DE10113045A1 - Fungizid zur Hemmung der pathogenen Wirkung von Pilzen sowie ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, die die pathogene Wirkung von Pilzen hemmen. - Google Patents

Abstract

Fungizid zur Hemmung von pathogenen Pilzen, die lipolytische Enzyme sekretieren, enthaltend einen chemischen lipolytische Enzyme inhibierenden Wirkstoff in einer zur Inhibierung ausreichenden Konzentration, Verwendung des Fungizids nach der Hemmung der pathogenen Wirkung von Pflanzen- und Humanpathogenen, sowie ein Verfahren zur Herstellung von transformierten Pflanzen, die die pathogene Wirkung von Pilzen hemmen können, entsprechend hergestellte transformierte Pflanzen und Vermehrungsgut.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Fungizid, mit dem sich die pathogene Wir­ kung von Pilzen hemmen läßt. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Ver­ fahren zur Herstellung von Pflanzen, die die pathogene Wirkung von Pilzen hemmen können sowie entsprechend hergestellte Pflanzen und ihr Vermehrungs­ gut. In beiden Fällen erfolgt die Hemmung der pathogenen Wirkung der Pilze nach dem gleichen Wirkprinzip.

Fungizide müssen eine Reihe von unterschiedlichen Anforderungen erfüllen. Ne­ ben der primären Wirksamkeit gegen den pathogen Pilz müssen sie pflanzenver­ träglich sein und dürfen keine oder nur eine geringe Anwendertoxizität aufwei­ sen. Ihre Verweilzeit auf der Pflanze muß für die Wirksamkeit ausreichen, Persistenz dagegen muß ausgeschlossen werden. Schließlich dürfen die Kosten für die Fungizidanwendung nicht zu hoch sein.

Die meisten der heutigen Fungizide enthalten als Wirkstoffe Dithiocarbamate, Organophosphorverbindungen, Phtalimide, Triazole oder Benzimidazole (siehe z. B. H. Lyr: Modem Selective Fungizides, 1995; Tab. 1.3, S. 14).

Organophosphorverbindungen wirken in frühen oder in späten Stadien des Infek­ tionsprozesses und hemmen im ersten Fall z. B. die Sporenkeimung und im letz­ ten Fall das Mycelwachstum und die Sporulation. Benzimidazole hemmen die DNA-Synthese in Pilzen sekundär über eine Hemmung der Zellteilung u. a. durch Hemmung des Tubulinaufbaus.

Geeignete Wirkstoffe müssen eine breite Wirkung haben, da eine spezifische Entwicklung für nur einen pathogenen Pilz, bzw. eine Krankheit, aus Kosten­ gründen ausscheidet.

Man versucht daher Wirkstoffe einzusetzen, die gegen pilzübergreifende An­ griffspunkte, sogenannte Targets, gerichtet sind.

Alle bisherigen im Einsatz befindliche Fungizide wirken gegen nur etwa 15 sog. Targets. Somit wirken sich auftretende Resistenzen gegenüber einem Wirkstoff häufig auf die gesamte Klasse der Fungizide aus.

Es besteht daher ein Bedarf nach weiteren Targets und geeigneten Wirkstoffen.

In diesem Zusammenhang wurde unlängst z. B. eine neue Wirkstoffgruppe, die Strobilurine, gefunden, die selektiv gegen die mitochondriale Atmungskette bei vielen pathogenen Pilzen wirkt.

In Verbindung mit der Untersuchung der Pathogenität von Pilzen wurde auch die Bedeutung extrazellulärer von den Pilzen sekretierter Enzyme untersucht. Von Comménil et. al wurde in: "Physiol. Mol. Plant. Pathol. 52: 1-14 (1998)" bei Bonytis cinerea ein möglicher Zusammenhang zwischen der von diesem Pilz se­ kretierten extrazellulären Lipase und der pathogenen Wirkung auf Tomatenblät­ tern beschrieben. In Gegenwart von polyklonalen Antikörpern gegen die extra­ zelluläre Lipase kam es bei In-Vitro-Experimenten zu geringeren Schädigungen der Blätter als in Abwesenheit der Antikörper.

