CN111647166A - 可降解超支化聚合物 - Google Patents

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Abstract

可降解超支化聚合物。提供了一种用于将蛋白质递送到细胞内的超支化聚合物，所述超支化聚合物包括由下式(1)表示的单体形成的单元。
Figure DDA0002560015900000011

Description

可降解超支化聚合物
技术领域
本申请涉及可降解超支化聚合物，更具体涉及用于蛋白质/多肽的胞内递送的可降解超支化聚合物。
背景技术
蛋白质治疗是近些年来被广泛发展的用于治疗代谢疾病、免疫疾病和癌症的有效方法。由于蛋白质分子量大，亲水性强，使得蛋白质难以通过细胞膜进入细胞。因而当前临床上基于蛋白质的药物主要针对细胞外靶点。将蛋白质高效、安全地递送到细胞内可以快速、特异性的发挥蛋白质的功能，并减少对细胞的毒副作用。因此，开发高效、安全的蛋白质胞内递送载体具有重要的研究意义及应用价值。
蛋白质的胞内递送对载体材料的设计需满足如下几个问题：1)载体材料与蛋白质的有效结合，形成稳定的复合物；2)将蛋白质高效地递送至细胞内；3)快速地溶酶体逃逸，并释放出活性蛋白；4)材料的自降解减少对细胞的毒副作用；以及5)对不同分子量和表面电荷的蛋白质具有通用性。将蛋白质共价结合在载体材料上可以有效地将蛋白质递送至细胞内，但是有机化学修饰损害了天然蛋白质的活性，并且难以在细胞内快速地释放。高分子材料与蛋白质的自组装可以借助多种相互作用机制形成稳定的复合物，例如胍基修饰的高分子聚合物利用静电相互作用和氢键作用，氟化修饰的阳离子高分子聚合物利用静电相互作用和氟化作用，苯硼酸修饰的高分子聚合物利用静电相互作用，硼氮配位作用和阳离子-π相互作用，羧基修饰的聚氨酯利用静电相互作用和疏水相互作用。尽管这些设计可以有效地递送蛋白质，但是载体材料仍然无法同时满足以上五点要求。
本领域急需一种新型的高分子载体，其能克服上述问题，用于高效、安全地蛋白质胞内递送。
发明内容
本申请的目的在于提供了一种新型的高分子载体，其能克服上述问题，用于高效、安全地蛋白质胞内递送，同时能够在细胞内自降解，并对于大部分蛋白质具有通用性。
本申请一方面提供了一种用于将蛋白质递送到细胞内的超支化聚合物，所述超支化聚合物包括由下式(1)表示的单体形成的单元：
Figure BDA0002560015880000021
式中：
R1-R8、R1'、R4'、R7'和R8'各自独立地表示氢、卤素、取代或未取代的C1-C30烷基、取代或未取代的C1-C30烷氧基、取代或未取代的C3-C30环烷基、硝基或氰基，
R5数目可以为1-3，R6的数目可以为1-4，当R5和/或R6的个数大于等于2时，两个R5或两个R6可以相互连接形成脂环或芳环，
L1、L2和L3各自独立地表示二价连接基团，
p表示0或1，当p表示0时，L1、L2和L3共同连接到同一个碳原子上。
本申请还提供了本申请所述的超支化聚合物与蛋白质/多肽形成的纳米复合物。
本申请还有一个方面提供了本申请所述的超支化聚合物在制备蛋白质载体中的应用。
本申请还有一个方面提供了本申请所述的超支化聚合物在制备蛋白质药物中的应用。
附图说明
图1描述了实施例1中单体A2的核磁图谱
图2描述了比较例1中单体a2的核磁图谱。
图3描述了实施例2中聚合物A2-B3-C2-S-P的核磁图谱。
图4描述了超支化聚合物A2-B3-C2-S-P与BSA复合物(质量比5/1)的粒径，以及A2-B3-C2-S-P与不同蛋白/多肽复合物(质量比5/1)的粒径和电势图谱。
图5描述了超支化聚合物A2-B3-C2-S-P及PULSin递送不同浓度的FITC-BSA在HeLa细胞上的细胞摄取水平图。
图6描述了超支化聚合物A2-B3-C2-S-P与BSA的纳米复合物在H2O2条件下的蛋白释放图。
图7描述了超支化聚合物A2-B3-C2-S-P与BSA的纳米复合物在H2O2条件下的荧光共振能量转移实验图。
图8描述了超支化聚合物A2-B3-C2-S-P(RB标记)与BSA(FITC标记)的纳米复合物在细胞内释放蛋白的激光共聚焦图。
图9描述了相对于商业化试剂PULSin，超支化聚合物A2-B3-C2-S-P在HeLa细胞内递送不同蛋白/多肽的聚光共聚焦图。
图10描述了超支化聚合物A2-B3-C2-S-P及PULSin递送β-半乳糖苷酶(β-gal)的细胞原位染色图及定量分析图。
图11描述了超支化聚合物A2-B3-C2-S-P及PULSin递送辣根过氧化物酶(HRP)的染色图。
图12描述了超支化聚合物A2-B3-C2-S-P递送毒性蛋白皂草素在不同肿瘤细胞系上的毒性测试图。
图13描述了超支化聚合物A2-B3-C2-S-P递送毒性蛋白皂草素在小鼠4T1移植瘤模型上抑制肿瘤生长的情况图。
具体实施方式
在本文中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份都指相对于组合物的重量百分数或者重量份。
