CN111378660A - 一种靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA及其敲除载体、载体构建方法和应用 - Google Patents

一种靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA及其敲除载体、载体构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及特异性靶向抗生素抗性基因tetA的sgRNA、含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体及其构建方法和应用，即一种靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA及其敲除载体、载体构建方法和应用。本发明通过对四环素类抗性基因tetA的序列分析，筛选出靶向切割tetA基因的上述sgRNA序列。经实验验证，本发明提供的CRISPR/Cas9敲除载体能够高效靶向切割tetA基因第251位至第270位序列。

Description

一种靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA及其敲除载体、载体构 建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及特异性靶向抗生素抗性基因tetA的sgRNA、含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体及其构建方法和应用。
背景技术
近年来，随着抗生素在畜禽养殖和临床治疗中的大量使用，环境中抗生素抗性细菌以及抗生素抗性基因的丰度正在不断增加。抗生素抗性基因会使细菌产生抗生素耐药性，目前已被当做一种新型的环境污染物。四环素类抗生素是由放线菌产生的或半合成的一类广谱抗生素，由于价格低廉，不仅被作为药物用于治疗人类或动物的细菌感染，同时也被作为常用的饲料添加剂，用于提高饲料利用率，促进养殖动物的生长。四环素的滥用导致了四环素抗性基因在细菌间广泛传播，这使得四环素的治疗效果不断被削弱，对人和动物有着潜在的健康风险。tetA基因是四环素抗性基因中的重要一种，目前在土壤，地表水，大气，污水处理厂、沉积物等环境中都被广泛检出。
目前，抗生素抗性基因的削减主要是通过微生物群落结构的改变，例如，通过过滤的方式减少微生物的生物量。但这些方式都没有从根本上破坏抗性基因，系统中残余的抗性基因仍能通过整合、转座以及接合转移等途径进行迁移转化。CRISPR/Cas9系统是近年来新兴的基因编辑技术，Cas9蛋白能在特定guide-RNA的引导下靶向切割特定序列。一些研究者利用CRISPR/Cas9系统对大肠杆菌等多种微生物的功能基因进行了敲除，但目前利用该系统对四环素抗性基因敲除的研究还较为缺乏。
发明内容
本发明的目的在于提供特异性靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA、含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体及其构建方法。
第一方面，本发明所涉及的sgRNA序列靶向tetA基因的第251位至第270位序列，Cas9蛋白在该sgRNA的引导下对该位点有良好的切割效果，该sgRNA的特异性核苷酸序列如sgRNA-1(为SEQ ID No.1)所示。
sgRNA-1：5’-CATGATGGCGTAGTCGACAG-3’。
第二方面，本发明提供了包含上述特异性靶向tetA基因第251至第270位核苷酸序列的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体，优选的，CRISPR/Cas9基因敲除载体图谱如附图3所示。
上述CRISPR/Cas9基因敲除载体为单质粒系统，即运用同一个质粒载体表达基因敲除所需要的Cas9蛋白和sgRNA。
第三方面，本发明提供上述CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法，其为：将Cas9蛋白基因，上述sgRNA基因，接合转移位点，复制子，筛选标记基因通过无缝克隆的方法得到上述的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
上述CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建包含以下步骤：
(1)合成含有上述sgRNA序列的表达元件sgRNA(tetA)，该表达元件包含原核生物J23119(SpeI)启动子、上述sgRNA序列、gRNA scaffold序列和终止子序列，其序列如SEQ IDNo.2所示(序列如下)：CTGCAGCACGTACAGCACTGATGCATCGCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGCTGGATCCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTCATGATGGCGTAGTCGACAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGCTTAGATCTATTACCCTGTTATCCCTGCAG
(2)将步骤(1)合成的sgRNA(tetA)插入到puc57载体中，得到载体puc57-sgRNA(tetA)，其图谱如图1所示。
