-
GEBIET DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Pflanzenmolekularbiologie,
insbesondere die Regulation der Genexpression in Pflanzen.
-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Die
Expression heterologer DNA-Sequenzen in einem Pflanzenwirt ist abhängig von
dem Vorhandensein eines wirksam bzw. funktionell verknüpften Promotors,
der in dem Pflanzenwirt funktionsfähig ist. Die Wahl der Promotorsequenz
wird darüber
bestimmen, wann und wo die heterologe DNA-Sequenz in dem Organismus
exprimiert wird. Wenn eine Expression in einem bevorzugten Gewebe
einer Pflanze gewünscht
wird, werden deshalb Gewebe-bevorzugte bzw. von diesem Gewebe bevorzugte
Promotoren ("tissue-preferred
promoters") verwendet.
Wenn im Gegensatz dazu eine Genexpression in allen Zellen einer
Pflanze gewünscht wird,
sind konstitutive Promotoren das regulatorische Element der Wahl.
Zusätzliche
Regulatorsequenzen stromaufwärts
und/oder stromabwärts
der Kern-Promotorsequenz können
in Expressionskonstrukten von Transformationsvektoren eingeschlossen
sein bzw. in diese aufgenommen werden, um variierende Level Gewebe-bevorzugter
oder konstitutiver Expression von heterologen Nucleotidsequenzen
in einer transgenen Pflanze zu bewirken.
-
Es
ist häufig
wünschenswert,
eine begünstigte
bzw. bevorzugte Expression einer DNA-Sequenz in einem Gewebe eines
Organismus zu haben. Beispielsweise könnte eine erhöhte Resistenz
einer Pflanze gegenüber
Insektenbefall erreicht werden durch genetische Manipulation des
Pflanzengenoms, so dass es einen Gewebe-spezifischen Promotor in
funktioneller Verknüpfung
mit einem heterologen Insektizidgen umfasst, so dass die Insektenabschreckenden
Substanzen spezifisch in den anfälligen
Pflanzengeweben exprimiert werden. Eine bevorzugte Expression der
heterologen Nucleotidsequenz in dem entsprechenden Gewebe verringert
die Verluste bzw. den Abfluss der Ressourcen der Pflanze, die auftreten,
wenn ein konstitutiver Promotor eine Transkription einer heterologen
Nucleotidsequenz in allen Zellen der Pflanze initiiert.
-
Alternativ
könnte
es wünschenswert
sein, die Expression einer nativen DNA-Sequenz in Geweben einer
Pflanze zu inhibieren, um einen gewünschten Phänotyp zu erzielen. In die sem
Fall könnte
eine derartige Inhibierung durch Transformation der Pflanze erreicht
werden, so dass sie einen Gewebe-spezifischen Promotor in funktioneller
Verknüpfung
mit einer Antisense-Nucleotidsequenz umfasst, so dass die Gewebe-spezifische
Expression der Antisense-Sequenz
ein RNA-Transkript erzeugt, das die Translation der mRNA der nativen
DNA-Sequenz in einer
Teilmenge der Zellen der Pflanze stört.
-
Das
Phloem-Gewebe transportiert Nährstoffe,
Hormone und andere Substanzen durch die verschiedenen Pflanzenorgane.
Die Parenchym-Zellen des Phloems partizipieren am Laden bzw. Beladen
und Entladen von Saccharose- und anderem Nährstoffgehalt in das Phloem-Transportsystem.
Der hohe Nährstoffgehalt von
in Phloem-Gewebe befindlichem Saft bzw. Pflanzensaft bewirkt, dass
das Phloem das Ziel einer Vielfalt an Insektenarten, einschließlich Blattläusen (Familie
Aphididae), Maiszünslern
(Familie Pyralidae) und Zikaden (Cicadellidae) ist. Die aus einem
Befall durch diese Insekten resultierenden Schäden an Pflanzen treten aufgrund
mehrfacher Mechanismen, einschließlich Verlust von Nährstoffen
und Wasser an die Insekten, Einführung
von Viruspartikeln in das Phloem-Gewebe infolge von Befällen und
Schaffung von Gewebe, das für Pilzbefall
anfällig
ist, auf. Es besteht ein Bedarf an von Gefäßgewebe bevorzugten Promotoren
in funktioneller Verknüpfung
mit heterologen Nucleotidsequenzen, die dabei helfen können, eine
Pflanze gegen Pathogene, wie z.B. Insekten, Viren, Pilze, Nematoden
und dergleichen, zu schützen.
-
Es
besteht ein zusätzlicher
Bedarf an einer für
Gefäßgewebe
spezifischen bzw. Gefäßgewebe-spezifischen
Promotorsequenz, die funktionell verknüpft wäre mit einer heterologen Nucleotidsequenz,
die die Beladungscharakteristika von Gefäßgewebe modifiziert und dadurch
die Pflanzenentwicklung und -reifung, Kohlenstoffallokation und
Ernteertrag bzw. Nutzpflanzenertrag beeinflusst. Durch Ändern der
Gehalte an Substanzen, die an der Phloem-Beladung beteiligt sind, können die
Beladungscharakteristika von Gefäßgewebe,
die Pflanzenentwicklung und das Pflanzenwachstum beeinflusst werden.
Es besteht ein Bedarf an Promotorsequenzen, die eingesetzt werden
können,
um die Expression von Substanzen zu modulieren, die die Gefäßgewebebeladung
regulieren.
-
Es
kann auch eine Verwendung für
einen Gefäßgewebe-spezifischen
Promotor bei der Verbesserung der Stängelfestigkeit geben, beispielsweise über eine
Zellwandverdickung, wie z.B. durch Ablagerung von mehr Cellulose.
Es ist wünschenswert,
einen Gefäßgewebe-spezifischen Promotor
zum Exprimieren von Genen zu verwenden, die an der Cellulose-Biosynthese beteiligt
sind, um die Zellwandfestigkeit zu erhöhen. Wenn die Zellwand festigkeit
im Maisstängel
erhöht
wird, wird eine bessere Stanzfestigkeit erwartet. Dies ist besonders
wichtig für
das Verbessern der Resistenz gegenüber dem Niederlegen der Stängel ("stalk lodging") bei Mais. Ein Beispiel
einer derartigen Anwendung ist es, einen Gefäßgewebe-spezifischen Promotor
zu verwenden, um ein Cellulosesynthasegen, das an der Sekundärzellwandbildung
beteiligt ist, wie z.B. das irx3-Gen aus Arabidopsis thaliana (Taylor
N.G., Scheible W.R., Cutler S., Somerville C.R., Turner S.R., 1999, The
irregular xylem 3 locus of Arabidopsis encodes a cellulose synthase
required for secondary cell wall synthesis, Plant Cell 11:769-80)
zu steuern bzw. anzutreiben. In diesem Fall würden Zellen, die normalerweise
keine Sekundärwand
besitzen, möglicherweise
ein zusätzliches
Zellwandwachstum erlangen, was zu einer festeren Zellstruktur führt.
-
Deshalb
wird die Isolation und Charakterisierung von Phloem-spezifischen
Promotoren, die als regulatorische Regionen für die Gewebe-spezifische Expression
von heterologen Nucleotidsequenzen von Interesse dienen können, benötigt für die genetische
Manipulation von Pflanzen, die spezielle phänotypische Merkmale aufweisen
sollen.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Es
werden Zusammensetzungen und Verfahren zum Regulieren der Expression
heterologer Nucleotidsequenzen in einer Pflanze bereitgestellt.
Die Zusammensetzungen umfassen neue Promotorsequenzen, die die Transkription
auf eine für
Gefäßgewebe
spezifische Weise bzw. Gefäßgewebe-spezifische
Weise, insbesondere für
Phloem-Gewebe spezifische Weise, initiieren. Insbesondere wird eine
Transkriptionsinitiationsregion, isoliert aus einem Prunus serotina-Gen,
das für
Prunasinhydrolase codiert, bereitgestellt. Weitere erfindungsgemäße Zusammensetzungen
umfassen die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 angegebene Nucleotidsequenz.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
umfassen weiterhin Nucleotidsequenzen, die wenigstens 50 zusammenhängende Nucleotide
der Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 angegeben ist,
umfassen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
umfassen weiterhin Nucleotidsequenzen mit wenigstens 70% Identität zu der
Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 angegeben ist, über die
gesamte Länge
der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
umfassen weiterhin Nucleotidsequenzen, die Komplemente einer beliebigen
der oben stehend genannten Sequenzen sind. Die in SEQ ID NO: 2 angegebene
Sequenz stellt eine für
Klonierungszwecke gemachte Modifikation der Nucleotidsequenz dar.
Die Sequenz für
das Prunasinhydrolaseoperon, einschließlich der Prunasinhydrolase-Promotorregion
ist in SEQ ID NO: 3 angegeben. Die Nucleotide 989-2626 der SEQ ID
NO: 3 codieren für
ein Prunasinhydrolase-Polypeptid. SEQ ID NO: 4 ist die Aminosäuresequenz
des Prunasinhydrolase-Polypeptids.
SEQ ID NOS: 5 und 6 sind verwandte Variationen der als SEQ ID NO:
1 offenbarten Polynucleotidsequenz.
-
Die
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen auch ein DNA-Konstrukt,
umfassend eine erfindungsgemäße Promotorsequenz
in funktioneller Verknüpfung
mit einer Nucleotidsequenz von Interesse, wobei der Promotor fähig ist,
die Expression der Nucleotidsequenz in einer Pflanzenzelle zu steuern.
Es werden auch transformierte Pflanzenzellen, transformierte Pflanzen
und transformierte Samen, die die neuen erfindungsgemäßen Promotorsequenzen
umfassen, bereitgestellt.
-
Es
werden Verfahren zur Expression einer Nucleotidsequenz von Interesse
in einer Pflanze bereitgestellt. Die Verfahren umfassen stabilen
Einbau einer Expressionskassette, umfassend eine erfindungsgemäße Promotorsequenz
in funktioneller Verknüpfung
mit einer Nucleotidsequenz von Interesse, in das Genom einer Pflanzenzelle,
wobei der Promotor fähig
ist, die Transkription der Nucleotidsequenz in einer Pflanzenzelle
zu initiieren. Die Verfahren stellen ferner ein Mittel für das spezifische
Exprimieren einer Nucleotidsequenz in Gefäßgewebe, insbesondere Phloemgewebe,
bereit.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER
FIGUREN
-
1 zeigt
die Nucleotidsequenz der Promotorregion von Prunus serotina-Prunasinhydrolase.
-
2 ist
ein Alignment bzw. eine Anordnung und ein Consensus der zwei genomischen
Fragmente SEQ ID NO: 1 (PH DL 1.4 PRO) und SEQ ID NO: 5 (PH DL 1.1
PRO), wobei verwandte bzw. ähnliche
Promotorsequenzmuster und -motive hervorgehoben sind: eine TATA-Box
bei Position 793-796, ein CAAT-Signal bei 659-662, ein RGATAOS-Motiv
(R-GATA, GATA-Motiv-Bindungsfaktor, erforderlich für eine Phloem-spezifische Genexpression
von Reistungrovirus ("Rice
Tungro Bacilliform Virus"))-Bindungsstelle
bei 259-267.
-
3 ist
eine Tabelle, die GUS-Expression in verschiedenen Geweben in transgenen
Maispflanzen darstellt.
-
4 ist
die GUS-Expression in T0-Maispflanzen, die PHP17688 tragen. A. 10541640-Mittelrippe,
60 Tage; B. 10541657-Internodium, 85 Tage, Längsschnitt (Pfeile deuten auf
GUS-Expression entlang eines Gefäßbündels);
C.10541665-Internodium, 85 Tage, Querschnitt; D. 10541628-Anthere,
60 Tage; E. 10541665-Korn, 4 DAP; F. 10541647-Korn, 8 DAP.
-
5 zeigt
die GUS-Expression in Arabidopsis-Pflanzen nach Agrobacterium-vermittelter Transformation
in planta.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen
sind Nucleinsäuremoleküle, umfassend
eine neue Nucleotidsequenz für
einen Pflanzenpromotor für
das Prunus serotina-Gen, das für
Prunasinhydrolase codiert. Diese Promotorsequenz verleiht eine Gefäßgewebe-spezifische
Expression, insbesondere Phloem-spezifische Expression, einer spezifischen
funktionell verknüpften
Nucleotidsequenz. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung
isolierte Nucleinsäuremoleküle, umfassend
Nucleotidsequenzen, die für
die in einem bakteriellen Wirt als Hinterlegungsnummer PTA-3235
hinterlegte DNA-Sequenz oder die in SEQ ID NO: 1 angegebene Nucleotidsequenz
und Varianten und Fragmente davon codieren, bereit. Diese Promotorsequenz
wurde aus dem 5'-nicht-translatierten
Bereich, der die Transkriptionsinitiationsstelle eines für Prunasinhydrolase
codierenden P. serotina-Gens flankiert, isoliert.
-
Ein
die erfindungsgemäße P. serotina-Promotorsequenz
enthaltendes Plasmid wurde bei der Patent Depository of the American
Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, am 27. März 2001
hinterlegt und mit der Hinterlegungsnummer PTA-3235 bezeichnet.
Die letzten zwei Nucleotide der SEQ ID NO: 1, Nucleotide 987 und
988, wurden in der Sequenz des bei der ATCC hinterlegten Plasmids
von C's zu T's geändert. Diese
Hinterlegung wird gemäß den Bestimmungen
des Budapester Vertrages über
die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
für die
Zwecke von Patentverfahren verwaltet. Diese Hinterlegung wurde lediglich
als Dinglichkeit für
Fachleute auf dem Gebiet gemacht und ist kein Eingeständnis, dass eine
Hinterlegung nach 35 U.S.C. § 112
erforderlich ist.
-
Die
Erfindung umfasst isolierte oder im Wesentlichen gereinigte Nucleinsäurezusammensetzungen. Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" Nucleinsäuremolekül oder biologisch
aktiver Anteil davon ist im Wesentlichen oder grundsätzlich frei
von Bestandteilen, die das Nucleinsäuremolekül, wie es in seiner natürlicherweise
auftretenden Umgebung gefunden wird, normalerweise begleiten oder
mit ihm wechselwirken. Daher ist ein isoliertes oder gereinigtes
Nucleinsäuremolekül oder ein
biologisch aktiver Anteil davon im Wesentlichen frei von weiterem
Zellmaterial oder Kulturmedium, wenn es durch Rekombinationstechniken
hergestellt wird, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder
anderen Chemika lien, wenn es chemisch synthetisiert wird. Vorzugsweise
ist eine "isolierte" Nucleinsäure frei
von Sequenzen (vorzugsweise Protein-codierenden Sequenzen), die
die Nucleinsäure
natürlicherweise
in der genomischen DNA des Organismus, von dem die Nucleinsäure stammt,
flankieren (d.h. Sequenzen, die an den 5'- und 3'-Enden der Nucleinsäure lokalisiert sind). Beispielsweise
kann das isolierte Nucleinsäuremolekül in verschiedenen
Ausführungsformen
weniger als näherungsweise
5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nucleotidsequenzen
enthalten, die das Nucleinsäuremolekül in der
genomischen DNA der Zelle, von der die Nucleinsäure stammt, natürlicherweise
flankieren.
-
Mit "Promotor" oder "Transkriptionsinitiationsregion" ist eine regulatorische
DNA-Region gemeint, die normalerweise eine TATA-Box umfasst, die
fähig ist,
RNA-Polymerase II
zu führen,
so dass sie die RNA-Synthese an der entsprechenden Transkriptionsinitiationsstelle
für eine
bestimmte codierende Sequenz beginnt. Ein Promotor kann zusätzlich andere
Erkennungssequenzen umfassen, die im Allgemeinen stromaufwärts oder
5' zu der TATA-Box
positioniert sind, bezeichnet als stromaufwärts gelegene Promotorelemente
bzw. Upstream-Promotorelemente, die die Rate der Transkriptionsinitiation
beeinflussen. Es wird anerkannt, dass, wenn man die Nucleotidsequenzen
für die
hierin offenbarte Promotorregion identifiziert hat, es innerhalb
des Standes der Technik liegt, weitere regulatorische Elemente in
dem 5' nicht-translatierten
Bereich stromaufwärts der
hierin identifizierten speziellen Promotorregion zu isolieren und
zu identifizieren. Deshalb umfasst die hierin offenbarte Promotorregion
ferner stromaufwärts
gelegene regulatorische Elemente, die Gewebe-spezifische Expression, insbesondere
Gefäßgewebe-spezifische
Expression, spezieller Phloemgewebe-spezifische Expression, und
noch spezieller Phloemparenchym-spezifische Expression von beliebigen
heterologen Nucleotidsequenzen, die mit der offenbarten Promotorsequenz
funktionell verknüpft
sind, verleihen.
-
Die
Nucleotidsequenzen für
die Promotoren der vorliegenden Erfindung können die natürlich auftretenden
Sequenzen oder jede beliebige Sequenz sein, die eine wesentliche
Homologie aufweist. Mit "wesentliche
Homologie" ist eine
Sequenz gemeint, die eine wesentliche funktionelle und strukturelle
Gleichwertigkeit bzw. Äquivalenz
zu der nativen oder natürlich
auftretenden Sequenz aufweist. Beliebige funktionelle oder strukturelle
Unterschiede zwischen im Wesentlichen homologen Sequenzen beeinträchtigen
die Fähigkeit
der Sequenz nicht, als ein Promotor, wie in der vorliegenden Erfindung
offenbart, zu wirken. Demnach wird jede beliebige Sequenz, die eine
wesentliche Sequenzhomologie zu der Sequenz eines bestimmten Promotors
der vorliegenden Erfindung aufweist, die Expression einer funktionell
verknüpften
heterologen Nucleotidsequenz steuern. Zwei Promotor-Nucleotidsequenzen
werden als im Wesentlichen homolog betrachtet, wenn sie wenigstens
50%, 60%, bis 70%, im Allgemeinen näherungsweise 80%, bevorzugt
näherungsweise
85%, 90%, bis zu 98% Sequenzhomologie besitzen.
