DE60131682T2

DE60131682T2 - Biologische bekämpfung von pflanzenkrankheiten

Info

Publication number: DE60131682T2
Application number: DE60131682T
Authority: DE
Inventors: Philip Albert Elmer; Tony Reglinski; Robert Anthony Hill
Original assignee: Horticulture and Food Research Institute of New Zealand Ltd
Current assignee: New Zealand Insitiute for Plant and Food Research Ltd
Priority date: 2001-06-15
Filing date: 2001-06-15
Publication date: 2008-10-30
Anticipated expiration: 2021-06-16
Also published as: PT1401283E; US20050063955A1; US20080050344A1; NZ529578A; DE60131682D1; ES2296762T3; EP1401283A1; AU2001267948B2; EP1401283B1; EP1401283A4; WO2002102161A1; US7407794B2

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Ulocladium oudemansii als ein Mittel zur biologischen Bekämpfung. Verfahren und Zusammensetzungen für die biologische Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten, insbesondere Botrytis cinerea, unter Verwendung von Ulocladium oudemansii werden ebenfalls bereitgestellt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Pflanzenkrankheiten, die von solchen Pathogenen wie Pilzen verursacht werden, sind ein signifikanter wirtschaftlicher Kostenfaktor für pflanzenbasierte Industriezweige. Verluste können durch den Verderb von Erzeugnissen sowohl vor als auch nach der Ernte, Verlust von Pflanzen selbst oder durch die Verringerung der Wachstums- und Fruchtentwicklungsfähigkeiten entstehen.
Traditionellerweise ist die Bekämpfung von Pflanzenpathogenen durch das Aufbringen von Chemikalien, wie etwa Fungiziden, durchgeführt worden. Die Verwendung von Chemikalien unterliegt einer Reihe von Nachteilen. Die Pathogene können über die Zeit Toleranz gegenüber Chemikalien entwickeln und haben dies getan, was zu fungizidresistenten Populationen führt. Chemische Rückstände können auch Umweltgefahren sowie steigende Gesundheitsbedenken darstellen.
Das Problem wird insbesondere in der Weinbeeren- und Weinindustrie deutlich. Es wird geschätzt, dass Traubenfäule bei Weinbeeren, verursacht durch den Pilz Botrytis cinerea, Verluste von 18 Millionen Dollar pro Jahr in der Weinindustrie von Neuseeland allein verursacht. Botrytis-Bekämpfung ist mit Fungiziden erfolgt. Die Praxis ist unhaltbar, weil Fungizidresistenz in vielen Weinbergen weit verbreitet ist und es einen Druck der Verbraucher zur Verringerung von Pestizidrückständen gibt.
Biologische Bekämpfung stellt ein alternatives Mittel zur Bekämpfung von Pflanzenerkrankungen dar, das potentiell wirksamer und spezifischer als gegenwärtige Methoden ist sowie die Abhängigkeit von Chemikalien verringert. Solche biologischen Bekämpfungsverfahren werden als eine „natürliche" Alternative zu Fungiziden wahrgenommen, mit dem Vorteil größerer öffentlicher Akzeptanz, verringerter Umweltverschmutzung und erhöhter Nachhaltigkeit.
Mechanismen zur biologischen Bekämpfung sind vielfältig. Ein Mechanismus, bei dem gezeigt worden ist, dass er wirksam ist, ist die Verwendung von Antagonisten-Mikroorganismn, wie etwa Bakterien, Hefe und Pilzen, um Pflanzenerkrankungen zu bekämpfen.
Biologische Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen, wie etwa Botrytis cinerea, mit ausgewählten Mitteln zur biologischen Bekämpfung (BCAs) wurde von Wood im Jahre 1951 und später von Newhook im Jahre 1957 berichtet, die den BCA-Pilz Cladosporium cladosporiodes einsetzen. Die seinerzeitige Einführung von preiswerten, wirksamen und leicht anzuwendenden Fungiziden stoppte jede weitere Entwicklung von BCAs. Vor kurzem sind weitere antagonistische Mikroorganismen zur Verwendung bei der biologischen Bekämpfung von Pflanzenerkrankungen identifiziert worden.
Die Verwendung von Ulocladium atrum, um Botrytis in einem Bereich von Pflanzen zu bekämpfen, ist vorgeschlagen worden, zum Beispiel für: Botrytis bei Zwiebeln (Köhl et al., 1995b), Botrytis bei Lilien (Köhl et al., 1995a, Elmer & Köhl, 1998), Botrytis bei Alpenveilchen (Köhl et al., 1998) und Botrytis bei Weinbeeren (Schöne et al., 1999). Es gibt jedoch auch Berichte von Pathogenität gegenüber bestimmten Pflanzenspezies, die von U. atrum gezeigt wird (Butler et al., 1979).
Die Wirksamkeit von verschiedenen Ulocladium spp., wie etwa Ulocladium atrum, als Mittel zur biologischen Bekämpfung, ist auch von Elmer et al., 1995; Walter et al., 1996a, b; Boyd-Wilson et al., 1998; Reglinski et al., 1999, 2000, Hill et al., 1998, Vanneste et al., 1999, Michailides & Elmer, 2000, diskutiert worden.
Es wird daher anerkannt werden, dass die Ulocladium-Spezies, die als wichtige Kandidaten für wirksame BCAs angesehen werden, über das letzte Jahrzehnt umfangreich erforscht worden sind. Bis heute hat sich jedoch noch keiner der Kandidaten als ideal erwiesen, entweder aufgrund von Pflanzenpathogenitätsbedenken oder durch Versagen, sich schnell auf der Zielpflanze zu etablieren plus die Umweltvariabilität, die im Feld existiert, zu überleben.
Überraschenderweise haben die Anmelder nunmehr eine Ulocladium-Spezies identifiziert, die in keinem der früheren Berichte als ein effektives BCA erwähnt worden ist. Die Anmelder haben festgestellt, dass diese Spezies, Ulocladium oudemansii, hochwirksam bei der Bekämpfung saprophyter Pilze ist, wie etwa Botrytis, und sich erfolgreich in Pflanzengeweben im Feld etabliert. Überdies gibt es bisher keine Berichte darüber, dass U. oudemansii Erkrankungen bei Pflanzen oder Pflanzenprodukten verursacht.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung zur biologischen Bekämpfung bereitzustellen, die wenigstens einen Stamm von Ulocladium oudemansii umfasst, der wirksam ist gegen eine Botrytis-Spezies, oder wenigstens für die Öffentlichkeit eine nützliche Wahl bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung, in einem Aspekt, eine Zusammensetzung zur biologischen Bekämpfung bereit, die, in einer reproduktiv lebensfähigen Form und Menge, mindestens einen Stamm von Ulocladium oudemansii, der gegen eine Botrytis-Spezies wirksam ist, und ein landwirtschaftlich akzeptables Trägermittel, Verdünnungsmittel oder Adjuvans umfasst.
Vorzugsweise liegt der mindestens eine Stamm in Form von reproduktiv lebensfähigen Sporen vor.
Es ist gegenwärtig am bevorzugtesten, dass der Stamm Ulocladium oudemansii AGAL Nr. NM 99/06216 ist oder die Zusammenfassung diesen einschließt.
Die Erfindung stellt auch eine biologisch reine Kultur von Ulocladium oudemansii AGAL Nr. NM99/06216 bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bekämpfung von Botrytis bei einer Pflanze oder einem Pflanzenprodukt bereit, wobei das Verfahren das Auftragen mindestens eines Stammes von Ulocladium oudemansii, der gegen eine Botrytis-Spezies wirksam ist, oder einer Zusammenfassung der Erfindung auf besagte Pflanze umfasst.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Ulocladium oudemansii in einer Zusammensetzung oder einem Verfahren der Erfindung.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung einer Zusammensetzung der Erfindung zum Auftragen auf Pflanzen, um Botrytis-Infektion zu bekämpfen.
Pflanzen, die mit der Zusammensetzung der Erfindung behandelt sind, bilden auch einen weiteren Aspekt der Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Balkendiagramm, das die Wirksamkeit von Ulocladium oudemansii-Isolat (AGAL Nr. NM 99/016216) auf die Unterdrückung der Botrytis-Entwicklung mit dem Fungizid Iprodion vergleicht.
2 ist ein Balkendiagramm, das das Niveau von Botrytis-Infektion bei Weinbeeren bei der Ernte zeigt. Das Sternchen (*) bezeichnet Trauben, die signifikant unterschiedliche Niveaus von Botrytis-Infektion zeigen, verglichen mit der nicht-behandelten Kontrolle bei P < 0,05.
3 ist ein Balkendiagramm, das das Niveau von Botrytis-Infektion in denselben Weinbeeren-Trauben nach zwei Tagen Inkubation in hoher Feuchte (Bedingungen, die günstig sind für die Krankheitsentwicklung) zeigt. Das Sternchen (*) bezeichnet Trauben, die signifikant unterschiedliche Niveaus von Botrytis-Infektion zeigen, verglichen mit der nicht-behandelten Kontrolle bei P < 0,05.
4 ist ein Balkendiagramm, das das Niveau von Botrytis-Infektion in denselben Weinbeeren-Trauben nach vierzehn (14) Tagen Inkubation in hoher Feuchte (Bedingungen, die für die Krankheitsentwicklung günstig sind) zeigt.
5 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung der Häufigkeit des Auftragens von Mittel zur biologischen Bekämpfung NM 99/06216 auf Botrytis-Niveaus in Chardonnay-Trauben bei Traubenschluss während der Saison in Hawkes Bay zeigt. 10d, 20d, 30d bezieht sich auf das Intervall (in Tagen) zwischen NM 99/06216-Aufträgen.
6 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung der Häufigkeit der Aufträge von Mittel zur biologischen Bekämpfung NM 99/06216 auf Botrytis-Niveaus in Chardonnay-Trauben bei der Ernte in Hawkes Bay und Marlborough im Jahre 1999 zeigt. 10d, 20d, 30d bezieht sich auf das Intervall (in Tagen) zwischen NM 99/06216-Aufträgen.
7 ist ein Balkendiagramm, das Botrytis-Niveaus in Merlot-Trauben (Gisborne) bei der Ernte in und auf Chardonnay-Trauben (Marlborough) nach 48 h Inkubation in hoher Feuchte nach der Ernte zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf Stämme der Ulocladium oiudemansii-Spezies mit Wirksamkeit gegen Botrytis und Verwendung derselben bei der Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten gerichtet.