Die Erzeugung antilipatischer Antikörper ist sehr aufwendig und muß für jede Pilzart bzw. Lipase separat durchgeführt werden. Lipasen sind sehr wenig kon­ serviert und haben sowohl auf Nukleotid- als auch auf Proteinebene nur geringe Homologien. Der mögliche Einsatz von Antikörpern in Fungiziden ist daher nicht sinnvoll und ist bislang auch nicht angedacht worden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Fungizid zu schaffen, das aufgrund seines Wirkprinzips relativ universell gegen pathogene Pilze eingesetzt werden kann.

Gelöst wird die Aufgabe mit einem Fungizid gemäß Anspruch 1.

Danach ist vorgesehen, daß das erfindungsgemäße Fungizid als Wirkstoff eine chemische Substanz enthält, die die Aktivität extrazellulärer von den Pilzen se­ kretierter lipolytischer Enzyme inhibiert.

Erfindungsgemäß wird damit erstmals ein Fungizid geschaffen, das in Wirkzu­ sammenhang zwischen der Sekretion extrazellulärer Lipasen bei Pilzen und ihrer Pathogenität eingreift.

Es hat sich herausgestellt, daß in erfindungsgemäßen Fungiziden relativ unspezi­ fisch wirkende Enzyminhibitoren eingesetzt werden können. Wichtig ist ledig­ lich, daß durch sie eine Hemmung von lipolytisch wirkenden Enzymen erfolgt.

Ein geeigneter von der Anmelderin getesteter Wirkstoff ist z. B. Acetylsalicylsäu­ re, mit dem sich extrazelluläre Lipasen bei Candida albicans und Rhizopus arrhi­ zus (SIGMA) hemmen lassen. Vermutlich wird durch Acetylsalicylsäure ein in dem aktiven Zentrum der Lipasen befindliches aktives Serin acetyliert. Da sich das aktive Serin in einem in Lipasen konservierten Sequenzabschnitt befindet, kann von einer relativ universellen Inhibitorwirkung von Acetylsalicylsäure aus­ gegangen werden.

Ein weiterer geeigneter Wirkstoff ist unter dem Namen Ebelactone A (Peninsula Laboratories Inc., CA) erhältlich. Ebelactone A hemmt z. B. die Lipase von Fusa­ rium solani.

Das erfindungsgemäße Fungizid ist nicht auf die angegebenen Substanzen be­ schränkt. Diese wurden nur als Beispiele genannt. Wie oben angesprochen, kön­ nen grundsätzlich alle Wirkstoffe eingesetzt werden, die relativ universell Lipa­ sen hemmen, wobei ggf. sogar in Kauf genommen werden kann, daß durch die eingesetzten Wirkstoffe auch andere Enzyme gehemmt werden. Die Bandbreite möglicher Wirkstoffe ist dadurch relativ groß und das erfindungsgemäße Fungi­ zid kann damit Wirkstoffe enthalten, die leicht zugänglich und relativ kostengün­ stig sind.

Untersuchungen der Anmelderin zeigen weiterhin, daß die Pathogenität auch sehr unterschiedlicher Pilze mit der Sekretion von extrazellulären Lipasen korrelierbar ist. Demzufolge können erfindungsgemäße Fungizide relativ breit gegen unterschiedliche Pilze ggf. sogar ohne Änderung ihrer Formulierung eingesetzt wer­ den.

