DE69525165T2

DE69525165T2 - Schädlingsfangpflanzen und pflanzenschutz

Info

Publication number: DE69525165T2
Application number: DE69525165T
Authority: DE
Inventors: M. Dandekar; John Driver
Original assignee: University of California; Treetech Management Inc
Current assignee: University of California; Treetech Management Inc
Priority date: 1994-09-14
Filing date: 1995-09-14
Publication date: 2002-10-02
Anticipated expiration: 2015-09-15
Also published as: PT784421E; WO1996008136A1; US5640804A; ZA957691B; DE69525165D1; AU3595795A; ES2170808T3; EP0784421A4; DK0784421T3; ATE212182T1; EP0784421B1; CA2219915A1; EP0784421A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der DNA-Rekombinationstechnologie. Im Speziellen bezieht sie sich auf Verfahren zur Nutzung von Genen, die für pestizide Proteine kodieren, um Schädlinge auf landwirtschaftlich wichtigen Pflanzen zu bekämpfen.
Zum Schutz gegen eine Vielzahl von Schädlingen in der Landwirtschaft und in der Forstindustrie verlässt man sich in umfangreichen Ausmaß auf synthetische Chemikalien. Die Verwendung einer mit einem systemischen Insektizid behandelten Pflanze zur Hemmung der Ausbreitung von Pflanzenviren wird von Grey et al., Plant Disease Reporter 57(8), 684-688, beschrieben. Der Einsatz von chemischen Schädlingsbekämpfungsmitteln hat jedoch zu einer Reihe von Problemen geführt. Im Speziellen haben viele befallende Insekten Resistenzen gegen weit verbreitete Verbindungen entwickelt. Darüber hinaus hat dieser weit verbreitete Einsatz zu Bedenken in Bezug auf Umweltverschmutzung geführt. Viele dieser Verbindungen haben schädliche Auswirkungen auf Nicht-Zielorganismen, wie z. B. Vögel und auch Menschen. Die Verbindungen können sich in der Nahrungskette akkumulieren und die natürlichen Räuber der befallenden Insekten beeinflussen.
Diese Befürchtungen haben dazu geführt, dass ein verstärkter Schwerpunkt auf alternative Strategien zur Schädlingsbekämpfung gelegt wurde. So würden z. B. Gene aus Viren und Bakterien, die für für Insekten und andere Schädlinge toxische Proteine kodieren, in der Schädlingsbekämpfung verwendet. Das am häufigsten verwendete dieser Proteine ist ein toxisches Protein eines grampositiven Bodenbakteriums, Bacillus thuringiensis (Bt-Toxin). B. thuringiensis produziert eine(n) proteinhältige(n) Paraspore oder Kristall, die bzw. das nach Aufnahme durch einen empfänglichen Insektwirten toxisch ist. Die Klonierung und Expression von Bt-Toxin-Genen wurde bereits in der Literatur beschrieben (H. E. Schnepf und H. R. Whitely, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2893-2897 (1981); US-Patente Nr. 5.236.843, 5..26.166 und 5.135.867). Transgene Pflanzen mit dieser Protein-Expression wurden verwendet, um eine Reihe von Pflanzenschädlingen zu bekämpfen. Die WO 92/15690 beschreibt die Herstellung von Fadenwurm-resistenten transgenen Pflanzen, die ein Proteinase-Inhibitor-Gen, wie z. B. Längbohnen-Trypsininhibitor (CpTi), exprimieren.
Die Verwendung transgener Pflanzen bei Nahrungserntepflanzen bringen aber neue Probleme zum Vorschein. So hemmen z. B. öffentlicher Widerstand und zusätzliche regulatorische Hürden die Produktion und den Verkauf transgener Nahrungserntepflanzen. Darüber hinaus, im Fall von perennierenden Pflanzen, können die Kosten für den Ersatz von Obst- und Weingärten und ähnlichen durch transgene Kulturrassen untragbar sein.
Somit besteht ein Bedarf für neue Ansätze, um die in der Pflanzengentechnologie erzielten Fortschritte für die Schädlingsbekämpfung anzuwenden. Die vorliegende Erfindung betrifft diese und andere Bedürfnisse.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Bekämpfung von Insektenbefall auf einer ersten Pflanze. Das Verfahren umfasst das Anpflanzen einer zweiten Pflanze in Nachbarschaft der ersten Pflanze, wobei die zweite Pflanze ein bevorzugter Wirt für das befallende Insekt ist und ein heterologes, insektizides Gen umfasst. Die zweite Pflanze wird hierin als den Insektenbefall abfangende Pflanze bezeichnet.
Ein Beispiel für ein solches Insekt ist die Apfelmade. Typischerweise kodiert das heterologe pestizide Gen für das Bacillus thuringiensis-Toxin, welches gegen Insektenbefall durch Schmetterlinge wirksam ist. Ein weiteres Beispiel für ein heterologes pestizides Gen ist eines, das für Langbohnen-Trypsininhibitor kodiert.
Typischerweise ist die zweite Pflanze ein Vertreter einer anderen Spezies als die erste Pflanze. In einigen Ausführungsformen ist die zweite Pflanze eine unkultivierte Pflanze. Ein Beispiel für eine Insektenbefall abfangende Pflanze sind Äpfel, die entweder mit Walnuss oder Birne in Kombination verwendet werden. Die Insektenbefall abfangende Pflanze kann auf demselben Feld wie die erste Pflanze angepflanzt werden.
Es besteht auch ein Anspruch auf ein Feld, welches eine Erntepflanze von Interesse und eine Insektenbefall abfangende Pflanze beinhaltet. Die Insektenbefall abfangende Pflanze ist ein bevorzugter Wirt für ein die Erntepflanze befallendes Insekt und umfasst ein heterologes insektizides Gen.

