Bereich der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung liegt im Bereich der biologischen
Kontrolle von Schädlingen und betrifft spezifischer die
biologische Kontrolle von Mehltau (powdery mildew; PMD) durch
einen Hyperparasiten des PMD-verursachenden Mikroorganismus.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
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In den letzten Jahren entstand ein wachsendes Interesses
hinsichtlich einer biologischen Kontrolle von
landwirtschaftlichen Schädlingen, d.h. unter Verwendung von
Mikroorganismen, die gegenüber den Schädlingen antagonistisch
wirken, mit Blick auf die gefährlichen Umweltbelastungen
konventioneller, chemischer Schädlingsbekämpfungsmittel. Eine
solche Kontrolle besitzt den Vorteil, zielspezifisch zu sein
und die Umwelt nicht zu belasten.
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PMD ist eine Pflanzenkrankheit, die weltweit vorkommt und
durch verschiedene Pilzarten, die viele Baumsorten,
Blütenpflanzen, Gemüsesorten, Obstpflanzen und verschiedene
Feldgetreidesorten, nachstehend alle gemeinsam als
"Nutzpflanzen" bezeichnet, infizieren können. Eine
PMD-Infektion ist erkennbar durch einen oberflächlichen, weißen
oder hellgrauen, pulverigen oder filzigen Bewuchs auf der
Oberfläche von Blättern, Knospen, jungen Schößlingen,
Blütenständen, Früchten und sogar Blüten. In vielen Fällen ist
das Ergebnis einer PMD-Infektion bei Nutzpflanzen eine
Verminderung des Ertrags und der Erntequalität.
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Bis heute sind keine Mirkroorganismen gefunden worden, die
die Fähigkeit besitzen, PMD zu bekämpfen. Es gab eine
Andeutung im Stand der Technik (Wolf-Dieter Philipp und Gerd
Cruger, Journal of Plant Diseases and Protection 86 (3/4),
129-142 (1979)), einen Hyperparasiten der PMD-verursachenden
Mikroorganismen zu verwenden; jedoch fand man, daß alle
Hyperparasiten, die vor der vorliegenden Erfindung isoliert
worden sind, eine ungenügende Wirksamkeit hinsichtlich der
Kontrolle von PMD bei Nutzpflanzen im Freiland oder in einem
Gewächshaus besaßen.
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Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine
Reinkultur eines Hyperparasiten des PMD-verursachenden
Mikroorganismus bereitzustellen, welcher zum Kontrollieren von PMD
verwendet werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
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Erfindungsgemäß ist ein neuer zu der Pilzart Ampelomyces
quisqualis gehörender Pilzstamm isoliert und AQ10 genannt
worden. Es wurde gefunden, daß AQ10 ein Hyperparasit des
PMD-verursachenden Pilzes ist. Es wurde weiterhin
erfindungsgemäß gefunden, daß die Conidien von AQ10 wirksame
Anti-PMD-Agenzien sind, die effektiv zum Bekämpfen von PMD
bei Nutzpflanzen verwendet werden können, wodurch ein
langgehegtes Bedürfnis zum ersten Mal befriedigt ist.
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Folglich wird erfindungsgemäß eine Reinkultur des Stammes
AQ10 bereitgestellt, welcher am 10. Oktober 1988 bei der
Kulturensammlung des Instituts Pasteur (Collection Nationale
de Cultures de Microorganismes - CNCM) hinterlegt und mit
der Bezeichnung I-807 registriert wurde.
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Eine Reinkultur von AQ10 kann einer kontrollierten mutagenen
Behandlung, wie z.B. durch verschiedene radioaktive
Substanzen, chemische Mutagene oder durch Bestrahlung mit γ- oder
Röntgen-Strahlen ausgesetzt werden, um eine Mutante des
AQ10-Stammes zu erhalten, dessen Conidie ebenso ein
Antagonist des PMD-verusachenden Pilzes ist und die einige
verbesserte Eigenschaften, wie z.B. eine höhere Wirksamkeit,
verbesserte Reproduktionsrate, eine bessere Lagerbeständigkeit
und ähnliches haben kann.
