DE69132357T2

DE69132357T2 - Antimikrobielle Peptide und darauf basierte Pflanzenkrankheitsresistenz

Info

Publication number: DE69132357T2
Application number: DE69132357T
Authority: DE
Inventors: Jonathan P. Duvick; Aragula G. Rao; Tracy A. Rood
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1990-06-05
Filing date: 1991-06-05
Publication date: 2000-12-28
Anticipated expiration: 2011-06-06
Also published as: CA2042448A1; AU642257B2; ES2150415T3; DE69132357D1; EP0465009B1; JPH05184373A; ATE195345T1; EP0465009A1; AU7735791A; US5905187A

Description

Technisches Gebiet

Diese Erfindung betrifft Materialien und Verfahren zum Abtöten von Pilzen und anderen Mikroorganismen, die für Pflanzen gefährlich sind, und Materialen und Verfahren, um Pflanzenkrankheitsresistenz zu übertragen.

Hintergrund der Erfindung

Zahlreiche Pilze und Bakerien sind ernsthafte Schädlinge verbreiteter Feldfrüchte. Ein Verfahren zur Krankheitsbekämpfung war es, antimikrobiell wirkende organische oder halborganische Chemikalien auf die Früchte auszubringen. Dieses Verfahren weist zahlreiche, unter Fachleuten wohl erkannte Probleme auf. Ein jüngeres Verfahren zur Bekämpfung von Krankkheiten durch Mikroorganismen war die Verwendung von biologischen Kontrollorganismen, die typischerweise natürliche Kompetitoren oder Inhibitoren des schädlichen Mikroorganismus sind. Es ist jedoch schwierig, biologische Kontrollorganismen auf großen Flächen auszubringen, und es ist sogar noch schwieriger, es zu bewerkstelligen, daß diese lebenden Organismen für eine längere Zeitperiode auf der behandelten Fläche verbleiben. In noch jüngerer Zeit bot die rekombinante DNA-Technologie die Möglichkeit, clonierte Gene, die antimikrobielle Verbindungen exprimieren, in Pflanzenzellen zu insertieren. Diese Technologie gab Anlaß zu zusätzlichen Bedenken wegen einer bleibenden Resistenz von Mikroben gegenüber gut bekannten, natürlicherweise auftretenden antimikrobiellen Mitteln, besonders angesichts des starken Selektionsdrucks, der auf manchen Flächen auftreten kann. Es besteht daher ein fortwährender Bedarf; natürlicherweise auftretende antimikrobielle Verbindungen zu identifizieren, die von Pflanzenzellen direkt durch Translation eines einzelnen Strukturgens gebildet werden können.
Die europäische Patentanmeldung 204 590, basierend auf der U. S. Patentanmeldung 725 368, beschreibt ein Verfahren zur genetischen Modifikation einer Pflanzenzelle, um die Expression eines heterologen fremden Strukturgens zu kontrollieren. Bei diesem Verfahren wird die Pflanzenzelle transformiert und enthält dann einen pRi T-DNA Promotor und ein heterologes fremdes Strukturgen, wobei der Promotor und das Strukturgen so zueinander positioniert und orientiert sind, daß das Strukturgen in der Pflanzenzelle unter der Kontrolle des Promotors exprimierbar ist.
In ähnlicher Weise beschreibt die europäische Patentanmeldung 186 425, basierend auf der U. S. Patentanmeldung 685 824, einen rekombinanten DNA-Expressionsvektor, welcher (a) eine Transskriptionseinheit, flankiert von an der T-DNA angrenzenden Sequenzen, die eine Promotorsequenz und benachbarte, die Amino-terminale Region codierende Sequenzen und eine Terminatorsignalsequenz, bei der die Sequenzen aus einem oder mehreren Genen, die natürli cherweise in einer Pflanzenzelle exprimiert werden, erhalten worden sind, umfaßt, und (b) eine Sequenz, die für ein antibiotisches Resistenzgen codiert, angeordnet zwischen der Promotorsequenz und der benachbarten Sequenz, die für die Amino-terminale Region codiert, und der Terminatorsequenz, und (c) ein DNA-Fragment, das ein Replikon enthält, das in Agrobacterium funktional ist.
Die PCT-Anmeldung 8807087, basierend auf der US Patentanmeldung 168 109, offenbart ein rekombinantes Virusexpressionssystem, welches einen Heliothis-Polyhedrin-Promotor und eine Nukleotidsequenz, die für ein heterologes Peptid oder Protein codiert, die antimikrobielle Aktivität haben können, umfaßt.
Duvick et al., Abstract Nr. 2730, The FASEB Journal 4 (7) (1990), offenbart die Isolierung eines kleinen, basischen Maissamenpeptids, CMIII, und daß CMIII gegenüber einigen pflanzenpathogenen Pilzen, einschließlich von Maissamenpathogenen, eine hohe inhibitorische Aktivität aufweist. CMIII ist besonders aktiv gegen den pflanzenpathogenen Pilz Sclerotinia, und ebenso gegen das Maissamenpathogen, Fusarium graminearum.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist eine Graphik, die die Resultate einer Cellulosechromatographie von rohem Pflanzenextrakt, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, zeigt.
Fig. 2 ist eine Graphik, die die Resultate der FPLC-Reinigung von rohem Pflanzenextrakt, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, zeigt.
Fig. 3 ist eine Graphik, die die Daten aus einem einzelnen mikrobiellen Inhibierungsexperiment zeigt. Die Inhibition wurde relativ zu Kontrollvertieflingen, die kein Peptid enthielten, ausgewertet, wie in Beispiel 5 beschrieben.
Die Fig. 4, 5 und 6 zeigen die CD-, Absorptions- bzw. Fluoreszenzspektren von cm- III.
