JPH06228190A

JPH06228190A - 病原性微生物に対して阻害活性を有する天然および合成のタンパク質

Info

Publication number: JPH06228190A
Application number: JP4097522A
Authority: JP
Inventors: Jonathan Duvick; デュビックジョナサン; Tracy Rood; ルードトレイシー
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1991-03-04
Filing date: 1992-03-04
Publication date: 1994-08-16
Also published as: CA2061862A1; EP0502718A1; HU9200711D0; HUT63878A; NZ241814A; AU1139992A

Abstract

(57)【要約】【目的】抗微生物特性を有するペプチドあるいはタンパ
ク質を用いて、植物あるいは動物に病気に対する耐性を
付与する。【構成】抗微生物特性を有する天然あるいは合成のペプ
チドおよびタンパク質に関する。さらに、これらのペプ
チドあるいはタンパク質を含む組成物あるいは、それを
コードする遺伝子を用いて、植物あるいは動物の病原体
微生物を破壊および阻害する方法が提供される。病気に
対して耐性を与えるこのようなタンパク質を発現させる
ように植物を遺伝子的に操作する方法もまた提供され
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明は、植物、ヒトおよび動物
の真菌および他の病原体を破壊および阻害するための材
料および方法、ならびに植物に病気に対する耐性を直接
与えるための材料および方法に関する。

【従来の技術】宿主生物には有害な影響を及ぼさず、病
原体に対して強い効力を有する、新規な殺菌剤の開発に
大きな関心が注がれている。抗微生物活性のある化合物
を探す際に関係する１つの分野は、天然の化合物であ
る。なぜならば、それらは環境中およびヒトおよび他の
動物中で自然のメカニズムによって容易に無毒化され得
るからである。〔ヒトおよびより下等な動物〕細菌および真菌は、ヒト
およびより下等な動物で多くの疾病の原因となってい
る。これらの疾病は、汗庖性白癬の様な軽度の炎症か
ら、重いあるいは致命的な全身感染までの範囲であり得
る。全身的な感染症を処置するのに用いられる薬物、特
に全身的な真菌感染を処置するのに用いられる薬物は、
しばしば処置されるヒトあるいは動物に重い副作用を引
き起こす。したがって、ヒトおよび獣医学の分野で、新
規なそして効果的な抗感染化合物の開発の必要性が引続
き存在している。〔植物〕多くの真菌および細菌は、ヒトおよびより下等
な動物の病原体であるばかりでなく、農作物にとっての
深刻な有害生物でもある。これまでに用いられてきた植
物の病気を制御する方法の１つは、抗微生物性の有機化
学物質あるいは半有機化学物質を作物に適用することで
あった。この方法は、多くの当該分野で認識されている
問題を有している。有害微生物を制御する最近の方法
は、典型的には、問題となる微生物の自然の競合物ある
いは阻害物である生物学的な制御微生物の使用である。
しかし、生物学的な制御微生物を広範囲に適用すること
は困難であり、そしてそれらの生きている微生物を処理
される場所に長期間とどめることはさらに困難である。
さらに最近では、組み換えＤＮＡ技術によって、植物細
胞中でタンパク質を発現するクローン化された遺伝子を
植物細胞に挿入する機会が提供されている、抗微生物活
性を有することが知られているタンパク質が存在する。
しかし、この技術は、特に、場所によって起こり得る高
い選択圧のもとでは、良く知られている天然の抗微生物
剤に対する微生物耐性についてさらに別の問題を起こ
す。従って、単一の構造遺伝子の翻訳によって、直接に
植物細胞により形成され得る、さらなる天然の抗微生物
化合物を同定する必要性が、継続して存在する。米国特
許出願第７２５，３６８号に基づく、欧州特許出願第２
０４，５９０号は、異種外来の構造遺伝子の発現を制御
するために、植物細胞を遺伝子的に改変する方法を記載
している。その方法では、植物細胞をｐＲｉＴ−ＤＮ
Ａプロモーターおよび異種外来の構造遺伝子を含むよう
に形質転換する。そのプロモーターおよび構造遺伝子
は、構造遺伝子がそのプロモーターの制御下で植物中で
発現し得るようなお互いの位置および方向で存在する。
同様に、米国特許出願第６８５，８２４号に基づく、欧
州特許出願第１８６，４２５号には、以下の（ａ）、
（ｂ）および（ｃ）を含む組み換えＤＮＡ発現ベクター
が記載されている：（ａ）Ｔ−ＤＮＡの境界配列がフラ
ンキングしている転写ユニットであって、植物細胞中で
自然に発現される１つあるいはそれ以上の遺伝子由来の
配列である、プロモーターおよび関連したアミノ末端領
域をコードする配列、ターミネーターシグナル配列を含
有する、ユニット；および（ｂ）プロモーターおよび関
連アミノ末端領域のコード配列およびターミネーター配
列との間に位置する抗生物質耐性遺伝子のコード配列；
および（ｃ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ）で機能するレプリコンを含むＤＮＡフラグ
メント。米国特許出願第１６８，１０９号に基づくＰＣ
Ｔ出願第８８０７０８７号には、ヘリオシスポリヘドリ
ン（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）のプ
ロモーター、および抗微生物活性を有し得る異種ペプチ
ドあるいはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を
含有する組み換えウィルス発現システムが開示されてい
る。

【発明の要旨】本発明では、ある種の天然および合成の
タンパク質が多くの一般的な病原体に対する抗微生物活
性を有することが測定された。従って本発明は、これら
のタンパク質を含む組成物、およびヒト、動物および植
物の病原体に対してそれらのタンパク質およびそれらを
含む組成物を用いる方法に対し広く関与する。とりわけ
病気および他の病疫に対する耐性を与える、タンパク質
を発現するために植物を遺伝子的に操作することが可能
であり、そして望み得ると現在考えられている。従っ
て、本発明はまた、これらのタンパク質の１つあるいは
それ以上を発現するこことによって、病気および他の有
害生物に耐性を有する植物をつくる方法、およびそれに
よってつくられた細胞および植物に広く関与する。