在本文中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
在本文中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
在本文中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
在本文中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100％。
在本文中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量份。
在本文中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。
在本文中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。
在本文中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。
如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。
如果没有特别指出，本文所述的百分数(包括重量百分数)的基准都是所述组合物的总重量。
本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60－120和80－110的范围，理解为60－110和80－120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1－3、1－4、1－5、2－3、2－4、和2－5。
在本说明书中，如果没有其它说明，术语“Cn-Cm”表示一种有机基团，所述n和m都是整数，其每个基团可包含n-m个碳原子。
在本说明书中，如果没有其它说明，术语“烷基”表示一种饱和烃基，其可以是直链或支链的，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、无机和正己基。
在本说明书中，如果没有其它说明，术语“环烷基”表示包含一个或多个环烷基环的饱和烃基，例如环戊基、环辛基和金刚烷基。
在本说明书中，如果没有其它说明，术语“烷氧基”表示由烷基加上氧原子构成的单价基团-RO(例如甲氧基)。
在本说明书中，如果没有其它说明，术语“芳基”表示包含一个或多个六元碳环的单价不饱和烃基，其中不饱和度可由三个共轭酸碱表示，所述芳基中的一个或多个环中的碳原子可被羟基、烷基、烯基、卤素、卤代烷基、单环芳基或氨基取代，所述芳基例如但不限于苯基、甲基苯基、甲氧基苯基、二甲基苯基、三甲基苯基、氯代苯基、三氯甲基苯基、三异丁基苯基、三苯乙烯基苯基和氨基苯基。
在本说明书中，如果没有其它说明，术语“芳烷基”表示一个或多个芳基取代的烷基，例如一个或多个(C6-C14)芳基取代的(C1-C18)烷基，比如苯基甲基、苯基乙基和三苯基甲基。
在本说明书中，如果没有其它说明，术语“烯基”表示包含一个或多个碳碳双键的不饱和直链或支链烃基，例如不饱和直链或支链(C2-C22)烃基，比如乙烯基、正丙烯基和异丙烯基。
在本说明书中，如果没有其它说明，术语“取代”或“取代的”或其类似表示基团包含一个或多个取代基，所述取代基包括但不限于氘、卤素、氰基、羧基、硝基、羟基、(C1-C30)烷基(优选(C1-C6)烷基)、(C2-C30)烯基(优选(C2-C6)烯基)、(C1-C30)烷氧基(优选(C1-C6)烷氧基)、(C1-C30)烷硫基(优选(C1-C6)烷硫基)、(C3-C30)环烷基(优选(C3-C6)环烷基)、(C6-C30)芳基(优选(C6-C14)芳基或C6芳基或苯基)或氨基。
本申请一方面提供了一种用于将蛋白质递送到细胞内的超支化聚合物，所述超支化聚合物包括由下式(1)表示的单体形成的单元：
Figure BDA0002560015880000061
式中：
R1-R8、R1'、R4'、R7'和R8'各自独立地表示氢、卤素、取代或未取代的C1-C30烷基、取代或未取代的C1-C30烷氧基、取代或未取代的C3-C30环烷基、硝基或氰基，
R5数目可以为1-3，R6的数目可以为1-4，当R5和/或R6的个数大于等于2时，两个R5或两个R6可以相互连接形成脂环或芳环，
L1、L2和L3各自独立地表示二价连接基团，
p表示0或1，当p表示0时，L1、L2和L3共同连接到同一个碳原子上。
在本说明书的一个实例中，R1-R8、R1'、R4'、R7'和R8'各自独立地表示取代或未取代的C1-C30烷基，优选取代或未取代的C1-C20烷基，更优选取代或未取代的C1-C15烷基，还要更优选取代或未取代的C1-C10烷基，最优选取代或未取代的C1-C6烷基。在本说明书的另一个实例中，R1-R8、R1'、R4'、R7'和R8'各自独立地表示甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