U. oudemansii ist ein saprophyter Pilz, der aus Erde, Holz, Blättern, Früchten oder Samen isoliert werden kann. Isolate haben die folgenden Identifikationsmerkmale im Vergleich zu U. atrum (Simmons, 1967):

	Merkmale
Ulocladium sp	Mycel	Conidiophoren	Conidien
U. atrum	Ca. 5 μ Durchmesser, gelb bis goldbraun, glatt oder manchmal fein aufgeraut	Bis zu 120 × 3–8 μ, glatt oder verrukös, goldbraun	Goldbraun oder dunkel rötlichbraun, olivfarben, gleichförmig und nahezu verrukös, manchmal ellipsoid oder obovoid, 15–32 μ × 11–18 μ, mit 1–3 querverlaufenden und 1 oder mehr längsverlaufenden Septen, aber überwiegend 2 vollständigen schrägen Septen, die sich im rechten Winkel schneiden, aber am üblichsten sphärisch oder subsphärisch
U. oudemansii	3–6 μ Durchmesser Subhyline bis verdünnt gelbbraun, glatt	Bis zu 250 × 5–8 μ, goldbraun, glatt, solitäre Conidien tragend	Anfänglich nahezu obovoid, hyline und glatt Gelbbraun und unverdächtig aufgeraut werdend: schließlich breit obovoid oder ellipsoid, dunkel rotbraun bis olivfarben, Abmessungen sind 18–34 μ × 11–17 μ mit 1–3 querverlaufenden und 1 oder mehr längsverlaufenden oder schrägen Septen. Apex ist breit abgerundet und oft unverdächtiger verrukös als der Rest des Conidiums, der glatt sein kann

Text in Fett sind Merkmale, die als eine Richtlinie verwendet werden können, um zwischen diesen zwei Spezies zu unterscheiden, zusätzlich zu Kulturmerkmalen und Wachstum auf HEA und PCA, beschrieben in Tabelle 1.