【発明の構成】下記のものからなる群のタンパク質が、
多くの一般的な病原体に対する強い抗微生物活性を有す
ることが決定された：デフェンジン（Ｄｅｆｅｎｓｉ
ｎ）ＮＰ１、マガイニン（Ｍａｇａｉｎｉｎ）−２、
マガイニン−Ａ、マガイニン−Ｇ、α−ホルドチオニン
（Ｈｏｒｄｏｔｈｉｏｎｉｎ）、β−プロチオニン（Ｐ
ｕｒｏｔｈｉｏｎｉｎ）、メリチン、ポリ−Ｌ−リシン
ＨＢｒ、ポリ−Ｌ−アルギニンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−
ヒスチジン、副腎皮質刺激ホルモン１−１７、副腎皮質
刺激ホルモン１−２４、カテプシンＧ、β−ホルドチ
オニン、好酸球主要塩基性タンパク質（Ｅｏｓｉｎｏｐ
ｈｉｌＭａｊｏｒＢａｓｉｃＰｒｏｔｅｉｎ）、
好酸球カチオンタンパク質（ＥｏｓｉｎｏｐｈｉｌＣ
ａｔｉｏｎｉｃＰｒｏｔｅｉｎ）、ポリ−Ｌ−リシン
ＨＣｌ、ポリ−Ｄ−リシン、好酸球パーオキシダー
ゼ、クロタミン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、クエン酸
シンターゼ、マストパラン（Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ）、
イラクサレクチン（ＳｔｉｎｇｉｎｇＮｅｔｔｌｅ
Ｌｅｃｔｉｎ）、カシニン（Ｋａｓｓｉｎｉｎ）、ライ
ティカーゼ（Ｌｙｔｉｃａｓｅ）、サイトヘリカーゼ
（Ｃｙｔｏｅｌｉｃａｓｅ）、ペニシリナーゼ（Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｎａｓｅ）、リゾチーム、Ｐｒｏ−Ｈｉｓ
−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ −Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ
−Ｔｙｒ−Ｌｙｓおよびそれらの混合物。これらのタン
パク質は、特に下記の群の病原体に対して活性である：
Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ、Ｄｐｌｏｄｉａ
ｍａｙｄｉｓ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇ
ｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍａ
ｌｂｏ−ａｔｒｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｍｅ
ｇａｓｐｅｒｍａｅｆ．ｓｐ．ｇｌｙｃｉｎｅａ、Ｍ
ａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａｐｈａｓｅｏｌｉｎａ、Ｄｉ
ａｐｏｒｔｈｅｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍｃａｕｌｉ
ｖｏｒａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉ
ｏｒｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｔｒｉｆｏｌｉｏ
ｒｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓおよび
Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｌｏｎｇｉｐｅｓ。従って、本
発明は、前記の群から選択される微生物を含む感受性の
病原体を破壊あるいは阻害する方法を提供する。この方
法は、以下のものからなる群から選択されるタンパク質
の抗微生物量を、この微生物の環境下に導入する工程を
包含する：デフェンジンＮＰ１、マガイニン−２、マ
ガイニン−Ａ、マガイニン−Ｇ、α−ホルドチオニン、
β−プロチオニオン、メリチチン、ポリ−Ｌ−リシンＨ
Ｂｒ、ポリ−ＬアルギニンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチ
ジン、副腎皮質刺激ホルモン１−１７、副腎皮質刺激
ホルモン１−２４、カテプシンＧ、β−ホルドチオ
ニン、好酸球主要塩基性タンパク質、好酸球カチオンタ
ンパク質、ポリ−Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−Ｄ−リシ
ン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、好酸球パーオキシダー
ゼ、クロタミン、クエン酸シンターゼ、マストパラン、
イラクサレクチン、カシニン、ライティカーゼ、サイト
ヘリカーゼ、ペニシリナーゼ、、リゾチーム、Ｐｒｏ−
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖ
ａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓおよびそれらの混合物。本発明は
また、感受性の微生物によって引き起こされた、ヒト、
より下等な動物、および植物の病気の処置および予防の
ための物質の組成物を提供する。この組成物には、無毒
性のキャリアーと組み合わせて、前述のポリペプチド
を、１つあるいはそれ以上を含有する。本明細書に用い
られている用語「タンパク質」および「ポリペプチド」
は、前述の特定の化合物に対して、相互変換的に用いら
れる。〔植物〕本発明に用いられているポリペプチドは、感受
性の微生物に感染している植物に、スプレー、クリー
ム、粉末あるいは抗菌剤の分野では一般的な他の処方を
含む、任意の都合のよい方法で、効果的に適用され得
る。さらに、このポリペプチドは、処置される植物の組
織に全体的に取り込まれ得るので、病原体は、植物に蔓
延する間に、抗微生物量の抗微生物タンパク質にさらさ
れる。これを行う１つの方法は、感受性植物に全体的に
投与するのに適した植物毒性のない媒体に、このタンパ
ク質を取り込ませることである。この方法は、カプタン
のような殺真菌剤に一般的に用いられ、そして植物の殺
真菌剤の処方の当業者の間でよく用いられる。しかし、
これらのタンパク質をコードする遺伝子は、単離され、
クローン化され、適切な発現カセットに挿入され、そし
て感受性の植物類の細胞に導入され得るため、この方法
の特に好ましい実施態様は、１つあるいはそれ以上の前
述のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、植物内で
活性である転写イニシエーターおよびプロモター配列と
共に、正しいリーディングフレームで、植物のゲノム中
に挿入することを含んでいる。調節配列の制御下でのこ
のＤＮＡ配列の転写および翻訳により、通常病原体に感
染した植物の組織中に、抗微生物レベルの単数あるいは
複数のタンパク質が発現される。植物は、Ｆｕｓａｒｉ
ｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｍ
ｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌ
ａｖｕｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｌｏｎｇｉｐｅｓ、
Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、
およびＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕ
ｍのうち１種あるいはそれ以上によって感染および損傷
しやすい植物が好ましい。これらには、トウモロコシ
（Ｚｅａｍａｙｓ）およびモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ
ｂｉｃｏｌｏｒ）が含まれる。しかし、これを限定と
して解釈してはならない。なぜならば、これら２つの種
は、確実に形質転換しそして再生するのが最も困難な商
業的作物の仲間であり、そしてこれらの病原体はまた、
ある種の他の作物にも感染するからである。従って、上
記掲載の植物病原体に感染しやすいことがわかれば、本
発明の方法は、従来法によって多くの植物類に容易に適
応され得る。これらの病原体には、限定はされないが以
下の属由来の種が含まれる：Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｌｏｔ
ｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、Ｔｒ
ｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｇｎａ、
Ｃｉｔｒｕｓ、Ｌｉｎｕｍ、Ｇｅｒａｎｉｕｍ、Ｍａｎ
ｉｃｏｔ、Ｄａｕｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｉｓ、Ｂｒ
ａｓｓｉｃａ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａ
ｔｒｏｐａ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｈｙｏ
ｓｃｙａｍｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎｎ、Ｎｉｃｏ
ｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｄｉｇ
ｉｔａｌｉｓ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｃｉｃｈｏｒｉｕ
ｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｂｒｏｍ
ｕｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、
Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｎｅｍｅｓｉａ、Ｐｅｌａ
ｒｇｏｎｉｕｍ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕ
ｍ、Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓａｌｐ
ｉｇｌｏｓｓｉｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｂｒｏｗａｌｌｉ
ａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕ
ｍ、およびＤａｔｕｒａ。本発明の方法により形質転換
される好ましい植物は、トウモロコシ、ライムギ、オオ
ムギ、コムギ、モロコシ、オートムギ、キビ、イネ、ラ
イコムギ、ヒマワリ、アルファルファ、アブラナおよび
ダイズを含む禾穀類である。発現したときに抗微生物活
性を与えるＤＮＡ配列は、本明細書に記載した選択され
た単数あるいは複数のタンパク質をコードする構造遺伝
子である。一般的に、本発明の１つの目的は、植物がそ
れに対して感受性である微生物に対する耐性を与えるこ
とであるため、多くの場合、そのタンパク質はその植物
にもともとあるものではない。すなわち、このタンパク
質およびこのタンパク質の遺伝子は、合成されるかある
いは形質転換された植物以外の種由来である。しかし、
これらのタンパク質の１つあるいはそれ以上を産生する
種が、抗微生物量に満たない植物では、このタンパク質
を過剰産生するように、構成プロモーターの強い制御の
下に、選択された単数あるいは複数のタンパク質の遺伝
子を挿入することが望まれ得る。これによって、抗微生
物量が達成され、効果的な病気への耐性が与えられる。
あるいは、植物が１つあるいはそれ以上の外来タンパク
質を産生するが、そのタンパク質は通常病気に感染した
組織内で産生されるか、あるいは産生されて組織へ分散
される場合には、組織特異的プロモーターはタンパク質
の局所的発現あるいは過剰産生の提供に用いられ得る。
組織特異的プロモーターは、例えば、タンパク質の生産
を感染しやすい組織、あるいはタンパク質を効率よく産
生する組織に局在化させるために用いられ得る。本発明
の実施において、選択されたタンパク質をコードするＤ
ＮＡ配列は、従来技術によってタンパク質の天然源から
得ることができ、そして次にその遺伝子は適切な制限酵
素を用いて取り出され得、そして選択された植物の発現
カセットに挿入され得る。別の方法では、公知の方法を
用いてその精製タンパク質の全体の配列が決定され得
る。そして次にアミノ酸の適切な配列をコードする合成
ＤＮＡ配列が調製され得、そしてこの合成ＤＮＡ配列は
適切な植物の発現カセットに挿入され得る。同様に、多
くの植物の発現カセットおよびベクターが、当該分野で
良く知られている。用語「発現カセット」とは、イニシ
エーション、プロモーターおよびターミネーション配列
を含む制御配列の１つの完全なセットを意味する。これ
らの配列は正しいリーディングフレームで構造遺伝子に
フランキングした場合、植物細胞内で機能する。発現カ
セットは、しばしばおよび好ましくは、任意の所望の構
造遺伝子の開裂および挿入に望ましい制限部位の組合せ
を包含する。クローン化した遺伝子が、構造配列に対し
て正しいリーディングフレームで開始コドンを有するこ
とは重要である。さらに、植物発現カセットは、好まし
くは、高頻度に遺伝子が転写されるように、強力な構成
プロモーター配列を一方の末端に、そしてメッセンジャ
ーＲＮＡの正しいプロセッシングおよび輸送のため、ポ
リ−Ａ認識配列をもう一方の端に含有する。本発明のｃ
ＤＮＡを挿入し得る、このような好ましい（挿入してい
ない）発現カセットの１つの例は、ＰｉｏｎｅｅｒＨ
ｉ−ＢｒｅｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎ
ｃ．，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ．ＩＡ．のＢｅａｃｈらが開発
した、ｐＰＨＩ４１４プラスミドである。より好ましい
植物発現カセットは、カナマイシン耐性あるいは除草剤
耐性遺伝子のような、１つあるいはそれ以上の選択マー
カーを含むように設計される。本明細書の用語「ベクタ
ー」とは、宿主内で外来遺伝子を複製および発現し得る
ＤＮＡ配列を意味する。典型的には、ベクターは、適切
な酵素の使用によって、予想される様式で切断され得
る、１つあるいはそれ以上のエンドヌクレアーゼの認識
部位を有する。このようなベクターは、好ましくは、さ
らに抗菌耐性あるいは除草剤耐性を与える構造遺伝子配
列を有するように構築され、そして次に形質転換した細
胞を確認および分離するためのマーカーとして働く。好
ましいマーカー／選択物質には、カナマイシン、クロロ
サルフロン、ホスホノスリシン、ハイグロマイシン、メ
トトレキセートが含まれる。ベクター中の外来遺伝子材
料が機能的に発現した細胞を、ベクターで「形質転換さ
れた」といい、そして「形質転換体」という。特に好ま
しいベクターは、プラスミドであり、これは細胞の染色
体の一部ではない、環状二本鎖ＤＮＡ分子を意味する。
遺伝子配列に用い得るプロモーターには、ｎｏｓ，ｏｃ
ｓ、およびＣａＭＶプロモーターが含まれ得る。用いら
れ得る有効な植物のプロモーターは、過剰生産性植物プ
ロモーターである。本発明に用い得る過剰生産性植物プ
ロモーターには、ダイズからのリブロース−１，５−２
ホスフェイトカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓ
ｓ）のプロモーターが含まれ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ
ら、Ｊ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＡｐｐ．Ｇｅ
ｎ．，１：４８３−４９８（１９８２））、そしてクロ
ロフィルａ−ｂ結合タンパク質のプロモーターが含まれ
る。これら２つのプロモーターは、真核植物細胞中で光
誘導性であることが知られている（例えば、Ｇｅｎｅｔ
ｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＰｌａｎｔｓ，
ＡｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＰｅｒｓｐｅｃｔｉ
ｖｅ，Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ，Ｐｅｌｈａｍ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９８３，ｐｐ．２９−３８，Ｇ．Ｃｏｒｕ
ｚｚｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，，２５８：１３
９９（１９８３）、およびＰ．Ｄｕｎｓｍｕｉｒら、
Ｊ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＡｐｐ．Ｇｅｎ．，
２：２８５（１９８３）を参照）。所望の制御配列に作
動可能に結合された、選択されたタンパク質の構造遺伝
子を含有する発現カセットは、適切なクローニングベク
ターにライゲーションし得る。一般的に、宿主細胞に適
合する種由来の複製配列および制御配列を含有するプラ
スミドあるいはウイルス（バクテリオファージ）のベク
ターが用いられる。典型的には、クローニングベクター
は、複製開始点、および形質転換された宿主細胞で表現
型の選択マーカーを提供し得る特異的な遺伝子を有す
る。典型的には、抗菌剤あるいは選択した除草剤に対し
て耐性を与える遺伝子が用いられる。遺伝子材料が標的
細胞に導入された後、うまく形質転換した細胞および／
あるいは細胞のコロニーは、これらのマーカーに基づく
選択によって単離され得る。典型的には、本発明の実施
において、中間宿主細胞が、クローニングベクターのコ
ピー数を増加させるために用いられる。コピー数を増加
させることによって、目的の遺伝子を含むベクターが、
所望の植物細胞へ導入するために十分な量で単離され得
る。本発明の実施に用いられ得る宿主細胞には、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＳｅｒｒ
ａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ等の細菌細胞を含む原
核細胞が含まれる。酵母あるいは糸状菌などの真核細胞
宿主もまた、本発明に用いられ得る。これらの宿主もま
た微生物であるので、選択されたタンパク質の発現を微
生物内で起こさない植物プロモーターがベクターに用ら
れるかを確かめることが必要である。次に、単離したク
ローニングベクターを、エレクトロポレーション（プロ
トプラストで）；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの種、レ
トロウイルス、微粒子射突法（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃ
ｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；およびマイクロイン
ジェクションを含む任意の従来技術を用いて、細胞培養
あるいは組織培養による、単子葉植物類あるいは双子葉
植物類からの細胞の植物細胞に導入する。このことによ
って、植物発現カセットのＤＮＡ配列の少なくとも１つ
のコピーを、外来ＤＮＡとして含む、形質転換した植物
細胞が提供される。好ましくは、単子葉植物類は、トウ
モロコシ、モロコシ、コムギおよびイネから選ばれ、そ
して双子葉植物類は、ダイズ、アルファルファ、タバ
コ、トマトおよびアブラナから選択される。公知の技術
を用いて、プロトプラストが再生され得、そして細胞あ
るいは組織の培養物が再生され得、選択されたタンパク
質の遺伝子を有しそして発現する、完全体の稔性の植物
を形成させる。それ故に、本発明のより好ましい実施態
様は、本発明の発現カセットのＤＮＡ配列の少なくとも
１つののコピーを、外来ＤＮＡとして含む細胞を有する
形質転換したトウモロコシ植物である。最終的に、本発
明は、以下より選ばれた微生物が引き起こす病気に対し
て、感受性のある分類群の植物に、耐性を与える方法を
提供する：Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、
Ｆｕｓａｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ、Ｄｉｐｌ
ｏｄｉａｍａｙｄｉｓ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｏｔｒｉｃ
ｈｕｍｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａＶｅｒｔｉｃｉｌｌ
ｉｕｍａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏ
ｒａｍｅｇａｓｐｅｒｍａｅｆ．ｓｐ．ｇｌｙｃ
ｉｎｅａ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａｐｈａｓｅｏｌ
ｉｎａ、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ
ｃａｕｌｉｖｏｒａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃ
ｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｔｒ
ｉｆｏｌｉｏｒｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａ
ｖｕｓおよびＡｌｔｅｒｎａｒｉａｌｏｎｇｉｐｅ
ｓ。この方法は次の工程を包含する：（ａ）その分類群の少なくとも１つの植物由来の再生
細胞あるいは組織を培養する工程；（ｂ）その細胞培養物あるいは組織培養物の細胞に、選
択されたタンパク質の構造遺伝子の発現を細胞内で引き
起こす植物の調節配列に、作動可能に結合された、選択
されたタンパク質の構造遺伝子を含有する発現カセット
の少なくとも１つのコピーを導入する工程；および（ｃ）その細胞あるいは組織の培養物から病気に耐性の
ある完全体の植物を再生する工程。一度完全体の植物が
得られると、それは発現カセットが提供する配列のコピ
ーの少なくとも１つが、再生産物の後代の細胞に存在す
るような様式で、有性的にあるいは無性的に再生産され
る。別な方法として、一度１つの形質転換植物が、前述の組
み換えＤＮＡ法で得られると、選択されたタンパク質の
構造遺伝子および関連する調節配列を移すために、交配
および戻し交配による従来の植物育種法が用いられ得
る。そのような中間的な方法には、さらに次の工程が包
含される：（ａ）病気に耐性の植物を病気にかかりやすい植物群と
有性交配させる工程；（ｂ）交配後代から生殖力のある材料を回収する工程；
および（ｃ）生殖力のある材料から病気に耐性の植物を生育さ
せる工程。所望あるいは必要な場合、感受性のある分類
群の、作物学的な特性が、さらに下記の工程を繰り返す
こを包含するようにこの方法を広げることによって、実
質的に保存され得る：（ａ）病気に耐性の後代を、病気に感受性の分類群から
の植物と戻し交配する工程：（ｂ）感受性のある分類群の特性が、抗微生物活性を与
える遺伝子を伴って、所望の割合で後代に存在するよう
になるまで、戻し交配後代の中から、抗微生物活性（あ
るいは関連したマーカー遺伝子）の発現を選択する工
程。本明細書の用語「分類群」とは、属あるいはそれ以下の
植物学的分類単位を意味する。従って、これには、属、
種、品種、変種、変異体、および一貫した命名を欠いた
他の小さな分類のグループを含む。本明細書に提供され
ている植物ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ中に組み込まれ得、そして次に
感受性のある植物細胞、特に双子葉植物類の細胞にその
ベクターを移すために用いられ得ることもまた当業者に
は明かである。従って、本発明は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに感受性のある双子葉
植物に、抗微生物活性および病気への耐性を与える方法
を提供する。この植物中では、発現カセットがＡｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの細胞感
染によって、細胞に導入されており、そのプラスミドは
本発明の植物発現カセットを含むように改変されてい
る。〔ヒトおよび獣医学上の薬学的使用〕本発明はまた、処
置が必要なヒトあるいはより下等な動物宿主中での、感
染性の微生物による感染の処置および予防の方法も提供
する。この方法には、処置が必要なヒトあるいはより下
等な動物宿主に、本発明のポリペプチド、あるいは１つ
あるいはそれ以上のポリペプチドを含む組成物を、治療
上有効な量投与することが包含される。本発明のポリペ
プチドは、所望により吸入スプレーによって非経口的に
投与されるか、あるいは従来の無毒性の薬学的に受容可
能な所望のキャリアー、アジュバンドおよび媒体を含有
する投与単位処方剤で、直腸あるいは局所に投与され得
る。本明細書で用いる用語「非経口」には、皮下、静
脈、筋肉内、関節内、および髄腔内の注射および注入法
が含まれる。他のポリペプチドを伴う場合、本発明のポ
リペプチドは経口的に活性であることは知られていな
い。単回あるいは分割投与で宿主に投与される、本発明
の化合物の１日当りの総投与量は、例えば、体重１ｋｇ
当り１日０．１から２０００ｍｇであり得、より一般的
には５０から５００ｍｇで有り得る。投与単位の組成物
は、その全量あるいは分割量あるいは約数倍の量を、１
日当りの投与量となるように調整して含み得る。しか
し、任意の個々の患者に対する特定の投与量レベルが、
様々なファクターに依存していることは理解されてい
る。これらのファクターには、用いる特定の化合物の活
性、年齢、体重、総合的な健康状態、性別、食物、投与
の期間あるいは時期、投与の経路、排出の速度、薬剤の
組合せおよび治療を行う個々の病気の重篤さが含まれ
る。本発明はまた、本発明の化合物の有効な量と従来の
薬学的キャリアーとを組み合わせて含有する、単位投薬
形態の薬学的組成物も提供する。本明細書の用語「薬学
的キャリアー」とは、固体あるいは液体の増量剤、希釈
剤あるいはカプセル化剤を意味する。薬学的キャリアー
になり得る材料の例には、乳糖、ブドウ糖およびショ糖
などの糖類；トウモロコシ澱粉およびジャガイモ澱粉な
どの澱粉；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エ
チルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロース
およびその誘導体；粉末トラガカンゴム；麦芽；ゼラチ
ン；タルク；ココアバターおよび座薬ワックスなどの賦
形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、胡麻油、オ
リーブ油、トウモロコシ油、大豆油などの油；プロピレ
ングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトー
ルおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オ
レイン酸エチルおよびラウリル酸エチルのようなエステ
ル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウ
ムのような緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンを含まな
い水；等張生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコー
ル；リン酸緩衝溶液、および薬学的処方剤に用いられる
無毒性の適合性物質がある。ラウリル硫酸ナトリウムお
よびステリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤お
よび潤滑剤、および着色剤、放出剤、コーティング剤、
および芳香剤および保存剤もまた、所望の処方によっ
て、組成物中に存在させ得る。単回投薬の形を製造する
ためのキャリアー材料と組合せ得る活性成分の量は、処
置される宿主および投与の個々の様式によって変化す
る。本明細書では「治療上有効な量」とは、任意の医療
処置で利益／危険性が妥当な割合で、処置されるヒトあ
るいはより下等な動物の感染性微生物による感染を軽減
あるいは予防するような抗微生物活性を提供するのに充
分なポリペプチドあるいはその組合せのいずれかの量を
意味する。本発明の方法は、副腎皮質刺激ホルモン、ラ
イティカーゼ（Ｌｙｔｉｃａｓｅ）、ペニシリナーゼ、
カシニン（Ｋａｓｓｉｎｉｎ）、マストパラン（Ｍａｓ
ｔｏｒｐａｒａｎ）、メリチン、Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−Ｌｙｓ、シンターゼおよびクロタミン（Ｃｒｏｔａｍ
ｉｎｅ）からなる群から選択されるタンパク質に感受性
のある病原性微生物を破壊および阻害する方法であっ
て、該病原性微生物の環境へ抗微生物量の該群から選択
されるタンパク質を導入することを包含する。本発明の
方法は、病原体による植物の感染を予防する、上記の方
法であって、上記の群から選択されるタンパク質をコー
ドする配列を、通常該病原体によって感染する植物の組
織中で、抗微生物量の該タンパク質を提供するレベルで
タンパク質を発現させる、該植物で活性な転写イニシエ
ーターおよびプロモーター配列に関して適切なリーディ
ングフレームで、植物ゲノムに挿入することを包含す
る。本発明の方法は、Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎ
ｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍ
ｅ、Ｄｉｐｌｏｄｉａｍａｙｄｉｓ、Ｃｏｌｌｅｔｏ
ｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｖｅｒ
ｔｉｃｉｌｌｉｕｍａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ、Ｐｈｙｔｏ
ｐｈｔｈｏｒａｍｅｇａｓｐｅｒｍａｅｆ．ｓｐ．ｇ
ｌｙｃｉｎｅａ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａｐｈａｓ
ｅｏｌｉｎａ、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｐｈａｓｅｏｌｏ
ｒｕｍｃａｕｌｉｖｏｒａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ
ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ
ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆ
ｌａｖｕｓおよびＡｌｔｅｒｎａｒｉａｌｏｎｇｉｐ
ｅｓから選択される病原体による感染を予防する方法で
あって、上記の群から選択されるタンパク質をコードす
る配列を、通常該病原体によって感染する植物の組織中
で、抗微生物量の該タンパク質を提供するレベルでタン
パク質を発現させる、該植物で活性な転写イニシエータ
ーおよびプロモーター配列に関して適切なリーディング
フレームで、植物ゲノムに挿入することを包含する。好
ましい実施態様では、さらに、下記の工程を包含する：（ａ）植物由来の細胞あるいは組織を培養する工程；（ｂ）請求項１に記載の群から選択されるタンパク質を
コードする配列を含有する発現カセットの、少なくとも
１つのコピーを細胞培養あるいは組織培養の細胞に導入
する工程；および（ｃ）細胞培養あるいは組織培養から、保護された全植
物を再生産する工程。本発明の方法は、Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｍｏ
ｎｉｌｉｆｏｒｍｅ、Ｄｉｐｌｏｄｉａｍａｙｄｉ
ｓ、、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｒａｍｉ
ｎｉｃｏｌａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｍａｌｂｏ−ａｔ
ｒｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｍｅｇａｓｐｅｒ
ｍａｅｆ．ｓｐ．ｇｌｙｃｉｎｅａ、Ｍａｃｒｏｐｈ
ｏｍｉｎａｐｈａｓｅｏｌｉｎａ、Ｄｉａｐｏｒｔｈ
ｅｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍｃａｕｌｉｖｏｒａ、Ｓ
ｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｓ
ｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ、Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ、およびＡｌｔｅｒｎ
ａｒｉａｌｏｎｇｉｐｅｓから選択される病原体によ
って引き起こされる病気に対する耐性を、該病気に感染
しやすい植物の分類群に与える方法であって、さらに下
記の工程を包含する：（ａ）上記の方法によって、性的に適合する植物から調
製された、稔性で病気に対して耐性のある植物を選択す
る工程；（ｂ）該病気に対して耐性のある植物と該病気に感染し
やすい分類群の植物とを有性交配する工程；（ｃ）該交配の後代から再生産物を回収する工程；およ
び（ｄ）再生産物から、保護された植物を生育させる工
程。本発明の植物ゲノム由来のＤＮＡクローンは、実質的
に、副腎皮質刺激ホルモン、ライティカーゼ（Ｌｙｔｉ
ｃａｓｅ）、ペニシリナーゼ、カシニン（Ｋａｓｓｉｎ
ｉｎ）、マストパラン（Ｍａｓｔｏｒｐａｒａｎ）、メ
リチン、Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐ
ｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ、シンターゼお
よびクロタミン（Ｃｒｏｔａｍｉｎｅ）からなる群から
選択されるタンパク質のみをコードする。本発明の発現
カセットは、上記のＤＮＡクローンを含有する発現カセ
ットであって、細菌細胞中で該ＤＮＡクローンの発現を
引き起こす細菌の発現制御配列に作動可能に結合されて
いる。本発明の細菌細胞は、上記の発現カセットの少な
くとも１つのコピーを、外来のプラスミドとして含有す
る。本発明の病原体Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅ
ａｒｕｍを破壊および阻害する方法は、マガイニン−
２、マガイニン−Ａ、マガイニン−Ｇ、ポリ−Ｌ−アル
ギニンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｌ−リ
シンＨＢｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−Ｄ−
リシン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、マストパラン、カ
シニン、Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐ
ｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ、副腎皮質刺激
ホルモン１−１７、副腎質刺激ホルモン１−２４、
クエン酸シンターゼ、デフェンシンＮＰ１、カテプシン
Ｇ、リゾチーム、α−ホルドチオニン、β−ホルドチオ
ニン、β−プロチオニン、クロタミン、メリチン、好酸
球主要塩基性タンパク質、好酸球カチオンタンパク質お
よび好酸球パーオキシダーゼからなる群から選択される
抗微生物量のタンパク質を、病原体微生物の環境下に導
入することを包含する。本発明の病原体Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍｍｏｎｉｌｉｆｏｍｅを破壊および阻害する方法
は、マガイニン−２、マガイニン−Ａ、マガイニン−
Ｇ、ポリ−Ｌ−アルギニンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチ
ジン、ポリ−Ｌ−リシンＨＢｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨＣ
ｌ、ポリ−Ｄ−リシン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、マス
トパラン、カシニン、Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ、
副腎皮質刺激ホルモン１−１７、副腎皮質刺激ホルモン
１−２４、クエン酸シンターゼ、デフェンシンＮＰ
１、カテプシンＧ、リゾチーム、α−ホルドチオニン、
β−ホルドチオニン、β−プロチオニン、メリチン、好
酸球主要塩基性タンパク質、好酸球カチオンタンパク質
および好酸球パーオキシダーゼからなる群から選択され
る抗微生物量のタンパク質を、病原体微生物の環境下に
導入することを包含する。本発明の病源体Ｄｉｐｌｏｄ
ｉａｍａｙｄｉｓを破壊および阻害する方法は、マガ
イニン−２、マガイニン−Ａ、マガイニン−Ｇ、ポリ−
Ｌ−アルギニンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−
Ｌ−リシンＨＢｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−
Ｄ−リシン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、デフェンシン
ＮＰ１、α−ホルドチオニン、β−プロチオニンおよび
メリチンなる群から選択される抗微生物量のタンパク質
を、病原体微生物の環境下に導入することを包含する。
本発明の病原体Ｃｏｌｌｅｔｏｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇ
ｒａｍｉｎｉｃｏｌａを破壊および阻害する方法はマガ
イニン−Ａ、マガイニン−Ｇ、ポリ−Ｌ−アルギニン
ＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｌ−リシンＨ
Ｂｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−Ｄ−リシン、
ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、デフェンシンＮＰ１、α−
ホルドチオニン、β−プロチオニンおよびメリチンなる
群から選択される抗微生物量のタンパク質を、病原体微
生物の環境下に導入することを包含する。本発明の病原
体Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍａｌｂｏ−ａｔｒｕｍを
破壊および阻害する方法は、マガイニン−２、マガイニ
ン−Ａ、マガイニン−Ｇ、ポリ−Ｌ−アルギニンＨＣ
ｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｌ−リシンＨＢ
ｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−Ｄ−リシン、ポ
リ−Ｄ−リシンＨＢｒ、デフェンシンＮＰ１、α−ホル
ドチオニン、β−プロチオニンおよびメリチンなる群か
ら選択される抗微生物量のタンパク質を、病原体微生物
の環境下に導入することを包含する。本発明の病原体Ｐ
ｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｍｅｇａｓｐｅｒｍａｅ
ｆ．ｓｐ．ｇｌｙｃｉｎｅａを破壊および阻害する方
法は、マガイニン−２、ポリ−Ｌ−リシンＨＢｒ、デ
フェンシンＮＰ１ β−プロチオニンおよびメリチン
なる群から選択される抗微生物量のタンパク質を、病原
体微生物の環境下に導入することを包含する。本発明の
病原体Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａｐｈａｓｅｏｌｉｎ
ａを破壊および阻害する方法は、ポリ−Ｌ−ヒスチジ
ン、ポリ−Ｄ−リシン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、デ
フェンシンＮＰ１、α−ホルドチオニン、β−プロチ
オニンからなる群から選択される抗微生物量のタンパク
質を、病原体微生物の環境下に導入することを包含す
る。本発明の病原体Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｐｈａｓｅｏ
ｌｏｒｕｍｃａｕｌｉｖｏｒａを破壊および阻害する
方法は、デフェンシンＮＰ１、α−ホルドチオニンお
よびβ−プロチオニンからなる群から選択される抗微生
物量のタンパク質を、病原体微生物の環境下に導入する
ことを包含する。本発明の病原体Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉ
ａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍを破壊および阻害する方
法は、マガイニン−Ａ、マガイニン−Ｇ、ポリ−Ｌ−ア
ルギニンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｌ−リ
シンＨＢｒ、ポリ−Ｌ−リシン、ＨＣｌ、ポリ−Ｄ−
リシン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、マストパラン、デ
フェンシンＮＰ１、カテプシンＧ、リゾチーム、α−
ホルドチオニン、β−ホルドチオニン、β−プロチオニ
ン、イラクサレクチン、クロタミン、メリチン、好酸球
主要塩基性タンパク質および好酸球カチオンタンパク質
からなる群から選択される抗微生物量のタンパク質を、
病原体微生物の環境下に導入することを包含する。本発
明の病原体Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｔｒｉｆｏｌｉｏ
ｒｕｍを破壊および阻害する方法は、マガイニン−Ａ、
ポリ−Ｌ−アルギニンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチジ
ン、ポリ−Ｌ−リシンＨＢｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨ
Ｃｌ、ポリ−Ｄ−リシン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ，
マストパラン、デフェンシンＮＰ１、カテプシンＧ、
リゾチーム、α−ホルドチオニン、β−ホルドチオニ
ン、β−プロチオニン、イラクサレクチン、クロタミ
ン、メリチン、好酸球主要塩基性タンパク質及び好酸球
カチオンタンパク質からなる群から選択される抗微生物
量のタンパク質を、病原体微生物の環境下に導入するこ
とを包含する。本発明の病原体Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｆｌａｖｕｓを破壊および阻害する方法は、マガイニ
ン−２、マガイニン−Ａ、マガイニン−Ｇ、ポリ−Ｌ−
アルギニンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｌ
−リシンＨＢｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−
Ｄ−リシン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、マストパラ
ン、カシニン、デフェンシンＮＰ１、カテプシンＧ、
リゾチーム、α−ホルドチオニン、β−ホルドチオニ
ン、β−プロチオニン、イラクサレクチン、クロタミ
ン、メリチン、および好酸球カチオンタンパク質からな
る群から選択される抗微生物量のタンパク質を、病原体
微生物の環境下に導入することを包含する。本発明の病
原体Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｌｏｎｇｉｐｅｓを破壊お
よび阻害する方法は、マガイニン−２、マガイニン−
Ａ、マガイニン−Ｇ、ポリ−Ｌ−アルギニンＨＣｌ、
ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｌ−リシンＨＢｒ、ポ
リ−Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−Ｄ−リシン、ポリ−Ｄ
−リシンＨＢｒ、マストパラン、Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙ
ｒ−Ｌｙｓ、副腎皮質刺激ホルモン１−１７、副腎皮質
刺激ホルモン１−２４、クエン酸シンターゼ、デフェ
ンシンＮＰ１、カテプシンＧ、リゾチーム、α−ホルド
チオニン、β−ホルドチオニン、β−プロチオニン、ク
ロタミン、メリチン、好酸球主要塩基性タンパク質、好
酸球カチオンタンパク質及び好酸球パーオキシダーゼか
らなる群から選択される抗微生物量のタンパク質を、病
原体微生物の環境下に導入することを包含する。本発明
の薬学的組成物は、副腎皮質刺激ホルモン、ライティカ
ーゼ（Ｌｙｔｉｃａｓｅ）、ペニシリナーゼ、カシニン
（Ｋａｓｓｉｎｉｎ）、マストパラン（Ｍａｓｔｏｒｐ
ａｒａｎ）、メリチン、Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈ
ｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙ
ｓ、シンターゼおよびクロタミン（Ｃｒｏｔａｍｉｎ
ｅ）からなる群から選択されるタンパク質の安全かつ有
効な量を含有する、抗真菌活性を有する単位投与形態で
ある。