Eine DNA-Sequenz, die für CMIII codiert, wurde nun isoliert, cloniert und in eine geeignete Expressionskassette insertiert, um sie in Zellen einer Pflanze einzuführen. Unter einem Gesichtspunkt ist die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren für das Abtöten oder das Inhibieren eines pflanzenpathogenen Mikroorganismus, welcher gegenüber dem antimikrobiellen Polypeptid CMIII mit der Aminosäuresequenz Arg-Ser-Gly-Arg-Gly-Glu-Cys-Arg-Arg-Gln-Cys- Leu-Arg-Arg-His-Glu-Gly-Gln-Pro-Trp-Glu-Thr-Gln-Glu-Cys-Met-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg- Gly-Gly empfindlich ist, umfassend das Bereitstellen von Pflanzen, die insertiert in ihr Genom eine DNA-Sequenz, die für CMIII codiert, im richtigen Leserahmen bezogen auf Transkriptionsinitiations- und Promotorsequenzen aufweisen, die in der Pflanze aktiv sind, um so die Expression einer antimikrobiellen Menge von CMIII in Geweben der Pflanze, die normalerweise durch dieses Pathogen infiziert werden, zu bewirken.
Pflanzen, die für die vorliegende Erfindung in Frage kommen, sind vorzugsweise Pflanzen, die empfindlich sind gegenüber einer Infektion und Schädigung durch einen oder mehrere aus Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme. Aspergillus flavus, Alternaria longipes, Sclerotinia sclerotiorum und Sclerotinia trifoliorum. Diese beinhalten Mais (Zeamais) und Sorghum (Sorghum bicolor. Dies sollte jedoch nicht als begrenzend verstanden werden, insofern als diese Arten zu den kommerziellen Nutzpflanzen gehören, die am schwierigsten in zuverlässiger Weise zu transformieren und zu regenerieren sind, und weil diese Mikroorganismen auch gewisse andere Nutzpflanzen infizieren. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind daher in einfacher Weise mittels konventioneller Techniken auf zahlreiche Pflanzenarten anwendbar, wenn gefunden wird, daß sie gegenüber den oben aufgelisteten Pflanzenschädlingen anfällig sind, einschließlich, aber nicht begrenzt, Arten aus den Familien Fragaria, Lotus, Medicago, Onob ·rychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manicot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersionn, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hemerocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browallia, Glycine, Lolium, Triticum und Datura.
Bevorzugte Pflanzen, die entsprechend den Verfahren der vorliegenden Erfindung transformiert werden sollen, sind Getreidenutzpflanzen, einschließlich Mais, Roggen, Gerste, Weizen, Sorghum, Hafer, Hirse, Reis, Triticale, Sonnenblume, Alfalfa, Raps und Sojabohne.
Da die Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Übertragung von Resistenz gegenüber einem Mikroorganismus, gegenüber dem eine Pflanze anfällig ist, ist, wird im allgemeinen in den meisten Fällen CMIII nicht nativ in der Pflanze vorkommen, d. h. das CMIII-Gen wird aus einer anderen Art stammen als der transformierten Pflanze. Bei Arten jedoch, die CMIII produzieren, aber in geringeren als antimikrobiellen Mengen, kann es bevorzugt sein, das Gen für CMIII unter die Kontrolle eines starken konstituiven Promotors zu insertieren, um so eine Überproduktion von CMIII zu bewirken, wodurch antimikrobielle Spiegel erreicht werden und eine effektive Krankheitsresistenz übertragen wird. Alternativ kann, wenn eine Pflanze zwar CMIII produziert, das CMIII aber nicht in den Geweben produziert oder verteilt wird, die normalerweise von der Erkrankung betroffen sind, ein gewebespezifischer Promotor verwendet werden, um eine lokalisierte Expression oder Überproduktion von CMIII zu ermöglichen. Ein gewebespezifischer Promotor kann immer verwendet werden, wenn es wünschenswert erscheint, die Produktion von CMIII in einem infizierten Gewebe oder einem Gewebe, welches CMIII effizient produzieren kann, zu lokalisieren.
Eine DNA-Sequenz, die für CMIII codiert, kann beispielsweise durch Durchmustern einer genomischen oder einer cDNA-Bibliothek aus Mais mit Oligonukleotidsonden erhalten werden, wie in Beispiel 3 beschrieben, und die DNA-Sequenz kann in eine ausgewählte Pflanzenexpressionskassette eingeführt werden.
Alternativ kann auf Basis der hier bereitgestellten Aminosäuresequenz von CMIII eine synthetische DNA-Sequenz, die für CMIII codiert, unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden und in eine geeignete Pflanzenexpressionskassette insertiert werden.
Zahlreiche Pflanzenexpressionskassetten und Vektoren sind im Fachgebiet gut bekannt. Mit "Expressionskassette" ist ein kompletter Satz von Kontrollsequenzen, einschließlich Initiations-, Promotor- und Terminationssequenzen gemeint, die in einer Pflanzenzelle funktionieren, wenn sie ein Strukturgen in dem richtigen Leserahmen flankieren. Expressionskassetten enhalten oft und bevorzugt ein Sortiment an Restriktionsschnittstellen, die geeignet sind für das Schneiden und die Insertion von irgendeinem gewünschten Strukturgen. Es ist wichtig, daß das clonierte Gen ein Startcodon in dem korrekten Leserahmen für die strukturelle Sequenz besitzt. Zusätzlich beinhaltet die Pflanzenexpressionskassette bevorzugt eine Sequenz für einen starken konstitutiven Promotor an einem Ende, um die Transkription des Gens mit hoher Frequenz zu bewirken, und eine Poly-A-Erkennungssequenz am anderen Ende, um ein korrektes Prozessieren und den Transport der Boten-RNA zu ermöglichen. Ein Beispiel für eine solche bevorzugte (leere) Expressionskassette, in welche die cDNA der vorliegenden Erfindung insertiert werden kann, ist das pPHI414-Plasmid, welches von Beach et al. von Pioneer Hi-Bred International, Inc., Johnston, IA, entwickelt wurde. Besonders bevorzugte Pflanzenexpressionskassetten werden so ausgestaltet sein, daß sie einen oder mehrere selektierbare Markergene beinhalten, wie Kanamycinresistenz- oder Herbizidtoleranzgene.
