孔板的boyden上室加入2×105个细胞，插入装有600ul含10％血清的培养基中，细胞培养箱中孵育24-48h。

显微镜观察可见穿入下室的细胞有20个以上时，去除上下室培养基，用PBS洗涤两次，用甲醇固定已经侵袭至膜下面的细胞，然后用湿棉签轻轻擦掉膜上面未侵袭的细胞，用PBS洗2次后用1％结晶紫染色，在显微镜下观察，随机计数每个孔中5个视野的细胞数，取平均值，用统计软件分析。实验结果如图9所示，20μM的TAT-LP8肽可以显著抑制鼻咽癌细胞侵袭。

实施例7：

小鼠体内药物实验

将带有荧光标记的5-8F鼻咽癌细胞进行NOD小鼠尾静脉注射(共10只)，每只注射1.2×106个细胞，构建实验性肺转移模型。记注射鼻咽癌细胞的那天为第0天，将小鼠随机分为2组，每组5只，分别为对照组(TAT治疗)和多肽治疗组(TAT-LP8治疗)。按每2天注射1次的频率，以15mg/kg的剂量腹腔注射进行治疗。第25天对小鼠进行安乐死，取出肺脏至荧光显微镜下拍照。肺转转移瘤情况如图10，结果表明，TAT-LP8治疗的小鼠体内鼻咽癌肺转移瘤较少，TAT-LP8对鼻咽癌肺转移瘤有明显的治疗效果。

Claims (10)

1.一种多肽，其特征在于，为具有式1和/或式2结构的化合物及其溶剂化合物、药学上可接受的盐；

2.如权利要求1所述的多肽的应用，其特征在于，将其用于制备和MDM2结合的药物。

3.如权利要求2所述的多肽的应用，其特征在于，将其用于制备与p53竞争性结合MDM2拮抗p53-MDM2的药物。

4.如权利要求3所述的多肽的应用，其特征在于，将其用于制备和MDM2选择性结合从而提高p53表达的药物。

5.如权利要求2～4任一项所述的多肽的应用，其特征在于，将其用于制备抗肿瘤的药物；

优选地，所述的抗肿瘤的药物为抗鼻咽癌药物。

6.如权利要求5所述的多肽的应用，其特征在于，将其用于制备治疗p53野生型的鼻咽癌的化疗药物；

优选地，将其和药学上可接受的辅料联合，用于制备药学上可接受的治疗鼻咽癌的化疗药物剂型。

7.一种抗肿瘤药物，其特征在于，含有药学有效量的权利要求1所述的多肽。

8.如权利要求7所述的抗肿瘤药物，其特征在于，还允许包括治疗剂；

优选地，所述治疗剂为任意的具有抗肿瘤活性的物质；

优选地，还含有一种以上药学上可接受的载体；

优选地，所述载体为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

9.如权利要求7或8所述的抗肿瘤药物，其特征在于，具有药学上可接受的剂型；优选为注射剂或口服制剂。

10.如权利要求7～9任一项所述的抗肿瘤药物，其特征在于，为抗鼻咽癌药物。

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