【実施例】以下の記載により、本発明の組成物、その製
造法、およびその使用法をさらに説明する。しかしなが
ら、当業者に公知の他の方法もまた使用し得ることを理
解されたい。（実施例１）抗微生物物質のスクリーニング方法タンパク質を、選択したタンパク質の分子量に依存した
濃度で、抗微生物活性に関してスクリーニングした。以
下の表は保存溶液の濃度の例を示している：分子量保存溶液の濃度＜５００Ｄａ３０００μＭ５００−５０００Ｄａ３００μＭ５０００−１００００Ｄａ１００μＭ＞１００００Ｄａ３０μＭ分子量が未知のタンパク質溶液は、１．０ｍｇ／ｍｌの
濃度に作成した。通常溶媒として水を用いるが、小さい
タンパク質には、０．０１％の酢酸が使用し得る。この
保存溶液は当業者に公知の手段を使用して滅菌し、そし
て適切な温度で保存した。次にタンパク質を以下の方法
で、抗微生物あるいは抗真菌活性に関してスクリーニン
グした：１０μｌのタンパク質溶液をマイクロタイター
プレートウエルに入れた。このウエルに、胞子、あるい
は胞子を形成しない菌類の菌糸断片をウエルに加えた。
ウエル当りの胞子の数は約２００−２５０で、菌糸断片
の数は約１０−５０とした。プレートを、２８℃にて暗
所中で、２０−２４時間培養した。倒立顕微鏡を用い、
目視で、各ウエルのスコアを調べた。０は水対照に比較
して阻害がなく、４は完全な阻害を示す、という定性的
な０−４のスケールを用いて抗真菌活性を測定した。
１、２および３のスコアは、中間的な抗真菌活性を示
す。表２−７に、６種の病原性生物に対するレベルＩの
スクリーニングの結果を示す。表に示したペプチド配列
はアミノ酸を、以下に示す通常の一文字記号で示してい
る。配列表には通常の三文字記号で示している。

