CN114605522A

CN114605522A - Mcl-1和bcl-xl蛋白双靶向bh3多肽模拟物及其应用

Info

Publication number: CN114605522A
Application number: CN202210364480.4A
Authority: CN
Inventors: 王俊卿; 李胜斌
Original assignee: Shenzhen Qiyu Biotechnology Co ltd; Sun Yat Sen University
Current assignee: Shenzhen Qiyu Biotechnology Co ltd; Sun Yat Sen University
Priority date: 2022-04-08
Filing date: 2022-04-08
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2042-04-08
Also published as: CN114605522B

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及抗凋亡蛋白抑制剂，具体涉及MCL‑1和BCL‑XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物及其应用，本发明公开了一种MCL‑1和BCL‑XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物R1‑(X)3‑R2‑X4‑R3，该多肽模拟物是一种新型BH3多肽模拟物，可以同时靶向MCL‑1和BCL‑XL两种抗凋亡蛋白，亲和力相比天然BH3更高。同时，该BH3多肽模拟物可以抑制恶性血液肿瘤细胞的增殖，具有更优异的抗肿瘤活性，且与其他具有抗肿瘤活性的药物联用使用可以起到协同抗癌的效果。因此，本发明提供的BH3多肽模拟物在肿瘤治疗药物的开发和应用方面具有较好的前景。

Description

MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及抗凋亡蛋白抑制剂，具体涉及MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物及其应用。

背景技术

在多细胞生物体中，细胞有多种不同的死亡形式，常见的形式主要包括坏死(Necrosis)、凋亡(Apoptosis)、焦亡(Pyroptosis)和铁死亡(Ferroptosis)等。其中，凋亡是由基因调控的细胞主动自杀过程,机体通过凋亡将衰老畸变的细胞从体内清除掉以维持内环境的稳定。然而，如果细胞过度凋亡会引发阿尔茨海默病等神经退行性疾病，凋亡受到抑制则会使存在DNA缺陷的细胞继续生长，进而导致肿瘤等疾病的发生。细胞凋亡主要包括两种的途径，分别是外源性途径和内源性途径。其中细胞的内源性凋亡途径主要是由Bcl-2蛋白家族调节的。Bcl-2家族蛋白是线粒体途径细胞凋亡的一类关键调节蛋白，Bcl-2家族蛋白功能失调是肿瘤发生的一个重要因素。因此，Bcl-2家族蛋白成为抗肿瘤药物开发的重要靶点之一。

自1984年由日本科学家Tsujimoto等人首次报道Bcl-2蛋白以来，目前至少已有25种Bcl-2家族蛋白被发现。Bcl-2家族蛋白是以BCL-2蛋白为原型演化而来的蛋白，这些蛋白含有一个到四个不等的BCL-2同源结构域(Bcl-2homology domains，简称BH结构域)，即BH1-BH4。其中，BH3结构域是促凋亡蛋白发挥凋亡诱导活性的必需结构。根据BH结构域和凋亡调控功能的差异，可将BCL-2家族分为三个亚型：第Ⅰ类为多域抗凋亡蛋白，包括BCL-2、BCL-xL、BCL-w、MCL-1、A1及BCL-B蛋白，这类蛋白一般拥有四个BH结构域(BH1－BH4)；第Ⅱ类为多域促凋亡蛋白，包括Bax，Bak及Bok，这类蛋白也拥有BH1－BH4四个结构域；第Ⅲ类为仅含有BH3结构域(BH3-only)的促凋亡蛋白，包括BIM、PUMA、BAD、NOXA、BIK、HRK、BMF及BID。BCL-2家族通过家族内的蛋白-蛋白相互作用(PPIs)来调控细胞凋亡信号通路。同时，BCL-2家族对凋亡的调控过程发生在线粒体膜上，线粒体膜上的Bax或Bak蛋白被激活后，发生构象变化，致使Bax和Bak形成蛋白寡聚体插入线粒体外膜，进而导致其通透性变高，并进一步促进细胞色素c释放到细胞质中，引起caspase(半胱氨酸蛋白酶)的活化，最后导致细胞凋亡。其中，I类抗凋亡蛋白的疏水口袋可以结合促凋亡蛋白Bax或Bak的BH3结构域，从而抑制其促凋亡活性。Ⅲ类促凋亡BH3-only蛋白有直接和间接两种促凋亡方式，一种是可以结合并抑制I类抗凋亡蛋白的活性(间接作用)，另一种是部分Ⅲ类蛋白(BIM、PUMA和tBID)也可以直接结合并激活Ⅱ类促凋亡蛋白Bax或Bak的活性。需要注意的是，虽然BCL-2家族成员有高度同源性，但是各个BCL-2家族成员的BH 3结合区和结构域都有些许不同，所以家族成员间的相互结合具有不同的选择性和亲和力。例如，Bax可以与大部分I类蛋白相结合，但Bak只能与MCL-1、A1及BCL-xL相结合。又比如，BAD蛋白只可以结合BCL-2、BCL-xL及BCL-w蛋白，NOXA蛋白只能结合MCL-1和A1蛋白，而BIM、PUMA和tBID蛋白则可以结合大多数的I类蛋白(BCL-2、BCL-xL、BCL-w、MCL-1和A1蛋白等)。

