CN102040655B - 一种在细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法。本发明提供了一种具有细胞核和/或叶绿体定位功能的多肽，其氨基酸序列如序列表的序列1所示。本发明还提供了编码权利要求1所述多肽的DNA片段以及含有所述DNA片段的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。本发明提供的在植物细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法，是所述多肽作为信号肽引导外源蛋白在植物细胞核和/或叶绿体中定位表达。本发明不仅为在细胞核中特异表达抗逆，抗病害相关基因，提高植物生存能力提供了良好技术路线，同时也为在叶绿体中表达激活光合作用反应的相关基因，提高农作物生物产量提供了新的技术支持。本发明在实际生产中有重要的应用价值。

Description

一种在细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种在细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法。 

背景技术

水稻矮缩病毒(rice dwarf virus，RDV)是水稻普通矮缩病的病原，1883年首次在日本被发现，广泛分布于中国、日本、朝鲜、菲律宾、尼泊尔等东南亚水稻产区。此病在水稻秧田和本田期均能发生，为系统性侵染病害。植株感病后，所有分蘖均能发病。症状为植株显著矮缩，分蘖增多，叶色浓绿，叶片粗而僵直，沿叶脉出现白色小斑点，形成断续的点线状(老叶不出现斑点)；如在孕穗后期发病，只在剑叶及其叶鞘上表现清晰的条点病斑；若在抽穗后发病，仅在剑叶叶鞘上表现病斑。病株根系发育不良，多老朽根，早期发病(苗期到分蘖期)一般不能抽穗，后期发病呈包茎穗或半包穗，穗小秕谷多。因此，水稻感染该病后能够造成大面积减产，严重威胁水稻的生产。 

RDV是呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)的成员(Boccardo G，1984)。呼肠孤病毒科病毒有一些共同特点，例如病毒粒子呈球状，有双层衣壳，每个衣壳均呈现20面体对称，直径为60-80nm，没有脂蛋白外膜，外壳由3种蛋白质组成，核心有4-6种蛋白，核心内含有线状dsRNA，有10-12个基因组分。RDV病毒粒子为无刺突、无脂蛋白外膜的二十面体，病毒粒子直径为69.3nm，具有双层外壳蛋白，内壳直径为53nm。RDV病毒粒子内有单拷贝基因组12条双链RNA，RNA基因组分以超卷曲形式包装在病毒粒子内，与蛋白质组成复合体。依照dsRNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率，由慢到快，依次命名为S1到S12。RDV基因组编码6-7种结构蛋白(包括P1，P2，P3，P5，P7，P8和P9)，和至少五种非结构蛋白(包括Pns4，Pns6，Pns10，Pns11，Pns12)。 

Pns11的编码序列有两个ORF，这两个ORF的读码框相同，但第二个ORF的AUG密码子满足Kozak保守转录的要求，在感病的植株和昆虫体内表达量较高。其编码一个181个氨基酸组成的20KD蛋白。S11的3’非编码区很长，占整个片段的46.4％，远远高于RDV其他片段3′非编码区的相对长度(约占3.1％-17.7％)。 

发明内容

本发明的目的是提供一种在细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法。 

本发明提供了一种具有细胞核和/或叶绿体定位功能的多肽，其氨基酸序列如序列表的序列1所示。 

编码所述多肽的DNA片段也属于本发明的保护范围。 

所述DNA片段的核苷酸序列可如序列表的序列2所示。 

含有所述DNA片段的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。 

所述重组表达载体可为将编码所述多肽的DNA片段插入载体pRTL2的多克隆位点得到的重组质粒。 

本发明还保护一种在植物细胞的细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法，是用所述多肽作为信号肽引导外源蛋白在植物细胞的细胞核和/或叶绿体中定位表达。 

所述方法可通过将含有所述DNA片段和所述外源蛋白的编码基因的融合DNA导入植物细胞实现；所述融合DNA中，编码所述多肽的DNA片段位于所述外源蛋白的编码基因的上游。具体来说，所述融合DNA通过如下重组表达载体导入所述植物细胞：骨架质粒为pRTL2，在35S启动子后依次插入编码所述多肽的DNA片段和外源蛋白的编码基因。 