【表１】以下の表２から７は、レベルＩの抗真菌スクリーニング
の結果を示している。データは１回の実験当り二回の繰
り返して、１回あるいは２回の実験で得られた抗真菌ス
コア（０−４のスケール）を表している。効果を調べた
微生物は以下の記号で示した。記号：ＡＬＯ＝Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｌｏｎｇｉ
ｐｅｓＡＦＬ＝ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓＦＧＲ＝ＦｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍＦＭＯ＝ＦｕｓａｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅＳＳＣ＝Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏ
ｒｕｍＳＴＲ＝Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｔｒｉｆｏｌｉｏｒ
ｕｍ

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】プレートをさらに１６−２０時間インキュベートし、各
ウエルの濁度を分光光度計で読み、測定し得る。濁度
は、ウエル当りの真菌質量の測定法である。マイクロタ
イタープレートを、プレートリーダーで６００ｎｍで読
み、そして対照に対する相対的阻害の割合（％）を計算
する。阻害の割合（％）を正確に測定するには、４から
８回の繰り返し測定が必要であり、８回の繰り返しが最
良の結果を与える。タンパク質が、対照と比較して有意
に真菌を阻害しているかどうかを統計的分析を用いて調
べた。次に上記の実験を、抗真菌活性の確認のために繰
り返した。最初のスクリーニングプロセスの中で１つ以
上の真菌に対して中程度から強い、活性を示したタンパ
ク質を、第２のスクリーニングに供した。第２のスクリ
ーニングは、阻害活性を示すタンパク質の最少濃度を決
定するように設計されている。このスクリーニング法
は、各タンパク質の６回の３倍ずつの系列希釈を行い、
約１００倍の濃度範囲にわたる溶液を用いたこと以外は
最初のスクリーニングと同じである。例えば、最初のス
クリーニングで３０μＭでスクリーニングされたタンパ
ク質は、第２のスクリーニングでは、２７μＭ、９μ
Ｍ、３μＭ，１μＭ、および０．３μＭでスクリーニン
グする。マイクロタイタープレートの各ウエルに、約９
０μｌの希釈タンパク質を入れた。胞子あるいは菌糸の
断片の一部ずつを、最初のスクリーニングに使用したの
と同じ濃度で添加する。最初のスクリーニングプロセス
中で用いたのと同じスコア方法を用い、この実験を繰り
返し、活性を個々に確認した。この結果は、最少有効濃
度あるいはＭＥＣとして記録した。表８に、レベルＩＩ
のスクリーニングの結果を示す。

