KR20040053645A - 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물 형질전환법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새로운 식물 형질전환 기법을 제공하기 위한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 식물 형질전환 기법은 양이온성 올리고펩타이드를 운반체로 이용하여 이 운반체에 도입시키고자 하는 유전자를 부착시킨 뒤 얻어지는 유전자(표적 DNA)/펩타이드 복합체를 발현 프로모터를 함유하는 플라스미드에 삽입시킨 다음 수용액 상태로 식물체에 처리하여 직접 도입시키는 것을 포함함을 특징으로 한다. 본 발명의 형질전환 기법은 세포 수준에서 뿐만 아니라 전체 식물 조직을 대상으로 가능하며 조직 배양 단계를 거치지 않고 형질전환이 가능한 기법이다. 이와 같은 본 발명의 식물 형질전환 기법에 따르면, 도입시키고자 하는 표적 유전자가 양이온을 띠는 운반체에 정전기적 상호작용으로 결합한 상태에서 식물 조직내로 도입되기 때문에 기존의 형질전환법에 비하여 매우 간편하고 높은 형질전환율로 형질전환된 식물을 수득할 수 있어 내병성, 식물 품종 개량 등과 같은 식물 육종 분야 및 형질전환이 불가능한 많은 작물(예, 콩, 보리, 밀 등)의 형질전환에도 널리 활용화될 수 있을 것으로 사료된다.

Description

양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물 형질전환법{CATIONIC OLIGOPEPTIDE-MEDIATED DNA TRANSFORMATION IN PLANTS}

본 발명은 새로운 식물 형질전환 기법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 식물 형질전환 기법은 양이온성 올리고펩타이드를 운반체로 이용하여 이 운반체에 도입시키고자 하는 유전자를 부착시킨 뒤 얻어지는 DNA/펩타이드 복합체를 수용액 상태에서 식물체 중으로 직접 도입시키는 인 플란타(in-planta) 형질전환법에 관한 것이다.

재조합 DNA를 식물에 도입시키는 식물체의 형질전환 기법은 농업 발전에 큰 가능성을 가져 왔다. 즉, 유해 곤충, 질병, 한냉, 한발 등 환경 스트레스에 대해서 저항성이 있는, 보다 영양가가 높은 작물을 수확하고 생산하게 되었다. 동물과는 달리, 식물은 형질전환을 받은 단일세포로부터 번식력이 있는 식물체가 될 수 있다. 따라서, 식물세포에 도입된 유전자는 최종적으로 종자를 통해 몇 세대에 걸쳐서 후손에 전해지게 된다. 모든 시스템에서와 마찬가지로, 식물세포에서의 클로닝에는 그 고유의 문제가 있다. 이 과정을 수행하기 위한 천연의 플라스미드는 식물에서는 아직 찾아볼 수 없으며, 따라서 가장 큰 과제는 DNA를 식물세포에 도입하는 것이다.

현재 일반적으로 사용되는 식물 형질전환 기법에는 (1) 토양세균인 아그로박테리움(Agrobacterium), CaMV, TMV 등의 바이러스를 이용하는 방법, (2) 바이오리스틱 기법(biolistics), (3) PEG를 매개로 한 융합법, (4) 전기충격법(electroporation), (5) 미세주입법(microinjection), (6) 거대주입법(macroinjection) 및 (7) 리포좀(liposome)을 매개로 하는 방법 등이 있다.

아그로박테리움을 이용하는 방법은 식물 세포와 접촉시 아그로박테리움이 보유하는 Ti 플라스미드 중의 일부 단편인 T DNA(약 23,000 염기쌍)가 식물 세포의 핵으로 전이되어 염색체 중의 임의의 위치에 통합하게 되는 현상을 이용하는 것으로서, 이 현상은 DNA가 무핵생물로부터 유핵생물로 옮겨지는 드문 예가 되고 있다. 아그로박테리움으로부터 식물 세포 핵으로의 T-DNA의 이행은 T DNA의 양 말단에 존재하는 2개의 25 염기쌍으로 된 반복 서열과 Ti 플라스미드 상의 서로 다른 부위에 있는 독성 유전자라고 부르는 몇가지 유전자 산물에 의해서 이루어진다. 따라서 이 방법은 T DNA 대신에 도입시키고자 하는 재조합 DNA를 치환시킨 Ti 플라스미드를 가지고 있는 아그로박테리움을 식물체에 감염시키는 것으로서, 특히 용이하게 형질전환되는 아그로박테리움의 성질로 인하여 흔히 실험에 사용되고 있다.