Bevorzugt vorgesehen ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Fungizide zur Hemmung von pflanzenpathogenen und humanpathogenen Pilzen. Denkbar ist der Einsatz erfindungsgemäßer Fungizide gegen z. B. die phytopathogenen Pilze: Pyrenophora spp., Fusarium spp., Phytophthora spp., Bortytis spp., Magnaporthe spp. Penicillium spp., Aspergillus spp., sowie deren anamorphe oder teleomorphe Formen oder gegen die humanpathogenen Pilze: Malasseszia furfur, Aspergillus fumigatus und Candida albicans. Die vorstehende Aufzählung ist nur beispeilhaft zu verstehen und soll die Anwendung der Erfindung keinesfalls ausschließlich auf die genannten Pilze beschränken.

Grundsätzlich bezieht sich die Erfindung auf übliche Fungizide, d. h. geeignete die Aktivität von lipolytischen Enzymen hemmende Wirkstoffe in Formulierun­ gen, die ein Aufbringen auf die zu schützenden Pflanzen in den gewünschten Konzentrationen ermöglichen. In aller Regel enthalten solche Formulierungen neben den Wirkstoffen Trägersubstanzen und Emulgatoren, die den Wirkstoff in z. T. in löslicher Form halten, haltbar machen oder ihm den Weg zum Target er­ möglichen.

Die Erfindung soll allerdings nicht nur die übliche Fungizidapplikation abdecken.

Es sind auch weitere Möglichkeiten denkbar, wie sich die extrazellulären lipoly­ tischen Enzyme von pathogenen Pilzen hemmen lassen. In diesem Zusammen­ hang besonders interessant ist der Einsatz von transgenen Pflanzen, die mit Gen­ sequenzen transformiert sind, die für spezielle, enzyminhibierende Peptide kodie­ ren. Das Design dieser Gensequenzen ist dergestalt, daß eine Exprimierung der Peptide und ggf Sekretion durch die Pflanzen erfolgt. Die exprimierten Peptide ihrerseits sind dann in der Lage im Bedarfsfall lipolytisch wirkende Enzyme von pathogenen Pilzen zu hemmen, was wiederum wie bei der Fungizidanwendung zu einem wirksamen Schutz der Pflanze führt.

Neben Verfahren zur Herstellung solcher transformierter Pflanzen soll die Erfin­ dung auch die transformierten Pflanzen selbst und aus ihnen gewonnenes Ver­ mehrungsgut abdecken.

Im humanmedizinischen Bereich wurden bereits Peptide isoliert, die das Enzym Chymotrypsin hemmen (Jeffrey et al., 1996. J. Mol. Biol. 259, 819-827). Es ist allerdings nicht bekannt, solche speziellen Peptide in transgenen Pflanzen zu ex­ primieren.

Transgene Pflanzen, die spezielle Proteine zum Schutz gegen pathogene Pilze produzieren, sind von Loritto et al. 1998 und Bliffeld et al. 1999 beschrieben worden. Bei den Proteinen handelt es sich in aller Regel um Enzyme, die den Pilz angreifen. Über transgene Pflanzen, die andere Peptidsequenzen exprimieren, ist bislang nichts bekannt.

Im folgenden soll die Erfindung anhand von mehreren Beispielen unter Bezug auf zwei Figuren beschrieben werden.

Fig. 1 zeigt in Diagrammform die Hemmung von Rhizopus-arrhizus-Lipase bei unterschiedlichen Acetylsalicilsäure-Konzenerationen.

Fig. 2 zeigt in Diagrammform die Hemmung des Wachstums von Candida albi­ cans bei unterschiedlichen Acetylsalicilsäure-Konzentrationen.

Beispiel 1 Vergleich der Pathogenität zwischen Wildtypstämmen und transformierten Stämmen (Knock-out Mutanten) von Fusarium solani.

Ziel der Transformation war, das in Fusarium solani für extrazelluläre Lipase kodierende Gen auszuschalten. Hierzu wurden Wildtypisolate von Fusarium so­ lani mit dem im 870 bp Lipasefragment linearisierten Plasmid pKO-SH (Fig. 1) transfotmiert. Der lineare DNA-Abschnitt integrierte dabei in den homologen DNA-Bereich und zerstört das Gen. Die transformierten Stämme werden im fol­ genden mit Knock-out 1, 2 und 3 bezeichnet.

