DE60216116T2 - Für Gefässgewebe spezifische Promotoren - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Pflanzenmolekularbiologie, insbesondere die Regulation der Genexpression in Pflanzen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Expression heterologer DNA-Sequenzen in einem Pflanzenwirt ist abhängig von dem Vorhandensein eines wirksam bzw. funktionell verknüpften Promotors, der in dem Pflanzenwirt funktionsfähig ist. Die Wahl der Promotorsequenz wird darüber bestimmen, wann und wo die heterologe DNA-Sequenz in dem Organismus exprimiert wird. Wenn eine Expression in einem bevorzugten Gewebe einer Pflanze gewünscht wird, werden deshalb Gewebe-bevorzugte bzw. von diesem Gewebe bevorzugte Promotoren ("tissue-preferred promoters") verwendet. Wenn im Gegensatz dazu eine Genexpression in allen Zellen einer Pflanze gewünscht wird, sind konstitutive Promotoren das regulatorische Element der Wahl. Zusätzliche Regulatorsequenzen stromaufwärts und/oder stromabwärts der Kern-Promotorsequenz können in Expressionskonstrukten von Transformationsvektoren eingeschlossen sein bzw. in diese aufgenommen werden, um variierende Level Gewebe-bevorzugter oder konstitutiver Expression von heterologen Nucleotidsequenzen in einer transgenen Pflanze zu bewirken.
  • Es ist häufig wünschenswert, eine begünstigte bzw. bevorzugte Expression einer DNA-Sequenz in einem Gewebe eines Organismus zu haben. Beispielsweise könnte eine erhöhte Resistenz einer Pflanze gegenüber Insektenbefall erreicht werden durch genetische Manipulation des Pflanzengenoms, so dass es einen Gewebe-spezifischen Promotor in funktioneller Verknüpfung mit einem heterologen Insektizidgen umfasst, so dass die Insektenabschreckenden Substanzen spezifisch in den anfälligen Pflanzengeweben exprimiert werden. Eine bevorzugte Expression der heterologen Nucleotidsequenz in dem entsprechenden Gewebe verringert die Verluste bzw. den Abfluss der Ressourcen der Pflanze, die auftreten, wenn ein konstitutiver Promotor eine Transkription einer heterologen Nucleotidsequenz in allen Zellen der Pflanze initiiert.
  • Alternativ könnte es wünschenswert sein, die Expression einer nativen DNA-Sequenz in Geweben einer Pflanze zu inhibieren, um einen gewünschten Phänotyp zu erzielen. In die sem Fall könnte eine derartige Inhibierung durch Transformation der Pflanze erreicht werden, so dass sie einen Gewebe-spezifischen Promotor in funktioneller Verknüpfung mit einer Antisense-Nucleotidsequenz umfasst, so dass die Gewebe-spezifische Expression der Antisense-Sequenz ein RNA-Transkript erzeugt, das die Translation der mRNA der nativen DNA-Sequenz in einer Teilmenge der Zellen der Pflanze stört.
  • Das Phloem-Gewebe transportiert Nährstoffe, Hormone und andere Substanzen durch die verschiedenen Pflanzenorgane. Die Parenchym-Zellen des Phloems partizipieren am Laden bzw. Beladen und Entladen von Saccharose- und anderem Nährstoffgehalt in das Phloem-Transportsystem. Der hohe Nährstoffgehalt von in Phloem-Gewebe befindlichem Saft bzw. Pflanzensaft bewirkt, dass das Phloem das Ziel einer Vielfalt an Insektenarten, einschließlich Blattläusen (Familie Aphididae), Maiszünslern (Familie Pyralidae) und Zikaden (Cicadellidae) ist. Die aus einem Befall durch diese Insekten resultierenden Schäden an Pflanzen treten aufgrund mehrfacher Mechanismen, einschließlich Verlust von Nährstoffen und Wasser an die Insekten, Einführung von Viruspartikeln in das Phloem-Gewebe infolge von Befällen und Schaffung von Gewebe, das für Pilzbefall anfällig ist, auf. Es besteht ein Bedarf an von Gefäßgewebe bevorzugten Promotoren in funktioneller Verknüpfung mit heterologen Nucleotidsequenzen, die dabei helfen können, eine Pflanze gegen Pathogene, wie z.B. Insekten, Viren, Pilze, Nematoden und dergleichen, zu schützen.
  • Es besteht ein zusätzlicher Bedarf an einer für Gefäßgewebe spezifischen bzw. Gefäßgewebe-spezifischen Promotorsequenz, die funktionell verknüpft wäre mit einer heterologen Nucleotidsequenz, die die Beladungscharakteristika von Gefäßgewebe modifiziert und dadurch die Pflanzenentwicklung und -reifung, Kohlenstoffallokation und Ernteertrag bzw. Nutzpflanzenertrag beeinflusst. Durch Ändern der Gehalte an Substanzen, die an der Phloem-Beladung beteiligt sind, können die Beladungscharakteristika von Gefäßgewebe, die Pflanzenentwicklung und das Pflanzenwachstum beeinflusst werden. Es besteht ein Bedarf an Promotorsequenzen, die eingesetzt werden können, um die Expression von Substanzen zu modulieren, die die Gefäßgewebebeladung regulieren.
  • Es kann auch eine Verwendung für einen Gefäßgewebe-spezifischen Promotor bei der Verbesserung der Stängelfestigkeit geben, beispielsweise über eine Zellwandverdickung, wie z.B. durch Ablagerung von mehr Cellulose. Es ist wünschenswert, einen Gefäßgewebe-spezifischen Promotor zum Exprimieren von Genen zu verwenden, die an der Cellulose-Biosynthese beteiligt sind, um die Zellwandfestigkeit zu erhöhen. Wenn die Zellwand festigkeit im Maisstängel erhöht wird, wird eine bessere Stanzfestigkeit erwartet. Dies ist besonders wichtig für das Verbessern der Resistenz gegenüber dem Niederlegen der Stängel ("stalk lodging") bei Mais. Ein Beispiel einer derartigen Anwendung ist es, einen Gefäßgewebe-spezifischen Promotor zu verwenden, um ein Cellulosesynthasegen, das an der Sekundärzellwandbildung beteiligt ist, wie z.B. das irx3-Gen aus Arabidopsis thaliana (Taylor N.G., Scheible W.R., Cutler S., Somerville C.R., Turner S.R., 1999, The irregular xylem 3 locus of Arabidopsis encodes a cellulose synthase required for secondary cell wall synthesis, Plant Cell 11:769-80) zu steuern bzw. anzutreiben. In diesem Fall würden Zellen, die normalerweise keine Sekundärwand besitzen, möglicherweise ein zusätzliches Zellwandwachstum erlangen, was zu einer festeren Zellstruktur führt.
  • Deshalb wird die Isolation und Charakterisierung von Phloem-spezifischen Promotoren, die als regulatorische Regionen für die Gewebe-spezifische Expression von heterologen Nucleotidsequenzen von Interesse dienen können, benötigt für die genetische Manipulation von Pflanzen, die spezielle phänotypische Merkmale aufweisen sollen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es werden Zusammensetzungen und Verfahren zum Regulieren der Expression heterologer Nucleotidsequenzen in einer Pflanze bereitgestellt. Die Zusammensetzungen umfassen neue Promotorsequenzen, die die Transkription auf eine für Gefäßgewebe spezifische Weise bzw. Gefäßgewebe-spezifische Weise, insbesondere für Phloem-Gewebe spezifische Weise, initiieren. Insbesondere wird eine Transkriptionsinitiationsregion, isoliert aus einem Prunus serotina-Gen, das für Prunasinhydrolase codiert, bereitgestellt. Weitere erfindungsgemäße Zusammensetzungen umfassen die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 angegebene Nucleotidsequenz. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen weiterhin Nucleotidsequenzen, die wenigstens 50 zusammenhängende Nucleotide der Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 angegeben ist, umfassen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen weiterhin Nucleotidsequenzen mit wenigstens 70% Identität zu der Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 angegeben ist, über die gesamte Länge der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen weiterhin Nucleotidsequenzen, die Komplemente einer beliebigen der oben stehend genannten Sequenzen sind. Die in SEQ ID NO: 2 angegebene Sequenz stellt eine für Klonierungszwecke gemachte Modifikation der Nucleotidsequenz dar. Die Sequenz für das Prunasinhydrolaseoperon, einschließlich der Prunasinhydrolase-Promotorregion ist in SEQ ID NO: 3 angegeben. Die Nucleotide 989-2626 der SEQ ID NO: 3 codieren für ein Prunasinhydrolase-Polypeptid. SEQ ID NO: 4 ist die Aminosäuresequenz des Prunasinhydrolase-Polypeptids. SEQ ID NOS: 5 und 6 sind verwandte Variationen der als SEQ ID NO: 1 offenbarten Polynucleotidsequenz.
  • Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen auch ein DNA-Konstrukt, umfassend eine erfindungsgemäße Promotorsequenz in funktioneller Verknüpfung mit einer Nucleotidsequenz von Interesse, wobei der Promotor fähig ist, die Expression der Nucleotidsequenz in einer Pflanzenzelle zu steuern. Es werden auch transformierte Pflanzenzellen, transformierte Pflanzen und transformierte Samen, die die neuen erfindungsgemäßen Promotorsequenzen umfassen, bereitgestellt.
  • Es werden Verfahren zur Expression einer Nucleotidsequenz von Interesse in einer Pflanze bereitgestellt. Die Verfahren umfassen stabilen Einbau einer Expressionskassette, umfassend eine erfindungsgemäße Promotorsequenz in funktioneller Verknüpfung mit einer Nucleotidsequenz von Interesse, in das Genom einer Pflanzenzelle, wobei der Promotor fähig ist, die Transkription der Nucleotidsequenz in einer Pflanzenzelle zu initiieren. Die Verfahren stellen ferner ein Mittel für das spezifische Exprimieren einer Nucleotidsequenz in Gefäßgewebe, insbesondere Phloemgewebe, bereit.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 zeigt die Nucleotidsequenz der Promotorregion von Prunus serotina-Prunasinhydrolase.
  • 2 ist ein Alignment bzw. eine Anordnung und ein Consensus der zwei genomischen Fragmente SEQ ID NO: 1 (PH DL 1.4 PRO) und SEQ ID NO: 5 (PH DL 1.1 PRO), wobei verwandte bzw. ähnliche Promotorsequenzmuster und -motive hervorgehoben sind: eine TATA-Box bei Position 793-796, ein CAAT-Signal bei 659-662, ein RGATAOS-Motiv (R-GATA, GATA-Motiv-Bindungsfaktor, erforderlich für eine Phloem-spezifische Genexpression von Reistungrovirus ("Rice Tungro Bacilliform Virus"))-Bindungsstelle bei 259-267.
  • 3 ist eine Tabelle, die GUS-Expression in verschiedenen Geweben in transgenen Maispflanzen darstellt.
  • 4 ist die GUS-Expression in T0-Maispflanzen, die PHP17688 tragen. A. 10541640-Mittelrippe, 60 Tage; B. 10541657-Internodium, 85 Tage, Längsschnitt (Pfeile deuten auf GUS-Expression entlang eines Gefäßbündels); C.10541665-Internodium, 85 Tage, Querschnitt; D. 10541628-Anthere, 60 Tage; E. 10541665-Korn, 4 DAP; F. 10541647-Korn, 8 DAP.
  • 5 zeigt die GUS-Expression in Arabidopsis-Pflanzen nach Agrobacterium-vermittelter Transformation in planta.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Erfindungsgemäße Zusammensetzungen sind Nucleinsäuremoleküle, umfassend eine neue Nucleotidsequenz für einen Pflanzenpromotor für das Prunus serotina-Gen, das für Prunasinhydrolase codiert. Diese Promotorsequenz verleiht eine Gefäßgewebe-spezifische Expression, insbesondere Phloem-spezifische Expression, einer spezifischen funktionell verknüpften Nucleotidsequenz. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung isolierte Nucleinsäuremoleküle, umfassend Nucleotidsequenzen, die für die in einem bakteriellen Wirt als Hinterlegungsnummer PTA-3235 hinterlegte DNA-Sequenz oder die in SEQ ID NO: 1 angegebene Nucleotidsequenz und Varianten und Fragmente davon codieren, bereit. Diese Promotorsequenz wurde aus dem 5'-nicht-translatierten Bereich, der die Transkriptionsinitiationsstelle eines für Prunasinhydrolase codierenden P. serotina-Gens flankiert, isoliert.
  • Ein die erfindungsgemäße P. serotina-Promotorsequenz enthaltendes Plasmid wurde bei der Patent Depository of the American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, am 27. März 2001 hinterlegt und mit der Hinterlegungsnummer PTA-3235 bezeichnet. Die letzten zwei Nucleotide der SEQ ID NO: 1, Nucleotide 987 und 988, wurden in der Sequenz des bei der ATCC hinterlegten Plasmids von C's zu T's geändert. Diese Hinterlegung wird gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren verwaltet. Diese Hinterlegung wurde lediglich als Dinglichkeit für Fachleute auf dem Gebiet gemacht und ist kein Eingeständnis, dass eine Hinterlegung nach 35 U.S.C. § 112 erforderlich ist.
  • Die Erfindung umfasst isolierte oder im Wesentlichen gereinigte Nucleinsäurezusammensetzungen. Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" Nucleinsäuremolekül oder biologisch aktiver Anteil davon ist im Wesentlichen oder grundsätzlich frei von Bestandteilen, die das Nucleinsäuremolekül, wie es in seiner natürlicherweise auftretenden Umgebung gefunden wird, normalerweise begleiten oder mit ihm wechselwirken. Daher ist ein isoliertes oder gereinigtes Nucleinsäuremolekül oder ein biologisch aktiver Anteil davon im Wesentlichen frei von weiterem Zellmaterial oder Kulturmedium, wenn es durch Rekombinationstechniken hergestellt wird, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemika lien, wenn es chemisch synthetisiert wird. Vorzugsweise ist eine "isolierte" Nucleinsäure frei von Sequenzen (vorzugsweise Protein-codierenden Sequenzen), die die Nucleinsäure natürlicherweise in der genomischen DNA des Organismus, von dem die Nucleinsäure stammt, flankieren (d.h. Sequenzen, die an den 5'- und 3'-Enden der Nucleinsäure lokalisiert sind). Beispielsweise kann das isolierte Nucleinsäuremolekül in verschiedenen Ausführungsformen weniger als näherungsweise 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nucleotidsequenzen enthalten, die das Nucleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, von der die Nucleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren.
  • Mit "Promotor" oder "Transkriptionsinitiationsregion" ist eine regulatorische DNA-Region gemeint, die normalerweise eine TATA-Box umfasst, die fähig ist, RNA-Polymerase II zu führen, so dass sie die RNA-Synthese an der entsprechenden Transkriptionsinitiationsstelle für eine bestimmte codierende Sequenz beginnt. Ein Promotor kann zusätzlich andere Erkennungssequenzen umfassen, die im Allgemeinen stromaufwärts oder 5' zu der TATA-Box positioniert sind, bezeichnet als stromaufwärts gelegene Promotorelemente bzw. Upstream-Promotorelemente, die die Rate der Transkriptionsinitiation beeinflussen. Es wird anerkannt, dass, wenn man die Nucleotidsequenzen für die hierin offenbarte Promotorregion identifiziert hat, es innerhalb des Standes der Technik liegt, weitere regulatorische Elemente in dem 5' nicht-translatierten Bereich stromaufwärts der hierin identifizierten speziellen Promotorregion zu isolieren und zu identifizieren. Deshalb umfasst die hierin offenbarte Promotorregion ferner stromaufwärts gelegene regulatorische Elemente, die Gewebe-spezifische Expression, insbesondere Gefäßgewebe-spezifische Expression, spezieller Phloemgewebe-spezifische Expression, und noch spezieller Phloemparenchym-spezifische Expression von beliebigen heterologen Nucleotidsequenzen, die mit der offenbarten Promotorsequenz funktionell verknüpft sind, verleihen.
  • Die Nucleotidsequenzen für die Promotoren der vorliegenden Erfindung können die natürlich auftretenden Sequenzen oder jede beliebige Sequenz sein, die eine wesentliche Homologie aufweist. Mit "wesentliche Homologie" ist eine Sequenz gemeint, die eine wesentliche funktionelle und strukturelle Gleichwertigkeit bzw. Äquivalenz zu der nativen oder natürlich auftretenden Sequenz aufweist. Beliebige funktionelle oder strukturelle Unterschiede zwischen im Wesentlichen homologen Sequenzen beeinträchtigen die Fähigkeit der Sequenz nicht, als ein Promotor, wie in der vorliegenden Erfindung offenbart, zu wirken. Demnach wird jede beliebige Sequenz, die eine wesentliche Sequenzhomologie zu der Sequenz eines bestimmten Promotors der vorliegenden Erfindung aufweist, die Expression einer funktionell verknüpften heterologen Nucleotidsequenz steuern. Zwei Promotor-Nucleotidsequenzen werden als im Wesentlichen homolog betrachtet, wenn sie wenigstens 50%, 60%, bis 70%, im Allgemeinen näherungsweise 80%, bevorzugt näherungsweise 85%, 90%, bis zu 98% Sequenzhomologie besitzen.