所述植物细胞为可烟草细胞，如烟草BY2细胞。 

所述外源蛋白可为GFP蛋白。所述GFP基因具体可为GENBANK ACCESSIONNUMBER：U55761中自5’末端第97至816位核苷酸序列所示的DNA。所述融合DNA具体可为序列表的序列6所示的DNA。 

本发明通过实验证实了水稻矮缩病毒的非结构蛋白Pns11的C端132-180多肽(第二个ORF)具有将外源蛋白特异定位到细胞核和叶绿体中的功能。不仅为在细胞核中特异表达抗逆，抗病害相关基因，提高植物生存能力提供了良好技术路线，同时也为在叶绿体中表达激活光合作用反应的相关基因，提高农作物生物产量提供了新的技术支持。本发明在实际生产中有重要的应用价值。 

附图说明

图1为pRTL2-S11::eGFP在烟草表皮细胞中的瞬时表达；A：pRTL2-S11::eGFP荧光；B：pRTL2-S11::eGFP可见光；C：pRTL2-S11::eGFP荧光和可见光叠加；D：pRTL2-eGFP荧光；E，F：pRTL2-S11::eGFP在烟草表皮细胞核中定位的放大图。 

图2为pCambia1301-S11::eGFP转基因烟草中，Pns11::eGFP在叶肉细胞和保卫细胞中的细胞定位情况。 

图3为免疫电镜显示Pns11在RDV宿主细胞中的定位；A：RDV感病水稻细胞的细胞核(标尺表示250nm)；B：RDV感病水稻细胞的叶绿体；C：健康水稻的细胞，Nu-细胞核，Ch-叶绿体；D：细胞中金胶体颗粒密度统计；红色箭头示胶体金颗粒所在位置。 

图4为Pns11序列及核定位信号分析模式图。 

图5为S11(132-181)::eGFP在烟草BY2细胞核中的瞬时表达。 

图6为S11(132-181)::eGFP在烟草BY2叶绿体中的瞬时表达。 

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 

pRTL2、大肠杆菌DH5α和EHA105：北京大学；参见文献：Cao，X.S.，Zhou，P.，Zhang，X.M.，Zhu，S.F.，Zhong，X.H.，Xiao，Q.，Ding，B.，and Li，Y.(2005).Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-strandedRNA virus.J Virol 79，13018-13027。 

烟草BY2细胞：北京大学；参见文献：Howard EA，Zupan JR，Citovsky V，Zambryski PC(1992)The Vird2 protein of A.tumefaciens contains a C-terminalbipartite nuclearlocalization signal-implications for nuclear uptake ofDNA in plant-cells.Cell 68：109-118。 

PCR引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)见表1。 

表1实施例中用到的PCR引物 

引物	引物序列	内切酶
				F1	5’CATGCCATGGGAATGAGTGGAACATTACCC 3’	NcoI	S11 5’
R1	5’GCGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA 3’	KpnI	GFP 3’
				F2	5’TCGCAAATCAAAGCGTAAGATGGTGAGCAAGGGCGAGG 3’		S11-GFP recombinant PCR 5’
R2	5’CCTCGCCCTTGCTCACCATCTTACGCTTTGATTTGCGA 3’		S11-GFP recombinant PCR 3’
				F3	5’CCACGCAAAAGGCGTACGACATGGTGAGCAAGGGCGAGG 3’		S11Δ(132-181)-GFP recombinant PCR 5’
R3	5’CCTCGCCCTTGCTCACCATGTCGTACGCCTTTTGCGTGG 3’		S11Δ(132-181)-GFP recombinant PCR 3’
				F4	5’CAAAGAAAGGTGGTAAAAAAATGGTGAGCAAGGGCGAGG 3’		S11(132-149)-GFP recombinant PCR 5’
R4	5’CCTCGCCCTTGCTCACCATTTTTTTACCACCTTTCTTTG 3’		S11(132-149)-GFP recombinant PCR 3’