Mit "Vektor" ist hier eine DNA Sequenz gemeint, die fähig ist, zu replizieren und ein Fremdgen in einer Wirtszelle zu exprimieren. Typischerweise besitzt der Vektor eine oder mehrere Endonukleaseerkennungsstellen, die in vorhersagbarer Weise durch Verwendung des geeigneten Enzyms geschnitten werden können. Solche Vektoren sind vorzugsweise so konstruiert, daß sie zusätzliche Strukturgensequenzen beinhalten, die eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide verleihen, und welche dann als Marker dienen, um transformierte Zellen zu identifizieren und abzutrennen. Bevorzugte Marker/Selektionsmittel beinhalten Kanamycin, Chlorosulfuron, Phosphonothricin, Hygromycin und Methotrexat. Eine Zelle, in welcher das fremde genetische Material in einem Vektor funktional exprimiert wird, wurde durch den Vektor "transformiert" und wird "Transformant" genannt.
Ein besonders bevorzugter Vektor ist ein Plasmid, womit ein kreisförmiges doppelsträngiges DNA-Molekül gemeint ist, welches nicht Teil des Chromosoms der Zelle ist.
Wie oben erwähnt, können sowohl genomische DNA als auch cDNA, die für CMIII codieren, in der vorliegenden Erfindung verwandt werden. Der interessierende Vektor kann auch teilweise aus einem cDNA-Clon und teilweise aus einem genomischen Clon konstruiert sein. Wenn das interessierende Gen isoliert worden ist, werden genetische Konstrukte hergestellt, die die notwendigen regulatorischen Sequenzen enthalten, um eine effiziente Expression des Gens in der Wirtszelle zu gewährleisten. Entsprechend der vorliegenden Erfindung, wird das genetische Konstrukt (a) eine erste genetische Sequenz, die für CMIII codiert, und (b) eine oder mehrere regulatorische Sequenzen, die funktionsfähig verbunden sind, auf einer der beiden Seiten des interessierenden Strukturgens, enthalten. Typischerweise werden die regulatorischen Sequenzen aus einer Gruppe, bestehend aus Promotoren und Terminatoren, ausgewählt sein. Die regulatorischen Sequenzen können von autologen oder heterologen Quellen stammen.
Promotoren, die für die genetische Sequenz verwendet werden können, beinhalten Nos-, Ocs- und CaMV-Promotoren.
Ein effizienter Pflanzenpromotor, der verwendet werden kann, ist ein überproduzierender Pflanzenpromotor. Überproduzierende Pflanezenpromotoren, die in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können, umfassen den Promotor der kleinen Untereinheit (small sub-unit; ss), der Ribulose-1,5-biphosphatcarboxylase aus Sojabohne (Berry-Lowe et al., J. Molecular and App. Gen., 1 : 483-498 (1982)) und den Promotor des Chlorophyll a-b-bindenden Proteins. Von diesen zwei Promotoren ist bekannt, daß sie lichtinduziert sind, in eukaryotischen Pflanzenzellen (siehe beispielsweise Genetic Engineering of Plants, An Agricultural Perspective, A. Cashmore, Pelham, New York, 1983, S. 29-38, G. Coruzzi et al., J. Biol. Chem., 258: 1399 (1983) und P. Dunsmuir et al., J. Molecular and App. Gen., 2: 285 (1983)).
Die das Strukturgen für CMIII, funktionsfähig verbunden mit den gewünschten Kontrollsequenzen, enthaltende Expressionskassette kann in einen geeigneten Cloniervektor ligiert werden. Im allgemeinen werden Plasmid- oder virale (Bakteriophagen) Vektoren, die die Replikations- und Kontrollsequenzen enthalten, die von Arten stammen, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, verwendet. Der Cloniervektor wird typischerweise einen Replikationsursprung tragen, wie auch spezifische Gene, die fähig sind, in transformierten Wirtszellen phenotypische Selektionsmarker bereitzustellen. Typischerweise werden Gene, die eine Resistenz gegenüber von Antibiotika oder ausgewählten Herbiziden übertragen, verwendet. Nachdem das genetische Material in die Zielzellen eingeführt ist, können erfolgreich transformierte Zellen und/oder Kolonien von Zellen durch Selektion auf Basis dieser Marker isoliert werden.
Typischerweise wird eine Zwischenwirtszelle in Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Kopienzahl des Cloniervektors zu erhöhen. Mit einer erhöhten Kopienanzahl kann der Vektor, der das interessierende Gen enthält, in signifikanten Mengen für die Einführung in die gewünschten Pflanzenzellen isoliert werden. Wirtszellen, die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Prokaryoten, einschließlich bakterieller Wirte, wie E. coli, S. typhimurium und Serratia marcescens. Eukaryotische Wirte, wie Hefe oder filamentöse Pilze, können ebenso im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Da diese Wirte auch Mikroorganismen sind, wird es von hoher Wichtigkeit sein, sicherzustellen, daß Pflanzenpromotoren, die eine Expression von CMIII in Bakterien nicht bewirken, im Vektor verwendet werden.