  • Die isolierten Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Gewebe-spezifische Expression einer Nucleotidsequenz von Interesse ermöglichen. Das Gefäßsystem von Pflanzen umfasst mehrere Gewebe, einschließlich Xylem und Phloem. Phloemgewebe umfassen zahlreiche Zelltypen, einschließlich Siebelementen oder Siebröhrenelementen, Siebzellen, Geleitzellen (bei Angiospermen), Eiweißzellen (bei Gymnospermen), Phloemparenchymzellen und Phloemfasern. Der hierin offenbarte von Gewebe bevorzugte bzw. Gewebe-spezifische Promotor ist fähig, Gewebe-spezifische Transkription von einer oder mehreren DNA-Sequenzen in dem Gefäßsystem von Pflanzen, besonders im Phloemgewebe, insbesondere in Phloemparenchymzellen, spezifisch zu aktivieren. Eine Nucleotidsequenz in funktioneller Verknüpfung mit dem hierin offenbarten Phloem-spezifischen Promotor bewirkt die Expression der funktionell verknüpften Sequenz in Leveln, die in Gefäßgewebe, besonders Phloemgewebe, höher sind als in anderen Geweben oder als sie in dem Gefäßgewebe der nicht-transformierten Pflanze festgestellt worden wären.
  • Die Erfindung umfasst auch Fragmente und Varianten der hierin offenbarten Promotornucleotidsequenz. Mit "Fragment" ist ein Anteil der Nucleotidsequenz gemeint. Fragmente einer Nucleotidsequenz können die biologische Aktivität beibehalten und folglich die Transkription einer heterologen Nucleotidsequenz initiieren. Alternativ behalten Fragmente einer Promotor-Nucleotidsequenz, die als Hybridisierungssonden verwendbar sind, im Allgemeinen die biologische Aktivität nicht bei. Folglich können Fragmente einer Nucleotidsequenz von wenigstens näherungsweise 20 Nucleotiden, näherungsweise 50 Nucleotiden, näherungsweise 100 Nucleotiden und bis zur Volllängen-Nucleotidsequenz der Erfindung reichen.
  • Demnach kann ein Fragment einer Promotor-Nucleotidsequenz für einen biologisch aktiven Anteil des Promotors codieren, oder es kann ein Fragment sein, das als eine Hybridisierungssonde oder ein PCR-Primer verwendet werden kann, wobei die hierin offenbarten Verfahren verwendet werden. Ein biologisch aktiver Anteil eines Promotors kann durch Isolieren eines Teils einer der erfindungsgemäßen Promotorsequenzen und Bewerten der Aktivi tät des Anteils des Promotors hergestellt werden. Nucleinsäure-Moleküle, die Fragmente einer Promotorsequenz sind, umfassen wenigstens 50, 75, 100, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900 oder 988 Nucleotide bei SEQ ID NO: 1.
  • Die Nucleotide derartiger Fragmente umfassen die TATA-Erkennungssequenz der speziellen Promotorsequenz oder regulatorischen Elemente, die Gewebespezifität verleihen. Derartige Fragmente können erhalten werden durch Verwendung von Restriktionsenzymen zum Spalten der natürlich vorkommenden Promotor-Nucleotidsequenz, die hierin offenbart ist; durch Synthetisieren einer Nucleotidsequenz, ausgehend von der natürlich vorkommenden Sequenz der Promotor-DNA-Sequenz, oder sie können erhalten werden durch die Verwendung der PCR-Technologie. Siehe insbesondere Mullis et al. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350, und Erlich, Hrsg. (1989), PCR Technology (Stockton Press, New York). Varianten dieser Promotorfragmente, wie z.B. jene, die aus ortsgerichteter Mutagenese hervorgehen, sind von den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfasst.
  • Mit "Varianten" sind im Wesentlichen ähnliche Sequenzen gemeint. Bei Nucleotidsequenzen natürlicherweise vorkommender Varianten können diese beispielsweise durch die Verwendung gut bekannter molekularbiologischer Techniken, wie z.B. durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und Hybridisierungstechniken, wie nachstehend dargelegt, identifiziert werden. Variante Nucleotidsequenzen umfassen auch synthetisch abgeleitete Nucleotidsequenzen, wie z.B. jene, die unter Verwendung ortsgerichteter Mutagenese erzeugt wurden. Im Allgemeinen werden Varianten einer speziellen erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz wenigstens näherungsweise 65%, 70%, im Allgemeinen wenigstens näherungsweise 75%, 80%, 85%, bevorzugt wenigstens näherungsweise 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% und am bevorzugtesten wenigstens näherungsweise 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu dieser speziellen Nucleotidsequenz aufweisen. Dies wird bestimmt durch Sequenzanordnungsprogramme bzw. Sequenz-Alignment-Programme, wie sie hierin an anderer Stelle beschrieben sind, wobei Standardeinstellungen für die Parameter bzw. Default-Parameter verwendet werden. Erfindungsgemäße variante Nucleotidsequenzen behalten die biologische Aktivität bei (d.h. regulieren die Transkription). Verfahren zum Austesten der Transkriptionsregulation sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die Test- bzw. Assay-Verfahren umfassen Northern Blots, RT-PCR und die Verwendung von Reportersequenzen, wie z.B. GUS.
  • Variante Nucleotidsequenzen umfassen auch Sequenzen, die aus einer mutagenen und rekombinogenen Verfahrensweise, wie z.B. DNA-Shuffling, stammen. Mit einer derartigen Verfahrensweise können eine oder mehrere unterschiedliche Sequenzen manipuliert werden, um einen neuen Promotor zu schaffen, der die erwünschten Eigenschaften besitzt. Auf diese Weise werden Bibliotheken rekombinanter Polynucleotide aus einer Population von sequenz-verwandten Polynucleotiden, umfassend Sequenzbereiche, die wesentliche Sequenzidentität besitzen und in vitro oder in vivo homogen rekombiniert werden können, erzeugt. Strategien für ein derartiges DNA-Shuffling sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe beispielsweise Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; und die US-Patente Nrn. 5,605,793 und 5,837,458.
  • Die erfindungsgemäße P. serotina-Promotorsequenz kann verwendet werden, um entsprechende Sequenzen aus anderen Organismen, besonders anderen Pflanzen, insbesondere anderen zweikeimblättrigen bzw. dikotylen Pflanzen, zu isolieren. Auf diese Weise können Verfahren, wie z.B. PCR, Hybridisierung und dergleichen verwendet werden, um derartige Sequenzen auf der Grundlage ihrer Sequenzhomologie mit den hierin angegebenen Sequenzen zu identifiziexen. Sequenzen, die auf der Grundlage ihrer Sequenzidentität mit der gesamten hierin angegebenen Promotorsequenz oder mit Fragmenten davon isoliert wurden, sind auch von der vorliegenden Erfindung umfasst. Eine Ausführungsform der Erfindung umfasst eine Nucleotidsequenz, die nativ assoziiert ist mit und fähig ist zum Steuern der Expression einer Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid codiert, wobei dieses Polypeptid wenigstens 74%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit der codierenden Sequenz von P. serotina-Prunasinhydrolase (Genbank Zugangsnummer U50201) besitzt.
  • In einem PCR-Ansatz können Oligonucleotid-Primer entworfen werden für die Verwendung in PCR-Reaktionen zum Amplifizieren entsprechender DNA-Sequenzen aus cDNA oder genomischer DNA, extrahiert aus einer beliebigen Pflanze von Interesse. Verfahren zum Entwerfen von PCR-Primern und für PCR-Klonierung sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt und sind offenbart in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Siehe auch Innis et al., Hrsg. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis und Gelfand, Hrsg. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); und Innis und Gelfand, Hrsg. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Bekannte PCR-Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Verfahren, die paarweise Primer, ineinander geschachtelte Primer bzw. "nested" Primer, einzelne spezifische Primer, degenerierte Primer, Gen-spezifische Primer, Vektor-spezifische Primer, partiell fehlgepaarte Primer und dergleichen verwenden.
  • Bei Hybridisierungstechniken wird die gesamte oder ein Teil einer bekannten Nucleotidsequenz als eine Sonde verwendet, die selektiv mit anderen entsprechenden Nucleotidsequenzen, die in einer Population von klonierten genomischen DNA-Fragmenten oder cDNA-Fragmenten (d.h. Genom- oder cDNA-Bibliotheken) aus einem gewählten Organismus vorhanden sind, hybridisieren. Die Hybridisierungssonden können genomische DNA-Fragmente, cDNA-Fragmente, RNA-Fragmente oder andere Nucleotide sein und können mit einer detektierbaren Gruppe, wie z.B. 32P, oder einer beliebigen anderen detektierbaren Markierung markiert sein. Folglich können beispielsweise Hybridisierungssonden durch Markieren synthetischer Oligonucleotide, die auf der erfindungsgemäßen Sequenz beruhen, hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Hybridisierungssonden und zur Konstruktion von cDNA- und Genombibliotheken sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt und sind offenbart in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
  • Beispielsweise kann die gesamte hierin offenbarte Promotorsequenz oder ein oder mehrere Teile davon als eine Sonde verwendet werden, die dazu fähig ist, mit entsprechenden Promotorsequenzen spezifisch zu hybridisieren. Um eine spezifische Hybridisierung unter einer Vielzahl an Bedingungen zu erreichen, umfassen derartige Sonden Sequenzen, die unter Promotorsequenzen einzigartig sind und die bevorzugt wenigstens näherungsweise 10 Nucleotide lang und am bevorzugtesten wenigstens näherungsweise 20 Nucleotide lang sind. Derartige Sonden können verwendet werden, um entsprechende Promotorsequenzen aus einer ausgewählten Pflanze durch PCR zu amplifizieren. Diese Technik kann verwendet werden, um zusätzliche Promotorsequenzen aus einer gewünschten Pflanze zu isolieren, oder als ein diagnostischer Assay zum Bestimmen des Vorhandenseins von Promotorsequenzen in einer Pflanze. Hybridisierungstechniken umfassen Hybridisierungsscreening von ausplattierten DNA-Bibliotheken (entweder Plaques oder Kolonien; siehe z.B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
  • Die Hybridisierung derartiger Sequenzen kann unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden. Mit "stringenten Bedingungen" oder "stringenten Hybridisierungsbedingung" sind Bedingungen gemeint, unter denen eine Sonde mit ihrer Zielsequenz in einem feststellbar größeren Ausmaß als mit anderen Sequenzen (z.B. wenigstens zweifach über dem Hintergrund) hybridisieren wird. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und werden unter unterschiedlichen Umständen verschieden sein. Durch Kontrollieren der Stringenz der Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen können Zielsequenzen identifiziert werden, die zu 100% komplementär zu der Sonde sind (homologes Sondieren). Alternativ können die Stringenzbedingungen angepasst werden, um einige Fehlpaarungen in den Sequenzen zu erlauben, so dass niedrigere Grade der Similarität bzw. Ähnlichkeit detektiert werden (heterologes Sondieren). Im Allgemeinen ist eine Sonde weniger als näherungsweise 1.000 Nucleotide lang, bevorzugt weniger als 500 Nucleotide lang.
  • Typischerweise werden stringente Bedingungen jene sein, bei denen die Salzkonzentration weniger als 1,5 M Na-Ionen-, typischerweise näherungsweise 0,01 bis 1,0 M Na-Ionenkonzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 beträgt und die Temperatur wenigstens näherungsweise 30°C bei kurzen Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) und wenigstens näherungsweise 60°C bei langen Sonden (z.B. mehr als 50 Nucleotide) beträgt. Stringente Bedingungen können auch durch die Zugabe destabilisierender Mittel, wie z.B. Formamid, erreicht werden. Beispielhafte Bedingungen niedriger Stringenz umfassen Hybridisierung mit einer Pufferlösung von 30 bis 35% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 37°C und Waschen in 1 × bis 2 × SSC (20 × SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat) bei 50 bis 55°C. Beispielhafte Bedingungen moderater Stringenz umfassen Hybridisierung in 40 bis 45% Formamid, 1,0 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und Waschen in 0,5 × bis 1 × SSC bei 55 bis 60°C. Beispielhafte Bedingungen hoher Stringenz umfassen Hybridisierung in 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und Waschen in 0,1 × SSC bei 60 bis 65°C. Optional können die Waschpuffer näherungsweise 0,1% bis näherungsweise 1% SDS umfassen. Die Dauer der Hybridisierung beträgt im Allgemeinen weniger als 24 Stunden, üblicherweise näherungsweise 4 bis näherungsweise 12 Stunden.
  • Die Spezifität ist typischerweise die Funktion von Waschschritten nach der Hybridisierung, wobei die kritischen Faktoren die Ionstärke und Temperatur der endgültigen Waschlösung sind. Für DNA-DNA-Hybride kann die Tm mittels der Gleichung von Meinkoth und Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:261-284, approximiert werden: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) – 0,61 (% Formamid) – 500/L, wobei M die Molarität der einwertigen Kationen ist, %GC der prozentuale Anteil von Guanosin- und Cytosinnucleotiden in der DNA ist, % Formamid der prozentuale Anteil von Formamid in der Hybridisierungslösung ist und L die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist. Tm ist die Temperatur (bei definierter/definiertem Ionenstärke und pH) bei der 50% einer komplementären Zielsequenz mit einer perfekt übereinstimmenden Sonde hybridisieren. Die Tm wird pro 1% Fehlpaarung um näherungsweise 1°C verringert; folglich können Tm, Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen angepasst werden, um mit Sequenzen der gewünschten Identität zu hybridisieren. Wenn beispielsweise Sequenzen mit > 90% Identität gesucht werden, kann Tm um 10°C verringert werden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie näherungsweise 5°C niedriger liegen, als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz und ihr Komplement bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH. Jedoch können streng stringente Bedingungen eine Hybridisierung und/oder Waschen bei 1, 2, 3 oder 4°C weniger als dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) verwenden; moderat stringente Bedingungen können eine Hybridisierung und/oder Waschen bei 6, 7, 8, 9 oder 10°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) verwenden; Bedingungen niedriger Stringenz können eine Hybridisierung und/oder Waschen bei 11, 12, 13, 14, 15 oder 20°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) verwenden. Unter Verwendung der Gleichung, Hybridisierungs- und Waschzusammensetzungen und der gewünschten Tm werden Durchschnittsfachleute begreifen, dass Variationen hinsichtlich der Stringenz der Hybridisierungs- und/oder Waschlösungen inhärent beschrieben sind. Wenn der gewünschte Grad an Fehlpaarung in einer Tm von weniger als 45°C (wässrige Lösung) oder 32°C (Formamid-Lösung) resultiert, ist es bevorzugt, die SSC-Konzentration zu erhöhen, so dass eine höhere Temperatur verwendet werden kann. Eine umfangreiche Anleitung zur Hybridisierung von Nucleinsäuren wird gefunden in Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Teil I, Kapitel 2 (Elsevier, New York) und Ausubel et al. Herausg. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 2 (Green Publishing and Wiley Interscience, New York). Siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
  • Folglich sind isolierte Sequenzen, die Promotoraktivität besitzen und die unter stringenten Bedingungen mit der hierin offenbarten Promotorsequenz oder mit Fragmenten davon hybridisieren, von der vorliegenden Erfindung umfasst. Derartige Sequenzen werden wenigstens näherungsweise 40% bis 50% homolog, näherungsweise 60%, 65% oder 70% homolog und sogar wenigstens näherungsweise 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr mit der offenbarten Sequenz homolog sein. Dies bedeutet, dass die Sequenzidentität von Sequenzen schwanken kann, wobei sie wenigstens näherungsweise 40% bis 50%, näherungsweise 60%, 65% oder 70% und sogar wenigstens näherungsweise 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität gemeinsam haben.
  • Die folgenden Begriffe werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehr Nucleinsäuren zu beschreiben: (a) "Referenzsequenz", (b) "Vergleichsfenster", (c) "Sequenzidentität", (d) "Prozentsatz der Sequenzidentität" und (e) "wesentliche Identität".
    • (a) Wie hierin verwendet, ist eine "Referenzsequenz" eine definierte Sequenz, die als eine Grundlage für einen Sequenzvergleich verwendet wird. Eine Referenzsequenz kann eine Teilmenge oder die Gesamtheit einer spezifizierten Sequenz, beispielsweise als ein Abschnitt einer Volllängen-cDNA- oder Gensequenz, oder die vollständige cDNA- oder Gensequenz sein.
    • (b) Wie hierin verwendet, bezieht sich ein "Vergleichsfenster" auf einen zusammenhängenden und spezifizierten Abschnitt einer Polynucleotidsequenz, wobei die Polynucleotidsequenz in dem Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) im Vergleich zu der Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) für eine optimale Anordnung der zwei Sequenzen umfassen kann. Im Allgemeinen ist das Vergleichsfenster wenigstens 20 fortlaufende Nucleotide lang und kann gegebenenfalls 30, 40, 50, 100 oder länger sein. Fachleute auf dem Gebiet begreifen, dass zum Vermeiden einer hohen Ähnlichkeit mit einer Referenzsequenz aufgrund des Einschließens von Lücken in die Polynucleotidsequenz typischerweise ein Lückenstrafmaß bzw. eine "gap penalty" eingeführt und von der Anzahl an Übereinstimmungen abgezogen wird.
  • Verfahren zur Anordnung von Sequenzen für den Vergleich sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Deshalb kann die Bestimmung des Prozentsatzes der Sequenzidentität zwischen zwei beliebigen Sequenzen unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus bewerk stelligt werden. Nicht-beschränkende Beispiele derartiger mathematischer Algorithmen sind der Algorithmus von Myers und Miller (1988) CABIOS 4:11-17; der lokale-Homologie-Algorithmus von Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; der Homologie-Anordnungs-Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; das Verfahren zur Suche nach Ähnlichkeit von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modifiziert wie in Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 beschrieben.