在本说明书的一个实例中，R1-R8、R1'、R4'、R7'和R8'各自独立地表示取代或未取代的C1-C30烷氧基，优选取代或未取代的C1-C20烷氧基，更优选取代或未取代的C1-C15烷氧基，还要更优选取代或未取代的C1-C10烷氧基，最优选取代或未取代的C1-C6烷氧基。在本说明书的另一个实例中，R1-R8、R1'、R4'、R7'和R8'各自独立地表示甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基。
在本说明书的一个实例中，R1-R8、R1'、R4'、R7'和R8'各自独立地表示取代或未取代的C3-C30环烷基，优选取代或未取代的C3-C20环烷基，更优选取代或未取代的C3-C10环烷基，最优选取代或未取代的C3-C6环烷基。在本说明书的另一个实例中，R1-R8、R1'、R4'、R7'和R8'各自独立地表示环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在本说明书的一个实例中，卤素表示F、Cl、Br或I。
在本说明书的一个实例中，R5和/或R6的个数大于等于2(例如2、3或4)，两个R5或两个R6相互连接形成芳环(例如苯环等)。
在本说明书的一个实例中，L1、L2和L3各自独立地表示有机二价连接基团，包括但不限于，单键、酰胺键、酯键、醚键、C1-C30二价烃基等；优选地，L1、L2和L3各自独立地表示-(CH2)n-、-R11-C(O)-O-、-R11-O-C(O)-、-R11-C(O)-NH-、-R11-NH-C(O)-、-R11-O-R11-、-Ar-O-R11-、-NH-C(O)-O-R11-Ar-R12-、-O-R11-Ar-R12-，其中n表示1-30的整数(优选1-20的整数，更优选1-15的整数，最优选1-8的整数)；R11表示-(CH2)m-(其中m表示0-30的整数，优选0-20的整数，更优选0-15的整数，最优选0-8的整数)；R12表示-O-C(O)-R13-或-NH-C(O)-O-R13-，其中R13表示-(CH2)t-(其中t表示0-30的整数，优选0-20的整数，更优选0-15的整数，最优选0-8的整数)；Ar表示取代或未取代基的C6-C30亚芳基(优选取代或未取代基的C6-C20亚芳基，更优选取代或未取代基的C6-C12亚芳基，最优选取代或未取代基的C6-C8亚芳基，包括但不限于取代或未取代基的亚苯基或取代或未取代基的亚萘基)。
在本说明书中，所述取代的基团中的取代基包括但不限于氘、卤素、氰基、羧基、硝基、羟基、(C1-C30)烷基(优选(C1-C6)烷基)、(C2-C30)烯基(优选(C2-C6)烯基)、(C1-C30)烷氧基(优选(C1-C6)烷氧基)、(C1-C30)烷硫基(优选(C1-C6)烷硫基)、(C3-C30)环烷基(优选(C3-C6)环烷基)、(C6-C30)芳基(优选(C6-C14)芳基或C6芳基或苯基)或氨基。在本说明书的另一个实例中，所述取代的基团中的取代基包括但不限于卤素、氰基、硝基、羟基、氨基、(C1-C6)烷氧基或优选(C1-C6)烷基。
在本说明书的一个优选实例中，所述式(1)表示的单体选自下述结构：
Figure BDA0002560015880000081
在本申请的一个实例中，以所述超支化聚合物的单体总摩尔数计，式(1)单体的含量为7摩尔％-35摩尔％，优选为10摩尔％-35摩尔％，更优选为15-35摩尔％，还要优选为20-35摩尔％，最优选为25-30摩尔％。
本申请所述的超支化聚合物进一步包括用于形成超支化骨架结构的单体形成的单元。在本申请的一个优选实例中，所述形成超支化骨架结构的单体为具有三个或更多个烯键式不饱和官能团的单体，优选具有3-10个(更优选3-8个，还要更优选3-6个，最优选3个)烯键式不饱和官能团的单体。在本申请另一个优选实例中，所述烯键式不饱和官能团包括但不限于乙烯基、烯丙基、丙烯酸基、苯乙烯基等。在本申请的一个优选实例中，所述形成超支化骨架结构的单体包括但不限于下式(2)表示的单体：
Figure BDA0002560015880000091
式中：R表示取代或未取代的C1-C30三价烷基、取代或未取代的C2-C30三价烯基、取代或未取代的C6-C30三价芳基。
在本说明书的一个实例中，R表示取代或未取代的C1-C30三价烷基，优选取代或未取代的C1-C20三价烷基，更优选取代或未取代的C1-C15三价烷基，还要更优选取代或未取代的C1-C10三价烷基，最优选取代或未取代的C1-C6三价烷基。
在本说明书的一个实例中，R表示取代或未取代的C2-C30三价烯基，优选取代或未取代的C2-C20三价烯基，更优选取代或未取代的C2-C15三价烯基，还要更优选取代或未取代的C2-C10三价烯基，最优选取代或未取代的C2-C6三价烯基。