Der isolierte Cloniervektor wird dann in die Pflanzenzelle unter Verwendung irgendeiner geeigneten Technik, einschließlich Elektroporation (in Protoplasten), Retroviren, Bombardierung und Mikroinjektion, eingeführt werden, in Zellen aus monocotyledonen oder dicotyledonen Pflanzen, in Zell- oder Gewebekultur, um transformierte Pflanzenzellen bereitzustellen, die äls Fremd-DNA mindestens eine Kopie der DNA-Sequenz der Pflanzenexpressionskassette enthal ten. Vorzugsweise wird die monocotyledone Art ausgewählt sein aus Mais, Sorghum, Weizen und Reis und die dicotyledone Art wird ausgewählt sein aus Sojabohne, Alfalfa, Tabak und Tomate. Unter Verwendung bekannter Techniken können Protoplasten regeneriert werden und Zell- oder Gewebekultur kann regeneriert werden, um vollständige und fruchtbare Pflanzen zu bilden, welche das Gen für CMIII tragen und exprimieren. Entsprechend ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform für die vorliegende Erfindung eine transformierte Maispflanze, deren Zellen als Fremd-DNA mindestens eine Kopie der DNA-Sequenz einer erfindungsgemäßen Expressionskassette enthalten.
Schließlich stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit zum Verleihen von Resistenz gegenüber von Krankheiten, bewirkt durch Mikroorganismen, ausgewählt aus Fusarium raminearum, Fusarium moniliforme, Aspergillus flavus, Alternaria longipes, Sclerotinia sclerotiorum und Sclerotinia trifoliorum auf Pflanzen eines dafür anfälligen Taxons, umfassend die Stufen:
(a) Kultivieren von Zellen oder Geweben aus mindestens einer Pflanze des Taxons,
(b) Einführen in die Zellen der Zell- oder Gewebekultur von mindestens einer Kopie einer Expressionskassette, umfassend ein Strukturgen für CMIII, funktionsfähig verbunden mit pflanzenregulatorischen Sequenzen, welche die Expression des CMIII-Strukturgens in den Zellen bewirken, und
(c) Regenerieren krankheitsresistenter, vollständiger Pflanzen aus der Zell- oder Gewebekultur. Sobald vollständige Pflanzen erhalten worden sind, können sie in einer solchen Weise sexuell oder clonal reproduziert werden, daß mindestens eine Kopie der durch die Expressionskassette bereitgestellten Sequenz in den Zellen der Nachkommenschaft der Vermehrung vorhanden ist.
Alternativ können konventionelle Pflanzenzüchtungsverfahren verwendet werden, sobald eine einzelne transformierte Pflanze durch die vorstehenden rekombinanten DNA-Verfahren erhalten wurde, um das CMIII-Strukturgen und die assoziierten regulatorischen Sequenzen über Kreuzung und Rückkreuzung zu transferieren. Solche intermediären Verfahren werden die weiteren Stufen umfassen:
(a) Sexuelles Kreuzen der krankheitsresistenten Pflanze mit einer Pflanze aus dem krankheitsempfänglichen Taxon;
(b) Gewinnen von reproduktivem Material aus der Kreuzungsnachkommenschaft; und
(c) Züchten von krankheitsresistenten Pflanzen aus dem reproduktiven Material. Wo wünschenswert oder notwendig, können die agronomischen Eigenschaften des empfindlichen Taxons im wesentlichen erhalten werden, indem dieses Verfahren darauf ausgedehnt wird, die weiteren Stufen wiederholt durchzuführen:
(a) Rückkreuzen der krankheitsresistenten Nachkommenschaft mit krankheitsempfindlichen Pflanzen des empfindlichen Taxons; und
(b) Selektieren auf Expression von antimikrobieller Aktivität (oder einem assoziierten Markergen) unter der Nachkommenschaft der Rückkreuzung, bis der gewünschte Prozentsatz der Eigenschaften des empfindlichen Taxons in der Nachkommenschaft zusammen mit dem Gen, welches antimikrobielle Aktivität verleiht, vorliegen.
Mit "Taxon" ist hier eine Einheit der botanischen Klassifikation gemeint, die der "Gattung" oder einer darunterstehenden Einheit entspricht. Dieser Begriff beinhaltet daher Gattung, Art, Sorte, Varietät, Variante und andere niedrige taxonomische Gruppen, denen eine konsistente Nomenklatur fehlt.
Der Fachmann wird es außerdem zu würdigen wissen, daß die hier bereitgestellten Pflanzenvektoren in Agrobacterium tumefaciens eingebaut werden können, der dann verwendet werden kann, um den Vektor in empfängliche Pflanzenzellen zu transferieren, primär in solche Zellen aus dicotyledonen Arten. Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zum Übertragen von antimikrobieller Aktivität und Krankheitsresistenz in Agrobacteriuim tumefaciens-empfänglichen dicotyledonen Pflanzen bereit, bei denen die Expressionskassette in die Zellen durch Infektion der Zellen mit Agrobacteriuim tumefaciens eingeführt wird, von dem ein Plasmid modifiziert wurde, so daß es eine erfindungsgemäße Pflanezenexpressionskassette enthält.
Die folgende Beschreibung liefert weitere Beispiele der Zusammensetzungen dieser Erfindung und der VerFahren, diese herzustellen und zu verwenden. Es wird jedoch verstanden werden, daß andere Verfahren, die dem Fachmann als äquivalent bekannt sind, ebenso verwendet werden können.