Definitionen

Ein "pestizides Gen" ist ein Polynucleotid, das, wenn es in einer Pflanzenzelle exprimiert wird, die Infektion der Pflanze durch den Pflanzenschädling verhindert. Das Gen kodiert vorzugsweise für ein Protein, das direkt die Entwicklung des Pflanzenschädlings hemmt und/oder für den Schädling toxisch ist. Ein Beispiel für ein pestizides Gen der Erfindung ist das Bt-Toxin-Gen.
Ein "Pflanzenschädling" ist ein Organismus, der in einer schädlich Weise auf die normale Entwicklung der Pflanze Einfluss nimmt. Ein Pflanzenschädling kann jedes Pflanzenorgan angreifen, einschließlich Blättern, Wurzeln, Blüten, Früchten und dergleichen. Pflanzen befallende Insekten, auf die das Verfahren der vorliegenden Erfindung abzielt, sind jene mit Verhaltenscharakteristiken, wonach der Schädling einen Pflanzenwirt einem anderen vorzieht.
Wie hierin verwendet ist eine Pflanze, die ein "bevorzugter Wirt" für einen bestimmten Pflanzenschädling ist, eine, die im Vergleich mit einer Erntepflanze von Interesse den Schädling vorzugsweise anzieht. Der bevorzugte Wirt kann eine andere Kulturrasse derselben Spezies wie die Erntepflanze sein, er kann aber auch einer wilden oder unkultivierten Spezies angehören. Der Grund für eine bevorzugte Anziehung des bevorzugten Wirtes ist nicht entscheidend und kann auf einen beliebigen Grund zurückgehen, z. B. Zeitpunkt der Blätter- oder Blütenproduktion des bevorzugten Wirtes oder relativer Mangel an inhibierenden Verbindungen in Blättern oder anderen Geweben. Die Vorliebe eines Schädlings für eine bestimmten Wirtpflanze kann das Ergebnis einer evolutionären Entwicklung zwischen den beiden Organismen sein, so etwa das Vorhandensein eines speziellen Chemoattraktivums in der Wirtpflanze.
Weiters ist auch der Grad, in welchem der Schädling den bevorzugten Wirt einer Erntepflanze von Interesse vorzieht, nicht von Entscheidung. Typischerweise sind die Verfahren der Erfindung um so effektiver, je größer der Unterschied in der Präferenz zwischen den beiden Pflanzen ist.
Eine "Insektenbefall abfangende Pflanze" ist eine bevorzugte Wirtpflanze, welche die genetische Information für ein pestizides Gen enthält.
Eine "unkultivierte Pflanze" ist eine Pflanze, die nicht von einer Pflanzenvielfalt, wie sie typischerweise im Verwendungsgebiet kultiviert wird, im garten- oder landwirtschaftstechnischen Sinn abstammt. Für gewöhnlich ist eine unkultivierte Pflanze eine wilde Spezies, die mit der Erntepflanze von Interesse verwandt sein kann oder auch nicht. So kann z. B. der Kalifornische Schwarze Walnussbaum als bevorzugter Wirt mit englischen Walnusskulturrassen verwendet werden.
Der Terminus "in Nachbarschaft", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf den Abstand zwischen einer Schädlingsbefall abfangenden Pflanze und einer Erntepflanze. Der genaue Abstand zwischen den zwei Pflanzen ist für die Erfindung nicht entscheidend und hängt unter anderem von der Erntepflanze von Interesse, dem zu bekämpfenden Schädling, Bodencharakteristiken und Klimabedingungen, in welchen die Pflanzen angebaut werden, ab. Die beiden Pflanzen werden als "in Nachbarschaft" befindlich betrachtet, wenn die Schädlingsbefall abfangende Pflanze nahe genug bei der Erntepflanze liegt, um die Schädlingspopulation auf der Erntepflanze wesentlich zu senken. In manchen Fällen pflanzt man die Schädlingsbefall abfangende Pflanze in einem Feld oder einem Garten an, in welchem die Erntepflanze angebaut wird. Als Alternative kann die Schädlingsbefall abfangende Pflanze auch außerhalb des Feldes gepflanzt werden, um eine Barriere gegen Schädlingsbefall zu liefern.
Der Terminus "Expression" bezieht sich auf Transkription und Translation eines Struktur- Gens, so dass ein Protein synthetisiert wird.
Der Terminus "operabel verbunden" bezieht sich auf die funktionelle Kopplung zwischen einer Promotorsequenz und einer zweiten Sequenz, wobei die Promotorsequenz die Transkription der RNA entsprechend der zweiten Sequenz initiiert.
Der Terminus "Pflanze" umfasst ganze Pflanzen, Pflanzenorgane (d. h. Blätter, Stiele, Wurzeln, etc.), Samen und Pflanzenzellen. Die Pflanzenklasse, die im Verfahren der Erfindung verwendet werden kann, ist im Allgemeinen so weitläufig wie die Klasse der höheren Pflanzen, welche für Transformationstechniken zugänglich sind, was sowohl einkeimblättrige als auch zweikeimblättrige Pflanzen umfasst. Dies schließt auch Pflanzen mit einer Vielzahl unterschiedlicher Chromosomensätze ein, darunter polyploide, diploide und haploide Pflanzen.
Der Terminus "Promotor" bezieht sich auf eine Region der DNA stromauf vom Struktur- Gen, welche in die Erkennung und Bindung der RNA Polymerase und anderer Porteine zur Initiierung von Transkription eingebunden ist. Ein "Pflanzenpromotor" ist ein Promotor, der Transkription in Pflanzenzellen initiieren kann.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Die vorliegender Erfindung liefert ein neues Verfahren zur Bekämpfung einer Vielfalt von Pflanzenschädlingen durch die Verwendung transgener Pflanzen. Die Verfahren bekämpfen Schädlinge auf einer gewünschten Erntepflanze, indem sie transgene Schädlingsbefall abfangende Pflanzen einer anderen Spezies oder Sorte verwenden, die für den Zielschädling der bevorzugte Wirt sind und dadurch den Schädling vorzugsweise anziehen. Die Schädlingsbefall abfangenden. Pflanzen beinhalten die genetische Information, die für ein für den Schädling toxisches Protein kodiert, was in einer Verringerung der Schädlingspopulation auf der gewünschten Erntepflanze resultiert.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann für die Bekämpfung jeglicher befallender Insekten eingesetzt werden. Das Verfahren der Erfindung kann auf jedes befallende Insekt, dessen toxische Gene bekannt sind oder später herausgefunden werden, abzielen. Eine Reihe von befallenden Insekten von Erntepflanzen ist bereits identifiziert und charakterisiert worden. So wurden etwa befallende Insekten der Gattungen Lepidoptera (Schmetterlinge, Maden), Coleoptera (Käfer), Diptera (Fliegen, Stechmücken) und Orthoptera (Heuschrecken, Grashüpfer, Grillen) umfangreichen Studien unterzogen. Beispiele für befallende Insekten umfassen Apfelwickler, Walnussschalenfliege, Apfelmade, Mittelmeerfruchtfliege, Nabelkrautwurm, Wicklerlarve, orientalische Fruchtmade, Colorado Kartoffelkäfer, weiße Süßkartoffelfliege, Lyguswanze, Singzirpe, Blattlaus und Spinnenmilbe.
Die Erfindung kann auch zur Bekämpfung von Insekten verwendet werden, die als Vektoren für Pflanzenpathogene wie z. B. Viren, Pilze, Bakterien und andere Mikroorganismen dienen. Beispiele dafür umfassen die Singzirpe, die ein Vektor für Mycoplasmainfektion in Kirschen ist, sowie Pyslla, die ein Mycoplasma verbreitet, das Birnbäume zerstört. Ein anderes Beispiel ist die weiße Süßkartoffelfliege, die ein Virus verbreitet, das infektiöse Gelbsucht bei Kohlpflanzen verursacht.