Stämme von U. oudemansii, die gegen Botrytis wirksam und daher geeignet sind zur Verwendung gemäß der Erfindung, sind identifiziert als diejenigen, die wenigstens 50% Antagonistenwirksamkeit zeigen, ausgedrückt als eine prozentuale Verringerung der Conidiophoren der relevanten Botrytis-Spezies, verglichen mit der Kontrollbehandlung. Zur Veranschaulichung kann die Methodologie, die in Beispiel 3 unten umrissen ist, eingesetzt werden, um U. oudemansii-Isolate zu identifizieren, die wirksam sind gegen B. cinerea, wohingegen Verfahren, die analog sind zu denjenigen in Beispiel 3, in Bezug auf andere Botrytis-Spezies eingesetzt werden können.
Ein Stamm von U. oudemansii, der die obigen Anforderungen erfüllt, wurde aus Kiwifrucht-Blätterabfallbruchstücken isoliert, gesammelt von einem Kiwifrucht-Forschungsblock an der Massey University, Palmerston North, Neuseeland, nach Inkubation in Kammern mit hoher Feuchte, um Saprophytensporenproduktion zu induzieren. Er zeigt die hohe Sporenproduktion, die typisch ist für die Gattung, wenn angezogen auf Hafermehlagar. Details des Isolierungs- und Selektionsverfahrens, das eingesetzt wurde, um das Isolat zu erhalten, sind in den Beispielen angegeben. Dieses Ulocladium oudemansii-Isolat ist hinterlegt worden bei den Australian Government Analytical Laboratories (AGAL), 1 Suakin Street, Pymble, New South Wales, Australien, am 2. September 1999, gemäß dem Budapester Vertrag für die Zwecke von Patentverfahren. Dem Isolat ist die Hinterlegungsnummer NM 99/06216 zugeteilt worden.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung, in einem Aspekt, eine biologisch reine Kultur von U. oudemansii AGAL Nr. NM 99/06216 bereit. In ähnlicher Weise bereitgestellt sind Ulocladium-Stämme mit den Identifikationsmerkmalen von AGAL Nr. NM 99/06216.
AGAL Nr. NM 99/06216 und andere Isolate von U. oudemansii sind besonders wirksame Mittel zur biologischen Bekämpfung, die in der Lage sind, unterbrochene Feuchteperioden zu überleben, nekrotische Gewebe zu kolonisieren und Botrytis-Wachstum und -Sporenproduktion im Feld zu unterdrücken. Der Grad an Unterdrückung durch diese Isolate von U. oudemansii ist im allgemeinen so gut wie das üblicherweise verwendete Fungizid Iprodion (Rovral^®). Resistenz (von Botrytis cinerea) gegenüber diesem bestimmten Fungizid hat sich entwickelt; in diesen und anderen Fällen liefern Ulocladium oudemansii-Isolate, die gemäß der Erfindung ausgewählt sind, eine wirksame Alternative für die Botrytis-Bekämpfung. Diese unerwartete und potente Aktivität bei der Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten, gekoppelt mit dem Fehlen irgendwelcher Berichte über durch U. oudemansii induzierte Pflanzenpathogenität, zeigen, dass Isolate der Spezies wünschenswerte Attribute zur Verwendung als ein Mittel zur biologischen Bekämpfung besitzen.
Der Begriff „Mittel zur biologischen Bekämpfung" (BCA), wie hierin verwendet, bezieht sich auf Mittel, die als Antagonisten von einem oder mehreren Phytopathogenen wirken. Antagonismus kann eine Reihe von Formen annehmen. In einer Form kann das Mittel zur biologischen Bekämpfung das Pathogen im Hinblick auf verfügbare Nährstoffe und/oder auf Raum für die Wirtspflanze einfach übertrumpfen. In einer anderen Form kann das Mittel zur biologischen Bekämpfung die Umgebung ungünstig für das Pathogen machen. Demgemäß schließen die Antagonistenmechanismen Antibiose, Mycoparasitismus, Nährstoffkonkurrenz und physische Verdrängung ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur biologischen Bekämpfung bereit, die mindestens einen Stamm von U. oudemansii, der gegen eine Botrytis-Spezies wirksam ist, und wenigstens ein landwirtschaftlich akzeptables Trägermittel, Verdünnungsmittel oder Adjuvans umfasst. Die Zusammensetzung kann mehrere U. oudemansii-Stämme einschließen, schließt aber vorzugsweise drei Stämme oder weniger ein und am bevorzugtesten einen einzigen Stamm. Geeigneterweise umfasst die Zusammensetzung Isolat AGAL Nr. NM 99/06216 als ein Mittel aus einem einzigen Stamm, das wirksam ist gegen wenigstens Botrytis cinerea.
Wirksame Konzentrationen von U. oudemansii als Mittel zur biologischen Bekämpfung in der Zusammensetzung können in Abhängigkeit von der Endverwendung, dem physiologischen Zustand der Pflanze, dem Typ, der Konzentration und dem Grad an Pathogeninfektion; der Temperatur, Jahreszeit, Feuchte, Stadium in der Wachstumssaison und dem Alter der Pflanze; der Anzahl und dem Typ herkömmlicher aufgebrachter Fungizide; und der Pflanzenbehandlungen (wie etwa Blattpflückung und Schnitt), variieren und können alle bei der Formulierung der Zusammensetzung in Betracht gezogen werden.
Der Stamm von U. oudemansii, der als Mittel für biologische Bekämpfung eingeschlossen ist, muss eine reproduktiv lebensfähige Form sein. Für die meisten Zwecke wird der U. oudemansii wünschenswerterweise in die Zusammensetzung in der Form von Sporen eingearbeitet. Die Konzentration der Pilzsporen in der Zusammensetzung wird von der Anwendung abhängen, der die Zusammensetzung zugeführt wird. Ein beispielhafter Konzentrationsbereich ist von etwa 1 × 10² bis 1 × 10⁷ Sporen pro ml, vorzugsweise von etwa 1 × 10³ bis 2 × 10⁶ und bevorzugter für U. oudemansii 1 × 10⁴ bis 2 × 10⁶ Sporen pro ml.
Es wird vorhergesagt, dass, bei Verwendung herkömmlicher statischer Trocken- und Flüssig-Fermentationstechnologie, U. oudemansii-Sporen aus ausgewählten Stämmen in Masse für Feldanwendung produziert werden können. Wachstum wird im allgemeinen unter aeroben Bedingungen bei jeder Temperatur bewirkt, die befriedigend für das Wachstum des Organismus ist. Ein Temperatur von 8 bis 30°C, vorzugsweise 15 bis 25°C und am bevorzugtesten 20°C ist bevorzugt. Der pH des Wachstumsmediums ist leicht sauer bis neutral, d. h. etwa 5,0 bis 7,0 und am bevorzugtesten 6,0. Inkubationszeit ist ausreichend für das Isolat, um eine stationäre Wachstumsphase zu erreichen, etwa 3 bis 4 Wochen, wenn inkubiert bei 18°C, und wird im Dunkeln eintreten. Die Sporen können mit herkömmlicher Filter- oder Sedimentierungsmethodik (z. B. Zentrifugation) geerntet werden oder bei Verwendung eines Zyklonsystems trocken geerntet werden. Sporen können sofort verwendet oder, abgekühlt auf 1° bis 7°C, vorzugsweise 2°C, so lange gelagert werden, wie sie reproduktiv lebensfähig bleiben. Es ist jedoch im allgemeinen bevorzugt, dass die Verwendung innerhalb von zwei Wochen nach dem Ernten eintritt.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann auch landwirtschaftlich akzeptable Trägermittel, Verdünnungsmittel oder Adjuvantien einschließen. Die Zusammensetzungen können auch einen breiten Bereich von Zusatzstoffen umfassen, wie etwa Tenside, Anfeuchtungsmittel, Feuchthaltemittel, Klebrigmacher, Verteilungsmittel, Stabilisatoren und Penetrationsmittel, die verwendet werden, um die aktiven Inhaltsstoffe zu verstärken, und sogenannte „Stressing"-Zusatzstoffe, um Sporenstärke, -keimung und -überlebensfähigkeit zu verbessern, wie etwa Kaliumchlorid, Glycerol, Natriumchlorid und Glucose. Zusatzstoffe können auch Zusammensetzungen einschließen, die bei der Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit des Mikroorganismus bei Langzeitlagerung unterstützen, zum Beispiel unraffiniertes Maisöl und sogenannte Invertemulsionen, die eine Mischung aus Ölen und Wachsen auf der Außenseite und Wasser, Natriumalginat und Conidien auf der Innenseite enthalten.
Beispiele für Tenside, Verteilungsmittel und Klebrigmacher schließen Fortune^®, Pulse, C-Daxoil^®, Codacide Oil^®, D-C. Tate^®, Supamet Oil, Bond^® Penetrant, Citowett^® und Freeway ein.
Beispiele für geeignete Zusammensetzungen, die Trägermittel, Konservierungsmittel, Tenside und Anfeuchtungsmittel, Verteilungsmittel oder Nährstoffe einschließen, sind in US 5780023 angegeben, das hierin durch Bezugnahme miteinbezogen wird.
Wo zur Einbeziehung ausgewählt, werden übliche landwirtschaftliche Tenside, wie etwa Tween (erhältlich von Rohm & Haas), wünschenswerterweise in der Zusammensetzung gemäß bekannten Protokollen einbezogen. Es ist wichtig, dass alle verwendeten Zusatzstoffe in Mengen vorliegen, die nicht mit der Wirksamkeit der Mittel zur biologischen Bekämpfung interferieren.
Die Anmelder haben auch festgestellt, dass viele üblicherweise verwendeten Fungizide U oudemansii nicht nachteilig beeinflussen. Die Zusammensetzungen der Erfindung können daher auch solche Fungizide einschließen. Alternativ können die Zusammensetzungen in Bekämpfungsprogrammen getrennt, aber im Zusammenhang mit solchen Fungiziden verwendet werden.