在本说明书的一个实例中，R表示取代或未取代的C6-C30三价芳基，优选取代或未取代的C6-C20三价芳基，更优选取代或未取代的C6-C15三价芳基，还要更优选取代或未取代的C6-C10三价芳基，最优选取代或未取代的C6三价芳基。
在本说明书的一个实例中，所述形成超支化骨架结构的单体选自下述结构：
Figure BDA0002560015880000092
Figure BDA0002560015880000101
在本申请的一个实例中，以所述超支化聚合物的单体总摩尔数计，式(2)单体的含量为8摩尔％-35摩尔％，优选为10摩尔％-30摩尔％，更优选为10-25摩尔％，还要优选为10-20摩尔％，最优选为12-16摩尔％。
在本申请的一个实例中，所述超支化聚合物进一步包括伯胺单体形成的单元。所述伯胺单体包括但不限于下式(3)表示的单体：
Figure BDA0002560015880000102
式中：R'表示有机基团。
在本申请的一个实例中，所述R'表示下述结构：
Figure BDA0002560015880000103
Figure BDA0002560015880000111
式中：n、m、o、x、y和z各自表示1-20的整数，优选1-15的整数，更优选1-10的整数，还要优选1-8的整数，最优选1-6的整数。
在本申请的一个实例中，以所述超支化聚合物的单体总摩尔数计，式(3)单体的含量为40摩尔％-50摩尔％，优选为42摩尔％-50摩尔％，更优选为42-48摩尔％，还要优选为42-46摩尔％，最优选为43-45摩尔％。
为了提高超支化聚合物与蛋白的结合能力、穿透细胞膜的能力以及细胞内自降解的能力，本申请所述的超支化聚合物还可进一步包括末端修饰的二胺基单体单元以及末端修饰的苯硼酸单体单元。
在本申请的一个实例中，所述末端修饰的二胺基单体由下式(4)表示：
H2N-R"-NH2 (4)
式中：R"表示二价有机基团。
在本说明书的一个实例中，R"表示二价有机基团，包括但不限于，单键、酰胺键、酯键、醚键、C1-C30二价烃基等。在本说明书的另一个实例中，所述R"表示下述结构的单体：
Figure BDA0002560015880000112
Figure BDA0002560015880000121
式中：m、x和y各自表示1-20的整数，优选1-15的整数，更优选1-10的整数，还要优选1-8的整数，最优选1-6的整数。
在本申请的一个实例中，以所述超支化聚合物的单体总摩尔数计，式(1)单体的含量为5摩尔％-15摩尔％，优选为6摩尔％-13摩尔％，更优选为7-11摩尔％，还要优选为7-10摩尔％，最优选为8-10摩尔％。
在本申请的一个实例中，所述末端修饰的苯硼酸单体包括下式结构的苯硼酸及其衍生物：
Figure BDA0002560015880000122
式中：X表示卤代C1-C10烷基、醛基、酰卤基、酸酐基或酯基；R表示H、或者C1-C10烷基或含氮、氧、硫或卤素的取代C1-C10烷基。
在本申请的另一个实例中，所述末端修饰的苯硼酸单体包括下述结构：
Figure BDA0002560015880000123
在本申请的一个实例中，以所述超支化聚合物的单体总摩尔数计，式(1)单体的含量为1摩尔％-10摩尔％，优选为2摩尔％-8摩尔％，更优选为3-7摩尔％，还要优选为4-6摩尔％，最优选为4-5摩尔％。
本申请另一方面提供了制备本申请所述超支化聚合物的方法，所述方法包括以下步骤：将上述式(1)表示的单体、上述式(2)表示的单体以及任选的式(3)表示的单体通过迈克尔加成反应进行聚合，得到超支化聚合物。
在本申请的一个实施方式中，所述方法还包括：中上述通过迈克尔加成反应得到的超支化聚合物中加入末端修饰的二胺基单体和/或末端修饰的苯硼酸单体，进行末端修饰。
在本申请的一个实例中，本申请的示例性反应流程如下：
Figure BDA0002560015880000141
X＝1-20，Y＝1-20，Z＝1-20。优选地，X、Y和Z各自独立地表示1-15，2-15，3-15，4-15，5-10。更优选地，X、Y和Z各自独立地表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
本发明方案中，聚合物A2-B3-C2-S-P可以调节单体A2，单体B3，单体C2的比例得到线性和不同支化度的聚合物，其中单体A2与单体B3的摩尔比优选1：0.25到1：4之间，更优选1：0.25到1：1之间。单体S与单体P的摩尔比优选1：0.25到1：2之间，更优选1：0.25到1：1之间。
本申请还公开了一种本申请所述聚合物与蛋白质/多肽形成的纳米复合物及其制备方法。将本申请所述聚合物和蛋白质/多肽分别溶于醋酸钠缓冲液中，将上述聚合物溶液与蛋白质/多肽溶液混合得到纳米复合物。
在本申请所述的一个实例中，所述聚合物与蛋白质的质量比为(1-40)：1，优选的质量比为(3-10)：1，更有选的质量比为5：1。
本申请还公开了上述超支化聚合物在制备蛋白质载体中的应用。
本申请进一步公开了上述超支化聚合物在制备蛋白质药物中的应用。