Konstruktion von Expressionsvektoren

Die für die Rekombinationsexpression von gewünschten Genen in transgenen Pflanzen nötigen Verfahren sind Fachleuten auf dem Gebiet der Technik gut bekannt. Kurz gesagt werden Expressionskassetten, die den passenden an ein Struktur-Gen, das für ein gewünschtes Protein kodiert, operabel verbundenen Promotor beinhalten, in die Pflanze eingeführt. Die Konstruktion von geeigneten Expressionsvektoren wird mittels Standardtechniken ausgeführt.
Im Allgemeinen sind die Nomenklatur und die Laborverfahren in der DNA-Rekombinationstechnik, wie nachfolgend beschrieben, in der Technik bekannt und werden allgemein angewendet. Standardtechniken werden zur Klonierung, DNA- und RNA-Isolierung, Amplifikation und Reinigung verwendet. Allgemein enzymatische Reaktionen, die DNA Ligase, DNA Polymerase, Restriktionsandonuclease und dergleichen enthalten, werden nach den Ausführungen der Hersteller ausgeführt. Diese Techniken und verschiedene anderen Techniken werden im Allgemeinen nach dem Handbuch Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989), durchgeführt.
Die Minimalanforderungen des Vektors bestehen darin, dass die gewünschte Nucleinsäuresequenz in relativ intaktem Zustand eingeführt wird. Somit sollte jeder beliebige Vektor ausreichen, der eine Pflanze ergibt, die die eingeführte DNA-Sequenz trägt. Die Auswahl von Vektoren und Verfahren zur Konstruktion derselben sind Fachleuten auf diesem Gebiet der Technik bekannt und werden in allgemeinen technischen Referenzen (siehe allgemein "Methods in Enzymology", Band 153 ("Recombinant DNA Part D"), Wu und Grossman (Hrsg.), Academic Press (1987)) beschrieben.
Die rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung umfassen typischerweise eine Expressionskassette, die einen Promotor zur Initiierung der Transkription der gewünschten Polynucleotid-Sequenz in Pflanzen umfassen. Begleitsequenzen bakteriellen Ursprungs sind ebenfalls enthalten, um dem Vektor die Klonierung im bakteriellen Wirt zu ermöglichen. Der Vektor umfasst vorzugsweise prokaryotischen Replikationsursprünge für eine breite Vielfalt von Wirten. Ein selektierbarer Marker sollte ebenfalls enthalten sein, um die Selektion bakterieller Zellen als Träger des gewünschten Konstrukts zu ermöglichen. Geeignete prokaryotische selektierbare Marker umfassen Resistenz gegen Antibiotika wie Kanamycin, Gentamycin oder Tetracyclin.
Bei der Konstruktion von Kombinationen aus heterologem Promotor und Struktur-Gen ist der Promotor bevorzugterweise in der gleichen Entfernung von der heterologen Ausgangsstelle der Transkription entfernt positioniert wie von der Ausgangsstelle der Transkription in seiner natürlichen Umgebung. Wie in der Technik bekannt kann eine Variation dieser Entfernung ohne den Verlust der Promotorfunktion erfolgen.
Der Promotor kann "konstitutiv" sein und die Genexpression in allen Geweben der regenerierten Pflanze steuern. Solche Promotoren sind typischerweise unter den meisten Umweltbedingungen sowie Stadien der Entwicklung und Zelldifferenzierung aktiv. Beispiele für konstitutive Promotoren umfassen die 35S-Transkriptionsinitiationsregion des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV), den 1'- oder 2'- Promotor der T-DNA von Agrobacterium tumafaciens und andere Transkriptionsinitiationsregionen verschiedener Pflanzengene, die Fachleuten auf dem Gebiet der Technik bekannt sind.
Alternativ kann der Pflanzenpromotor die Genexpression in einem spezifischen Gewebe kontrollieren, er kann aber auch unter der Kontrolle von Umwelt- und Entwicklungseinflüssen stehen: Solche Promotoren werden hierin als "induzierbar" bezeichnet. Beispiele für Umweltbedingungen, die Transkription durch induzierbare Promotoren bewirken können, umfassen anaerobe Bedingungen sowie die Gegenwart von Licht.