Zur Untersuchung der Pathogenität wurden sterile Erbsensamen unter kontrol­ lierten Bedingungen bei 28°C (nachts 23°C) mit jeweils 16 Std. Lichtphase ge­ folgt von 8 Std. Dunkelheit angezogen. Die Erde wurde nach der Aussaat der Erbsensamen mit einer wässrigen Suspension von Pilzsporen gegossen und somit der gewünschte Erregerdruck eingestellt

Die Pathogenitätstests wurden in einer Wachstumskammer mit 90% Feuchtigkeit durchgeführt.

Als Ergebnis zeigte sich, daß die pathogene Wirkung von Knock-out Mutanten deutlich geringer war als die des Wildtyps. Es zeigte sich, daß die Wurzelberei­ che von mit Wildtyp inokulierten Pflanzen bereits nach 22 Tagen zerstört waren, während die Pflanzen, die mit Knock-out Mutanten (transformiert) inokuliert wurden, sogar noch nach 5 Wochen lebensfähig waren.

Beispiel 2 Untersuchung der lipase-hemmenden Eigenschaften unter­ schiedlicher Substanzen a. Ebelacton A

Die Lipaseaktivität wurde unter Verwendung von p-Nitrophenylpalmitat als Substrat gemessen.

Als Kontrolle wurde ein Reaktionspuffer bestehend aus 5 mM p- Nitrophenylpalmitat 13,5 mM Natrium-taurocholat, 0,1% Gummi arabicum, 50 mM bis-tris-Propan HCL pH 8 hergestellt. 8 Teile Reaktionspuffer wurden mit 2 Teilen Kulturmedium vermischt und es wurde bei 37° für 30 min. inkubiert. Die Bildung von p-Nitrophenol bei 405 nm photometrisch bestimmt.

Die Versuchsansätze enthielten Reaktionspuffer mit Ebelacton A in einer Kon­ zentration von 100 µg/ml.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt:

Es zeigte sich zunächst, daß alle getesteten Stämme in Gegenwart von Ebelacto­ ne A deutlich geringere Lipaseaktivität aufwiesen, als die Kontrollansätze.

Weiterhin belegen die Ergebnisse, daß die in Beispiel 1 erzeugten transformierten drei Knock-out-Mutanten eine gegenüber dem Wildtyp deutlich reduzierte Lipaseaktivität besitzen, die sich aber ebenfalls durch Ebelactone A noch weiter ver­ ringern ließ.

b. Acetylsalicylsäure (ASS), Tetrahydrolipstatin (THL)

Hierzu wurde ein lipolytischer Aktivitätstest mit Kulturüberständen von Candida albicans und Rhizopus arrhizus durchgeführt.

Die Lipaseaktivität wurde unter Verwendung von (-Naphthylpalmitat als Substrat gemessen. 0,45 ml Kulturüberstand (Candida albicans in YNB-Olivenöl) oder 5 (g/ml Kontroll-Lipase (in H2O) wurden mit 0,05 ml Lösungsmittel (H2O, EtOH oder DMSO) bzw. ASS (in EtOH) oder THL (in DMSO) bei 37°C im Schüttel­ block für 20 min inkubiert. Anschließend wurden 0,2 ml Reaktionspuffer beste­ hend aus 1,12 mM (-Naphthylpalmitat in 14 mM Citronensäure-74 mM Trispuf­ fer (pH 5,5) hinzugegeben und weitere 1,5 h bei 37°C im Schüttelblock inku­ biert.

Die Reaktion wurde mit 0,325 ml 0,5 M NaOH gestoppt und mit 0,065 ml 1% Fast Violet B in H2O (Farbreagenz) versetzt und für 5 min inkubiert. Danach wurden 0,04 ml 20% Triton X-100 zugegeben und für weitere 5 min inkubiert. Es folgte ein Zentrifugationsschritt mit 21000 × g für 5 min bei 4°C. Der Über­ stand wurde bei 520 nm photomerisch vermessen (Kontrolle: 0-Wert mit DMSO oder EtOH).