-
Die
isolierten Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung sind dadurch
gekennzeichnet, dass sie eine Gewebe-spezifische Expression einer
Nucleotidsequenz von Interesse ermöglichen. Das Gefäßsystem von
Pflanzen umfasst mehrere Gewebe, einschließlich Xylem und Phloem. Phloemgewebe
umfassen zahlreiche Zelltypen, einschließlich Siebelementen oder Siebröhrenelementen,
Siebzellen, Geleitzellen (bei Angiospermen), Eiweißzellen
(bei Gymnospermen), Phloemparenchymzellen und Phloemfasern. Der
hierin offenbarte von Gewebe bevorzugte bzw. Gewebe-spezifische
Promotor ist fähig,
Gewebe-spezifische Transkription von einer oder mehreren DNA-Sequenzen
in dem Gefäßsystem
von Pflanzen, besonders im Phloemgewebe, insbesondere in Phloemparenchymzellen,
spezifisch zu aktivieren. Eine Nucleotidsequenz in funktioneller
Verknüpfung
mit dem hierin offenbarten Phloem-spezifischen Promotor bewirkt die Expression
der funktionell verknüpften
Sequenz in Leveln, die in Gefäßgewebe,
besonders Phloemgewebe, höher
sind als in anderen Geweben oder als sie in dem Gefäßgewebe
der nicht-transformierten Pflanze festgestellt worden wären.
-
Die
Erfindung umfasst auch Fragmente und Varianten der hierin offenbarten
Promotornucleotidsequenz. Mit "Fragment" ist ein Anteil der
Nucleotidsequenz gemeint. Fragmente einer Nucleotidsequenz können die
biologische Aktivität
beibehalten und folglich die Transkription einer heterologen Nucleotidsequenz
initiieren. Alternativ behalten Fragmente einer Promotor-Nucleotidsequenz,
die als Hybridisierungssonden verwendbar sind, im Allgemeinen die
biologische Aktivität
nicht bei. Folglich können
Fragmente einer Nucleotidsequenz von wenigstens näherungsweise
20 Nucleotiden, näherungsweise
50 Nucleotiden, näherungsweise 100
Nucleotiden und bis zur Volllängen-Nucleotidsequenz
der Erfindung reichen.
-
Demnach
kann ein Fragment einer Promotor-Nucleotidsequenz für einen
biologisch aktiven Anteil des Promotors codieren, oder es kann ein
Fragment sein, das als eine Hybridisierungssonde oder ein PCR-Primer verwendet
werden kann, wobei die hierin offenbarten Verfahren verwendet werden.
Ein biologisch aktiver Anteil eines Promotors kann durch Isolieren
eines Teils einer der erfindungsgemäßen Promotorsequenzen und Bewerten
der Aktivi tät
des Anteils des Promotors hergestellt werden. Nucleinsäure-Moleküle, die
Fragmente einer Promotorsequenz sind, umfassen wenigstens 50, 75,
100, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800,
900 oder 988 Nucleotide bei SEQ ID NO: 1.
-
Die
Nucleotide derartiger Fragmente umfassen die TATA-Erkennungssequenz
der speziellen Promotorsequenz oder regulatorischen Elemente, die
Gewebespezifität
verleihen. Derartige Fragmente können
erhalten werden durch Verwendung von Restriktionsenzymen zum Spalten
der natürlich
vorkommenden Promotor-Nucleotidsequenz, die hierin offenbart ist;
durch Synthetisieren einer Nucleotidsequenz, ausgehend von der natürlich vorkommenden
Sequenz der Promotor-DNA-Sequenz, oder sie können erhalten werden durch die
Verwendung der PCR-Technologie. Siehe insbesondere Mullis et al.
(1987) Methods Enzymol. 155:335-350, und Erlich, Hrsg. (1989), PCR
Technology (Stockton Press, New York). Varianten dieser Promotorfragmente,
wie z.B. jene, die aus ortsgerichteter Mutagenese hervorgehen, sind
von den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
umfasst.
-
Mit "Varianten" sind im Wesentlichen ähnliche
Sequenzen gemeint. Bei Nucleotidsequenzen natürlicherweise vorkommender Varianten
können
diese beispielsweise durch die Verwendung gut bekannter molekularbiologischer
Techniken, wie z.B. durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und Hybridisierungstechniken, wie
nachstehend dargelegt, identifiziert werden. Variante Nucleotidsequenzen
umfassen auch synthetisch abgeleitete Nucleotidsequenzen, wie z.B.
jene, die unter Verwendung ortsgerichteter Mutagenese erzeugt wurden.
Im Allgemeinen werden Varianten einer speziellen erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz
wenigstens näherungsweise
65%, 70%, im Allgemeinen wenigstens näherungsweise 75%, 80%, 85%,
bevorzugt wenigstens näherungsweise
90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% und am bevorzugtesten wenigstens
näherungsweise
98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu dieser speziellen Nucleotidsequenz
aufweisen. Dies wird bestimmt durch Sequenzanordnungsprogramme bzw.
Sequenz-Alignment-Programme, wie sie hierin an anderer Stelle beschrieben
sind, wobei Standardeinstellungen für die Parameter bzw. Default-Parameter verwendet werden.
Erfindungsgemäße variante
Nucleotidsequenzen behalten die biologische Aktivität bei (d.h.
regulieren die Transkription). Verfahren zum Austesten der Transkriptionsregulation
sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die Test- bzw. Assay-Verfahren umfassen
Northern Blots, RT-PCR und die Verwendung von Reportersequenzen,
wie z.B. GUS.
-
Variante
Nucleotidsequenzen umfassen auch Sequenzen, die aus einer mutagenen
und rekombinogenen Verfahrensweise, wie z.B. DNA-Shuffling, stammen.
Mit einer derartigen Verfahrensweise können eine oder mehrere unterschiedliche
Sequenzen manipuliert werden, um einen neuen Promotor zu schaffen,
der die erwünschten
Eigenschaften besitzt. Auf diese Weise werden Bibliotheken rekombinanter
Polynucleotide aus einer Population von sequenz-verwandten Polynucleotiden, umfassend
Sequenzbereiche, die wesentliche Sequenzidentität besitzen und in vitro oder
in vivo homogen rekombiniert werden können, erzeugt. Strategien für ein derartiges
DNA-Shuffling sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe beispielsweise
Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer
(1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech.
15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang
et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et
al. (1998) Nature 391:288-291; und die US-Patente Nrn. 5,605,793
und 5,837,458.
-
Die
erfindungsgemäße P. serotina-Promotorsequenz
kann verwendet werden, um entsprechende Sequenzen aus anderen Organismen,
besonders anderen Pflanzen, insbesondere anderen zweikeimblättrigen bzw.
dikotylen Pflanzen, zu isolieren. Auf diese Weise können Verfahren,
wie z.B. PCR, Hybridisierung und dergleichen verwendet werden, um
derartige Sequenzen auf der Grundlage ihrer Sequenzhomologie mit
den hierin angegebenen Sequenzen zu identifiziexen. Sequenzen, die
auf der Grundlage ihrer Sequenzidentität mit der gesamten hierin angegebenen
Promotorsequenz oder mit Fragmenten davon isoliert wurden, sind
auch von der vorliegenden Erfindung umfasst. Eine Ausführungsform
der Erfindung umfasst eine Nucleotidsequenz, die nativ assoziiert
ist mit und fähig
ist zum Steuern der Expression einer Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid
codiert, wobei dieses Polypeptid wenigstens 74%, 80%, 85%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit der
codierenden Sequenz von P. serotina-Prunasinhydrolase (Genbank Zugangsnummer
U50201) besitzt.
-
In
einem PCR-Ansatz können
Oligonucleotid-Primer entworfen werden für die Verwendung in PCR-Reaktionen
zum Amplifizieren entsprechender DNA-Sequenzen aus cDNA oder genomischer
DNA, extrahiert aus einer beliebigen Pflanze von Interesse. Verfahren
zum Entwerfen von PCR-Primern und für PCR-Klonierung sind auf dem
Fachgebiet allgemein bekannt und sind offenbart in Sambrook et al.
(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Siehe auch
Innis et al., Hrsg. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications (Academic Press, New York); Innis und Gelfand, Hrsg.
(1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); und Innis und
Gelfand, Hrsg. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York).
Bekannte PCR-Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
Verfahren, die paarweise Primer, ineinander geschachtelte Primer
bzw. "nested" Primer, einzelne
spezifische Primer, degenerierte Primer, Gen-spezifische Primer,
Vektor-spezifische Primer, partiell fehlgepaarte Primer und dergleichen
verwenden.
-
Bei
Hybridisierungstechniken wird die gesamte oder ein Teil einer bekannten
Nucleotidsequenz als eine Sonde verwendet, die selektiv mit anderen
entsprechenden Nucleotidsequenzen, die in einer Population von klonierten
genomischen DNA-Fragmenten oder cDNA-Fragmenten (d.h. Genom- oder cDNA-Bibliotheken)
aus einem gewählten
Organismus vorhanden sind, hybridisieren. Die Hybridisierungssonden
können
genomische DNA-Fragmente, cDNA-Fragmente, RNA-Fragmente oder andere
Nucleotide sein und können
mit einer detektierbaren Gruppe, wie z.B. 32P,
oder einer beliebigen anderen detektierbaren Markierung markiert sein.
Folglich können
beispielsweise Hybridisierungssonden durch Markieren synthetischer
Oligonucleotide, die auf der erfindungsgemäßen Sequenz beruhen, hergestellt
werden. Verfahren zur Herstellung von Hybridisierungssonden und
zur Konstruktion von cDNA- und Genombibliotheken sind auf dem Fachgebiet
allgemein bekannt und sind offenbart in Sambrook et al. (1989) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Plainview, New York).
-
Beispielsweise
kann die gesamte hierin offenbarte Promotorsequenz oder ein oder
mehrere Teile davon als eine Sonde verwendet werden, die dazu fähig ist,
mit entsprechenden Promotorsequenzen spezifisch zu hybridisieren.
Um eine spezifische Hybridisierung unter einer Vielzahl an Bedingungen
zu erreichen, umfassen derartige Sonden Sequenzen, die unter Promotorsequenzen
einzigartig sind und die bevorzugt wenigstens näherungsweise 10 Nucleotide
lang und am bevorzugtesten wenigstens näherungsweise 20 Nucleotide lang
sind. Derartige Sonden können
verwendet werden, um entsprechende Promotorsequenzen aus einer ausgewählten Pflanze
durch PCR zu amplifizieren. Diese Technik kann verwendet werden,
um zusätzliche Promotorsequenzen
aus einer gewünschten
Pflanze zu isolieren, oder als ein diagnostischer Assay zum Bestimmen
des Vorhandenseins von Promotorsequenzen in einer Pflanze. Hybridisierungstechniken
umfassen Hybridisierungsscreening von ausplattierten DNA-Bibliotheken
(entweder Plaques oder Kolonien; siehe z.B. Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
-
Die
Hybridisierung derartiger Sequenzen kann unter stringenten Bedingungen
durchgeführt
werden. Mit "stringenten
Bedingungen" oder "stringenten Hybridisierungsbedingung" sind Bedingungen
gemeint, unter denen eine Sonde mit ihrer Zielsequenz in einem feststellbar
größeren Ausmaß als mit
anderen Sequenzen (z.B. wenigstens zweifach über dem Hintergrund) hybridisieren
wird. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und werden unter unterschiedlichen
Umständen
verschieden sein. Durch Kontrollieren der Stringenz der Hybridisierungs-
und/oder Waschbedingungen können
Zielsequenzen identifiziert werden, die zu 100% komplementär zu der
Sonde sind (homologes Sondieren). Alternativ können die Stringenzbedingungen
angepasst werden, um einige Fehlpaarungen in den Sequenzen zu erlauben,
so dass niedrigere Grade der Similarität bzw. Ähnlichkeit detektiert werden
(heterologes Sondieren). Im Allgemeinen ist eine Sonde weniger als näherungsweise
1.000 Nucleotide lang, bevorzugt weniger als 500 Nucleotide lang.
-
Typischerweise
werden stringente Bedingungen jene sein, bei denen die Salzkonzentration
weniger als 1,5 M Na-Ionen-, typischerweise näherungsweise 0,01 bis 1,0 M
Na-Ionenkonzentration
(oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 beträgt und die Temperatur wenigstens
näherungsweise
30°C bei
kurzen Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) und wenigstens näherungsweise
60°C bei
langen Sonden (z.B. mehr als 50 Nucleotide) beträgt. Stringente Bedingungen
können
auch durch die Zugabe destabilisierender Mittel, wie z.B. Formamid, erreicht
werden. Beispielhafte Bedingungen niedriger Stringenz umfassen Hybridisierung
mit einer Pufferlösung
von 30 bis 35% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat)
bei 37°C
und Waschen in 1 × bis 2 × SSC (20 × SSC =
3,0 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat) bei 50 bis 55°C. Beispielhafte Bedingungen
moderater Stringenz umfassen Hybridisierung in 40 bis 45% Formamid,
1,0 M NaCl, 1% SDS bei 37°C
und Waschen in 0,5 × bis
1 × SSC
bei 55 bis 60°C.
Beispielhafte Bedingungen hoher Stringenz umfassen Hybridisierung
in 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und Waschen in 0,1 × SSC bei
60 bis 65°C.
Optional können
die Waschpuffer näherungsweise
0,1% bis näherungsweise
1% SDS umfassen. Die Dauer der Hybridisierung beträgt im Allgemeinen
weniger als 24 Stunden, üblicherweise
näherungsweise
4 bis näherungsweise
12 Stunden.
-
Die
Spezifität
ist typischerweise die Funktion von Waschschritten nach der Hybridisierung,
wobei die kritischen Faktoren die Ionstärke und Temperatur der endgültigen Waschlösung sind.
Für DNA-DNA-Hybride kann
die Tm mittels der Gleichung von Meinkoth
und Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:261-284, approximiert werden:
Tm = 81,5°C
+ 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) – 0,61
(% Formamid) – 500/L,
wobei M die Molarität
der einwertigen Kationen ist, %GC der prozentuale Anteil von Guanosin-
und Cytosinnucleotiden in der DNA ist, % Formamid der prozentuale
Anteil von Formamid in der Hybridisierungslösung ist und L die Länge des
Hybrids in Basenpaaren ist. Tm ist die Temperatur
(bei definierter/definiertem Ionenstärke und pH) bei der 50% einer
komplementären
Zielsequenz mit einer perfekt übereinstimmenden
Sonde hybridisieren. Die Tm wird pro 1%
Fehlpaarung um näherungsweise
1°C verringert;
folglich können
Tm, Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen
angepasst werden, um mit Sequenzen der gewünschten Identität zu hybridisieren.
Wenn beispielsweise Sequenzen mit > 90%
Identität
gesucht werden, kann Tm um 10°C verringert
werden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass
sie näherungsweise
5°C niedriger
liegen, als der thermische Schmelzpunkt (Tm)
für die
spezifische Sequenz und ihr Komplement bei einer definierten Ionenstärke und
einem definierten pH. Jedoch können
streng stringente Bedingungen eine Hybridisierung und/oder Waschen
bei 1, 2, 3 oder 4°C
weniger als dem thermischen Schmelzpunkt (Tm)
verwenden; moderat stringente Bedingungen können eine Hybridisierung und/oder
Waschen bei 6, 7, 8, 9 oder 10°C
unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm)
verwenden; Bedingungen niedriger Stringenz können eine Hybridisierung und/oder
Waschen bei 11, 12, 13, 14, 15 oder 20°C unter dem thermischen Schmelzpunkt
(Tm) verwenden. Unter Verwendung der Gleichung, Hybridisierungs-
und Waschzusammensetzungen und der gewünschten Tm werden
Durchschnittsfachleute begreifen, dass Variationen hinsichtlich
der Stringenz der Hybridisierungs- und/oder Waschlösungen inhärent beschrieben
sind. Wenn der gewünschte
Grad an Fehlpaarung in einer Tm von weniger
als 45°C
(wässrige
Lösung)
oder 32°C
(Formamid-Lösung)
resultiert, ist es bevorzugt, die SSC-Konzentration zu erhöhen, so
dass eine höhere
Temperatur verwendet werden kann. Eine umfangreiche Anleitung zur
Hybridisierung von Nucleinsäuren
wird gefunden in Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology-Hybridization
with Nucleic Acid Probes, Teil I, Kapitel 2 (Elsevier, New York)
und Ausubel et al. Herausg. (1995) Current Protocols in Molecular
Biology, Kapitel 2 (Green Publishing and Wiley Interscience, New
York). Siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (2. Ausgabe., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,
New York).
-
Folglich
sind isolierte Sequenzen, die Promotoraktivität besitzen und die unter stringenten
Bedingungen mit der hierin offenbarten Promotorsequenz oder mit
Fragmenten davon hybridisieren, von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Derartige Sequenzen werden wenigstens näherungsweise 40% bis 50% homolog,
näherungsweise
60%, 65% oder 70% homolog und sogar wenigstens näherungsweise 75%, 80%, 85%,
90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr mit der
offenbarten Sequenz homolog sein. Dies bedeutet, dass die Sequenzidentität von Sequenzen
schwanken kann, wobei sie wenigstens näherungsweise 40% bis 50%, näherungsweise
60%, 65% oder 70% und sogar wenigstens näherungsweise 75%, 80%, 85%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität gemeinsam
haben.
-
Die
folgenden Begriffe werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen zwischen
zwei oder mehr Nucleinsäuren
zu beschreiben: (a) "Referenzsequenz", (b) "Vergleichsfenster", (c) "Sequenzidentität", (d) "Prozentsatz der Sequenzidentität" und (e) "wesentliche Identität".
- (a)
Wie hierin verwendet, ist eine "Referenzsequenz" eine definierte
Sequenz, die als eine Grundlage für einen Sequenzvergleich verwendet
wird. Eine Referenzsequenz kann eine Teilmenge oder die Gesamtheit einer
spezifizierten Sequenz, beispielsweise als ein Abschnitt einer Volllängen-cDNA-
oder Gensequenz, oder die vollständige
cDNA- oder Gensequenz sein.
- (b) Wie hierin verwendet, bezieht sich ein "Vergleichsfenster" auf einen zusammenhängenden und spezifizierten
Abschnitt einer Polynucleotidsequenz, wobei die Polynucleotidsequenz
in dem Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) im
Vergleich zu der Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen
umfasst) für
eine optimale Anordnung der zwei Sequenzen umfassen kann. Im Allgemeinen
ist das Vergleichsfenster wenigstens 20 fortlaufende Nucleotide
lang und kann gegebenenfalls 30, 40, 50, 100 oder länger sein.
Fachleute auf dem Gebiet begreifen, dass zum Vermeiden einer hohen Ähnlichkeit
mit einer Referenzsequenz aufgrund des Einschließens von Lücken in die Polynucleotidsequenz
typischerweise ein Lückenstrafmaß bzw. eine "gap penalty" eingeführt und
von der Anzahl an Übereinstimmungen
abgezogen wird.