Die Zusammensetzungen können in einer Reihe von Formen hergestellt werden. Eine Zubereitung umfasst eine pulverisierte Form der Zusammensetzung der Erfindung, die aufgestäubt werden kann. In einer weiteren Form ist die Zusammensetzung mit einem Verdünnungsmittel, wie etwa Wasser, vermischt, um ein Spray, einen Schaum, ein Gel oder eine Tauchlösung zu bilden, und wird in angemessener Weise unter Verwendung bekannter Protokolle aufgebracht. In der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform wird die U. oudemansii-Zusammensetzung in 0,1% v/v Tween80, vermischt mit Wasser, unter Verwendung einer unter Druck stehenden Sprühvorrichtung aufgebracht.
Zusammensetzungen, die für andere Auftragsmethoden formuliert werden, wie etwa Injektion, Einreiben oder Aufbürsten, können ebenfalls verwendet werden, wie tatsächlich jede bekannte Methode nach dem Stand der Technik. Indirektes Auftragen der Zusammensetzung auf die Pflanzenumgebung, wie etwa Erde, Wasser, oder als Samenbeschichtungen, sind potentiell möglich.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bekämpfung von Botrytis in einer Pflanze dar, wobei das Verfahren das Auftragen wenigstens eines Stammes von U. oudemansii, der gegen eine Botrytis-Spezies wirksam ist, oder einer Zusammensetzung der Erfindung auf die Pflanze umfasst.
Der Begriff „bekämpfen", wie hierin verwendet, umfasst im allgemeinen Verhinderung oder Verminderung von Botrytis-Infektion oder Hemmung der Geschwindigkeit und des Ausmaßes einer solchen Infektion. Kurative Behandlung wird ebenfalls in Betracht gezogen.
Obgleich mehrere Stämme von U. oudemansii mit Aktivität gegen eine Botrytis-Spezies im Bekämfungsverfahren eingesetzt werden können, werden vorzugsweise drei Stämme oder weniger und bevorzugt ein einziger Stamm im Verfahren verwendet. In der gegenwärtig bevorzugtesten Ausführungsform wird der einzige Stamm U. oudemansii AGAL Nr. NM99/06216 eingesetzt.
Wiederholtes Auftragen zu den gleichen oder unterschiedlichen Zeitpunkten in einem Erntezyklus wird ebenfalls in Betracht gezogen. Der U. oudemansii kann entweder früher oder später in der Saison aufgetragen werden. Das kann über die Blüteperiode sein. Der U. oudemansii kann auch unmittelbar nach der Ernte aufgetragen werden, um nekrotische oder seneszierende Blätter und maschinengeerntete Stengel (Rachiden) schnell zu kolonisieren, um Botrytis-Kolonisierung, insbesondere von Botrytis cinerea, auf Weinblättern und -stengeln zu verhindern. Der U. oudemansii kann auch auf ruhende Weinstöcke im Winter aufgetragen werden, um das Botrytis-Wachstum in ruhenden Geweben zu verlangsamen.
Das Auftragen kann zu einem Zeitpunkt vor oder nach dem Aufbrechen der Knospen und vor oder nach der Ernte stattfinden. Behandlung findet jedoch vorzugsweise zwischen Blüte und Ernte statt. Um die Wirksamkeit zu erhöhen, ist mehrfaches Auftragen (z. B. 2 bis 6 Aufträge Leber die phänologischen Stadien der Blüte bis zur Fruchtbildung oder Traubenschluss für Weinbeeren) bevorzugt.
Erneuter Auftrag des U. oudemansii oder der Zusammensetzung sollte auch nach Regen in Betracht gezogen werden. Unter Verwendung von Botrytis-Vorhersagemodellen kann der Auftrag des BCA auch so getimet werden, um Botrytis-Risikoperioden Rechnung zu tragen.
In den gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen wird der U. oudemansii in einer 0,1% v/v Tween80-Lösung unter Verwendung einer unter Druck stehenden Sprühvorrichtung aufgebracht. Die Pflanzenteile sollten bis unmittelbar vor dem Ablaufen leicht besprüht werden. Aufträge können auf entweder die gesamten Pflanzenkrone oder nur auf den Bereich in der Krone, wo die Blüten und sich entwickelnden Früchte konzentriert sind (z. B. „Traubenlinie" bei Weinbeeren) vorgenommen werden.
Die aufgebrachten Zusammensetzungen bekämpfen Botrytis. Botrytis spp. ist verantwortlich für viele Schimmelkrankheiten vor und nach der Ernte, die Pflanzenteile angreifen und Grauschimmel bei Weinbeeren und Kiwifrüchten, Gewächshausfrüchten, Prozesstomaten, Steinfrüchten, Schnittblumen, Erdbeeren und Zierpflanzen sowie einer Vielzahl anderer Pflanzen verursachen. In einer Ausführungsform werden die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung daher wünschenswerter zur Verwendung gegen einen oder mehreren von Botrytis cinerea und/oder Borrytis fabae, Botrytis aclada und Botrytis elliptica, Botrytis squamosa, Botrytis allii formuliert. Bekämpfung von Botrytis cinerea bei Weinbeeren unter Verwendung der Zusammensetzungen und des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird insbesondere in Betracht gezogen.
Der Begriff „Pflanze", wie hierin verwendet, umfasst nicht nur ganze Pflanzen, sondern erstreckt sich auch auf Pflanzenteile, Abschnitte sowie Pflanzenprodukte, einschließlich Wurzeln, Blätter, Blüten, Samen, Stengel, Callusgewebe, Nüsse und Früchte. Pflanzen, die von der Anwendung der vorliegenden Erfindung profitieren können, decken einen breiten Bereich landwirtschaftlicher und gartenbaulicher Gewächse ab. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind auch insbesondere geeignet zur Anwendung in organischen Produktionssystemen.
Das Verfahren der Erfindung hat besondere Anwendung bei Pflanzen und Pflanzenprodukten, entweder vor oder nach der Ernte. Die Zusammensetzung der Erfindung kann zum Beispiel auf gelagerte Produkte des oben aufgelisteten Typs aufgetragen werden, einschließlich Früchte, Gemüsen, Schnittblumen und Samen. Geeignete Auftragstechniken umfassen diejenigen, die oben identifiziert sind, insbesondere Aufsprühen.
Die Zusammensetzung kann potentiell verwendet werden, um Böden oder Samen zu behandeln oder vorzubehandeln, im Gegensatz zum direkten Pflanzenauftrag. Die Zusammensetzung kann Verwendung finden in Pflanzenverarbeitungsmaterialien, wie etwa Schutzüberzügen, Kisten und Verpackungen.
Ebenfalls umfasst von der vorliegenden Erfindung sind Pflanzen, Pflanzenprodukte, Böden und Samen, die direkt mit einem aktiven Stamm von U. oudemansii oder einer Zusammensetzung der Erfindung behandelt worden sind.
In einem weiteren Aspekt erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf dem Ulocladium oudemansii der Erfindung zur Verwendung in einer Zusammensetzung der Erfindung.
Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele werden vorgelegt, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen und den Schutzumfang derselben in keiner Weise zu beschränken.
BEISPIEL 1
Ulocladium oudemansii (AGAL Nr. NM 99/06216)
Dieser wurde ursprünglich isoliert aus Kiwifrucht-Blattabfall, bezogen vom Kiwifrucht-Forschungsgarten der Massey University in Palmerston North. Die Blattabfallprobe wurde in einer Kammer mit hoher Feuchte inkubiert, um Sporenproduktion durch saprophyte Pilze zu begünstigen. Conidien, die zu Ulocladium spp. gehören, aus der Blattabfallprobe, wurden auf Hafermehlagar kultiviert, zur Reinigung der Kultur und späteren Testung gemäß dem Protokoll von Beispiel 3.
Ulocladium-Merkmale
Das Isolat wurde als Ulocladium oudemansii beim Zentralbüro voor Schimmelkulturen (CBS), Delft, Niederlande, unter Verwendung der taxonomischen Referenz von Simmons, EG (1967), identifiziert.
Morphologische Merkmale
Mycel blass olivfarben-braun, glatt und feingeraut.
Kolonien auf Agar (Kartoffel-Karotten-Agar, PCA) langsam wachsend, samtschwarz oder olivfarben-kohlenschwarz mit einem weißen Rand. Nach 9 Tagen bei 20°C beträgt der Kulturdurchmesser 72 mm. Auf Hafermehlagar(OA) erscheinen Kolonien zunächst braun (1–2 Tage), erscheinen dann olivfarben für die ersten 2–7 Tage, werden dann zunehmend dunkler, so dass die gesamte Kolonie nach 3–4 Wochen ein samtschwarzes Aussehen hat. Koloniewachstum ist schnell, so dass die gesamte Petrischale (90 mm Durchmesser) nach 12 Tagen im Dunkeln bei 18°C überzogen ist. Auf PDA (Kartoffeldextroseagar) ist das Koloniewachstum langsamer, und die Kolonie nimmt ein dunkler olivfarben-schiefergraues Aussehen an. Auf diesem Medium ist die gesamte Petrischale (90 mm Durchmesser) nach 14–16 Tagen im Dunkeln bei 18°C überzogen. Auf Heuextraktagar (HEA) betrug das Wachstum 40 mm nach 10 Tagen bei 10°C und kontinuierlichem UV-Licht. Die Kolonie war dadurch gekennzeichnet, dass sie feingelappter war. Die Wachstumsmerkmale, Kolonie- und Conidien-Morphologie von AGAL Nr. NM 99/06216 auf HEA kann ein nützliches diskriminierendes Merkmal sein, wie unten zusammengefasst.