(3)以pk18mobsacB质粒为模板，利用引物对1PCR扩增RP4-oriT序列，其中RP4-oriT序列中包含接合转移位点，将扩增产物凝胶纯化。
(4)以步骤(2)中puc57-sgRNA(tetA)为模板，利用引物对2PCR扩增oriV-sgRNA(tetA)序列，将扩增产物凝胶纯化。
(5)步骤(3)、(4)所涉及的引物对1、2含有同源片段，利用无缝克隆将步骤(3)、(4)纯化所得的扩增产物连接，得到puc57-oriT-sgRNA(tetA)质粒，其图谱如图2所示。
(6)以pCas质粒为模板，利用引物对3PCR扩增Cas9-Kan序列，将扩增产物凝胶纯化。
(7)以步骤(5)所得的puc57-oriT-sgRNA(tetA)为模板，利用引物对4PCR扩增oriV-oriT-sgRNA(tetA)序列，将扩增产物凝胶纯化。
(8)步骤(6)、(7)所涉及的引物对3、4含有同源片段，利用无缝克隆将步骤(6)、(7)纯化所得的扩增产物连接，得到puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)质粒，其图谱如图3所示，该质粒即为靶向tetA基因第251位至第270位序列的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
引物对1：
OriT-S:CTGGAGGATCATCCAGCCCTG
OriT-F:GCCGAGCTTCCTGCTGAACATC
引物对2
Puc19-F:GATGTTCAGCAGGAAGCTCGGCCTTCCGCTTCCTCGCTCACTG
Puc19-S:ATCAGGGCTGGATGATCCTCCAGTCATTAATGCAGCTGGCACGAC
引物对3：
Fragment-F:ATCTCAGCGATCCAGGTCATTCAGACTGGCTAATGC
Fragment-S:GATGATCCTCCAGGATGTAGCCGTCAAGTTGTCAT
引物对4：
Vector-F:GACGGCTACATCCTGGAGGATCATCCACGTACAGCACTGATGCATCG
Vector-S:TCTGAATGACCTGGATCGCTGAGATAGGTGCCTC
同样地，本发明利用PCR扩增，无缝克隆的方法获得puc57-oriT-Cas9-△sgRNA质粒，其图谱如图4所示，该质粒与puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)相比缺少含有上述sgRNA的sgRNA(tetA)序列，无法行使基因敲除的功能，而puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)可以行使敲除功能。
上述所涉及的PCR反应采用50ul体系，反应体系如下：PrimeSTAR Max Premix25ul，上下游引物各1ul，模板1ul，ddH2O 22ul。
上述所涉及的PCR反应程序如下：98℃变性10s，55℃退火10s，延伸温度为72℃，速度为5s/kb，循环数为30。
上述所涉及的无缝克隆反应体系如下：NovoRec plus重组酶1ul，5×缓冲液4ul，长片段0.05pmol，短片段为0.025pmol，用ddH2O将反应体系补充至20ul，50℃反应15分钟。
第四方面，本发明提供一种微生物，该微生物含有上述的puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)质粒。其中，所述微生物为大肠杆菌，该微生物由感受态大肠杆菌转化入puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)质粒得到。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明通过对四环素类抗性基因tetA的序列分析，筛选出靶向切割tetA基因的上述sgRNA序列。经实验验证，本发明提供的CRISPR/Cas9敲除载体能够高效靶向切割tetA基因第251位至第270位序列。
(2)本发明提供的CRISPR/Cas9敲除载体能够通过转化或接合转移的方式进入受体细胞，对受体细胞中的目的序列进行靶向切割(高效靶向切割tetA基因第251位至第270位序列)。
(3)本发明提供的CRISPR/Cas9敲除载体及其构建方法具有很强的实用性，为tetA基因及其他抗性基因的敲除及其研究提供了有效方法和基础。
附图说明
图1为本发明实施例2中puc57-sgRNA(tetA)质粒的图谱。图中标出了复制子(ori)，氨苄抗性基因(Amp)，sgRNA-1的表达元件sgRNA(tetA)。
图2为本发明实施例2中puc57-oriT-sgRNA(tetA)质粒的图谱。该质粒在puc57-sgRNA(tetA)质粒的基础上增加了接合转移位点(OriT)。
图3为本发明实施例2中puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)敲除载体的质粒图谱。图中标出了复制子(ori)，卡那抗性基因(Kan)，sgRNA-1的表达元件sgRNA(tetA),Cas9蛋白基因(Cas9)以及接合转移位点(OriT)。
图4为本发明实施例2中puc57-oriT-Cas9-△sgRNA对照载体的质粒图谱。该质粒与puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)质粒相比缺少了sgRNA-1的表达元件sgRNA(tetA)。