基于BCL-2家族的上述结构基础，开发BH3模拟物来破坏抗凋亡和促凋亡蛋白之间的PPIs是非常有效的重新激活细胞凋亡的策略。目前，研究人员基于BH3结构域已经开发出了多种具有抗肿瘤活性的化合物，其中一些已进入了临床研究阶段，包括Oblimersen、Navitoclax(ABT-263)、Venetoclax(ABT-199)、Obatoclax mesylate(GX15-070)等，其中Venetoclax于2016年获得FDA批准上市。BH3类似物以小分子化合物居多，且大部分为BCL-2蛋白特异性抑制剂，目前特异性结合BCL-XL和MCL-1蛋白的双抑制剂研究仍然较少。由于细胞凋亡的调节是通过一系列相互作用的凋亡调节因子组成的网络共同完成的,因此仅对个别抗凋亡蛋白进行抑制可能无法有效诱导细胞凋亡，也可能会使肿瘤细胞容易产生获得性耐药性。有研究表明，BH3多肽模拟物的组合在血液和某些实体肿瘤中存在协同作用，BH3类似物无法同时与BCL-2、MCL-1和BCL-XL等多个主要抗凋亡蛋白结合是药物抗性产生的主要原因之一，尤其是当肿瘤细胞过度表达某些不能被结合的抗凋亡蛋白时。例如，新型BCL-2选择性抑制剂ABT-199在急性淋巴系白血病(Acute lymphocytic leukemia,ALL)和慢性淋巴系白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)中均表现出较好的效果，然而由于其无法同时与MCL-1和BCL-XL结合，导致在急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)中由于MCL-1和BCL-XL的上调而出现获得性耐药性，而通过靶向MCL-1和BCL-XL，抗性AML细胞系可以对ABT-199重新敏感。此外，靶向MCL-1和/或BCL-XL并同时施用ABT-199能够延迟或阻止耐药性的获得。因此，开发对多个主要抗凋亡蛋白具有高亲和力的BH3多肽模拟物抑制剂是解决目前BCL-2家族抗凋亡蛋白抑制剂治疗效果不佳且容易产生耐药性的有效策略。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物。

本发明的第二个目的是提供上述MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物的应用。所述BH3多肽模拟物对蛋白亲和力更高，稳定性更好，抗肿瘤效果更优异。

本发明的第一个发明目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供了一种MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物，所述BH3多肽模拟物的结构通式为R1-(X)3-R2-X4-R3，其中，R1、R2、R3代表一个或多个天然氨基酸残基，X代表一个天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基。

优选地，所述BH3多肽模拟物的结构通式为R1-X1-X2-X3-R2-X4-R3，其中R1、R2、R3、X的定义同上。

进一步地，所述R1选自Glu、Pro-Glu、Asp-Met-Arg-Pro-Glu，R2选自Ala-Gln-Glu-Leu-Arg-Arg-Ile-Gly-Asp-Glu，R3选自Asn-Ala-Tyr-Tyr-Ala、Asn-Ala-Tyr-Tyr-Ala-Arg-Arg，X1选自Ile、Omt，X2选自Trp，X3选自Ile、Chg，X4选自Phe、Phe(4-Me)。