在本申请中，所述蛋白质、蛋白或多肽可以是分子量从4kDa到430kDa，等电点从4.3-10.3的蛋白质或多肽，举例包括，红色荧光蛋白，绿色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，血清蛋白，辣根过氧化物酶，皂草素，β-半乳糖苷酶，核糖核酸酶A，细胞色素C，凋亡肽，晚期糖基化终产物受体结合肽。
本申请的优势在于，该超支化聚合物主链引入ROS可降解的苯硼酸结构，既可以增加聚合物与蛋白质的相互作用，形成稳定的纳米复合物，也可以在ROS环境下降解释放出活性蛋白质，并且降解的材料减少了对细胞的毒副作用。本发明中的聚合物同时还具有如下优点：1)依赖超支化聚合物特有的结构，在细胞内实现快速的溶酶体逃逸；2)可以递送不同分子量和不同表面电荷的蛋白质，具有蛋白质递送的通用性，并且保持蛋白活性。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
(1)将2-羟基-5-甲基间苯二甲醇(10g，57.7mmol)和咪唑(8.9g，130.7mmol)溶于干燥的二甲基甲酰胺(40mL)中，搅拌冷却至0℃。将叔丁基二甲基氯硅烷(19.7g，126.9mmol)溶于二甲基甲酰胺(40mL)中，并逐渐滴加到上述溶液中。室温下反应2小时后用乙醚稀释，用去离子水洗三次。将所得的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸后得到的粗产品经过硅胶柱(流动相为正己烷/乙酸乙酯＝95/5的混合溶剂)提纯后得到化合物1：
Figure BDA0002560015880000161
(2)将化合物1(1878mg，4.72mmol)溶于干燥的二甲基甲酰胺(10mL)中，在冰水浴中搅拌冷却至0℃。将碳酸钾(784mg，5.66mmol)加入到上述溶液中，并在0℃条件下搅拌10分钟。将4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(1476mg，4.72mmol)加入到上述溶液中。室温反应过夜后用乙醚稀释，分别用饱和氯化铵和饱和氯化钠洗三次。将所得的有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸后得到的粗产品经过硅胶柱(流动相为正己烷/乙酸乙酯＝95/5的混合溶剂)提纯后得到化合物2：
Figure BDA0002560015880000162
(3)将化合物2(780mg，1.28mmol)溶于甲醇(5mL)中，加入对甲苯磺酸(48.8mg，0.24mmol)。溶液在室温条件下反应1小时，旋蒸得到的粗产品经过硅胶柱(流动相为正己烷/乙酸乙酯＝50/50的混合溶剂)提纯后得到化合物3：
Figure BDA0002560015880000163
(4)将化合物3(400mg，1.04mmol)溶于干燥的四氢呋喃(50mL)溶液中，在冰水浴中搅拌冷却至0℃。在氮气保护下加入干燥的三乙胺(433μL，3.12mmol)溶液，并在0℃条件下搅拌10分钟。将丙烯酰氯(254μL，3.12mmol)溶于干燥的四氢呋喃(20mL)中，在氮气保护下逐渐滴加到上述溶液中。滴加完成后，溶液在室温条件下反应12小时，过滤除去副产物三乙胺盐。将四氢呋喃旋蒸除去，并加入二氯甲烷(70mL)，用饱和氯化钠溶液洗三次，将所得的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸后得到的粗产品经过硅胶柱(流动相为正己烷/乙酸乙酯＝50/50的混合溶剂)提纯后得到单体A2，氘代氯仿打核磁。具体参见图1。
比较例1
(1)将2-羟基-5-甲基间苯二甲醇(10g，57.7mmol)和无水碳酸钾(12g，86.8mmol)溶于干燥的丙酮(100mL)中，加入溴化苄(9.4g，55mmol)。反应混合物在75℃条件下回流12h。过滤除去副产物盐，旋干丙酮，向粗产物中加入二氯甲烷(70mL)，用15％的NaOH溶液和饱和氯化钠溶液洗三次，将所得的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸后得到化合物4：
Figure BDA0002560015880000171
(2)将化合物4(268.3mg，1.04mmol)溶于干燥的四氢呋喃(50mL)溶液中，在冰水浴中搅拌冷却至0℃。在氮气保护下加入干燥的三乙胺(433μL，3.12mmol)溶液，并在0℃条件下搅拌10分钟。将丙烯酰氯(254μL，3.12mmol)溶于干燥的四氢呋喃(20mL)中，在氮气保护下逐渐滴加到上述溶液中。滴加完成后，溶液在室温条件下反应12小时，过滤除去副产物三乙胺盐。将四氢呋喃旋蒸除去，并加入二氯甲烷(70mL)，用饱和氯化钠溶液洗三次，将所得的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸后得到的粗产品经过硅胶柱(流动相为正己烷/乙酸乙酯＝50/50的混合溶剂)提纯后得到单体a2，氘代氯仿打核磁。具体参见图2。