Beispiele für Promotoren, die durch Entwicklungsbedingungen kontrolliert werden, umfassen Promotoren, die Transkription nur in bestimmten Geweben, wie etwa Wurzeln, Frucht, Samen oder Blüten, auslösen. Durch die Verwendung eines bestimmten organspezifischen Promotors kann die Genexpression auf die gewünschten Gewebe innerhalb der Pflanze ausgerichtet sein. So kann z. B. ein fruchtspezifischer Promotor verwendet werden, um die Expression von Toxin-Genen auf Blüten, Frucht oder Samen auszurichten, um auf die diese Gewebe befallenden Schädlinge abzuzielen. Für eine allgemeine Beschreibung geeigneter Promotoren siehe J. K. Okamuro und R. B. Goldberg, "Regulation of plant gene expression: general principles", The Biochemistry of Plants: A Comprehensive Treatise, Band 15 (1989).
Für die Expression von Polypeptiden in Pflanzen beinhaltet die Rekombinations-Expressionskassette zusätzlich zur gewünschten Polynucleotid-Sequenz und dem Promotor eine Transkriptionsinitiationssstelle (wenn der zu transkribierenden Sequenz eine fehlt) sowie eine Transkriptionsterminationsstelle. Die Terminationsregion kann von demselben Gen wie die Promotorsequenz oder von anderen Genen erhalten werden.
Wenn die vom Struktur-Gen kodierte mRNA effizient translatiert werden soll, werden gemeinsam noch Polyadenylierungs-Sequenzen an das Vektor-Konstrukt angefügt. Polyadenylierungs-Sequenzen umfassen, sind auf aber nicht darauf beschränkt, das Octopin- Synthase-Signal von Agrobacterium (Gielen et al., EMBO J. 3, 835-846 (1984)) oder das Nopalin-Synthase-Signal (Depicker et al., Mol and Appl. Genet. 1, 561-573 (1982)).
Der Vektor umfasst typischerweise auch ein selektierbares Marker-Gen, durch welches transformierte Pflanzenzellen in Kultur identifiziert werden können. Normalerweise kodiert das Marker-Gen für Antibiotikaresistenz. Diese Marker umfassen Resistenz gegen G418, Hygromycin, Bleomycin, Kanamycin und Gentamycin. Nach Transformation der Pflanzenzellen kann man jene Zellen, die über den Vektor verfügen, dadurch identifizieren, dass sie sich in einem Medium mit dem bestimmten Antibiotikum vermehren können. Darüber hinaus können diese Vektoren auch detektierbare Marker-Gene beinhalten, die für das Enzym β-Glucuronidase (GUS) kodieren, welche in transgenen Geweben visuell nachgewiesen werden können und beim Screenen von Pflanzentransformanten nützlich sind.
Das spezielle Pestizid-Struktur-Gen, das zur Inhibierung von Pflanzenschädlingen verwendet wird, stellt keinen entscheidenden Aspekt der Erfindung dar. In der Technik ist eine ganze Reihe solcher Gene bekannt. Die am häufigsten verwendeten mikrobiellen Toxin-Gene stammen vom Bakterium Bacillus thuringiensis. Die Klonierung und Expression dieses Bt-Toxin-Gens wurde bereits beschrieben. Die Toxin-Gene von verschiedenen B. thuringiensis-Stämmen sind gegen verschiedene Insekten wirksam. Bt-Toxine, die gegen Angehörige der Lepidoptera (Maden und Schmetterlinge), Diptera (Fliegen und Stechmücken) und Coleoptera (Käfer) aktiv sind, wurden beschrieben. Die US-Patente Nr. 5.236.843, 5.26.166 und 5135.867 beschreiben Toxin-Gene, die gegen Lepidoptera-Spezies wirksam sind. Ein Gen, das für ein Nematoden-aktives Toxin kodiert, wird im US-Patent Nr. 5.236.843 beschrieben.
Andere insektizide Gene umfassen jene, die für Proteinaseinhibitoren kodieren, so etwa Langbohnen-Trypsininhibitor (in WO92/15690 beschrieben), Sojabohnen-Lipoxidase, Polyphenol-Oxidase, Weizen-α-Amylase, Schneeglöckchen-Lectin und eine Vielzahl verschiedener Pflanzenlectine. Für eine Beschreibung geeigneter Gene siehe V. A. Hilder et al., "Genes for protecting transgenic crops from chewing and sap-sucking insect, pests", "Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference on Pest and Diseases", Bd. 2, 731-740 (1992)).