【表８】（実施例２）タンパク質合成法合成ペプチド：合成ペプチドマガイニン−２、マガイニ
ン−Ａ、マガイニン−Ｇ、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ
−Ｌ−ヒスチジン、マストパラン、カシニン、Ｐｒｏ−
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖ
ａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ、および、副腎皮質刺激ホルモン
１−１７、副腎皮質刺激ホルモン１−２４、はペプチド
合成装置を用い、当分野で公知の固相合成法および化学
合成法で合成し得る。アミノ酸配列をペプチド合成装置
（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓｍｏｄｅｌ
４３１Ａ）にプログラミングし、そして１００ｍｇの
ペプチドを得た。このペプチドを、逆相高圧液体クロマ
トグラフィー（ＲＰＨＰＬＣ）を用いて精製した。合
成ペプチドの活性を確認するため、逆相ＨＰＬＣの主要
ピークの活性を、抗真菌活性に関して試験した。合成ペ
プチド用の遺伝子を得るために、先ず最適のコドンユー
セージを決定した。形質転換された種からのタンパク質
のアミノ酸配列を、ＧｅｎＢａｎｋから抽出し、そして
分析した。タンパク質中のコドンの平均頻度に基づき、
最適コドンを選択した。このようにして、目的のペプチ
ドをコードする最適ＤＮＡ配列を決定した。もし存在し
ていない場合には、ＡＴＧ開始コドンをＤＮＡ配列の始
まりに付加した。植物発現ベクターへの遺伝子のクロー
ニングを可能とするため、ＤＮＡ配列のどちらかの末端
に適切な制限酵素部位を付加した。次にＤＮＡ合成装置
を用いてオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ配列）およびその
相補鎖を合成した。両オリゴヌクレオチド鎖をアニール
させ、当分野で公知の技術を用い、植物発現ベクターに
クローニングした。精製したタンパク質および酵素：
精製したタンパク質および酵素である、クエン酸シンタ
ーゼ、ディフェンジン１、カテプシンＧ、リゾチーム、
α−ホルドチオン、β−ホルドチオニン、β−プロチオ
ニン、イラクサレクチン、クロタミン、メリチン、好酸
球主要塩基性タンパク質、好酸球カチオン性タンパク
質、および好酸球ペルオキシダーゼ、を単離し、そして
以下の方法でクローニングした。タンパク質および酵素
は、前記の表２および引用した文献に示された生物材料
から単離した。タンパク質および酵素の精製には、当分
野で公知の種々の精製方法を用いた。精製したタンパク
質および酵素の抗真菌活性は、ポリアクリルアミドゲル
の単一バンド、あるいは逆相ＨＰＬＣからの単一ピーク
の抗真菌活性により確認した。精製したタンパク質の遺
伝子をクローニングするために、以下の方法の何れもが
使用し得る：ａ．タンパク質（あるいはタンパク質分解産物）の配列
を決定する。配列の６−２０個のアミノ酸のコーディン
グ配列に基づく縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計
する。◇ ｂ．タンパク質に対する抗体を発現ライブラリーのスク
リーニングに使用し得る。この方法は、タンパク質の配
列決定をするよりも、目的のタンパク質に対する抗体を
作成するのが簡単な場合に使用する。当分野で良く知ら
れている分子生物学的技術を用いて、λファージ発現ラ
イブラリーを、タンパク質の由来生物からのｃＤＮＡで
構築する。このライブラリーは、β−ガラクトシダ−ゼ
のオープンリーディングフレームに挿入された、全ての
可能なリーディングフレーム中のｃＤＮＡ挿入物を含
む。当分野で公知の方法を用いて、抗体と反応するエピ
トープにより、このライブラリーをスクリーニングし得
る。次にこのクローンを配列決定し、そしてタンパク質
の大きさを確認する。次に遺伝子を、当分野で公知の技
術、および本発明の背景に記載した技術を用いて、植物
発現ベクターに挿入し得る。◇ ｃ．ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）は、
遺伝子をクローニングするための、別の良く知られた技
術である。この方法では、配列が分かっている、タンパ
ク質の二つ別々の領域に基づくＤＮＡプライマーを用い
る（コドンは、縮重であっても、なくとも良い）。プラ
イマーの間の特定のＤＮＡ断片を増幅するためにＰＣＲ
法を用いる。この断片を、精製し、そして非常に特異的
なプローブとして使用し得る。ゲノムライブラリー、あ
るいはより好適にはｃＤＮＡライブラリーを、標準的な
クローニング技術を用いてスクリーニングする。オリゴ
ヌクレオチドにより確認されたクローンの配列を決定
し、オープンリーディングフレームの存在を確認する。
推定されるタンパク質の大きさと、精製されたタンパク
質の大きさとを比較して確認する。インビトロでの突然
変異導入を用いて、遺伝子の３’および５’末端にクロ
ーニング用の制限酵素部位を導入する。次にこの遺伝子
を、当分野で良く知られたクローニング法を用いて、植
物発現ベクターに挿入する。部分精製したタンパク質抽出物：ライティカーゼ、ペニ
シリナーゼおよびサイトヘリカーゼのタンパク質は、均
質になるまで精製することはできなかった。抗真菌活性
を担うエレメントを同定するために、タンパク質抽出物
を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、あるいは逆相Ｈ
ＰＬＣで分析し、そして全てのバンドあるいは画分を抗
真菌活性に関して分析し得る。抗真菌活性に関連する画
分を単一のバンドが得られるまでさらに精製し得る。次
に遺伝子を、精製されたタンパク質の項で記載した方法
を用いて、クローニングし得る。本明細書で用いた％
は、断わりがない限り全て重量％である。本明細書の用
語「微生物」は、細菌および真菌を包含する。本明細書
の用語「細菌」および「細菌感染」は、通常に用いられ
ているのと同じである。本明細書の「真菌」は、ｐｈｙ
ｃｏｍｙｃｅｔｅｓ、ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓおよびｂ
ａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ、および通常「酵母」ある
いは「かび」と呼ばれる原生生物を包含する、高等原生
生物を意味する。選択した群のタンパク質が、抗微生物
特性を有することが判明した。好ましい実施態様では、
これらのタンパク質に感受性のある植物病原体により引
き起こされた病気に対する植物の耐性は、選択されたタ
ンパク質の抗微生物量の産生を引き起こすような発現を
する遺伝子を、植物細胞に挿入することで付与した。

【配列表】

【配列番号：１】

【配列番号：２】

【配列番号：３】

【配列番号：４】

【配列番号：５】

【配列番号：６】

【配列番号：７】

【配列番号：８】

【配列番号：９】

【配列番号：１０】

【配列番号：１１】

【配列番号：１２】

【配列番号：１３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 5/04 15/12 15/16 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者ジョナサンデュビックアメリカ合衆国アイオワ 50310，ポークカウンティ，デモイン，サーティーエイスストリート 17 07 (72)発明者トレイシールードアメリカ合衆国アイオワ 50310，ポークカウンティ，デモイン，アリソンアベニュー 4333