实施例2
将实施例1所得单体A2与单体B3(购自于阿拉丁试剂)溶于干燥的二甲基亚砜溶液中，其中单体A2与单体B3的摩尔比为1：0.5，加入单体C2(购自于阿拉丁试剂)，保证丙烯酸酯/氨基的摩尔比为2.2：1，最终三个单体的总浓度为150mg/mL。溶液在90℃条件下反应过夜。将溶液冷却至室温，加入含有单体S(购自于阿拉丁试剂)的二甲基亚砜溶液，使得单体S的最终浓度为0.2mol/L。溶液在室温下搅拌2小时后，用无水乙醚洗三次，真空抽干得到超支化聚合物A2-B3-C2-S。将超支化聚合物A2-B3-C2-S溶于干燥的二甲基亚砜溶液中，加入单体P(购自于阿拉丁试剂)，溶液在80℃条件下反应过夜。用无水乙醚洗三次，真空抽干得到超支化聚合物A2-B3-C2-S-P，氘代二甲基亚砜打核磁。具体见图3。形成所述超支化聚合物的各单体的结构式和摩尔百分比如下：
Figure BDA0002560015880000181
(B3，占14摩尔％)
Figure BDA0002560015880000182
(C2，占44.7摩尔％)
Figure BDA0002560015880000183
(S，占8.9摩尔％)
Figure BDA0002560015880000184
(P，占4.5％)，
A2占27.9摩尔％
实施例3
将实施例2所得A2-B3-C2-S-P聚合物(50μg)与蛋白质(10μg,具体见附图4)分别溶于25mM的醋酸钠缓冲液(pH 5.0)中,然后等体积混合，并在室温下孵育10分钟得到纳米复合物。将纳米复合物按照1：5的比例稀释于150mM的磷酸缓冲液(pH 7.4)中，通过动态光散射仪测定纳米复合物的粒径和电势。具体参见图4。
将HeLa细胞以每孔10×104个接种到12孔板内，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后将培养基替换成无FBS的DMEM，将A2-B3-C2-S-P或商业化产品PULsin与蛋白BSA的纳米复合物(质量比为5/1)按照每孔不同的蛋白浓度加入到孔中，孵育4小时。用冷的含20U/mL肝素钠的PBS溶液洗三次，最后通过流式细胞仪分析细胞的摄取情况。具体参见图5。
实施例4
根据ROS的响应特性测定纳米复合物的蛋白释放。按照实施例3中的方法制备纳米复合物，向纳米复合物溶液中加入H2O2使得最终浓度为1mM或5mM。置于37℃摇床中，在间隔时间段内，离心，取100μL上清液，在485nm的激发波长下测量525nm处的荧光强度。具体参见图6。
通过荧光共振能量转移(FRET)探究纳米复合物的ROS响应特性。将超支化聚合物A2-B3-C2-S-P和a2-B3-C2-S-P用罗丹明B异硫氰酸酯标记，BSA用FITC标记，分别制备成纳米复合物(质量比为5/1)。在485nm的激发波长下测量525和580nm处的荧光强度。并进一步地在纳米复合物的溶液中加入H2O2(5mM)。置于37℃摇床中孵育3h。在485nm的激发波长下测量525和580nm处的荧光强度。具体参见图7。
进一步地观察纳米复合物在细胞内的蛋白释放。将HeLa细胞以每孔4×104个接种到24孔板内，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后将培养基替换成无FBS的DMEM，将RB标记的A2-B3-C2-S-P和a2-B3-C2-S-P分别与FITC标记的BSA制备的纳米复合物(质量比为5/1)按照每孔1μg/mL的蛋白浓度加入到孔中，孵育4小时。用冷的含20U/mL肝素钠的PBS溶液洗三次，Hoechst 33342(5μg/mL)染色20分钟，激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞内的荧光分布。具体参见图8。
实施例5
超支化聚合物递送不同分子量，不同表面电荷的蛋白质/多肽。用FITC标记不同分子量，不同表面电荷的蛋白质/多肽，制备纳米复合物(质量比为5/1，蛋白质的分子量和等电点具体参见图9)。将HeLa细胞以每孔4×104个接种到24孔板内，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后将培养基替换成无FBS的DMEM，将A2-B3-C2-S-P与蛋白的纳米复合物(质量比为5/1)按照每孔1μg/mL的蛋白浓度加入到孔中，孵育4小时。用冷的含20U/mL肝素钠的PBS溶液洗三次，Hoechst 33342(5μg/mL)染色20分钟，激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞内的荧光分布。具体参见图9。