바이오리스틱(Biolistics) 기법은 유전자 도입에 의한 식물의 형질전환기술중에서도 가장 최근에 개발된 기술이지만 많은 파급효과를 가져오고 있다. 입자 충격(Particle bombardment) 기법이라고도 불리우는 이 기술은 외래 유전자가 피복되어 있거나 또는 내부에 포함하고 있는 작은 금속 입자(예, 금이나 텅스텐)를 식물에 쏘아서 원하는 유전자를 식물세포 내로 도입하고 식물의 형질전환을 이루고자 하는 기법이다. 1988년도에 처음 보고된 본 기법은 급격하게 기술적인 다양성을 이루고 있어 이미 다른 기술로는 불가능했던 여러 종의 형질전환 식물체의 개발을 이룩하였다. 바이오리스틱 방법은 사용되는 금속 입자의 여러 가지 성질과 피격(bombard)될 식물체의 상태와 성질이 성공적인 결과를 가져오는 데 고려되어야 할 중요한 두 가지 요소로 꼽히고 있다.

대상 식물체의 상태와 성질은 이론적으로는 두 가지의 성질을 가지고 있는 식물세포들을 대상으로 하여야 된다고 할 수 있다. 첫째, 식물세포는 형질전환능(transformation competence)을 가져야 하고, 둘째 재분화능(regeneration competence)을 가져야 한다. 그러나 현재 세포학적 측면에서 이들 성질을 세포 수준에서 구별하는 것은 거의 불가능하기 때문에 조직 수준에서 일반적으로 위의 성질들을 가지고 있다고 판단되는 배(embryo) 조직을 대상으로 하여 주로 시도가 이루어지고 있다. 아울러 적절한 식물조직에 유전자를 도입하기 위한 바이오리스틱 장치에는 금속입자의 살포속도가 정밀히 조절됨이 매우 중요하여 금속입자 살포장치의 개량에 많은 노력이 투여되고 있으며 현재로는 방전 장치가 주로 활용되고 있다.

바이오리스틱 기법은 아그로박테리움을 이용한 형질전환기법이 기능을 하지 못하는 많은 식물체들, 특히 단자엽 식물들의 형질전환을 이룰 수 있는 새로운 기법이다. 현재로는 도입되는 유전자의 수나 크기를 조절하지 못함으로써 형질전환체를 재분화한 후 여러 번의 역교배를 수행하여야 원하는 형질전환 식물체를 얻을 수 있는 어려움은 있으나, 벼를 위시한 많은 수의 주요 작물의 형질전환에 널리 사용되고 있고 더욱 많은 사용이 이루어질 기법으로 생각되고 있다. 또한 본 기법은 학문적인 측면에서 유전자의 일시 발현을 목표하는 식물조직 내에서 확인하는데에 매우 효율적으로 사용될 수 있어 유전자 발현의 연구과정에서 더욱 널리 사용되고 있다. 이 기법의 중요한 단점을 금속 입자와 함께 도입되는 유전자가 핵으로 유입되어야 유전자 표현이 가능함으로써 형질 전환 효율이 매우 낮다는 것이다.

PEG를 매개로 한 융합법에 사용되는 PEG(폴리에틸렌글리콜)는 매우 강한 흡수력을 가지고 있으며 고농도 PEG 용액에 세포가 위치되면 세포막의 변성을 가져와 순간적으로 PEG 수용액에 첨가되어 있는 DNA가 세포 내로 전달되게 된다. 식물 세포의 경우 역시 원형질체가 대상이 되어야 하는 바, 원형질체로부터 식물체의 재분화가 해결해야 할 과제로 남아있다.