B. Pflanzentransformation

Die oben beschriebenen verschiedenen DNA-Konstrukte können in das Genom der gewünschten Pflanze mittels einer Vielzahl konventioneller Techniken eingeführt werden. So kann das DNA-Konstrukt z. B. direkt in die Genom-DNA der Pflanzenzelle durch Polyethylenglykol-Präzipitation (Paszkowski et al., Embo J. 3, 2717-2722 (1984)), Elektroporation und Mikroinjektion in Pflanzenzellenprotoplasten (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)) eingeführt werden, oder das DNA-Konstrukt kann auch durch ballistische Verfahren, so etwa DNA-Partikelbeschuss (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)) in das Pflanzengewebe eingeführt werden. Alternativ dazu können die DNA-Konstrukte mit geeigneten T-DNA flankierenden Regionen kombiniert und in einen konventionellen Agrobacterium tumefaciens-Wirtsvektor eingeführt werden. Die virulente Funktion des Agrobacterium tumefaciens-Wirts lenkt den Einsatz des Konstruktes und des bzw. der benachbarten Marker-Gens oder -Gene in die Pflanzenzellen- DNA, wenn die Zelle durch ein Bakterium infiziert wird. Um einen Überblick über Gentransferverfahren für Pflanzen- und Zellkulturen zu erhalten, siehe H. J. Fisk und A. M. Dandekar, "The introduction and expression of transgenes in crop plants", Scientia Horticulturae 55, 5-36 (1993), und Potrykus CIBA Found. Symp. 154-198 (1990).
Transformationsverfahren mittels Agrobacterium tumefaciens sind die am häufigsten verwendeten Verfahren für den Gentransfer in Pflanzen. Diese Verfahren sind in der wissenschaftlichen Literatur sehr gut dokumentiert. Siehe z. B. Horsch et al., Science 233, 496-498 (1984); Fralex et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4803 (1983); und Hooykaas, Plant Mol. Biol. 13, 327-336 (1989).
Alle Spezies, die einen natürlichen Wirt von Agrobacterium darstellen, sind in vitro transformierbar. Die meisten zweikeimblättrigen Pflanzen können durch Agrobacterium transformiert werden. Einkeimblättrige Pflanzen, und im Speziellen Getreidepflanzen, sind keine natürlichen Wirte für Agrobacterium. Es gibt immer mehr Beweise dafür, dass gewisse Monokoten durch Agrobacterium transformiert werden können. Durch neue experimentelle Ansätze ist es nunmehr auch möglich, Getreidepflanzen, wie z. B. Roggen (de la Pena et al., Nature 325, 274-276 (1987)), Mais (Rhodes et al., Science 240, 204- 207 (1988)) und Reis (Shimamoto et al., Nature 338, 274-276 (1989)) zu transformieren.
Die Transformation einer Reihe von Holzpflanzen durch Agrobacterium und andere Verfahren wurden beschrieben (P. L. Shuerman und A. M. Dandekar, "Transformation of Temperature Crop Species: Progress and Potentials", Scientia Horticulturae 55, 101-124 (1993)). So wird z. B. die Regeneration und Transformation von Äpfeln von James et al., Plant Cell Rep. 7, 658-661 (1989), beschrieben. Gewebekulturverfahren für Äpfel einschließlich Mikrovermehrung (O. P. Jones, Nature 262, 392-393 (1976); R. H. Zimmerman, Methods in Fruit Breeding 124-135 (1983)) und zufällige Knospenbildung (D. J. James, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, Bd. 5, 33-79 (1987)) wurden ebenfalls beschrieben.
Nach der Transformation müssen die transformierten Pflanzenzellen oder Pflanzen mit der eingeführten DNA identifiziert werden. Ein selektierbares und/oder detektierbares Marker-Gen, wie z. B. das vorab beschriebene, wird normalerweise verwendet. Transformierte Pflanzenzellen können selektiert werden, indem man die Zellen auf Wachstumsmedium mit den geeigneten Antibiotika züchtet. In einigen Fällen können Opine verwendet werden, wenn die Pflanzen mit Agrobacterium transformiert werden.
Nach Selektion der transformierten Zellen kann man die Expression der eingeführten Struktur-Gene bestätigen. Eine einfache Detektion von durch die insertierte DNA kodierter mRNA kann durch bekannte Verfahrenstechniken erbracht werden, wie etwa Northern-Blot-Hybridisierung. Die insertierte Sequenz kann identifiziert werden, indem Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wie auch Southern-Blot-Hybridisierung einsetzt. Siehe z. B. Sambrook (s. o.).
Transformierte Pflanzenzellen (z. B. Protoplasten), die durch ein beliebiges der oben angeführten Transformationsverfahren abgeleitet werden, können als Kulturen gezüchtet werden; um eine ganze Pflanze, die über den transformierten Genotyp und somit über den gewünschten Pestizid-resistenten Phenotyp verfügt, zu regenerieren. Solche Regenerationsverfahren basieren auf der Manipulation bestimmter Phytohormone in einem Gewebekulturwachstumsmedium. Pflanzenregeneration aus in Kultur gezüchteten Protoplasten wird von Evans et al., "Protoplasts Isolation and Culture", Handbook of Plant Cell Culture, S. 124-176, MacMillan Publishing Company, New York (1983); und Binding, "Regeneration of Plants, Plant Protoplasts", S. 21-73, CRC Press, Boca Raton (1985), beschrieben. Regeneration kann von Pflanzenkallus, Explantaten, Organen oder Teilen derselben erzielt werden. Solche Regenerationsverfahren werden allgemein von Klee et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38, 467-486 (1987), beschrieben.
Fachleute erkennen, dass, nachdem die Expressionskassette stabil in die transgenen Pflanze insertiert und als operabel bestätigt worden ist, diese mittels geschlechtlicher Kreuzung auch in andere Pflanzen eingeführt werden kann. Jedes beliebige einer Reihe von Standardzüchtungsverfahren kann dazu eingesetzt werden, abhängig nur von der zu kreuzenden Spezies.