Beispiel 1

Reinigung von CMIII

CMIII wurde aus zwei Quellen, der öffentlichen Kornvarietät B 73 und der gesetzlich geschützten Maisvarietät MH18 wie folgt erhalten:
Gemahlene Maiskörner wurden bei Raumtemperatur mit 0,1 N H&sub2;SO&sub4; extrahiert. Der resultierende Extrakt wurde neutralisiert und zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Der Extrakt wurde auf pH 5,2 eingestellt und auf einer Carboxymethylcellulose- Kationenaustauschsäule chromatographiert, die mit 0,3 M Ammoniumacetat äquilibriert worden war, und es wurde mit einem Ammoniumacetatgradienten von 0,4 zu 1,0 M (Fig. 1) eluiert. CMIII eluierte bei etwa 0,8 M in einer Serie von A280 Peaks, die auch andere Peptide ähnlicher Größe und Eigenschaften beinhaltet.
CMIII kann auch durch Chromatographie an einer Mono-S-Kationenaustausch-FPLC- Säule (Pharmacia) mit einem ähnlichen Ammoniumacetatgradienten gereinigt werden. Der Peak MS-16 entspricht in Fig. 2 CMIII.
CMIII eluiert als ein einzelner UV-absorbierender Haupt-Peak von einer "Reverse phase"-HPLC-Säule (C&sub1;&sub8;, äquilibriert mit 0,1% TFA ein 10-40%iger Gradient AcetonitriUO,1% TFA), wodurch ein Hinweis geliefert wird, daß es im wesentlichen frei von kontaminierenden Proteinen oder Peptiden ist.

Beispiel 2

Charakterisierung von CMIII

CMIII wanderte sowohl in einem STS-Harnstoff- und einem STS-TRIS- Tricinpolyacrylamidgel-System, als eine einzelne Coomassieblau-färbende Bande mit einer relativen Beweglichkeit, die ein Molekulargewicht von 4000 Dalton anzeigte. Die Aminosäureanalyse zeigte einen hohen Anteil von Arginin (10 Reste/mol), Glutamat/Glutamin (7 Reste/mol) und Cystein (4 Reste/mol).
Tryptophan, das durch die Aminosäureanalyse nicht nachgewiesen wird, wurde mittels quantitativer Oxidation mit N-Brom-Succinimid nachgewiesen (annähernd 1 Rest/mol). Die Zirkulardichroismusspektroskopie zeigt einen hohen alpha-helikalen Anteil.
Die ersten 24 N-terminalen Aminosäuren von CMIII wurden durch Sequenzieren von Peptid, welches von TRIS-Tricin-SDS-PAGE-Gelen auf Immobilon P Polyvinylidinfluorid- Membranen geblottet war, identifiziert. Zusätzlich wurden fünf Endo-Gluc-C-Fragmente von CMIII durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt und sequenziert, womit die Peptidsequenz zu einer Gesamtzahl von 34 Resten, mit einem Gesamtmolekulargewicht von annäherend 3900 Daltons bestätigt und vorläufig erweitert wurde. Somit wurde gefunden, daß CMIII die Aminosäuresequenz besitzt: Arg-Ser-Gly-Arg-Gly-Glu-Cys-Arg-Arg-Gln-Cys-Leu-Arg-Arg-His-Glu-Gly-Gln- Pro-Trp-Glu-Thr-Gln-Glu-Cys-Met-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg-Gly-Gly.
Aus dieser Analyse kann entnommen werden, daß CMIII strukturell unterschiedlich von irgendeinem anderen der Thionine aus monocotyledonen Pflanzen ist, die im Gegensatz zu CMI- II einen hohen Lysingehalt und einen niedrigen Arginingehalt aufweisen. CMIII weist eine überraschende Ähnlichkeit zu einem antimikrobiellen Peptid aus Säugern auf, dem Defensin NP1 aus Kaninchen, obwohl CMIII einen wesentlich höheren Glutamatgehalt aufweist und 4 anstelle von 6 Cysteinen besitzt. Es gibt daher leichte Ähnlichkeit zu einem basischen Peptid aus Kürbissamen (Naisbitt et' al., Plant Physiol. 1988, 88: 770), welches einen hohen Arginin- bzw. Glutamat/Glutamingehalt aufweist, dem jedoch Cystein fehlt.
CMIII wurde weiterhin mittels seiner CD-, UV-Absorptions- und Fluoreszenzspektren charakterisiert, wie in den Fig. 4, 5 und 6 gezeigt.