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Conidien sind asexuelle, reproduktive Sporen von
Pilzmikroorganismen. Die Conidien von AQ10 werden auf einfache Weise
in einer im wesentlichen reinen Form von der AQ10-Reinkultur
erhalten.
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Folglich stellt die vorliegende Erfindung auch eine im
wesentlichen reine, wäßrige Suspension von AQ10-Conidien
bereit.
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Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung eine wäßrige
Anti-PMD-Zusammensetzung bereit, welche eine wirksame Menge
an Conidien von AQ10 oder einer Mutante davon und, falls
gewünscht, phytologisch annehmbare Zusatzmittel, die mit
diesen Conidien verträglich sind, umfaßt.
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Weiterhin stellt die Erfindung noch ein Verfahren zum
Kontrollieren von PMD bei Nutzpflanzen bereit, welches das
Anwenden einer wirksamen Menge an Conidien von AQ10 oder einer
Mutante davon auf die Pflanzen umfaßt. Eine solche
Behandlung, die periodisch wiederholt werden kann, ist wirksam zum
Vernichten des PMD-verursachenden Mikroorganismus, zum
Hemmen seiner Proliferation, wie auch zum Verhindern eines
zukünftigen PMD-Befalls.
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Die erfindungsgemäße Kontrolle von PMD kann im Freiland oder
in einem Gewächshaus ausgeführt werden. Für eine
prophylaktische Anwendung sollten die Conidien auf eine Weise
formuliert werden, daß ihre Lebensfähigkeit bis zum Ausbruch
eines PMD-Befalls gesichert ist, wonach sie sofort beginnen,
ihre hyperparasitäre Aktivität auszuüben.
Genaue Beschreibung der Erfindung
I. Konservierung und Lagerung der Kulturen
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Die Reinkulturen von AQ10 können für einige Zeit in Medien
konserviert werden, die für Pilzwachstum und -vermehrung
geeignet sind. Ein Beispiel eines solches Mediums ist ein
Agar-Substrat, welches Weizenkleie-Extrakte umfaßt.
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Aufgrund des Verbrauchs von Nährstoffen durch AQ10 und die
Sezernierung von Abfallprodukten sollte ein Probe der
Kultur, welche Zellen von AQ10 oder davon produzierten Conidien
umfaßt, regelmäßig, z.B. einmal alle 3-4 Wochen, in ein
neues, frisches Medium transferiert werden. Wenn die Kultur
auf einem Agar-Substrat wachsen gelassen wird, können die
Conidien, die durch den Mikroorganismus produziert werden,
geerntet und danach auf ein neues Agar-Substrat ausgesät
werden. Das Ernten der Conidien wird geeigneterweise durch
das Zufügen von destilliertem Wasser auf das Agar-Substrat
durchgeführt und aufgrund eines hypertonischen Drucks werden
die reifen Conidien in die Flüssigkeit des Überstands
gesondert, aus dem sie auf einfache Weise gesammelt werden
können.
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Jedoch kann die periodische Überführung der Conidien in neue
Medien einen mutagenen Streß verursachen und folglich kann
sich eine genetische Drift der Kultur ergeben. Daher ist
eine solche Konservierung der Kultur hauptsächlich für kurze
Zeiträume geeignet.
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Für Lagerzeiträume bis zu ungefähr 6 Monaten werden AQ10-
Zellen auf einem festen Nährboden, wie z.B. BEA
(Kleieextraktagar; bran extract agar) bei 4ºC gehalten.
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Eine Suspension von AQ10-Conidien in einer wäßrigen,
ungefähr 10&sup7; Conidien/ml umfassenden Lösung, welche durch
Fermentation (siehe unten) erhalten wird, kann für längere
Zeiträume, d.h. bis zu ungefähr 12 Monaten, gelagert werden.
Die Conidien sezernieren wahrscheinlich antibiotische
Verbindungen, die das Wachstum anderer Mikroorganismen hemmen;
damit eine Hemmung wirksam ist, wird eine
Conidienkonzentration in der angegebenen Größenordnung benötigt.