更进一步地，所述BH3多肽模拟物为R1-Omt-Trp-Chg-R2-Phe(4-Me)-R3，其中R1、R2、R3的定义同上。该BH3多肽模拟物对MCL-1蛋白和BCL-XL蛋白具更高的亲和力。

具体地，BH3多肽模拟物R1-Omt-Trp-Chg-R2-Phe(4-Me)-R3中，所述R1为Asp-Met-Arg-Pro-Glu，R2为Ala-Gln-Glu-Leu-Arg-Arg-Ile-Gly-Asp-Glu，R3为Asn-Ala-Tyr-Tyr-Ala-Arg-Arg。

本发明通过生物信息学方法，构建具有100多个非天然氨基酸的数据库，然后基于计算机辅助设计对天然BIM BH3序列(如SEQ ID NO：1所示)进行单点或多点突变，获得BH3多肽模拟物(R1-(X)3-R2-X4-R3，其中X代表非天然氨基酸突变位点)，最后通过筛选获得了8条对MCL-1蛋白和BCL-XL蛋白具有高亲和力的BH3多肽模拟物，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2～9所示。

本发明的第二个发明目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明还提供了上述MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物在制备抗凋亡蛋白抑制剂中的应用。

本发明还提供了上述MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。

本发明还提供了上述MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选地，所述肿瘤包括恶性血液肿瘤、皮肤癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、鼻咽癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、宫颈癌或胰腺癌。

进一步地，所述肿瘤为恶性血液肿瘤。

更进一步地，所述恶性血液肿瘤为急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)、慢性髓系白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)、急性淋巴系白血病(Acutelymphocytic leukemia,ALL)及慢性淋巴系白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)。

具体的，所述恶性血液肿瘤为急性髓系白血病(对应THP-1细胞)和急性淋巴系白血病(对应Daudi细胞)。

本发明经过研究发现，BH3多肽模拟物(R1-(X)3-R2-X4-R3中，“(X)3”突变位点中的X3突变为非天然氨基酸残基Chg的突变体与MCL-1蛋白和BCL-XL蛋白的结合能力提升最为显著，而X4突变为非天然氨基酸残基、N端“R1”的DMR天然氨基酸残基和C端“R3”的RR氨基酸残基对结合亲和力也有一点影响，即N端包含DMR和C端包含RR的BH3模拟肽与MCL-1蛋白和BCL-XL蛋白的结合能力提高。细胞实验进一步表明，本发明提供的BH3多肽模拟物相比天然BIM BH3序列具有更好的肿瘤抑制效果，尤其是高表达MCL-1和BCL-XL的肿瘤细胞。此外，本发明提供的BH3多肽模拟物与BCL-2蛋白抑制剂或其他化疗药物联用表现出良好的协同效果。

本发明还提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的药物，所述药物包括上述的MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述药物包括上述的MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物及其他具有抗肿瘤活性的药物。

本发明提供了对MCL-1蛋白和BCL-XL蛋白具更高亲和力的双靶向的BH3多肽模拟物，该BH3多肽模拟物与其他具有抗肿瘤活性的药物结合，可以起到协同作用提高肿瘤细胞抑制效果并减少耐药性发生。

优选地，所述MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物的N端插入Tat穿膜肽序列。

具体地，所述Tat穿膜肽序列为RKKRRQRRR。

优选地，所述其他具有抗肿瘤活性的药物为化学治疗药物或生物治疗药物。

进一步地，所述其他具有抗肿瘤活性的药物为紫杉醇、Venetoclax(ABT-199)等化学治疗药物，也可以是多肽、蛋白、抗体类生物治疗药物，优选BCL-2抑制剂。

具体地，所述其他具有抗肿瘤活性的药物为Venetoclax(ABT-199)。

实验结果表明，本发明的BH3多肽模拟物可以抑制THP-1、Daudi等肿瘤细胞的增殖，且所述新型BH3多肽模拟物与Venetoclax(ABT-199)或其他化疗药物联用起协同效果，有望开发为肿瘤治疗药物进行应用。