F5	5’CATCCATGGCGAGAAAGAGGAAAGAATATTC 3’	NcoI	S11(154-181)-GFP 5’
				F6	5’CATCCATGGCGAGGAAGGATAAGTCCCCTTC 3’	NcoI	S11(132-181)5’
R6	5’CGCGTCGACTCAGTCGTACGCCTTTTGCGTGG 3’	SalI	S11Δ(132-181)3’
				F7	5’GCACCATGGCTAGGAAGGATAAGGCCCCTGCTAAAG3’	NcoI	S11NLS136&138-SA 5’
F8	5’GCTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG 3’	NcoI	GFP 5’

实施例1、S11的细胞定位 

一、S11在瞬时表达体系中的定位分析 

1、瞬时表达载体pRTL2-S11:eGFP的构建 

(1)用重组PCR的方法获得S11::eGFP片段 

①制备含有S11基因(GENBANK ACCESSION NUMBER：NC_003767自5′末端第30至572位核苷酸)和酶切位点(NcoI)的DNA片段甲(序列3所示DNA)；以pEGFP-1(GENBANK ACCESSION NUMBER：U55761)为模板，用引物F2和R1进行PCR，得到扩增产物乙(eGFP；序列4所示DNA)。 

PCR反应体系(50μl)： 

10×pfu polymerase buffer            5.0μl 

引物F2(10μM)                        2.5μl 

引物R1(10μM)                        2.5μl 

dNTP(2.5mM)                          5.0μl 

GFP(10ng)                            1.0μl 

Pfu polymerase                       1.0μl 

ddH₂O                                33.0μl 

PCR反应条件：预变性：94℃，5min；循环参数，94℃、30sec，55℃、30sec，72℃、1min，25个循环；72℃延伸5min。 

PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目的片段。 

②以DNA片段甲和扩增产物乙为模板，按照以下条件进行PCR： 

小循环： 

10×pfu polymerase buffer                5.0μl 

DNA片段甲                                15(ng) 

扩增产物                                 20(ng) 

dNTP(2.5mM)                              5.0μl 

Pfu polymerase                       1.0μl 

ddH₂O                                至50μl 

PCR反应条件：预变性：94℃，5min；循环参数，94℃、30sec，55℃、30sec，72℃、1min，5个循环；72℃延伸5min。 

大循环： 

直接向PCR体系中加入引物，进行大循环： 

Primer F1(10μM)                    2.5μl 

Primer R1(10μM)                    2.5μl 

10×pfu polymerase buffer           0.5μl 

PCR反应条件：预变性：94℃，5min；循环参数，94℃、30sec，55℃、30sec，72℃、2min，25个循环；72℃延伸5min。 

PCR产物即为S11::eGFP片段(序列5所示DNA)。 

(2)将步骤(1)的PCR产物进行酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，然后用NcoI和KpnI双酶切，与同样酶切过的载体pRTL2连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取阳性质粒进行酶切和测序鉴定。结果表明，得到了瞬时表达载体pRTL2-S11::eGFP(骨架质粒为pRTL2，在35S启动子后依次插入S11和eGFP；即在pRTL2的NcoI和KpnI酶切位点间插入序列5所示DNA)。 

以步骤1中的eGFP为模板，引物F8和R1为引物扩增，扩增产物插入载体pRTL2的NcoI和KpnI酶切位点间，得到对照质粒pRTL2-eGFP。 

2、S11在瞬时表达体系中的定位分析 

使用无内毒素大提质粒kit(TianGen)大量提取pRTL2-S11::eGFP。利用基因枪轰击法将质粒导入到烟草(Nicotiana benthamiana)叶片的表皮细胞中进行瞬时表达。使用的是 

-PDS-1000/He Particle Delivery System，按照产品说明书进行操作，同时以pRTL2-eGFP作为对照 

将转化后的烟草叶片置于MS培养基上25-28℃培养，16-24h后使用激光共聚焦显微镜观察Pns11在细胞内定位情况(GFP荧光)。 

结果发现，如图1A所示，瞬时表达了pRTL2-S11::eGFP的烟草叶片表皮细胞的GFP绿色荧光主要分布在细胞核和质体中，这种分布形式与对照质粒pRTL2-eGFP的在细胞内弥散的荧光分布形成鲜明的对比，如图1D。图1E和F是对转化了pRTL2-S11::eGFP的烟草叶片表皮细胞的细胞核GFP荧光的局部放大，可以看到， Pns11::eGFP在细胞核中呈现明显的团状分布。这说明，RDV的非结构蛋白Pns11是一个细胞核和质体定位蛋白。 

