CN102441177A - 用于siRNA传递的纳米泡载体 - Google Patents

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金义光
杜丽娜
王双苗
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Abstract

本发明公开了一种纳米泡载体，可以在体外和体内传递siRNA，并且在携带siRNA的纳米泡经过部位或作用部位施加超声手段，可以促进siRNA的释放，并起到相应的药理作用。

Description

用于siRNA传递的纳米泡载体
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及用于siRNA传递的纳米泡载体。
背景技术
siRNA中文名称是小干扰脱氧核糖核酸，是基于基因沉默(RNAi)技术而设计的一种核酸活性成分。siRNA是人工合成的双链RNA，是一种小RNA分子(21-25核苷酸)，由Dicer(RNAaseIII家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。siRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。siRNA无论得到的方法如何，如化学合成、体外转录、用RNAaseIII消化长片断双链RNA制备siRNA、siRNA表达载体、病毒载体、siRNA表达框架，因为它们的分子结构相同，理化性质也一样，只是产品形式可能有所不同，即保存在什么溶液中。
siRNA自发现以来已获得大量关注，但一直没有作为新药上市，最重要的问题是siRNA作为核酸分子，很容易被体内核酸酶降解，并且siRNA从注射部位到达作用部位要经历很多过程途径，进入细胞后，还有从内涵体或溶酶体中逃逸，进入胞浆，才能发挥作用。siRNA的特殊性使其制剂研究非常困难。
发明内容
本发明人出乎意料地发现我们设计的一种纳米泡载体，可以在体外和体内传递siRNA，并且在携带siRNA的纳米泡经过部位或作用部位施加超声手段，可以促进siRNA的释放，并起到相应的药理作用。
本发明公开的用于siRNA传递的纳米泡载体，其特征是纳米泡由聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物和阳离子脂质构成外壳，内部充填气体或在正常体温下转化为气体的液体。
本发明中的siRNA根据所表达的功能特点而设计核苷酸序列，并通过生物技术公司合成得到。siRNA的功能包括各种疾病的治疗用途，例如各种病毒性肝炎、肿瘤、心血管疾病、免疫性疾病。
本发明中的聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物选自聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物，优选的是聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物。聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物中聚乳酸羟基乙酸嵌段的分子量范围是1000～20000，优选的是2000～10000，更优选的是3000～10000；聚乙二醇嵌段的分子量范围是500～10000，优选的是1000～5000，更优选的是1500～3000。聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物和聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物可以从市场上购买得到；或根据文献合成方法，也可以自行合成得到。
本发明中的阳离子脂质选自1，2-二油酰-3-三甲基胺基丙烷、双十八烷基二甲基溴化铵、双十烷基二甲基溴化铵、双十二烷基二甲基溴化铵、尿嘧啶脂质衍生物、1，4-二氢吡啶脂质衍生物、二甲基羟乙基胺丙胺碳酰胆固醇酯、3β-(N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)碳酰)胆固醇、O，O’-双十四酰-N-三甲基氨基乙酰二乙醇胺盐酸盐、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、苯扎氯胺、鱼精蛋白、硬脂胺、二油酰磷脂酰乙醇胺。这些阳离子脂质都可以从市场上得到。
本发明中的气体选自空气、、氮气、氧气、二氧化碳、全氟丙烷、全氟丁烷、六氟化硫。
本发明中的在正常体温下转化为气体的液体是全氟戊烷。全氟戊烷的沸点是29.5℃。
本发明公开的用于siRNA传递的纳米泡载体，其特征是纳米泡粒径范围是20～700纳米，优选的是50～500纳米，更优选的是50～300纳米，进一步优选的是50～200纳米。
由于siRNA的水溶性，siRNA无法包裹在纳米泡内部，而只能通过静电作用，与纳米泡外壳中的阳离子脂质发生相互作用而进行包裹。本发明基于siRNA和纳米泡的特点还专门设计了用于siRNA传递的纳米泡载体的制备方法如下：
(1)将聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物和阳离子脂质溶解在有机溶剂中；
(2)将含siRNA的水溶液在搅拌下加入上述溶液中；
(3)挥发或透析除去有机溶剂得到含siRNA的胶束溶液；
(4)在胶束溶液中加入气体或在正常体温下转化为气体的液体，并持续超声，形成纳米泡。