Schädlingsbefall abfangende Pflanzen

Die Erfindung kann in der Herstellung Schädlingsbefall abfangender Pflanzenkulturrassen jeder für eine durch Zielschädlinge ausgelöste Infektion anfälligen Pflanze Anwendung finden. Jede Pflanze kann in der Erfindung verwendet werden, solange sie nicht einen bevorzugten Wirt für den Zielschädling darstellt und solange sie transformierbar und regenerierbar ist. Der Grund dafür, dass die Schädlingsbefall abfangende Pflanze ein bevorzugter Wirt für den Schädling ist, stellt für die Erfindung keinen entscheidenden Aspekt dar. So kann z. B. die Pflanze eine unterschiedliche Kulturrasse derselben Spezies wie die Pflanze sein, für die man einen Schutz vor Schädlingen sucht. Produziert die erste Kulturrasse Blüten oder Blätter, wenn die Schädlinge besonders häufig auftreten, so wird diese bevorzugt die Zielschädlinge anziehen und eliminieren. Typischerweise ist die Schädlingsbefall abfangende Pflanze ein Vertreter einer anderen Spezies als die Erntepflanze. Die Vorlieben vieler Schädlinge für bestimmte Wirte sind bekannt und auch in der Literatur gut dokumentiert. Für eine Diskussion der Wirt- Schädling-Wechselwirkung siehe E. A. Bernays und R. F. Chapman, Host-Plant Selection by Phytophagous Insects (1994).
Bevorzugte Wirte für bestimmte Schädlingen sind in der Literatur ausreichend beschrieben. Es ist typisch, dass solche Pflanzen als jene Pflanzen identifiziert werden können, die aus Gebieten, in denen die bestimmte Erntepflanze wächst, entfernt worden sind. So wird z. B. allgemein empfohlen, den Schwarzen Walnussbaum, der als bevorzugter Wirt der Walnussschalenfliege bekannt ist, aus Englischen Walnussgärten zu entfernen. Integrated Pest Management for Walnuts, 2. Ausg., University of California, Statewide Integrated Pest Management Project, Publikation Nr. 3270, S. 45. Darüber hinaus wird allgemein empfohlen, dass Wirte der Lygus-Wanze (z. B. wilder Rettich und Wicke) aus Birnen-, Pflaumen- und Nektarinengärten entfernt werden, um die Zuchtpopulationen zu reduzieren. "Peaches, Plums and Nectarine Growing and Handling for Fresh Market", University of California Cooperative Extension, Division of Agriculture and Natural Resources, Publikation Nr. 3270. Die rosenfarbige Apfelblattlaus verbringt einen Teil ihres Lebenszyklus auf einem wechselständigen Wirt, wobei der häufigste davon der Spitzwegerich, Plantago lanceolata, ist. Es wird empfohlen, diesen Wegerich in oder nahe einem Obstgarten zu entfernen, um den Sommerwirt dieses Schädlings zu eliminieren. "Integrated Pest Management for Apples and Pears", University of California, Statewide Integrated Pest Management Project, Publikation Nr. 3340, S. 124-126.
Andere Beispiele für Kombinationen von Spezies umfassen die Verwendung von Apfel als bevorzugten Wirt für die Apfelmade anstelle von Walnuss oder Birne; Weißdorn als bevorzugten Wirt anstelle von Apfel für die Apfelmade; Quitte als bevorzugten Wirt für die orientalische Fruchtmade; Luzerne, wilder Rettich oder Wicke als bevorzugten Wirt für die Lygus-Wanze, Buffalobar (Soanum rostratum), Schwarzer Nachtschatten, Cutleaf- Nachtschatten und Erdkirsche als bevorzugte Wirte für den Colorado-Kartoffelkäfer; und Falschen Jasmin als bevorzugten Wirt für die Mittelmeerfruchtfliege.
Die Schädlingsbefall abfangende Pflanze kann auch gezüchtet oder gentechnisch erzeugt werden, um ihre Attraktivität für den Zielschädling noch zu steigern. So kann z. B. durch Erhöhen der Mengen an Phagostimulanten, das sind Nährstoffe, im Speziellen Zucker, diese Attraktivität gesteigert werden.
Die Erfindung hat somit in einer Vielzahl kultivierter Pflanzen ihre Verwendung, einschließlich Spezies der Genera Trifolium, Medicago, Phaseolus, Pisum, Vigna, Glycine, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Cichorium, Helianthus, Chrysanthemum, Vitus, Lactuca, Asparagus, Cucumis, Cucurbita, Malus, Pyrus, Prunus, Rosa, Fragaria, Tarro, Ananas, Musa, Cacoa, Beta, Coffea, Gossypium, Thea, Dioscorea, Arachis, Citrullus, Juglans, Olea, Cannabis, Triticum, Hordeum, Avena, Festuca, Sorghum, Oryza, Secale und Zea.
Zusätzlich kann noch eine Reihe von unkultivierten Spezies in der Erfindung verwendet werden. Beispiele dafür umfassen Weißdorn, die Kalifornische Schwarze Walnuss, Rainwaide, Spitzwegerich, Wilder Rettich, Wicke, Buffalobar, Schwarzer Nachtschatten, Cutleaf-Nachtschatten, Erdkirsche, Wilder Senf, Wilde Brombeere und dergleichen.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung, beschränken diese aber nicht darauf.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Produktion einer transgenen Apfelplanze mit Bt-Toxin-Expression, welche im Speziellen gegen die Lepidoptera Spezies sehr wirksam ist. Diese transgenen Pflanzen sind für die Bekämpfung der Apfelmade auf Walnussbäumen sehr nützlich.