Beispiel 3

Identifikation des CMIII-Gens und Insertion in Bakterien

Die Aminosäuresequenz von CMIII beinhaltet einige Abschnitte, die dazu geeignet sind, synthetische, degenerierte Oligonukleotidsonden zu konstruieren; ein Beispiel hierfür ist der Rest 20-26 (Try-Glu-Thr-Gln-Glu-Cys-Met-Arg), der durch die Nukleotidsequenz TGG GAR ACN CAR GAR TGY ATG MG codiert wird, wobei Y = T oder C, R = A oder G, M = A oder C, und N = A, G, T oder C. Ein anderer, überlappender Abschnitt ist Rest 15-21 (His-Glu-Gly-Gln- Pro-Tryp-Glu-Thr), der durch die folgende Nukleotidsequenz codiert werden kann: CAY GAR GGN CAR CCN TGG GAR AC. Diese Oligonukleotide werden mit 32P entmarkiert und zum Durchmustern einer genomischen oder einer cDNA-Bibliothek aus Mais verwendet. Clone, die mit beiden Sonden hybridisieren, werden in einen geeigneten einzelsträngigen Phagenvektor, wie den Bluescript KS+ subcloniert, die Restriktionsschnittstellen in der clonierten DNA werden kartiert, und die mit dem CMIII-Gen korrespondierende Region wird durch Southern-Blot- Analyse der Restriktionsfragmente unter Verwendung der Oligonukleotide als Sonden identifiziert. Die CMIII-Genregion wird subcloniert und sequenziert, um ihre Identität zu bestätigen und um den offenen Leserahmen für die Proteinsynthese zu bestimmen. Schlußendlich werden Restriktionsschnittstellen an beiden Enden des offenen Leserahmens durch gerichtete Mutagenese verändert, um die Einführung des Gens in eine Pflanzenexpressionskassette zu erlauben. Alternativ kann logischerweise ein vollständiges synthetisches Gen aus der hier für das CMIII-Protein angegebenen Sequenz konstruiert werden.

Beispiel 4

Expression des CMIII-Gens in Pflanzen

Eine Pflanzenexpressionskassette mit den regulatorischen Sequenzen, die von Beach et al. entwickelt wurden, und die weiterhin das CMIII-Gen enthält, wird konstruiert. Das bevorzugte Plasmid, pPHI414 genannt, enthält einen verstärkten 35S-Promotor, der sich über die Nukleotide -421 bis +2 des Cauliflower-Mosaik-Virus erstreckt, wobei die Region von -421 bis -90 im Tandem dupliziert wurde, ein 79 bp-HindIII-SaII-Fragment aus pilII101, welches sich über die 5'-Leadersequenz des Tabak-Mosaik-Virus erstreckt, ein 579 bp-Fragment, welches sich über das erste Intron aus dem Mais-AdH1-S-Gen erstreckt, und ein 281 bp-Fragment, welches sich über die Polyadenylierungsstelle des Nopalinsynthasegens aus pTiT37 erstreckt. Ein anderes Konstrukt, das als Expressionskassette verwendet werden kann, ist das pPHI412-Plasmid. Es unterscheidet sich von pPHI414 darin, daß ihm das AdH-Intronsegment fehlt. Es wird jedoch, wie pPHI414 so konstruiert, daß es zahlreiche Restriktionsschnittstellen zwischen dem O'-Segment und dem NOS-Segment aufweist; diese Schnittstellen können in bequemer Weise verwendet werden, um das CMIII-Strukturgen in Position einzusetzen.
Dieser Vektor kann mit einem ähnlichen Plasmid in Protoplasten aus schwarzem mexikanischen Süßmais ("Black Mexican Sweet corn") durch Elektroporation zusammen mit einem ähnlichen Plasmid, welches einen selektierbaren Antibiotikaresistenzmarker enthält, cotransformiert werden. Diese Protoplasten können dann durch konventionelle Techniken so induziert werden, daß sie Zellwände regenerieren und sich zu einem Kallus entwickeln. Zusätzlich kann dieser Kallus dann einer antibiotischen Selektion unterzogen werden, um transformierte Kolonien zu selektieren, und diese Kolonien können dann auf die Expression des CMIII unter Verwendung bekannter Methoden mit Hilfe von Antiseren gegen das entsprechende CMIII getestet werden. Die Wirksamkeit des Schutzes kann gemessen werden, indem der Kallus (oder aus dem Kallus erhaltene Suspensionskulturen) mit dem Zielmikroorganismus infiziert wird (werden) und der überlebende Prozentsatz gemessen wird.
Das CMIII-Gen kann in einen embryogenen Maiskallus durch ähnliche Methoden wie denen, die bei Black Mexican Sweet verwendet wurden, eingeführt werden. Ein embryogeni scher Kallus kann zu vollständigen fruchtbaren Pflanzen regeneriert werden. Die antimikrobielle Aktivität und die Krankheitsresistenz, die durch die endogene Produktion des CMIII verliehen werden, sind einfach vererbte, dominante Eigenschaften und können, falls nötig, in andere Pflanzenvarietäten einfach durch Kreuzen oder Rückkreuzen eingeführt werden.
Der Begriff "antimikrobielle Menge" bedeutet, sowie wie er hier verwendet wird, daß mindestens eine LD&sub5;&sub0; des CMIII bei einem Zielorganismus gemessen wird.