图5为本发明实施例3中接合转移实验的结果。实验组和对照组的细菌菌落数有显著差异(P<0.01)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请权利要求书所限定的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1特异性靶向tetA基因的sgRNA序列的获得
(1)从http://www.ncbi.nlm.nih.gov网址中下载四环素抗性基因tetA(GenBank:NG_048148.1)的基因序列。
(2)将(1)得到的序列导入https://zlab.bio/guide-design-resources中获得符合条件的sgRNA，从中筛选出效率和特异性得分都较高的sgRNA-1，sgRNA-1序列如下：
sgRNA-1：5’-CATGATGGCGTAGTCGACAG-3’。
实施例2构建含有sgRNA-1的CRISPR/Cas9基因敲除载体
含有sgRNA-1的CRISPR/Cas9基因敲除载体构建的构建方法包括如下步骤：
(1)利用软件Snapgene设计含有sgRNA-1的表达元件序列sgRNA(tetA)，并在杭州擎科梓熙生物技术公司合成该序列，表达元件包含原核生物J23119(SpeI)启动子、上述sgRNA-1、gRNA scaffold序列和终止子序列，其序列如序列1所示。
(2)将步骤(1)合成的sgRNA(tetA)插入到puc57载体中，得到载体puc57-sgRNA(tetA)，并将该载体转化入大肠杆菌感受态细胞中，质粒载体图谱如图1所示。
(3)以pk18mobsacB质粒为模板，利用引物对1PCR扩增RP4-oriT序列，其中RP4-oriT序列中包含接合转移位点，将扩增产物用Tiangen凝胶纯化试剂盒纯化。
(4)将步骤(2)所得大肠杆菌阳性克隆扩增，用Tiangen质粒小提试剂盒提取5ml菌液中步骤(2)涉及的puc57-sgRNA(tetA)质粒，以该质粒为模板，利用引物对2PCR扩增oriV-sgRNA(tetA)序列，将扩增用Tiangen凝胶纯化试剂盒纯化。
(5)步骤(3)、(4)所涉及的引物对1、2含有同源片段，利用NovoRec plus无缝克隆试剂盒将步骤(3)、(4)纯化所得的扩增产物连接，得到puc57-oriT-sgRNA(tetA)质粒，并将该载体转化入大肠杆菌感受态细胞中，质粒载体图谱如图2所示。
(6)以pCas质粒为模板，利用引物对3PCR扩增Cas9-Kan序列，将扩增产物用Tiangen凝胶纯化试剂盒纯化。
(7)将步骤(5)所得大肠杆菌阳性克隆扩增，用Tiangen质粒小提试剂盒提取5ml菌液中步骤(5)涉及的puc57-oriT-sgRNA(tetA)质粒，以该质粒为模板，利用引物对4PCR扩增oriV-oriT-sgRNA(tetA)序列，将扩增产物用Tiangen凝胶纯化试剂盒纯化。
(8)步骤(6)、(7)所涉及的引物对3、4含有同源片段，利用NovoRec plus无缝克隆试剂盒将步骤(6)、(7)纯化所得的扩增产物连接，得到puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)质粒，其载体图谱如图3所示，该质粒即为靶向tetA基因第251位至第270位序列的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
类似地，本发明利用PCR扩增，无缝克隆的方法获得puc57-oriT-Cas9-△sgRNA对照质粒，质粒载体图谱如图4所示，该质粒与puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)相比缺少含有sgRNA-1的sgRNA(tetA)序列，无法行使基因敲除的功能，而puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)可以行使敲除功能。
实施例2中涉及的PCR反应采用Takara公司的PrimeSTAR Max高保真聚合酶，反应体系如下：PrimeSTAR Max Premix 25ul，上下游引物各1ul，模板1ul，ddH2O 22ul。PCR反应程序如下：98℃变性10s，55℃退火10s，延伸温度为72℃，速度为5s/kb，循环数为30。
实施例2中涉及的无缝克隆采用NovoRec plus one step PCR Cloning试剂盒，反应体系如下：NovoRec plus重组酶1ul，5×缓冲液4ul，长片段0.05pmol，短片段为0.025pmol，用ddH2O将反应体系补充至20ul，50℃反应15分钟
实施例2中涉及的转化步骤如下：取100ul感受态细胞置于冰上解冻，加入无缝克隆连接产物，在冰上放置30分钟；将感受态细胞42℃水浴60秒，快速转移到冰浴中，冷却3分钟；向感受态细胞中加入500ul LB液体培养基，混匀后置于37℃200rpm摇床中复苏60分钟；吸取复苏后的感受态细胞100ul涂布于相应抗性的培养基，置于恒温培养箱中培养16小时。
实施例3实施例2构建的CRISPR/Cas9敲除载体的敲除效果验证
对于大肠杆菌而言，在puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)敲除载体的作用下，若发生质粒DNA的断裂，质粒会逐渐丢失，失去四环素抗性，若发生染色体DNA的断裂，细菌将难以存活。
