KR100976778B1 - 1-（2'-플루오로-베타-엘-아라비노푸라노실）티민의 황 유도체를 유효 활성 성분으로 하는 b형 간염 바이러스 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항바이러스 활성, 특히 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus; HBV) 에 대한 활성을 나타내는 하기 화학식 1로 표시되는 새로운 화합물인 1-(2'-플루오로-5'-디옥시-5'-치오-베타-엘-아라비노푸라노실)티민과 하기 화학식 2로 표시되는 1-(2'-플루오로-5'-디옥시-5'-아세틸치오-베타-엘-아라비노푸라노실)티민 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

Description

1-（2'-플루오로-베타-엘-아라비노푸라노실）티민의 황 유도체를 유효 활성 성분으로 하는 B형 간염 바이러스 치료제{THERAPEUTIC AGENT FOR HEPATITIS B VIRUS USING SULFUR DERIVATIVES OF 1-(2'-FLUORO-β-L-ARABINOFURANOSYL)THYMINE}

본 발명은 화학식 [3]의 5-히드록시기에 적절한 황을 도입함으로써 우수한 항바이러스 활성을 나타내는 화학식 1과 2로 표시되는 L-FMAU의 황 유도체에 관한 것이다.

화학식 [3]으로 표시되는 1-(2'-플루오로-베타-엘-아라비노푸라노실)티민(이하 "L-FMAU"라 약칭한다)은 미국특허 제5,587,362호에 알려져 있다.

화학식 (1) 및 화학식 (2)의 L-FMAU의 황 유도체가 뉴클레오사이드 화합물의 일반적인 부작용인 신경독성을 감소시키고 항바이러스 효과를 증가시킴을 확인하고 안전성이 있는 항바이러스제를 제공하고자 하였다.

본 발명에 따른 L-FMAU의 황 유도체의 제조공정을 도시하면 다음과 같다.

특허(대한민국 특허공개번호 특제1999-0076091호)에 의해 제조된 화학식 [3]으로 표시되는 L-FMAU를 미쯔노부(mitsnobu) 반응을 통하여 5'위치를 선택적으로 아세틸티오기를 도입하여 화학식 [2]로 표시되는 1-(2'-플루오로-5'-디옥시-5'-아세틸치오-베타-엘-아라비노푸라노실)티민을 제조하였다(3'위치가 치환된 황 유도체는 입체장애로 인하여 수율이 좋지 않았음). 상기 반응식에서, R₁은 페닐, 페녹시 등이고 R₂는 에틸, 이소프로필 등이다. 이때 사용되는 용매는 THF(테트라히드로푸란), 벤젠, 디에틸에테르, 디옥산, HMPT(헥사메틸포스포러스 트리아미드), 피리딘, N,N-디메틸 포름아미드 등이며 반응온도는 -10℃∼상온 이다.

상기 미쯔노부(mitsnobu) 반응은 트리페닐포스핀(또는 트리페닐포스파이트)과 에틸(또는 이소프로필)아조디카르복실레이트를 이용하여 카르복실기(본 특허에서는 카르복시티오기)를 활성화 함으로써 히드록시기와의 반응성을 증가시켜 높은 수율로의 에스테르화 반응을 수행하는 반응이다.

화학식 [2]의 화합물의 아세틸기를 제거하면 화학식 [1]로 표시되는 1-(2'- 플루오로-5'-디옥시-5'-치오-베타-엘-아라비노푸라노실)티민을 합성할 수 있다. 이때 탈아세틸 시약으로 소듐 에톡사이드, 소듐 메톡사이드, 디에틸아민, 디이소프로필아민, 암모니아를 사용할 수 있으며 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올등이며 반응온도는 0∼60℃가 적당하다.

실시예 1

1-(2'-플루오로-5'-디옥시-5'-아세틸치오-베타-엘-아라비노푸라노실)티민(화학식 2)의 합성

트리페닐포스핀 5.8g을 무수 테트라히드로푸란 100ml에 녹인 후 0℃로 냉각하였다. DIAD(diisopropyl azodicarboxylate) 8ml를 10분 동안 천천히 가하였다. 30분 후 L-FMAU 5.2g을 무수 THF 20ml에 녹인 용액과 티올아세트산 3ml를 무수 THF 20ml에 녹인 용액을 차례대로 가하였다. 상온으로 방치 후 4시간 동안 교반하였다. 유기용매를 증발시키고 초산에틸 : n-헥산 = 1 : 1 로 크로마토그래피하여 하얀색의 고체인1-(2'-플루오로-5'-디옥시-5'-아세틸치오-베타-엘-아라비노푸라노실)티민 3.3g을 얻었다.