Beispiel 5

Empfindlichkeit von Mikroorganismen gegenüber CMIII

Es wurde gefunden, daß CMIII in Sporengerminations- und Hyphenwachstumstests, durchgeführt an pflanzenpathogenen Pilzen, inhibitorische Aktivität gegenüber Fusarium graminearum, Sclerotinia sclerotiorum und Sclerotinia trifoliorum bei einer Konzentration von 112 ug/ml aufweist. Andere Pilze, einschließlich Fusarium moniliforme und Aspergillus flavus waren bei dieser Konzentration leicht inhibiert. Die CMIII-Aktivität wird in Gegenwart von Pflanzenzellextrakten wesentlich reduziert.
Etwa 150 Konidien oder etwa 5 bis 10 Mycelfragmente wurden in 90 Mikrolitern Kulturmedium in Mikrotiterplattenvertiefungen inkubiert. Das Kulturmedium war ein Wachstumsmedium, welches 0,25% Hefeextrakt, 0,1% Kaseinhydrolysat, 1% Glucose, 0,025% Calciumnitrat, 0,005% Kaliumphosphat und 0,00625% Magnesiumsulfat enthielt. Die Testkonzentration an Peptid wurde in 10 Mikroliter Wasser oder Puffer zugesetzt, und die Platten wurden 1 bis 3 Tage bei 28ºC inkubiert. Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Vertiefungen untersucht und myceliales Wachstum wurde gegenüber Kontrollvertiefungen wie folgt bewertet:
0 = Keine Inhibition
1 = Leichte Inhibition
2 = Moderate Inhibition
3 = Fast vollständige Inhibition
4 = Vollständige Inhibition
Die Resultate einer solchen Untersuchung sind in Fig. 3 gezeigt.
In anderen Untersuchungen wurde gezeigt, daß Alternaria longipes der sensitivste Pilz gegenüber der Wirkung von CMIII ist, und eine spürbare Inhibition bei einer Konzentration von 1,9 uM zeigt. Aspergillus flavus war der resistenteste Pilz und zeigte eine leichte Inhibition bei einer Konzentration von 122 uM. Die Maissamenpathogene Fusarium graminearum und Fusarium moniliforme wurden spürbar bei Konzentrationen ab 2,8 uM inhibiert, obwohl F. moniliforme selbst bei einer Konzentration von 122 uM nicht vollständig inhibiert wurde. Sclerotinia- Isolate wurden bei höheren Konzentrationen stark inhibiert, aber bei niedrigeren Konzentrationen (unterhalb von 30,4 uM bei S. sclerotiorum und unterhalb 15,2 uM bei S. trifoliorum) wurde eine Inhibition nicht beobachtet.
Bei noch einer weiteren Studie wurde A. longipes durch CMIII in einer Konzentration von 3 uM nicht beeinflußt.
Zusammenfassend wirkt CMIII auf einen weiten Bereich von Pflanzenpathogenen inhibitorisch, obwohl die Inhibitionsprofile von Pathogen zu Pathogen stark variieren.

Claims

1. Verfahren zum Abtöten oder Inhibieren eines pflanzenpathogenen Mikroorganismus, welcher gegenüber dem antimikrobiellen Polypeptid CMIII mit der Aminosäuresequenz Arg-Ser- Gly-Arg-Gly-Glu-Cys-Arg-Arg-Gln-Cys-Leu-Arg-Arg-His-Glu-Gly- Gln-Pro-Trp-Glu-Thr-Gln-Glu-Cys-Met-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg- Gly-Gly empfindlich ist, umfassend das Zurverfügungstellen von Pflanzen, die in ihrem Genom eine DNA-Sequenz insertiert haben, die für CMIII codiert, im richtigen Leserahmen bezogen auf Transskriptions-, Initiations- und Promotorsequenzen, die in der Pflanze aktiv sind, so daß die Expression einer antimikrobiellen Menge von CMIII in Geweben der Pflanze bewirkt wird, welche normalerweise durch dieses Pathogen infiziert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der besagte Mikroorganismus Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme, Aspergillus flavus, Alternaria longipes, Sclerotinia sclerotiorum oder Sclerotinia trifoliorum ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei diese Pflanzen monocotyledone Arten sind, ausgewählt aus Weizen, Reis und Sorghum.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiterhin umfassend die Stufen:

a) Kultivieren von Zellen oder Geweben aus einer Pflanze,

b) Einführen in die Zellen der Zell- oder Gewebekultur von mindestens einer Kopie einer Expressionskassette, umfassend eine Sequenz, die für CMIII codiert, und

c) Regenerieren geschützter vollständiger Pflanzen aus der Zell- oder Gewebekültur.