二、Pns11在组成性表达体系中的细胞定位分析 

1、植物表达载体pCambia-1301-S11::eGFP的构建 

将pRTL2-S11::eGFP通过亚克隆将35S-S11:eGFP构建到植物表达载体pCambia-1301中，形成一个新的重组子pCambia-1301-S11::eGFP。 

2、农杆菌电击转化 

(1)农杆菌的电击转化感受态的制备 

农杆菌EHA105(OD₆₀₀＝1.5-2)，在2200g的相对离心力下，离心5分钟。去上清，用灭菌的去离子水洗至少六遍，即不断离心(2200g相对离心力)、重悬菌体。最后用10％甘油重悬菌液至浓度约为4-6×10¹¹ cells/ml，分装后保存在-70℃。 

(2)农杆菌的转化 

60μl农杆菌细胞加小于5μl的质粒，混匀后加入电击杯中，冰上放置5分钟，擦干电击杯外部的水分，放入电击转化仪中(BTX，Model ECM 630)。 

电击转化条件为： 

模式：2.5kV/RESISTANCE High Voltage(HV) 

电击杯类型：BTX Disposable Cuvette P/N 610(1mm gap) 

电容：50μF 

电阻：125Ω 

电压：1.4kV 

额定场强(供参考)：14.4kV/cm 

额定脉冲长度(供参考)：5.0msec 

转化后的菌液在28℃静置1小时以上。2200g离心5分钟，混匀后涂在含有相应抗性的培养基上，置于28℃培养48h。 

3、农杆菌介导的烟草转化 

(1)烟草叶片的准备 

选取较靠近植株顶部的叶面比较平整、肥厚并且绒毛较少的叶片。一般大小为12-27cm²。将3-5片取好叶片放在一个10cm的平皿(最好是无菌的)中，倒入次氯酸钠溶液(有效氯浓度为2.0％)，以充分浸过叶片为宜，浸泡20分钟。其间不断用镊子轻轻将叶片压入次氯酸钠溶液，并用镊子夹住叶柄翻动叶片。浸泡完毕后 将叶片用镊子夹入盛有无菌水的平皿中漂洗，约4-6次。 

(2)烟草叶片的剪切 

用镊子轻轻夹住叶柄，用剪刀剪去叶尖和其边缘部分。并且沿着垂直于中脉的方向将一半叶片剪成宽约0.5cm的条状(到中脉处停止)。再沿着平行于中脉的方向，将叶片剪成片状，浸泡在液体MS培养基中。剪完另外一半叶片后，丢弃掉中脉。 

(3)侵染农杆菌的准备 

挑取新鲜的农杆菌于2ml LB加相应抗生素的液体培养基中28℃振荡培养过夜OD₆₀₀＝0.6-0.8。次日以1∶50或1∶100比例转接菌液至80-100ml新鲜的加有相应抗生素的LB液体培养基中(3-5片叶子40-50ml培养基)在28℃振荡培养4-6小时，菌液呈云雾状，OD₆₀₀＝0.2-0.5时即可用于转化。 

(4)侵染叶盘 

5000rpm，10min收集农杆菌，用液体MS培养基稀释农杆菌重悬液，至OD₆₀₀约等于0.5。在超净台中将剪好的叶片浸入重悬液约5-10min。取出叶片至无菌滤纸上吸去多余菌液，将叶片摆放在共培养培养基上28℃暗培养2-4day。 

(5)筛选培养 

将在黑暗中共培养2-4天的烟草叶片转移到加有筛选压的继代培养基上，250mg/L cef，300mg/L kan，(或者10mg/L潮霉素)用封口膜封好培养皿，在光照为2000-100001ux、25-28℃，16/8hd^-1光暗条件下培养，2-3周有抗性组织出现。(叶盘边缘轻轻压入培养基中，以增加筛选压力) 

(6)生根培养 

大概2-3周后，待不定芽长到1cm左右时，切下不定芽转移到有筛选压的生根培养基上继续生长，至长出足够的根系。(250mg/L cef，100mg/L kan，或者10mg/L潮霉素。 