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Eine langandauernde Lagerung kann auch durch Gefriertrocknen
der Conidien erreicht werden. Solche gefriergetrockneten
Conidien behalten ihre Lebensfähigkeit über ausgedehnte
Lagerzeiträume bei.
II. Fermentation
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Eine Fermentation wird benötigt, um große Mengen an AQ10 für
die Herstellung von Anti-PMD-Zusammensetzungen zu erhalten.
Eine Fermentation kann entweder in Flüssigmedien, wie z.B.
Kartoffelmedium (welches der lösliche Extrakt gekochter
Kartoffeln ist), Maisquellwasser (Cornsteepliquor; welches ein
Sirup ist, der nach dem Kochen von Maissamen in der
Stärkeindustrie zurückbleibt), Baumwollmehlextrakt (die
extrahierten Bestandteile von Baumwollsamenmehl nach Kochen), Molke,
Weizenkleie oder einer Kombination davon ausgeführt werden
oder in einem halbfesten Medium, d.h. einem feuchten,
teilweise festen Substrat, wie z.B. pulverisierte Träger, wie
Vermikulit und Torfmoos oder innerhalb feuchter,
granulierter Nährböden, wie solche aus Sorghum, Weizen oder
Gerstenkörnern.
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Eine Flüssigfermentation wird durch Beimpfen einer Probe von
AQ10 in ein Kulturmedium und aerobes Inkubieren des Mediums
für eine ausreichende Zeitdauer durchgeführt. Es wurde
gefunden, daß die optimale Temperatur für die Fermentation
ungefähr 25ºC und der optimale pH ungefähr 6,5 bis ungefähr
8,0 beträgt. Die Fermentation wird vorzugsweise unter
Schütteln z.B. in Schüttelflaschen durchgeführt.
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Unter solchen optimalen Bedingungen ist es möglich,
innerhalb von 7 bis 9 Tagen einen Ertrag von ungefähr 1,5-2,0 x
10&sup7; Conidien/ml zu erhalten.
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Ein geeignetes Medium zum Durchführen der Fermentation ist
Kartoffelmedium. In diesem Medium ist der Ertrag an Conidien
nach 7 bis 9 Tagen Inkubation ungefähr zehnfach höher als
derjenige der anderen, vorstehend aufgeführten Medien.
Jedoch wurde gefunden, daß ein ähnlicher Ertrag an Conidien
erreicht wird, wenn ein mit Maisquellwasser ergänztes
Molkemedium verwendet wird, wobei das Volumenverhältnis von Molke
zu Maisquellwasser ungefähr 2:1 beträgt. Dagegen wurde
erfindungsgemäß gefunden, daß AQ10 unter gewissen Bedingungen
besser in der Dunkelheit wächst und sich vermehrt. Daher
wird manchmal erfindungsgemäß die Fermentation von AQ10
vorzugsweise in der Dunkelheit durchgeführt.
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Halbfeste Fermentationen können an einer Anzahl von Trägern,
wie vorstehend angegeben, durchgeführt werden. Die Endanzahl
an Conidien, die nach einer solchen Fermentation geerntet
werden können, ist höher als diejenige, die durch
Flüssigfermentation erreicht wird, obwohl die Fermentationszeit,
die vom Trägertyp abhängt, gewöhnlich länger ist.
III. Formulierung der Anti-PMD-Zusammensetzungen
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AQ10-Conidien werden gewöhnlich durch Sprühen einer
wäßrigen, 10&sup6; Conidien/ml enthaltenden Zusammensetzung auf die
Nutzpflanzen aufgebracht.
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Für eine wirksame Behandlung sollte eine wäßrige
Zusammensetzung von AQ10-Conidien auf eine Weise versprüht werden,
daß die gesamte Oberfläche der Blätter und der anderen
Pflanzenorgane, wie Blütenstände, Früchte oder Blüten, die
mit PMD infiziert sind, bedecken. Wenn Wasser auf eine
wachsartige Oberfläche wie Blätter gesprüht wird, ist das
Befeuchten unvollständig, da sich Tropfen bilden. Folglich
enthalten die wäßrigen, erfindungsgemäßen
Anti-PMD-Zusammensetzungen vorzugsweise Zusätze wie oberflächenaktive Mittel
oder Befeuchtungsmittel, wie z.B. sogenannte Ausdünner, die
typischerweise in einer Menge von ungefähr 0,2% Gew/Gew
zugefügt werden.