전기충격법은 식물 원형질체의 접합을 위하여 고안된 방법이나 식물 원형질체와 동물세포를 포함한 다양한 세포에 유전자를 효율적으로 도입할 수 있는 방법이다. 도입을 원하는 DNA가 녹아있는 수용성 완충액에 식물 원형질체를 넣고 강하고 짧은 전류를 적용하면 순간적으로 DNA가 원형질체 내로의 도입이 이루어져 식물 염색체 내로의 외래 유전자의 도입이 가능해 진다. 이 방법의 문제점은 유전자의 식물 세포 원형질체 내로의 도입이 아니라 원형질체 로부터 식물체의 재분화에 있다.

미세주입 기법은 동물체의 핵과 세포질과의 상호 연관성을 연구하기 위한 노력으로 핵의 치환을 시도함으로써 처음 연구에 이용되기 시작하였다. 미세주입 기법은 현미경에 부착된 미세조작기(micromanipulator)를 이용하여 매우 가늘게 뽑은 유리 모세관을 통해 소량의 물질을 세포의 특정 부위에 주입하는 과정으로써 동물체의 형질전환에는 널리 이용되는 기법이다. 식물체의 경우는 세포벽이라는 두꺼운 장벽이 일반적으로 매우 가는 유리 모세관의 침투를 막는 관계로 세포벽이 제거된 원형질체를 사용하여야 하는 어려움이 있다.

거대주입 기법은 비교적 굵은 관을 이용하여 다량의 유전자를 식물 조직에 일시에 투여하는 방법으로 원형질체를 대상으로 하여서는 사용 가능한 방법으로 판단되나 세포벽을 가지고 있는 식물조직을 대상으로 하여서는 효용성이 의문시되어, 원래의 의도를 성취하기 위해서는 많은 개량이 요구되는 방법이다.

리포좀을 매개로 하는 방법에 이용되는 리포좀은 지질(lipid) 용액을 DNA나 RNA의 수용액에 떨어뜨리는 경우 지질 간의 소수결합(hydrophobic interaction)에 의하여 DNA나 RNA 수용액을 소량 함유하게 되는 지질 소포체이다. DNA 또는 RNA를 함유한 리포좀은 화학적 성질이 원형질막과 유사하기 때문에 원형질체와 융합을 이룰 수 있으며 또는 미세주입법에 의하여 식물세포의 특정 내부기관(예, 액포)으로 주입될 수 있다. 따라서 본 기법은 유전자의 세포 내로의 도입 측면에서는 효율적인 기법이다.

전술한 아그로박테리움의 식물체 형질전환 기법을 제외한, 원형질체를 대상으로 하여 수행되고 있는 식물 형질전환 시도는 매우 낮은 성공률을 보이고 있다.원형질체로부터 식물체의 재생은 지난 30년의 엄청난 노력에도 불구하고 아직 매우 드물게 이루어지고 있으며, 특히 외래 유전자 도입 후 형질전환된 세포를 선별하기 위하여 기내 재분화 배지에 첨가하는 항생제등의 선별표지가 형질전환된 원형질체의 식물체로의 재분화를 거의 불가능하게 만들고 있는 것으로 판단된다. 따라서 원형질체를 대상으로 한 외래 유전자의 도입은 주로 일시발현(transient expression) 연구에 활용되고 있으며 새로운 형질전환 식물체의 개발에 널리 사용되기 위하여는 보다 효율적인 기내 재분화 기법과 선별기법의 발달이 요구된다.

본 발명은 이와 같은 원형질체를 대상으로 하는 식물 형질전환 기법의 근본적인 해결책으로서 원형질체 준비없이 식물 조직으로 직접 DNA를 도입시킬 수 있는 새로운 방식의 인플랜타 형질전환법(in-planta transformation)을 제공하기 위한 것이다. 또한 유전자 운반체의 핵 지향성을 통해 형질전환 효율을 최대한 높이고자 하는 것이다.

도 1의 좌측 패널 A는 양파의 뿌리 조직에 12량체의 라이신 펩타이드에 의해 전달된 GFP(green fluorescent protein) 유전자의 발현 정도를 처리 후 3일째 되는 날 형광현미경으로 관찰한 사진으로서. (a)는 신장대(elongation zone) 지역, (b)는 뿌리끝 생장점(root apical meristem) 지역을 확대한 것이다.