上述制备方法中，有机溶剂优选的是和水互溶的有机溶剂，选自乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氧六环、二甲基亚砜。加入的siRNA水溶液占分散介质的有机溶液体积的5～80％，优选的是10～50％。
附图说明
图1.ELISA检测HBsAg OD值
具体实施方式
实施例1.载siRNA的纳米泡
将80mg聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇(PLGA8000-PEG15000)、10mg1，2-二油酰-3-三甲基胺基丙烷共同溶解于40mL二甲基甲酰胺中，在磁力搅拌条件下加入5mg siRNA，转移至截留分子量为7000的透析袋，于4L水中透析48小时，每隔12小时更换新鲜水，透析完成后，取出透析袋内的溶液，在水浴超声条件下，加入气体或在正常体温下转化为气体的液体，并持续超声0.5小时，形成纳米泡。
siRNA可选自各种治疗疾病用siRNA，如针对乙型肝炎病毒(HBV)的序列：
序列1：ACCCUUAUAAAGAAUUUGGdAdG
      dGdCUGGGAAUAUUUCUUAAACC
序列2：GCUGUGCCUUGGGUGGCUUdTdT
      dTdTCGACACGGAACCCACCGAA
序列3：UACCGCAGAGUCUAGACUCdTdT
      dTdTAUGGCGUCUCAGAUCUGAG
还有抗肿瘤siRNA，如针对血管内皮生长因子(VEGF)的siRNA。
实验例1.载siRNA的纳米泡的体外转染实验
1材料和方法
1.1材料和仪器
HepG2.2.15细胞株(HBV DNAayw亚型转染肝母细胞瘤HepG2细胞的细胞系，可分泌HBV各种病毒标志物及完整的Dane颗粒)，DMEM混合培养液(含10％胎牛血清，380μg/mlG418，3％谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)，乙肝病毒表面抗原、核心抗原检测试剂盒。酶标仪，实时荧光定量PCR仪，高速台式离心机，超低温冰箱。
载siRNA的纳米泡由实施例1方法制备，siRNA序列为
序列1：ACCCUUAUAAAGAAUUUGGdAdG
      dGdCUGGGAAUAUUUCUUAAACC。
采用的是全氟戊烷充填。
1.3HBV的siRNA干扰试验
HepG2.2.15细胞接种到96孔板，转染前一天换无抗生素培养基培养24小时。设置三组，包括载siRNA的纳米泡、Lipofectamine 2000(阳性对照)、空白未给药组，分别设3复孔，继续培养至72小时。
1.4ELISA检测表抗与核抗及RT-PCR检测HBV DNA的表达
HBV表面抗原和核心抗原的检测，参照试剂盒标准操作程序执行；并用RNA抽提试剂盒分别提取各组转染后的总RNA，进行RT-PCR的检测。
2结果与讨论
2.1乙肝表面抗原检测
HepG2.2.15细胞与载siRNA的纳米泡或其他对照一起孵育72小时，并在加入5分钟后，37℃水浴超声10分钟，双波长450/690nm读取OD值。根据诊断试剂盒的判断标准，阴性对照OD值≤0.1且阳性对照OD值≥0.8时实验正常，否则实验无效，由此判断本实验有效。本发明中载siRNA的纳米泡能明显干扰HBsAg的复制，明显优于阳性对照(图1)。
2.2RT-PCR定量检测HBV DNA的表达
参照2.1的结果对抗HBsAg有效的实验组进行了RT-PCR检测(表1)。载siRNA的纳米泡组可见明显的DNA复制被抑制，证明其具有干扰HBV效应，明显优于阳性对照。
表1.HepG2.2.15细胞中HBV DNA拷贝数
Figure BSA00000627488300031
实验例2.载siRNA的纳米泡的体内治疗实验
1材料与方法
1.1材料与仪器
采用实验例1中的载siRNA纳米泡，HBV转染小鼠模型(C57)，实时荧光定量PCR仪。高速台式离心机，超低温冰箱。
1.2HBV转染小鼠模型的建立
取4-8周18-19g的C57小鼠5只，采用水动力转染法静脉快速(4～8s)注射含10μgHBV基因组质粒的生理盐水(体积为小鼠体重的10％)，饲养两天待用。
1.3给药方案及血样的制备
将小鼠分为三组，每组三只：阴性对照，给药组，给药超声组。阴性组不做任何处理，给药组小鼠将载siRNA纳米泡经尾静脉注射给药0.1mL。给药超声组在静脉注射载siRNA纳米泡完毕30min后，将给药组小鼠肝部位浸入100W超声波清洗器37℃水浴中连续超声30秒，分别于第五天及第十天眼眶取血0.15mL，静置3小时后于离心机上经5000rpm离心20分钟，用移液器取血清置于0.5mL离心管放置超低温冰箱-70℃，待测。
1.4血清样品的测定
将血清样品用实时荧光定量PCR仪测定含量。
2结果与讨论
2.1HBV转染小鼠血清中HBV DNA含量变化
HBV小鼠血清样品经PCR扩增仪进行扩增，扩增后HBV DNA含量反映药物抑制HBVDNA复制效果。数值越小表明LAPE自组装体抑制HBV DNA复制效果越好。
表2.HBV转染小鼠血液HBV DNA含量
Figure BSA00000627488300041
由于PCR扩增仪测定HBV DNA含量会有一定误差，因此未给药的阴性对照组在5天后或10天HBV DNA含量会有所下降和上升，而且HBV DNA有一个自然下降的趋势。由表2可见HBV转染小鼠经给药后血液中HBV DNA含量下降非常明显，超声后由于促进siRNA从纳米泡中释放，转染效果更强。