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Da der erfindungsgemäße Anti-PMD AQ10-Mikroorganismus ein
Hyperparasit der PMD-verursachenden Mikroorganismen ist,
müssen keine Nährstoffe in die Zusammensetzungen eingebracht
werden. Jedoch kann es manchmal wünschenswert sein, solche
Nährstoffe und auch Schutzmittel zuzufügen, um die Conidien
lebensfähig zu erhalten, wenn z.B. die Zusammensetzungen für
eine prophylaktische Behandlung verwendet werden, für die es
notwendig ist, daß die Mikroorganismen für lange Zeiträume
lebensfähig sein werden.
Beschreibung einiger spezifischer Ausführungsformen
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In der folgenden Beschreibung werden einige spezifische
Ausführungsformen beschrieben werden, wobei verständlich ist,
daß die Erfindung nicht darauf beschränkt ist und daß
verschiedene Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der
Ansprüche möglich sind.
Beispiel 1: Kultur von AQ10
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AQ10 wurde auf Platten, die BEA-Substrat enthielten,
inkubiert.
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Für die Herstellung von BEA wurden 100 g Weizenkleie in 1 l
destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung wurde danach in
einem Autoklaven für 20 min sterilisiert, um die Weizenkleie
zu extrahieren und danach durch Gazefilter (20 um-Poren)
filtriert. Nach dem Autoklavieren und nachfolgendem
Filtrieren wurde Wasser auf 1 l ergänzt, und 20 g Malzextrakt, 2 g
DL-Asparagin und 20 g Agar wurden in die Lösung gemischt,
die danach autoklaviert und in Agarplatten gegossen und
gekühlt wurde.
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Nach drei Wochen Inkubation wurden 10 ml destilliertes
Wasser zu jeder Platte zugefügt und aufgrund des hypertonischen
Druckes wurden die reifen Conidien in den Überstand
abgesondert, woraus sie gesammelt wurden und wobei der Ertrag 10&sup7;
bis 10&sup8; Conidien/ml war.
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Die geernteten Conidien wurden danach entweder nochmals auf
frischen BEA-Platten ausplattiert, gefriergetrocknet und bei
4ºC gelagert oder für eine Fermentation verwendet.
Beispiel 2: Lagerung von AQ10
(a) Lagerung von Einzelschichten von AQ10:
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AQ10-Conidien wurden auf eine BEA-Platte ausgesät, die
wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, und für 14 Tage
inkubiert bis eine Einzelschicht an AQ10 erhalten wurde.
Die Agarplatte wurde danach bei 4ºC gelagert, ohne einen
Verlust der Zellebensfähigkeit für wenigstens 6 Monate.
(b) Lagerung von Conidiensuspensionen:
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Das Aussäen von AQ10 auf BEA-Platten und das Ernten der
Conidien wurde gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Die 10&sup7;
bis 10&sup8; Conidien/ml enthaltende Conidiensuspension wurde
danach bei 4ºC für bis zu 12 Monate gelagert, ohne
offensichtlichen Verlust derer Lebensfähigkeit.
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Während dieser Zeitdauer wurde keine Kontamination durch
andere Pilze oder Bakterien beobachtet, wahrscheinlich
aufgrund einer Sezernierung von antibiotischen
Substanzen, die in der Conidienpräparation vorhanden sind.
(c) Gefriertrocknen von Conidien:
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Eine Suspension von 10&sup6; Conidien/ml wurde bei 12.000 g
für 10 min zentrifugiert, wonach das resultierende
Pellet mit 10% entrahmter Milch resuspendiert wurde. Danach
wurde die Suspension in Trockeneis/Aceton gefroren,
lyophilisiert und danach bei -4ºC gelagert. Die
Wiederbefeuchtung wurde durch Zufügen von sterilem Wasser zu den
lyophilisierten Conidien erreicht.