도 1의 우측 패널 B는 동일 실험군인 양파 뿌리 조직에 12량체의 라이신 펩타이드에 의해 전달된 GFP 유전자의 발현 정도를 처리 후 21일째 되는 날 형광현미경으로 관찰한 사진으로서, (c)는 처리 시 발현 단위(expression unit)에 직접 접촉하는 신장대 지역, (d)는 처리 후 세포 분열을 통해 성장된 조직의 신장대 지역, (e)는 처리 후 세포 분열을 통해 성장된 조직의 곁뿌리(lateral root) 지역, (f) 뿌리끝 생장점 지역을 확대한 것이다.

도 2a는 아라비돕시스(arabidopsis: 애기장대)의 뿌리 조직에서 12량체의 알기닌 펩타이드에 의해 전달된 GUS(β-glucuronidase) 유전자의 발현정도를 활성도 염색(activity staining) 후 광학현미경으로 관찰한 사진.

도 2b는 토마토 줄기에서 GUS 유전자만을 단독으로 처리한 후 GUS 유전자의 발현정도를 활성도 염색 후 광학현미경으로 관찰한 사진.

도 2c는 토마토의 줄기에서 12량체의 알기닌 펩타이드에 의해 전달된 GUS 유전자의 발현정도를 활성도 염색 후 광학현미경으로 관찰한 사진.

도 3은 F-K12를 이용하여 올리고라이신의 핵지향성을 조사하기 위해 양파의 상피세포[(a), (b), (c) 및 (d)]는 물론 뿌리의 신장대 지역(e)과 분열조직(f) 주변의 세포에서 시간별 국재화율을 관찰한 광학현미경 사진.

이와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 양이온성 올리고펩타이드를 운반체(carrier)로 이용하여 이 운반체에 도입시키고자 하는 유전자(이하, 표적 DNA 라고 명명함)를 부착시킨 뒤 얻어지는 유전자(표적 DNA)/펩타이드 복합체를 발현 프로모터를 함유하는 플라스미드에 삽입시킨 다음 수용액 상태에서 식물체에 처리하여 직접 도입시키는 것을 포함하는, 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물 형질전환법을 제공한다.

이와 같은 방법에서 양이온성 올리고펩타이드는 양하전을 띠는 라이신 또는 알기닌의 올리고머로서, 6량체, 9량체, 12량체 및 15량체의 길이를 갖는 올리고라이신 또는 올리고알기닌을 포함한다. 이 운반체는 실질적으로 핵 지향성이 있는 것이면 전술한 펩타이드 이외의 다른 펩타이드 또는 펩타이드 유사체도 사용가능하다. 형광 표식 분자인 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 올리고 12량체인 올리고라이신에 라벨링하여 수행한 실험에서도 증명되듯이 양이온성 올리고펩타이드의 핵 지향성이 높은 형질전환율의 원인인 것으로 추정된다. 특히 높은 형질전환율에는 9 내지 12량체의 길이를 갖는 올리고펩타이드가 바람직하다. 이와 같은 올리고펩타이드를 이용한 동물세포의 형질전환기법은 이미 잘 알려져 사용되고 있지만, 본 발명에서와 같이 식물세포의 형질전환기법에 사용한 예나 사용이 가능함을 암시한 문헌도 전혀 없다.

본 발명에 제시된 DNA/펩타이드 복합체는 아미노산의 양하전과 DNA의 음하전의 정전기적 상호작용을 이용하여 결합시킨 것으로, 이와 같은 결합에 적합한 반응 용액으로는 일반적인 PBS(인산염 완충용액, pH 7.4)나, MS 배지 등을 사용할 수 있으며, 심지어 정제수 또는 바닷물 농도의 식염수 등도 사용할 수 있다. 반응 용액의 pH는 다양한 pH 범위, 약 pH 4 내지 10의 범위에서도 결합이 확인되듯이 엄밀한 pH를 필요로 하지는 않는다. 반응 온도는 약 4℃에서 실시하는 것이 적당하며, 약 15분 내지 약 1시간 동안 방치시킨 결과 DNA와 펩타이드 복합체가 형성되는 것으로 확인된다. 바람직하게는, 결합체의 안정성을 향상시키기 위해서 1시간 동안 반응시키는 것이 좋다.