优选地，所述药物的剂型包括但不限于注射剂、粉针剂、植入剂、丸剂、胶囊剂、口服剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明公开了一种MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物R1-(X)3-R2-X4-R3，该多肽模拟物是一种新型BH3多肽模拟物，与天然BH3或其他已报道的类似物具有不同的氨基酸结构，且该BH3多肽模拟物可以同时靶向MCL-1和BCL-XL两种抗凋亡蛋白，亲和力相比天然BH3更高。同时，该BH3多肽模拟物可以抑制恶性血液肿瘤细胞的增殖，具有更优异的抗肿瘤活性，且与其他具有抗肿瘤活性的药物联用使用可以起到协同抗癌的效果。因此，本发明提供的BH3多肽模拟物在肿瘤治疗药物的开发和应用方面具有较好的前景。

附图说明

图1为BH3多肽模拟物对THP-1细胞(A)和Daudi细胞(B)的抑制活力图；

图2为BH3多肽模拟物与ABT-199联用对THP-1细胞的抑制活力图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

实施例1BH3多肽模拟物的设计

本发明采用生物信息学的方法，构建了一个具有100多个非天然氨基酸的数据库，采用蛋白模拟软件分别对MCL-1-BH3和BCL-XL-BH3结合活性进行突变扫描，获得亲和力较高的多肽序列(P1～9)，如表1所示，P1为26个氨基酸的人BIM BH3的氨基酸序列，P5为21个氨基酸的截短型人BIM BH3的氨基酸序列，其他序列为计算机利用非天然氨基酸(部分非天然氨基酸如表2所示)数据库进行单点或多点突变设计所得到的多肽序列。

其中，多肽P2～9的结构通式符合R1-X1-X2-X3-R2-X4-R3，其中，R1、R2、R3代表一个或多个天然氨基酸残基，X代表一个天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基。具体地，R1选自Glu、Pro-Glu、Asp-Met-Arg-Pro-Glu，R2选自Ala-Gln-Glu-Leu-Arg-Arg-Ile-Gly-Asp-Glu，R3选自Asn-Ala-Tyr-Tyr-Ala、Asn-Ala-Tyr-Tyr-Ala-Arg-Arg，X1选自Ile、Omt，X2选自Trp，X3选自Ile、Chg，X4选自Phe、Phe(4-Me)。

表1BH3及其类似物氨基酸序列

注：Ace是N端乙酰化；-NH₂是C端酰胺化，作用是增强多肽的稳定性。

表2非天然天然氨基酸的名称和结构

实施例2BH3多肽模拟物的合成

采用固相合成法制备BH3多肽模拟物(如P1～9所示)，具体方法如下：

(1)溶胀树脂：称取1000mg(载样量为0.3mmol/g)Wang树脂置于固相合成反应管中，加入15mL二氯甲烷浸泡溶胀30min，用DMF洗涤3次，抽干待用。

(2)缩合反应：向树脂中加入3倍当量Fmoc-氨基酸(0.9mmol)，加10mL DMF溶解，再依次加入6倍当量的DIEPA(1.8mmol)、2.85倍当量的HBTU(0.855mmol)，室温鼓氮气反应30分钟，反应后抽干反应液，用DMF洗涤Wang树脂3次，取少量树脂，用乙醇茚三酮溶液检测显无色。

(3)脱Fmoc保护：加入15mL 20％哌啶/DMF溶液反应30min，脱去Fmoc-氨基酸上N端的Fmoc保护，用DMF洗涤Wang树脂5次，取少量树脂，用乙醇茚三酮溶液检测显色。

(4)重复上述缩合反应和脱Fmoc保护，按照预定氨基酸序列，分别将0.9mmolFmoc-氨基酸、10mL DMF、1.8mmol DIEPA和0.855mmol HBTU添加到树脂中，依次偶联，每次偶联后，均使用20％哌啶/DMF溶液进行脱Fmoc处理，进而获得具有特定氨基酸序列且带侧链保护基团的多肽树脂。将此多肽树脂用DCM和甲醇交替各洗涤2次，再用甲醇洗涤1次后，将树脂抽干待用。