-
Verfahren
zur Anordnung von Sequenzen für
den Vergleich sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Deshalb kann
die Bestimmung des Prozentsatzes der Sequenzidentität zwischen
zwei beliebigen Sequenzen unter Verwendung eines mathematischen
Algorithmus bewerk stelligt werden. Nicht-beschränkende Beispiele derartiger
mathematischer Algorithmen sind der Algorithmus von Myers und Miller
(1988) CABIOS 4:11-17; der lokale-Homologie-Algorithmus von Smith et al. (1981)
Adv. Appl. Math. 2:482; der Homologie-Anordnungs-Algorithmus von Needleman und Wunsch
(1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; das Verfahren zur Suche nach Ähnlichkeit
von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; der Algorithmus
von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264,
modifiziert wie in Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90:5873-5877 beschrieben.
-
Computer-Implementierungen
dieser mathematischen Algorithmen können für Sequenzvergleiche zum Bestimmen
der Sequenzidentität
verwendet werden. Derartige Implementierungen umfassen, sind aber nicht
beschränkt
auf: CLUSTAL im PC/Gene-Programm (erhältlich von Intelligenetics,
Mountain View, Kalifornien); das ALIGN-Programm (Version 2.0) und
GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA in dem Wisconsin Genetics-Softwarepaket, Version
(erhältlich
von Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin,
USA). Anordnungen unter Verwendung dieser Programme können unter
Verwendung der Standardparameter durchgeführt werden. Das CLUSTAL-Programm
ist gut beschrieben von Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988);
Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic
Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; und
Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. Das ALIGN-Programm
beruht auf dem Algorithmus von Myers und Miller (1988) supra. Eine PAM120-Matrix
("PAM120 weight
residue table"),
ein Strafmaß für die Lückenlänge ("gap length penalty") von 12 und ein
Lückenstrafmaß von 4
können
beim Vergleichen von Aminosäuresequenzen
mit dem ALIGN-Programm verwendet werden. Die BLAST-Programme von
Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 beruhen auf dem Algorithmus
von Karlin und Altschul (1990) supra. BLAST-Nucleotidrecherchen
können
mit dem BLASTN-Programm, score = 100, wordlength = 12, durchgeführt werden,
um Nucleotidsequenzen zu erhalten, die homolog sind zu einer für ein erfindungsgemäßes Protein
codierende Nucleotidsequenz. BLAST-Proteinrecherchen können mit
dem BLASTX-Programm, score = 50, wordlength = 3, durchgeführt werden,
um Aminosäuresequenzen
zu erhalten, die zu einem erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid
homolog sind. Um für
Vergleichszwecke Lücken
aufweisende Alignments zu erhalten, kann Gapped BLAST (in BLAST
2.0) verwendet werden, wie es in Altschul et al. (1997) Nucleic
Acids Res. 25:3389 beschrieben ist. Alternativ kann PSI-BLAST (in
BLAST 2.0) verwendet werden, um eine iterative Recherche bzw. Suche
durchzuführen,
die entfernte Verwandtschaften zwischen Molekülen detektiert. Siehe Altschul
et al. (1997) supra. Beim Verwenden von BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST
können
die Standardparameter bzw. Default-Parameter der jeweiligen Programme
(z.B. BLASTN für
Nucleotidsequenzen, BLASTX für
Proteine) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Eine
Anordnung kann auch manuell durch Betrachtung durchgeführt werden.
-
Sofern
nicht anders angegeben, beziehen sich hierin angegebene Werte für Sequenzidentität/Ähnlichkeit
auf den Wert, der unter Verwendung von GAP Version 10 unter Verwendung
der nachstehenden Parameter: % Identität unter Verwendung einer Lückengewichtung
("gap weight") von 50 und einer
Längengewichtung ("length weight") von 3; % Ähnlichkeit
unter Verwendung einer Lückengewichtung
von 12 und einer Längengewichtung
von 4, oder eines gleichwertigen Programms erhalten wird. Mit "gleichwertiges Programm" ist jedes beliebige
Sequenzvergleichsprogramm, das für
zwei fragliche Sequenzen eine Anordnung mit identischen Nucleotid-
oder Aminosäurerest-Übereinstimmungen
und einem identischen Prozentsatz der Identität erzeugt im Vergleich zu der
entsprechenden Anordnung, die durch das bevorzugte Programm erzeugt
wurde, gemeint.
-
GAP
verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol.
Biol. 48:443-453 zum Auffinden der Anordnung von zwei vollständigen Sequenzen,
die die Anzahl an Übereinstimmungen
maximiert und die Anzahl an Lücken
minimiert. GAP erwägt
alle möglichen
Anordnungen und Lückenpositionen
und erzeugt die Anordnung mit der größten Anzahl an übereinstimmenden
Basen und den wenigsten Lücken.
Es ermöglicht
die Vorgabe eines Lückenschaffungsstrafmaßes ("gap creation penalty") und eines Lückenverlängerungsstrafmaßes ("gap extension penalty") in Einheiten übereinstimmender
Basen. GAP muss einen Gewinn aus Lückenerzeugungsstrafmaßzahlen
von Übereinstimmungen
für jede
Lücke,
die es einfügt,
erzielen. Wenn ein Lückenverlängerungsstrafmaß von mehr
als 0 gewählt
wird, muss GAP für
jede eingefügte
Lücke einen Gewinn
aus der Länge
der Lücke
mal dem Lückenverlängerungsstrafmaß ziehen.
Standard-Lückenerzeugungsstrafmaßwerte und
-Lückenverlängerungsstrafmaßwerte in
der Version 10 des Wisconsin Genetics-Softwarepakets sind 8 bzw.
2 für Proteinsequenzen.
Für Nucleotidsequenzen
ist das Standard-Lückenerzeugungsstrafmaß 50, während das
Standard-Lückenverlängerungsstrafmaß 3 beträgt. Die
Lückenerzeugungs-
und Lückenverlängerungsstrafmaße können als
eine ganze Zahl, ausgewählt
aus der Gruppe ganzer Zahlen, die von 0 bis 200 reicht, ausgedrückt werden.
Folglich können
die Lückenerzeugungs-
und Lückenverlängerungsstrafmaße beispielsweise
0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50,
55, 60, 65 oder mehr sein.
-
GAP
stellt ein Mitglied der Familie bester Anordnungen dar. Es kann
viele Mitglieder dieser Familie geben, aber kein Mitglied hat eine
bessere Qualität.
GAP zeigt vier Leistungsmerkmale für Anordnung: Qualität, Verhältnis, Identität und Ähnlichkeit.
Die Qualität
ist das Maß,
das maximiert wurde, um die Sequenzen anzugleichen. Das Verhältnis ist
die Qualität
geteilt durch die Anzahl an Basen im kürzeren Abschnitt. Der Prozentsatz
der Identität
ist der Prozentsatz der Symbole, die tatsächlich übereinstimmen. Der Prozentsatz
der Ähnlichkeit
ist der Prozentsatz der Symbole, die ähnlich sind. Symbole, die Lücken gegenüberstehen,
werden ignoriert. Eine Ähnlichkeit
ist erzielt, wenn der Bewertungsmatrixwert ("scoring matrix value") für
ein Paar von Symbolen größer oder
gleich 0,50, dem Ähnlichkeitsschwellenwert,
ist. Die in Version 10 des Wisconsin Genetics-Softwarepakets verwendete
Bewertungsmatrix ist BLOSUM62 (siehe Henikoff und Henikoff (1989) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
- (c) Wie hierin
im Kontext von zwei Nucleinsäure-
oder Polypeptidsequenzen verwendet, bezieht sich "Sequenzidentität" oder "Identität" auf Reste in den
zwei Sequenzen, die gleich sind, wenn sie über ein spezifiziertes Vergleichsfenster
bezüglich
maximaler Übereinstimmung
angeordnet bzw. angeglichen werden. Wenn Prozentsatz der Sequenzidentität in Bezug
auf Proteine verwendet wird, wird anerkannt, dass Rest-Positionen,
die nicht identisch sind, sich häufig
durch konservative Aminosäuresubstitutionen
unterscheiden, wobei Aminosäurereste
durch andere Aminosäurereste
mit ähnlichen
chemischen Eigenschaften (z.B. Ladung oder Hydrophobizität) ersetzt
sind und deshalb die funktionellen Eigenschaften des Moleküls nicht ändern. Wenn
sich Sequenzen in konservativen Substitutionen unterscheiden, kann
der Prozentsatz der Identität
nach oben angepasst werden, um entsprechend der konservativen Natur
der Substitution zu korrigieren. Man sagt, dass Sequenzen, die sich
durch derartige konservative Substitutionen unterscheiden, "Sequenzähnlichkeit" oder "Ähnlichkeit" haben. Mittel zum Durchführen dieser
Anpassungen sind Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt. Typischerweise
umfasst dies Bewerten einer konservativen Ersetzung als eine teilweise
oder einer völligen
Fehlpaarung, wodurch der Prozentsatz der Sequenzidentität erhöht wird.
Wenn beispielsweise einer identischen Aminosäure eine Bewertung von 1 zugewiesen
wird und einer nicht-konservativen Ersetzung eine Bewertung von
0 zugewiesen wird, wird einer konservativen Ersetzung eine Bewertung
zwischen 0 und 1 zugewiesen. Die Bewertung kon servativer Substitutionen
wird berechnet, z.B. wie es in dem Programm "PC/GENE" (Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien)
implementiert ist.
- (d) Wie hierin verwendet, bedeutet "Prozentsatz der Sequenzidentität" den Wert, der durch
Vergleichen von zwei optimal angeglichenen Sequenzen über ein
Vergleichsfenster hinweg bestimmt wird, wobei der Anteil der Polynucleotidsequenz
im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) im
Vergleich zu der Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen
umfasst) für
eine optimale Anordnung der zwei Sequenzen umfassen kann. Der Prozentsatz
wird durch Bestimmung der Anzahl an Positionen, an denen die identische
Nucleinsäurebase
in beiden Sequenzen auftritt, was die Anzahl übereinstimmender Positionen
ergibt, Teilen der Anzahl übereinstimmender
Positionen durch die Gesamtzahl der Positionen im Vergleichsfenster
und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100, um den Prozentsatz der
Sequenzidentität
zu ergeben, errechnet.
- (e) Der Begriff "wesentliche
Identität" ("substantial identity") von Polynucleotidsequenzen
bedeutet, dass eine Polynucleotidsequenz eine Sequenz umfasst, die
wenigstens 70% Sequenzidentität,
bevorzugt wenigstens 80%, stärker
bevorzugt wenigstens 90% und am stärksten bevorzugt wenigstens
95% im Vergleich zu einer Referenzsequenz unter Verwendung eines
der beschriebenen Anordnungsprogramme, wobei Standardparameter verwendet
werden, besitzt. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass
diese Werte auf geeignete Weise angepasst werden können, um
eine entsprechende Identität
von Proteinen, die von zwei Nucleotidsequenzen codiert werden, zu
bestimmen, wobei Codondegeneriertheit, Aminosäureähnlichkeit, Positionierung
des Leserasters und dergleichen berücksichtigt werden. Wesentliche
Identität von
Aminosäuresequenzen
für diese
Zwecke bedeutet normalerweise eine Sequenzidentität von wenigstens
60%, bevorzugter wenigstens 70%, 80%, 90% und am stärksten bevorzugt
wenigstens 95%.
-
Ein
weiterer Hinweis darauf, dass Nucleotidsequenzen im Wesentlichen
identisch sind, ist es, wenn zwei Moleküle miteinander unter stringenten
Bedingungen hybridisieren. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen
so gewählt,
dass sie näherungsweise
5°C unter
dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) der spezifischen
Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH
liegen. Jedoch umfassen stringente Bedingungen Temperaturen im Bereich
von näherungsweise
1°C bis
näherungsweise
20°C unter
der Tm, abhängig von dem gewünschten
Stringenzgrad, wie andernfalls hierin qualifiziert. Nucleinsäuren, die
unter stringenten Bedingungen nicht miteinander hybridisieren, sind
noch im Wesentli chen identisch, wenn die Polypeptide, für die sie
codieren, im Wesentlichen identisch sind. Dies kann auftreten, wenn
z.B. eine Kopie einer Nucleinsäure
unter Verwendung der maximalen Codon-Degeneriertheit, die vom genetischen
Code zugelassen wird, erzeugt wird. Ein Anzeichen dafür, dass
zwei Nucleinsäuresequenzen
im Wesentlichen identisch sind, ist es, wenn das von der ersten
Nucleinsäure
codierte Polypeptid mit dem von der zweiten Nucleinsäure codierten
Polypeptid immunologisch kreuzreaktiv ist.
-
Die
in der vorliegenden Erfindung offenbarte Promotorsequenz, sowie
Varianten und Fragmente davon sind bei der genetischen Manipulation
einer beliebigen Pflanze nützlich
bzw. verwendbar, wenn sie in einem DNA-Konstrukt so zusammengesetzt
werden, dass die Promotorsequenz mit einer heterologen Nucleotidsequenz
von Interesse funktionell verknüpft
ist. Die Kassette wird 5'-
und 3'-Regulationssequenzen
in funktioneller Verknüpfung
mit einer heterologen Nucleotidsequenz umfassen. Mit "funktionell verknüpft" ist eine funktionelle
Verknüpfung
zwischen einer erfindungsgemäßen Promotorsequenz
und einer zweiten Sequenz gemeint, wobei die Promotorsequenz die
Transkription der DNA-Sequenz, die der zweiten Sequenz entspricht, initiiert
und vermittelt. Im Allgemeinen bedeutet funktionell verknüpft, dass
die Nucleinsäuresequenzen
zusammenhängend
verknüpft
sind und, sofern notwendig, so dass sie zwei Protein-codierende
Bereiche zusammenhängend
und in dem gleichen Leseraster verbinden. Auf diese Weise wird die
Promotornucleotidsequenz in Expressionskassetten zusammen mit heterologen
Nucleotidsequenzen zur Expression in einer Pflanze von Interesse
bereitgestellt. Eine derartige Expressionskassette wird mit einer
Vielzahl an Restriktionsstellen für die Insertion der heterologen
Nucleotidsequenz, die unter der Transkriptionsregulation der regulatorischen
Bereiche, umfassend die erfindungsgemäße Promotorsequenz, stehen
soll, bereitgestellt. Die Kassette kann zusätzlich wenigstens ein zusätzliches
Gen, das in den Organismus co-transformiert werden soll, enthalten.
Alternativ kann das zusätzliche
Gen/die zusätzlichen
Gene auf mehrfachen bzw. mehreren Expressionskassetten bereitgestellt
werden.
-
Die
Expressionskassette kann zusätzlich
selektierbare Marker-Gene enthalten. Im Allgemeinen wird die Expressionskassette
ein selektierbares Markergen für
die Selektion transformierter Zellen umfassen. Selektierbare Markergene
werden für
die Selektion transformierter Zellen oder Gewebe verwendet. Markergene umfassen
Gene, die für
Antibiotikaresistenz codieren, wie z.B. jene, die für Neomycin-Phosphortransferase
II (NEO) und Hygromycin-Phosphortransferase
(HPT) codieren, sowie Gene, die Resistenz gegenüber herbiziden Ver bindungen,
wie z.B. Glufosinatammonium, Bromoxynil, Imidazolinonen und 2,4-Dichlorphenoxyacetat (2,4-D),
verleihen. Siehe allgemein, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech.
3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992)
Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) in The Operon,
S. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987)
Cell 49: 603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle
et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86: 5400-5404; Fuerst et
al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science
248:480-483; Gossen (1993) Ph. D. Thesis, Universität Heidelberg;
Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1917-1921; Labow
et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic
Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc.
Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother.
35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27: 1094-1104;
Bonin (1993) Ph. D. Thesis, Universität Heidelberg; Gossen et al.
(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992)
Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook
of Experimental Pharmacology, Band 78 (Springer Verlag, Berlin);
Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Die oben stehende Liste selektierbarer
Markergene soll nicht beschränkend
sein. In der vorliegenden Erfindung kann jedes beliebige selektierbare
Markergen verwendet werden.
-
Die
Expressionskassette wird in der 5'-3'-Richtung
der Transkription eine erfindungsgemäße Promotorsequenz, eine Translationsinitiationsregion,
eine heterologe Nucleotidsequenz und eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion,
funktionsfähig
in Pflanzen, umfassen. Die heterologe Nucleotidsequenz kann in Bezug
auf den Pflanzenwirt nativ oder analog oder fremd oder heterolog
sein. Zusätzlich
kann die heterologe Nucleotidsequenz die natürliche Sequenz oder alternativ
eine synthetische Sequenz sein. Mit "fremd" ist gemeint, dass die Transkriptionsinitiationsregion
nicht in der nativen Pflanze gefunden wird, in die die Transkriptionsinitiationsregion
eingeführt
wird. Wie hierin verwendet, umfasst ein chimäres Gen eine Promotorsequenz in
funktioneller Verknüpfung
mit einer codierenden Sequenz, die zu der Promotorsequenz heterolog
ist.
-
Die
Terminationsregion kann in Bezug auf die erfindungsgemäße Promotorsequenz
nativ sein oder kann nativ sein in Bezug auf die funktionell verknüpfte heterologe
Nucleotid sequenz oder kann von einer anderen Quelle stammen. Zweckdienliche
Terminationsregionen sind verfügbar
aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens, wie z.B. die Octopinsynthase-
und Nopalinsynthase-Terminationsregionen. Siehe auch Guerineau et al.
(1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674;
Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell
2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al.
(1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; und Joshiet et al. (1987)
Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.
-
Beim
Herstellen der Expressionskassette können zahlreiche DNA-Fragmente
manipuliert werden, um zu gewährleisten,
dass die DNA-Sequenzen in der richtigen Orientierung und, sofern
erforderlich, im richtigen Leseraster sind. Zu diesem Zweck können Adaptoren
oder Linker eingesetzt werden, um die DNA-Fragmente zu verbinden,
oder andere Manipulationen können
eingesetzt werden, um zweckdienliche Restriktionsstellen, Entfernung überflüssiger DNA,
Entfernung von Restriktionsorten oder dergleichen bereitzustellen.
Für diesen Zweck
können
in vitro-Mutagenese, Primerreparatur ("primer repair"), Restriktion, Annealing, Resubstitutionen,
d.h. Transitionen und Transversionen, eingesetzt werden.