이와 같이 형성된 DNA/펩타이드 복합체는 표적 DNA의 발현에 필요한 발현 단위(expression unit)를 포함하는 플라스미드에 삽입시킨 후, 이 복합체 구조를 안정화시키는 용액중에 용해시킨 상태에서 식물의 배양 세포는 물론이고, 종자, 뿌리, 줄기, 구근 등의 조직으로 직접 도입시킬 수 있다.

이와 같이 DNA/펩타이드 복합체를 식물 중으로 직접 도입시키는 방식은 용액 상태의 DNA/펩타이드 복합체를 함유하는 플라스미드를 세포배양 배지, 발아 배지 또는 육종 배지 등에 첨가하고 이 배지에서 세포를 배양하거나 종자를 발아시키거나 어린 식물을 육종함으로서 이루어지는 매우 간단한 방법이다. 어떤 이론적 근거를 통해 입증하지는 못하였으나, 이와 같은 도입은 식물 뿌리의 삼투작용과 같은 자연적인 흡수현상을 이용하여 식물체 자신이 DNA/펩타이드 복합체 함유 수용액을 흡수하도록 한 뒤, 흡수된 수용액중의 양이온성 올리고펩타이드의 핵지향성에 의하여 각 식물조직의 세포벽과 원형질막을 통과하여 핵으로 유도된 뒤, 식물 염색체에 재조합되는 것으로 이루어지는 현상인 것으로 추정된다. 대안적으로, DNA/펩타이드 함유 플라스미드 용액을 표적 DNA를 도입시키고자 하는 식물의 조직으로 직접 주사하는 방법 등도 이용할 수 있다.

이와 같이 도입된 본 발명에 제시된 핵지향성의 양이온성 올리고펩타이드-DNA 복합체는 약 50% 이상의 높은 형질전환율을 나타내는 것으로 관찰되고, 또한 일반적인 식물세포 형질전환에 필요한 장비를 요구하지 않는 바, 효율적이며 신속 간편한 식물 형질전환 기법으로서 당해 기술분야에 널리 이용될 수 있을 것으로 사료된다. 또한 형질전환이 불가능한 많은 작물(예, 콩, 보리, 밀 등)에 직접 형질전환도 시도할 수 있을 것이다.

본 발명에서 사용되는 "식물 또는 식물체"란 용어는 식물의 배양 세포는 물론이고, 식물의 종자, 뿌리, 줄기, 구근, 잎 등과 같은 식물체를 구성하는 모든 조직과 기관을 포괄적으로 의미하는 것이다.

이하, 본 발명의 식물 형질전환법을 구체적 실험을 통해 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명의 범위는 이와 같은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : DNA/펩타이드 복합체를 포함하는 플라스미드의 제조

식물에서 유전자 발현연구를 위한 리포터로서 광범위하게 사용되고 있고 형질전환된 조직 또는 유전자의 발현양상을 조직학적인 염색을 통하여 확인할 수 있는 마커 유전자로서 녹색형광 단백질(green fluorescent protein: GFP) 및 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase: GUS) 유전자를 본 발명의 표적 유전자로서 사용하였다. GFP 유전자 (Clontech.USA) 6㎍을 12량체의 올리고라이신 6㎍과 PBS(phosphate buffered salines pH 7.4)에서 혼합하여 얼음위에서 1시간 반응시켜 GFP DNA/올리고라이신 복합체를 수득하였다.

이와 동일한 방식으로, GUS 유전자(Clontech.USA) 4.5㎍ 를 12량체의 올리고알기닌 5㎍과 PBS(phosphate buffered salines pH 7.4)에서 혼합하여 얼음위에서 1시간 반응시켜 GUS DNA/올리고알기닌 복합체를 제조하였다.

35S 프로모터를 함유하는 플라스미드와 상기 DNA/올리고펩타이드를 각각 항온반응시켜 35S 프로모터 조절하에 GFP DNA/올리고라이신을 함유하는 플라스미드및 35S 프로모터 조절하에 GUS DNA/올리고알기닌을 함유하는 플라스미드를 수득하였다.