从图2可见，不论在叶肉细胞还是保卫细胞中，GFP荧光都有着类似的分布，即，除了在细胞核中有着明显的荧光以外，细胞中还有这许多的点状的分布(图2A，D)。结合对叶绿体中叶绿素的自发红色荧光的观察(图2B，E)，发现图2A，D中GFP荧光的点状分布区域能和叶绿体中叶绿素的自发红色荧光完全重合(图2C，F)，这说明这些点状区域正是烟草叶片细胞的叶绿体，也就是说在pCambia1301-S11::eGFP转基因烟草中，Pns11::eGFP无论在叶片的叶肉细胞和保 卫细胞中都是定位在细胞核和叶绿体中的，这与前面在瞬时表达系统中获得的结果完全一致。 

三、Pns11在RDV侵染的宿主细胞中的细胞定位分析 

切取RDV感病水稻和健康水稻的一小部分组织在固定液(100mM二甲胂酸钠缓冲液，pH7.2，1％(vol/vol)戊二醛，4％(wt/vol)甲醛)中固定3小时。固定完毕后，样品在一系列梯度浓度的丙酮中脱水，然后用环氧树脂在60℃包埋和聚合。样品超薄切片后，载于200网孔的镍网上，并用一滴封闭液，即含有1％的牛血清白蛋白(BSA)的TBS缓冲液(10mMTris-HCl，150mM NaCl，[pH7.4])中封闭20分钟。然后，将样品的超薄切片放入以1∶200比例加入了兔源的抗Pns11的多克隆抗体的封闭液中，在室温温育2小时。样品切片使用TBS缓冲液洗涤4次，每次10分钟后再放入1∶30加入了耦链了直径为15nm的胶体金颗粒的羊抗兔IgG的TBS缓冲液中温育1小时。切片再用TBS缓冲液和双蒸水洗涤。经干燥后，使用醋酸铀和柠檬酸铅染色后用电子显微镜在80KV下观察。 

结果如图3所示。图3A，B所示RDV侵染的水稻叶片的超薄切片的使用特异抗Pns11的抗体的免疫电镜胶体金标记法的结果。可以看到，在Nu表示的细胞核和Ch表示的叶绿体内都分布有比较多的黑色胶体金的颗粒，如图中红色箭头所指示，而作为阴性对照的健康水稻叶片的电镜图中(图3C)，都没有可见的金胶体颗粒，这说明使用的Pns11的抗体是十分特异的。同时金胶体颗粒密度的统计结果也支持同样的结论(图3D)。这样看来，在RDV侵染的水稻叶片细胞中，即使在RDV病毒其他组分存在的情况下，Pns11仍然定位于细胞核和叶绿体中，与前面的瞬时表达系统和组成性表达系统得到的结果完全一致。 

实施例2、定位DNA片段的发现 

大多数核内蛋白向核内运输的过程都是通过蛋白质中的信号肽的帮助来穿越核孔复合物而进入细胞核内的，而这段信号肽被称为核定位信号(nuclearlocalization signal，NLS)。NLS可以位于核蛋白的任何部位，并且没有专一性。典型的NLS类型可以分为两种，一种是单序列的核定位信号，(single-stretchmonopartite basic-type)，这种NLS一般由一段富含碱性氨基酸残基的序列组成，保守的序列模式是(K/R)_4-6，其典型代表就是第一个被确定NLS序列的SV40大T抗原的NLS；另外一种是双组分核定位信号，(bipatite basic-type)，典型的 bipartite NLS motif包括两个碱性氨基酸(Arg or Lys)、一段包含10个氨基酸的间隔序列和一个碱性氨基酸区域。这个碱性区域中五个氨基酸内至少3个是碱性的，其保守序列模式为(K/R)₂X_10-12(K/R)₃，其典型代表是核质蛋白(nucleoplasmin)的NLS。除了典型的NLS类型以外，还有一些其他类型的序列模式也能介导蛋白转运入核。大多数的这种NLS都是由一段比较长的氨基酸残基组成，并且碱性氨基酸残基的含量也不是十分丰富，比如有38bp长的来自于hnRNP A1和A2蛋白的M9序列以及hnRNP K蛋白的KNS序列等等。当然也有一些短序列的NLS模式，它们并不符合典型的NLS的保守模式，比如Sam68蛋白(P-P-X-X-R)和Cdc6蛋白(S/T-P-X-K-R-L/I)。另外也有报道一段G-R的重复序列能够介导大FGF-2异构体进入细胞核。 