Kolonie- und Conidien-Merkmale von verwandten Ulocladium spp.-Isolaten, angezogen bei 10°C mit kontinuierlichem UV-Licht auf Heuextraktagar, sind in Tabelle 1 umrissen. Tabelle 1

Isolat	Ulocladium sp.	Koloniedurchmesser auf:		Übertragene Conidien:	Ausmaß von "Warzen" auf Conidien
		PCA (9 Tage)	HEA (10 Tage)
AGAL Nr. NM 99/06216	Ulocladium oudemansii	72 mm	40 mm	Kurze Kettten	Wenige Warzen
HRU G	Ulocladium oudemansii	80 mm	78 mm	Keine Ketten	Grob gewarzt
HRV N	Ulocladium oudemansii	> 85 mm	68 mm	Keine Ketten	Wenige Warzen
U385	Ulocladium atrum	70 mm	50 mm	Keine Ketten	Deutlich gewarzt

Conidien-Morphologie von Ulocladium oudemansii
Conidiophoren sind reichlich vorhanden, aufrecht oder absteigend, einfach oder verzweigt, goldbraun, glatt, borstig, solitäre Conidien an 1–5 uniportaten Genikulationen tragend. Conidien sind anfänglich eng obovoid, hyline, glatt, werden gelblich-braun und unverdächtig geraut; letztendlich breit obovoid oder ellipsoid, dunkel olivfarben-kohlenartig 21,6–30,8 auf 10,8–16,9 Mikrons mit 1 oder 3–5 querverlaufenden und einer oder zwei längsverlaufenden oder schrägen Septen, Basis breit konisch bis abgerundet, Apex breit abgerundet und oft verdächtiger verrukös (warzig) als der Rest des Conidiums. Conidien keimen leicht auf feuchten Substraten, was ein oder mehrere schnell wachsende Hyphen pro Conidium erzeugt.
Rezepte für PCA (Kartoffeln-Karotten Agar), HEA (Heuextraktagar), PDA (Kartoffeldextroseagar) und OA (Hafermehlagar), die in den obigen Tests verwendet wurden, wurden gemäß Gams et al. 1998 hergestellt.
BEISPIEL 2
Herstellung von Ulocladium oudemansii für Feldexperimente
Lagerkulturen von U. oudemansii (einschließlich AGAL Nr. NM 99/06216) wurden in 15% sterilem Glycerol bei –70°C konserviert und gelagert, bis sie gebraucht wurden.
Die U. oudemansii-Isolate wurden auf Hafermehlagar(OA)-Schrägkulturen in 35–50 ml-Reagenzgläsern mit einem Baumwoll-Woll-Pfropfen für 2–3 Wochen bei 18°C im Dunkeln angezogen. 10–20 ml steriles Millipure^®-Wasser (plus 0,01% Tween80) wurden zu den Schrägkulturen zugegeben, die dann vorsichtig mit einem sterilen Skalpell abgeschabt wurden, um Conidien zu entfernen. Für kleine Fermentationsläufe wurde die resultierende Sporensuspension dann zu vollständigem angefeuchteten organischen Hafer (zweimal für 45 Minuten bei 12°C, 100 kPa autoklaviert) in sterilen Kulturbeuteln (Typ MB03LPP, flexible Van-Leer-Verpackung, Pont-Audemer, Frankreich) zugegeben. Diese Kulturbeutel wurden dann mit Klebeband verschlossen und bei 18°C im Dunkeln für 3–4 Wochen inkubiert.
The U. oudemansii-Isolate wurden für Feldexperimente unter Verwendung des folgenden Protokolls vorbereitet. Der gesamte kolonisierte Hafer wurden aus den Kulturbeuteln entnommen und in einen Nylonnetzbeutel in eine Sporenwaschvorrichtung (Miniwash 2000SR MW100, Piraeus, Griechenland) gegeben. Abgekühltes Millipure^®-Wasser (plus 0,01% Tween80) wurde zugegeben und der kolonisierte Hafer in dieser Vorrichtung für 30 Minuten gründlich gewaschen. Die resultierende Suspension wurde durch einen Primärfilter (Masche = 4 mm × 4 mm) hindurchgegeben, um ganzen Hafer zu entfernen, und dann einen Sekundärfilter, der aus feiner steriler Nylongase (Masche = 200 μm) bestand, um Kleinteilchen und Mycel-Fragmente zu entfernen. Die Konzentration dieser Suspension wurde mit Hilfe eines Hämocytometers bestimmt und auf 2 × 10⁶ Conidien ml^–1 mit gekühltem Millipure^®-Wasser (plus 0,01% Tween 80) eingestellt und bei 5°C für maximal 2 Wochen vor Einsatz im Feld auf Eis gehalten. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass Lagerung bei dieser Temperatur für diesen Zeitraum nicht zu einer Verringerung der Sporenlebensfähigkeit oder anschließenden Keimrohrstärke führte. Die Isolatsuspension wurde auf zuvor markierte Weinbeeren (cv Chardonnay) unter Verwendung pneumatischer Sprühvorrichtungen 4 L Yates MaxiSpray aufgetragen.
BEISPIEL 3
Auswahlverfahren für Mittel zur biologischen Bekämpfung
Einführung
Wirksame Mittel zur biologischen Bekämpfung können entsprechend ihrer Fähigkeit ausgewählt werden, einen potentiellen krankheitsverursachenden Mikroorganismus von einem Substrat oder aus seiner ökologischen Nische zu verdrängen oder auszuschließen. Unter förderlichen Bedingungen können Phytopathogene, wie etwa Botrytis cinerea, seneszierenes totes oder nekrotisches Gewebe kolonisieren. Kompetitive, nicht-pathogene Saprophyten können aufgebracht werden, um das Phytopathogen auszuschließen und/oder zu übertrumpfen, wodurch die krankheitsverursachende Fähigkeit des Pathogens verhindert oder beschränkt wird. Die Wirksamkeit dieser Saprophyten im Feld ist ihrerseits abhängig von ihrer Fähigkeit, schwankende klimatische Bedingungen zu überleben, wie etwa unterbrochene Feuchteperioden und Austrocknung. Ein Verfahren wird bereitgestellt, mit dem kompetitive Saprophyten mit diesen Eigenschaften ausgewählt werden können. Das Verfahren folgt demjenigen, das ursprünglich von Dr. Jürgen Köhl für Zwiebel- und Lilienblätter konzipiert worden ist (Köhl et al, 1995a, 1995b).
Methoden
Scheiben (Durchmesser 21 mm) wurden aus reifen unbesprühten Wein- oder Kiwifruchtblättern geschnitten, die nach Zufallsprinzip ausgewählt wurden, und zwischen Lagen aus Karton gelegt. Die Scheiben wurden vorsichtig bei 40°C für ungefähr 9 Stunden getrocknet und dann unter laufendem Wasser für 10 Minuten gewaschen, um jegliche lösliche Nährstoffe zu entfernen. Die Blattscheiben wurden kann noch einmal auf sterilen Papiertüchern abgetupft, bei 40°C für 6 Stunden getrocknet, dann in Kunststoffprobenbehältern verschlossen, vor einer Sterilisierung durch Gammabestrahlung (4 Mrad).
Isolate saprophyter Pilze, wird bei Ulocladium spp., können leicht aus Erde, Holz, Blättern, Früchten oder Samenoberflächen isoliert werden, wie berichtet in Beispiel 1.
Isolate wurden auf Hafermehlagar (30 g feinvermahlenes Hafermehl plus 20 g Agar pro Liter Wasser) gehalten und für 2 bis 4 Wochen bei 20°C inkubiert, beleuchtet entsprechend einem Zyklus von 12 Stunden Tag/Nacht. Pilzfortpflanzungseinheiten wurden aus den sporulierenden Agarplatten unter Verwendung von sterilem 0,01% (v/v) Tween 80 in destilliertem Wasser herausgewaschen. Die Sporensuspensionen wurden durch steriles Linsengewebe (Whatman) filtriert, um Mycelfragmente zu entfernen, und bei 4.000 UPM für 2 min zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig vom Sporenpellet dekantiert und die Sporen erneut in frischem sterilen 0,01% (v/v) Tween 80 in destilliertem Wasser suspendiert. Der Zentrifugier- und Waschvorgang wurde wiederholt und die letztendliche Sporendichte mit Hilfe eines Hämocytometers auf 1 × 10⁶ Conidien m^–1 eingestellt.
Sterile Blattscheiben (4) wurden in eine Kammer mit hoher Feuchte gegeben, die aus einer sterilen Kunststoffpetrischale (90 mm Durchmesser) bestand, enthaltend 2 sterile Filterpapiere (Whatman), angefeuchtet mit 2 ml sterilem destilliertem Wasser (SDW). Die Blattscheiben wurden über Nacht gekühlt (4°C), um zu ermöglichen, dass das Gewebe das aufgebrachte Wasser aufsaugt. Im Anschluss an die Rehydratisierung wurden die Blattscheiben mit Conidien-Suspension von Botrytis cinerea (1 × 10⁴ Sporen/ml^–1) beimpft und in den Kammern mit hoher Feuchte für 8 Stunden bei 18°C im Dunkeln inkubiert. Nach diesem Inkubationszeitraum wurden Isolate von Kandidaten-BCAs (Saprophyten) auf die mit B. cinerea beimpften Blattscheiben aufgetragen, durch Vernebeln einer feinen Suspension (1 × 10⁶ Sporen/ml^–1) auf die Blattscheiben in den Feuchtekammern. Gleichzeitig beimpfte Gewebe wurden dann in den Kammern mit hoher Feuchte für weitere 16 Stunden bei 18°C im Dunkeln inkubiert.
Die Inkubation bei hoher Feuchte wurde unterbrochen, indem die Blattscheiben aus den Feuchtekammern in offene Petrischalen überführt wurden, die 2 Schichten aus sterilen trockenen (Whatman) Filterscheiben enthielten. Die Blattscheiben wurden dann an Luft in einer Kammer mit Laminarströmung für 6 Stunden bei 20–22°C getrocknet. Nach diesem Zeitraum stimulierter Austrocknung wurden die Gewebe rehydratisiert, durch Aufbringen von 2 ml SDW, dann in der Feuchtekammer eingeschlossen und für 10 Tage bei 18°C im Dunkeln inkubiert. Der Bereich des Blattscheibengewebes mit B. cinerea-Sporulation wurde visuell bestimmt. Kontrollen wurden eingesetzt; rehydratisierte Blattscheiben ohne Inokulum, rehydratisierte Blattscheiben nur mit B. cinerea Inokulum.
Statistische Analyse
Vor der Varianzanalyse wurden alle Daten arcsin-transformiert unter Verwendung einer Winkeltransformation, um die Varianz zu stabilisieren, und LSD-Werte wurden für Zwecke der durchschnittlichen Trennung berechnet.
Ergebnisse

Viele Isolate zeigen signifikant bessere Leistung als das herkömmliche Fungizid, wobei 90–100% Unterdrückung von B. cinerea-Sporulation erreicht wurden. Die Isolate mit besserer Leistung wurden für einen Wiederholungs-Laborbiotest ausgewählt, um die Unterdrückung von B. cinerea zu bestätigen. Ergebnisse des Wiederholungs-Biotests für Ulocladium spp. sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Isolate mit der besten Leistung wurden für weitere Feldevaluierung und Bestätigung der Wiederholungs-Laborbiotests ausgewählt, wie umrissen in Beispiel 4. Tabelle 2: Unterdrückung von B. cinerea-Sporulation durch Ulocladium spp. auf nekrotischen Kiwifrucht-Blattgeweben mit einer unterbrochenen Feuchteperiode in einem Wiederholungs-Biotest, um Antagonistenwirksamkeit zu bestätigen.

Behandlung	% Überdeckung von nekrotischem Blattgewebe durch B. cinerea-Canidiophoren
B. cinerea-Kontrolle	25
Ulocladium spp.
U. oudemansii (AGAL Nr. NM 99/06216)	6	76^a
U. atrum (U385 Holländisches Isolat)	11	56
Fungizid (Iprodion)	20	20
LSD (P < 0,05)	5,6

^a Antagonistenwirksamkeit, ausgedruckt als eine prozentuale Verringerung von B. cinerea-Conidiophoren, verglichen mit der B. cinerea-Kontrollbehandlung.