Fig. 1 zeigt die Hemmung der Rhizopus Lipase in Abhängigkeit von der ASS- Konzentration. Die nicht wiedergegebenen Ergebnisse für Candida entsprechen grundsätzlich denen bei Rhizopus. Damit ist Acetylsalicylsäure (in Alkohol) in der Lage, die lipolytische Aktivität in Kulturüberstanden beider Stämme zu hemmen.

Alternativ konnte auch für Tetrahydrolipstatin in DMSO eine Inhibierung von lipolytischer Aktivität nachgewiesen werden.

Beispiel 3 Einfluß von Acetylsalicylsäure (ASS) auf das Wachstum von Candida albicans

Hierzu wurde Candida albicans unter Verwendung von Tween 40 als einziger Kohlenstoffquelle und Lipasesubstrat in Gegenwart von unterschiedlichen ASS- Konzentrationen in Alkohol angezogen. Die Ergbnisse zeigt Fig. 2.

Es wird deutlich, daß der Wachstumsverlauf von Candida albicans durch höhere Konzentration von ASS deutlich stärker gehemmt wird als durch niedrigere Kon­ zentrationen, was mit den unter Beispiel 2b beobachteten Hemmung der lipolyti­ schen Aktivität durch ASS korreliert.

Kontrollversuche mit mehreren Kohlenstoffquellen, zu deren Abbau keine lypo­ lytisch wirkenden Enzyme benötigt werden, ergaben keine Wachstumshemmung von C. albicans bei Zugabe von ASS. Dies zeigt, daß ASS spezifisch auf die Li­ pase wirkt.

Beispiel 4 Einfluß von Ebelactone A auf die pathogene Wirkung von Fusa­ rium solanum

Für den Virulenztest mit Ebelactone A wurden die Keimung der Samen in Erde eingeleitet, die Keimlinge für vier Tage ethioliert (dunkel gehalten) und anschlie­ ßend in sterile Petrischalen (200 × 200 × 30 mm) gebracht.

Als Inokulum wurden Wildtyp-Konidien mit 0,01% Tween geerntet und die Konzentration auf 2000 Konidien/µl eingestellt.

Die Ebelactone A-Konzentration in den Konidiensuspensionen wurde auf 100 µg/ml eingestellt.

10⁵ Konidien + jew. Ebelactone A-Konzentration wurden auf den Erbsenstengel getropft (Positivkontrolle: 10⁵ Konidien ohne Ebelactone A; Negativkontrolle: Lösungsmittel Tween 0.01% ohne Konidien).

Der Wildtyp ohne Ebelactone A verursachte große Läsionen, die zu Stengelbruch und Welke und zum Absterben der Pflanze führten. In Gegenwart von Ebelacto­ ne A verursachte der Wildtyp keine sichtbaren Läsionen und Schädigungen an der Pflanze. Der Pilz verliert damit durch Ebelactone A seine pathogene Wirkung.

Claims (5)

1. Fungizid zur Hemmung von pathogenen Pilzen, die lipolytische Enzyme se­ kretieren, enthaltend einen chemischen lipolytische Enzyme inhibierenden Wirk­ stoff in einer zur Inhibierung ausreichenden Konzentration.

2. Verwendung des Fungizids nach Anspruch 1 zur Hemmung der pathogenen Wirkung von Pflanzen- und Humanpathogenen.

3. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, die die pathogene Wirkung von Pil­ zen hemmen können, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzen mit einem Gen transformiert werden, das für ein, die Aktivität von lipolytischen Enzymen hem­ mendes Peptid kodiert.

4. Transformierte Pflanze herstellbar gemäß Anspruch 4.

5. Vermehrungsgut zur Vermehrung der Pflanze gemäß Anspruch 4.