-
Wo
es erforderlich ist, können
heterologe Nucleotidsequenzen bezüglich erhöhter Expression in der transformierten
Pflanze optimiert werden. Das bedeutet, dass die Gene unter Verwendung
Pflanzen-bevorzugter Codons bzw. von der Pflanze bevorzugter Codons
für eine
verbesserte Expression synthetisiert werden können. Siehe z.B. Campbell und
Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 für eine Diskussion Wirts-bevorzugter Codon-Nutzung
("host-preferred codon usage"). Es sind auf dem
Fachgebiet Verfahren zum Synthetisieren Pflanzen-bevorzugter Gene verfügbar. Siehe
z.B. die US-Patente Nrn. 5,380,831 und 5,436,391 und Murray et al.
(1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.
-
Weitere
Sequenzmodifikationen sind dafür
bekannt, dass sie die Genexpression in einem zellulären Wirt
steigern. Diese umfassen Eliminierung von Sequenzen, die für störende bzw.
fehlerhafte Polyadenylierungssignale, Exon-Intron-Spleißstellensignale,
Transposonartige Wiederholungen und andere derartige gut charakterisierte
Sequenzen, die für
die Genexpression schädlich
sein können,
codieren. Der G-C-Gehalt der Sequenz kann auf Level angepasst werden,
die für
einen gegebenen zellulären
Wirt durchschnittlich sind, was durch Bezug auf bekannte Gene, die
in der Wirtszelle exprimiert werden, berechnet wird. Wo es möglich ist, wird
die Sequenz modifiziert, um vorhergesagte Haarnadel-Sekundärstrukturen
der mRNA zu vermeiden.
-
Die
Expressionskassetten können
darüber
hinaus 5'-Leadersequenzen
bzw. 5'-Leitsequenzen in
dem Expressionskassettenkonstrukt oder Expressionsvektor enthalten.
Derartige Leadersequenzen können
eine erhöhte
Translation bewirken. Translationsleader bzw. Translationsleadersequenzen
sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen: Picornavirus-Leader, beispielsweise
den EMCV-Leader (Encephalomyocarditis-5'-nicht-codierende Region) (Elroy-Stein
et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); Potyvirus-Leader,
z.B. TEV-Leader (Tabakätzvirus)
(Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), MDMV-Leader (Maisverzwergungsmosaik-Virus)
(Virology 154:9-20), und humanes Immunglobulin-Heavy-Chain-Bindeprotein (BiP)
(Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); nicht-translatierter Leader
aus der Hüllprotein-mRNA
von Alfalfa-Mosaikvirus (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature
325:622-625); Tabakmosaikvirus-Leader (TMV) (Gallie et al. (1989)
in Molecular Biology of RNA, Hrs. Cech (Liss, New York), S. 237-256);
und Chlorotisches Maisscheckungsvirus-Leader ("maize chlorotic mottle virus" (MCMV)) (Lommel
et al. (1991) Virology 81:382-385). Siehe auch Della-Cioppa et al.
(1987) Plant Physiol. 84:965-968. Andere Verfahren zum Steigern der
Translation können
auch eingesetzt werden, beispielsweise Introns und dergleichen.
-
Es
wird anerkannt, dass die erfindungsgemäßen Promotorsequenzen verwendet
werden können,
um die Transkription von Antisense-Konstruktionen, komplementär zu wenigstens
einem Teil der Messenger-RNA (mRNA) für die Nucleotidsequenz eines
Gens von Interesse, zu initiieren. Antisense-Nucleotide sind so
konstruiert, dass sie mit der entsprechenden mRNA hybridisieren.
Modifikationen der Antisense-Sequenzen können gemacht werden, sofern
die Sequenzen mit der entsprechenden mRNA hybridisieren und deren
Expression stören.
Auf diese Weise können
Antisense-Konstruktionen mit 70%, bevorzugt 80%, stärker bevorzugt 85%,
Sequenzähnlichkeit
zu den entsprechenden "antisensed"-Sequenzen besitzen,
verwendet werden. Weiterhin können
Teile dieser Antisense-Nucleotide verwendet werden, um die Expression
von Zielgenen zu stören
bzw. zu unterbrechen. Im Allgemeinen werden Sequenzen von wenigstens
50 Nucleotiden, 100 Nucleotiden, 200 Nucleotiden oder mehr verwendet.
-
Die
erfindungsgemäßen Promotorsequenzen
können
auch verwendet werden, um die Transkription einer Nucleotidsequenz
in Sinn-Orientierung bzw. Sense-Orientierung zu initiieren, um die
Expression endogener Gene in Pflanzen zu unterdrücken. Verfahren zum Unterdrücken der
Genexpression in Pflanzen unter Verwendung von Nucleotidsequenzen
in der Sinn-Orientierung sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die Verfahren
umfassen im Allgemeinen Transformieren von Pflanzen mit einem DNA-Konstrukt,
umfassend einen Promotor, der die Expression in einer Pflanze steuert,
in funktioneller Verknüpfung
mit wenigstens einem Teil einer Nucleotidsequenz, die dem Transkript
des endogenen Gens entspricht. Typischerweise hat eine derartige
Nucleotidsequenz eine wesentliche Sequenzidentität mit der Sequenz des Transkripts
des endogenen Gens, bevorzugt mehr als näherungsweise 65% Sequenzidentität, stärker bevorzugt
mehr als näherungsweise
85% Sequenzidentität,
am stärksten
bevorzugt mehr als 95% Sequenzidentität, siehe US-Patente Nrn. 5,283,184
und 5,034,323.
-
Die
erfindungsgemäßen Promotorsequenzen
sind verwendbar bei der Gewebe-bevorzugten
Expression einer heterologen Nucleotidsequenz von Interesse. Mit "heterologe Nucleotidsequenz" ist eine Sequenz gemeint,
die natürlicherweise
nicht zusammen mit der Promotorsequenz vorkommt. Während diese
Nucleotidsequenz für
die Promotorsequenz heterolog ist, kann sie für den Pflanzenwirt homolog
oder nativ oder heterolog oder fremd sein. Die heterologe Nucleotidsequenz
in funktioneller Verknüpfung
mit einem der hierin offenbarten Promotoren kann für ein Polypeptid
von Interesse codieren. Beispiele derartiger heterologer Gene umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf Nucleotidsequenzen, die für
Polypeptide codieren, die Resistenz gegenüber abiotischem Stress, wie
z.B. Trockenheit, Temperatur, Salzgehalt bzw. Salinität, Ozon
und Toxinen, wie z.B. Pestiziden und Herbiziden, oder gegenüber biotischem
Stress, wie z.B. Befälle
durch Pathogene, einschließlich
Insekten, Viren, Bakterien, Pilze und Nematoden, und Entwicklung
von Krankheiten, die mit diesen Organismen zusammenhängen, verleihen.
-
Die
hierin offenbarten Promotor-Nucleotidsequenzen und Verfahren sind
nützlich
beim Regulieren der Expression einer beliebigen heterologen Nucleotidsequenz
in einer Wirtspflanze, um den Phenotyp einer Pflanze zu variieren.
Verschiedene Veränderungen
im Phenotyp sind von Interesse, einschließlich Modifikation der Fettsäurezusammensetzung
in einer Pflanze, Ändern
des Aminosäuregehalts
einer Pflanze, Ändern
der Pathogenabwehrmechanismen einer Pflanze, Ändern des Eintritts und Austritts
von Substanzen in das Gefäßgewebe
und dergleichen. Diese Ergebnisse können erreicht werden, indem
Expression heterologer Produkte oder erhöhte Expression endogener Produkte
in Pflanzen bereitgestellt werden. Alternativ können diese Ergebnisse erreicht
werden, indem eine Verringerung der Expression eines oder mehrerer
endogener Produkte, insbesondere Enzyme oder Co-Faktoren in der Pflanze,
bereitgestellt werden. Diese Veränderungen
können eine
Veränderung
des Phenotyps der transformierten Pflanze bewirken.
-
In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung sind die hierin offenbarten Promotorsequenzen funktionell
verknüpft
mit heterologen Nucleotidsequenzen, die die Beladungscharakteristika
bzw. Beladungseigenschaften von Gefäßgewebe modifizieren und dadurch
die Pflanzenentwicklung und -reifung, Kohlenstoffallokation und
Ernteausbeute beeinflussen. Das Phloem transportiert Substanzen
in dem gesamten Pflanzenorganismus. In Phloem transportierte Materialien
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf, Kohlenhydrate, Aminosäuren,
Peptide, anorganisches Phosphat und eindringende Pathogene. Diese
vom Phloem transportierten Substanzen müssen in das Phloem geladen
oder importiert werden, und zahlreiche Gene regulieren die Phloembeladung.
Mit "Gefäßgewebe
beladen" ist Laden
und Entladen von Nährstoffen,
wie z.B. Hormonen, Polypeptiden oder Kohlenhydraten, in Zellen des
vaskulären
Transportsystems der Pflanze gemeint. Durch Ändern der Konzentrationen von
Substanzen, die an der Phloembeladung beteiligt sind, können die
Beladungscharakteristika von Gefäßgewebe,
die Pflanzenentwicklung und das Pflanzenwachstum beeinflusst werden.
Die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen
können
verwendet werden, um die Expression von Substanzen, die Gefäßgewebebeladung
regulieren, zu modulieren.
-
Substanzen,
die die Gefäßgewebebeladung
regulieren, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Saccharosetransporter,
codiert von SUT1 (Genbank-Eingangsnummern. AF280050, AJ272309, AF167417, AF191025,
AF191024, AF109922, X82275, AJ224961, X83850, X69165), SUT2 (Genbank-Eingangsnummern
Y16768, AF166498, AJ272308) und SUT4 (Genbank-Eingangsnummern AF176950,
AF175322, AF237780); Saccharosesynthasen, codiert von ASUS1 (Genbank-Eingangsnummer
X70990), SUC1 (Genbank-Eingangsnummer
X75365), SUC2 (Genbaank-Eingangsnummern X75764, X79702), SUS1 (Genbank-Eingangsnummern
L29418), Shrunken1 (Genbank-Eingangsnummer J01241), SS1 (Genbank-Eingangsnummer
AJ001117) und SS2 (Marana et al. (1988) Gene 63:253-260); Aminosäuretransporter,
codiert von NaAAP1 (Genbank-Eingangsnummer AF080542); Peptidtransporter,
codiert von NaNTR1 (Schultz et al. (1999) Plant J. 6:637-646), Galactinolsynthasen
(Genbank-Eingangsnummern AF249912, AJ237693, AJ237694), anorganische
Pyrophosphatasen (Genbank-Eingangsnummer AJ252210), K+-Kanalproteine,
codiert von AKT3 (Genbank-Eingangsnummer U44745), H+-ATPasen,
codiert von AHA1 (Genbank-Eingangsnummer
AJ002020), AHA2 (Harper et al. (1990) J.Biol. Chem. 265:13601-13608), AHA3
(DeWitt et al. (1991) Plant J. 1:121-128), und pma4 (Gianinazzi-Pearson
et al. (2000) Planta 211:609-613 und Genbank-Eingangsnummer X66737),
Aminosäurepermeasen
(Genbank-Eingangsnummer X71787), Kohlenhydratregulatoren des Phloems,
codiert von pgm (Genbank-Eingangsnummer AF216580) und sex1 (Genbank-Eingangsnummer AF312027),
und Fructosyltransferasegenen (z.B. Genbank Eingangsnummer AJ250634).
-
In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung können
hierin offenbarte Promotorsequenzen operativ bzw. funktionell verknüpft sein
mit heterologen Nucleotidsequenzen, die nützlich sind beim Schützen von Pflanzen
gegen Pathogene, wobei diese Pathogene Insekten, Viren, Pilze, Nematoden
und dergleichen umfassen. Viele Pathogene wandern durch das Gefäßgewebe,
um die Krankheit über
die Pflanze zu verbreiten. Saft-saugende Insekten übertragen
Viren, Pilze und Nematoden von infizierten Pflanzen auf gesunde
Pflanzen. Die Erfindung ermöglicht
eine Gefäßgewebe-spezifische,
insbesondere Phloemgewebe-spezifische Expression von Genen, die
anti-pathogene Aktivität
verleihen. Mit "anti-pathogene
Zusammensetzungen" ist
gemeint, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
fähig sind,
den eindringenden pathogenen Organismus zu unterdrücken, zu
kontrollieren und/oder zu töten.
Eine erfindungsgemäße anti-pathogene
Zusammensetzung wird die aus der Provokation durch das Pathogen
resultierenden Symptome um wenigstens näherungsweise 5% bis näherungsweise
50%, wenigstens näherungsweise
10% bis näherungsweise
60%, wenigstens näherungsweise
30% bis näherungsweise
70%, wenigstens näherungsweise
40% bis näherungsweise
80% oder wenigstens näherungsweise
50% bis näherungsweise
90% oder mehr verringern. Folglich können die erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzt werden, um Pflanzen vor Krankheiten, insbesondere jenen Krankheiten,
die von Pflanzenpathogenen verursacht werden, zu schützen.
-
Assays,
die anti-pathogene Aktivität
messen, sowie Verfahren zum Quantifizieren der Krankheitsresistenz
in Pflanzen nach einer Pathogeninfektion sind auf dem Fachgebiet
allgemein bekannt. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,614,395. Derartige
Techniken umfassen Messen des durchschnittlichen Läsionsdurchmessers,
der Pathogenbiomasse und des insgesamten prozentualen Anteils zersetzter
Pflanzengewebe über
die Zeit. Zum Beispiel zeigt eine Pflanze, die entweder ein anti-pathogenes
Polypeptid exprimiert oder auf deren Oberfläche eine anti-pathogene Zusammensetzung
aufgebracht wurde, anschließend
an eine Pathogen-Provokation
eine Verringerung der Gewebenekrose (d.h. Läsionsdurchmesser) oder eine
Verriongerung des Absterbens der Pflanze, im Vergleich zu einer
Kontrollpflanze, die der anti- pathogenen
Zusammensetzung nicht ausgesetzt wurde. Alternativ kann anti-pathogene
Aktivität
durch eine Verringerung der Pathogen-Biomasse gemessen werden. Zum
Beispiel wird eine Pflanze, die ein anti-pathogenes Polypeptid exprimiert
oder einer anti-pathogenen Zusammensetzung ausgesetzt wurde, mit
einem interessierenden Pathogen provoziert. Über die Zeit hinweg werden
Gewebeproben aus den mit dem Pathogen inokulierten Geweben entnommen,
und es wird RNA extrahiert. Der Prozentsatz eines spezifischen Pathogen-RNA-Transkripts relativ
zu dem Level eines Pflanzen-spezifischen Transkripts erlaubt es,
den Level der Pathogenbiomasse zu bestimmen. Siehe z.B. Thomma et
al. (1998) Plant Biology 95:15107-15111.
-
Weiterhin
umfassen anti-pathogene in vitro-Assays beispielsweise das Aufgeben
variierender Konzentrationen der anti-pathogenen Zusammensetzung
auf Papierscheiben und Auflegen der Scheiben auf Agar, der eine
Suspension des Pathogens von Interesse enthält. Anschließend an
eine Inkubation entwickeln sich klare Hemmhöfe um die Scheiben, die eine
wirksame Konzentration des anti-pathogenen Polypeptids enthalten
(Liu et al. (1994) Plant Biology 91:1888-1892). Darüber hinaus
kann eine Mikrospektrofotometrie-Untersuchung eingesetzt werden,
um die anti-pathogenen in vitro-Eigenschaften einer Zusammensetzung
zu messen (Hu et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:949-959 und Cammue
et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:2228-2233).
-
Gene,
die für
Krankheitresistenzmerkmale codieren, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
Detoxifizierungsgene, wie z.B. gegen Fumonosin (US-Patent Nr. 5,792,931);
Avirulenz-(avr-) und Krankheitsresistenz-(R-) Gene (Jones et al.
(1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; und
Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089) und dergleichen.
-
Mit "Insektenresistenz" ist gemeint, dass
die Pflanzen die Symptome und Schädigung vermeiden, die das Ergebnis
von Pflanze-Insekt-Interaktionen sind. Das heißt, dass Insekten daran gehindert
werden, Pflanzenschädigung,
Erntegutschädigung
bzw. Ertragsschädigung,
Missbildung der Pflanze und Pflanzenkrankheiten zu verursachen,
oder alternativ wird die durch das Insekt verursachte Pflanzenschädigung,
Erntegutschädigung,
Missbildung der Pflanze und Pflanzenkrankheit minimiert oder verringert.
Insektenresistenzgene von Interesse umfassen Toxinproteine aus Bacillus,
von denen viele auf dem Fachgebiet bekannt sind.
-
Heterologe
Nucleotidsequenzen von besonderem Interesse umfassen Sequenzen,
die eine erhöhte Krankheitsresistenz
gegenüber
einer Vielzahl von Pflanzenschädlingen
bzw. Pflanzen-schädigenden
Organismen, einschließlich
Insekten mit stechenden und saugenden Mundwerkzeugen, die sich von
Pflanzensaft ernähren,
verleihen. Beispielsweise umfassen Insekten der Ordnung Homoptera,
die oft als eine separate Unterordnung der Ordnung Hemiptera betrachtet
wird, jene Insekten, die als Blattwanzen ("plant bugs") bekannt sind. Diese Schädlinge umfassen
die Blattläuse
[Familie Aphididae], weiße
Fliegen bzw. Mottenschildläuse [Aleyrodidae],
Spornzikaden bzw. Zwergzikaden [Delphacidae], Singzikaden [Cicadellidae],
Blattflöhe
bzw. Springläuse
[Psyllidae], Blasenläuse
[Pemphigidae], Schmier- bzw. Wollläuse [Pseudococcidae] und (Napf)-Schildläuse [Coccidae,
Diaspididae, Asterolecaniidae und Margarodidae]. Viele Arten sind
ernsthafte Schädlinge
von landwirtschaftlichen bzw. ackerbaulichen und gartenbaulichen
Nutzpflanzen und von Zierpflanzen und umfassen beispielsweise Erbsenblattlaus,
schwarze Bohnenblattlaus, Aphis gossypii, Baumwollblattlaus; grüne Apfelblattlaus,
gestreifte Kartoffellaus, kleine Pflaumenlaus, Bananenblattlaus;
Brevicoryne brassicae, Kohlblattlaus; mehlige Kartoffelblattlaus,
Pfirsichblattlaus, Maisblattlaus, Getreideblattlaus, Kohlmottenschildlaus
("brassica whitefly"), Tabakmottenschildlaus,
Gewächshausmottenschildlaus,
schwarze Zitronenlaus ("citrus
blackfly"), kleine
braune Zwergzikade, braune Reiszikade, Zuckerrohrzikade ("sugarcane planthopper"), Weißrückenzwergzikade,
grüne Reiszikade,
Circulifer tenellus ("beet
leafhopper"), Baumwollzwergzikade
("cottonjassid"), "zig-zag winged riceleafhopper", Apfelblattsauger,
großer
Birnenblattsauger, Blutlaus, Salatwurzellaus bzw. Pappelwolllaus,
Reblaus, Pseudococcus longispinus ("long-tailed mealybug"), Ananasschmierlaus, gestreifte Schmierlaus,
rosa Zuckerrohrschmierlaus bzw. Saccharococcus sacchari, Australische
Wollschildlaus, Olivenschildlaus, Kommaschildlaus, San-Jose-Schildlaus,
Aonidiella aurantii, Chrysonphalus aonidum und Kokospalmenschildlaus.