  • Computer-Implementierungen dieser mathematischen Algorithmen können für Sequenzvergleiche zum Bestimmen der Sequenzidentität verwendet werden. Derartige Implementierungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: CLUSTAL im PC/Gene-Programm (erhältlich von Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien); das ALIGN-Programm (Version 2.0) und GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA in dem Wisconsin Genetics-Softwarepaket, Version (erhältlich von Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA). Anordnungen unter Verwendung dieser Programme können unter Verwendung der Standardparameter durchgeführt werden. Das CLUSTAL-Programm ist gut beschrieben von Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; und Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. Das ALIGN-Programm beruht auf dem Algorithmus von Myers und Miller (1988) supra. Eine PAM120-Matrix ("PAM120 weight residue table"), ein Strafmaß für die Lückenlänge ("gap length penalty") von 12 und ein Lückenstrafmaß von 4 können beim Vergleichen von Aminosäuresequenzen mit dem ALIGN-Programm verwendet werden. Die BLAST-Programme von Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 beruhen auf dem Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) supra. BLAST-Nucleotidrecherchen können mit dem BLASTN-Programm, score = 100, wordlength = 12, durchgeführt werden, um Nucleotidsequenzen zu erhalten, die homolog sind zu einer für ein erfindungsgemäßes Protein codierende Nucleotidsequenz. BLAST-Proteinrecherchen können mit dem BLASTX-Programm, score = 50, wordlength = 3, durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die zu einem erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid homolog sind. Um für Vergleichszwecke Lücken aufweisende Alignments zu erhalten, kann Gapped BLAST (in BLAST 2.0) verwendet werden, wie es in Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 beschrieben ist. Alternativ kann PSI-BLAST (in BLAST 2.0) verwendet werden, um eine iterative Recherche bzw. Suche durchzuführen, die entfernte Verwandtschaften zwischen Molekülen detektiert. Siehe Altschul et al. (1997) supra. Beim Verwenden von BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST können die Standardparameter bzw. Default-Parameter der jeweiligen Programme (z.B. BLASTN für Nucleotidsequenzen, BLASTX für Proteine) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Eine Anordnung kann auch manuell durch Betrachtung durchgeführt werden.
  • Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich hierin angegebene Werte für Sequenzidentität/Ähnlichkeit auf den Wert, der unter Verwendung von GAP Version 10 unter Verwendung der nachstehenden Parameter: % Identität unter Verwendung einer Lückengewichtung ("gap weight") von 50 und einer Längengewichtung ("length weight") von 3; % Ähnlichkeit unter Verwendung einer Lückengewichtung von 12 und einer Längengewichtung von 4, oder eines gleichwertigen Programms erhalten wird. Mit "gleichwertiges Programm" ist jedes beliebige Sequenzvergleichsprogramm, das für zwei fragliche Sequenzen eine Anordnung mit identischen Nucleotid- oder Aminosäurerest-Übereinstimmungen und einem identischen Prozentsatz der Identität erzeugt im Vergleich zu der entsprechenden Anordnung, die durch das bevorzugte Programm erzeugt wurde, gemeint.
  • GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453 zum Auffinden der Anordnung von zwei vollständigen Sequenzen, die die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. GAP erwägt alle möglichen Anordnungen und Lückenpositionen und erzeugt die Anordnung mit der größten Anzahl an übereinstimmenden Basen und den wenigsten Lücken. Es ermöglicht die Vorgabe eines Lückenschaffungsstrafmaßes ("gap creation penalty") und eines Lückenverlängerungsstrafmaßes ("gap extension penalty") in Einheiten übereinstimmender Basen. GAP muss einen Gewinn aus Lückenerzeugungsstrafmaßzahlen von Übereinstimmungen für jede Lücke, die es einfügt, erzielen. Wenn ein Lückenverlängerungsstrafmaß von mehr als 0 gewählt wird, muss GAP für jede eingefügte Lücke einen Gewinn aus der Länge der Lücke mal dem Lückenverlängerungsstrafmaß ziehen. Standard-Lückenerzeugungsstrafmaßwerte und -Lückenverlängerungsstrafmaßwerte in der Version 10 des Wisconsin Genetics-Softwarepakets sind 8 bzw. 2 für Proteinsequenzen. Für Nucleotidsequenzen ist das Standard-Lückenerzeugungsstrafmaß 50, während das Standard-Lückenverlängerungsstrafmaß 3 beträgt. Die Lückenerzeugungs- und Lückenverlängerungsstrafmaße können als eine ganze Zahl, ausgewählt aus der Gruppe ganzer Zahlen, die von 0 bis 200 reicht, ausgedrückt werden. Folglich können die Lückenerzeugungs- und Lückenverlängerungsstrafmaße beispielsweise 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 oder mehr sein.
  • GAP stellt ein Mitglied der Familie bester Anordnungen dar. Es kann viele Mitglieder dieser Familie geben, aber kein Mitglied hat eine bessere Qualität. GAP zeigt vier Leistungsmerkmale für Anordnung: Qualität, Verhältnis, Identität und Ähnlichkeit. Die Qualität ist das Maß, das maximiert wurde, um die Sequenzen anzugleichen. Das Verhältnis ist die Qualität geteilt durch die Anzahl an Basen im kürzeren Abschnitt. Der Prozentsatz der Identität ist der Prozentsatz der Symbole, die tatsächlich übereinstimmen. Der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist der Prozentsatz der Symbole, die ähnlich sind. Symbole, die Lücken gegenüberstehen, werden ignoriert. Eine Ähnlichkeit ist erzielt, wenn der Bewertungsmatrixwert ("scoring matrix value") für ein Paar von Symbolen größer oder gleich 0,50, dem Ähnlichkeitsschwellenwert, ist. Die in Version 10 des Wisconsin Genetics-Softwarepakets verwendete Bewertungsmatrix ist BLOSUM62 (siehe Henikoff und Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
    • (c) Wie hierin im Kontext von zwei Nucleinsäure- oder Polypeptidsequenzen verwendet, bezieht sich "Sequenzidentität" oder "Identität" auf Reste in den zwei Sequenzen, die gleich sind, wenn sie über ein spezifiziertes Vergleichsfenster bezüglich maximaler Übereinstimmung angeordnet bzw. angeglichen werden. Wenn Prozentsatz der Sequenzidentität in Bezug auf Proteine verwendet wird, wird anerkannt, dass Rest-Positionen, die nicht identisch sind, sich häufig durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, wobei Aminosäurereste durch andere Aminosäurereste mit ähnlichen chemischen Eigenschaften (z.B. Ladung oder Hydrophobizität) ersetzt sind und deshalb die funktionellen Eigenschaften des Moleküls nicht ändern. Wenn sich Sequenzen in konservativen Substitutionen unterscheiden, kann der Prozentsatz der Identität nach oben angepasst werden, um entsprechend der konservativen Natur der Substitution zu korrigieren. Man sagt, dass Sequenzen, die sich durch derartige konservative Substitutionen unterscheiden, "Sequenzähnlichkeit" oder "Ähnlichkeit" haben. Mittel zum Durchführen dieser Anpassungen sind Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt. Typischerweise umfasst dies Bewerten einer konservativen Ersetzung als eine teilweise oder einer völligen Fehlpaarung, wodurch der Prozentsatz der Sequenzidentität erhöht wird. Wenn beispielsweise einer identischen Aminosäure eine Bewertung von 1 zugewiesen wird und einer nicht-konservativen Ersetzung eine Bewertung von 0 zugewiesen wird, wird einer konservativen Ersetzung eine Bewertung zwischen 0 und 1 zugewiesen. Die Bewertung kon servativer Substitutionen wird berechnet, z.B. wie es in dem Programm "PC/GENE" (Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien) implementiert ist.
    • (d) Wie hierin verwendet, bedeutet "Prozentsatz der Sequenzidentität" den Wert, der durch Vergleichen von zwei optimal angeglichenen Sequenzen über ein Vergleichsfenster hinweg bestimmt wird, wobei der Anteil der Polynucleotidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) im Vergleich zu der Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) für eine optimale Anordnung der zwei Sequenzen umfassen kann. Der Prozentsatz wird durch Bestimmung der Anzahl an Positionen, an denen die identische Nucleinsäurebase in beiden Sequenzen auftritt, was die Anzahl übereinstimmender Positionen ergibt, Teilen der Anzahl übereinstimmender Positionen durch die Gesamtzahl der Positionen im Vergleichsfenster und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100, um den Prozentsatz der Sequenzidentität zu ergeben, errechnet.
    • (e) Der Begriff "wesentliche Identität" ("substantial identity") von Polynucleotidsequenzen bedeutet, dass eine Polynucleotidsequenz eine Sequenz umfasst, die wenigstens 70% Sequenzidentität, bevorzugt wenigstens 80%, stärker bevorzugt wenigstens 90% und am stärksten bevorzugt wenigstens 95% im Vergleich zu einer Referenzsequenz unter Verwendung eines der beschriebenen Anordnungsprogramme, wobei Standardparameter verwendet werden, besitzt. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass diese Werte auf geeignete Weise angepasst werden können, um eine entsprechende Identität von Proteinen, die von zwei Nucleotidsequenzen codiert werden, zu bestimmen, wobei Codondegeneriertheit, Aminosäureähnlichkeit, Positionierung des Leserasters und dergleichen berücksichtigt werden. Wesentliche Identität von Aminosäuresequenzen für diese Zwecke bedeutet normalerweise eine Sequenzidentität von wenigstens 60%, bevorzugter wenigstens 70%, 80%, 90% und am stärksten bevorzugt wenigstens 95%.
  • Ein weiterer Hinweis darauf, dass Nucleotidsequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist es, wenn zwei Moleküle miteinander unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie näherungsweise 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) der spezifischen Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH liegen. Jedoch umfassen stringente Bedingungen Temperaturen im Bereich von näherungsweise 1°C bis näherungsweise 20°C unter der Tm, abhängig von dem gewünschten Stringenzgrad, wie andernfalls hierin qualifiziert. Nucleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen nicht miteinander hybridisieren, sind noch im Wesentli chen identisch, wenn die Polypeptide, für die sie codieren, im Wesentlichen identisch sind. Dies kann auftreten, wenn z.B. eine Kopie einer Nucleinsäure unter Verwendung der maximalen Codon-Degeneriertheit, die vom genetischen Code zugelassen wird, erzeugt wird. Ein Anzeichen dafür, dass zwei Nucleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist es, wenn das von der ersten Nucleinsäure codierte Polypeptid mit dem von der zweiten Nucleinsäure codierten Polypeptid immunologisch kreuzreaktiv ist.
  • Die in der vorliegenden Erfindung offenbarte Promotorsequenz, sowie Varianten und Fragmente davon sind bei der genetischen Manipulation einer beliebigen Pflanze nützlich bzw. verwendbar, wenn sie in einem DNA-Konstrukt so zusammengesetzt werden, dass die Promotorsequenz mit einer heterologen Nucleotidsequenz von Interesse funktionell verknüpft ist. Die Kassette wird 5'- und 3'-Regulationssequenzen in funktioneller Verknüpfung mit einer heterologen Nucleotidsequenz umfassen. Mit "funktionell verknüpft" ist eine funktionelle Verknüpfung zwischen einer erfindungsgemäßen Promotorsequenz und einer zweiten Sequenz gemeint, wobei die Promotorsequenz die Transkription der DNA-Sequenz, die der zweiten Sequenz entspricht, initiiert und vermittelt. Im Allgemeinen bedeutet funktionell verknüpft, dass die Nucleinsäuresequenzen zusammenhängend verknüpft sind und, sofern notwendig, so dass sie zwei Protein-codierende Bereiche zusammenhängend und in dem gleichen Leseraster verbinden. Auf diese Weise wird die Promotornucleotidsequenz in Expressionskassetten zusammen mit heterologen Nucleotidsequenzen zur Expression in einer Pflanze von Interesse bereitgestellt. Eine derartige Expressionskassette wird mit einer Vielzahl an Restriktionsstellen für die Insertion der heterologen Nucleotidsequenz, die unter der Transkriptionsregulation der regulatorischen Bereiche, umfassend die erfindungsgemäße Promotorsequenz, stehen soll, bereitgestellt. Die Kassette kann zusätzlich wenigstens ein zusätzliches Gen, das in den Organismus co-transformiert werden soll, enthalten. Alternativ kann das zusätzliche Gen/die zusätzlichen Gene auf mehrfachen bzw. mehreren Expressionskassetten bereitgestellt werden.
  • Die Expressionskassette kann zusätzlich selektierbare Marker-Gene enthalten. Im Allgemeinen wird die Expressionskassette ein selektierbares Markergen für die Selektion transformierter Zellen umfassen. Selektierbare Markergene werden für die Selektion transformierter Zellen oder Gewebe verwendet. Markergene umfassen Gene, die für Antibiotikaresistenz codieren, wie z.B. jene, die für Neomycin-Phosphortransferase II (NEO) und Hygromycin-Phosphortransferase (HPT) codieren, sowie Gene, die Resistenz gegenüber herbiziden Ver bindungen, wie z.B. Glufosinatammonium, Bromoxynil, Imidazolinonen und 2,4-Dichlorphenoxyacetat (2,4-D), verleihen. Siehe allgemein, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) in The Operon, S. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49: 603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86: 5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph. D. Thesis, Universität Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993) Ph. D. Thesis, Universität Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Band 78 (Springer Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Die oben stehende Liste selektierbarer Markergene soll nicht beschränkend sein. In der vorliegenden Erfindung kann jedes beliebige selektierbare Markergen verwendet werden.
  • Die Expressionskassette wird in der 5'-3'-Richtung der Transkription eine erfindungsgemäße Promotorsequenz, eine Translationsinitiationsregion, eine heterologe Nucleotidsequenz und eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion, funktionsfähig in Pflanzen, umfassen. Die heterologe Nucleotidsequenz kann in Bezug auf den Pflanzenwirt nativ oder analog oder fremd oder heterolog sein. Zusätzlich kann die heterologe Nucleotidsequenz die natürliche Sequenz oder alternativ eine synthetische Sequenz sein. Mit "fremd" ist gemeint, dass die Transkriptionsinitiationsregion nicht in der nativen Pflanze gefunden wird, in die die Transkriptionsinitiationsregion eingeführt wird. Wie hierin verwendet, umfasst ein chimäres Gen eine Promotorsequenz in funktioneller Verknüpfung mit einer codierenden Sequenz, die zu der Promotorsequenz heterolog ist.
  • Die Terminationsregion kann in Bezug auf die erfindungsgemäße Promotorsequenz nativ sein oder kann nativ sein in Bezug auf die funktionell verknüpfte heterologe Nucleotid sequenz oder kann von einer anderen Quelle stammen. Zweckdienliche Terminationsregionen sind verfügbar aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens, wie z.B. die Octopinsynthase- und Nopalinsynthase-Terminationsregionen. Siehe auch Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; und Joshiet et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.
  • Beim Herstellen der Expressionskassette können zahlreiche DNA-Fragmente manipuliert werden, um zu gewährleisten, dass die DNA-Sequenzen in der richtigen Orientierung und, sofern erforderlich, im richtigen Leseraster sind. Zu diesem Zweck können Adaptoren oder Linker eingesetzt werden, um die DNA-Fragmente zu verbinden, oder andere Manipulationen können eingesetzt werden, um zweckdienliche Restriktionsstellen, Entfernung überflüssiger DNA, Entfernung von Restriktionsorten oder dergleichen bereitzustellen. Für diesen Zweck können in vitro-Mutagenese, Primerreparatur ("primer repair"), Restriktion, Annealing, Resubstitutionen, d.h. Transitionen und Transversionen, eingesetzt werden.
  • Wo es erforderlich ist, können heterologe Nucleotidsequenzen bezüglich erhöhter Expression in der transformierten Pflanze optimiert werden. Das bedeutet, dass die Gene unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter Codons bzw. von der Pflanze bevorzugter Codons für eine verbesserte Expression synthetisiert werden können. Siehe z.B. Campbell und Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 für eine Diskussion Wirts-bevorzugter Codon-Nutzung ("host-preferred codon usage"). Es sind auf dem Fachgebiet Verfahren zum Synthetisieren Pflanzen-bevorzugter Gene verfügbar. Siehe z.B. die US-Patente Nrn. 5,380,831 und 5,436,391 und Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.
  • Weitere Sequenzmodifikationen sind dafür bekannt, dass sie die Genexpression in einem zellulären Wirt steigern. Diese umfassen Eliminierung von Sequenzen, die für störende bzw. fehlerhafte Polyadenylierungssignale, Exon-Intron-Spleißstellensignale, Transposonartige Wiederholungen und andere derartige gut charakterisierte Sequenzen, die für die Genexpression schädlich sein können, codieren. Der G-C-Gehalt der Sequenz kann auf Level angepasst werden, die für einen gegebenen zellulären Wirt durchschnittlich sind, was durch Bezug auf bekannte Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden, berechnet wird. Wo es möglich ist, wird die Sequenz modifiziert, um vorhergesagte Haarnadel-Sekundärstrukturen der mRNA zu vermeiden.
  • Die Expressionskassetten können darüber hinaus 5'-Leadersequenzen bzw. 5'-Leitsequenzen in dem Expressionskassettenkonstrukt oder Expressionsvektor enthalten. Derartige Leadersequenzen können eine erhöhte Translation bewirken. Translationsleader bzw. Translationsleadersequenzen sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen: Picornavirus-Leader, beispielsweise den EMCV-Leader (Encephalomyocarditis-5'-nicht-codierende Region) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); Potyvirus-Leader, z.B. TEV-Leader (Tabakätzvirus) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), MDMV-Leader (Maisverzwergungsmosaik-Virus) (Virology 154:9-20), und humanes Immunglobulin-Heavy-Chain-Bindeprotein (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); nicht-translatierter Leader aus der Hüllprotein-mRNA von Alfalfa-Mosaikvirus (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); Tabakmosaikvirus-Leader (TMV) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, Hrs. Cech (Liss, New York), S. 237-256); und Chlorotisches Maisscheckungsvirus-Leader ("maize chlorotic mottle virus" (MCMV)) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Siehe auch Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Andere Verfahren zum Steigern der Translation können auch eingesetzt werden, beispielsweise Introns und dergleichen.