실시예 2 : 양파 구근을 통한 올리고펩타이드의 핵지향성 관찰

식물체내에서의 올리고펩타이드의 핵지향성을 관찰하기 위하여, 형광 표식 분자인 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 올리고 12량체인 올리고라이신에 라벨링하고, 라벨링된 12량체 올리고라이신 50㎍을 PBS 완충액(pH 7.4) 200㎕에 녹인 후, 이 용액을 직경 1㎝로 준비된 양파의 구근 절편에 처리한 다음 형광현미경(Zeiss, Germany, Axiovert2)과 공초점주사현미경(Zeiss, Germany, LSM510)(488nm의 필터 세트 장착)을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, 양파 구근의 상피세포에서 높은 효율로 국재화되는 것이 관찰되었다[도 3의 (a), (b), (c) 및 (d)].

또한, 시간 경과에 따라 이동성을 관찰하였다. 항온처리 개시 후 30분 이내에서는 몇몇 세포들에서만 세포질에서 F-K12가 검출되었고 주로 세포벽들에 분포하는 것으로 관찰되었다. 1시간이 경과한 후에는 대부분의 세포들에서 F-K12가 세포질에 분포하는 양상으로 나타났으며, 세포질로 일찍 들어간 세포들에서는 약하지만 핵의 형태도 관찰되기 시작하였다[도 3의 (g)]. 2시간이 경과한 후에는 동일 위치의 세포들에서 강한 형광성을 나타내는 핵들이 새롭게 발견되기 시작하였다[도 3의 (h)].

이와 같은 결과를 토대로 시간경과별 움직임을 볼 때, 항온처리 개시 후 30분이 지난 시점부터 세포질로의 진입이 일어나며 1시간이 지난 시점부터 핵 표적화가 시작되며, 2시간이 지난 시점부터는 핵에 국재화가 시작된다는 것을 알 수 있다.

실시예 3 : 양파 뿌리를 통한 올리고펩타이드의 핵지향성 관찰

형광 표식 분자인 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 올리고 12량체인 올리고라이신에 라벨링하고, 라벨링된 12량체 올리고라이신 50㎍을 PBS 완충액(pH 7.4) 200㎕에 녹인 다음, 3일동안 발근(發根) 유도된 양파 뿌리를 상기 용액에 담구어 처리한 다음 형광현미경(Zeiss, Germany, Axiovert2)과 공초점주사현미경(Zeiss, Germany, LSM510)(488nm의 필터 세트 장착)을 이용하여 핵지향성을 관찰하였다.

그 결과, 뿌리 분열조직 주변의 표적화 패턴[도 3의 (e) 및 (f)]을 보면, 세포 분열이 활발하여 세포 크기는 작지만 일정한 크기의 핵들이 관찰되었는데, 이는 세포 유사분열 활성이 강한 지역으로도 직접 POL/A가 표적화될 수 있다는 가능성을 보여주는 것이다.

실시예 4 : DNA/펩타이드 복합체를 이용한 양파의 형질전환

실시예 1에서 수득한 GFP DNA/올리고라이신을 함유하는 플라스미드 6㎍를 PBS 완충액(pH 7.4) 200㎕에 용해시킨 용액에 양파의 뿌리를 침지시켜 2시간 정도 접촉시켰다. 그 다음, DNA가 포함되지 않은 물로 옮겨 약 3일 정도 키운 후 일부 뿌리 조직을 취하여 형광현미경으로 관찰한 결과, 신장대 지역[도 1의 좌측 패널 및 확대도인 도 1의 (a)]과 뿌리끝 생장점 지역[도 1의 좌측 패널과 확대도인 도 1의 (b)]에서 녹색 형광성을 확인할 수 있었다. 관찰된 뿌리 세포의 약 50%에서 GFP가 발현되는 결과를 얻었다. 바이오리스틱(Biolistics) 기법의 경우에는 1% 미만이라는 점과 비교하면 본 방법이 높은 효율임을 알 수 있다.

이 뿌리를 1주간 역시 DNA가 없는 물에서 더 키웠을 때 성장된 조직의 세포에서도 역시 50%의 세포에서 GFP가 발현되었는데, 이는 GFP 유전자가 염색체에 삽입되어 세포분열이 된 딸세포에 옮겨간 것을 보여주는 것이다[도 1의 (c), (d), (e) 및 (f)].