-
Von
Interesse sind auch Gene, die für
Resistenz gegenüber
pflanzenkauenden bzw. an Pflanzen nagenden Stadien von Insekten
codieren, die zu den Ordnungen Coleoptera, Lepidoptera und Orthoptera
gehören,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf: Acanthoscelides obtectus; Bruchus spp.; Callosobruchus spp. [zu
den Samenkäfern
gehörende
Käfer];
Agriotes spp. [Drahtwürmer],
insbesondere Agrotis ipsilon, schwarze Eulenraupe; Amphimallon spp.
[Blatthornkäfer];
Anthonomus grandis grandis, Baumwollkapselkäfer; Ceutorhynchus assimilis,
Kohlschotenrüssler;
Cylas spp. [Batatenkäfer];
Diabrotica spp. [Maiswurzelbohrer], insbesondere Diabrotica virgifera,
Westlicher Maiswurzelbohrer, Diabrotica longicornis barberi, Nördlicher
Maiswurzelbohrer, Diabrotica undecimpunctata howardi, Südlicher
Maiswur zelbohrer; Epicauta spp. [Ölkäfer bzw. "black blister beetles"]; Epilachna spp.
[Melonenkäfer
usw.], insbesondere Epilachna varivestis, Mexikanischer Bohnenkäfer; Leptinotarsa
decemlineata, Colorado-Kartoffelkäfer; Meligisthes spp. [Glanzkäfer); Melolontha spp.
(Maikäfer];
Phyleotreta spp.; Psylliodes spp. [Flohkäfer]; Popillia japonica, Japankäfer; Scolytus
spp. Borken-/Splintkäfer];
Sitophilus spp. [Kornkäfer],
insbesondere Sitophilus oryzae, Reiskäfer; Tenebrio molitor [Mehlwurm];
Tribolium spp. [Reismehlkäfer];
Trogoderma granarium, Khaprakäfer;
Acleris spp. [Obstbaumwickler]; Acraeaacerata, "sweet potato butterfly"; Agrotis spp. [Eulenwurm],
insbesondere Agrotis offhogonia, "western cutworm"; Autographa gamma, Gammaeule; Chilo
spp. [Stängelbohrer],
insbesondere Chilo partellus, Sorghumbohrer; Cydia pomonella, Apfelwickler;
Diparopsis spp. [rote Kapselwürmer];
Ephestia spp. [Speichermotten]; Heliothis spp., insbesondere Heliothis
virescens, Baumwollknospenwurm; Helicoverpa spp. [budworms, Kapselwürmer], insbesondere
Helicoverpa zea, Baumwollkapselwurm; Mamestra brassicae, Kohlmotte;
Manduca spp. [Hornwürmer],
Maruca testulalis, "mung
moth"; Mythimna
spp. [Getreideheerwürmer
("cereal armyworms"]; Ostrinia nubilalis,
Europäischer
Maiszünsler;
Pectinophora gossypiella, rosa Kapselwurm; Phthorimaea operculella,
Kartoffelmotte; Pieris brassicae, Großer Kohlweißling; Pieris rapae, Kleiner
Kohlweißling;
Plodia interpunctella, Dörrobstmotte;
Plutella xylostella, Kohlmotte; Sitatroga cerealella, Angoumois-Kornmotte;
Spodoptera spp. [Heerwürmer],
insbesondere Spodoptera frugiperda, Herbstheerwurm oder Maisheerwurm
und Spodoptera exigua, Rübenheerwurm;
Trichoplusia ni, Kohlspanner; Acheta spp. [Feldgrillen]; Gryllotalph
spp. [Maiswurfsgrillen]; Locusta migratoria, Wanderheuschrecke und
Schistocerca gregaria, Wüstenheuschrecke.
-
Darüber hinaus
ermöglicht
die erfindungsgemäße Promotorsequenz
Gefäßgewebe-bevorzugte Expression
von Insektenresistenzgenen, die für Resistenz gegenüber Insektenschädlingen
codieren, die ausgewählt
sind aus den Ordnungen Diptera, Hymenoptera, Mallophaga, Thysanoptera,
Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, usw.
Insektenschädlinge
der wichtigsten Nutzpflanzen umfassen: Mais: Diatraea grandiosella, "southwestern corn
borer"; Elasmopalpus
lignosellus, "lesser
cornstalk borer";
Diatraea saccharalis, Zuckerrohrbohrer; Melanotus spp., Drahtwürmer; Cyclocephala
borealis, "northern
masked chafer" (Engerling);
Cyclocephala immaculata, "southern
masked chafer" (Engerling);
Chaetocnema pulicaria, Getreideerdfloh; Sphenophorus maidis, Maiskäfer; Rhopalosiphum
maidis, Maisblattlaus; Anuraphis maidiradicis, Maiswurzellaus; Blissus
leucopterus leucopterus, "chinch
bug"; Melanoplus
femurrubrum, rotbeiniger Grashüpfer;
Melanoplus sanguinipes, Wandergrashüpfer; Hylemya platura, Saatfliegenlarve;
Agromyza parvicornis, "corn
blot leafminer";
Anaphothrips obscrurus, Gräserthrips;
Solenopsis milesta, Diebameise; Tetranychus urticae, Bohnenspinnmilbe;
Sorghum: Elasmopalpus lignosellus, "lesser cornstalk borer"; Feltia subterranea, "granulate cutworm"; Phyllophaga crinita,
Engerling; Elendes, Conoderus und Aeolus spp., Drahtwürmer; Oulema
melanopus, Getreidehähnchen;
Chaetocnema pulicaria, Getreideerdfloh; Sphenophorus maidis, Maiskäfer; Rhopalosiphum
maidis; Maisblattlaus; Sipha flava, gelbe Zuckerrohrblattlaus; Blissus
leucopterus leucopterus, "chinch
bug"; Contarinia
sorghicola, Sorghummücke;
Tetranychus cinnabarinus, Karminspinnmilbe; Tetranychus urticae,
Bohnenspinnmilbe; Weizen: Pseudaletia unipunctata, Heerwurm; Elasmopalpus
lignosellus, "lesser
cornstalk borer";
Elasmopalpus lignosellus, "lessercornstalk
borer"; Oulema melanopus,
Getreidehähnchen;
Hypera punctata, Kleegraskäfer;
Schizaphis graminum, Getreidelaus; Macrosiphum avenae, Englische Getreideblattlaus;
Melanoplus femurrubrum, rotbeiniger Grashüpfer; Melanoplus differentialis, "differential grasshopper"; Melanoplus sanguinipes,
Wandergrashüpfer;
Mayetiola destructor, Hessenfliege; Sitodiplosis mosellana, Weizengallmücke; Meromyza
americana, "wheat
stem maggot"; Hylemya
coarctata, Brachfliege; Frankliniella fusca, Tabakthrips; Cephus
cinctus, Getreidehalmwespe; Aceria tulipae, Tulpengallmilbe; Sonnenblume:
Suleima helianthana, "sunflower
bud moth"; Homoeosoma
electellum, Sonnenblumenmotte; Zygogramma exclamationis, "sunflower beetle"; Bothyrus gibbous, "carrot beetle"; Neolasioptera murtfeldtiana, "sunflower seed midge"; Baumwolle: Pseudatomoscelis
seriatus, "cotton
fleahopper"; Trialeurodes
abutilonea, "banded
winged whitefly";
Lygus lineolaris, Blindwanze; Melanoplus femurrubrum, rotbeiniger
Grashüpfer;
Melanoplus differentialis, "differential
grasshopper"; Thrips
tabaci, Zwiebelthrips; Franklinkiella fusca, Tabakthrips; Tetranychus
cinnabarinus, Karminspinnmilde; Tetranychus urticae, Bohnenspinnmilbe;
Reis: Diatraea saccharalis, Zuckerrohrbohrer; Colaspis brunnea, "grape colaspis"; Lissorhoptrus oryzophilus, "rice water weevil"; Nephotettix nigropictus,
Reissingzikade; Blissus leucopterus leucopterus, "chinch bug"; Acrosternum hilare,
grüne Stinkwanze;
Sojabohne: Pseudoplusia includens, Sojabohnenwickler; Anticarsia
gemmatalis, "velvetbean"-Raupe; Plathypena
scabra, "green cloverworm"; Myzus persicae,
grüne Pfirsichblattlaus;
Empoasca fabae, hellgrüne
Zwergzikade; Acrosternum hilare, grüne Stinkwanze; Melanoplus femurrubrum,
rotbeiniger Grashüpfer;
Melanoplus differentialis, "differential
grasshopper"; Hylemya
platura, Saat fliegenlarbe; Sericothrips variabilis, Sojabohnenthrips;
Thrips tabaci, Zwiebelthrips; Tetranychus turkestani, Erdbeerspinnmilbe; Tetranychus
urticae, Bohnenspinnmilbe; Gerste: Schizaphis graminum, Getreidelaus;
Blissus leucopterus leucopterus, "chinch bug"; Acrosternum hilare, grüne Stinkwanze;
Euschistus servus, braune Stinkwanze; Delia platura, Saatfliegenwanze;
Mayetiola destructor, Hessenfliege; Petrobia latens; braune Weizenmilbe; Ölraps: Phyllotreta
cruciferae, Erdfloh; Mamestra configurata, Bertha-Heerwurm; Delia
ssp., Wurzelfliegenlarven.
-
Nucleotidsequenzen,
die für
Polypeptide codieren, die eine erhöhte Insektenresistenz verleihen,
sind auf dem Fachgebiet bekannt. Derartige Sequenzen umfassen beispielsweise,
sind aber nicht beschränkt
auf: Sequenzen, die für
toxische Proteine von Bacillus thuringiensis codieren (US-Patente
Nrn. 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; 6,110,464;
6,033,874; 6,015,891; 5,942,664; 5,914,318; 5,567,600; 5,567,862;
5,723,440; 6,153,814; 6,063,756; 5,854,053; 5,854,053; Geiser et
al. (1986) Gene 48: 109); Lectine, wobei das Lectin Schneeglöckchenlectin,
Erbsenlectin, Riesenbohnenlectin, modifiziertes Riesenbohnenlectin,
Weizenkeimlectin, Tomatenlectin, Erdnusslectin oder Weizenkeim-Agglutinin, Aprotinin
und Hernandia moerenhoutiana-Lectin (Zhou et al. (1998) Chin. J.
Biotechnol 14:9; Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24: 825;
US 5,545,820 ; WO 94/16565
A1 und WO 00/44780) umfasst; Lipoxidasen, wobei die Lipoxidase Erbsenlipoxidase
1 oder Sojabohnenlipoxidase umfasst; Insektenchitinasen (US-Patent
Nr. 5,866,788); insektizide Polypeptide (US-Patent Nr. 5,824,864);
und dergleichen.
-
Saft-saugende
Schädlinge übertragen
Viren von infizierten Pflanzen auf gesunde Pflanzen. Derartige Viren
umfassen Reistungro-Virus ("rice
tungro bacilliform virus")
(Bhattacharyya-Pakrassi et al. (1993) Plant J. 4:71), Tabakmosaikvirus
(Cheng et al. (2000) Plant J., 3:349), "Sweet potato chlorotic stunt"-Virus und "sweet potato feather
mottle"-Virus (Karyeija
et al. (2000) Virology 269:26). Phloem-spezifische Expression einer
heterologen Nucleotidsequenz mit anti-pathogener Aktivität verringert
oder minimiert die Auswirkungen der viralen Pathogene.
-
Weitere
Pathogene von Interesse umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
Viren oder Viroide und Pilze. Viren können jedes beliebige Pflanzenvirus
umfassen, beispielsweise Tabak- oder Gurkenmosaikvirus, Ringfleckenvirus,
Necrosevirus, Maisverzwergungsmosaikvirus, usw. Spezifische pilzliche
und virale Pathogene für
die wichtigsten Nutzpflanzen umfassen: Sojabohnen: Phytophthora
megasperma fsp. glycinea, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani,
Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Diaporthe phaseolorum
var. sojae (Phomopsis sojae), Diaporthe phaseolorum var. caulivora,
Sclerotium rolfsii, Cercospora kikuchii Cercospora sojina, Peronospora
manshurica, Colletotrichum dematium (Colletotichum truncatum), Corynespora
cassiicola, Septoria glycines, Phyllosticta sojicola, Alternaria
alternata, Pseudomonas syringae p.v. glycinea, Xanthomonas campestris
p.v. phaseoli, Microsphaera diffusa, Fusarium semitectum, Phialophora gregata,
Sojabohnenmosaikvirus, Glomerella glycines, Tabakringfleckenvirus,
Tabakstrichelvirus, Phakopsora pachyrhizi, Pythium aphanidermatum,
Pythium ultimum, Pythium debaryanum, Tomatenbronzefleckenvirus, Heterodera
glycines Fusarium solani; Rapssorten: Albugo candida, Alternaria
brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia
sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola, Pythium ultimum, Peronospora
parasitica, Fusarium roseum, Alternaria alternata; Alfalfa: Clavibafer
michiganese subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irregulare,
Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, Phytophthora
megasperma, Peronospora trifoliorum, Phoma medicaginis var. medicaginis,
Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila
medicaginis, Fusarium, Xanthomonas campestris p.v. alfalfae, Aphanomyces
euteiches, Stemphylium herbarum, Stemphylium alfalfae; Weizen: Pseudomonas
syringae p.v. atrofaciens, Urocystis agropyri, Xanthomonas campestris
p v. translucens, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Alternaria
alternata, Cladosporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium
avenaceum, Fusarium culmorum, Ustilago tritici, Ascochyta tritici,
Cephalosporium gramineum, Collotetrichum graminicola, Erysiphe graminis
f.sp. tritici, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recondita
f.sp. tritici, Puccinia strüformis,
Pyrenophora triticirepentis, Septoria nodorum, Septoria tritici,
Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoides, Rhizoctonia
solani, Rhizoctonia cereals, Gaeumannomyces graminis var. tritici,
Pythium aphanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythiumultimum, Bipolaris
sorokiniana, Gerstengelbverzweigungsvirus, Trespenmosaikvirus, Bodenübertragbares
Weizenmosaikvirus, Weizenstrichelvirus, Weizenspindelstrichelvirus, "American Wheat Striate
Virus", Claviceps
purpura, Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia
indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomannes, Pythium gramicola,
Pythium aphanidermatum, "High
Plains Virus", "European wheat striate
virus"; Sonnenblume:
Plasmophora halstedii, Sclerotinia sclerotiorum, Aster yellows,
Septoria helianthi, Phomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria
zinniae, Botrytis cinerea, Phoma macdonaldii, Macrophomina phaseolina,
Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus
stolonifer, Puccinia helianthi, Verticillium dahliae, Erwinia carotovorum
pv. carotovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea,
Albugo tragopogonis; Mais: Fusarium moniliforme var. subglutinans,
Erwinia stewartii, Fusarium moniliforme, Gibberella zeae (Fusarium
graminearum), Stenocarpella maydi (Diplodia maydis), Pythium irregulare,
Pythium debaryanum, Pythium graminicola, Pythium splendens, Pythium
ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus flavus, Bipolaris maydis
O, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium carbonum I,
II & III (Cochliobolus
carbonum), Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium pedicellatum, Physoderma
maydis, Phyllosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghi,
Ustilago maydis, Puicinia sorghi, Puccinia polysora, Macrophomina
phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum,
Curvularia lunata, Curvularia inaequalis, Curvularia pallescens,
Clavibacter michiganense subsp. nebraskense, Trichoderma viride,
Maisverzwergungsmosaikvirus A & B,
Weizenstrichelvirus, Chlorotisches Maisverzwergungsvirus, Claviceps
sorghi, Pseudonomas avenae, Erwinia chrysanthemi pv. zea, Erwinia
carotovora, Maisverzwergungs-Spiroplasma,
Diplodia macrospora, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora
sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Peronosclerospora maydis,
Peronosclerospora sacchari, Sphacelotheca reiliana, Physopella zeae,
Cephalosporium maydis, Cephalosporium acremonium, Chlorotisches
Maisscheckungsvirus, High Plains Virus, Maismosaikvirus, Mais-Rayado Fino-Virus,
Maisstrichelvirus, Maisstreifenvirus, Maisrauhverzwergungsvirus;
Sorghum: Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella
graminicola), Cercospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochyta
sorghina, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Xanthomonas campestris
p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonis, Puccinia purpurae, Macrophomina
phaseolina, Perconia circinata, Fusarium moniliforme, Alternaria
alternata, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia
lunata, Phoma insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans),
Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Phyllachara sacchari,
Sporisorium reilianum (Sphacelotheca reiliana), Sphacelotheca cruenta,
Sporisorium sorghi, Zuckerrohrmosaik H, Maisverzwergungsmosaikvirus
A & B, Claviceps
sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium strictum, Sclerophthona macrospora,
Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora
graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes,
Pythium graminicola, usw.
-
Nematoden
umfassen parasitische Nematoden, wie z.B. Wurzelgallen-, Cysten-
und Läsionsnematoden,
einschließlich
Heterodera und Globodera spp.; insbesondere Globodera rostochiensis
und Globodera pailida (Kartoffelcystenelchen bzw. Kartoffelcystennematoden);
Heterodera glycines (Sojabohnencystennematode); Heterodera schachtii
(Rübencystennematode);
und Heterodera avenae (Getreidecystennematode).