1、利用接合转移验证该质粒载体对含有tetA基因大肠杆菌的削减作用
(1)细菌培养
将含有RP4质粒的大肠杆菌划线活化后接种于四环素抗性的LB液体培养基中，置于恒温震荡培养箱中37℃震荡培养16小时，速度为200rmp。其中RP4质粒是IncPα系列，能够在多种细菌间接合转移的泛宿主型质粒，其大小为60099bp，该质粒携带多种抗生素抗性基因，其中就包含四环素抗性基因tetA。
将含有puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)敲除载体和含有puc57-oriT-Cas9-△sgRNA对照载体的大肠杆菌划线活化后分别接种于卡那抗性的LB液体培养基中，置于恒温震荡培养箱中37℃震荡培养16小时，速度为200rmp。
(2)洗菌
将步骤(1)扩大培养后的摇菌管以转速5000rmp离心5分钟。离心后倒弃上清液，向摇菌管中加入适量PBS缓冲液使沉积的菌液重悬并再次离心，再次弃去上清液，共重复3次。最后，再次用PBS缓冲液将菌液OD600值均调节至0.7(±0.03)。
(3)细菌接合
实验组：在10ml离心管中加入2.5ml PBS重悬的含有RP4质粒的大肠杆菌与2.5mlPBS重悬的含有puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)敲除载体的大肠杆菌。
对照组：在10ml离心管中加入2.5ml PBS重悬的含有RP4质粒的大肠杆菌与2.5mlPBS重悬的含有puc57-oriT-Cas9-△sgRNA对照载体的大肠杆菌。
将实验组和对照组的离心管37℃震荡培养1h后放入37℃恒温培养箱静置培养12h。
(4)平板计数
取步骤(3)中实验组和对照组的菌液分别稀释到适宜浓度，各取100ul菌液涂布于四环素抗性的LB固体培养基上，平行重复3次。平板置于37℃恒温培养箱中培养15h，对菌落进行计数，并计算单位体积实验组和对照组菌液中四环素抗性菌的菌落数(CFU/ml)。
(5)作图结果
根据步骤(4)的平板计数结果，本实验利用R语言绘制了实验组和对照组中四环素抗性菌菌落数的箱线图，如图5所示，其中纵坐标代表单位体积取对数后的菌落数(lg(CFU)/ml)。结果显示与对照组相比，实验组当中携带四环素抗性的菌落数显著减少(P<0.01)，这说明puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)敲除载体能够有效去除RP4质粒上的tetA基因。
2、该质粒载体对大肠杆菌S17-1菌株中tetA基因同源片段的敲除
大肠杆菌S17-1菌株的染色体上整合了RP4-2质粒，其中就包括tetA基因的同源片段，因此，本实验将puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)敲除载体转化入S17-1菌株中，若该敲除载体能靶向切割tetA基因第251位至第270位序列，那么含有该质粒的转化子将无法生长，具体验证方法如下：
(1)转化
取100ul大肠杆菌S17-1感受态细胞置于冰上解冻至冰水混合物状态，将该100ul感受态平均分为2份，每份50ul，分别置于2个离心管中。
实验组：在50ul感受态细胞中加入100ng puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)敲除载体，在冰上放置30分钟。
对照组：在50ul感受态细胞中加入100ng puc57-oriT-Cas9-△sgRNA对照载体，在冰上放置30分钟。
将对照组和实验组42℃水浴60秒，速转移到冰浴中，冷却3分钟。分别向对照组与实验组感受态细胞中加入500ul LB液体培养基，混匀后置于37℃200rpm摇床中复苏60分钟，稀释到合适浓度后，吸取稀释后的感受态细胞100ul涂布于相应抗性的培养基上，平行重复3次，将培养基置于恒温培养箱中培养16小时。
(2)平板计数与结果
经过抗性平板的培养，对照组转化子的平均菌落数为62000CFU/ml，而实验组转化子的平均菌落数为0CFU/ml，转化实验表明puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)敲除载体能有效靶向切割tetA基因的第251位至第270位序列。
综上所述，本发明提供的特异性靶向tetA基因的sgRNA序列以及含有该sgRNA的CRISPR/Cas9敲除载体能够高效靶向切割tetA基因第251位至第270位序列，实现抗性基因tetA基因的敲除。同时，用本发明提供的CRISPR/Cas9敲除载体制备方法较易得到靶向相应抗生素抗性基因的CRISPR/Cas9敲除载体，为tetA及其他抗性基因的敲除及其研究提供了有效方法和基础。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA及其敲除载体、载体构建方法和应用
<130> 20-212069-00016124
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catgatggcg tagtcgacag 20
<210> 2
<211> 284
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgcagcacg tacagcactg atgcatcgct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 60