실시예 5: DNA/펩타이드 복합체를 이용한 애기장대의 형질전환

실시예 1에서 수득한 GUS DNA/올리고알기닌을 함유하는 플라스미드 4.5㎍를 PBS 완충액(pH 7.4) 200㎕에 용해시킨 용액에 애기장대(Arabidopsis)의 종자를 침지시켜 낮(22??, 16시간)/밤(8시간) 조건의 배양기에서 발아시켰다. 그 다음, 발아된 뿌리를 무작위 선발하여, 10mM EDTA(pH8.0), 100mM 인산나트륨, 0.5mM 칼륨 페로시아나이드, 0.5mM 칼륨 페리시아나이드, 0.1%(v/v) Triton X-100, 0.5mg/ml X-GlcA(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠론산) 로 이루어진 염색시약을 이용하여 활성도 염색 후 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과 GUS가 뿌리 전체에서 표현되는 것을 관찰할 수 있었다[도 2의 (a)].

실시예 6: DNA/펩타이드 복합체를 이용한 토마토의 형질전환

실시예 1에서 수득한 GUS DNA/올리고알기닌을 함유하는 플라스미드 4.5㎍을 PBS 완충액(pH 7.4) 30㎕에 용해시킨 용액을 갓 발아한 토마토의 줄기에 주사기를 이용하여 주사한 후 약 1주일간 증식시켰다. 1주일 후 줄기조직을 취하여 활성도 염색 후 광학현미경으로 관찰한 결과, 역시 GUS가 주사줄기단면을 통하여 표현되었다[도 2의 (c)].

비교예 1: DNA 만을 이용한 토마토의 형질전환

GUS DNA/올리고알기닌 복합체 대신에 GUS DNA만을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 6과 같은 조건하에 실험하였다. 구체적으로, GUS DNA만을 PBS 완충액(pH 7.4)에 용해시킨 용액을 갓 발아한 토마토 줄기에 주사하고, 1주일 경과후 줄기조직을 취하여 활성도 염색 후 광학현미경으로 관찰한 결과, GUS가 발현되지 않았음을 확인할 수 있었다[도 2의 (b)].

이와 같은 본 발명의 식물 형질전환 기법에 따르면, 도입시키고자 하는 표적 유전자가 양이온을 띠는 운반체에 정전기적 상호작용으로 결합한 상태에서 식물 조직내로 도입되고, 운반체의 핵지향적 성질로 인하여 기존의 형질전환법에 비하여 매우 우수한 형질전환율로 형질전환된 식물을 간편하게 수득할 수 있어 내병성, 식물 품종 개량 등과 같은 식물 육종 분야에 널리 활용화될 수 있을 것으로 사료된다. 특히, 형질전환이 불가능한 많은 작물(예, 콩, 보리, 밀 등)의 형질전환에도 이용될 수 있을 것이다.

Claims (5)

1. 양이온성 올리고펩타이드를 운반체(carrier)로 이용하여 이 운반체에 도입시키고자 하는 유전자를 부착시킨 뒤 얻어지는 유전자(표적 DNA)/펩타이드 복합체를 발현 프로모터를 함유하는 플라스미드에 삽입시킨 다음 수용액 상태로 식물체에 처리하여 직접 도입시키는 것을 포함하는, 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물 형질전환법.
2. 제1항에 있어서, 올리고펩타이드가 6량체, 9량체, 12량체 및 15량체의 길이를 갖는 올리고라이신 또는 올리고알기닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물 형질전환법.
3. 제1항에 있어서, 올리고펩타이드에 대한 표적 DNA의 부착이 약 pH 4 내지 10 범위의 인산염 완충액, MS 배지, 물 또는 식염수용액에서 약 4℃하에 약 15분 내지 1시간 정도 반응시킴으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물 형질전환법.
4. 제1항에 있어서, 식물체가 식물의 배양 세포, 종자, 뿌리, 줄기 또는 구근 조직을 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물 형질전환법.
5. 제1항에 있어서, 직접 도입이 배양액을 통한 투과이거나 또는 주사를 통한 주입에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물 형질전환법.