BEISPIEL 4
Für Feldtests von U. oudemansii (AGAL Nr. NM99/06216) wurden rehydratisierte nekrotische Kiwifrucht-Blattscheiben auf kleine Streifen aus dem Kunststoff Coreflute^® (Waikato Signs, Hamilton, Neuseeland) gelegt (5 Scheiben pro Streifen) und mit B. cinerea inokuliert, wie oben für die Laborversuche beschrieben, dann ohne Rehydratisierung für Inkubation für 22 Stunden unter Feldbedingungen auf die Pflanzenkrone überführt. Mit Pathogen inokulierte Blattscheiben wurden in das Labor zurückgebracht, mit AGAL Nr. NM99/06216 inokuliert, wie oben für die Laborversuche beschrieben, dann zurück ins Feld gebracht und in der Pflanzenkrone verteilt. Alle Behandlungen wurden im Hinblick auf die Position in der Krone randomisiert. Erneut wurden Kontrollbehandlungen einbezogen; Pflanzenscheiben ohne Inokulum, Pflanzenscheiben mit nur B. cinerea-Inokulum. Während des Inkubationszeitraums von 10 Tagen wurden vom Bauern keine Pestizidbehandlungen aufgebracht. Im Anschluss an die Inkubation unter Feldbedingungen wurden Blattscheiben aus der Pflanzenkrone eingesammelt und in Kammern mit hoher Feuchte für 10 Tage inkubiert, wie oben für die Labortests beschrieben. Die Scheiben wurden auf B. cinerea-Sporenproduktion bewertet, wie zuvor beschrieben. Dieses Feldscreeningverfahren wurde 11-mal wiederholt, um Exposition gegenüber einem breiten Bereich von Umweltbedingungen sicherzustellen.
Ergebnisse
Das AGAL Nr. NM99/06216-Isolat zeigte signifikant bessere Leistung als das herkömmliche Fungizid, Iprodion (Rovral^®), in bis zu 11 wiederholten Feldtests. Das Isolat reduzierte Botrytis cinerea-Sporulation konsistent und wiederholt um 80–100% (siehe 1), sogar wenn B. cinerea 22 h aufgetragen wurde, bevor das Isolat aufgetragen wurde.
Diskussion
Das AGAL Nr. NM99/0616-Isolat unterdrückte B. cinerea-Wachstum und -Sporulation in allen diesen Tests wirksam.
BEISPIEL 5
Materialien und Methoden
Feldversuch
Feldstudien begannen in einem Block von Chardonnay mit einer Botrytis cinerea-Geschichte, im Montana's Twin Rivers-Gebiet (Taradale, Napier, Neuseeland). Acht Behandlungen (siehe unten) wurden ausgewählt und auf einzelne Rebenstellen aufgebracht (acht markierte Trauben pro Rebe) in jeder von 5 Replikatreihen (40 Trauben pro Behandlung insgesamt). Es gab Pufferreihen auf jeder Seite der behandelten Fläche.
Behandlungen

1) Unbehandelt
2) Pulse (0,1%)
3) Tween (0,05%)
4) Algan (0,5%; plus Pulse)
5) AGAL Nr. NM99/06216-Spray (plus Tween)
6) AGAL Nr. NM99/06216 getaucht (plus Tween)
7) Zitronengrasöl (0,1%; plus Pulse)
8) Shirlan (1 ml/l)

AGAL Nr. NM99/06216-Sporensuspension eingestellt auf 2 × 10⁶ Sporen/ml
Auftrag
Behandlungen wurden während des Sommers und frühen Herbstes am 15. Dezember, 23. Dezember, 30. Dezember, 13. Januar, 28. Januar, 12. Februar, 24. Februar, 6. März, 16. März, 26. März, 9. April aufgetragen. Behandlungen wurden bis zum Ablaufen aufgetragen, unter Verwendung handgehaltener pneumatischer Sprühvorrichtungen, mit der Ausnahme von Behandlung 6, die durch Tauchen der Trauben aufgetragen wurde.
Ernte
Das Auftreten von Botrytis bei der kommerziellen Ernte war sehr niedrig. Die Ernte dieses Versuches wurde für zwei Wochen verzögert, um weitere Botrytis-Entwicklung zu fördern. Am 21. April wurden die markierten Trauben geerntet, in Polythen-Beutel auf Eis gegeben und dann zu den HotResearch-Laboratorien im Ruakura Research Center transportiert. Die Trauben wurden aus den Polythen-Beuteln entnommen, und Traubenfäule wurden beurteilt durch Auszählen der Anzahl von Beeren in jeder Traube, die mit Botrytis infiziert waren.
Inkubationstest unter hoher Feuchte
Um die Botrytis-Entwicklung zu fördern, wurde jede Weinbeerentraube nach der Erntebeurteilung in einen Kunststoffbehälter (Plix Packaging, Carter Holt Harvey, Neuseeland) gegeben, mit angefeuchteten Papiertüchern auf dem Boden jedes Behälters, um eine feuchte Umgebung aufrecht zu erhalten. Die Behälter wurden randomisiert und bei 20°C +/– 2°C inkubiert. Die zweite Traubenfäule-Bewertung wurde nach 2 Tagen Inkubation durchgeführt. Die Trauben wurden in hoher Feuchte für weitere 12 Tage inkubieren gelassen, um die Behandlung unter scharfen Bedingungen zu testen. Nach diesem Zeitraum waren die Botrytis-Infektionsniveaus sehr hoch, und Traubenfäule wurde unter Verwendung der folgenden Skala gemessen:

Bewertung der Schwere des Traubenbefalls % Traubeninfektion

0 0

1 1–10

2 11–25

3 26–50

4 51–75

5 76–100
Statistische Analyse
Vor der Varianzanalyse wurden die Daten unter Verwendung einer Winkeltransformation transformiert, um die Varianz zu stabilisieren. Eine Analyse der Rohdaten gab ähnliche Schlussfolgerungen zu denjenigen der Analyse nach Transformation, und daher sind aus Einfachheitsgründen die Rohdaten angegeben worden.
Ergebnisse
Feldbeobachtungen
Keine der Behandlungen bewirkte irgendeinen sichtbaren Schaden an den Weinbeerentrauben. Die Reben wurden in regelmäßigen Intervallen auf das Vorhandensein von Botrytis untersucht und das Auftreten von Krankheit war sehr niedrig. Daher wurde die Ernte bis zum 21. April verzögert, um die Botrytis-Entwicklung im Versuchsblock zu fördern.
Botrytis-Bewertung bei Ernte
Obgleich Botrytis-Niveaus bei der Ernte niedrig waren, gab es signifikante Behandlungswirkungen. Die unbehandelten Trauben und diejenigen, die mit Algan, Zitronengrasöl, Pulse und Tween behandelt worden waren, besaßen zwischen 7–17 infizierte Beeren pro Traube (ungefähr 5–10% Infektion) (2). Alle anderen Behandlungen besaßen signifikant (P < 0,05) niedrigere Niveaus von Botrytis (< 2% Infektion).
Botrytis-Entwicklung auf Trauben nach 2 Tagen Inkubation in Kammern mit hoher Feuchte
Es gab einen allgemeinen Anstieg in Botrytis auf Trauben im Anschluss an 2 Tage Inkubation in Kammern mit hoher Feuchte. Das Infektionsniveau auf mit AGAL Nr. NM 99/06216 (gesprüht oder getaucht) und mit Shirlan behandelten Trauben blieb jedoch signifikant (P < 0,05) niedriger als die unbehandelte Kontrolle (3).
Botrytis-Entwicklung auf Trauben nach 14 Tagen Inkubation in Kammern mit hoher Feuchte
Die Botrytis-Infektionsniveaus reichen von 75 bis 83% auf unbehandelten Trauben und denjenigen, die mit Pulse, Tween, Algan und Zitronengrasöl behandelt worden waren. Auf mit AGAL Nr. NM99/06216 (gesprüht oder getaucht) behandelten Trauben lag das Infektionsniveau zwischen 36–41%. Die wirksamste Behandlung war Shirlan, wo das Auftreten von Botrytis 3% trug (4). Dieses Bekämpfungsniveau wurde jedoch durch Vornahme von 12 Aufträgen Shirlan^® während der Saison erreicht, etwas, was deutlich außerhalb normaler kommerzieller Praxis liegt. Im Weinberg würde die Verwendung von Shirlan^® kurz vor der Ernte beschränkt werden, um potentielle Rückstandsprobleme zu vermeiden, und man würde erwarten, dass nur die Hälfte dieser Anzahl von Aufträgen verwendet würde.
Diskussion
Ausgewählte Elizitoren, Antagonisten und antimikrobielle natürliche Produkte wurden auf Botrytis-Bekämpfung bei Weinbeeren (cv. Chardonnay) im Twin Rivers-Weinberg in Napier bewertet. Es gab signifikante Verringerungen von Botrytis cinerea auf Trauben, die mit AGAL Nr. NM99/06216-Isolat und dem Fungizid Shirlan behandelt worden waren, wenn verglichen mit den unbehandelten Kontrollen bei der Ernte. Die Trauben wurden dann unter Bedingungen hoher Feuchte inkubiert, um die Botrytis-Entwicklung zu begünstigen. Nach 14 Tagen Inkubation waren die Botrytis-Niveaus noch signifikant niedriger auf Trauben, die mit dem Isolat und Shirlan behandelt worden waren, verglichen mit den unbehandelten Kontrollen. Zitronengrasöl, Algan und die Benetzungsmittel Pulse und Tween bekämpften Botrytis nicht.
Dies ist ein praktischer Beweis für die Verwendung eines Mittels zur biologischen Bekämpfung, um Botrytis in Weinkultur im Feld zu bekämpfen. Dieses hervorragende Ergebnis weist auf das Potenzial biologischer Bekämpfung hin.
BEISPIEL 6
Einführung
Der Zweck dieser Studie war, die oben in Beispiel 5 beschriebenen Befunde zu bestätigen und den Umfang der Untersuchung auszuweiten. Feldversuche wurden in zwei wichtigen Weinanbaugebieten von Neuseeland, Hawkes Bay und Marlborough, durchgeführt, um den potentiellen Einfluss regionaler und saisonaler Variation auf die Wirksamkeit der Behandlung zur biologischen Bekämpfung zu bestimmen. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen dieser Studie werden vorgestellt.
Methoden
Versuchsstellen