cggtatttca caccgcatat gctggatcct tgacagctag ctcagtccta ggtataatac 120
tagtcatgat ggcgtagtcg acaggtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct 180
agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc tttttttgaa ttctctagag 240
tcgacctgca gaagcttaga tctattaccc tgttatccct gcag 284
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctggaggatc atccagccct g 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccgagcttc ctgctgaaca tc 22
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatgttcagc aggaagctcg gccttccgct tcctcgctca ctg 43
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcagggctg gatgatcctc cagtcattaa tgcagctggc acgac 45
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atctcagcga tccaggtcat tcagactggc taatgc 36
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatgatcctc caggatgtag ccgtcaagtt gtcat 35
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gacggctaca tcctggagga tcatccacgt acagcactga tgcatcg 47
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tctgaatgac ctggatcgct gagataggtg cctc 34

Claims (10)

1.特异性靶向抗生素抗性基因tetA的sgRNA，其特征在于，该sgRNA靶向tetA基因的第251位至第270位的序列。
2.根据权利要求1所述的特异性靶向tetA基因的sgRNA，其特征在于，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1：5’-CATGATGGCGTAGTCGACAG-3’。
3.含有权利要求1或2所述的特异性靶向tetA基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
4.根据权利要求3所述的CRISPR/Cas9基因敲除载体，其特征在于，其图谱如图3所示。
5.一种构建权利要求3或4所述的CRISPR/Cas9基因敲除载体的方法，其特征在于，包括：
(1)根据权利要求1或2所述靶向切割tetA基因的sgRNA，合成含有该sgRNA的表达元件sgRNA(tetA)，该表达元件sgRNA(tetA)包含原核生物J23119(SpeI)启动子、编码基因的核苷酸序列为：5’-CATGATGGCGTAGTCGACAG-3’的sgRNA、gRNA scaffold序列和终止子序列，其序列如SEQ ID No.2；将该表达元件sgRNA(tetA)插入到puc57载体中，得到载体puc57-sgRNA(tetA)；
(2)利用无缝克隆技术在上述(1)所述的puc57-sgRNA(tetA)载体内插入接合转移位点(OriT)，得到puc57-oriT-sgRNA(tetA)质粒；
(3)将上述(2)所述的puc57-oriT-sgRNA(tetA)质粒和pCas质粒中的目的片段分别PCR扩增，利用无缝克隆技术得到puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)质粒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的PCR反应程序为98℃变性10s，55℃退火10s，延伸温度为72℃，速度为5s/kb，循环数为30；所述的PCR反应体系为PrimeSTAR Max Premix 25ul，上下游引物各1ul，模板1ul，ddH2O 22ul；所述的无缝克隆反应体系为NovoRec plus重组酶1ul，5×缓冲液4ul，长片段0.05pmol，短片段为0.025pmol，用ddH2O将反应体系补充至20ul，50℃反应15分钟。
7.含有权利要求3或4所述的CRISPR/Cas9基因敲除载体的微生物，该微生物为大肠杆菌。
8.权利要求1或2所述的sgRNA在四环素抗性基因tetA敲除中的应用。
9.权利要求3或4所述的CRISPR/Cas9基因敲除载体在四环素抗性基因tetA敲除中的应用。
10.权利要求7所述的微生物在四环素抗性基因tetA敲除中的应用。
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