-
Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung ermöglicht
die Expression von Herbizidresistenzmerkmalen. Herbizidresistenzmerkmale
können
in Pflanzen durch Gene eingeführt
werden, die für
Resistenz gegenüber
Herbiziden, die durch Inhibieren der Wirkung von Acetolactatsynthase
(ALS) wirken, codieren, insbesondere den Herbiziden vom Sulfonylharnstoff-Typ
(z.B. das Acetolactatsynthase-(ALS-) Gen, enthaltend Mutationen,
die zu einer derartigen Resistenz führen, insbesondere die S4-
und/oder Hra-Mutationen. Von Interesse sind auch Gene, die für eine Resistenz
gegenüber
Herbiziden, die durch Inhibieren der Wirkung von Glutaminsynthase
wirken, wie z.B. Phosphinothricin oder Basta (z.B. das bar-Gen),
codieren oder andere derartige Gene, die im Fachgebiet bekannt sind.
Das bar-Gen codiert für
Resistenz gegenüber
dem Herbizid basta und die ALS-Genmutanten codieren für eine Resistenz
gegenüber
dem Herbizid Chlorsulfuron.
-
Es
wird weiterhin anerkannt, dass die Nucleotidsequenzen von Interesse,
die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, den Handelsmarkt
und die Interessen von jenen, die an der Entwicklung der Nutzpflanzen
beteiligt sind, widerspiegeln. Nutzpflanzen und Märkte von
Interesse verändern
sich und so wie sich entwickelnde Nationen bzw. Entwicklungsländer dem
Weltmarkt öffnen,
werden auch neue Nutzpflanzen und Technologien entstehen. Zusätzlich wird
sich, so wie sich unser Verständnis
agronomischer Merkmale und Charakteristika, wie z.B. Ertrag und
Heterosis, erhöht,
die Wahl der Gene für
die Transformation entsprechend ändern.
-
Allgemeine
Kategorien von interessierenden Nucleotidsequenzen umfassen z.B.
jene Gene, die an Information beteiligt sind, wie z.B. Zinkfinger,
jene, die an Kommunikation beteiligt sind, wie z.B. Kinasen, jene, die
am Housekeeping beteiligt sind, wie z.B. Hitzeschockproteine, und
jene, die an der Phloembeladung beteiligt sind, wie z.B. Transporter.
Speziellere Kategorien von Transgenen umfassen z.B. Gene, die für die Agronomie
wichtige Merkmale, Insektenresistenz, Krankheitsresistenz, Herbizidresistenz,
Exsudateigenschaften und Handelsprodukte codieren. Interessierende
Nucleotidsequenzen umfassen weiterhin im Allgemeinen jene, die an Öl-, Stärke-, Kohlenhydrat-
oder Nährstoffmetabolismus
beteiligt sind, sowie jene, die Korngröße, Saccharosebeladung, Nährstofftransport
und dergleichen beeinflussen.
-
Argonomisch
wichtige Merkmale, wie z.B. Öl-,
Stärke-
und Proteingehalt können
gentechnisch unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren verändert werden.
Modifikationen umfassen das Erhöhen
des Gehalts an Ölsäure, gesättigten
und ungesättigten Ölen, Erhöhen der
Level an Lysin und Schwefel, Bereitstellen essentieller Aminosäuren und
Modifizieren von Stärke.
Hordothionin-Proteinmodifikationen sind in den US-Patentanmeldungen
Serien-Nummern 08/838,763, eingereicht am 10. April 1997; 08/824,379,
eingereicht am 26. März
1997; 08/824,382, eingereicht am 26. März 1997; und im US-Patent Nr.
5,703,049 beschrieben. Ein weiteres Beispiel ist Lysin- und/oder
Schwefel-reiches Samenprotein, das von dem 2S-Albumin aus Sojabohne,
beschrieben in der US-Seriennummer 08/618,911, eingereicht am 20.
März 1996,
und dem Chymotrypsininhibitor aus Gerste, Williamson et al. (1987)
Eur. J. Biochem. 165:99-106, codiert werden.
-
Derivate
der codierenden Sequenzen können
durch ortsgerichtete Mutagenese erzeugt werden, um den Level an
vorausgewählten
Aminosäuren
im codierten Polypeptid zu erhöhen.
Beispielsweise ist das Gen, das für Gersten-Hochlysinpolypeptid
(BHL) codiert, vom Gersten-Chymotrypsin-Inhibitor abgeleitet, siehe US-Seriennummer
08/740,682, eingereicht am 1. November 1996 und PCT/US 97/20441,
eingereicht am 31. Oktober 1997. Andere Proteine umfassen Methionin-reiche
Pflanzenproteine, wie z.B. aus Sonnenblumensamen (Lilley et al.
(1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization
in Human Foods and Animal Feedstuffs, Hrsg. Applewhite (American
Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), S. 497-502; Mais (Pedersen
et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene,
71:359); und Reis (Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123.
Andere agronomisch bedeutende Gene codieren für Latex, Floury 2, Wachstumsfaktoren,
Samenspeicherfaktoren und Transkriptionsfaktoren.
-
Die
Getreide- bzw. Kornqualität
wird widergespiegelt von Merkmalen, wie z.B. Gehalten und Typen von Ölen, gesättigt und
ungesättigt,
Qualität
und Menge essentieller Aminosäuren
und Cellulosegehalte. Bei Mais, modifizierte Hordothioninproteine,
beschrieben in der US-Patentanmeldung, Seriennummer 08/838,763, eingereicht
am 10. April 1997; 08/824,379, eingereicht am 26. März 1997;
08/824,382, eingereicht am 26. März 1997;
und das US-Patent Nr. 5,703,049, erteilt am 30. Dezember 1997 stellen
Beschreibungen von Modifikationen von Proteinen für die gewünschten
Zwecke bereit.
-
Wirtschaftlich
bedeutsame Merkmale ("commercial
traits") können auch
von einem Gen oder von Genen codiert werden, das/die z.B. Stärke für die Ethanolproduktion
erhöhen
könnten
oder die Expression von Proteinen bereitstellen könnten. Eine
weitere wichtige kommerzielle Verwendung transformierter Pflanzen
ist die Produktion von Polymeren und Biokunststoffen, wie sie z.B.
im US-Patent Nr. 5,602,321, erteilt am 11. Februar 1997, beschrieben
werden. Gene, wie z.B. B-Ketothiolase, PHBase (Polyhydroxybutyratsynthase)
und Acetoacetyl-CoA-Reduktase (siehe Schubert et al. (1988) J. Bacteriol.
170:5837-5847) erleichtern die Expression von Polyhydroxyalkanoaten
(PHAs). Eine spezielle Ausführungsform
der Erfindung umfasst Phloem-bevorzugte Expression dieser Polymere
und Biokunststoffe, um das Sammeln und Ernten dieser Produkte aus dem
Exsudat oder Pflanzensaft zu erleichtern.
-
Exogene
Produkte umfassen Pflanzenenzyme und -produkte, sowie jene aus anderen
Quellen, einschließlich
Prokaryonten und anderen Eukaryonten. Derarige Produkte umfassen
Enzyme, Co-Faktoren, Hormone und dergleichen. Die Gehalte an Proteinen,
insbesondere modifizierte Proteine mit verbesserter Aminosäureverteilung
zum Verbessern des Nährwerts
der Pflanze, können
gesteigert werden. Dies wird durch die Expression solcher Proteine
mit verbessertem bzw. erhöhtem
Aminosäuregehalt
erreicht.
-
Die
Expressionskassette, umfassend die erfindungsgemäße Promotorsequenz in funktioneller
Verknüpfung
mit einer interessierenden Nucleotidsequenz kann verwendet werden,
um beliebige Pflanzenarten zu transformieren, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf Monocotyle und Dicotyle. Beispiele für Pflanzenarten von Interesse
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Mais (Zea mays), Brassica sp. (z.B. B. napus, B. rapa, B. juncea),
insbesondere jene Brassica-Arten, die als Quellen für Samenöl verwendbar
sind, Alfalfa (Medicago sativa), Reis (Oryza sativa), Roggen (Secale
cereale), Sorghum (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Hirse (z.B.,
Perlhirse (Pennisetum glaucum), Rispenhirse (Panicum miliaceum),
Borkenhirse (Setaria italica), Fingerhirse (Eleusine coracana)),
Sonnenbluem (Helianthus annuus), Saflor (Carthamus tinctorius),
Weizen (Triticum aestivum), Sojabohne (Glycine max), Tabak (Nicotiana
tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum), Erdnüsse (Arachis hypogaea), Baumwolle
(Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), Süßkartoffel (Ipomoea batatus),
Cassava (Manihot esculenta), Kaffee (Coffea spp.), Kokosnuß (Cocos
nucifera), Ananas (Ananas comosus), Citrusbäume (Citrus spp.), Kakao (Theobroma
cacao), Tee (Camellia sinensis), Bananen (Musa spp.), Avocado (Persea
americana), Feige (Ficus casica), Guave (Psidium guajava), Mango
(Mangifera indica), Olive (Olea europaea), Papaya (Carica papaya),
Cashew (Anacardium occidentale), Macadamia (Macadamia integrifolia),
Mandel (Prunus amygdalus), Zuckerrüben (Beta vulgaris), Zuckerrohr
(Saccharum spp.), Hafer, Gerste, Gemüse, Zierpflanzen und Koniferen.
-
Gemüse umfassen
Tomaten (Lycopersicon esculentum), Salat (z.B. Lactuca sativa) grüne Bohnen (Phaseolus
vulgaris), Limabohnen (Phaseolus limensis), Erbsen (Lathyrus spp.)
und Angehörige
der Gattung Cucumis, wie z.B. Gurke (C. sativus), Cantalop (C. cantalupensis)
und Zuckermelone (C. melo). Zierpflanzen umfassen Azaleen (Rhododendron
spp.), Hydrangea bzw. Hortensie (Macrophylla hydrangea), Hibiscus
(Hibiscus rosasanensis), Rosen (Rosa spp.), Tulpen (Tulipa spp.),
Osterglocken (Narcissus spp.), Petunien (Petunia hybrida), Nelken
(Dianthus caryophyllus), Poinsettia (Euphorbia pulcherrima) und
Chrysantheme.
-
Koniferen,
die beim Benutzen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, umfassen
z.B. Kiefern, wie z.B. Taedakiefer (Pinus taeda), Karibische Kiefer
(Pinus elliotii), Gelbkiefer (Pinus ponderosa), Drehkiefer (Pinus
contorta) und Monterey-Kiefer (Pinus radiata); Douglasie (Pseudotsuga
menziesili); Westamerikanische Hemlocktanne (Tsuga canadensis);
Sitkafichte (Picea glauca); Küstenmammutbaum
(Sequoia sempervirens); echte Tannen, wie z.B. Purpurtanne (Abies
amabilis) und Balsamtanne (Abies balsamea); und Zedern, wie z.B. "Western red cedar" (Thuja plicata)
und Nutka-Scheinzypresse (Chamaecyparis nootkatensis). Erfindungsgemäße Pflanzen
sind bevorzugt Nutzpflanzen (z.B. Mais, Alfalfa, Sonnenblume, Brassica,
Sojabohne, Baumwolle, Saflor, Erdnuss, Sorghum, Weizen, Hirse, Tabak
usw.), stärker
bevorzugt Mais- und Sojabohnenpflanzen, noch stärker bevorzugt Maispflanzen.
-
Transformationsprotokolle
sowie Protokolle zum Einführen
von Nucleotidsequenzen in Pflanzen können abhängig von dem Typ der Pflanze
und der Pflanzenzelle, d.h. Monocotyl oder Dicotyl, die für die Transformation
als Ziel genommen werden, variieren. Geeignete Verfahren zum Einführen von
Nucleotidsequenzen in Pflanzenzellen und nachfolgende Insertion
in das Pflanzengenom umfassen Mikroinjektion (Crossway et al. (1986)
Biotechniques 4:320-334), Elektroporation (Riggs et al. (1986) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), Agrobacterium-vermittelte Transformation
(Townsend et al., US-Patent Nr. 5,563,055; Zhao et al., US-Patent
Nr. 5,981,840), direkten Gentransfer (Paszkowski et al. (1984) EMBO
J. 3:2717-2722) und ballistische Partikelbeschleunigung (siehe z.B.
Sauford et al., US-Patent Nr. 4,945,050; Tomes et al., US-Patent Nr.
5,879,918; Tomes et al., US-Patent Nr. 5,886,244; Bidney et al.,
US-Patent Nr. 5,932,782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant
Cells via Microprojectile Bombardment"; in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture:
Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg und Phillips (Springer-Verlag,
Berlin); und McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926). Siehe
auch Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford
et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (Zwiebel);
Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (Sojabohne); McCabe
et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (Sojabohne); Finer und McMullen (1991)
In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (Sojabohne); Singh et al. (1998)
Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (Sojabohne); Datta et al. (1990)
Biotechnology 8:736-740 (Reis); Klein et al. (1988) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 85:4305-4309 (Mais); Klein et al. (1988) Biotechnology
6:559-563 (Mais); Tomes, US-Patent
Nr. 5,240,855; Buising et al., US-Patent Nrn. 5,322,783 und 5,324,646;
Tomes et al. (1995) "Direct
DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", in Plant Cell,
Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (Mais);
Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (Mais); Fromm et al. (1990)
Biotechnology 8:833-839 (Mais); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984)
Nature (London) 311:763-764; Bowen et al., US-Patent Nr. 5,736,369
(Getreide); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349
(Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation
of Ovule Tissues, Hrsg. Chapman et al. (Longman, New York), S. 197-209 (Pollen); Kaeppler
et al. (1990) Plant Cell (Faser- bzw. Whisker-vermittelte Transformation);
D'Halluin et al.
(1992) Plant Cell 4:1495-1505, Elektroporation); Li et al. (1993) Plant
Cell Reports 12:250-255 und Christou und Ford (1995) Annals of Botany
75:407-413 (Reis); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750
(Mais über
Agrobacterium tumefaciens).
-
Die
Zellen, die transformiert worden sind, können auf herkömmlichen
Wegen zu Pflanzen entwickelt werden. Siehe z.B. McCormick et al.
(19986) Plant Cell Reports 5:81-84. Diese Pflanzen können dann
gezüchtet
werden und entweder mit dem gleichen transformierten Stamm oder
unterschiedlichen Stämmen
bestäubt werden
und die resultierende Hybride mit Expression des gewünschten
phänotypischen
Merkmals können identifiziert
werden. Es können
zwei oder mehr Generationen gezüchtet
werden, um sicherzustellen, dass die Expression des gewünschten
phänotypischen
Merkmals stabil beibehalten und vererbt wird; und dann können Samen
geerntet werden, um sicherzustellen, dass die Expression des gewünschten
phänotypischen
Merkmals erzielt worden ist.
-
Die
nachstehenden Beispiele werden zum Zweck der Erläuterung angegeben und nicht
zum Zweck der Beschränkung.
-
EXPERIMENTE
-
Beispiel 1: Isolierung
von Promotorsequenzen
-
Die
Promotorregion für
das für
Prunasinhydrolyse codierende Prunus serotina-Gen wurde unter Verwendung
des GenomeWalker KitTM (Clontech) aus Kirschbäumen isoliert.
Die Sequenz für
den Prunasinhydrolase-Promotor ist in SEQ ID NO: 1 angegeben. Die
Sequenz für
das Prunasinhydrolase-Operon, einschließlich der Prunasinhydrolase-Promotorregion, ist
in SEQ ID NO: 3 angegeben. Die Nucleotide 989-2626 von SEQ ID NO:
3 codieren für
ein Prunasinhydrolase-Polypeptid.
-
Genomische
DNA wurde aus Blättern
der Späten
Traubenkirsche (Prunus serotina) unter Verwendung des "DNeasy Plant mini"-Kits (Qiagen Kat.#
69104) extrahiert. Das Protokoll in der niedergeschriebenen Form wurde
befolgt (Ausgabe vom November 1999). Fünf GenomeWalker
TM-Bibliotheken
wurden dann aus dieser genomischen DNA gemäß dem Handbuch für das "Universal GenomeWalker
TM-Kit" (Clontech
K1807-1) erzeugt. Sie wurden unter Verwendung von stumpf ("blunt") schneidenden Enzymen
erzeugt:
Bibliothek | Enzym |
DL-1 | EcoRV |
DL-2 | ScaI |
DL-3 | DraI |
DL-4 | PvuII |
DL-5 | StuI |
-
Genspezifische
Primer (GSP1/SEQ ID NO: 7 und GSP2/SEQ ID NO: 8) wurden unter Verwendung
einer bekannten Prunasinhydrolase-Sequenz (Genbank Eingangsnummer
U50201) konstruiert.
-
GenomeWalkerTM-Primer für Prunasinhydrolase
-
- GSP1/SEQ ID NO.: 7 5'-GTATCGAAATGGGTCCTGTTGAGAGT
- GSP2/SEQ ID NO.: 8 5'-ATATGTCCCGGCAGCATTGGTATTTG
-
Dann
wurden Amplifikationen gemäß dem Handbuch
für den "Universal Genome-WalkerTM-Kit" durchgeführt, wobei
der GSP1-Primer fü die
erste GenomeWalkerTM- Amplifikation und GSP2 für die zweite
Amplifikation verwendet wurden. In der DL-1-Bibliothek wurde eine 1,5 kb-Bande erzeugt.
Dieses Fragment wurde in pGEMT-easy (Promega Kat.# A1360) cloniert
und sequenziert. Ergebnisse aus der Sequenz wiesen darauf hin, dass
in dem clonierten Produkt zwei verschiedene Produkte vorhanden waren.
Sie wurden als DL1.4 und DL1.1 bezeichnet. Es wurde bestätigt, dass
beide Produkte der Prunasinhydrolase genomisch benachbart sind,
und zwar durch Amplifizieren von Produkten unter Verwendung von
Vorwärtsprimern,
die auf einer Sequenz aus den GenomeWalkerTM-Fragmenten
beruhen, und Rückwärtsprimern
aus der Prunasinhydrolase-Sequenz. Sobald sie bestätigt waren,
wurden die PH DL1.1- und PH DL1.4-Promotoren dann aus der genomischen
DNA der späten
Traubenkirsche amplifiziert, wobei die unten stehenden Primer verwendet
wurden, um NcoI-Stellen
am Start-Codon hinzuzufügen.
Die erzeugten Fragmente wurden in pGEMT-easy cloniert und zur Bestätigung sequenziert.