Claims (4)

1.一种用于siRNA传递的纳米泡载体，其特征是纳米泡由聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物和阳离子脂质构成外壳，内部充填气体或在正常体温下转化为气体的液体。
2.如权利要求1所述的用于siRNA传递的纳米泡载体，其特征是聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物选自聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物。
3.如权利要求1所述的用于siRNA传递的纳米泡载体，其特征是气体选自空气、氮气、氧气、二氧化碳、全氟丙烷、全氟丁烷、六氟化硫。
4.如权利要求1所述的用于siRNA传递的纳米泡载体，其特征是在正常体温下转化为气体的液体是全氟戊烷。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI476005B (zh) * 2013-01-31 2015-03-11 Univ Nat Yang Ming 具有超音波觸發釋藥功能以及造影功能的奈米級與微米級氣泡

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008148223A1 (en) * 2007-06-07 2008-12-11 Agriculture And Agri-Food Canada Nanocarrier based plant transfection and transduction
CN101822838A (zh) * 2009-03-05 2010-09-08 无锡纳奥生物医药有限公司 靶向识别肿瘤细胞的纳米药物载体材料及其制备和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008148223A1 (en) * 2007-06-07 2008-12-11 Agriculture And Agri-Food Canada Nanocarrier based plant transfection and transduction
CN101822838A (zh) * 2009-03-05 2010-09-08 无锡纳奥生物医药有限公司 靶向识别肿瘤细胞的纳米药物载体材料及其制备和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王双苗: "新型基因传递系统", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库.医药卫生科技辑》, no. 10, 15 October 2011 (2011-10-15), pages 060 - 69 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI476005B (zh) * 2013-01-31 2015-03-11 Univ Nat Yang Ming 具有超音波觸發釋藥功能以及造影功能的奈米級與微米級氣泡

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