수율 : 52%

m.p. : 181∼184℃

¹H-NMR(DMSO-d₆) : 7.47(s, 1H), 6.14(dd, 1H), 5.97(d, 1H), 5.09(m, 1H), 4.23(m, 1H), 3.85(m, 1H), 2.85(d, 2H), 2.67(s, 1H), 1.80(s, 3H)

실시예 2

1-(2'-플루오로-5'-디옥시-5'-치오-베타-엘-아라비노푸라노실)티민(화학식 1)의 합성

상기 화학식 2의 화합물 1.1g을 메탄올 50ml에 현탁시킨 후 28% NaOCH₃/CH₃OH 10ml를 가한 후 24시간 상온에서 교반하였다. Dowex-50H(Dow Chemical Co.)를 가하여 pH를 2∼3으로 맞춘 후 여과하였다. 여액을 증류한 후 에탄올로 재결정하여 하얀색의 고체인 1-(2'-플루오로-5'-디옥시-5'-치오-베타-엘-아라비노푸라노실)티민 700mg을 얻었다.

수율 : 73.3%

m.p. : 208℃

¹H-NMR(DMSO-d₆) : 11.47(s, 1H), 7.41(s, 1H), 6.16(dd, 1H, J=4.0Hz, 16.0Hz), 6.05(d, 1H, J=4.0Hz), 5.03(ddd, 1H, J=2.4, 3.6, 52.4Hz), 4.20∼4.27(m, 1H), 4.04∼4.09(m, 1H), 3.29(s, 1H), 3.12∼3.22(m, 2H), 1.79(s, 3H)

하기 실험예 1에서 보는 바와같이 본발명의 화학식 1 화합물은 높은 항 바이러스 활성에도 불구하고, 세포독성을 거의 나타내지 않으므로 항 바이러스제를 위한 유효성분으로 사용할 수 있는 점이 유리하다.

실험예 1 L-FMAU 황 유도체(화학식 1 화합물)의 세포독성 실험

Mosmann(1983)의 방법에 의하여, 각 웰에 예비실험에서 결정된 1 ×10⁵ 개의 세포를 1ml의 배지에 부유시켜 24 플레이트 웰에 접종하여 하루 동안 부착시켰다. 기존의 배지를 모두 제거한 후, L-FMAU 황 유도체를 RPMI-1640배지로 희석하여 180, 360, 720, 1440uM의 4가지 농도로 만든 후 (대조군은 약물이 없음) 1ml 씩 각 웰에 넣어주었다. HepG2 2.2.15와 L-FMAU 황 유도체 들어있는 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 기존의 배지를 모두 제거한 후 새 RPMI 1640배지를 넣어주고 100ul 의 MTT 용액을 모든 웰에 가해준 후 37℃에서 4시간 더 배양하였다. 배양 후 배지를 피펫으로 모두 빨아내었다. 각웰에 DMSO 500ul 씩을 가한 후 결정이 녹을 때까지 10분간 가볍게 진탕해 준 후 마이클로플레이트 리더 (Elisa 540nm)에서 흡광도를 측정하였다. 각 웰의 평균 OD₅₄₀ 값을 구하여 대조군의 평균 OD₅₄₀ 값에 대한 백분율 값을 산출하였다. 결과는 다음 표 1과 같다.

L-FMAU 황 유도체(화학식 1 화합물)의 세포독성실험결과

L-FMAU 황유도체 농도(μM)	HepG2 2.2.15 세포
	흡광도 값 평균	% of control
Control	2.343	100
180	2.350	100.3
360	1.859	79.3
720	1.106	47.2
1440	0.197	8.4

상기 표의 결과에서 보듯이 HepG2 2.2.15 세포를 이용한 상기실험에서 화학식 1 화합물은 180uM/㎖까지 세포독성을 나타내지 않았다.

L-FMAU 황 유도체는 HBV RNA에서 (-)strand DNA로 복제되는 과정과 (-)strand DNA에서 (+)strand DNA로의 복제과정을 경쟁적으로 방해하며 virus DNA 복 제과정에서 HBV-DNA chain형성 과정의 여러부위에 들어가 체인 종결자로서 작용하고 HBV 전사체(mRNA)로부터 생성된 HBsAg 생성을 억제하여 DNA 바이러스와 관련된 질병 특히 B형 간염 바이러스(HBV)의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

또한, L-FMAU 황 유도체는 HBsAg 발생억제능력을 나타낸다. HBV 유전자를 인간의 간암 세포주 HepG2 에 도입(stable transfection)하여 HBV가 증식되는 HepG2 2.2.15 세포를 이용한 HBsAg 생성능 억제 시험에서 양성 대조물질로 사용된 잘시타빈(ddC)이 10uM에서 25%의 억제효과만을 보인 반면에 화학식 1 화합물은 180uM에서 37%의 억제능을 보여 증식기의 HBsAg 및 HBV-DNA양성인 만성간염과 HBsAg 및 IgM anti-HBc가 양성인 급성간염에 탁월한 효능이 기대된다.

또한,L-FMAU 황 유도체는 HBsAg 억제능력을 통해 바이러스의 표적항원 즉 HBsAg 항원이 간세포에 표현되어 이 항원이 숙주(Host)의 항원과 함께 세포독성을 갖는 T 림프구를 끌어들이고 이 림프구들이 HBV에 감염된 간세포를 파괴시켜 염증과 섬유화를 일으키는 것을 억제함으로써 간염의 진행을 억제할 뿐만 아니라 간경변의 발생과 간경변에 따른 식도정맥류 출혈, 간부전증, 간신증후군, 전신감염을 예방할 수 있다.