5. Verfahren nach Anspruch 4, welches den weiteren Schritt des sexuellen oder klonalen Vermehrens der vollständigen Pflanze in einer solchen Weise umfaßt, daß mindestens eine Kopie der durch die Expressionskassette bereitgestellten Sequenz in den Zellen der Nachkommenschaft der Vermehrung vorhanden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, bei dem die Expressionskassette in die Zellen durch Elektroporation eingeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, bei dem die Expressionskassette in die Zellen durch Mikropartikelbombardierung eingeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, bei dem die Expressionskassette in die Zellen durch Mikroinjektion eingeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5 zur Verleihung von Resistenz gegen Mikroorganismen bei Agrobacterium-tumefaciens-anfälligen dicotyledonen Pflanzen, bei dem die Expressionskassette in die Zellen durch Infizieren der Zellen mit Agrobacterium tumefaciens, bei dem ein Plasmid so modifiziert wurde, daß es die Expressionskassette beinhaltet, eingeführt wird.

10. Verfahren zum Übertragen von Resistenz gegen Krankheiten, die durch Pflanzenpathogene ausgewählt aus Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme, Aspergillus flavus, Alternaria longipes, Sclerotinia sclerotiorium und Sclerotinia trifoliorum bewirkt werden, auf Pflanzen eines Taxons, welche anfällig gegenüber diesen Krankheiten sind, umfassend die Stufen:

a) Auswählen einer fruchtbaren, krankheitsresistenten Pflanze, hergestellt aus einer sexuell kompatiblen Pflanze nach einem Verfahren nach Anspruch 4;

b) sexuelles Kreuzen der krankheitsresistenten Pflanze mit einer Pflanze aus dem krankheitsempfänglichen Taxon;

c) Gewinnen von fortpflanzungsfähigem Material aus der Nachkommenschaft der Kreuzung; und

d) Züchten geschützter Pflanzen aus dem fortpflanzungsfähigen Material.

11. Verfahren nach Anspruch 10 zur Übertragung von Krankheitsresistenz und antimikrobieller Aktivität auf ein Taxon, welches aus im wesentlichen homozygoten Pflanzen besteht, umfassend die weiteren wiederholten Stufen:

a) Rückkreuzen der krankheitsresistenten Nachkommenschaft mit im wesentlichen homozygoten, krankheitsanfälligen Pflanzen des Taxons; und

b) Selektionieren auf eine Ausprägung der Krankheitsresistenz und eine antimikrobielle Aktivität hin, zusammen mit den anderen erwünschten Eigenschaften des anfälligen Taxons aus der Nachkommenschaft der Rückkreuzung, bis der gewünschte Prozentsatz der Eigenschaften des anfälligen Taxons in der Nachkommenschaft zusammen mit Krankheitsresistenz und antimikrobieller Aktivität vorhanden sind.

12. Rekominante DNA, welche im wesentlichen ausschließlich für CMIII codiert, welches die Aminosäuresequenz Arg-Ser-Gly- Arg-Gly-Glu-Cys-Arg-Arg-Gln-Cys-Leu-Arg-Arg-His-Glu-Gly-Gln- Pro-Trp-Glu-Thr-Gln-Glu-Cys-Met-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg-Gly- Gly aufweist.

13. Rekombinante DNA nach Anspruch 12, welche eine Expressionskassette umfaßt, worin die für CMIII codierende Sequenz funktionsfähig verknüpft ist mit bakteriellen expressionsregulatorischen Sequenzen, die die Expression von CMIII in bakteriellen Zellen bewirken.

14. Bakterielle Zellen, enthaltend als ein fremdes Plasmid mindestens eine Kopie einer Expressionskassette nach Anspruch 13.

15. Rekombinante DNA nach Anspruch 12, welche eine Expressionskassette umfaßt, worin die für CMIII codierende Sequenz funktionsfähig verknüpft ist mit pflanzenregulatorischen Sequenzen, welche die Expression von CMIII in Pflanzenzellen bewirken.

16. Transformierte Pflanzenzellen, enthaltend als Fremd-DNA mindestens eine Kopie der DNA-Sequenz einer Expressionskasnette nach Anspruch 15.

17. Transformierte Zellen nach Anspruch 16, welche Zellen einer monocotyledonen Art sind.

18. Transformierte Zellen nach Anspruch 17, welche Mais-, Sorghum-, Weizen- oder Reiszellen sind.

19. Transformierte Zellen nach Anspruch 16, welche Zellen einer dicotyledonen Art sind.

20. Transformierte Zellen nach Anspruch 19, welche Sojabohnen-, Alfalfa-, Tabak- oder Tomatenzellen sind.

21. Eine Maiszellen- oder Maisgewebekultur, umfassend Zellen nach Anspruch 18.

22. Transformierte Pflanze, deren Zellen als Fremd-DNA mindestens eine Kopie der DNA-Sequenz einer Expressionskassette nach Anspruch 15 enthalten.

23. Transformierte Pflanze, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11.

24. Transformierte Pflanze nach Anspruch 22 oder 23, welche aus einer in einem der Ansprüche 17 bis 20 definierten Art stammt.

25. Transformierte Pflanze nach Anspruch 24, welche eine Maispflanze ist.

26. Transformierte Pflanze nach einem der Ansprüche 22 bis 25, welche nicht eine Pflanzenvarietät ist.