Feldversuche wurden in Hawkes Bay und Marlborough durchgeführt. Behandlungen (Tabelle 3) wurden auf jede von 10 markierten Trauben pro Weinstock in einzelnen Weinstockflächen (cv. Chardonnay) unter Verwendung von Drucksprühvorrichtungen Yates Plassay Maxi4 aufgebracht. Es gab 5 Replikat-Weinstöcke pro Behandlung mit unbehandelten Pufferweinstöcken zwischen jedem behandelten Weinstock und unbehandelte Pufferreihen auf jeder Seite der Versuchsblockfläche, um ausreichend B. cinerea-Inokulum für die Infektion von Blüten und Früchten bereitzustellen. Tabelle 3: Behandlungen für 1998/99-Feldversuche

1998/99 Weinbergversuche
Behandlung	Sprühprogramm	Ort
AGAL Nr. NM99/06216	alle 10, 20 und 30 Tage	Hawkes Bay & Marlborough
Befeuchtungsmittel allein (Pulse)	alle 10 Tage	Hawkes Bay & Marlborough
Fungizid	herkömmliches Sprühprogramm*	Hawkes Bay & Marlborough

U. oudemansii-Suspensionen einhielten 2 × 10⁶ Conidien ml^–1 in 0,01% (v/v) Tween80.

* Das herkömmliche Sprühprogramm besteht aus Switch^® und Shirlan^® (Hawkes Bay) oder Euparen^® DF (Marlborough), aufgebracht während Capfall; Crop Care Captan WG, aufgebracht vor Traubenschluss und bei Veraison; und Rovral^®Flo, aufgebracht zweimal vor der Ernte (nur Hawkes Bay).

Die ersten Behandlungen wurden in Hawkes Bay im frühen November und in Marlborough im späten November aufgebracht. Danach wurden die Aufträge (ausgenommen Fungizide, die gemäß dem herkömmlichen oder Industriestandard-BOTRYTIS-Sprühprogramm aufgebracht wurden) alle 10, 20 oder 30 Tage durchgeführt.
Krankheitsbewertung
Vorher markierte Trauben wurden visuell während der Saison auf irgendwelche Anzeichen von Phytotoxizität und auf das Auftreten von Botrytis überwacht. Die Krankheitsbewertungen wurden in Hawkes Bay im späten Januar und an beiden Orten Mitte März durchgeführt. Zu jedem Datum wurde die Anzahl von mit Botrytis infizierten Beeren pro Traube aufgezeichnet. Das Auftreten von Botrytis war in Marlborough gering, und so wurden Trauben vom Weinstock entfernt, für 48 h unter Bedingungen, die für Botrytis-Entwicklung günstig waren, inkubiert, dann bewertet. Statistische Analyse der Ergebnisse wurde unter Verwendung von ANOVA durchgeführt. Vor der Varianzanalyse wurden die Daten unter Verwendung einer Winkeltransformation transformiert, um die Varianz zu stabilisieren. Analyse der Rohdaten ergab ähnliche Schlussfolgerungen zu denjenigen der Analyse nach der Transformation, und aus Einfachheitsgründen haben wir die Rohdaten angegeben.
Ergebnisse
Bewertung in Hawkes Bay zur Mitte der Saison
Keine der Behandlungen bewirkte irgendeinen beobachtbaren Schaden an Weinbeerengeweben in irgendeinem Stadium der Saison in Hawkes Bay. Auf schwere Regenfälle während des Januars in Hawkes Bay folgte die Entwicklung von Botrytis im Versuchsblock. Reichliche Botrytis-Sporulation wurde auf unbehandelten Trauben sowohl bei den unbehandelten Pufferweinstöcken als auch bei unbehandelten Trauben auf den Flächen beobachtet, was darauf hinweist, dass reichlich Botrytis-Inokulum für Infektion zu diesem Zeitpunkt verfügbar war.
Trauben auf den unbehandelten Weinstöcken hatten das höchste Niveau an Botrytis mit ungefähr 7 infizierten Beeren pro Traube (5). Alle Behandlungen mit Ausnahme der Befeuchtungsmittelkontrolle „Pulse" verringerten das Auftreten von Botrytis signifikant. Die "10 Tage"-Behandlung mit U. oudemansii AGAL Nr. NM99/06216 verringerte Botrytis um über 80% und die „20 Tage"- und „30 Tage"-Behandlungen um ca. 70%. Dies war günstig im Vergleich mit dem herkömmlichen Fungizid-Programm, das das Auftreten von Botrytis um ungefähr 60% verringerte. Es gab keine Anzeichen von Botrytis-Infektionen in Marlborough zu diesem Zeitpunkt.
Botrytis-Bewertung bei Ernte
Bestätigung der Wirksamkeit von Ulocladium oudemansii
Die Schwere von Botrytisbefall in Hawkes Bay war am höchsten auf den unbehandelten Trauben mit durchschnittlich 35 infizierten Beeren pro Traube. Die Behandlungen mit U. oudemanssii AGAL Nr. NM99/06216 waren mindestens so wirksam wie das Fungizid. Diese Ergebnisse bestätigen unsere früheren Befunde, die in Beispiel 5 oben beschrieben sind.
Effekt der regionalen Variation und des Zeitintervalls auf die Wirksamkeit von U. oudemansii AGAL Nr. NM99/06216
Die Schwere des Botrytisbefalls war im allgemeinen niedriger in Marlborough als in Hawkes Bay (6). Wenn das Zeitintervall zwischen Aufträgen von U. oudemansii AGAL Nr. NM99/06216 von alle 10 auf alle 20 oder sogar alle 30 Tage verlängert wurde, gab es keine Verringerung in der Behandlungswirksamkeit. Das Niveau der Krankheitsbekämpfung in allen Behandlungen war jedoch vergleichsweise günstig gegenüber dem herkömmlichen Fungizid-Programm in Hawkes Bay. In Marlborough, wo es minimalen Krankheitsdruck gab, waren die Ergebnisse weniger klar. Das Auftreten von Botrytis bei allen Marlborough-Behandlungen, einschließlich der unbehandelten Kontrolle, war niedriger als 8%.
DISKUSSION
Ulocladium oudemansii AGAL Nr. NM99/06216 wurde zur Bekämpfung von Botrytis bei Weinbeeren (cv. Chardonnay) in Weinbergen in Hawkes Bay und Marlborough bewertet. Alle U. oudemansii-Behandlungen waren so wirksam wie das Fungizid und in einigen Fällen signifikant besser. Diese Ergebnisse bestätigen unsere früheren Befunde, wie berichtet in Beispiel 5, und das Ergebnis für Hawkes Bay war besonders ermutigend, wenn man in Betracht zieht, dass wir einen sehr hohen Inokulumdruck auf die Behandlungen ausgeübt haben (benachbarte Pufferweinstöcke und die Mehrzahl von Trauben im Weinstock waren unbehandelt).
Das Versprühen alle 10 Tage könnte sich zu soviel wie 15 Aufträgen während einer Saison aufaddieren, und dies könnte für Züchter unerwünscht sein. Erhöhen des Behandlungsintervalls auf 20 oder 30 Tage führte zu einer Verringerung der Wirksamkeit, lieferte aber immer noch ein Niveau der Krankheitsbekämpfung, das äquivalent war zu demjenigen, das mit einem herkömmlichen Fungizidprogramm erreicht wurde. Ein weiterer Weg zur Verringerung der Fungizid-Aufträge könnte sein, bestimmte Wachstumsstadien anzuzielen. Arbeit an anderen Pflanzen und mit anderen Chemikalien hat belegt, dass Unterdrückung von Botrytis früh in der Saison wichtig ist für wirksame Krankheitsbekämpfung (Nair & Allen, 1993). Wir untersuchen diesen Ansatz in Beispiel 7.
BEISPIEL 7
Einführung
Das Ziel dieser Studie war, in Beispiel 6 unternommene Arbeiten weiter auszudehnen und die Wirkung gezielter Aufträge auf die Bekämpfung von Botrytis zu untersuchen. Erneut wurden Feldversuche in zwei wichtigen Weinanbauregionen von Neuseeland, Gisborne und Marlborough, durchgeführt, um regionale und saisonale Variation auf die Behandlungswirksamkeit zu berücksichtigen. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen dieser Studie werden vorgelegt.
Methoden
Versuchsstellen

Ähnliche Feldversuche wurden in Gisborne und Marlborough durchgeführt. Behandlungen (Tabelle 4) wurde auf jede Behandlungsfläche aus 3 Weinstöcken (cv. Chardonnay in Blenheim und cv. Merlot in Gisborne) unter Verwendung von 15-Liter-Rückensprühvorrichtungen „Solo" aufgebracht. Es gab 5 Replikatflächen pro Behandlung mit unbehandelten Pufferweinstöcken auf jeder Seite jeder behandelten Gruppe von Weinstöcken und unbehandelten Pufferreihen auf jeder Seite der Versuchsblockfläche, um ausreichend B. cinerea-Inokulum bereitzustellen. Tabelle 4: Behandlungen

Behandlung	Sprühprogramm	Ort
Keine Botrytizide	Schwefel aufgebracht, um pulverigen Mehltau unter Kontrolle zu halten¹	Gisborne & Marlborough
U. oudemansii AGAL Nr. NM99/06216	bei Blüte, Traubenschluss und Veraison	Gisborne & Marlborough
Standard-Fungizid	Industriestandard-Sprühprogramm*	Gisborne & Marlborough