  • Es wird anerkannt, dass die erfindungsgemäßen Promotorsequenzen verwendet werden können, um die Transkription von Antisense-Konstruktionen, komplementär zu wenigstens einem Teil der Messenger-RNA (mRNA) für die Nucleotidsequenz eines Gens von Interesse, zu initiieren. Antisense-Nucleotide sind so konstruiert, dass sie mit der entsprechenden mRNA hybridisieren. Modifikationen der Antisense-Sequenzen können gemacht werden, sofern die Sequenzen mit der entsprechenden mRNA hybridisieren und deren Expression stören. Auf diese Weise können Antisense-Konstruktionen mit 70%, bevorzugt 80%, stärker bevorzugt 85%, Sequenzähnlichkeit zu den entsprechenden "antisensed"-Sequenzen besitzen, verwendet werden. Weiterhin können Teile dieser Antisense-Nucleotide verwendet werden, um die Expression von Zielgenen zu stören bzw. zu unterbrechen. Im Allgemeinen werden Sequenzen von wenigstens 50 Nucleotiden, 100 Nucleotiden, 200 Nucleotiden oder mehr verwendet.
  • Die erfindungsgemäßen Promotorsequenzen können auch verwendet werden, um die Transkription einer Nucleotidsequenz in Sinn-Orientierung bzw. Sense-Orientierung zu initiieren, um die Expression endogener Gene in Pflanzen zu unterdrücken. Verfahren zum Unterdrücken der Genexpression in Pflanzen unter Verwendung von Nucleotidsequenzen in der Sinn-Orientierung sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die Verfahren umfassen im Allgemeinen Transformieren von Pflanzen mit einem DNA-Konstrukt, umfassend einen Promotor, der die Expression in einer Pflanze steuert, in funktioneller Verknüpfung mit wenigstens einem Teil einer Nucleotidsequenz, die dem Transkript des endogenen Gens entspricht. Typischerweise hat eine derartige Nucleotidsequenz eine wesentliche Sequenzidentität mit der Sequenz des Transkripts des endogenen Gens, bevorzugt mehr als näherungsweise 65% Sequenzidentität, stärker bevorzugt mehr als näherungsweise 85% Sequenzidentität, am stärksten bevorzugt mehr als 95% Sequenzidentität, siehe US-Patente Nrn. 5,283,184 und 5,034,323.
  • Die erfindungsgemäßen Promotorsequenzen sind verwendbar bei der Gewebe-bevorzugten Expression einer heterologen Nucleotidsequenz von Interesse. Mit "heterologe Nucleotidsequenz" ist eine Sequenz gemeint, die natürlicherweise nicht zusammen mit der Promotorsequenz vorkommt. Während diese Nucleotidsequenz für die Promotorsequenz heterolog ist, kann sie für den Pflanzenwirt homolog oder nativ oder heterolog oder fremd sein. Die heterologe Nucleotidsequenz in funktioneller Verknüpfung mit einem der hierin offenbarten Promotoren kann für ein Polypeptid von Interesse codieren. Beispiele derartiger heterologer Gene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Nucleotidsequenzen, die für Polypeptide codieren, die Resistenz gegenüber abiotischem Stress, wie z.B. Trockenheit, Temperatur, Salzgehalt bzw. Salinität, Ozon und Toxinen, wie z.B. Pestiziden und Herbiziden, oder gegenüber biotischem Stress, wie z.B. Befälle durch Pathogene, einschließlich Insekten, Viren, Bakterien, Pilze und Nematoden, und Entwicklung von Krankheiten, die mit diesen Organismen zusammenhängen, verleihen.
  • Die hierin offenbarten Promotor-Nucleotidsequenzen und Verfahren sind nützlich beim Regulieren der Expression einer beliebigen heterologen Nucleotidsequenz in einer Wirtspflanze, um den Phenotyp einer Pflanze zu variieren. Verschiedene Veränderungen im Phenotyp sind von Interesse, einschließlich Modifikation der Fettsäurezusammensetzung in einer Pflanze, Ändern des Aminosäuregehalts einer Pflanze, Ändern der Pathogenabwehrmechanismen einer Pflanze, Ändern des Eintritts und Austritts von Substanzen in das Gefäßgewebe und dergleichen. Diese Ergebnisse können erreicht werden, indem Expression heterologer Produkte oder erhöhte Expression endogener Produkte in Pflanzen bereitgestellt werden. Alternativ können diese Ergebnisse erreicht werden, indem eine Verringerung der Expression eines oder mehrerer endogener Produkte, insbesondere Enzyme oder Co-Faktoren in der Pflanze, bereitgestellt werden. Diese Veränderungen können eine Veränderung des Phenotyps der transformierten Pflanze bewirken.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die hierin offenbarten Promotorsequenzen funktionell verknüpft mit heterologen Nucleotidsequenzen, die die Beladungscharakteristika bzw. Beladungseigenschaften von Gefäßgewebe modifizieren und dadurch die Pflanzenentwicklung und -reifung, Kohlenstoffallokation und Ernteausbeute beeinflussen. Das Phloem transportiert Substanzen in dem gesamten Pflanzenorganismus. In Phloem transportierte Materialien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Peptide, anorganisches Phosphat und eindringende Pathogene. Diese vom Phloem transportierten Substanzen müssen in das Phloem geladen oder importiert werden, und zahlreiche Gene regulieren die Phloembeladung. Mit "Gefäßgewebe beladen" ist Laden und Entladen von Nährstoffen, wie z.B. Hormonen, Polypeptiden oder Kohlenhydraten, in Zellen des vaskulären Transportsystems der Pflanze gemeint. Durch Ändern der Konzentrationen von Substanzen, die an der Phloembeladung beteiligt sind, können die Beladungscharakteristika von Gefäßgewebe, die Pflanzenentwicklung und das Pflanzenwachstum beeinflusst werden. Die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen können verwendet werden, um die Expression von Substanzen, die Gefäßgewebebeladung regulieren, zu modulieren.
  • Substanzen, die die Gefäßgewebebeladung regulieren, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Saccharosetransporter, codiert von SUT1 (Genbank-Eingangsnummern. AF280050, AJ272309, AF167417, AF191025, AF191024, AF109922, X82275, AJ224961, X83850, X69165), SUT2 (Genbank-Eingangsnummern Y16768, AF166498, AJ272308) und SUT4 (Genbank-Eingangsnummern AF176950, AF175322, AF237780); Saccharosesynthasen, codiert von ASUS1 (Genbank-Eingangsnummer X70990), SUC1 (Genbank-Eingangsnummer X75365), SUC2 (Genbaank-Eingangsnummern X75764, X79702), SUS1 (Genbank-Eingangsnummern L29418), Shrunken1 (Genbank-Eingangsnummer J01241), SS1 (Genbank-Eingangsnummer AJ001117) und SS2 (Marana et al. (1988) Gene 63:253-260); Aminosäuretransporter, codiert von NaAAP1 (Genbank-Eingangsnummer AF080542); Peptidtransporter, codiert von NaNTR1 (Schultz et al. (1999) Plant J. 6:637-646), Galactinolsynthasen (Genbank-Eingangsnummern AF249912, AJ237693, AJ237694), anorganische Pyrophosphatasen (Genbank-Eingangsnummer AJ252210), K+-Kanalproteine, codiert von AKT3 (Genbank-Eingangsnummer U44745), H+-ATPasen, codiert von AHA1 (Genbank-Eingangsnummer AJ002020), AHA2 (Harper et al. (1990) J.Biol. Chem. 265:13601-13608), AHA3 (DeWitt et al. (1991) Plant J. 1:121-128), und pma4 (Gianinazzi-Pearson et al. (2000) Planta 211:609-613 und Genbank-Eingangsnummer X66737), Aminosäurepermeasen (Genbank-Eingangsnummer X71787), Kohlenhydratregulatoren des Phloems, codiert von pgm (Genbank-Eingangsnummer AF216580) und sex1 (Genbank-Eingangsnummer AF312027), und Fructosyltransferasegenen (z.B. Genbank Eingangsnummer AJ250634).
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können hierin offenbarte Promotorsequenzen operativ bzw. funktionell verknüpft sein mit heterologen Nucleotidsequenzen, die nützlich sind beim Schützen von Pflanzen gegen Pathogene, wobei diese Pathogene Insekten, Viren, Pilze, Nematoden und dergleichen umfassen. Viele Pathogene wandern durch das Gefäßgewebe, um die Krankheit über die Pflanze zu verbreiten. Saft-saugende Insekten übertragen Viren, Pilze und Nematoden von infizierten Pflanzen auf gesunde Pflanzen. Die Erfindung ermöglicht eine Gefäßgewebe-spezifische, insbesondere Phloemgewebe-spezifische Expression von Genen, die anti-pathogene Aktivität verleihen. Mit "anti-pathogene Zusammensetzungen" ist gemeint, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen fähig sind, den eindringenden pathogenen Organismus zu unterdrücken, zu kontrollieren und/oder zu töten. Eine erfindungsgemäße anti-pathogene Zusammensetzung wird die aus der Provokation durch das Pathogen resultierenden Symptome um wenigstens näherungsweise 5% bis näherungsweise 50%, wenigstens näherungsweise 10% bis näherungsweise 60%, wenigstens näherungsweise 30% bis näherungsweise 70%, wenigstens näherungsweise 40% bis näherungsweise 80% oder wenigstens näherungsweise 50% bis näherungsweise 90% oder mehr verringern. Folglich können die erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, um Pflanzen vor Krankheiten, insbesondere jenen Krankheiten, die von Pflanzenpathogenen verursacht werden, zu schützen.
  • Assays, die anti-pathogene Aktivität messen, sowie Verfahren zum Quantifizieren der Krankheitsresistenz in Pflanzen nach einer Pathogeninfektion sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,614,395. Derartige Techniken umfassen Messen des durchschnittlichen Läsionsdurchmessers, der Pathogenbiomasse und des insgesamten prozentualen Anteils zersetzter Pflanzengewebe über die Zeit. Zum Beispiel zeigt eine Pflanze, die entweder ein anti-pathogenes Polypeptid exprimiert oder auf deren Oberfläche eine anti-pathogene Zusammensetzung aufgebracht wurde, anschließend an eine Pathogen-Provokation eine Verringerung der Gewebenekrose (d.h. Läsionsdurchmesser) oder eine Verriongerung des Absterbens der Pflanze, im Vergleich zu einer Kontrollpflanze, die der anti- pathogenen Zusammensetzung nicht ausgesetzt wurde. Alternativ kann anti-pathogene Aktivität durch eine Verringerung der Pathogen-Biomasse gemessen werden. Zum Beispiel wird eine Pflanze, die ein anti-pathogenes Polypeptid exprimiert oder einer anti-pathogenen Zusammensetzung ausgesetzt wurde, mit einem interessierenden Pathogen provoziert. Über die Zeit hinweg werden Gewebeproben aus den mit dem Pathogen inokulierten Geweben entnommen, und es wird RNA extrahiert. Der Prozentsatz eines spezifischen Pathogen-RNA-Transkripts relativ zu dem Level eines Pflanzen-spezifischen Transkripts erlaubt es, den Level der Pathogenbiomasse zu bestimmen. Siehe z.B. Thomma et al. (1998) Plant Biology 95:15107-15111.
  • Weiterhin umfassen anti-pathogene in vitro-Assays beispielsweise das Aufgeben variierender Konzentrationen der anti-pathogenen Zusammensetzung auf Papierscheiben und Auflegen der Scheiben auf Agar, der eine Suspension des Pathogens von Interesse enthält. Anschließend an eine Inkubation entwickeln sich klare Hemmhöfe um die Scheiben, die eine wirksame Konzentration des anti-pathogenen Polypeptids enthalten (Liu et al. (1994) Plant Biology 91:1888-1892). Darüber hinaus kann eine Mikrospektrofotometrie-Untersuchung eingesetzt werden, um die anti-pathogenen in vitro-Eigenschaften einer Zusammensetzung zu messen (Hu et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:949-959 und Cammue et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:2228-2233).
  • Gene, die für Krankheitresistenzmerkmale codieren, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Detoxifizierungsgene, wie z.B. gegen Fumonosin (US-Patent Nr. 5,792,931); Avirulenz-(avr-) und Krankheitsresistenz-(R-) Gene (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; und Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089) und dergleichen.
  • Mit "Insektenresistenz" ist gemeint, dass die Pflanzen die Symptome und Schädigung vermeiden, die das Ergebnis von Pflanze-Insekt-Interaktionen sind. Das heißt, dass Insekten daran gehindert werden, Pflanzenschädigung, Erntegutschädigung bzw. Ertragsschädigung, Missbildung der Pflanze und Pflanzenkrankheiten zu verursachen, oder alternativ wird die durch das Insekt verursachte Pflanzenschädigung, Erntegutschädigung, Missbildung der Pflanze und Pflanzenkrankheit minimiert oder verringert. Insektenresistenzgene von Interesse umfassen Toxinproteine aus Bacillus, von denen viele auf dem Fachgebiet bekannt sind.
  • Heterologe Nucleotidsequenzen von besonderem Interesse umfassen Sequenzen, die eine erhöhte Krankheitsresistenz gegenüber einer Vielzahl von Pflanzenschädlingen bzw. Pflanzen-schädigenden Organismen, einschließlich Insekten mit stechenden und saugenden Mundwerkzeugen, die sich von Pflanzensaft ernähren, verleihen. Beispielsweise umfassen Insekten der Ordnung Homoptera, die oft als eine separate Unterordnung der Ordnung Hemiptera betrachtet wird, jene Insekten, die als Blattwanzen ("plant bugs") bekannt sind. Diese Schädlinge umfassen die Blattläuse [Familie Aphididae], weiße Fliegen bzw. Mottenschildläuse [Aleyrodidae], Spornzikaden bzw. Zwergzikaden [Delphacidae], Singzikaden [Cicadellidae], Blattflöhe bzw. Springläuse [Psyllidae], Blasenläuse [Pemphigidae], Schmier- bzw. Wollläuse [Pseudococcidae] und (Napf)-Schildläuse [Coccidae, Diaspididae, Asterolecaniidae und Margarodidae]. Viele Arten sind ernsthafte Schädlinge von landwirtschaftlichen bzw. ackerbaulichen und gartenbaulichen Nutzpflanzen und von Zierpflanzen und umfassen beispielsweise Erbsenblattlaus, schwarze Bohnenblattlaus, Aphis gossypii, Baumwollblattlaus; grüne Apfelblattlaus, gestreifte Kartoffellaus, kleine Pflaumenlaus, Bananenblattlaus; Brevicoryne brassicae, Kohlblattlaus; mehlige Kartoffelblattlaus, Pfirsichblattlaus, Maisblattlaus, Getreideblattlaus, Kohlmottenschildlaus ("brassica whitefly"), Tabakmottenschildlaus, Gewächshausmottenschildlaus, schwarze Zitronenlaus ("citrus blackfly"), kleine braune Zwergzikade, braune Reiszikade, Zuckerrohrzikade ("sugarcane planthopper"), Weißrückenzwergzikade, grüne Reiszikade, Circulifer tenellus ("beet leafhopper"), Baumwollzwergzikade ("cottonjassid"), "zig-zag winged riceleafhopper", Apfelblattsauger, großer Birnenblattsauger, Blutlaus, Salatwurzellaus bzw. Pappelwolllaus, Reblaus, Pseudococcus longispinus ("long-tailed mealybug"), Ananasschmierlaus, gestreifte Schmierlaus, rosa Zuckerrohrschmierlaus bzw. Saccharococcus sacchari, Australische Wollschildlaus, Olivenschildlaus, Kommaschildlaus, San-Jose-Schildlaus, Aonidiella aurantii, Chrysonphalus aonidum und Kokospalmenschildlaus.
  • Von Interesse sind auch Gene, die für Resistenz gegenüber pflanzenkauenden bzw. an Pflanzen nagenden Stadien von Insekten codieren, die zu den Ordnungen Coleoptera, Lepidoptera und Orthoptera gehören, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Acanthoscelides obtectus; Bruchus spp.; Callosobruchus spp. [zu den Samenkäfern gehörende Käfer]; Agriotes spp. [Drahtwürmer], insbesondere Agrotis ipsilon, schwarze Eulenraupe; Amphimallon spp. [Blatthornkäfer]; Anthonomus grandis grandis, Baumwollkapselkäfer; Ceutorhynchus assimilis, Kohlschotenrüssler; Cylas spp. [Batatenkäfer]; Diabrotica spp. [Maiswurzelbohrer], insbesondere Diabrotica virgifera, Westlicher Maiswurzelbohrer, Diabrotica longicornis barberi, Nördlicher Maiswurzelbohrer, Diabrotica undecimpunctata howardi, Südlicher Maiswur zelbohrer; Epicauta spp. [Ölkäfer bzw. "black blister beetles"]; Epilachna spp. [Melonenkäfer usw.], insbesondere Epilachna varivestis, Mexikanischer Bohnenkäfer; Leptinotarsa decemlineata, Colorado-Kartoffelkäfer; Meligisthes spp. [Glanzkäfer); Melolontha spp. (Maikäfer]; Phyleotreta spp.; Psylliodes spp. [Flohkäfer]; Popillia japonica, Japankäfer; Scolytus spp. Borken-/Splintkäfer]; Sitophilus spp. [Kornkäfer], insbesondere Sitophilus oryzae, Reiskäfer; Tenebrio molitor [Mehlwurm]; Tribolium spp. [Reismehlkäfer]; Trogoderma granarium, Khaprakäfer; Acleris spp. [Obstbaumwickler]; Acraeaacerata, "sweet potato butterfly"; Agrotis spp. [Eulenwurm], insbesondere Agrotis offhogonia, "western cutworm"; Autographa gamma, Gammaeule; Chilo spp. [Stängelbohrer], insbesondere Chilo partellus, Sorghumbohrer; Cydia pomonella, Apfelwickler; Diparopsis spp. [rote Kapselwürmer]; Ephestia spp. [Speichermotten]; Heliothis spp., insbesondere Heliothis virescens, Baumwollknospenwurm; Helicoverpa spp. [budworms, Kapselwürmer], insbesondere Helicoverpa zea, Baumwollkapselwurm; Mamestra brassicae, Kohlmotte; Manduca spp. [Hornwürmer], Maruca testulalis, "mung moth"; Mythimna spp. [Getreideheerwürmer ("cereal armyworms"]; Ostrinia nubilalis, Europäischer Maiszünsler; Pectinophora gossypiella, rosa Kapselwurm; Phthorimaea operculella, Kartoffelmotte; Pieris brassicae, Großer Kohlweißling; Pieris rapae, Kleiner Kohlweißling; Plodia interpunctella, Dörrobstmotte; Plutella xylostella, Kohlmotte; Sitatroga cerealella, Angoumois-Kornmotte; Spodoptera spp. [Heerwürmer], insbesondere Spodoptera frugiperda, Herbstheerwurm oder Maisheerwurm und Spodoptera exigua, Rübenheerwurm; Trichoplusia ni, Kohlspanner; Acheta spp. [Feldgrillen]; Gryllotalph spp. [Maiswurfsgrillen]; Locusta migratoria, Wanderheuschrecke und Schistocerca gregaria, Wüstenheuschrecke.