检测细胞内β-gal的酶活性。将HeLa细胞以每孔4×104个接种到24孔板内，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后将培养基替换成无FBS的DMEM，将A2-B3-C2-S-P与β-gal的纳米复合物(质量比为5/1)按照每孔1μg/mL的蛋白浓度加入到孔中，孵育4小时。用PBS洗三次，加入细胞固定液，室温固定10分钟。移除固定液，PBS洗三次，加入含有X-gal(0.1mg/mL)的底物染色液。将细胞板放置于不含CO2的37℃培养箱中过夜。之后移除染色液，PBS洗三次。用光学显微镜观察细胞的染色。进一步地使用邻硝基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)对酶的活性定量分析。β-gal胞内递送实验处理后，PBS洗三次，加入200μL裂解液裂解细胞，取50μL裂解液加入50μL含有ONPG的酶活检测液，37℃放置1h，之后加入150μLNaHCO3(1M)终止反应，将溶液转移至96孔板中检测420nm的吸光度。以等浓度未处理的β-gal的酶活作为阳性对照，吸光度定义为100％。具体参见图10。
HRP的胞内递送。将HeLa细胞以每孔4×104个接种到24孔板内，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后将培养基替换成无FBS的DMEM，将A2-B3-C2-S-P与HRP的纳米复合物(质量比为5/1)按照每孔1μg/mL的蛋白浓度加入到孔中，孵育4小时。PBS洗6次，加入四甲基联苯胺(TMB，10μg/mL)溶液和H2O2(3mM)溶液，室温孵育10分钟，观察各孔的染色情况。具体参见图11。
毒性蛋白的胞内递送。选取皂青素作为模型蛋白检测胞内的递送效率及生物学功能。将HeLa细胞以每孔6×103个接种到96孔板内，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。将A2-B3-C2-S-P与皂青素的纳米复合物(质量比为5/1)按照每孔1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL，0.125μg/mL，0.0625μg/mL，0.03125μg/mL的蛋白浓度加入到孔中，继续培养48h。用MTT测定法测定细胞的活力，以无任何处理的细胞作为参照，结果表示为对照细胞的百分比。具体参见图12。
实施例6
将生长良好的乳腺癌细胞(4T1)接种到BALB/c(6-8周)小鼠皮下，建立乳腺癌移植瘤模型。当肿瘤体积达到约60mm3的时候，随机将小鼠分为四组，每组10只，分别为(1)PBS组，(2)A2-B3-C2-S-P/BSA组，(3)皂草素(Saporin)组，(4)A2-B3-C2-S-P/皂草素组。每组小鼠瘤内接种30μL的PBS，A2-B3-C2-S-P/BSA，皂草素，或者A2-B3-C2-S-P/皂草素。其中皂青素和聚合物的剂量分别为300μg/kg和1.5mg/kg。分别在第1，3，5天给药。每隔一天测量小鼠肿瘤的体积和体重，同时检测小鼠的生存状况。当肿瘤体积达到1000mm3的时候默认为死亡。进一步地在第17天的时候取出肿瘤和小鼠的主要器官(心，肝，脾，肺，肾)做组织病理学分析。具体参见图13。

Claims (10)

1.一种用于将蛋白质递送到细胞内的超支化聚合物，所述超支化聚合物包括由下式(1)表示的单体形成的单元：
Figure FDA0002560015870000011
式中：
R1-R8、R1'、R4'、R7'和R8'各自独立地表示氢、卤素、取代或未取代的C1-C30烷基、取代或未取代的C1-C30烷氧基、取代或未取代的C3-C30环烷基、硝基或氰基，
R5数目可以为1-3，R6的数目可以为1-4，当R5和/或R6的个数大于等于2时，两个R5或两个R6可以相互连接形成脂环或芳环，
L1、L2和L3各自独立地表示二价连接基团，
p表示0或1，当p表示0时，L1、L2和L3共同连接到同一个碳原子上。
2.如权利要求1所述的超支化聚合物，其特征在于，R1-R8、R1'、R4'、R7'和R8'各自独立地表示取代或未取代的C1-C30烷基，优选取代或未取代的C1-C20烷基，更优选取代或未取代的C1-C15烷基，还要更优选取代或未取代的C1-C10烷基，最优选取代或未取代的C1-C6烷基，还要最优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基；
或者，R1-R8、R1'、R4'、R7'和R8'各自独立地表示取代或未取代的C1-C30烷氧基，优选取代或未取代的C1-C20烷氧基，更优选取代或未取代的C1-C15烷氧基，还要更优选取代或未取代的C1-C10烷氧基，最优选取代或未取代的C1-C6烷氧基，还要最优选甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基；
或者，R1-R8、R1'、R4'、R7'和R8'各自独立地表示取代或未取代的C3-C30环烷基，优选取代或未取代的C3-C20环烷基，更优选取代或未取代的C3-C10环烷基，最优选取代或未取代的C3-C6环烷基，还要最优选环丙基、环丁基、环戊基或环己基；