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Nach drei Monaten gab es im wesentlichen keine Zeichen
eines Verlustes der Lebensfähigkeit, wenn die Suspension
auf BEA-Platten ausplattiert wurde.
Beispiel 3: Fermentation
(a) Flüssigfermentation in verschiedenen Wachstumsmedien.
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Eine Probe von 100 ml Conidien, enthaltend ungefähr 10&sup6;
Conidien/ml, wurde in Kulturflaschen, enthaltend jeweils
1 l eines Fermentationsmediums mit einem pH zwischen
6,5-8,0, geimpft. Jede der Kulturflaschen enthielt ein
unterschiedliches Medium. Die Inkubationstemperatur lag
bei ungefähr 25ºC. Während der Inkubation wurden die
Kulturflaschen geschüttelt, und nach 9 Tagen wurde der
Ertrag an Conidien bestimmt. Die Ergebnisse werden in
der folgenden Tabelle 1 angegeben:
Tabelle 1: AQ10
Kulturmedium
Ertrag an Conidien (x 10&sup6; /ml)
Durchschnitt*
Maximal
a) 10% Weizenkleie
b) 20% Kartoffelextrakt
c) 20% Molke
d) 20% Molke + 7,5 g Baumwollmehlextrakt
e) 10% Molke + 6 ml Maisquellwasser (Cornsteepliquor; CSL)
f) 20% Molke + 14 ml CSL
g) 20% Molke + 12 ml CSL
* vier Wiederholungen
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Es kann aus den vorstehenden Ergebnissen gesehen werden,
daß der höchste Ertrag mit einem Medium einer einzigen
Nährstoffquelle in einem 20%-igen Kartoffelextrakt
erhalten wird. Jedoch ergab eine Kombination von 20% Molke
mit CSL einen noch höheren Ertrag.
(b) Die Wirkung von Licht auf das AQ10-Wachstum
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Eine Probe einer Suspension von AQ10-Conidien,
enthaltend 10&sup6; Conidien/ml, wurde in einem Experiment auf
einem BEA-Substrat ausgesät, das in Petrischalen enthalten
war, oder in ein Kartoffel/Dextrose (PD)-Flüssigmedium
und in einem weiteren Experiment in ein flüssiges
Saccharosemedium geimpft. Einige der AQ10-Kulturen
wurden während des Tages über die Inkubationszeit hinweg
Sonnenlicht ausgesetzt, während andere durch Bedecken
mit Aluminiumfolie abgedunkelt wurden. Die Temperatur
und der pH hatten die vorstehend angegebenen Werte. Nach
10-14 Tage Inkubation wurde Ertrag an Conidien bestimmt
und die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 2
dargestellt:
Tabelle 2:
Gesamtzahl an Conidien
Kulturmedium
LICHT
DUNKELHEIT
flüssige Saccharose
BEA/Agar
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Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß
unter den beschriebenen Bedingungen weit bessere Erträge
erreicht werden, wenn AQ10 in der Dunkelheit kultiviert
wird.
(c) Halbfeste Fermentation:
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Sorghumkörner wurden mit einer 10&sup6; Conidien/ml
enthaltenden AQ10-Conidiensuspension gemischt. Die Mischung
wurde danach in einem dunklen Behälter inkubiert.
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Nach 20 Tagen Inkubation wurden 6 x 10&sup7; Conidien/ml
erhalten.
Beispiel 4: Formulierung von AQ10-Conidien
(a) Feldversuche
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Markkürbis-Pflanzen wurden im Freiland mit PMD
infiziert. Die Pflanzen in einer 0,25 Morgen-Parzelle wurden
in Gruppen von ungefähr jeweils 40 Pflanzen geteilt,
wobei jede Gruppe eine der folgenden Behandlungen empfing:
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1. Besprühen einer wäßrigen AQ10-Suspension, wie z.B. durch
Fermentation gemäß Beispiel (a) unter Verwendung des
Kulturmediums b) der Tabelle 1 erhalten. Ingesamt wurden
vier getrennte Besprühungen, jeweils innerhalb fünf Tage
ausgehend von der vorausgehenden, durchgeführt.