Pns11的第二个ORF编码一个181个氨基酸组成的20KD蛋白。对Pns11的进行序列分析发现，在Pns11的氨基酸序列的N末端有一个CyS₂-CyS₂锌指模式序列，此模式序列位于第47位氨基酸残基至61位残基氨基酸之间。Pns11的C末端极端亲水，分布着5个碱性氨基酸残基富集的区域，如图4A所示。对Pns11的碱性氨基酸残基富集区域进一步分析发现，BR2和BR3以及BR4和BR5序列模式正好符合典型NLS类型中的双组分核定位信号(bipatite NLS)的保守模式，所以如图4B所示，推测在Pns11的C端部分可能存在两个双组分核定位信号，NLS I和NLS II.因此很可能Pns11的第二个ORF的132-181位氨基酸残基(Pns11基因编码的蛋白质的第161至189位氨基酸残基)对于Pns11的核定位是至关重要的。 

实施例3、定位DNA片段的功能验证 

一、融合瞬时表达载体pRTL2-S11(132-181)::eGFP的构建 

以实施例1制备的pRTL2-S11:eGFP为PCR模板，使用引物F6和R1进行PCR扩增，得到的扩增产物为序列6所示的DNA片段；PCR产物使用NcoI和KpnI双酶切，与使用同样酶切过的载体pRTL2连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取阳性质粒进行酶切和测序鉴定。结果表明，得到了瞬时表达载体pRTL2-S11(132-181)::eGFP(骨架质粒为pRTL2，在35S启动子后依次插入S11(132-181)和eGFP；即在pRTL2的NcoI和KpnI酶切位点间插入序列6所示DNA)。 

二、定位DNA片段的功能验证 

在烟草BY2细胞中瞬时表达pRTL2-S11(132-181)::eGFP，以实施例1制备的 pRTL2-S11::eGFP和pRTL2-eGFP为对照。烟草BY2悬浮细胞的培养及原生质体的电击转化方法如下： 

1、BY-2悬浮细胞的培养及保存 

液体培养基：(1L) 

800ml            ddH₂O 

4.3g             MS盐 

200mg            KH₂PO₄

30g              蔗糖 

用KOH调节pH＝5.8，定容至1L，113℃、30min灭菌。 

使用前加入以下成分： 

100mg               肌醇 

1mg                 Thiamin(VB1)    1000×贮存液(过滤除菌) 

2mg                 甘氨酸 

0.6mg               2，4-D          10mg/ml贮存液(无水乙醇溶液) 

烟草BY2悬浮细胞以1∶25转接到液体培养基中，135rpm，26℃暗培养，一般4-7天转接一次。 

2、BY-2原生质体制备及其电击转化 

①酶解 

原生质体酶液： 

2％                纤维素酶R-10 

0.2％              离析酶R-10 

0.2％              BSA 

0.36μl/ml         巯基乙醇 

5mM                MES(pH5.8) 

0.4M               甘露醇 

1mM                CaCl₂

烟草BY2悬浮细胞转接后3-4天，1000rpm(小于100×g)，2min离心收集细胞，(0.4M甘露醇，5mM MES pH5.8)洗1遍，悬于原生质体酶液中(一般30ml悬浮细胞用5ml酶液)，26℃避光，40rpm消化约3-4h，可通过显微镜检测消化程度。 

②过滤 

酶解完毕，酶液用40μm尼龙膜过滤，滤过液1000rpm(小于100×g)，2min收集细胞。 

③洗涤 

原生质体先用(0.4M甘露醇，5mM MES pH5.8)洗1-2遍，再用原生质体电转液(5mM MES pH5.8，0.4M甘露醇，70mM KCl)洗涤1-2次，最后悬浮于电转液中(约2×10⁶/ml)。 