-
PCR-Primer für den Prunasinhydrolase-Promotor
-
DL1.1/SEQ ID NO: 5:
-
- Produkt der Länge
1260 (Bemessung: 162 setzt NcoI an das Start-Codon)
- Tm: 74,5°C
TaOpt: 54,0°C
GC: 36,8
- SEQ ID NO.: 9 ACCGTGCGAAAGGTCTTCTTG
- SEQ ID NO.: 10 ATGCCATGGCTGAGAGGAGGG
-
DL1.4/SEO ID NO: 1:
-
- Produkt der Länge
871 (Bemessung: 162)
- (setzt NcoI an das Start-Codon)
- Tm: 73,7°C
TaOpt: 55,6°C
GC: 35,6
- SEQ ID NO.: 11 GGGGTGCTTACACCCACAATCATCC
- SEQ ID NO.: 12 GCAATGCCATGGCTCAGTGGAG
-
Beispiel 2: Transformation
und Regeneration transgener Pflanzen
-
Unreife
Maisembryonen aus Gewächshaus-Donorpflanzen
wurden mit einem Plasmid, enthaltend den Prunasinhydrolase-Promotor
in funktioneller Verknüpfung
mit einer heterologen Nucleotidsequenz und dem selektierbaren Marker-Gen
PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37), das Resistenz gegenüber dem
Herbizid Bialaphos verleiht, bombadiert. Alternativ wird das selektierbare
Markergen auf einem separaten Plasmid bereitgestellt. Die Transformation
wird durchgeführt
wie folgt: Rezepte für
Medien folgen nachstehend.
-
Präparation
von Zielgewebe
-
Die Ähren werden
von den Lieschblättern
befreit ("husked") und in 30%igem
Blechmittel plus 0,5% Detergens 20 Minuten lang oberflächensterilisiert
und zweimal mit sterilem Wasser gespült. Die unreifen Embryonen
werden exzidiert und mit der Embryo-Achse nach unten (Schildchenseite
nach oben) zu 25 Embryonen pro Platte für 4 Stunden auf 560Y-Medium gelegt und
dann zur Vorbereitung der Bombardierung innerhalb der 2,5-cm-Zielzone
angeordnet.
-
DNA-Präparation
-
Ein
Plasmidvektor, umfassend den Prunasinhydrolase-Promotor in funktioneller
Verknüpfung
mit einer heterologen Nucleotidsequenz, wird hergestellt. Dieser
Vektor plus ein selektierbarer PAT-Marker, entweder mit gleichen
oder einem separaten Vektor, werden auf Wolframpellets mit einem
mittleren Durchmesser von 1,1 μm
unter Verwendung einer CaCl2-Präzipitationsverfahrensweise
wie folgt präzipitiert
bzw. aufgefällt:
100 μl vorbereitete
Wolframpartikel in Wasser
10 μl (1 μg) DNA in Tris-EDTA-Puffer (1 μg Gesamt-DNA)
100 μl 2,5 M CaCl2
10 μl
0,1 M Spermidin
-
Jedes
Reagenz wird sequenziell zu der Wolframpartikelsuspension gegeben,
während
diese in der Vortex-Vorrichtung für mehrere Röhrchen verbleibt. Das endgültige Gemisch
wird kurz ultraschallbehandelt und unter konstanter Vortex-Behandlung
10 Minuten lang inkubieren gelassen. Nach der Präzipitationszeitdauer werden
die Röhrchen
kurz zentrifugiert, die Flüssigkeit
wird entfernt, und es wird mit 500 ml 100% Ethanol gewaschen und
30 Sekunden lang zentrifugiert. Danach wird die Flüssigkeit
entfernt und 105 μl
100% Ethanol werden zu dem endgültigen
Wolframpartikel-Pellet zugegeben. Für die Partikelkanonenbombardierung
werden die Wolfram/DNA-Partikel kurz ultraschallbehandelt und 10 μl werden
auf das Zentrum jedes "Macrocarriers" aufgetüpfelt und
vor der Bombardierung näherungsweise
2 Minuten trocknen gelassen.
-
Partikelkanonenbehandlung
-
Die
Probenplatten werden bei Einstellung #4 in einer Partikelkanone
#HE34-1 oder #HE34-2 bombardiert. Alle Proben empfangen einen einzigen
Schuss bei 650 PSI, wobei eine Gesamtzahl von Aliquots aus jedem
Röhrchen
vorbereiteter bzw. hergestellter Partikel/DNA entnommen wurde.
-
Nachfolgende
Behandlung
-
Im
Anschluss an die Bombardierung werden die Embryonen 2 Tage lang
auf 560Y-Medium gehalten, dann werden sie auf 560R-Selektivmedium,
enthaltend 3 mg/Liter Bialaphos, transferiert und alle 2 Wochen subkultiviert.
Nach näherungsweise
10 Wochen der Selektion werden selektionsresistente Callusklone
auf 288J-Medium transferiert, um die Pflanzenregeneration zu initiieren.
Anschließend
an die Reifung somatischer Embryonen (2-4 Wochen) werden gut entwickelte
somatische Embryonen auf Keimungsmedium transferiert und in den
beleuchteten Kulturraum gebracht. Ungefähr 7-10 Tage später werden
sich entwickelnde Pflänzchen
für 7-10
Tage auf hormonfreies 272V-Medium in Röhrchen transferiert, bis die
Pflänzchen
gut entwickelt bzw. etabliert sind. Die Pflanzen werden dann auf
Einsätze
in Flachpaletten ("flats") (entsprechend einem 2,5-Zoll-Topf),
die Topferde enthalten, transferiert und 1 Woche lang in einer Wachstumskammer
gezogen bzw. wachsen gelassen, nachfolgend weitere 1-2 Wochen im
Gewächshaus
gezogen und dann in klassische Töpfe vom
Typ 600 (1,6 Gallonen) transferiert und bis zur Reife gezogen. Die
Pflanzen werden hinsichtlich der Expression der heterologen Nucleotidsequenz überwacht
und bewertet.
-
Bombardierungs- und Kulturmedien
-
Bombardierungsmedium
(560Y) umfasst 4,0 g/l N6-Basalsalze (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l Eriksson's Vitaminmischung
(1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l Thiamin-HCl, 120,0 g/l Saccharose,
1,0 mg/l 2,4-D und 2,88 g/l L-Prolin (Volumen mit D-I H2O
eingestellt, anschließend
an Einstellung auf pH 5,8 mit KOH); 2,0 g/l Gelrite (nach Einstellung
des Volumens mit D-I H2O) zugegeben); und
8,5 mg/l Silbernitrat (nach Sterilisieren des Medium und Abkühlen auf
Raumtemperatur zugegeben). Selektivmedium (560R) enthält 4,0 g/l
N6-Basalsalze (SIGMA
C-1416), 1,0 ml/l Erikssons's
Vitamin-Mischung (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l Thiamin-HCl, 30,0
g/l Saccharose und 2,0 mg/l 2,4-D (Volumen mit D-I H2O
eingestellt, anschließend
an Einstellung auf pH 5,8 mit KOH); 3,0 g/l Gelrite (zugegeben nach
Einstellen des Volumens mit D-I H2O); und
0,85 mg/l Silbernitrat und 3,0 mg/l Bialaphos (beide nach Sterilisieren
des Mediums und Abkühlen
auf Raumtemperatur zugegeben).
-
Pflanzenregenerationsmedium
(288J) enthält
4,3 g/l MS-Salze (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l MS-Vitaminstammlösung (0,100
g Nicotinsäure,
0,02 g/l Thiamin-HCl, 0,10 g/l Pyridoxin-HCl und 0,40 g/l Glycin,
Volumen mit gereinigtem D-I H2O eingestellt)
(Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l Myo-Inositol,
0,5 mg/l Zeatin, 60 g/l Saccharose und 1,0 ml/l 0,1 mM Abscisinsäure (Volumen
mit gereinigtem D-I H2O einge stellt nach
Einstellung auf pH 5,6); 3,0 g/l Gelrite (zugegeben nach Einstellen
des Volumens mit D-I H2O) und 1,0 mg/l Indolessigsäure und
3,0 mg/l Bialaphos (nach Sterilisieren des Mediums und Abkühlen auf
60°C zugegeben).
Hormonfreies Medium (272V) enthält
4,3 g/l MS-Salze (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l MS-Vitamin-Stammlösung (0,100
g/l Nicotinsäure,
0,02 g/l Thiamin-HCl, 0,10 g/l Pyridoxin-HCl und 0,40 g/l Glycin,
Volumen mit gereinigtem D-I H2O eingestellt),
0,1 g/l Myo-Inositol und 40,0 g/l Saccharose (Volumen mit gereinigtem
D-I H2O eingestellt nach Einstellen des
pH-Werts auf 5,6), und 6 g/l Bacto-Agar (zugegeben nach Einstellen
des Volumens mit gereinigtem D-I H2O), sterilisiert
und abgekühlt
auf 60°C.
-
Beispiel, 3: Agrobacterium-vermittelte
Transformation von Mais
-
Für Agrobacterium-vermittelte
Transformation von Mais mit einem erfindungsgemäßen Prunasinhydrolase-Promotor
wird bevorzugt das Verfahren von Zhao eingesetzt (US-Patent Nr.
5,981,840 und PCT-Patentveröffentlichung
WO 98/32326; deren Inhalte hierin durch Literaturverweis aufgenommen
sind). Kurz gesagt, werden unreife Embryonen aus Mais isoliert und
die Embryonen werden mit einer Agrobacterium-Suspension in Kontakt
gebracht, wobei die Bakterien zum Übertragen des Prunasinhydrolase-Promotors
in funktioneller Verknüpfung
mit einer heterologen Nucleotidsequenz von Interesse auf wenigstens
eine Zelle wenigstens eines der unreifen Embryonen (Stufe 1: die
Infektionsstufe) fähig,
sind. In dieser Stufe werden die unreifen Embryonen bevorzugt in
eine Agrobacterium-Suspension zum Starten der Inokulation eingetaucht.
Die Embryonen werden für
einige Zeit mit dem Agrobacterium co-kultiviert (Stufe 2: die Co-Kultivierungsstufe).
Die unreifen Embryonen werden anschließend an die Infektionsstufe
bevorzugt auf festem Medium kultiviert. Anschließend an diesen Co-Kultivierungszeitraum
wird eine optionale "Ruhe"-Stufe erwogen. In
dieser Ruhe-Stufe werden die Embryonen in Gegenwart von wenigstens
einem Antibiotikum, von dem bekannt ist, dass es das Wachstum von
Agrobacterium hemmt, ohne die Zugabe eines selektiven Wirkstoffs
für Pflanzentransformanten
inkubiert (Stufe 3: Ruhe-Stufe). Bevorzugt werden die unreifen Embryonen
auf festem Medium mit Antibiotikum, aber ohne einen selektierenden
Wirkstoff für
die Eliminierung von Agrobacterium und für eine Ruhephase für die infizierten
Zellen kultiviert. Als Nächstes
werden die inokulierten Embryonen auf einem Medium kultiviert, das
einen selektiven Wirkstoff enthält,
und wachsender transformierter Callus wird gewonnen (Stufe 4: die
Selektionsstufe). Bevorzugt werden die unreifen Embryonen auf festem
Medium mit einem selektiven Wirkstoff kultiviert, was das selektive
Wachs tum transformierter Zellen bewirkt. Der Callus wird dann zu
Pflanzen regeneriert (Stufe 5: die Regenerationsstufe), und bevorzugt
werden auf Selektivmedium gewachsene bzw. gezüchtete Calli auf festem Medium
kultiviert, um die Pflanzen zu regenerieren.
-
Transformation
eines Gus-Fusionskonstrukts in Mais
-
Ein
Konstrukt, enthaltend den Prunasinhydrolase-Promotor fusiert bzw.
verknüpft
mit GUS, wurde verwendet, um Mais gemäß dem Verfahren von Zhao supra,
zu transformieren. Pro Ereignis wurde eine Gesamtzahl von drei Pflanzen
erzeugt und in das Gewächshaus
verbracht.
-
GUS-Detektionsprotokoll
-
Verschiedene,
von transgenen Pflanzen gesammelte Gewebeproben wurden per Hand
geschnitten und GUS-Expressionsmuster wurden histochemisch durch
Färben
in einer Färbelösung bei
37°C über Nacht untersucht.
Die Lösung
enthielt 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,1% Triton X-100 und 0,5
mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid
(X-gluc). Das in den Zellen, die die Transgene exprimieren, produzierte
GUS-Enzym würde
X-gluc in situ zu einem blauen Präzipitat umwandeln, was die
Lokalisierung der Transgene ermöglicht
(Jefferson et al., 1987 EMBO J. 6:3901). Das Chlorophyll aus grünen Geweben
wurde mit 75% Ethanol gebleicht, um die Visualisierung bzw. das
Sichtbarmachen der blauen Färbung
aus der GUS-Expression zu erleichtern. Dann wurden die Gewebeschnitte
untersucht und unter einem Präpariermikroskop
fotografiert.
-
GUS-Expression
in Mais
-
Blattmittelrippenproben
aus 16 Ereignissen wurden auf GUS-Expression überwacht. 15 der 16 Ereignisse
enthielt eine detektierbare Färbung
unter Verwendung des histochemischen Assays. Pflanzen für 10 Ereignisse
wurden auf zufällige
Weise für
weitere Untersuchungen bzw. Überwachungen
ausgewählt,
wobei Proben von fünf
dieser Ereignisse an mehreren Zeitpunkten genommen wurden, um die
Expression in sich entwickelnden Körnern zu detektieren. Eine
Vielfalt an Geweben und Organen wurde überwacht und die GUS-Expression wurde
konsistent bzw. beständig
in den Gefäßbündeln bzw.
Leitbündeln
gefunden. Bei einigen Gewebeschnitten wurde auch eine Diffusion
in umgebende Zellen nahe der Gefäßbündel beobachtet.
Die an diesen Pflanzen gesammelten Expressionsdaten weisen darauf
hin, dass der Prunasin-Promotor in Mais vollständig aktiv war und dass seine
Spezifität
für Gefäßgewebe
erhalten blieb.
-
Die 3 und 4 beschreiben
weiterhin die mit der Mais-Transformation mit dem GUS/Prunasin-Promotor-Konstrukt
verbundene Gefäßgewebe-Expression
detaillierter.
-
Beispiel 4: Sojabohnenembryo-Transformation
-
Sojabohnenembryos
werden mit einem Plasmid, enthaltend den Prunasinhydrolase-Promotor in funktioneller
Verknüpfung
mit einer heterologen Nucleotidsequenz von Interesse (1),
wie folgt bombardiert. Um somatische Embryonen zu induzieren, werden
3-5 mm lange Keimblätter
aus oberflächensterilisierten
unreifen Samen des Sojabohnen-Kultivars A2872 dissektiert und unter
Licht oder im Dunklen bei 26°C
auf einem geeigneten Agarmedium sechs bis zehn Wochen lang kultiviert.
Somatische Embryonen, die sekundäre
Embryonen produzieren, werden dann exsidiert und in ein geeignetes
Flüssigmedium
gegeben. Nach wiederholter Selektion auf Cluster bzw. Klumpen somatischer
Embryonen, die sich als frühe
Embryonen der globulären Stufe
vervielfältigen,
werden die Suspensionen wie nachstehend beschrieben aufrecht erhalten.
-
Embryogene
Sojabohnen-Suspensionskulturen können
in 35 ml Flüssigmedium
auf einem Rotationsschüttler,
150 U/min, bei 26°C
mit Fluoreszenzlampen bzw. Leuchtstofflampen bei einem Tag/Nacht-Zeitplan von
16:8 Stunden aufrecht erhalten werden. Die Kulturen werden alle
zwei Wochen durch Inokulieren von näherungsweise 35 mg Gewebe in
35 ml Flüssigmedium
subkultiviert.
-
Embryogene
Sojabohnen-Suspensionskulturen können
dann durch das Verfahren der Partikelkanonenbombardierung (Klein
et al. (1987) Nature (London) 327:70-73, US-Patent Nr. 4,945,050)
transformiert werden. Für
diese Transformationen kann ein Instrument mit der Bezeichnung Du
Pont Biolistic PDS1000/HE (Helium-Umrüstung) verwendet werden.
-
Ein
selektierbares Marker-Gen, das verwendet werden kann, um die Sojabohnen-Transformation zu erleichtern,
ist ein Transgen, bestehend aus dem 35S-Promotor aus dem Blumenkohlmosaik-Virus
(Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), dem Hygromycin-Phosphortransferase-Gen
aus dem Plasmid pJR225 (aus E. coli; Gritz et al. (1983) Gene 25:179-188)
und der 3'-Region
des Nopalinsynthase-Gens aus der T-DNA des Ti-Plasmids von Agrobacterium
tumefaciens. Die Expressionskassette, umfassend den Prunasinhydrolase-Promotor in funktioneller
Verknüpfung
mit der heterologen Nucleotidsequenz, kann als ein Restriktionsfragment
isoliert werden. Dieses Fragment kann dann in eine singuläre Restriktionsstelle
des Vektors, der das Markergen trägt, inseriert werden.
-
Zu
50 μl einer
60 mg/ml-Lösung
von 1 μm
Goldpartikeln wird zugegeben (in dieser Reihenfolge): 5 μl DNA (1 μg/μl), 20 μl Spermidin
(0,1 M) und 50 μl
CaCl2 (2,5 M). Die Partikelzubereitung wird
dann 3 Minuten lang geschüttelt,
in einer Mikrozentrifuge 10 Sekunden lang zentrifugiert, und der Überstand
wird entfernt. Die DNA-beschichteten Partikel werden dann einmal
in 400 μl
70% Ethanol gewaschen und in 40 μl
wasserfreiem Ethanol resuspendiert. Die DNA/Partikel-Suspension
kann dreimal für
jeweils 1 Sekunde ultraschallbehandelt werden. Fünf Mikroliter der DNA-beschichteten
Goldpartikel werden dann auf jede "Macrocarrier"-Scheibe geladen.
-
Näherungsweise
300-400 mg einer zwei Wochen alten Suspensionskultur werden in eine
leere Petrischale mit den Abmessungen 60 × 15 mm gegeben, und die Restflüssigkeit
wird mit einer Pipette aus dem Gewebe entfernt. Für jedes
Transformationsexperiment werden normalerweise näherungsweise 5-10 Platten an
Gewebe bombardiert. Der Membran-Berstdruck
wird auf 1100 psi eingestellt, und die Kammer wird auf ein Vakuum
von 28-Zoll Quecksilbersäule
evakuiert. Das Gewebe wird näherungsweise
2,5 Zoll von dem Rückhalteschirm
entfernt platziert und dreimal bombardiert. Anschließend an
die Bombardierung kann das Gewebe hälftig aufgeteilt und zurück in die
Flüssigkeit
gegeben werden und wie oben stehend beschrieben kultiviert werden.