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2. Besprühen jedes der folgenden konventionellen,
chemischen Fungizide: Afugan (Hoechst, BRD), Magen (Nippon
Soda Company Ltd. Japan), San619 (Sandoz, Schweiz), Ofir
(Ciba Geigy, Schweiz). In jedem Fall wurden drei
getrennte Besprühungen wie in (1) oben durchgeführt.
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3. Besprühen von Tilt (Ciba Geigy, Schweiz), welches ein
systemisches Fungizid ist. Insgesamt wurden drei
Besprühungen wie in (1) oben durchgeführt.
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4. Unbehandelte Kontrolle
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Die Kürbisse wurden alle zwei Tage mit der Hand
gepflückt, und die Ernten der vier Gruppen wurden getrennt
aufbewahrt und in eine erste und zweite Gütequalität
unterteilt und gewogen. Die Ergebnisse werden in der
folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt:
Tabelle 3
Ertrag in kg
Qualitätseinschätzung
unbehandelte Kontrolle
Ophir
Afugan
Magen
Tilt
1. Qualität
Gesamt:
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Die Buchstaben an den Gesamtwerten zeigen die
statistische Signifikanz an: alle mit einem "b" gekennzeichneten
Gesamtwerte sind nicht signifikant unterschiedlich
voneinander. Der mit "a" gekennzeichnete Gesamtwert ist
signifikannt unterschiedlich von denjenigen mit "c"
gekennzeichneten und beide sind signifikant
unterschiedlich von den mit "b" gekennzeichneten Gesamtwerten.
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Trotz des trockenen und heißen Wetters wurde ein guter
Hyperparasitismus von AQ10 auf PMD über die Saison
hinweg beobachtet, wie durch mikroskopische Beobachtung der
Blattproben gezeigt wurde.
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Der höchste Ernteertrag wurde mit Tilt erhalten, welches
ein neues chemisches Fungizid ist, gegenüber welchem
keine Resistenz bisher entwickelt worden ist. AQ10 ergab
einen Ernteertrag, der ähnlich zu denjenigen ist, die
mit anderen Fungiziden erhalten wurden und der
signifikant besser als bei der unbehandelten Kontrolle ist.
(b) Kontrolle von PMD bei Mangobäumen
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36 Mangobäume in einer Farm auf den Golanhöhen,
Nordisrael, wurden in vier Gruppen geteilt, wobei jede aus
neun Bäumen bestand. Zwei Gruppen von Bäumen wurden mit
einer erfindungsgemäßen AQ10-Zusammensetzung behandelt,
die auf jede Gruppe mit einer verschiedenen
Wiederholungsrate angewendet wurde. Eine dritte Gruppe diente
als unbehandelte Kontrolle und die vierte wurde mit
Schwefel behandelt, was die konventionelle Behandlung
gegen PMD in der Landwirtschaft ist. Das Ausmaß der PMD-
Kontrolle wurde sowohl durch Zählen der Anzahl an
Früchten als auch durch Bestimmen des Durchschnittsgewichtes
aller Früchte pro Baum berechnet. Die Ergebnisse werden
in der folgenden Tabelle 4 gezeigt:
Tabelle 4
Behandlung
durchschnittliche Anzahl an Früchten/Baum
durchschnittliches Gewicht der Früchte/Baum (kg)
nicht-behandelte Kontrolle
AQ10 alle 5 Tage (6 Wochen)
Schwefelbehandlung (gewöhnlich verwendet in Agrarparzellen)
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Die Buchstaben an den durchschnittlichen Anzahlen und
Durchschnittsgewichten der Früchte pro Baum zeigen Statistische
Signifikant an: die mit "a" gekennzeichneten Zahlen sind
signifikant unterschiedlich von den Zahlen in der selben
Spalte, die mit "b" gekennzeichnet sind; die mit "ab"
gekennzeichneten Zahlen sind nicht signifikant unterschiedlich
vom Rest in der selben Spalte.
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Der Fruchtertrag aus der AQlo-Behandlung ist signifikant
höher als die nicht-behandelte Kontrolle und ist auch höher im
Vergleich zur konventionellen Schwefelbehandlung.