1. Von Schwefel ist nicht bekannt, dass es irgendeine Wirkung auf Botrytis-Bekämpfung hat
2. NM99/06216-Suspensionen enthielten 2 × 10⁶ Conidien ml^–1 in 0,01% Tween 80.
3. Das Industriestandard-Sprühprogramm, das verwendet wurde, um Botrytis zu bekämpfen, war Switch^® und Euparen^® DF, aufgebracht während Capfall; mit Crop Care Captan WG, aufgebracht vor dem Traubenschluss und bei Veraison (zwei Besprühungen bei Veraison in Gisborne)

Mit Ausnahme des Industriestandard-Fungizid-Programms wurden die ersten Behandlungen unmittelbar vor der Blüte aufgebracht: am 3. Dezember in Gisborne und am 14. Dezember in Marlborough. Die zwei Aufträge wurden in jedem Wachstumsstadium mit einem Abstand von ungefähr 2 Wochen durchgeführt.
Krankheitsbewertung
Zuvor markierte Trauben wurden visuell während der gesamten Saison auf das Auftreten von Botrytis überwacht. Krankheitsbewertungen wurden an beiden Orten im späten Januar/frühen Februar und erneut Mitte März, unmittelbar vor der Ernte, durchgeführt. Zu jedem Termin wurde die Anzahl von mit Botrytis infizierten Beeren pro Traube aufgezeichnet. Das Auftreten von Botrytis war in Marlborough gering, und so wurden Trauben vom Weinstock entfernt, für 48 h unter für Botrytis-Entwicklung günstigen Bedingungen inkubiert, dann bewertet. Statistische Analyse der Ergebnisse wurde unter Verwendung von ANOVA durchgeführt. Vor der Varianzanalyse wurden die Daten unter Verwendung einer Winkeltransformation transformiert, um die Varianz zu stabilisieren. Die Analyse der Rohdaten ergab ähnliche Schlussfolgerungen zu denjenigen der Analyse nach der Transformation, und aus Einfachheitsgründen haben wir die Rohdaten angegeben.
Ergebnisse
Botryts-Bewertung in Gisborne
Keine der Behandlungen verursachte irgendeinen beobachtbaren Schaden an Weinbeerengeweben in irgendeinem Stadium der Saison. Häufige Regenfälle während des späten Januars und Februars in Gisborne erleichterten die Entwicklung von Botrytis im Versuchsblock. Wenigstens 70% der Trauben zeigten ein gewisses Auftreten von Botrytis bei der Ernte.
Botrytis-Bewertung in Marlborough
In Marlborough blieben die Bedingungen während der gesamten Saison extrem trocken, und das Auftreten von Botrytis war entsprechend niedrig, selbst wenn Beeren für 48 Stunden in feuchten Bedingungen inkubiert wurden, um zu versuchen, Botrytis zu induzieren, unter Verwendung derselben Technik, wie berichtet in Beispiel 5.
Diskussion
U. oudemansii AGAL Nr. NM99/06216 wurde wieder auf Botrytis-Bekämpfung bei Weinbeeren (cv. Chardonnay) in Weinbergen in Gisborne und Marlborough bewertet. In Gisborne waren die Bedingungen günstig für die Krankheitsentwicklung, aber die U. oudemansii-Behandlung war so wirksam wie das Fungizid. Diese Ergebnisse bestätigen unsere früheren Befunde, wie berichtet in den Beispielen 5 und 6. Im Gegensatz dazu waren die Bedingungen in Marlborough nicht förderlich für Botrytis-Infektion aufgrund der längeren Trockenheit in dieser Region während des Versuchs. Etwas Botrytis wurde jedoch nachgewiesen und NM99/06216 verringerte die Schwere des Krankheitsbefalls. Das Niveau der Krankheitsbekämpfung war wieder äquivalent zu demjenigen des Fungizids.
Diese Beispiele veranschaulichen, dass das Mittel zur biologischen Bekämpfung, U. oudemansii AGAL Nr. NM99/06216, in der Lage ist, Botrytis-Traubenfäule bei Weinbeeren konsistent und wiederholt zu verringern. Dies wurde über einen Bereich von Wachstumssaisons und Weinanbauregionen wiederholt.
BEISPIEL 8
Wirksamkeit anderer Isolate, die ebenfalls zur selben U. oudemansii-Spezies wie AGAL Nr. NM99/06216 gehören
Einführung
Andere Isolate von U. oudemansii sind auf ihre Fähigkeit getestet worden, Botrytis zu bekämpfen. Die Methode, die verwendet wurde zum Vergleich der relativen Wirksamkeit dieser Isolate, war dieselbe wie diejenige, die in Beispiel 3 beschrieben ist.
Methoden
Herstellung der Blattscheiben, Sporensuspensionen, Auftrag, Timing und Inkubationsdetails, die für den Biotest verwendet wurden, waren dieselben wie diejenigen, die in Beispiel 3 beschrieben sind.
Statistische Analyse
Die Daten wurden einer Analyse unter Verwendung von ANOVA unterzogen, und LSD-Werte wurden für die Zwecke der durchschnittlichen Trennung unter Verwendung des GENSTAT-Statistikpakets berechnet.
Ergebnisse

Unterdrückung von Botrytis-Sporenproduktion mit unterschiedlichen Isolaten von Ulocladium oudemansii reichten von 82–96% (Tabelle 5). Tabelle 5: Die Wirkung verschiedener Isolate von U. oudemansii auf B. cinerea-Entwicklung auf nekrotischen Kiwifrucht-Blattgeweben in einem Test mit einer unterbrochenen Feuchteperiode

Behandlung	% Überdeckung von nekrotischem Blattgewebe durch B. cinerea-Conidiophoren
B. cinerea-Kontrolle	89
U. oudemansii (Code HRU G).	16	82^a
U. oudemansii (Code HRU N)	4	95
U. oudemansii (AGAL Nr. NM 99/06216)	3,8	96
LSD (P < 0,05)	7,6

^a Antagonistenwirksamkeit, ausgedrückt als eine prozentuale Verringerung von B. cinerea-Conidiophoren, verglichen mit der B. cinerea-Kontrollbehandlung.

Dieses Beispiel belegt klar, dass wir andere Isolate von U. oudemansii getestet haben und festgestellt haben, dass jedes von diesen die Botrytis-Entwicklung um wenigstens 50% signifikant verringert hat. Zwei Isolate, AGAL Nr. NM99/06216 und U. oudemansii (Code HRU N), verringerten die Botrytis-Entwicklung in diesem Test um wenigstens 95%.
Literaturstellen

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Domsch, K. H., Gams, W. and Traute-Heidi Anderson (1980). Ulocladium Preuss 1851 p 825 in Compendium of Soil Fungi Volume 1. Academic Press.
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Claims

Zusammensetzung zur biologischen Bekämpfung, welche in reproduktiv lebensfähiger Form und Menge mindestens einen Stamm von Ulocladium oudemansii, der gegen eine Botrytis-Spezies wirksam ist, und ein landwirtschaftlich akzeptables Trägermittel, Verdünnungsmittel oder Adjuvans umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der mindestens eine Stamm in Form von reproduktiv lebensfähigen Sporen vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Sporen in einem Konzentrationsbereich von 1 × 10² bis 1 × 10⁷ Sporen pro ml vorliegen.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Sporen in einem Konzentrationsbereich von 1 × 10³ bis 2 × 10⁶ Sporen pro ml vorliegen.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Sporen in einem Konzentrationsbereich von 1 × 10⁴ bis 2 × 10⁶ Sporen pro ml vorliegen.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welche mindestens zwei Stämme von Ulocladium oudemansii aufweist, die gegen eine Botrytis-Spezies wirksam sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der mindestens eine Stamm Ulocladium oudemansii AGAL Nr. NM99/06216 ist oder die Zusammensetzung diesen umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Botrytis-Spezies Botrytis cinerea ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, welche weiters ein oberflächenaktives Mittel umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das oberflächenaktive Mittel ein Tween ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das oberflächenaktive Mittel Tween 80 ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Zusammensetzung in Form eines Pulvers, Sprays, Schaums, Gels oder Eintauchmittels vorliegt.
Biologisch reine Kultur von Ulocladium oudemansii AGAL Nr. NM99/06216.
Verfahren zur Bekämpfung einer Botrytis-Spezies bei einer Pflanze oder einem Pflanzenprodukt, wobei das Verfahren das Auftragen einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 auf die Pflanze oder das Pflanzenprodukt umfasst.
Verfahren zur Bekämpfung einer Botrytis-Spezies bei einer Pflanze oder einem Pflanzenprodukt, wobei das Verfahren das Auftragen einer wirksamen Menge von mindestens einem Stamm von Ulocladium oudemansii, der gegen eine Botrytis-Spezies wirksam ist, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der mindestens eine Stamm von Ulocladium oudemansii Ulocladium oudemansii AGAL Nr. NM99/06216 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Botrytis-Spezies Botrytis cinerea ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die Pflanze ein Weinstock ist.
Pflanze oder Pflanzenprodukt, behandelt mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18.