  • Darüber hinaus ermöglicht die erfindungsgemäße Promotorsequenz Gefäßgewebe-bevorzugte Expression von Insektenresistenzgenen, die für Resistenz gegenüber Insektenschädlingen codieren, die ausgewählt sind aus den Ordnungen Diptera, Hymenoptera, Mallophaga, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, usw. Insektenschädlinge der wichtigsten Nutzpflanzen umfassen: Mais: Diatraea grandiosella, "southwestern corn borer"; Elasmopalpus lignosellus, "lesser cornstalk borer"; Diatraea saccharalis, Zuckerrohrbohrer; Melanotus spp., Drahtwürmer; Cyclocephala borealis, "northern masked chafer" (Engerling); Cyclocephala immaculata, "southern masked chafer" (Engerling); Chaetocnema pulicaria, Getreideerdfloh; Sphenophorus maidis, Maiskäfer; Rhopalosiphum maidis, Maisblattlaus; Anuraphis maidiradicis, Maiswurzellaus; Blissus leucopterus leucopterus, "chinch bug"; Melanoplus femurrubrum, rotbeiniger Grashüpfer; Melanoplus sanguinipes, Wandergrashüpfer; Hylemya platura, Saatfliegenlarve; Agromyza parvicornis, "corn blot leafminer"; Anaphothrips obscrurus, Gräserthrips; Solenopsis milesta, Diebameise; Tetranychus urticae, Bohnenspinnmilbe; Sorghum: Elasmopalpus lignosellus, "lesser cornstalk borer"; Feltia subterranea, "granulate cutworm"; Phyllophaga crinita, Engerling; Elendes, Conoderus und Aeolus spp., Drahtwürmer; Oulema melanopus, Getreidehähnchen; Chaetocnema pulicaria, Getreideerdfloh; Sphenophorus maidis, Maiskäfer; Rhopalosiphum maidis; Maisblattlaus; Sipha flava, gelbe Zuckerrohrblattlaus; Blissus leucopterus leucopterus, "chinch bug"; Contarinia sorghicola, Sorghummücke; Tetranychus cinnabarinus, Karminspinnmilbe; Tetranychus urticae, Bohnenspinnmilbe; Weizen: Pseudaletia unipunctata, Heerwurm; Elasmopalpus lignosellus, "lesser cornstalk borer"; Elasmopalpus lignosellus, "lessercornstalk borer"; Oulema melanopus, Getreidehähnchen; Hypera punctata, Kleegraskäfer; Schizaphis graminum, Getreidelaus; Macrosiphum avenae, Englische Getreideblattlaus; Melanoplus femurrubrum, rotbeiniger Grashüpfer; Melanoplus differentialis, "differential grasshopper"; Melanoplus sanguinipes, Wandergrashüpfer; Mayetiola destructor, Hessenfliege; Sitodiplosis mosellana, Weizengallmücke; Meromyza americana, "wheat stem maggot"; Hylemya coarctata, Brachfliege; Frankliniella fusca, Tabakthrips; Cephus cinctus, Getreidehalmwespe; Aceria tulipae, Tulpengallmilbe; Sonnenblume: Suleima helianthana, "sunflower bud moth"; Homoeosoma electellum, Sonnenblumenmotte; Zygogramma exclamationis, "sunflower beetle"; Bothyrus gibbous, "carrot beetle"; Neolasioptera murtfeldtiana, "sunflower seed midge"; Baumwolle: Pseudatomoscelis seriatus, "cotton fleahopper"; Trialeurodes abutilonea, "banded winged whitefly"; Lygus lineolaris, Blindwanze; Melanoplus femurrubrum, rotbeiniger Grashüpfer; Melanoplus differentialis, "differential grasshopper"; Thrips tabaci, Zwiebelthrips; Franklinkiella fusca, Tabakthrips; Tetranychus cinnabarinus, Karminspinnmilde; Tetranychus urticae, Bohnenspinnmilbe; Reis: Diatraea saccharalis, Zuckerrohrbohrer; Colaspis brunnea, "grape colaspis"; Lissorhoptrus oryzophilus, "rice water weevil"; Nephotettix nigropictus, Reissingzikade; Blissus leucopterus leucopterus, "chinch bug"; Acrosternum hilare, grüne Stinkwanze; Sojabohne: Pseudoplusia includens, Sojabohnenwickler; Anticarsia gemmatalis, "velvetbean"-Raupe; Plathypena scabra, "green cloverworm"; Myzus persicae, grüne Pfirsichblattlaus; Empoasca fabae, hellgrüne Zwergzikade; Acrosternum hilare, grüne Stinkwanze; Melanoplus femurrubrum, rotbeiniger Grashüpfer; Melanoplus differentialis, "differential grasshopper"; Hylemya platura, Saat fliegenlarbe; Sericothrips variabilis, Sojabohnenthrips; Thrips tabaci, Zwiebelthrips; Tetranychus turkestani, Erdbeerspinnmilbe; Tetranychus urticae, Bohnenspinnmilbe; Gerste: Schizaphis graminum, Getreidelaus; Blissus leucopterus leucopterus, "chinch bug"; Acrosternum hilare, grüne Stinkwanze; Euschistus servus, braune Stinkwanze; Delia platura, Saatfliegenwanze; Mayetiola destructor, Hessenfliege; Petrobia latens; braune Weizenmilbe; Ölraps: Phyllotreta cruciferae, Erdfloh; Mamestra configurata, Bertha-Heerwurm; Delia ssp., Wurzelfliegenlarven.
  • Nucleotidsequenzen, die für Polypeptide codieren, die eine erhöhte Insektenresistenz verleihen, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Derartige Sequenzen umfassen beispielsweise, sind aber nicht beschränkt auf: Sequenzen, die für toxische Proteine von Bacillus thuringiensis codieren (US-Patente Nrn. 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; 6,110,464; 6,033,874; 6,015,891; 5,942,664; 5,914,318; 5,567,600; 5,567,862; 5,723,440; 6,153,814; 6,063,756; 5,854,053; 5,854,053; Geiser et al. (1986) Gene 48: 109); Lectine, wobei das Lectin Schneeglöckchenlectin, Erbsenlectin, Riesenbohnenlectin, modifiziertes Riesenbohnenlectin, Weizenkeimlectin, Tomatenlectin, Erdnusslectin oder Weizenkeim-Agglutinin, Aprotinin und Hernandia moerenhoutiana-Lectin (Zhou et al. (1998) Chin. J. Biotechnol 14:9; Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24: 825; US 5,545,820 ; WO 94/16565 A1 und WO 00/44780) umfasst; Lipoxidasen, wobei die Lipoxidase Erbsenlipoxidase 1 oder Sojabohnenlipoxidase umfasst; Insektenchitinasen (US-Patent Nr. 5,866,788); insektizide Polypeptide (US-Patent Nr. 5,824,864); und dergleichen.
  • Saft-saugende Schädlinge übertragen Viren von infizierten Pflanzen auf gesunde Pflanzen. Derartige Viren umfassen Reistungro-Virus ("rice tungro bacilliform virus") (Bhattacharyya-Pakrassi et al. (1993) Plant J. 4:71), Tabakmosaikvirus (Cheng et al. (2000) Plant J., 3:349), "Sweet potato chlorotic stunt"-Virus und "sweet potato feather mottle"-Virus (Karyeija et al. (2000) Virology 269:26). Phloem-spezifische Expression einer heterologen Nucleotidsequenz mit anti-pathogener Aktivität verringert oder minimiert die Auswirkungen der viralen Pathogene.
  • Weitere Pathogene von Interesse umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Viren oder Viroide und Pilze. Viren können jedes beliebige Pflanzenvirus umfassen, beispielsweise Tabak- oder Gurkenmosaikvirus, Ringfleckenvirus, Necrosevirus, Maisverzwergungsmosaikvirus, usw. Spezifische pilzliche und virale Pathogene für die wichtigsten Nutzpflanzen umfassen: Sojabohnen: Phytophthora megasperma fsp. glycinea, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Diaporthe phaseolorum var. sojae (Phomopsis sojae), Diaporthe phaseolorum var. caulivora, Sclerotium rolfsii, Cercospora kikuchii Cercospora sojina, Peronospora manshurica, Colletotrichum dematium (Colletotichum truncatum), Corynespora cassiicola, Septoria glycines, Phyllosticta sojicola, Alternaria alternata, Pseudomonas syringae p.v. glycinea, Xanthomonas campestris p.v. phaseoli, Microsphaera diffusa, Fusarium semitectum, Phialophora gregata, Sojabohnenmosaikvirus, Glomerella glycines, Tabakringfleckenvirus, Tabakstrichelvirus, Phakopsora pachyrhizi, Pythium aphanidermatum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, Tomatenbronzefleckenvirus, Heterodera glycines Fusarium solani; Rapssorten: Albugo candida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola, Pythium ultimum, Peronospora parasitica, Fusarium roseum, Alternaria alternata; Alfalfa: Clavibafer michiganese subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irregulare, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, Phytophthora megasperma, Peronospora trifoliorum, Phoma medicaginis var. medicaginis, Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Fusarium, Xanthomonas campestris p.v. alfalfae, Aphanomyces euteiches, Stemphylium herbarum, Stemphylium alfalfae; Weizen: Pseudomonas syringae p.v. atrofaciens, Urocystis agropyri, Xanthomonas campestris p v. translucens, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Ustilago tritici, Ascochyta tritici, Cephalosporium gramineum, Collotetrichum graminicola, Erysiphe graminis f.sp. tritici, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recondita f.sp. tritici, Puccinia strüformis, Pyrenophora triticirepentis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoides, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cereals, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium aphanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythiumultimum, Bipolaris sorokiniana, Gerstengelbverzweigungsvirus, Trespenmosaikvirus, Bodenübertragbares Weizenmosaikvirus, Weizenstrichelvirus, Weizenspindelstrichelvirus, "American Wheat Striate Virus", Claviceps purpura, Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomannes, Pythium gramicola, Pythium aphanidermatum, "High Plains Virus", "European wheat striate virus"; Sonnenblume: Plasmophora halstedii, Sclerotinia sclerotiorum, Aster yellows, Septoria helianthi, Phomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria zinniae, Botrytis cinerea, Phoma macdonaldii, Macrophomina phaseolina, Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Puccinia helianthi, Verticillium dahliae, Erwinia carotovorum pv. carotovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea, Albugo tragopogonis; Mais: Fusarium moniliforme var. subglutinans, Erwinia stewartii, Fusarium moniliforme, Gibberella zeae (Fusarium graminearum), Stenocarpella maydi (Diplodia maydis), Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium graminicola, Pythium splendens, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus flavus, Bipolaris maydis O, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium carbonum I, II & III (Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium pedicellatum, Physoderma maydis, Phyllosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puicinia sorghi, Puccinia polysora, Macrophomina phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaequalis, Curvularia pallescens, Clavibacter michiganense subsp. nebraskense, Trichoderma viride, Maisverzwergungsmosaikvirus A & B, Weizenstrichelvirus, Chlorotisches Maisverzwergungsvirus, Claviceps sorghi, Pseudonomas avenae, Erwinia chrysanthemi pv. zea, Erwinia carotovora, Maisverzwergungs-Spiroplasma, Diplodia macrospora, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Peronosclerospora maydis, Peronosclerospora sacchari, Sphacelotheca reiliana, Physopella zeae, Cephalosporium maydis, Cephalosporium acremonium, Chlorotisches Maisscheckungsvirus, High Plains Virus, Maismosaikvirus, Mais-Rayado Fino-Virus, Maisstrichelvirus, Maisstreifenvirus, Maisrauhverzwergungsvirus; Sorghum: Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella graminicola), Cercospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochyta sorghina, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Xanthomonas campestris p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonis, Puccinia purpurae, Macrophomina phaseolina, Perconia circinata, Fusarium moniliforme, Alternaria alternata, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Phoma insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans), Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Phyllachara sacchari, Sporisorium reilianum (Sphacelotheca reiliana), Sphacelotheca cruenta, Sporisorium sorghi, Zuckerrohrmosaik H, Maisverzwergungsmosaikvirus A & B, Claviceps sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium strictum, Sclerophthona macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes, Pythium graminicola, usw.
  • Nematoden umfassen parasitische Nematoden, wie z.B. Wurzelgallen-, Cysten- und Läsionsnematoden, einschließlich Heterodera und Globodera spp.; insbesondere Globodera rostochiensis und Globodera pailida (Kartoffelcystenelchen bzw. Kartoffelcystennematoden); Heterodera glycines (Sojabohnencystennematode); Heterodera schachtii (Rübencystennematode); und Heterodera avenae (Getreidecystennematode).
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ermöglicht die Expression von Herbizidresistenzmerkmalen. Herbizidresistenzmerkmale können in Pflanzen durch Gene eingeführt werden, die für Resistenz gegenüber Herbiziden, die durch Inhibieren der Wirkung von Acetolactatsynthase (ALS) wirken, codieren, insbesondere den Herbiziden vom Sulfonylharnstoff-Typ (z.B. das Acetolactatsynthase-(ALS-) Gen, enthaltend Mutationen, die zu einer derartigen Resistenz führen, insbesondere die S4- und/oder Hra-Mutationen. Von Interesse sind auch Gene, die für eine Resistenz gegenüber Herbiziden, die durch Inhibieren der Wirkung von Glutaminsynthase wirken, wie z.B. Phosphinothricin oder Basta (z.B. das bar-Gen), codieren oder andere derartige Gene, die im Fachgebiet bekannt sind. Das bar-Gen codiert für Resistenz gegenüber dem Herbizid basta und die ALS-Genmutanten codieren für eine Resistenz gegenüber dem Herbizid Chlorsulfuron.
  • Es wird weiterhin anerkannt, dass die Nucleotidsequenzen von Interesse, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, den Handelsmarkt und die Interessen von jenen, die an der Entwicklung der Nutzpflanzen beteiligt sind, widerspiegeln. Nutzpflanzen und Märkte von Interesse verändern sich und so wie sich entwickelnde Nationen bzw. Entwicklungsländer dem Weltmarkt öffnen, werden auch neue Nutzpflanzen und Technologien entstehen. Zusätzlich wird sich, so wie sich unser Verständnis agronomischer Merkmale und Charakteristika, wie z.B. Ertrag und Heterosis, erhöht, die Wahl der Gene für die Transformation entsprechend ändern.
  • Allgemeine Kategorien von interessierenden Nucleotidsequenzen umfassen z.B. jene Gene, die an Information beteiligt sind, wie z.B. Zinkfinger, jene, die an Kommunikation beteiligt sind, wie z.B. Kinasen, jene, die am Housekeeping beteiligt sind, wie z.B. Hitzeschockproteine, und jene, die an der Phloembeladung beteiligt sind, wie z.B. Transporter. Speziellere Kategorien von Transgenen umfassen z.B. Gene, die für die Agronomie wichtige Merkmale, Insektenresistenz, Krankheitsresistenz, Herbizidresistenz, Exsudateigenschaften und Handelsprodukte codieren. Interessierende Nucleotidsequenzen umfassen weiterhin im Allgemeinen jene, die an Öl-, Stärke-, Kohlenhydrat- oder Nährstoffmetabolismus beteiligt sind, sowie jene, die Korngröße, Saccharosebeladung, Nährstofftransport und dergleichen beeinflussen.
  • Argonomisch wichtige Merkmale, wie z.B. Öl-, Stärke- und Proteingehalt können gentechnisch unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren verändert werden. Modifikationen umfassen das Erhöhen des Gehalts an Ölsäure, gesättigten und ungesättigten Ölen, Erhöhen der Level an Lysin und Schwefel, Bereitstellen essentieller Aminosäuren und Modifizieren von Stärke. Hordothionin-Proteinmodifikationen sind in den US-Patentanmeldungen Serien-Nummern 08/838,763, eingereicht am 10. April 1997; 08/824,379, eingereicht am 26. März 1997; 08/824,382, eingereicht am 26. März 1997; und im US-Patent Nr. 5,703,049 beschrieben. Ein weiteres Beispiel ist Lysin- und/oder Schwefel-reiches Samenprotein, das von dem 2S-Albumin aus Sojabohne, beschrieben in der US-Seriennummer 08/618,911, eingereicht am 20. März 1996, und dem Chymotrypsininhibitor aus Gerste, Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, codiert werden.