Vektoren zur Einführung und Expression von Toleranz gegen befallende Insekten bei Apfelbäumen

Zwei von Calgene (Davis, CA) gelieferte Vektoren wurden dadurch modifiziert, dass man ein für GUS (β-Glucoronidase) kodiertes Gen einführte. Die Konstrukte beinhalten ein chemisch synthetisiertes; verkürztes cry1Ac-Gen. In einem der beiden Vektoren wurde das chemisch synthetisierte, verkürzte Gen weiter modifiziert (durch Calgene), indem die nichtkodierenden 5'-Sequenzen hinzugefügt wurden, um die Translationseffizienz dieses Gens und somit auch seine Expression zu erhöhen und zu verbessern.
Die Vektoren wurden weiter modifiziert, indem ein für GUS kodiertes Gen insertiert wurde, wodurch zwei neue Vektoren, nämlich pDU92.67 und pDU92.63, erzeugt wurden, die beide mögliche Orientierungen des GUS und des modifizierten cry1AC-Gens beinhalteten. In einer ähnlichen Weise wurde der Vektor, der das Gen ohne die 5'-Modifizierung enthielt, modifiziert, wobei pDU92.710 und pDU92.1 S entstanden. Diese binären Vektoren wurden daraufhin in drei verschiedene Stränge von Agrobacterium, nämlich C58C1, EHA101 und AGL1 eingeführt, um ein funktionelles Übertragungssystem zu bilden.

Apfeltransformationsverfahren

Äpfel wurden mittels der von D. J. James und A. M. Dandekar, "Regeneration and transformation of apple (Malus pumila Mill.) in Plant tissue culture manual: Fundamentals and applications", Bd. 8, S. 1-18 (1991), beschriebenen Verfahren transformiert.