或者，卤素表示F、Cl、Br或I；
或者，R5和/或R6的个数大于等于2(例如2、3或4)，两个R5或两个R6相互连接形成芳环(例如苯环等)；
或者，L1、L2和L3各自独立地表示有机二价连接基团，包括但不限于，单键、酰胺键、酯键、醚键、C1-C30二价烃基等；优选地，L1、L2和L3各自独立地表示-(CH2)n-、-R11-C(O)-O-、-R11-O-C(O)-、-R11-C(O)-NH-、-R11-NH-C(O)-、-R11-O-R11-、-Ar-O-R11-、-NH-C(O)-O-R11-Ar-R12-、-O-R11-Ar-R12-，其中n表示1-30的整数(优选1-20的整数，更优选1-15的整数，最优选1-8的整数)；R11表示-(CH2)m-(其中m表示0-30的整数，优选0-20的整数，更优选0-15的整数，最优选0-8的整数)；R12表示-O-C(O)-R13-或-NH-C(O)-O-R13-，其中R13表示-(CH2)t-(其中t表示0-30的整数，优选0-20的整数，更优选0-15的整数，最优选0-8的整数)；Ar表示取代或未取代基的C6-C30亚芳基(优选取代或未取代基的C6-C20亚芳基，更优选取代或未取代基的C6-C12亚芳基，最优选取代或未取代基的C6-C8亚芳基，包括但不限于取代或未取代基的亚苯基或取代或未取代基的亚萘基)。
3.如权利要求1或2所述的超支化聚合物，其特征在于，所述取代的基团中的取代基包括但不限于氘、卤素、氰基、羧基、硝基、羟基、(C1-C30)烷基(优选(C1-C6)烷基)、(C2-C30)烯基(优选(C2-C6)烯基)、(C1-C30)烷氧基(优选(C1-C6)烷氧基)、(C1-C30)烷硫基(优选(C1-C6)烷硫基)、(C3-C30)环烷基(优选(C3-C6)环烷基)、(C6-C30)芳基(优选(C6-C14)芳基或C6芳基或苯基)或氨基。
4.如权利要求1所述的超支化聚合物，其特征在于，所述式(1)表示的单体选自下述结构：
Figure FDA0002560015870000031
5.如权利要求1所述的超支化聚合物，其特征在于，所述超支化聚合物进一步包括形成超支化骨架结构的单体形成的单元；优选地，所述形成超支化骨架结构的单体为具有三个或更多个烯键式不饱和官能团的单体，优选具有3-10个(更优选3-8个，还要更优选3-6个，最优选3个)烯键式不饱和官能团的单体；优选地，所述烯键式不饱和官能团包括但不限于乙烯基、烯丙基、丙烯酸基、苯乙烯基等；优选地，所述形成超支化骨架结构的单体包括但不限于下式(2)表示的单体：
Figure FDA0002560015870000041
式中：R表示取代或未取代的C1-C30三价烷基、取代或未取代的C2-C30三价烯基、取代或未取代的C6-C30三价芳基；
优选地，所述形成超支化骨架结构的单体选自下述结构：
Figure FDA0002560015870000042
6.如权利要求1所述的超支化聚合物，其特征在于，所述超支化聚合物进一步包括伯胺单体形成的单元；优选地，所述伯胺单体包括但不限于下式(3)表示的单体：
Figure FDA0002560015870000043
式中：R'表示有机基团；
优选地，所述R'表示下述结构：
Figure FDA0002560015870000051
式中：n、m、o、x、y和z各自表示1-20的整数，优选1-15的整数，更优选1-10的整数，还要优选1-8的整数，最优选1-6的整数。
7.如权利要求1所述的超支化聚合物，其特征在于，所述超支化聚合物还可进一步包括末端修饰的二胺基单体单元以及末端修饰的苯硼酸单体单元；
优选地，所述末端修饰的二胺基单体由下式(4)表示：
H2N-R"-NH2(4)
式中：R"表示二价有机基团。
优选地，式(4)表示的单体选自下述结构的单体：
Figure FDA0002560015870000052
Figure FDA0002560015870000061
式中：m、x和y各自表示1-20的整数，优选1-15的整数，更优选1-10的整数，还要优选1-8的整数，最优选1-6的整数；
优选地，所述末端修饰的苯硼酸单体包括下式结构的苯硼酸及其衍生物：
Figure FDA0002560015870000062
式中：X表示卤代C1-C10烷基、醛基、酰卤基、酸酐基或酯基；R表示H、或者C1-C10烷基或含氮、氧、硫或卤素的取代C1-C10烷基；
优选地，所述末端修饰的苯硼酸单体包括下述结构：
Figure FDA0002560015870000063
8.一种权利要求1-7中任一项所述的超支化聚合物与蛋白质/多肽形成的纳米复合物。
9.权利要求1-7中任一项所述超支化聚合物在制备蛋白质载体中的应用。
10.权利要求1-7中任一项所述超支化聚合物在制备蛋白质药物中的应用。
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