(5)树脂切割：将上述干燥的树脂置入有盖的专用切割塑料瓶中，加入10mL切割液【三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水＝87.5％：5％：2.5％：2.5％：2.5％(体积比)】，盖紧瓶盖，摇床上室温摇晃2.5h，过滤树脂收集液体，再往液体中快速加入30mL冰的无水乙醚并搅拌均匀，5000rpm离心3分钟，得到白色沉淀，用冷的无水乙醚重复洗涤白色沉淀3次，真空干燥沉淀物，得粗品多肽。

(6)用RP-HPLC对上述粗品多肽进行分离纯化，流动相A(有机相)为0.1％TFA/乙腈、流动相B(水相)为0.1％TFA/水，线性梯度洗脱为10％-40％/40min，流速10mL/min,将收集到的多肽溶液进行冻干处理，得到粉末状固体多肽。

(7)经HPLC鉴定，各个多肽的纯度均达95％以上，使用的分析柱型号为ZORBAX SB-C18，4.6×250MM，5um。最后经质谱鉴定，分子量和目标多肽分子量吻合。

实施例3BH3多肽模拟物与MCL-1和BCL-XL蛋白的亲和力鉴定

(1)采用BPS Bioscience公司的MCL-1TR-FRET检测试剂盒和BCL-XL TR-FRET检测试剂盒，两种蛋白试剂盒的原理及使用方式相同，以MCL-1 TR-FRET检测试剂盒为例，使用方式如下(表3)：

1)用2份体积蒸馏水稀释1份体积3×MCL-1 TR-FRET分析缓冲液(3倍稀释)，制成1×MCL-1 TR-FRET分析缓冲液。

2)将抗His Tb标记供体和Dye标记受体用1×MCL-1 TR-FRET分析缓冲液稀释200倍。

3)向每个指定为“试验抑制剂”、“阴性对照”和“阳性对照”的孔中加入5μL稀释的抗His Tb标记供体和5μL稀释的Dye标记受体。

4)向每个指定为“试验抑制剂”的孔中加入2μL抑制剂溶液，向标记为“阴性对照”和“阳性对照”的孔中加入2μL不含抑制剂的抑制剂缓冲液。

表3亲和力鉴定实验分组

	阴性对照	阳性对照	试验抑制剂
				抗HisTb标记的供体	5μL	5μL	5μL
Dye标记的受体	5μL	5μL	5μL
				试验抑制剂	-	-	2μL
抑制剂缓冲液	2μL	2μL	-
				1×TR-FRET分析缓冲液	5μL	-	-
MCL-1肽配体	-	5μL	5μL
				MCL-1蛋白3.34ng/μL	3μL	3μL	3μV
总计	20μL	20μL	20μL

5)将MCL-1肽配体重新悬浮于320μL的1×MCL TR-FRET分析缓冲液中。

6)使用1×MCL TR-FRET分析缓冲液将步骤5)中的MCL-1肽配体稀释10倍。向每个指定为“阳性对照”和“试验抑制剂”的孔中加入5μL这种稀释的MCL-1肽配体。向标记为“阴性对照”的孔中加入5μL 1×MCL TR-FRET分析缓冲液。

7)将MCL-1蛋白在冰上解冻，短暂旋转试管以及回收试管中的全部内容物。

8)将MCL-1蛋白在1×MCL TR-FRET分析缓冲液中稀释至3.33ng/μL，通过向“阴性对照”、“阳性对照”和“试验抑制剂”的孔中加入3μL稀释的MCL-1蛋白引发反应。

9)在室温下孵育2小时。

10)在多功能酶标仪上按表4的参数进行TR-FRET检测，读取荧光强度。

表4TR-FRET检测参数

仪器设置
		阅读模式	Time Resolved
激发波长	340±20nm
		发射波长	620±10nm
滞后时间	60μs
		积分时间	500μs
激发波长	340±20nm
		发射波长	665 10nm
滞后时间	60μs
		积分时间	500μs

(2)计算结果:

使用多功能酶标仪进行TR-FRET检测，读取荧光强度(连续测量1620nm，1665nm)，并使用FRET比(665nm发射/620nm发射)进行数据分析。计算活性百分比时，阴性对照的FRET值设置为活性百分比为零，阳性对照的FRET值设置为活性百分比百分之百。活性百分比计算公式如下：

活性百分比(％)＝(FRET_样本－FRET_阴性对照)/(FRET_阳性对照－FRET_阴性对照)×100％。

同时，使用GraphPad8.0软件作量效曲线，进行非线性拟合计算IC50。

如表5所示，多肽P2～P6的MCL-1和BCL-XL的IC₅₀(半数抑制浓度)大于P1，即与这两种蛋白的亲和力比天然序列P1低，但多肽P7～P9的MCL-1和BCL-XL的IC₅₀均小于P1，即与这两种蛋白的亲和力比天然序列P1高，其中，多肽P9的亲和力最高。

表5BH3多肽模拟物与抗凋亡蛋白MCL-1和Bcl-XL的结合活性

实施例4BH3多肽模拟物对肿瘤细胞增殖的抑制作用

(1)按照实施例2的固相合成方法合成N端插入Tat穿膜肽序列(RKKRRQRRR-)的BH3多肽模拟物P10、P11，在细胞水平评估BH3多肽模拟物的抑瘤活性。其中，P10为在天然BH3序列P1的N端添加一段9个氨基酸的Tat穿膜肽序列(RKKRRQRRR-)，P11为在BH3非天然氨基酸突变体P9序列N端添加相同的穿膜肽序列(RKKRRQRRR-)，P10和P11的序列详情见表6。

表6BH3多肽模拟物(P10、P11)氨基酸序列

多肽	序列
		P10	RKKRRQRRR-DMRPEIWIAQELRRIGDEFNAYYARR-NH2
P11	RKKRRQRRR-DMRPE-Omt-W-Chg-AQELRRIGDE-Phe(4-Me)-NAYYARR-NH2

(2)将THP-1细胞(急性单核细胞白血病细胞)和Daudi细胞(人Burkitt's淋巴瘤细胞)置于在37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养，其中，THP-1细胞采用含10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗、0.5％β-巯基乙醇的PRMI1640培养基，Daudi细胞采用含10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗的PRMI1640培养基。

(3)取对数生长期细胞接种于96孔板中，THP-1细胞为每孔1×10⁴个，Daudi细胞为每孔2×10⁴个，每组设置3-5个复孔，加入不同梯度浓度的BH3多肽模拟物(P10、P11)后孵育48小时；

(4)每孔加入10μL CCK8试剂，混匀后在37℃、5％CO₂的培养箱中继续孵育2小时，取样振摇1分钟后再使用Molecular Devices Spectramax-i3x多功能酶标仪在450nM波长处测定吸光度值(A)，然后计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100％。

(5)使用GraphPad8.0软件绘制细胞存活率曲线，并通过非线性拟合模式计算出药物的半数生长抑制浓度，即IC₅₀值。

如图1所示，在THP-1细胞和Daudi细胞中，BH3及其多肽模拟物均表现出较好的抗肿瘤活性，且呈现一定的浓度依赖性，但非天然氨基酸突变体P11相比天然BH3序列(P10)具有更高的抑制肿瘤活性。

实施例5BH3多肽模拟物与其他药物协同抑制肿瘤细胞的增殖

(1)采用含10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗、0.5％β-巯基乙醇的PRMI1640培养基，将THP-1细胞置于37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养。

(2)取对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔1×10⁴个，每组设置3-5个复孔，加入固定浓度(3μM)的Venetoclax(ABT-199)和不同浓度(0～6μM)的BH3多肽模拟物(P11)后孵育48小时；

(3)每孔加入10μL CCK8试剂，混匀后在37℃、5％CO₂的培养箱中继续孵育2小时，取样振摇1分钟后使用Molecular Devices Spectramax-i3x多功能酶标仪在450nM波长处测定吸光度值(A)，然后计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100％，最后使用Excel软件绘制细胞存活率直方图。