  • Derivate der codierenden Sequenzen können durch ortsgerichtete Mutagenese erzeugt werden, um den Level an vorausgewählten Aminosäuren im codierten Polypeptid zu erhöhen. Beispielsweise ist das Gen, das für Gersten-Hochlysinpolypeptid (BHL) codiert, vom Gersten-Chymotrypsin-Inhibitor abgeleitet, siehe US-Seriennummer 08/740,682, eingereicht am 1. November 1996 und PCT/US 97/20441, eingereicht am 31. Oktober 1997. Andere Proteine umfassen Methionin-reiche Pflanzenproteine, wie z.B. aus Sonnenblumensamen (Lilley et al. (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, Hrsg. Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), S. 497-502; Mais (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene, 71:359); und Reis (Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123. Andere agronomisch bedeutende Gene codieren für Latex, Floury 2, Wachstumsfaktoren, Samenspeicherfaktoren und Transkriptionsfaktoren.
  • Die Getreide- bzw. Kornqualität wird widergespiegelt von Merkmalen, wie z.B. Gehalten und Typen von Ölen, gesättigt und ungesättigt, Qualität und Menge essentieller Aminosäuren und Cellulosegehalte. Bei Mais, modifizierte Hordothioninproteine, beschrieben in der US-Patentanmeldung, Seriennummer 08/838,763, eingereicht am 10. April 1997; 08/824,379, eingereicht am 26. März 1997; 08/824,382, eingereicht am 26. März 1997; und das US-Patent Nr. 5,703,049, erteilt am 30. Dezember 1997 stellen Beschreibungen von Modifikationen von Proteinen für die gewünschten Zwecke bereit.
  • Wirtschaftlich bedeutsame Merkmale ("commercial traits") können auch von einem Gen oder von Genen codiert werden, das/die z.B. Stärke für die Ethanolproduktion erhöhen könnten oder die Expression von Proteinen bereitstellen könnten. Eine weitere wichtige kommerzielle Verwendung transformierter Pflanzen ist die Produktion von Polymeren und Biokunststoffen, wie sie z.B. im US-Patent Nr. 5,602,321, erteilt am 11. Februar 1997, beschrieben werden. Gene, wie z.B. B-Ketothiolase, PHBase (Polyhydroxybutyratsynthase) und Acetoacetyl-CoA-Reduktase (siehe Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) erleichtern die Expression von Polyhydroxyalkanoaten (PHAs). Eine spezielle Ausführungsform der Erfindung umfasst Phloem-bevorzugte Expression dieser Polymere und Biokunststoffe, um das Sammeln und Ernten dieser Produkte aus dem Exsudat oder Pflanzensaft zu erleichtern.
  • Exogene Produkte umfassen Pflanzenenzyme und -produkte, sowie jene aus anderen Quellen, einschließlich Prokaryonten und anderen Eukaryonten. Derarige Produkte umfassen Enzyme, Co-Faktoren, Hormone und dergleichen. Die Gehalte an Proteinen, insbesondere modifizierte Proteine mit verbesserter Aminosäureverteilung zum Verbessern des Nährwerts der Pflanze, können gesteigert werden. Dies wird durch die Expression solcher Proteine mit verbessertem bzw. erhöhtem Aminosäuregehalt erreicht.
  • Die Expressionskassette, umfassend die erfindungsgemäße Promotorsequenz in funktioneller Verknüpfung mit einer interessierenden Nucleotidsequenz kann verwendet werden, um beliebige Pflanzenarten zu transformieren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Monocotyle und Dicotyle. Beispiele für Pflanzenarten von Interesse umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Mais (Zea mays), Brassica sp. (z.B. B. napus, B. rapa, B. juncea), insbesondere jene Brassica-Arten, die als Quellen für Samenöl verwendbar sind, Alfalfa (Medicago sativa), Reis (Oryza sativa), Roggen (Secale cereale), Sorghum (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Hirse (z.B., Perlhirse (Pennisetum glaucum), Rispenhirse (Panicum miliaceum), Borkenhirse (Setaria italica), Fingerhirse (Eleusine coracana)), Sonnenbluem (Helianthus annuus), Saflor (Carthamus tinctorius), Weizen (Triticum aestivum), Sojabohne (Glycine max), Tabak (Nicotiana tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum), Erdnüsse (Arachis hypogaea), Baumwolle (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), Süßkartoffel (Ipomoea batatus), Cassava (Manihot esculenta), Kaffee (Coffea spp.), Kokosnuß (Cocos nucifera), Ananas (Ananas comosus), Citrusbäume (Citrus spp.), Kakao (Theobroma cacao), Tee (Camellia sinensis), Bananen (Musa spp.), Avocado (Persea americana), Feige (Ficus casica), Guave (Psidium guajava), Mango (Mangifera indica), Olive (Olea europaea), Papaya (Carica papaya), Cashew (Anacardium occidentale), Macadamia (Macadamia integrifolia), Mandel (Prunus amygdalus), Zuckerrüben (Beta vulgaris), Zuckerrohr (Saccharum spp.), Hafer, Gerste, Gemüse, Zierpflanzen und Koniferen.
  • Gemüse umfassen Tomaten (Lycopersicon esculentum), Salat (z.B. Lactuca sativa) grüne Bohnen (Phaseolus vulgaris), Limabohnen (Phaseolus limensis), Erbsen (Lathyrus spp.) und Angehörige der Gattung Cucumis, wie z.B. Gurke (C. sativus), Cantalop (C. cantalupensis) und Zuckermelone (C. melo). Zierpflanzen umfassen Azaleen (Rhododendron spp.), Hydrangea bzw. Hortensie (Macrophylla hydrangea), Hibiscus (Hibiscus rosasanensis), Rosen (Rosa spp.), Tulpen (Tulipa spp.), Osterglocken (Narcissus spp.), Petunien (Petunia hybrida), Nelken (Dianthus caryophyllus), Poinsettia (Euphorbia pulcherrima) und Chrysantheme.
  • Koniferen, die beim Benutzen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, umfassen z.B. Kiefern, wie z.B. Taedakiefer (Pinus taeda), Karibische Kiefer (Pinus elliotii), Gelbkiefer (Pinus ponderosa), Drehkiefer (Pinus contorta) und Monterey-Kiefer (Pinus radiata); Douglasie (Pseudotsuga menziesili); Westamerikanische Hemlocktanne (Tsuga canadensis); Sitkafichte (Picea glauca); Küstenmammutbaum (Sequoia sempervirens); echte Tannen, wie z.B. Purpurtanne (Abies amabilis) und Balsamtanne (Abies balsamea); und Zedern, wie z.B. "Western red cedar" (Thuja plicata) und Nutka-Scheinzypresse (Chamaecyparis nootkatensis). Erfindungsgemäße Pflanzen sind bevorzugt Nutzpflanzen (z.B. Mais, Alfalfa, Sonnenblume, Brassica, Sojabohne, Baumwolle, Saflor, Erdnuss, Sorghum, Weizen, Hirse, Tabak usw.), stärker bevorzugt Mais- und Sojabohnenpflanzen, noch stärker bevorzugt Maispflanzen.
  • Transformationsprotokolle sowie Protokolle zum Einführen von Nucleotidsequenzen in Pflanzen können abhängig von dem Typ der Pflanze und der Pflanzenzelle, d.h. Monocotyl oder Dicotyl, die für die Transformation als Ziel genommen werden, variieren. Geeignete Verfahren zum Einführen von Nucleotidsequenzen in Pflanzenzellen und nachfolgende Insertion in das Pflanzengenom umfassen Mikroinjektion (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), Elektroporation (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), Agrobacterium-vermittelte Transformation (Townsend et al., US-Patent Nr. 5,563,055; Zhao et al., US-Patent Nr. 5,981,840), direkten Gentransfer (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722) und ballistische Partikelbeschleunigung (siehe z.B. Sauford et al., US-Patent Nr. 4,945,050; Tomes et al., US-Patent Nr. 5,879,918; Tomes et al., US-Patent Nr. 5,886,244; Bidney et al., US-Patent Nr. 5,932,782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment"; in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg und Phillips (Springer-Verlag, Berlin); und McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926). Siehe auch Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (Zwiebel); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (Sojabohne); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (Sojabohne); Finer und McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (Sojabohne); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (Sojabohne); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (Reis); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4305-4309 (Mais); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (Mais); Tomes, US-Patent Nr. 5,240,855; Buising et al., US-Patent Nrn. 5,322,783 und 5,324,646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (Mais); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (Mais); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (Mais); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen et al., US-Patent Nr. 5,736,369 (Getreide); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, Hrsg. Chapman et al. (Longman, New York), S. 197-209 (Pollen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell (Faser- bzw. Whisker-vermittelte Transformation); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505, Elektroporation); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 und Christou und Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (Reis); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (Mais über Agrobacterium tumefaciens).
  • Die Zellen, die transformiert worden sind, können auf herkömmlichen Wegen zu Pflanzen entwickelt werden. Siehe z.B. McCormick et al. (19986) Plant Cell Reports 5:81-84. Diese Pflanzen können dann gezüchtet werden und entweder mit dem gleichen transformierten Stamm oder unterschiedlichen Stämmen bestäubt werden und die resultierende Hybride mit Expression des gewünschten phänotypischen Merkmals können identifiziert werden. Es können zwei oder mehr Generationen gezüchtet werden, um sicherzustellen, dass die Expression des gewünschten phänotypischen Merkmals stabil beibehalten und vererbt wird; und dann können Samen geerntet werden, um sicherzustellen, dass die Expression des gewünschten phänotypischen Merkmals erzielt worden ist.
  • Die nachstehenden Beispiele werden zum Zweck der Erläuterung angegeben und nicht zum Zweck der Beschränkung.
  • EXPERIMENTE
  • Beispiel 1: Isolierung von Promotorsequenzen
  • Die Promotorregion für das für Prunasinhydrolyse codierende Prunus serotina-Gen wurde unter Verwendung des GenomeWalker KitTM (Clontech) aus Kirschbäumen isoliert. Die Sequenz für den Prunasinhydrolase-Promotor ist in SEQ ID NO: 1 angegeben. Die Sequenz für das Prunasinhydrolase-Operon, einschließlich der Prunasinhydrolase-Promotorregion, ist in SEQ ID NO: 3 angegeben. Die Nucleotide 989-2626 von SEQ ID NO: 3 codieren für ein Prunasinhydrolase-Polypeptid.
  • Genomische DNA wurde aus Blättern der Späten Traubenkirsche (Prunus serotina) unter Verwendung des "DNeasy Plant mini"-Kits (Qiagen Kat.# 69104) extrahiert. Das Protokoll in der niedergeschriebenen Form wurde befolgt (Ausgabe vom November 1999). Fünf GenomeWalkerTM-Bibliotheken wurden dann aus dieser genomischen DNA gemäß dem Handbuch für das "Universal GenomeWalkerTM-Kit" (Clontech K1807-1) erzeugt. Sie wurden unter Verwendung von stumpf ("blunt") schneidenden Enzymen erzeugt:
    Bibliothek Enzym
    DL-1 EcoRV
    DL-2 ScaI
    DL-3 DraI
    DL-4 PvuII
    DL-5 StuI
  • Genspezifische Primer (GSP1/SEQ ID NO: 7 und GSP2/SEQ ID NO: 8) wurden unter Verwendung einer bekannten Prunasinhydrolase-Sequenz (Genbank Eingangsnummer U50201) konstruiert.
  • GenomeWalkerTM-Primer für Prunasinhydrolase
    • GSP1/SEQ ID NO.: 7 5'-GTATCGAAATGGGTCCTGTTGAGAGT
    • GSP2/SEQ ID NO.: 8 5'-ATATGTCCCGGCAGCATTGGTATTTG
  • Dann wurden Amplifikationen gemäß dem Handbuch für den "Universal Genome-WalkerTM-Kit" durchgeführt, wobei der GSP1-Primer fü die erste GenomeWalkerTM- Amplifikation und GSP2 für die zweite Amplifikation verwendet wurden. In der DL-1-Bibliothek wurde eine 1,5 kb-Bande erzeugt. Dieses Fragment wurde in pGEMT-easy (Promega Kat.# A1360) cloniert und sequenziert. Ergebnisse aus der Sequenz wiesen darauf hin, dass in dem clonierten Produkt zwei verschiedene Produkte vorhanden waren. Sie wurden als DL1.4 und DL1.1 bezeichnet. Es wurde bestätigt, dass beide Produkte der Prunasinhydrolase genomisch benachbart sind, und zwar durch Amplifizieren von Produkten unter Verwendung von Vorwärtsprimern, die auf einer Sequenz aus den GenomeWalkerTM-Fragmenten beruhen, und Rückwärtsprimern aus der Prunasinhydrolase-Sequenz. Sobald sie bestätigt waren, wurden die PH DL1.1- und PH DL1.4-Promotoren dann aus der genomischen DNA der späten Traubenkirsche amplifiziert, wobei die unten stehenden Primer verwendet wurden, um NcoI-Stellen am Start-Codon hinzuzufügen. Die erzeugten Fragmente wurden in pGEMT-easy cloniert und zur Bestätigung sequenziert.
  • PCR-Primer für den Prunasinhydrolase-Promotor
  • DL1.1/SEQ ID NO: 5:
    • Produkt der Länge 1260 (Bemessung: 162 setzt NcoI an das Start-Codon)
    • Tm: 74,5°C TaOpt: 54,0°C GC: 36,8
    • SEQ ID NO.: 9 ACCGTGCGAAAGGTCTTCTTG
    • SEQ ID NO.: 10 ATGCCATGGCTGAGAGGAGGG
  • DL1.4/SEO ID NO: 1:
    • Produkt der Länge 871 (Bemessung: 162)
    • (setzt NcoI an das Start-Codon)
    • Tm: 73,7°C TaOpt: 55,6°C GC: 35,6
    • SEQ ID NO.: 11 GGGGTGCTTACACCCACAATCATCC
    • SEQ ID NO.: 12 GCAATGCCATGGCTCAGTGGAG
  • Beispiel 2: Transformation und Regeneration transgener Pflanzen
  • Unreife Maisembryonen aus Gewächshaus-Donorpflanzen wurden mit einem Plasmid, enthaltend den Prunasinhydrolase-Promotor in funktioneller Verknüpfung mit einer heterologen Nucleotidsequenz und dem selektierbaren Marker-Gen PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37), das Resistenz gegenüber dem Herbizid Bialaphos verleiht, bombadiert. Alternativ wird das selektierbare Markergen auf einem separaten Plasmid bereitgestellt. Die Transformation wird durchgeführt wie folgt: Rezepte für Medien folgen nachstehend.
  • Präparation von Zielgewebe
  • Die Ähren werden von den Lieschblättern befreit ("husked") und in 30%igem Blechmittel plus 0,5% Detergens 20 Minuten lang oberflächensterilisiert und zweimal mit sterilem Wasser gespült. Die unreifen Embryonen werden exzidiert und mit der Embryo-Achse nach unten (Schildchenseite nach oben) zu 25 Embryonen pro Platte für 4 Stunden auf 560Y-Medium gelegt und dann zur Vorbereitung der Bombardierung innerhalb der 2,5-cm-Zielzone angeordnet.
  • DNA-Präparation
  • Ein Plasmidvektor, umfassend den Prunasinhydrolase-Promotor in funktioneller Verknüpfung mit einer heterologen Nucleotidsequenz, wird hergestellt. Dieser Vektor plus ein selektierbarer PAT-Marker, entweder mit gleichen oder einem separaten Vektor, werden auf Wolframpellets mit einem mittleren Durchmesser von 1,1 μm unter Verwendung einer CaCl2-Präzipitationsverfahrensweise wie folgt präzipitiert bzw. aufgefällt:
    100 μl vorbereitete Wolframpartikel in Wasser
    10 μl (1 μg) DNA in Tris-EDTA-Puffer (1 μg Gesamt-DNA)
    100 μl 2,5 M CaCl2
    10 μl 0,1 M Spermidin
  • Jedes Reagenz wird sequenziell zu der Wolframpartikelsuspension gegeben, während diese in der Vortex-Vorrichtung für mehrere Röhrchen verbleibt. Das endgültige Gemisch wird kurz ultraschallbehandelt und unter konstanter Vortex-Behandlung 10 Minuten lang inkubieren gelassen. Nach der Präzipitationszeitdauer werden die Röhrchen kurz zentrifugiert, die Flüssigkeit wird entfernt, und es wird mit 500 ml 100% Ethanol gewaschen und 30 Sekunden lang zentrifugiert. Danach wird die Flüssigkeit entfernt und 105 μl 100% Ethanol werden zu dem endgültigen Wolframpartikel-Pellet zugegeben. Für die Partikelkanonenbombardierung werden die Wolfram/DNA-Partikel kurz ultraschallbehandelt und 10 μl werden auf das Zentrum jedes "Macrocarriers" aufgetüpfelt und vor der Bombardierung näherungsweise 2 Minuten trocknen gelassen.
  • Partikelkanonenbehandlung
  • Die Probenplatten werden bei Einstellung #4 in einer Partikelkanone #HE34-1 oder #HE34-2 bombardiert. Alle Proben empfangen einen einzigen Schuss bei 650 PSI, wobei eine Gesamtzahl von Aliquots aus jedem Röhrchen vorbereiteter bzw. hergestellter Partikel/DNA entnommen wurde.