-
Fünf bis sieben
Tage nach der Bombardierung kann das Flüssigmedium durch frisches Medium
ersetzt werden und elf bis zwölf
Tage nach der Bombardierung mit frischem Medium, das 50 mg/ml Hygromycin
enthält.
Dieses Selektivmedium kann wöchentlich
aufgefrischt werden. Sieben bis acht Wochen nach der Bombardierung
kann grünes,
transformiertes Gewebe beobachtet werden, das aus untransformierten
nekrotischen embryogenen Haufen herauswächst. Isoliertes grünes Gewebe
wird entfernt und in einzelne Kolben inokuliert, um neue, klonal
vermehrte, transformierte embryogene Suspensionskulturen zu erzeugen.
Jede neue Linie kann als ein unabhängiges Transformationsereignis
behandelt werden. Diese Suspensionen können dann als Haufen unreifer
Embryonen subkultiviert und erhalten werden oder sie können durch
Reifung und Keimung individueller somatischer Embryonen zu vollständigen Pflanzen
regeneriert werden.
-
Beispiel 5: Transformation
von Sonnenblumenmeristemgewebe
-
Sonnenblumenmeristemgewebe
werden transformiert mit einer Expressionskassette, enthaltend den Prunasinhydrolase-Promotor
in funktioneller Verknüpfung
mit einer heterologen Nucleotidsequenz, wie folgt (siehe auch das
Europäische
Patent Nr.
EP 0 486 233 ,
hierin durch Literaturverweis aufgenommen, und Malone-Schoneberg
et al. (1994) Plant Science 103:199-207). Reife Sonnenblumensamen
(Helianthus annuus L.) werden unter Verwendung einer Dreschvorrichtung
für einzelne
Weizenähren
("single wheat-head
thresher") entspelzt
bzw. geschält.
Die Samen werden 30 Minuten lang in einer 20%igen Cloroxs-Blechlösung oberflächensterilisiert,
wobei pro 50 ml Lösung
zwei Tropfen Tween 20 zugegeben sind. Die Samen werden mit sterilem
destilliertem Wasser gewaschen.
-
Embryonalachsenspalt-Explantate
("split embryonic
axis explants")
werden mittels einer Modifikation der von Schrammeijer et al. (Schrammeijer
et al. (1990) Plant Cell Rep. 9:55-60) beschriebenen Verfahrensweisen
hergestellt. Die Samen werden anschließend an die Oberflächensterilisationsprozedur
60 Minuten lang in destilliertes Wasser eingetaucht. Dann werden
die Keimblätter
jedes Samens abgebrochen, wobei auf der Ebene der Embryonalachse
ein sauberer Bruch erzeugt wird. Anschließend an die Exzision der Wurzelspitze werden
die Explantate in Längsrichtung
zwischen den Primordialblättern
halbiert. Die zwei Hälften
werden mit der Schnittfläche
nach oben auf GBA-Medium platziert, das aus mineralischen Bestandteilen
nach Murashige und Skoog (Murashige et al. (1962) Physiol. Plant.
15:473-497), Shepard's-Vitaminzusätzen (Shepard
(1980) in Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops
(University of Minnesota Press, St. Paul, Minnesota), 40 mg/l Adeninsulfat,
30 g/l Saccharose, 0,5 mg/l 6-Benzylaminopurin (BAP), 0,25 mg/l
Indol-3-essigsäure
(IAA), 0,1 mg/l Gibberellinsäure
(GA3), pH 5,6, und 8 g/l Phytagar besteht.
-
Die
Explantate werden vor der Agrobacterium-Behandlung einer Mikroprojektil-Bombardierung unterworfen
(Bidney et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:301-313). Für diese
Behandlung werden dreißig
bis vierzig Explantate in einen Kreis im Zentrum einer Platte mit
den Abmessungen 60 × 20
mm angeordnet. Näherungsweise
4,7 mg 1,8 mm-Wolframmikroprojektile werden in 25 ml sterilem TE-Puffer
(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert, und es werden
Aliquots von 1,5 ml pro Bombardierung verwendet. Jede Platte wird zweimal
durch einen 150 mm Nytex-Schirm bombardiert, der 2 cm oberhalb der
Proben in einer Partikelbeschleunigungsvorrichtung mit der Bezeichnung
PDS 1000® angeordnet
ist.
-
In
allen Transformationsexperimenten wird der entschärfte Agrobacterium
tumefaciens-Stamm EHA105 verwendet. Ein binärer Plasmidvektor, umfassend
die Expressionskassette, die den Prunasinhydrolase-Promotor in funktioneller
Verknüpfung
mit der heterologen Nucleotidsequenz enthält, wird in den Agrobacterium-Stamm
EHA105 über
Gefrieren-Auftauen,
wie von Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187 beschrieben,
einge führt.
Dieses Plasmid umfasst ferner ein Kanamycin-selektierbares Markergen
(d.h. nptII). Bakterien für
Pflanzentransformationsfermente werden über Nacht (28°C und 100
U/min kontinuierliches Schütteln)
in flüssigem
YEP-Medium (10 gm/l Hefeextrakt, 10 gm/l Bactopepton und 5 gm/l
NaCl, pH 7,0) mit den entsprechenden Antibiotika gezüchtet bzw.
kultiviert, die für
die Erhaltung des Bakterienstammes und des binären Plasmids erforderlich sind.
Die Suspension wird verwendet, wenn sie eine OD600 von
näherungsweise
0,4 bis 0,8 erreicht. Die Agrobacterium-Zellen werden pelletiert
und in einem Okulationsmedium, bestehend aus 12,5 mM MES, pH 5,7,
1 gm/l NH4Cl und 0,3 gm/l MgSO4,
zu einer endgültigen
OD600 von 0,5 resuspendiert.
-
Frisch
bombardierte Explantate werden in eine Agrobacterium-Suspension
gegeben, gemischt und 30 Minuten lang ungestört stehen gelassen. Die Explantate
werden dann auf GBA-Medium transferiert und mit der Schnittfläche nach
unten bei 26°C
und 18-Stunden-Tagen
kultiviert. Nach drei Tagen der Co-Kultivierung werden die Transplantate
auf 374B (GBA-Medium, dem Wachstumsregulatorenfehlen, und mit einem
verringerten Saccharosegehalt von 1%), supplementiert mit 250 mg/l
Cefotaxim und 50 mg/l Kanamycinsulfat, transferiert. Die Explantate
werden zwei bis fünf
Wochen lang auf Selektions- bzw. Selektivmedium kultiviert und dann
auf frisches 374B-Medium ohne Kanamycin für ein oder zwei Wochen fortgesetzter
Entwicklung transferiert. Explantate mit sich differenzierenden,
Antibiotika-resistenten Wachstumsbereichen, die keine zur Exzision
geeigneten Schösslinge
bzw. Triebe gebildet haben, werden für eine zweite dreitägige Phytohormon-Behandlung
auf GBA-Medium,
das 250 mg/l Cefotaxim enthält,
transferiert. Blattproben aus grünen
Kanamycin-resistenten
Trieben werden mittels ELISA auf das Vorhandensein von NPTII und
durch Untersuchen bzw. Testen auf durch den Prunasinhydrolase-Promotor
gesteuerte Expression der heterologen Nucleotidsequenz auf das Vorhandensein
von Transgenexpression untersucht.
-
NPTII-positive
Triebe werden in vitro gezüchtete
Sonnenblumen-Sämlingsunterlagen
vom Typ Pioneer®-Hybrid
6440 gepfropft. Oberflächen-sterilisierte
Samen werden in 48-0-Medium
(halbkonzentrierte Salze nach Murashige und Skoog, 0,5% Saccharose,
0,3% Gelrite, pH 5,6) gekeimt bzw. zum Keimen gebracht und unter
den für
Explantatkultur beschriebenen Bedingungen wachsen gelassen. Der
obere Teil des Sämlings wird
entfernt, ein vertikaler Einschnitt von 1 cm wird im Hypocotyl hergestellt
und der transformierte Trieb wird in den Schnitt eingefügt. Der
gesamte Bereich wird mit Parafilm eingewickelt, um den Trieb zu
sichern. Nach einer Woche der in vitro-Kultur können gepfropfte Pflanzen auf
Erde transferiert werden. Die Pfropfungen in Erde werden unter Bedingungen
hoher Feuchtigkeit gehalten, gefolgt von einer langsamen Gewöhnung an
die Gewächshausumgebung.
Transformierte Sektoren bzw. Bereiche von T0-Pflanzen
(Elterngeneration), die im Gewächshaus
reifen, werden durch NPTII-ELISA und/oder Untersuchung der Transkriptionsaktivität von Blattextrakten
identifiziert, während
transgene Samen, die von NPTII-positiven T0-Pflanzen
geerntet werden, durch Untersuchung der Transkriptionsaktivität von kleinen
Teilen des Keimblatts trockener Samen identifiziert werden.
-
Ein
alternatives Sonnenblumen-Transformationsprotokoll ermöglicht das
Erhalten transgener Nachkommenschaft ohne die Verwendung eines chemischen
Selektionsdrucks. Samen werden entspelzt und 20 Minuten lang in
einer 20%igen Clorox-Blechlösung,
der pro 100 ml Lösung
zwei bis drei Tropfen Tween 20 zugegeben sind, oberflächensterilisiert,
dann dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Sterilisierte Samen werden
im Dunklen bei 26°C
20 Stunden lang auf mit Wasser befeuchtetem Filterpapier quellen
gelassen. Die Keimblätter
und die Wurzelanlage ("root
radical") werden
entfernt und die Meristem-Explantate werden auf 374E (GBA-Medium,
bestehend aus MS-Salzen, Shepard-Vitaminen, 40 mg/l Adeninsulfat,
3% Saccharose, 0,5 mg/l 6-BAP, 0,25 mg/l IAA, 0,1 mg/l GA und 0,8%
Phytagar bei pH 5,6) 24 Stunden lang im Dunklen kultiviert. Die
Primärblätter werden
entfernt, um das apicale Meristem freizulegen, rund 40 Explantate
werden mit aufwärts
weisendem Wachstumskegel in einem 2 cm-Kreis im Zentrum von 374
M (GBA-Medium mit 1,2% Phytagar) angeordnet und auf dem Medium 24
Stunden lang im Dunklen kultiviert.
-
Näherungsweise
18,8 mg 1,8 μm-Wolframpartikel
werden in 150 μl
absolutem Ethanol resuspendiert. Nach Ultraschallbehandlung werden
8 μl davon
auf das Zentrum der Oberfläche
eines Makrocarriers aufgetropft. Jede Platte wird zweimal mit 650
psi-Berstscheiben im ersten Einschub bei 26 mm Hg Heliumkanonenvakuum
bombardiert.
-
Das
Plasmid von Interesse wird wie vorstehend beschrieben über Gefrieren/Auftauen
in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA105 eingeführt. Das
Pellet über
Nacht bei 28°C
in einem flüssigen
YEP-Medium (10 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Bactopepton und 5 g/l NaCl,
pH 7,0) in Gegenwart von 50 μg/l
Kanamycin gewachsener Bakterien wird in einem Inokulationsmedium
(12,5 mM 2-mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, MES, 1 g/l NH4Cl
und 0,3 g/l MgSO4 bei pH 5,7) resuspendiert,
um eine Endkonzentration von 4,0 bei OD600 zu
erreichen. Partikel-bombardierte Explantate werden auf GBA-Medium
(374E) transferiert und ein Tröpfchen Bakteriensuspendion
wird direkt auf die Spitze des Meristems gegeben. Die Explantate
werden auf dem Medium 4 Tage lang co-kultiviert, wonach die Explantate
auf 374C-Medium (GBA mit 1% Saccharose und ohne BAP, IAA, GA3 und
mit 250 μg/ml
Cefotaxim supplementiert) transferiert werden. Die Pflänzchen werden
für näherungsweise
zwei Wochen unter den Inkubationsbedingungen eines 16-Stunden-Tages
und 26°C
kultiviert.
-
Explantate
(näherungsweise
2 cm lang) aus 2-wöchigen
Kulturen in 374C-Medium werden unter Verwendung auf dem Fachgebiet
bekannten Assays, wie z.B. Northern Blot, auf Expression durchmustert
bzw. gescreent. Nachdem positive (d.h. für durch den Prunasinhydrolase-Promotor
gesteuerte Expression) Explantate identifiziert sind, werden jene
Triebe, die keine durch den Prunasinhydrolase-Promotor gesteuerte
Expression aufweisen, verworfen und jedes positive Explantat wird
in nodale Explantate unterteilt. Ein nodales Explantat enthält wenigstens
ein potentielles Nodium. Die nodalen Abschnitte werden dann 3 bis
4 Tage lang auf GBA-Medium kultiviert, um die Bildung von Nebenknospen
("auxiliary buds") aus jedem Nodium
zu fördern. Sie
werden dann auf 374C-Medium transferiert und für weitere 4 Wochen entwickeln
gelassen. Sich entwickelnde Knospen werden separiert und weitere
4 Wochen auf 374C-Medien kultiviert. Vereinigte bzw. gepoolte Blattproben
von jedem neu erhaltenen Trieb werden wieder mittels des geeigneten
Proteinaktivitätsassays durchmustert.
Zu diesem Zeitpunkt werden die aus einem einzelnen Nodium gewonnenen
positiven Triebe im Allgemeinen in dem transgenen Sektor angereichert
worden sein, der im anfänglichen
Assay vor der Nodienkultur detektiert worden ist.
-
Gewonnene
Triebe, die positiv sind hinsichtlich von Prunasinhydrolase-Promotorregulierter
Expression, werden auf in vitro-gezüchtete Sonnenblumensämlingsunterlagen
vom Typ Pioneer Hybrid 6440 gepfropft. Die Unterlagen werden auf
die folgende Weise hergestellt. Samen werden entspelzt und 20 Minuten
lang in einer 20%igen Clorox-Bleichlösung, der pro 100 ml Lösung zwei
bis drei Tropfen Tween 20 zugegeben sind, oberflächensterilisiert und werden
dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die sterilisierten Samen
werden auf dem mit Wasser befeuchteten Filter drei Tage lang keimen
gelassen, dann werden sie auf Medium 48 (halb-konzentriertes MS-Salz,
0,5% Saccharose, 0,3% Gelrit, pH 5,0) transferiert und bei 26°C im Dunklen
drei Tage lang wachsen gelassen, dann unter Kulturbedingungen eines
16-Stunden-Tages inkubiert. Der obere Teil ausgewählter Sämlinge wird
entfernt, ein vertikaler Einschnitt wird in jedem Hypocotyl hergestellt
und ein transformierter Trieb wird in einen V-Schnitt eingefügt. Der
Schnittbereich wird mit Parafilm umhüllt. Nach einer Woche der Kultur
auf dem Medium werden die gepfropften Pflanzen auf Erde transferiert.
In den ersten zwei Wochen werden sie unter Bedingungen hoher Feuchtigkeit
gehalten, um sie an eine Gewächshausumgebung
zu gewöhnen.
-
Beispiel 6: Transformation
eines GUS-Fusionskonstrukts in Arabidopsis
-
Ein
Konstrukt, enthaltend den mit GUS fusionierten bzw. verknüpften Prunasinhydrolase-Promotor, wurde
verwendet, um Arabidopsis nach dem Verfahren von Bechtold und Pelletier
zu transformieren. (N. Bechtold und G. Pelletier; In Planta Agrobacterium-mediated transformation
of adult Arabidopsis thaliana plants by vakuum infiltration, in
Arabidopsis Protocols. Methods in Molekcular Biology, Band 82, S.
259-266 (J. M. Martinez-Zapater
und J. Salinas, Hrsg., Humana Press, Totowa, New Jersey).
-
Arabidopsis-Transformation
-
4-6
Wochen alte Arabidopsis-Pflanzen wurden vorsichtig aus der Erde
entfernt, um die Wurzelsysteme unbeschädigt zu lassen. Die Wurzeln
wurden mit Wasser gewaschen, um jegliche an ihnen anhaftende Erdpartikel
zu entfernen. 25-50 Pflanzen wurden in eine Aluminiumwanne gegeben.
Eine zweite durchlöcherte
bzw. perforierte Wanne der gleichen Größe wurde auf der ersten Wanne
angeordnet, um eine Bewegung der Pflanzen zu verhindern. Dann wurde
eine Agrobacterium-Suspension in die Wannen gegossen. Die Wannen
wurden in eine 101-Vakuumkammer eingestellt. Ein Vakuumdruck von
104 Pa (0,1 atm) wurde 20 Minuten lang angelegt.
Während
der Vakuumbehandlung wurde eine mit Kompost, "treat" und Wasser gefüllte Kunststoffwanne vorbereitet.
Das Vakuum wurde vorsichtig abgebaut, und die Wannen wurden aus
der Kammer entnommen. Die infiltrierten Pflanzen wurden unverzüglich wieder
eingesetzt und mit einer perforierten Kunststoffumhüllung oder
einem Samenwanneninkubator ("seed
tray incubator")
mit Wasser darunter abgedeckt. Die Abdeckung wurde von den Pflanzen
nach 3-4 Tagen entfernt. Die Pflanzen wurden unter moderaten Wässern weiter
wachsen gelassen, bis die gewünschte
Reife erreicht war.
-
GUS-Detektionsprotokoll
-
Verschiedene
von transgenen Pflanzen gesammelte Gewebeproben wurden per Hand
geschnitten und GUS-Expressionsmuster wurden histochemisch untersucht,
indem über
Nacht eine Färbelösung bei
37°C gefärbt wurde.
Die Lösung
enthielt 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,1% Triton X-100 und 0,5
mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-glucuronid
(X-gluc). Das in Zellen, die die Transgene exprimieren, produzierte GUS-Enzym
würde X-gluc
in situ zu einem blauen Präzipitat
umwandeln, was die Lokalisierung der Transgene ermöglicht (Jefferson
et al., 1987, EMBO J. 6:3901). Chlorophyl aus grünen Geweben wurde mit 75% Ethanol gebleicht,
um die Visualisierung der blauen Färbung aus der GUS-Expression
zu erleichtern. Gewebeschnitte wurden dann untersucht und unter
einem Präpariermikroskop
fotografiert.
-
5 beschreibt
detaillierter die Gefäßgewebeexpression,
die mit Arabidopsis-Transformation
unter Verwendung des GUS/Prunasin-Promotor-Konstrukts verbunden
ist. SEQUENZLISTE