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】副腎皮質刺激ホルモン、ライティカーゼ
（Ｌｙｔｉｃａｓｅ）、ペニシリナーゼ、カシニン（Ｋ
ａｓｓｉｎｉｎ）、マストパラン（Ｍａｓｔｏｒｐａｒ
ａｎ）、メリチン、Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−
Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ、シ
ンターゼおよびクロタミン（Ｃｒｏｔａｍｉｎｅ）から
なる群から選択されるタンパク質に感受性のある病原性
微生物を破壊および阻害する方法であって、該病原性微
生物の環境へ抗微生物量の該群から選択されるタンパク
質を導入することを包含する、方法。
【請求項２】前記病原体の環境が植物組織である、請求
項１に記載の方法。
【請求項３】前記タンパク質が前記植物に天然には存在
していない、請求項２に記載の方法。
【請求項４】病原体による植物の感染を予防する、請求
項１に記載の方法であって、請求項１に記載の群から選
択されるタンパク質をコードする配列を、通常該病原体
によって感染する植物の組織中で、抗微生物量の該タン
パク質を提供するレベルでタンパク質を発現させる、該
植物で活性な転写イニシエーターおよびプロモーター配
列に関して適切なリーディングフレームで、植物ゲノム
に挿入することを包含する、方法。
【請求項５】前記タンパク質が植物に天然には存在して
いない、請求項４に記載の方法。
【請求項６】前記植物が、コムギ、イネおよびモロコシ
から選択される単子葉植物の種である、請求項４に記載
の方法。
【請求項７】さらに、下記の工程を包含する、請求項４
に記載の方法：（ａ）植物由来の細胞あるいは組織を培養する工程；（ｂ）請求項１に記載の群から選択されるタンパク質を
コードする配列を含有する発現カセットの少なくとも１
つのコピーを、細胞培養あるいは組織培養の細胞へ導入
する工程；および（ｃ）細胞培養あるいは組織培養から、保護された全植
物体を再生産する工程。
【請求項８】請求項７に記載の方法であって、前記発現
カセットにより提供される配列の少なくとも１つのコピ
ーが、再生産の後代細胞に存在する様式で、全植物体を
有性的あるいはクローンにより再生産する工程をさらに
包含する、方法。
【請求項９】前記発現カセットがエレクトロポレーショ
ンにより細胞に導入される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】前記発現カセットが微粒子射突法（ｍｉ
ｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）に
よって細胞に導入される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】前記発現カセットがマイクロインジェク
ションによって細胞に導入される、請求項７に記載の方
法
【請求項１２】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓに感染しやすい双子葉植物に微生物に対
する耐性を与える、請求項７に記載の方法であって、前
記発現カセットを含有するように改変したプラスミドを
有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓで細胞を感染させることにより、細胞に発現カセ
ットを導入する、方法。
【請求項１３】Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒ
ｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ、Ｄ
ｉｐｌｏｄｉａｍａｙｄｉｓ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｏｔ
ｒｉｃｈｕｍｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｖｅｒｔｉｃ
ｉｌｌｕｍａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈ
ｏｒａｍｅｇａｓｐｅｒｍａｅｆ．ｓｐ．ｇｌｙｃ
ｉｎｅａ、Ｍａｃｒｏｐｈｍｉｎａｐｈａｓｅｏｌｉ
ｎａ、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ
ｃａｕｌｉｖｏｒａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌ
ｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｔｒｉ
ｆｏｌｉｏｒｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖ
ｕｓ、およびＡｌｔｅｒｎａｒｉａｌｏｎｇｉｐｅ
ｓから選択される病原体を破壊および阻害する方法であ
って、デフェンジン（Ｄｅｆｅｎｓｉｎ）ＮＰ１、マガ
イニン（Ｍａｇａｉｎｉｎ）−２、マガイニン−Ａ、
マガイニン−Ｇ、α−ホルドチオニン（Ｈｏｒｄｏｔｈ
ｉｏｎｉｎ）、β−ホルドチオニン、β−プロチオニン
（Ｐｕｒｏｔｈｉｏｎｉｎ）、メリチン、ポリ−Ｌ−リ
シンＨＢｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−Ｄ−
リシン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、ポリ−Ｌ−アルギ
ニンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、副腎皮質刺激ホ
ルモン１−１７、副腎皮質刺激ホルモン１−２４、カ
テプシンＧ、リゾチーム、β−ホルドチオニン、好酸
球主要塩基性タンパク質（ＥｏｓｉｎｏｐｈｉｌＭａ
ｊｏｒＢａｓｉｃＰｒｏｔｅｉｎ）、好酸球カチオ
ンタンパク質（ＥｏｓｉｎｏｐｈｉｌＣａｔｉｏｎｉ
ｃＰｒｏｔｅｉｎ）、好酸球パーオキシダーゼ、カシ
ニン、イラクサレクチン（ＳｔｉｎｇｉｎｇＮｅｔｔ
ｌｅＬｅｃｔｉｎ）、マストパラン（Ｍａｓｔｏｒｐ
ａｒａｎ）、Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ
−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ、クエン酸
シンターゼ、ライティカーゼ、ペニシリナーゼ、クロタ
ミンおよびサイトヘリカーゼ（Ｃｙｔｏｈｅｌｉｃａｓ
ｅ）から選択される抗微生物量のタンパク質を、病原体
微生物の環境下に導入することを包含する、方法。
【請求項１４】Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒ
ｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ、Ｄ
ｉｐｌｏｄｉａｍａｙｄｉｓ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｏｔ
ｒｉｃｈｕｍｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｖｅｒｔｉｃ
ｉｌｌｉｕｍａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔ
ｈｏｒａｍｅｇａｓｐｅｒｍａｅｆ．ｓｐ．ｇｌｙ
ｃｉｎｅａ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａｐｈａｓｅｏ
ｌｉｎａ、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｐｈａｓｅｏｌｏｒｕ
ｍｃａｕｌｉｖｏｒａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓ
ｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｔｒ
ｉｆｏｌｉｏｒｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａ
ｖｕｓおよびＡｌｔｅｒｎａｒｉａｌｏｎｇｉｐｅｓ
から選択される病原体による感染を予防する請求項１３
に記載の方法であって、請求項１に記載の群から選択さ
れるタンパク質をコードする配列を、通常該病原体によ
って感染する植物の組織中で、抗微生物量の該タンパク
質を提供するレベルでタンパク質を発現させる、該植物
で活性な転写イニシエーターおよびプロモーター配列に
関して適切なリーディングフレームで、植物ゲノムに挿
入することを包含する、方法。
【請求項１５】前記タンパク質が植物に天然には存在し
ていない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】前記植物が、コムギ、イネおよびモロコ
シから選択される単子葉植物の種である、請求項１４に
記載の方法。
【請求項１７】さらに、下記の工程を包含する、請求項
１４に記載の方法：（ａ）植物由来の細胞あるいは組織を培養する工程；（ｂ）請求項１に記載の群から選択されるタンパク質を
コードする配列を含有する発現カセットの、少なくとも
１つのコピーを細胞培養あるいは組織培養の細胞に導入
する工程；および（ｃ）細胞培養あるいは組織培養から、保護された全植
物を再生産する工程。
【請求項１８】請求項１７に記載の方法であって、前記
発現カセットにより提供される配列の少なくとも１つの
コピーが、再生産の後代細胞に存在する様式で、全植物
体を有性的あるいはクローンにより再生産する工程をさ
らに包含する、方法。
【請求項１９】前記発現カセットがエレクトロポレーシ
ョンによって細胞に導入される、請求項１７に記載の方
法。
【請求項２０】前記発現カセットが微粒子射突法によっ
て導入される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】前記発現カセットがマイクロインジェク
ションによって導入される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】前記発現カセットを含有するように改変
したプラスミドを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓで細胞を感染させることにより
細胞に発現カセットを導入して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに感染しやすい双子葉
植物に微生物に対する耐性を与える、請求項１７に記載
の方法。
【請求項２３】Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒ
ｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ、Ｄ
ｉｐｌｏｄｉａｍａｙｄｉｓ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｏｔ
ｒｉｃｈｕｍｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｖｅｒｔｉｃ
ｉｌｌｉｕｍａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔ
ｈｏｒａｍｅｇａｓｐｅｒｍａｅｆ．ｓｐ．ｇｌｙ
ｃｉｎｅａ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａｐｈａｓｅｏ
ｌｉｎａ、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｐｈａｓｅｏｌｏｒ
ｕｍｃａｕｌｉｖｏｒａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ
ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ
ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆ
ｌａｖｕｓ、およびＡｌｔｅｒｎａｒｉａｌｏｎｇｉ
ｐｅｓから選択される病原体によって引き起こされる病
気に対する耐性を、該病気に感染しやすい植物の分類群
に与える方法であって、さらに下記の工程を包含する方
法；（ａ）請求項１７に記載の方法によって、性的に適合す
る植物から調製された、稔性で病気に対して耐性のある
植物を選択する工程；（ｂ）該病気に対して耐性のある植物と該病気に感染し
やすい分類群の植物とを有性交配する工程；（ｃ）該交配の後代から再生産物を回収する工程；およ
び（ｄ）再生産物から、保護された植物を生育させる工
程。
【請求項２４】実質的にホモ接合の植物からなる分類群
に、病気に対する耐性および抗微生物活性を与える請求
項２３に記載の方法であって、下記の工程を繰り返し包
含する、方法：（ａ）病気に耐性のある後代を、該分類群由来の実質的
にホモ接合で病気に感染しやすい植物と戻し交配する工
程；および（ｂ）戻し交配の後代から、感染しやすい分類群の病気
に対する耐性および抗微生物活性の発現を、他の望まし
い性質の発現と共に選択する工程であって、感染しやす
い群の性質が所望の率で、病気に対する耐性および抗微
生物活性を伴って後代中に存在するまで繰り返す工程。
【請求項２５】実質的に請求項１に記載の群から選択さ
れるタンパク質のみをコードする、植物ゲノム由来のＤ
ＮＡクローン。
【請求項２６】請求項２５に記載のＤＮＡクローンを含
有する発現カセットであって、植物細胞で該ＤＮＡクロ
ーンの発現を引き起こす植物の制御配列に作動可能に結
合された、発現カセット。
【請求項２７】請求項２５に記載のＤＮＡクローンを含
有する発現カセットであって、細菌細胞中で該ＤＮＡク
ローンの発現を引き起こす細菌の発現制御配列に作動可
能に結合された、発現カセット。
【請求項２８】請求項２７に記載の発現カセットの少な
くとも１つのコピーを、外来のプラスミドとして含有す
る、細菌細胞。
【請求項２９】請求項２６に記載の発現カセットのＤＮ
Ａ配列の少なくとも１つのコピーを外来のＤＮＡとして
含有する、形質転換された植物細胞。
【請求項３０】さらに、単子葉植物の種の細胞であるこ
とにより特徴付けられる、請求項２９に記載の形質転換
された細胞。
【請求項３１】さらに、トウモロコシ、モロコシ、コム
ギおよびイネの細胞であることにより特徴付けられる、
請求項３０に記載の形質転換された細胞。
【請求項３２】さらに、双子葉植物の種の細胞であるこ
とにより特徴付けられる、請求項２９に記載の形質転換
された細胞。
【請求項３３】さらに、ダイズ、アルファルファ、タバ
コあるいはトマトの細胞であることにより特徴付けられ
る、請求項３２に記載の形質転換された細胞。
【請求項３４】請求項３１に記載の細胞を含有する、ト
ウモロコシの細胞培養物あるいは組織培養物。
【請求項３５】形質転換されたトウモロコシ植物体であ
って、その細胞が請求項２６に記載の発現カセットのＤ
ＮＡ配列の少なくとも１つのコピーを、外来のＤＮＡと
して含有する、植物体。
【請求項３６】請求項１に記載の群から選択されるタン
パク質の抗微生物量を無毒性の媒体中に含有する、抗微
生物組成物。
【請求項３７】前記媒体が感染しやすい生物に対する全
身投与用に適している、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】病原体Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒｍｉｎｅ
ｒｕｍを破壊および阻害する方法であって、マガイニン
−２、マガイニン−Ａ、マガイニン−Ｇ、ポリ−Ｌ−ア
ルギニンＨＣｌポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｌ−
リシンＨＢｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−Ｄ
−リシン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、マストパラン
（Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ）、カシニン、Ｐｒｏ−Ｈｉｓ
−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−
Ｔｙｒ−Ｌｙｓ、副腎皮質刺激ホルモン１−１７、副
腎皮質刺激ホルモン１−２４、クエン酸シンターゼ、デ
フェンシンＮＰ１、カテプシンＧ、リゾチーム、α−ホ
ルドチオニン、β−ホルドチオニン、β−プロチオニ
ン、クロタミン、メリチン、好酸球主要塩基性タンパク
質、好酸球カチオンタンパク質および好酸球パーオキシ
ダーゼからなる群から選択される抗微生物量のタンパク
質を、病原体微生物の環境下に導入することを包含す
る、方法。
【請求項３９】病原体Ｆｕｓａｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉ
ｆｏｒｍｅを破壊および阻害する方法であって、マガイ
ニン−２、マガイニン−Ａ、マガイニン−Ｇ、ポリ−Ｌ
−アルギニンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−
Ｌ−リシンＨＢｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−
Ｄ−リシン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、マストパラ
ン、カシニン、Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉ
ｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ、副腎皮
質刺激ホルモン１−１７、副腎皮質刺激ホルモン１−
２４、クエン酸シンターゼ、デフェンシンＮＰ１、カテ
プシンＧ、リゾチーム、α−ホルドチオニン、β−ホル
ドチオニン、β−プロチオニン、メリチン、好酸球主要
塩基性タンパク質、好酸球カチオンタンパク質および好
酸球パーオキシダーゼからなる群から選択される抗微生
物量のタンパク質を、病原体微生物の環境下に導入する
ことを包含する、方法。
【請求項４０】病原体Ｄｉｐｏｄｉａｍａｙｄｉｓ
を破壊および阻害する方法であって、マガイニン−２、
マガイニン−Ａ、マガイニン−Ｇ、ポリ−Ｌ−アルギニ
ンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｌ−リシン
ＨＢｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−Ｄ−リシ
ン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、デフェンシンＮＰ
１、β−ホルドチオニン、β−プロチオニンおよびメリ
チンなる群から選択される抗微生物量のタンパク質を、
病原体微生物の環境下に導入することを包含する、方
法。
【請求項４１】病原体Ｃｏｌｌｅｔｏｔｏｔｒｉｃｈｕ
ｍｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａを破壊および阻害する方法
であって、マガイニン−Ａ、マガイニン−Ｇ、ポリ−Ｌ
−アルギニンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−
Ｌ−リシンＨＢｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−
Ｄ−リシン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、デフェンシン
ＮＰ１、α−ホルドチオニン、β−プロチオニンおよ
びメリチンなる群から選択される抗微生物量のタンパク
質を、病原体微生物の環境下に導入することを包含す
る、方法。
【請求項４２】病原体Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍａｌ
ｂｏ−ａｔｒｕｍを破壊および阻害する方法であって、
マガイニン−２、マガイニン−Ａ、マガイニン−Ｇ、ポ
リ−Ｌ−アルギニンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、
ポリ−Ｌ−リシンＨＢｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨＣ
ｌ、ポリ−Ｄ−リシン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、デ
フェンシンＮＰ１、α−ホルドチオニン、β−プロチ
オニンおよびメリチンなる群から選択される抗微生物量
のタンパク質を、病原体微生物の環境下に導入すること
を包含する、方法。
【請求項４３】病原体Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｍｅ
ｇａｓｐｅｒｍａｅｆ．ｓｐ．ｇｌｙｃｉｎｅａを
破壊および阻害する方法であって、マガイニン−２、ポ
リ−Ｌ−リシンＨＢｒ、デフェンシンＮＰｌ、β−
プロチオニンおよびメリチンなる群から選択される抗微
生物量のタンパク質を、病原体微生物の環境下に導入す
ることを包含する、方法。
【請求項４４】病原体Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａｐｈ
ａｓｅｏｌｉｎａを破壊および阻害する方法であって、
ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｄ−リシン、ポリ−Ｄ−
リシンＨＢｒ、デフェンシンＮＰ１、α−ホルドチ
オニン、β−プロチオニンからなる群から選択される抗
微生物量のタンパク質を、病原体微生物の環境下に導入
することを包含する、方法。
【請求項４５】病原体Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｐｈａｓｅ
ｏｌｏｒｕｍｃａｕｌｉｖｏｒａを破壊および阻害す
る方法であって、デフェンシンＮＰ１、α−ホルドチ
オニンおよびβ−プロチオニンからなる群から選択され
る抗微生物量のタンパク質を、病原体微生物の環境下に
導入することを包含する、方法。
【請求項４６】病原体Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌ
ｅｒｏｔｉｏｒｕｍを破壊および阻害する方法であっ
て、マガイニン−Ａ、マガイニン−Ｇ、ポリ−Ｌ−アル
ギニンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｌ−リ
シンＨＢｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−Ｄ−
リシン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、マストパラン、デ
フェンシンＮＰ１、カテプシンＧ、リゾチーム、α
−ホルドチオニン、β−ホルドチオニン、β−プロチオ
ニン、イラクサレクチン、クロタミン、メリチン、好酸
球主要塩基性タンパク質および好酸球カチオンタンパク
質からなる群から選択される抗微生物量のタンパク質
を、病原体微生物の環境下に導入することを包含する、
方法。
【請求項４７】病原体Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｔｒｉ
ｆｏｌｉｏｒｕｍを破壊および阻害する方法であって、
マガイニン−Ａ、ポリ−Ｌ−アルギニンＨＣｌ、ポリ
−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｌ−リシンＨＢｒ、ポリ−
Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−Ｄ−リシン、ポリ−Ｄ−リシ
ンＨＢｒ、マストパラン、デフェンシンＮＰ１、カ
テプシンＧ、リゾチーム、α−ホルドチオニン、β−
ホルドチオニン、β−プロチオニン、イラクサレクチ
ン、クロタミン、メリチン、好酸球主要塩基性タンパク
質および好酸球カチオンタンパク質からなる群から選択
される抗微生物量のタンパク質を、病原体微生物の環境
下に導入することを包含する、方法。
【請求項４８】病原体Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａ
ｖｕｓを破壊および阻害する方法であって、マガイニン
−２、マガイニン−Ａ、マガイニン−Ｇ、ポリ−Ｌ−ア
ルギニンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｌ−
リシンＨＢｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−Ｄ
−リシン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、マストパラン、
カシニン、デフェンシンＮＰ１、カテプシンＧ、リ
ゾチーム、α−ホルドチオニン、β−ホルドチオニン、
β−プロチオニン、ラクサレクチン、クロタミン、メリ
チン、および好酸球カチオンタンパク質からなる群から
選択される抗微生物量のタンパク質を、病原体微生物の
環境下に導入することを包含する、方法。
【請求項４９】病原体Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｌｏｎｇ
ｉｐｅｓを破壊および阻害する方法であって、マガイニ
ン−２、マガイニン−Ａ、マガイニン−Ｇ、ポリ−Ｌ−
アルギニンＨＣｌ、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｌ
−リシンＨＢｒ、ポリ−Ｌ−リシンＨＣｌ、ポリ−Ｄ
−リシン、ポリ−Ｄ−リシンＨＢｒ、マストパラン、
Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ、副腎皮質刺激ホルモン
１−１７、副腎皮質刺激ホルモン１−２４、クエン酸
シンターゼ、デフェンシンＮＰｌ、カテプシンＧ、リ
ゾチーム、α−ホルドチオニン、β−ホルドチオニン、
β−プロチオニン、クロタミン、メリチン、好酸球主要
塩基性タンパク質、好酸球カチオンタンパク質および好
酸球パーオキシダーゼからなる群から選択される抗微生
物量のタンパク質を、病原体微生物の環境下に導入する
ことを包含する、方法。
【請求項５０】請求項１に記載のタンパク質の安全かつ
有効な量を含有する、抗真菌活性を有する単位投与形態
の薬学的組成物。
【請求項５１】処置の必要なヒトおよび他の動物に抗真
菌処置を提供する方法であって、請求項１に記載のタン
パク質の安全かつ有効な量を、ヒトあるいは他の動物に
投与する工程を包含する、方法。
【請求項５２】前記化合物が局所的に投与される、請求
項５１に記載の方法。
【請求項５３】前記化合物が非経口的に投与される、請
求項５１に記載の方法。
【請求項５４】前記化合物が筋肉内投与される、請求項
５３に記載の方法。
【請求項５５】前記化合物が皮下投与される、請求項５
３に記載の方法。