  • Nachfolgende Behandlung
  • Im Anschluss an die Bombardierung werden die Embryonen 2 Tage lang auf 560Y-Medium gehalten, dann werden sie auf 560R-Selektivmedium, enthaltend 3 mg/Liter Bialaphos, transferiert und alle 2 Wochen subkultiviert. Nach näherungsweise 10 Wochen der Selektion werden selektionsresistente Callusklone auf 288J-Medium transferiert, um die Pflanzenregeneration zu initiieren. Anschließend an die Reifung somatischer Embryonen (2-4 Wochen) werden gut entwickelte somatische Embryonen auf Keimungsmedium transferiert und in den beleuchteten Kulturraum gebracht. Ungefähr 7-10 Tage später werden sich entwickelnde Pflänzchen für 7-10 Tage auf hormonfreies 272V-Medium in Röhrchen transferiert, bis die Pflänzchen gut entwickelt bzw. etabliert sind. Die Pflanzen werden dann auf Einsätze in Flachpaletten ("flats") (entsprechend einem 2,5-Zoll-Topf), die Topferde enthalten, transferiert und 1 Woche lang in einer Wachstumskammer gezogen bzw. wachsen gelassen, nachfolgend weitere 1-2 Wochen im Gewächshaus gezogen und dann in klassische Töpfe vom Typ 600 (1,6 Gallonen) transferiert und bis zur Reife gezogen. Die Pflanzen werden hinsichtlich der Expression der heterologen Nucleotidsequenz überwacht und bewertet.
  • Bombardierungs- und Kulturmedien
  • Bombardierungsmedium (560Y) umfasst 4,0 g/l N6-Basalsalze (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l Eriksson's Vitaminmischung (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l Thiamin-HCl, 120,0 g/l Saccharose, 1,0 mg/l 2,4-D und 2,88 g/l L-Prolin (Volumen mit D-I H2O eingestellt, anschließend an Einstellung auf pH 5,8 mit KOH); 2,0 g/l Gelrite (nach Einstellung des Volumens mit D-I H2O) zugegeben); und 8,5 mg/l Silbernitrat (nach Sterilisieren des Medium und Abkühlen auf Raumtemperatur zugegeben). Selektivmedium (560R) enthält 4,0 g/l N6-Basalsalze (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l Erikssons's Vitamin-Mischung (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l Thiamin-HCl, 30,0 g/l Saccharose und 2,0 mg/l 2,4-D (Volumen mit D-I H2O eingestellt, anschließend an Einstellung auf pH 5,8 mit KOH); 3,0 g/l Gelrite (zugegeben nach Einstellen des Volumens mit D-I H2O); und 0,85 mg/l Silbernitrat und 3,0 mg/l Bialaphos (beide nach Sterilisieren des Mediums und Abkühlen auf Raumtemperatur zugegeben).
  • Pflanzenregenerationsmedium (288J) enthält 4,3 g/l MS-Salze (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l MS-Vitaminstammlösung (0,100 g Nicotinsäure, 0,02 g/l Thiamin-HCl, 0,10 g/l Pyridoxin-HCl und 0,40 g/l Glycin, Volumen mit gereinigtem D-I H2O eingestellt) (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l Myo-Inositol, 0,5 mg/l Zeatin, 60 g/l Saccharose und 1,0 ml/l 0,1 mM Abscisinsäure (Volumen mit gereinigtem D-I H2O einge stellt nach Einstellung auf pH 5,6); 3,0 g/l Gelrite (zugegeben nach Einstellen des Volumens mit D-I H2O) und 1,0 mg/l Indolessigsäure und 3,0 mg/l Bialaphos (nach Sterilisieren des Mediums und Abkühlen auf 60°C zugegeben). Hormonfreies Medium (272V) enthält 4,3 g/l MS-Salze (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l MS-Vitamin-Stammlösung (0,100 g/l Nicotinsäure, 0,02 g/l Thiamin-HCl, 0,10 g/l Pyridoxin-HCl und 0,40 g/l Glycin, Volumen mit gereinigtem D-I H2O eingestellt), 0,1 g/l Myo-Inositol und 40,0 g/l Saccharose (Volumen mit gereinigtem D-I H2O eingestellt nach Einstellen des pH-Werts auf 5,6), und 6 g/l Bacto-Agar (zugegeben nach Einstellen des Volumens mit gereinigtem D-I H2O), sterilisiert und abgekühlt auf 60°C.
  • Beispiel, 3: Agrobacterium-vermittelte Transformation von Mais
  • Für Agrobacterium-vermittelte Transformation von Mais mit einem erfindungsgemäßen Prunasinhydrolase-Promotor wird bevorzugt das Verfahren von Zhao eingesetzt (US-Patent Nr. 5,981,840 und PCT-Patentveröffentlichung WO 98/32326; deren Inhalte hierin durch Literaturverweis aufgenommen sind). Kurz gesagt, werden unreife Embryonen aus Mais isoliert und die Embryonen werden mit einer Agrobacterium-Suspension in Kontakt gebracht, wobei die Bakterien zum Übertragen des Prunasinhydrolase-Promotors in funktioneller Verknüpfung mit einer heterologen Nucleotidsequenz von Interesse auf wenigstens eine Zelle wenigstens eines der unreifen Embryonen (Stufe 1: die Infektionsstufe) fähig, sind. In dieser Stufe werden die unreifen Embryonen bevorzugt in eine Agrobacterium-Suspension zum Starten der Inokulation eingetaucht. Die Embryonen werden für einige Zeit mit dem Agrobacterium co-kultiviert (Stufe 2: die Co-Kultivierungsstufe). Die unreifen Embryonen werden anschließend an die Infektionsstufe bevorzugt auf festem Medium kultiviert. Anschließend an diesen Co-Kultivierungszeitraum wird eine optionale "Ruhe"-Stufe erwogen. In dieser Ruhe-Stufe werden die Embryonen in Gegenwart von wenigstens einem Antibiotikum, von dem bekannt ist, dass es das Wachstum von Agrobacterium hemmt, ohne die Zugabe eines selektiven Wirkstoffs für Pflanzentransformanten inkubiert (Stufe 3: Ruhe-Stufe). Bevorzugt werden die unreifen Embryonen auf festem Medium mit Antibiotikum, aber ohne einen selektierenden Wirkstoff für die Eliminierung von Agrobacterium und für eine Ruhephase für die infizierten Zellen kultiviert. Als Nächstes werden die inokulierten Embryonen auf einem Medium kultiviert, das einen selektiven Wirkstoff enthält, und wachsender transformierter Callus wird gewonnen (Stufe 4: die Selektionsstufe). Bevorzugt werden die unreifen Embryonen auf festem Medium mit einem selektiven Wirkstoff kultiviert, was das selektive Wachs tum transformierter Zellen bewirkt. Der Callus wird dann zu Pflanzen regeneriert (Stufe 5: die Regenerationsstufe), und bevorzugt werden auf Selektivmedium gewachsene bzw. gezüchtete Calli auf festem Medium kultiviert, um die Pflanzen zu regenerieren.
  • Transformation eines Gus-Fusionskonstrukts in Mais
  • Ein Konstrukt, enthaltend den Prunasinhydrolase-Promotor fusiert bzw. verknüpft mit GUS, wurde verwendet, um Mais gemäß dem Verfahren von Zhao supra, zu transformieren. Pro Ereignis wurde eine Gesamtzahl von drei Pflanzen erzeugt und in das Gewächshaus verbracht.
  • GUS-Detektionsprotokoll
  • Verschiedene, von transgenen Pflanzen gesammelte Gewebeproben wurden per Hand geschnitten und GUS-Expressionsmuster wurden histochemisch durch Färben in einer Färbelösung bei 37°C über Nacht untersucht. Die Lösung enthielt 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,1% Triton X-100 und 0,5 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-gluc). Das in den Zellen, die die Transgene exprimieren, produzierte GUS-Enzym würde X-gluc in situ zu einem blauen Präzipitat umwandeln, was die Lokalisierung der Transgene ermöglicht (Jefferson et al., 1987 EMBO J. 6:3901). Das Chlorophyll aus grünen Geweben wurde mit 75% Ethanol gebleicht, um die Visualisierung bzw. das Sichtbarmachen der blauen Färbung aus der GUS-Expression zu erleichtern. Dann wurden die Gewebeschnitte untersucht und unter einem Präpariermikroskop fotografiert.
  • GUS-Expression in Mais
  • Blattmittelrippenproben aus 16 Ereignissen wurden auf GUS-Expression überwacht. 15 der 16 Ereignisse enthielt eine detektierbare Färbung unter Verwendung des histochemischen Assays. Pflanzen für 10 Ereignisse wurden auf zufällige Weise für weitere Untersuchungen bzw. Überwachungen ausgewählt, wobei Proben von fünf dieser Ereignisse an mehreren Zeitpunkten genommen wurden, um die Expression in sich entwickelnden Körnern zu detektieren. Eine Vielfalt an Geweben und Organen wurde überwacht und die GUS-Expression wurde konsistent bzw. beständig in den Gefäßbündeln bzw. Leitbündeln gefunden. Bei einigen Gewebeschnitten wurde auch eine Diffusion in umgebende Zellen nahe der Gefäßbündel beobachtet. Die an diesen Pflanzen gesammelten Expressionsdaten weisen darauf hin, dass der Prunasin-Promotor in Mais vollständig aktiv war und dass seine Spezifität für Gefäßgewebe erhalten blieb.
  • Die 3 und 4 beschreiben weiterhin die mit der Mais-Transformation mit dem GUS/Prunasin-Promotor-Konstrukt verbundene Gefäßgewebe-Expression detaillierter.
  • Beispiel 4: Sojabohnenembryo-Transformation
  • Sojabohnenembryos werden mit einem Plasmid, enthaltend den Prunasinhydrolase-Promotor in funktioneller Verknüpfung mit einer heterologen Nucleotidsequenz von Interesse (1), wie folgt bombardiert. Um somatische Embryonen zu induzieren, werden 3-5 mm lange Keimblätter aus oberflächensterilisierten unreifen Samen des Sojabohnen-Kultivars A2872 dissektiert und unter Licht oder im Dunklen bei 26°C auf einem geeigneten Agarmedium sechs bis zehn Wochen lang kultiviert. Somatische Embryonen, die sekundäre Embryonen produzieren, werden dann exsidiert und in ein geeignetes Flüssigmedium gegeben. Nach wiederholter Selektion auf Cluster bzw. Klumpen somatischer Embryonen, die sich als frühe Embryonen der globulären Stufe vervielfältigen, werden die Suspensionen wie nachstehend beschrieben aufrecht erhalten.
  • Embryogene Sojabohnen-Suspensionskulturen können in 35 ml Flüssigmedium auf einem Rotationsschüttler, 150 U/min, bei 26°C mit Fluoreszenzlampen bzw. Leuchtstofflampen bei einem Tag/Nacht-Zeitplan von 16:8 Stunden aufrecht erhalten werden. Die Kulturen werden alle zwei Wochen durch Inokulieren von näherungsweise 35 mg Gewebe in 35 ml Flüssigmedium subkultiviert.
  • Embryogene Sojabohnen-Suspensionskulturen können dann durch das Verfahren der Partikelkanonenbombardierung (Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70-73, US-Patent Nr. 4,945,050) transformiert werden. Für diese Transformationen kann ein Instrument mit der Bezeichnung Du Pont Biolistic PDS1000/HE (Helium-Umrüstung) verwendet werden.
  • Ein selektierbares Marker-Gen, das verwendet werden kann, um die Sojabohnen-Transformation zu erleichtern, ist ein Transgen, bestehend aus dem 35S-Promotor aus dem Blumenkohlmosaik-Virus (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), dem Hygromycin-Phosphortransferase-Gen aus dem Plasmid pJR225 (aus E. coli; Gritz et al. (1983) Gene 25:179-188) und der 3'-Region des Nopalinsynthase-Gens aus der T-DNA des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens. Die Expressionskassette, umfassend den Prunasinhydrolase-Promotor in funktioneller Verknüpfung mit der heterologen Nucleotidsequenz, kann als ein Restriktionsfragment isoliert werden. Dieses Fragment kann dann in eine singuläre Restriktionsstelle des Vektors, der das Markergen trägt, inseriert werden.
  • Zu 50 μl einer 60 mg/ml-Lösung von 1 μm Goldpartikeln wird zugegeben (in dieser Reihenfolge): 5 μl DNA (1 μg/μl), 20 μl Spermidin (0,1 M) und 50 μl CaCl2 (2,5 M). Die Partikelzubereitung wird dann 3 Minuten lang geschüttelt, in einer Mikrozentrifuge 10 Sekunden lang zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt. Die DNA-beschichteten Partikel werden dann einmal in 400 μl 70% Ethanol gewaschen und in 40 μl wasserfreiem Ethanol resuspendiert. Die DNA/Partikel-Suspension kann dreimal für jeweils 1 Sekunde ultraschallbehandelt werden. Fünf Mikroliter der DNA-beschichteten Goldpartikel werden dann auf jede "Macrocarrier"-Scheibe geladen.
  • Näherungsweise 300-400 mg einer zwei Wochen alten Suspensionskultur werden in eine leere Petrischale mit den Abmessungen 60 × 15 mm gegeben, und die Restflüssigkeit wird mit einer Pipette aus dem Gewebe entfernt. Für jedes Transformationsexperiment werden normalerweise näherungsweise 5-10 Platten an Gewebe bombardiert. Der Membran-Berstdruck wird auf 1100 psi eingestellt, und die Kammer wird auf ein Vakuum von 28-Zoll Quecksilbersäule evakuiert. Das Gewebe wird näherungsweise 2,5 Zoll von dem Rückhalteschirm entfernt platziert und dreimal bombardiert. Anschließend an die Bombardierung kann das Gewebe hälftig aufgeteilt und zurück in die Flüssigkeit gegeben werden und wie oben stehend beschrieben kultiviert werden.
  • Fünf bis sieben Tage nach der Bombardierung kann das Flüssigmedium durch frisches Medium ersetzt werden und elf bis zwölf Tage nach der Bombardierung mit frischem Medium, das 50 mg/ml Hygromycin enthält. Dieses Selektivmedium kann wöchentlich aufgefrischt werden. Sieben bis acht Wochen nach der Bombardierung kann grünes, transformiertes Gewebe beobachtet werden, das aus untransformierten nekrotischen embryogenen Haufen herauswächst. Isoliertes grünes Gewebe wird entfernt und in einzelne Kolben inokuliert, um neue, klonal vermehrte, transformierte embryogene Suspensionskulturen zu erzeugen. Jede neue Linie kann als ein unabhängiges Transformationsereignis behandelt werden. Diese Suspensionen können dann als Haufen unreifer Embryonen subkultiviert und erhalten werden oder sie können durch Reifung und Keimung individueller somatischer Embryonen zu vollständigen Pflanzen regeneriert werden.
  • Beispiel 5: Transformation von Sonnenblumenmeristemgewebe
  • Sonnenblumenmeristemgewebe werden transformiert mit einer Expressionskassette, enthaltend den Prunasinhydrolase-Promotor in funktioneller Verknüpfung mit einer heterologen Nucleotidsequenz, wie folgt (siehe auch das Europäische Patent Nr. EP 0 486 233 , hierin durch Literaturverweis aufgenommen, und Malone-Schoneberg et al. (1994) Plant Science 103:199-207). Reife Sonnenblumensamen (Helianthus annuus L.) werden unter Verwendung einer Dreschvorrichtung für einzelne Weizenähren ("single wheat-head thresher") entspelzt bzw. geschält. Die Samen werden 30 Minuten lang in einer 20%igen Cloroxs-Blechlösung oberflächensterilisiert, wobei pro 50 ml Lösung zwei Tropfen Tween 20 zugegeben sind. Die Samen werden mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen.
  • Embryonalachsenspalt-Explantate ("split embryonic axis explants") werden mittels einer Modifikation der von Schrammeijer et al. (Schrammeijer et al. (1990) Plant Cell Rep. 9:55-60) beschriebenen Verfahrensweisen hergestellt. Die Samen werden anschließend an die Oberflächensterilisationsprozedur 60 Minuten lang in destilliertes Wasser eingetaucht. Dann werden die Keimblätter jedes Samens abgebrochen, wobei auf der Ebene der Embryonalachse ein sauberer Bruch erzeugt wird. Anschließend an die Exzision der Wurzelspitze werden die Explantate in Längsrichtung zwischen den Primordialblättern halbiert. Die zwei Hälften werden mit der Schnittfläche nach oben auf GBA-Medium platziert, das aus mineralischen Bestandteilen nach Murashige und Skoog (Murashige et al. (1962) Physiol. Plant. 15:473-497), Shepard's-Vitaminzusätzen (Shepard (1980) in Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops (University of Minnesota Press, St. Paul, Minnesota), 40 mg/l Adeninsulfat, 30 g/l Saccharose, 0,5 mg/l 6-Benzylaminopurin (BAP), 0,25 mg/l Indol-3-essigsäure (IAA), 0,1 mg/l Gibberellinsäure (GA3), pH 5,6, und 8 g/l Phytagar besteht.
  • Die Explantate werden vor der Agrobacterium-Behandlung einer Mikroprojektil-Bombardierung unterworfen (Bidney et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:301-313). Für diese Behandlung werden dreißig bis vierzig Explantate in einen Kreis im Zentrum einer Platte mit den Abmessungen 60 × 20 mm angeordnet. Näherungsweise 4,7 mg 1,8 mm-Wolframmikroprojektile werden in 25 ml sterilem TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert, und es werden Aliquots von 1,5 ml pro Bombardierung verwendet. Jede Platte wird zweimal durch einen 150 mm Nytex-Schirm bombardiert, der 2 cm oberhalb der Proben in einer Partikelbeschleunigungsvorrichtung mit der Bezeichnung PDS 1000® angeordnet ist.
  • In allen Transformationsexperimenten wird der entschärfte Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA105 verwendet. Ein binärer Plasmidvektor, umfassend die Expressionskassette, die den Prunasinhydrolase-Promotor in funktioneller Verknüpfung mit der heterologen Nucleotidsequenz enthält, wird in den Agrobacterium-Stamm EHA105 über Gefrieren-Auftauen, wie von Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187 beschrieben, einge führt. Dieses Plasmid umfasst ferner ein Kanamycin-selektierbares Markergen (d.h. nptII). Bakterien für Pflanzentransformationsfermente werden über Nacht (28°C und 100 U/min kontinuierliches Schütteln) in flüssigem YEP-Medium (10 gm/l Hefeextrakt, 10 gm/l Bactopepton und 5 gm/l NaCl, pH 7,0) mit den entsprechenden Antibiotika gezüchtet bzw. kultiviert, die für die Erhaltung des Bakterienstammes und des binären Plasmids erforderlich sind. Die Suspension wird verwendet, wenn sie eine OD600 von näherungsweise 0,4 bis 0,8 erreicht. Die Agrobacterium-Zellen werden pelletiert und in einem Okulationsmedium, bestehend aus 12,5 mM MES, pH 5,7, 1 gm/l NH4Cl und 0,3 gm/l MgSO4, zu einer endgültigen OD600 von 0,5 resuspendiert.