항 DNA 바이러스제의 투약에 따른 효과는 질병의 증세의 정도에 따라 달라진다. 간염바이러스의 HBV DNA와 DNA 중합효소가 혈중에 나타나고 몇주 후 HBsAg 이 나타나는데 그 후 1∼6주 정도 지나면 신체적 증상이 나타나며 항체의 등장은 HBcAg 에 대한 항체가 가장 먼저 나타나고 신체면역반응으로 HBeAg이 사라지고 몇주 후부터 HBeAg에 대한 항체가 나타난다. 그 다음으로 HBsAg이 사라지고 HBsAg에 대한 항체가 검출될 때 간효소 수치(ALT)가 저하되기 시작하므로 L-FMAU 황 유도체의 장기간 투여는 HBsAg의 급격한 감소에 따라 ALT 수치를 감소시켜 간염, 지방간, 간경변증 또는 간암과 같은 간장질환을 억제할 수 있으며 부가적으로 나타날 수 있는 심장질환 및 근육질환을 예방할 수 있다.

본발명의 화학식 1 화합물은 DNA 바이러스의 종류에 관계없이 높은 항 바이러스활성을 가지고 있다. 그러나 그 활성의 정도는 대상 DNA 바이러스의 종류에 따라 상이하다. 예를 들면 상기 화학식 1 화합물은 간염 B형 바이러스(HBV)에 대하여 타입 2헤르페스(HSV-2), 타입 1헤르페스(HSV-1)또는 엡스테인 바(EBV), 바리셀라 조스터(VZV)에 대한 것보다 높은 항바이러스 활성을 나타낸다.

상기 기술한 바와 같이 본원발명이 목표로 하는 전형적인 DNA 바이러스는 B형 간염 바이러스이다. 그러나, 감염후에 더욱 피리미딘 뉴클레오사이드 키나아제를 유도하는 DNA 바이러스에 대하여, 본원 발명의 화합물은 항바이러스 활성을 충분히 발휘할 것으로 기대된다. 왜냐하면 그것은 숙주세포내의 효소 및 키나아제에 의하여 특히 바이러스 DNA 합성을 방해하는 뉴클레오사이드 삼인산염 형태로 변환될 수 있기 때문이다.

실험예 2 ELISA Test에 의한 화학식 1 화합물의 HBsAg 생성저해율 실험

HepG2 2.2.15세포를 24 웰 세포배양판에 1x10⁵ cells/well의 농도로 분주하여 세포가 완전히 자랄 때까지 24시간 배양하였다. L-FMAU 황유도체의 처치는 37℃로 예열한 세포 배양액 (2% FBS)에 최종농도가 11.25, 22.5, 45, 90, 180uM이 되도 록 하였다. 대조군인 ddC(Zalcitabine)는 10uM이 되도록 처치하였다.

각 시료가 포함된 세포 배양액 1ml을 매일 교환하면서 세포배양액의 수집은 3일마다 하여 8일간 처치하였다. 8일째 세포배양액을 수거하여 효소 면역분석 키트 (Murex HBsAg Version 3, Abbott, U.S.A)를 이용하여 HBsAg 양을 측정하였다. 결과는 다음 표 2와 같다.

L-FMAU 황 유도체(화학식 1 화합물)의 HBsAg 의 생성저해율

L-FMAU 황유도체 농도(μM)	HepG2 2.2.15 세포
	HBsAg 의 생성저해율 (%)
11.25	10.9
22.5	15.1
45	13
90	17.7
180	37

양성대조물인 ddC는 10uM에서 25%의 HBs 항원생성 억제도를 나타내었고 L-FMAU 황유도체는 11.25uM에서 10.9% 감소시켰으며, 고농도인 180uM에서는 L-FMAU 황유도체는 37%정도의 HBsAg의 생성을 억제하는 것으로 나타났다.

따라서 본원발명의 화학식 1 화합물은 B형 간염 바이러스(HBV)의 예방 및 치료제로 사용될수 있다.

투여경로로는 경구 비경구 모두 가능하나 경구투여가 보다 바람직하며, 통상의 경구, 비경구제제화 방법에 의해 제공될 수 있다.

B형 간염 바이러스(HBV) 치료를 위한 화학식 1 화합물의 1회 투여량은 1 mg/60kg ~ 100 mg/60kg 이며, 1일 1 내지 2 회 투여한다.

화학식 1로 표시되는 새로운 화합물인 1-(2'-플루오로-5'-디옥시-5'-치오-베타-엘-아라비노푸라노실)티민과 화학식 2로 표시되는 1-(2'-플루오로-5'-디옥시-5'-아세틸치오-베타-엘-아라비노푸라노실)티민은 항바이러스 활성, 특히 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus; HBV)에 대한 우수한 활성을 나타내며, 신경독성이 적은 안전한 항바이러스제 이다.

Claims (6)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 하기 화학식 1의 화합물을 유효 활성 성분으로 하는 B형 간염 바이러스 치료제.

   [화학식 1]