Analyse transgener Apfelpflanzen

Nach Regeneration und Selektion wurden vermeintlich transgene Schösslinge, welche für unabhängige Transformationsereignisse stehen, durch Mikrovermehrung (Schösslingkulturen) vervielfältigt. Für jedes verwendete Konstrukt wurden einige Transformationen durchgeführt, um genügend unabhängige Tranformationsereignisse (10-20) zu erzielen. Northern-Analyse des Konstrukts sowie Quantifizierung der GUS-Aktivität wurden eingesetzt, um das Expressionsausmaß der Transformanten zu analysieren. Die Erfinder haben herausgefunden, dass die GUS-Menge einen guten Indikator für die Transformation einer Pflanzenzelle darstellt.
Die unabhängigen Transformationsereignisse wurden anfänglich durch PCR-Analyse bestätigt. DNA wurde den einzelnen transformierten Apfelschösslingstämmen entnommen, und man verwendete für GUS- und APH-Marker-Gene und das Bt-Gen spezifische Primer. PCR-Produkte wurden durch diagnostische Restriktionsendonuclease-Spaltung und Southern-Hybridisierung mit den entsprechenden Gensequenzen gemäß Standardtechniken bestätigt.
Die Transformationsereignisse wurden schließlich durch Southern-Blot-Hybridisierung überprüft. Diese Analyse schließt auch die Identifizierung interner T-DNA-Fragmente und die Bestimmung der Kopienanzahl des durch Hybridisierung herbeigeführten Inserts von rechten Randregionen mit ein, wie zuvor beschrieben. Es wurden rechte Rand- und interne Fragmentproben verwendet, wie dies bereits von Dandekar et al., "Agrobacterium-mediated transformation of somatic embryos as a method for the production of transgenic plants", J. Tissue Cult. Meth. 12, 145-150 (1989); McGranahan et al., "Improved efficiency of the walnut somatic embryo gene transfer system", Plant Cell Rep. 8, 512-516 (1990), beschrieben wurde, um die unabhängigen Transformationsereignisse voneinander zu unterscheiden und die Kopienanzahl der insertierten DNA zu bestimmen. Transgene Pflanzen mit einzelnen Kopien wie auch solche, die für eine unabhängige Transformation stehen, wurden daraufhin in weiteren Experimenten verwendet.

Test der Effizienz der Schädlingsresistenz

Mit Hilfe von Insektenpathologie und Bioanalyse wurde die Resistenz gegen die Ziel-Insektenspezies Apfelmade ("codling moth", cm) bestimmt. Die Empfänglichkeit von cm für gereinigte Präparate von insektiziden Kristallproteinen ("insecticidal crystal proteins", ICPs) von (Bt) wurde vorher durch zuvor beschriebene Zufuhr-Experimente (Vail et al., "Response of production and postharvest walnut pests to Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein fragments", Biological Control 1, 329-333 (1991)) bestimmt.
Qualitative Bioanalysen wurden zuerst auf ausgewählten Geweben durchgeführt, welche entnommen wurden, um die Mortalität zu bestimmen und transgene Klone zu identifizieren, die eine Mortalität zwischen 80 und 100% aufzeigen. Diese werden daraufhin mittels quantitativer Analyse weiter untersucht, um die Menge an exprimiertem Protein festzustellen, indem ein Western-Blot und spezifische Antikörper direkt gegen das exprimierte Protein eingesetzt werden. Jene transgenen Stämme, die eine niedrige oder gar keine Mortaliät aufzeigten, werden aufgrund der qualitativen Daten verworfen.
Die oben angeführten Beispiele veranschaulichen die Erfindung, schränken aber nicht ihren Schutzumfang ein. Andere Varianten der Erfindung sind für Fachleute auf dem Gebiet der Technik rasch offensichtlich und sind in den nachfolgenden Ansprüchen enthalten. Alle hierin zitierten Publikationen, Patente und Patentanmeldungen sind hiermit durch Verweis aufgenommen.

Claims

1. Verfahren zum Bekämpfen von Insektenbefall auf einer ersten Pflanze, wobei das Verfahren das Anpflanzen einer zweiten Pflanze in Nachbarschaft der ersten Pflanze umfasst, wobei die zweite Pflanze ein bevorzugter Wirt für das befallende Insekt ist und ein heterologes insektizides Gen umfasst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das befallende Insekt Apfelmade ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das heterologe insektizide Gen für Bacillus thuringiensis-Toxin kodiert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Bacillus thuringiensis-Toxin gegen Schmetterlingsinsektenbefall wirksam ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das heterologe insektizide Gen für Langbohnen-Trypsininhibitor kodiert.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die zweite Pflanze ein Vertreter einer anderen Spezies als die erste Pflanze ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin die zweite Pflanze eine unkultivierte Pflanze ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin die erste Pflanze Walnuss ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin die erste Pflanze Birne ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin die zweite Pflanze Apfel ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin die zweite Pflanze in demselben Feld wie die erste Pflanze gepflanzt wird.

12. Feld, das eine Erntepflanze von Interesse und eine Insektenbefall abfangende Pflanze umfasst, wobei die Insektenbefall abfangende Pflanze ein bevorzugter Wirt für ein die Erntepflanze von Interesse befallendes Insekt ist und ein heterologes insektizides Gen umfasst.

13. Feld nach Anspruch 12, worin die Erntepflanze und die den Insektenbefall abfangende Pflanze Vertreter unterschiedlicher Spezies sind.

14. Feld nach Anspruch 12, worin die Erntepflanze Walnuss ist und die den Insektenbefall abfangende Pflanze Apfel ist.

15. Feld nach Anspruch 12, worin die Erntepflanze Birne ist und die den Insektenbefall abfangende Pflanze Apfel ist.

16. Feld nach Anspruch 12, worin das insektizide Gen für Bacillus thuringiensis-Toxin kodiert.

17. Verwendung einer transgenen Pflanze, die ein heterologes insektizides Gen umfasst, zur Bekämpfung von Insektenbefall auf einer anderen Pflanze, die in der Nachbarschaft der transgenen Pflanze angepflanzt ist, wobei die transgene Pflanze ein bevorzugter Wirt für das befallende Insekt ist.