  • Frisch bombardierte Explantate werden in eine Agrobacterium-Suspension gegeben, gemischt und 30 Minuten lang ungestört stehen gelassen. Die Explantate werden dann auf GBA-Medium transferiert und mit der Schnittfläche nach unten bei 26°C und 18-Stunden-Tagen kultiviert. Nach drei Tagen der Co-Kultivierung werden die Transplantate auf 374B (GBA-Medium, dem Wachstumsregulatorenfehlen, und mit einem verringerten Saccharosegehalt von 1%), supplementiert mit 250 mg/l Cefotaxim und 50 mg/l Kanamycinsulfat, transferiert. Die Explantate werden zwei bis fünf Wochen lang auf Selektions- bzw. Selektivmedium kultiviert und dann auf frisches 374B-Medium ohne Kanamycin für ein oder zwei Wochen fortgesetzter Entwicklung transferiert. Explantate mit sich differenzierenden, Antibiotika-resistenten Wachstumsbereichen, die keine zur Exzision geeigneten Schösslinge bzw. Triebe gebildet haben, werden für eine zweite dreitägige Phytohormon-Behandlung auf GBA-Medium, das 250 mg/l Cefotaxim enthält, transferiert. Blattproben aus grünen Kanamycin-resistenten Trieben werden mittels ELISA auf das Vorhandensein von NPTII und durch Untersuchen bzw. Testen auf durch den Prunasinhydrolase-Promotor gesteuerte Expression der heterologen Nucleotidsequenz auf das Vorhandensein von Transgenexpression untersucht.
  • NPTII-positive Triebe werden in vitro gezüchtete Sonnenblumen-Sämlingsunterlagen vom Typ Pioneer®-Hybrid 6440 gepfropft. Oberflächen-sterilisierte Samen werden in 48-0-Medium (halbkonzentrierte Salze nach Murashige und Skoog, 0,5% Saccharose, 0,3% Gelrite, pH 5,6) gekeimt bzw. zum Keimen gebracht und unter den für Explantatkultur beschriebenen Bedingungen wachsen gelassen. Der obere Teil des Sämlings wird entfernt, ein vertikaler Einschnitt von 1 cm wird im Hypocotyl hergestellt und der transformierte Trieb wird in den Schnitt eingefügt. Der gesamte Bereich wird mit Parafilm eingewickelt, um den Trieb zu sichern. Nach einer Woche der in vitro-Kultur können gepfropfte Pflanzen auf Erde transferiert werden. Die Pfropfungen in Erde werden unter Bedingungen hoher Feuchtigkeit gehalten, gefolgt von einer langsamen Gewöhnung an die Gewächshausumgebung. Transformierte Sektoren bzw. Bereiche von T0-Pflanzen (Elterngeneration), die im Gewächshaus reifen, werden durch NPTII-ELISA und/oder Untersuchung der Transkriptionsaktivität von Blattextrakten identifiziert, während transgene Samen, die von NPTII-positiven T0-Pflanzen geerntet werden, durch Untersuchung der Transkriptionsaktivität von kleinen Teilen des Keimblatts trockener Samen identifiziert werden.
  • Ein alternatives Sonnenblumen-Transformationsprotokoll ermöglicht das Erhalten transgener Nachkommenschaft ohne die Verwendung eines chemischen Selektionsdrucks. Samen werden entspelzt und 20 Minuten lang in einer 20%igen Clorox-Blechlösung, der pro 100 ml Lösung zwei bis drei Tropfen Tween 20 zugegeben sind, oberflächensterilisiert, dann dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Sterilisierte Samen werden im Dunklen bei 26°C 20 Stunden lang auf mit Wasser befeuchtetem Filterpapier quellen gelassen. Die Keimblätter und die Wurzelanlage ("root radical") werden entfernt und die Meristem-Explantate werden auf 374E (GBA-Medium, bestehend aus MS-Salzen, Shepard-Vitaminen, 40 mg/l Adeninsulfat, 3% Saccharose, 0,5 mg/l 6-BAP, 0,25 mg/l IAA, 0,1 mg/l GA und 0,8% Phytagar bei pH 5,6) 24 Stunden lang im Dunklen kultiviert. Die Primärblätter werden entfernt, um das apicale Meristem freizulegen, rund 40 Explantate werden mit aufwärts weisendem Wachstumskegel in einem 2 cm-Kreis im Zentrum von 374 M (GBA-Medium mit 1,2% Phytagar) angeordnet und auf dem Medium 24 Stunden lang im Dunklen kultiviert.
  • Näherungsweise 18,8 mg 1,8 μm-Wolframpartikel werden in 150 μl absolutem Ethanol resuspendiert. Nach Ultraschallbehandlung werden 8 μl davon auf das Zentrum der Oberfläche eines Makrocarriers aufgetropft. Jede Platte wird zweimal mit 650 psi-Berstscheiben im ersten Einschub bei 26 mm Hg Heliumkanonenvakuum bombardiert.
  • Das Plasmid von Interesse wird wie vorstehend beschrieben über Gefrieren/Auftauen in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA105 eingeführt. Das Pellet über Nacht bei 28°C in einem flüssigen YEP-Medium (10 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Bactopepton und 5 g/l NaCl, pH 7,0) in Gegenwart von 50 μg/l Kanamycin gewachsener Bakterien wird in einem Inokulationsmedium (12,5 mM 2-mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, MES, 1 g/l NH4Cl und 0,3 g/l MgSO4 bei pH 5,7) resuspendiert, um eine Endkonzentration von 4,0 bei OD600 zu erreichen. Partikel-bombardierte Explantate werden auf GBA-Medium (374E) transferiert und ein Tröpfchen Bakteriensuspendion wird direkt auf die Spitze des Meristems gegeben. Die Explantate werden auf dem Medium 4 Tage lang co-kultiviert, wonach die Explantate auf 374C-Medium (GBA mit 1% Saccharose und ohne BAP, IAA, GA3 und mit 250 μg/ml Cefotaxim supplementiert) transferiert werden. Die Pflänzchen werden für näherungsweise zwei Wochen unter den Inkubationsbedingungen eines 16-Stunden-Tages und 26°C kultiviert.
  • Explantate (näherungsweise 2 cm lang) aus 2-wöchigen Kulturen in 374C-Medium werden unter Verwendung auf dem Fachgebiet bekannten Assays, wie z.B. Northern Blot, auf Expression durchmustert bzw. gescreent. Nachdem positive (d.h. für durch den Prunasinhydrolase-Promotor gesteuerte Expression) Explantate identifiziert sind, werden jene Triebe, die keine durch den Prunasinhydrolase-Promotor gesteuerte Expression aufweisen, verworfen und jedes positive Explantat wird in nodale Explantate unterteilt. Ein nodales Explantat enthält wenigstens ein potentielles Nodium. Die nodalen Abschnitte werden dann 3 bis 4 Tage lang auf GBA-Medium kultiviert, um die Bildung von Nebenknospen ("auxiliary buds") aus jedem Nodium zu fördern. Sie werden dann auf 374C-Medium transferiert und für weitere 4 Wochen entwickeln gelassen. Sich entwickelnde Knospen werden separiert und weitere 4 Wochen auf 374C-Medien kultiviert. Vereinigte bzw. gepoolte Blattproben von jedem neu erhaltenen Trieb werden wieder mittels des geeigneten Proteinaktivitätsassays durchmustert. Zu diesem Zeitpunkt werden die aus einem einzelnen Nodium gewonnenen positiven Triebe im Allgemeinen in dem transgenen Sektor angereichert worden sein, der im anfänglichen Assay vor der Nodienkultur detektiert worden ist.
  • Gewonnene Triebe, die positiv sind hinsichtlich von Prunasinhydrolase-Promotorregulierter Expression, werden auf in vitro-gezüchtete Sonnenblumensämlingsunterlagen vom Typ Pioneer Hybrid 6440 gepfropft. Die Unterlagen werden auf die folgende Weise hergestellt. Samen werden entspelzt und 20 Minuten lang in einer 20%igen Clorox-Bleichlösung, der pro 100 ml Lösung zwei bis drei Tropfen Tween 20 zugegeben sind, oberflächensterilisiert und werden dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die sterilisierten Samen werden auf dem mit Wasser befeuchteten Filter drei Tage lang keimen gelassen, dann werden sie auf Medium 48 (halb-konzentriertes MS-Salz, 0,5% Saccharose, 0,3% Gelrit, pH 5,0) transferiert und bei 26°C im Dunklen drei Tage lang wachsen gelassen, dann unter Kulturbedingungen eines 16-Stunden-Tages inkubiert. Der obere Teil ausgewählter Sämlinge wird entfernt, ein vertikaler Einschnitt wird in jedem Hypocotyl hergestellt und ein transformierter Trieb wird in einen V-Schnitt eingefügt. Der Schnittbereich wird mit Parafilm umhüllt. Nach einer Woche der Kultur auf dem Medium werden die gepfropften Pflanzen auf Erde transferiert. In den ersten zwei Wochen werden sie unter Bedingungen hoher Feuchtigkeit gehalten, um sie an eine Gewächshausumgebung zu gewöhnen.
  • Beispiel 6: Transformation eines GUS-Fusionskonstrukts in Arabidopsis
  • Ein Konstrukt, enthaltend den mit GUS fusionierten bzw. verknüpften Prunasinhydrolase-Promotor, wurde verwendet, um Arabidopsis nach dem Verfahren von Bechtold und Pelletier zu transformieren. (N. Bechtold und G. Pelletier; In Planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vakuum infiltration, in Arabidopsis Protocols. Methods in Molekcular Biology, Band 82, S. 259-266 (J. M. Martinez-Zapater und J. Salinas, Hrsg., Humana Press, Totowa, New Jersey).
  • Arabidopsis-Transformation
  • 4-6 Wochen alte Arabidopsis-Pflanzen wurden vorsichtig aus der Erde entfernt, um die Wurzelsysteme unbeschädigt zu lassen. Die Wurzeln wurden mit Wasser gewaschen, um jegliche an ihnen anhaftende Erdpartikel zu entfernen. 25-50 Pflanzen wurden in eine Aluminiumwanne gegeben. Eine zweite durchlöcherte bzw. perforierte Wanne der gleichen Größe wurde auf der ersten Wanne angeordnet, um eine Bewegung der Pflanzen zu verhindern. Dann wurde eine Agrobacterium-Suspension in die Wannen gegossen. Die Wannen wurden in eine 101-Vakuumkammer eingestellt. Ein Vakuumdruck von 104 Pa (0,1 atm) wurde 20 Minuten lang angelegt. Während der Vakuumbehandlung wurde eine mit Kompost, "treat" und Wasser gefüllte Kunststoffwanne vorbereitet. Das Vakuum wurde vorsichtig abgebaut, und die Wannen wurden aus der Kammer entnommen. Die infiltrierten Pflanzen wurden unverzüglich wieder eingesetzt und mit einer perforierten Kunststoffumhüllung oder einem Samenwanneninkubator ("seed tray incubator") mit Wasser darunter abgedeckt. Die Abdeckung wurde von den Pflanzen nach 3-4 Tagen entfernt. Die Pflanzen wurden unter moderaten Wässern weiter wachsen gelassen, bis die gewünschte Reife erreicht war.
  • GUS-Detektionsprotokoll
  • Verschiedene von transgenen Pflanzen gesammelte Gewebeproben wurden per Hand geschnitten und GUS-Expressionsmuster wurden histochemisch untersucht, indem über Nacht eine Färbelösung bei 37°C gefärbt wurde. Die Lösung enthielt 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,1% Triton X-100 und 0,5 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-glucuronid (X-gluc). Das in Zellen, die die Transgene exprimieren, produzierte GUS-Enzym würde X-gluc in situ zu einem blauen Präzipitat umwandeln, was die Lokalisierung der Transgene ermöglicht (Jefferson et al., 1987, EMBO J. 6:3901). Chlorophyl aus grünen Geweben wurde mit 75% Ethanol gebleicht, um die Visualisierung der blauen Färbung aus der GUS-Expression zu erleichtern. Gewebeschnitte wurden dann untersucht und unter einem Präpariermikroskop fotografiert.
  • 5 beschreibt detaillierter die Gefäßgewebeexpression, die mit Arabidopsis-Transformation unter Verwendung des GUS/Prunasin-Promotor-Konstrukts verbunden ist. SEQUENZLISTE
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Claims (29)

  1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das Transkription auf eine für Gefäßgewebe spezifische Weise initiiert, mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer Nukleotidsequenz, umfassend die in SEQ ID NO.: 1 oder SEQ ID NO.: 2 angegebene Sequenz; (b) einer Nukleotidsequenz, umfassend wenigstens 50 zusammenhängende Nukleotide der Sequenz, die in SEQ ID NO.: 1 oder SEQ ID NO.: 2 angegeben ist; (c) einer Nukleotidsequenz, umfassend eine Sequenz mit wenigstens 70% Identität zu der Sequenz, die in SEQ ID NO.: 1 oder SEQ ID NO.: 2 angegeben ist, über die gesamte Länge der SEQ ID NO.: 1 oder 2; oder ein Komplement davon.
  2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, Teil (c), wobei der Prozentsatz der Identität wenigstens 80% ist.
  3. Nukleinsäure nach Anspruch 1, Teil (c), wobei der Prozentsatz der Identität wenigstens 90% ist.
  4. Nukleinsäure nach Anspruch 1, Teil (c), wobei der Prozentsatz der Identität wenigstens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% ist.
  5. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die für Gefäßgewebe spezifische Transkription Phloem-spezifische Transkription ist.
  6. DNA-Konstrukt, umfassend eine Nukleotidsequenz nach einem der vorstehenden Ansprüche, die Transkription auf eine für Gefäßgewebe spezifische Weise initiiert, in funktioneller Verknüpfung mit einer heterologen Nukleotidsequenz von Interesse.
  7. DNA-Konstrukt nach Anspruch 6, wobei die heterologe Nukleotidsequenz von Interesse für ein Polypeptid mit antipathogener Aktivität codiert.
  8. DNA-Konstrukt nach Anspruch 7, wobei die heterologe Nukleotidsequenz für ein Polypeptid mit antipathogener Aktivität auf Insekten codiert.
  9. DNA-Konstrukt nach Anspruch 8, wobei die heterologe Nukleotidsequenz für ein toxisches Polypeptid von Bacillusthuringiensis (B.t.) oder ein chimäres toxisches B.t.-Polypeptid codiert.
  10. DNA-Konstrukt nach Anspruch 8, wobei die heterologe Nukleotidsequenz von Interesse für ein Polypeptid codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Lectinen und Lipoxidasen.
  11. DNA-Konstrukt nach Anspruch 8, wobei die heterologe Nukleotidsequenz von Interesse für ein Polypeptid codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Insekten-Chitinase und einem insektiziden Polypeptid.
  12. DNA-Konstrukt nach Anspruch 6, wobei die heterologe Nukleotidsequenz von Interesse für ein Polypeptid codiert, das Gefäßgewebe-Beladung („vascular tissue loading") reguliert.
  13. DNA-Konstrukt nach Anspruch 12, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Saccharosesynthasen, Saccharosetransportern, Galactinolsynthasen, K+-Kanälen, Aminosäuretransportern, H+-ATPasen, Aminosäurepermeasen, Sulfattransportern, Fructosyltransferasen und Phloem-Kohlenhydrat-Regulatoren.
  14. Expressionsvektor, umfassend das DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 6 bis 13.
  15. Wirtszelle, die das DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 6 bis 13 stabil in ihr Genom eingebaut hat.
  16. Pflanzenzelle, die das DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 6 bis 13 stabil in ihr Genom eingebaut hat.
  17. Pflanzenzelle nach Anspruch 16, wobei die Pflanzenzelle von einer dicotylen Pflanze ist.
  18. Pflanzenzelle nach Anspruch 16, wobei die Pflanzenzelle von einer monoctylen Pflanze ist.
  19. Pflanze, die ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 6 bis 13 stabil in ihr Genom eingebaut hat.
  20. Pflanze nach Anspruch 19, wobei die Pflanze eine dicotyle Pflanze ist.
  21. Pflanze nach Anspruch 19, wobei die Pflanze eine monocotyle Pflanze ist.
  22. Samen der Pflanze nach Anspruch 19, 20 oder 21, wobei der Samen das DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 6 bis 13 umfasst.
  23. Verfahren zur Expression einer heterologen Nukleotidsequenz in einer Pflanze, wobei das Verfahren stabile Integration eines DNA-Konstrukts nach einem der Ansprüche 6 bis 13 in eine Pflanzenzelle umfasst.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Pflanze dicotyl ist.
  25. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Pflanze monocotyl ist.
  26. Pflanzenzelle nach Anspruch 17, wobei die dicotyle Pflanze aus der Spezies Glycine max ist.
  27. Pflanze nach Anspruch 20, wobei die dicotyle Pflanze aus der Spezies Glycine max ist.
  28. Pflanzenzelle nach Anspruch 18, wobei die monocotyle Pflanze aus den Spezies Zea mays oder Oryza sativa ist.
  29. Pflanze nach Anspruch 21, wobei die monocotyle Pflanze aus den Spezies Zea mays oder Oryza sativa ist.
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