④冰浴及检测 

原生质体悬浮液冰上放置1小时，同时取出30μl到Ep管中，加入1.5μl 0.5％埃文斯蓝染色，显微镜下用细胞计数板计算原生质体总数、活细胞(无色)数及死细胞(蓝色)数。 

⑤电击转化 

每300μl或400μl原生质体中加入瞬时表达载体(5-30μg)、鲑精DNA 1.5μl或2.0μl(50μg/ml)，小心混匀，转入2mm电转杯(预先洗干净并冰浴)，擦尽壁上水滴，进行电击，参数如下： 

电压    150V     (LV) 

电阻    50Ω 

电容    900μF 

输出值大约为140V、14ms。 

⑥培养 

电击结束，往Cuvette中加入1ml预冷的原生质体电转液(5mM MES pH5.8，0.4MMannitol，70mM KCl)，通常此时会看到有部分死细胞(白色成粘稠状浮于液表)，吸出液体(弃死细胞)转移到Ep管中，冰浴30min。4℃，900rpm(小于100×g)，2min离心收集细胞，重悬于约2-3ml原生质体培养液(含50μg/ml Amp以抑制细菌生长)中，转移到用5％小牛血清封闭的6孔板中，26℃、避光静置培养16h后，在荧光显微镜下观察GFP荧光。 

原生质体培养液配方： 

0.5×       MS Salts and Vitamins 

0.4M        Mannitol 

3％         Sucrose 

5mM            MES pH5.8。 

观察核定位情况的结果如图5所示。转入pRTL2-S11(132-181)::eGFP的烟草BY2细胞中和转入pRTL2-S11::eGFPPns11::eGFP的烟草BY2细胞中，GFP荧光都定位在细胞核内(图5E和图5H)。而转入pRTL2-eGFP的烟草BY2细胞中，GFP荧光弥散地分布细胞中(图5B)。结果表明Pns11的132-181位氨基酸本身就能独立指导定位在细胞质中的eGFP蛋白转运入核。这就说明Pns11的132-181位氨基酸残基就是Pns11的核定位信号。 

观察叶绿体定位情况的结果如图6所示。转入pRTL2-S11(132-181)::eGFP的烟草BY2细胞中，GFP荧光定位在叶绿体内。而转入pRTL2-eGFP的烟草BY2细胞中，GFP荧光弥散地分布细胞中。 

序列表 

<110>北京大学 

<120>一种在细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法 

<130>CGGNARY92585 

<160>6 

<210>1 

<211>50 

<212>PRT 

<213>人工序列 

<220> 

<223> 

<400>1 

Arg Lys Asp Lys Ser Pro Ser Lys Gly Lys Asn Ser Lys Lys Gly Gly 

1               5                   10                  15 

Lys Lys Ser Ser Ser Ala Arg Lys Arg Lys Glu Tyr Ser Ser Asn Ser 

            20                  25                  30 

Glu Thr Asp Leu Ser Ser Asp Ser Asp Ala Asn Thr Arg Lys Ser Lys 

        35                  40                  45 

Arg Lys 

    50 

<210>2 

<211>150 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223> 

<400>2 

aggaaggata agtccccttc taaaggcaaa aattcaaaga aaggtggtaa aaaatcttca   60 

tccgcaagaa agaggaaaga atattcttca aattctgaaa cggatttgag ttctgacagt   120 

gatgccaata ctcgcaaatc aaagcgtaag                                    150 

<210>3 

<211>574 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223> 

<400>3 

catgccatgg gaatgacggc gagtgaatca ttcgttggca tgcaagtttt ggctcaagac  60 

aaagaagtca aagcgacctt tattgctctc gacaggaaat tacctgccaa tctgaaagta  120 

ccatacatga aaaatgctaa atatagaact tgtatttgtc caagttcaaa ccatttggta  180 

gatgactgtg tatgcgaaga tgtgattatt gcgtatactg cacacagaaa taatgcggta  240 

gctgcccttt tgtatagtga cggaaacgtc atacacaaga gcggtacttt gaaacctaaa  300 

tcccaaaatc ggtttgattt acgtggtttt ttaaccagtg ctaacccagg ggaaagctca  360 

aaagctgaag ccggcacctc gaaatccacg caaaaggcgt acgacaggaa ggataagtcc  420 

ccttctaaag gcaaaaattc aaagaaaggt ggtaaaaaat cttcatccgc aagaaagagg  480 

aaagaatatt cttcaaattc tgaaacggat ttgagttctg acagtgatgc caatactcgc    540 

aaatcaaagc gtaagatggt gagcaagggc gagg                                574 

<210>4 

<211>748 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223> 

<400>4 

tcgcaaatca aagcgtaaga tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc    60 

catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg    120 

cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct    180 

gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg    240 

ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt    300 

ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa    360 

gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga    420 

cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat    480 

ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga    540 

cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt    600 

gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga    660 

gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat    720 

ggacgagctg tacaagtaag gtacccgc                                       748 

<210>5 

<211>1278 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223> 

<400>5 

catgccatga cggcgagtga atcattcgtt ggcatgcaag ttttggctca agacaaagaa    60 

gtcaaagcga cctttattgc tctcgacagg aaattacctg ccaatctgaa agtaccatac    120 

atgaaaaatg ctaaatatag aacttgtatt tgtccaagtt caaaccattt ggtagatgac    180 

tgtgtatgcg aagatgtgat tattgcgtat actgcacaca gaaataatgc ggtagctgcc    240 

cttttgtata gtgacggaaa cgtcatacac aagagcggta ctttgaaacc taaatcccaa    300 

aatcggtttg atttacgtgg ttttttaacc agtgctaacc caggggaaag ctcaaaagct    360 

gaagccggca cctcgaaatc cacgcaaaag gcgtacgaca ggaaggataa gtccccttct    420 

aaaggcaaaa attcaaagaa aggtggtaaa aaatcttcat ccgcaagaaa gaggaaagaa    480 

tattcttcaa attctgaaac ggatttgagt tctgacagtg atgccaatac tcgcaaatca    540 

aagcgtaaga tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc    600 

gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat    660 

gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc    720 

tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac    780 

cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc    840 

accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc    900 

gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc    960 

ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag    1020 

cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg    1080 

cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc    1140 

gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat    1200 

cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg    1260 

tacaagtaag gtacccgc                                                  1278 

<210>6 

<211>890 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223> 

<400>6 

catccatggc gaggaaggat aagtcccctt ctaaaggcaa aaattcaaag aaaggtggta  60 

aaaaatcttc atccgcaaga aagaggaaag aatattcttc aaattctgaa acggatttga  120 

gttctgacag tgatgccaat actcgcaaat caaagcgtaa gatggtgagc aagggcgagg  180 

agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca  240 

agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt  300 

tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct  360 

acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt  420 

ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact  480 

acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga  540 

agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca  600 

acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca  660 

agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca  720 

cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg  780 

ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg  840 

ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta aggtacccgc             890 

Claims (10)

1.一种多肽，其氨基酸序列如序列表的序列1所示。

2.编码权利要求1所述多肽的DNA片段。

3.如权利要求2所述的DNA片段，其特征在于：所述DNA片段的核苷酸序列如序列表的序列2所示。

4.含有权利要求2或3所述DNA片段的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将权利要求2或3所述DNA片段插入载体pRTL2的多克隆位点得到的。

6.一种在植物细胞的细胞核和/或叶绿体中定位表达外源蛋白的方法，是用权利要求1所述多肽作为信号肽引导外源蛋白在植物细胞的细胞核和/或叶绿体中定位表达。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法是通过将含有权利要求2或3所述DNA片段和所述外源蛋白的编码基因的融合DNA导入植物细胞实现的；所述融合DNA中，权利要求2或3所述DNA片段位于所述外源蛋白的编码基因的上游。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述融合DNA通过如下重组表达载体导入所述植物细胞：骨架质粒为pRTL2，在35S启动子后的多克隆位点依次插入权利要求2或3所述DNA片段和外源蛋白的编码基因，得到的重组质粒。

9.如权利要求6至8中任一所述的方法，其特征在于：所述植物细胞为烟草细胞。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述植物细胞为烟草BY2细胞；所述外源蛋白为GFP蛋白。

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