如图2所示，ABT-199⁺表示BH3多肽模拟物与ABT-199联合用药，ABT-199^-表示BH3多肽模拟物单独用药。结果显示，单独予以BH3多肽模拟物处理时，随浓度增加THP-1细胞活力下降；而同时予以固定浓度的ABT-199和不同浓度的BH3多肽模拟物处理时，ABT-199与BH3多肽模拟物显示出协同作用，联合用药比单独使用BH3多肽模拟物对肿瘤的抑制效果更好，因此本发明提供的BH3多肽模拟物可单独用药或与其他化疗药物联用。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中山大学

<120> MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> P1(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Met Arg Pro Glu Ile Trp Ile Ala Gln Glu Leu Arg Arg Ile Gly

1 5 10 15

Asp Glu Phe Asn Ala Tyr Tyr Ala Arg Arg

20 25

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> P2(Artificial Sequence)

<400> 2

Pro Glu Trp Ala Gln Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Asn Ala Tyr

1 5 10 15

Tyr Ala

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> P3(Artificial Sequence)

<400> 3

Pro Trp Ile Ala Gln Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Asn Ala Tyr

1 5 10 15

Tyr Ala

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> P4(Artificial Sequence)

<400> 4

Pro Trp Ala Gln Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Asn Ala Tyr Tyr

1 5 10 15

Ala

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> P5(Artificial Sequence)

<400> 5

Pro Glu Ile Trp Ile Ala Gln Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Phe

1 5 10 15

Asn Ala Tyr Tyr Ala

20

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> P6(Artificial Sequence)

<400> 6

Pro Glu Ile Trp Ile Ala Gln Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Asn

1 5 10 15

Ala Tyr Tyr Ala

20

<210> 7

<211> 19

<212> PRT

<213> P7(Artificial Sequence)

<400> 7

Pro Glu Ile Trp Ala Gln Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Asn Ala

1 5 10 15

Tyr Tyr Ala

<210> 8

<211> 21

<212> PRT

<213> P8(Artificial Sequence)

<400> 8

Arg Pro Glu Trp Ala Gln Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Asn Ala

1 5 10 15

Tyr Tyr Ala Arg Arg

20

<210> 9

<211> 23

<212> PRT

<213> P9(Artificial Sequence)

<400> 9

Asp Met Arg Pro Glu Trp Ala Gln Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu

1 5 10 15

Asn Ala Tyr Tyr Ala Arg Arg

20

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Tat穿膜肽(Artificial Sequence)

<400> 10

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5

Claims

1.一种MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物，其特征在于，所述BH3多肽模拟物的结构通式为R1-(X)3-R2-X4-R3，其中，R1、R2、R3代表一个或多个天然氨基酸残基，X代表一个天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基。

2.根据权利要求1所述的一种MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物，其特征在于，所述BH3多肽模拟物的结构通式为R1-X1-X2-X3-R2-X4-R3，其中R1、R2、R3、X的定义同实施例1。

3.根据权利要求1或2所述的一种MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物，其特征在于，所述R1选自Glu、Pro-Glu、Asp-Met-Arg-Pro-Glu，R2选自Ala-Gln-Glu-Leu-Arg-Arg-Ile-Gly-Asp-Glu，R3选自Asn-Ala-Tyr-Tyr-Ala、Asn-Ala-Tyr-Tyr-Ala-Arg-Arg，X1选自Ile、Omt，X2选自Trp，X3选自Ile、Chg，X4选自Phe、Phe(4-Me)。

4.根据权利要求3所述的一种MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物，其特征在于，所述BH3多肽模拟物为R1-Omt-Trp-Chg-R2-Phe(4-Me)-R3，其中R1、R2、R3的定义同实施例3。

5.权利要求1-3任一项所述的MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物在制备抗凋亡蛋白抑制剂中的应用。

6.权利要求1-3任一项所述的MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。

7.权利要求1-3任一项所述的MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物在制备抗肿瘤药物中的应用。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括恶性血液肿瘤、皮肤癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、鼻咽癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、宫颈癌或胰腺癌。

9.一种抑制肿瘤细胞增殖的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1-3任一项所述的MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物。

10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1-3任一项所述的MCL-1和BCL-XL蛋白双靶向BH3多肽模拟物及其他具有抗肿瘤活性的药物。